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Étude structurale d’un complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae,
DivIB, DivIC et FtsL
Soizic MASSON
Directeurs de thèse : André Zapun, Frank Gabel et Thierry Vernet
Thèse pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université Joseph Fourier
Grenoble 1
Préparée au Laboratoire d’Ingénierie des Macromolécules
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Présentation du plan
IntroductionContexte biologique
Présentation du modèle utilisé
RésultatsI. Le complexe contraint EC/KLII. La partie extracellulaire de DivIBIII. L’interaction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB
Conclusion, perspectives, collaborations
1/44
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Les règnes du vivantIntroduction / Contexte biologique
Eucaryote: « à noyau » Procaryote
Sarcodina (Amibe)
Streptococcus pneumoniae
Methanococcus jannischii
2/44
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Les bactériesIntroduction / Contexte biologique
Une bactérie est un organisme unicellulaire
Membrane plasmique
Peptidoglycane
Membrane externe (Gram négatif)
ADN
3/44
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Les bactériesIntroduction / Contexte biologique
3/44
Gram positif
Une bactérie est un organisme unicellulaire
Membrane plasmique
ADN
Peptidoglycane
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La division bactérienneIntroduction / Contexte biologique
Les bactéries se reproduisent par division:
une cellule mère donne 2 cellules filles identiques
4/44
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La division bactérienneIntroduction / Contexte biologique
FtsZ FtsA FtsK DivIB DivIC FtsL FtsW FtsI
Constriction membrane
Ségrégation chromosome
Synthèse paroi septale
Fonction inconnue
5/44
Plusieurs protéines impliquées dans la division :
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La division bactérienneIntroduction / Contexte biologique
FtsZ FtsA FtsK DivIB
DivIC
FtsL
FtsW FtsI
Ordre de recrutement chez E. coli
Ordre de recrutement similaire chez B. subtilis,
supposé équivalent chez S. pneumoniae
Constriction membrane Ségrégation chromosome Synthèse paroi septale
5/44
Plusieurs protéines impliquées dans la division :
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FtsLIntroduction / Contexte biologique
Chez S. pneumoniae:
FtsL57 aa
23 aa
25 aa
Le gène est
-présent dans la plupart de génomes bactériens,
-transcrit avec FtsI (synthèse de la paroi septale).
La protéine est
-essentielle à la survie de la plupart des bactéries,
-peu stable face à la dégradation in vivo,
-un substrat de la protéase YluC.N-ter
6/44
Cyt.
Ext.
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Introduction / Contexte biologique
DivIC
Chez S. pneumoniae:
68 aa
23 aa
33 aa
Le gène est
-présent dans la plupart de génomes bactériens.
La protéine est
-essentielle à la survie de la plupart des bactéries.
N-ter
DivIC
7/44
Cyt.
Ext.
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FtsL et DivICIntroduction / Contexte biologique
23 aa
Les deux protéines
-se protègent mutuellement de la dégradation,
-se co-localisent mutuellement,
-présentent un motif de « coiled-coil »,
-interagissent in vivo et in vitro.
8/44
FtsL
N-ter
N-ter
DivIC
Cyt.
Ext.
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DivIBIntroduction / Contexte biologique
Chez S. pneumoniae:
Le gène est
-présent dans la plupart de génomes bactériens.
La protéine est
-n’est pas essentielle à la survie du pneumocoque
-protége FtsL de la dégradation,
-semble liée à la synthèse du peptidoglycane.
248 aa
23 aa
125 aa
DivIB
La partie extracellulaire est
-composée de 3 domaines (2 structures proposées).
N-ter 9/44
Cyt.
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La partie extracellulaire de DivIBIntroduction / Contexte biologique
Chez E. coli:Chez G. stearothermophilus:
Code PDB: 1YR1
αα
β
()
Code PDB: 2VH1Robson et al., 2006 Van den Ent et al., 2008 10/44
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FtsL, DivIC et DivIBIntroduction / Contexte biologique
Très peu de conservation dans les séquences primaires
Les trois protéines interagissent :
-protection de FtsL par DivIB,
-co-localisation mutuelle,
-interaction prouvée in vitro et in vivo
11/44
DivIB
N-ter
FtsL
N-ter
N-ter
DivIC
Cyt.
Ext.
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La division bactérienneIntroduction / Contexte biologique
DivIB
DivIC
FtsL
FtsW FtsI
Structure supposée en « coiled-coil »
Topologie déterminée
Structures résolues Structure résolue
Constriction membrane
FtsZ FtsA FtsK
Ségrégation chromosomes Synthèse paroi septale
2 structures proposées du domaine extracellulaire
Plusieurs protéines impliquées dans la division :
12/44
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Objectifs du travailIntroduction / Objectif du travail
But de cette thèse:
apporter des informations structurales sur
- DivIB, DivIC et FtsL,
- les complexes qu’elles forment,
- l’arrangement de chacune dans ces complexes,
- leur interface d’interaction.
13/44
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Présentation du modèle utiliséIntroduction / Présentation du modèle utilisé
DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae :
Très peu de conservation dans les séquences primaires,
notamment dans les parties cytoplasmiques
=> Étude sur les parties extracellulaires seules
14/44
DivIB
N-ter
FtsL
N-ter
N-ter
DivIC
Cyt.
Ext.
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Présentation du modèle utiliséIntroduction / Présentation du modèle utilisé
DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae :
IB
Pas d’interaction
Rôle des segments transmembranaires de DivIC et FtsL ?
14/44N-ter
CL
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.
.
.
.
.
.KE
Présentation du modèle utiliséIntroduction / Présentation du modèle utilisé
DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae :
Formation d’un complexe entre la partie extracellulaire de DivIC et celle de FtsL
14/44
CL
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IB
Présentation du modèle utiliséIntroduction / Présentation du modèle utilisé
DivIB, DivIC, FtsL de S. pneumoniae
Interaction avec la partie extracellulaire de DivIB
Validation du système modèle
Noirclerc-Savoye et al., 2005
14/44
K
L
E
C
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Outils utilisésIntroduction / Objectif du travail
Outils biophysiques utilisés:
- RMN (étude structurale préliminaire et analyse de structuration),
- SANS et SAXS (détermination du degré d’oligomérisation et modélisation basse résolution),
- BIA par SPR (cartographie de zone d’interaction et détermination de constantes cinétiques).
15/44
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Présentation du plan
IntroductionContexte biologique
Présentation du modèle utilisé
RésultatsI. Le complexe contraint EC/KLII. La partie extracellulaire de DivIBIII. L’interaction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB
Conclusion, perspectives, collaborations
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EC/KL, un hétéro complexeI. Le complexe contraint EC/KL
E CStrep
K LHis6
Les protéines EC et KL:
Co-élution :
SDS-PAGE
16/44
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EC/KL, un hétéro complexeI. Le complexe contraint EC/KL
Spectre HSQC de KL 15N dans le complexe EC/KL:
Peu de pics se distinguent du bruit, problème de sensibilité
17/44
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EC/KL, un hétéro complexe, tétramériqueI. Le complexe contraint EC/KL
Etude par SANS:
Le complexe EC/KL est un tétramère, (EC/KL)2
Conc (mg/ml) Mapp (kDa)
10 57 ± 6
4 42 ± 9
1,5 50 ± 14
M (EC/KL)1 = 25 kDa
Détermination de la masse:
I(0) = f1. M. c
18/44
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EC/KL, un hétéro complexe, allongéI. Le complexe contraint EC/KL
Etude par SANS:
Le complexe (EC/KL)2 a une forme allongée, similaire à un bâton long
Estimation de la fonction de distribution de distances:
19/44
EC/KLCylindreSphère
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EC/KL, un hétéro complexe, en équilibreI. Le complexe contraint EC/KL
Etude par SAXS:
Le complexe (EC/KL)2 se dissocie en (EC/KL)1, avec un KD d’environ 25 M
Détermination de la masse:
I(0)= f2. M. c
20/44
![Page 28: Étude structurale dun complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae, DivIB, DivIC et FtsL Soizic MASSON Directeurs de thèse : André Zapun,](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062404/551d9d82497959293b8bb90a/html5/thumbnails/28.jpg)
Conclusions sur le complexe contraint EC/KLI. Le complexe contraint EC/KL
• Le tétramère à la forme d’un bâton allongé;
• Le complexe EC/KL est en équilibre entre un tétramère et un dimère;
• La constante de dissociation du tétramère en dimère est environ 25 µM.
Le tétramère de EC/KL reflète-t-il une réalité physiologique?
21/44
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Présentation du plan
IntroductionContexte biologique
Présentation du modèle utilisé
RésultatsI. Le complexe contraint EC/KLII. La partie extracellulaire de DivIBIII. L’interaction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB
Conclusion, perspectives, collaborations
![Page 30: Étude structurale dun complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae, DivIB, DivIC et FtsL Soizic MASSON Directeurs de thèse : André Zapun,](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062404/551d9d82497959293b8bb90a/html5/thumbnails/30.jpg)
II. La partie extracellulaire de DivIB
La partie extracellulaire de DivIB
Spectre HSQC de IB 15N :
La partie extracellulaire de DivIB est structurée, en partie
IB
22/44
![Page 31: Étude structurale dun complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae, DivIB, DivIC et FtsL Soizic MASSON Directeurs de thèse : André Zapun,](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062404/551d9d82497959293b8bb90a/html5/thumbnails/31.jpg)
IB est composée de trois domaines II. La partie extracellulaire de DivIB
Protéolyse limitée de IB:
La partie extracellulaire de DivIB est organisée en trois domaines, dont le domaine central est résistant à la trypsine
+ séquençage N-Ter et analyse en spectrométrie de masse
IB
α
γ
β
23/44
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Spectre HSQC de β 15N :
II. La partie extracellulaire de DivIB
Étude du domaine β par RMN
β
=> Bon candidat pour une étude par RMN
24/44
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Les constructions utilisées pour étudier IB II. La partie extracellulaire de DivIB
Élaboration de différentes constructions d’étude:
IB
25/44
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Les constructions utilisées pour étudier IB II. La partie extracellulaire de DivIB
Élaboration de différentes constructions d’étude:
Étude comparée par SAXS
Trop peu stable face à la dégradation
Étude par RMN
α
γ
β
25/44
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Étude du domaine β par SAXSII. La partie extracellulaire de DivIB
Courbe de diffusion de β de S. pneumoniae:
β
26/44
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Étude du domaine β par SAXSII. La partie extracellulaire de DivIB
Courbe de diffusion de β :
β de G. stearothermophilusβ de E. coli
27/44
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Étude du domaine β par SAXSII. La partie extracellulaire de DivIB
Courbe de diffusion de β :
Le domaine β de S. pneumoniae est structuralement proche du domaine β d’E. coli
β
27/44
β G. stearothermophilusβ E. coliβ S. pneumoniae
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II. La partie extracellulaire de DivIB
Étude des domaines βγ par SAXS
Courbe de diffusion de βγ:
Modélisation ab initio
β
γ
28/44
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II. La partie extracellulaire de DivIB
Étude des domaines βγ par SAXS
Modèle ab initio de βγ:
29/44
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II. La partie extracellulaire de DivIB
Étude des domaines βγ par SAXS
Modèle ab initio de βγ:
Le domaine β de S. pneumoniae enveloppe bien celui d’E. coli1. Le domaine γ est modélisé par une boule en C-Ter du domaine β
1 La structure représentée du domaine β d’E. coli comprend les acides aminés de la valine 127 à la proline 260 de la structure 2VH1 29/44
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II. La partie extracellulaire de DivIB
Étude des domaines αβγ (IB) par SAXS
Courbe de diffusion de αβγ:
α
β
γ
30/44
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II. La partie extracellulaire de DivIB
Étude des domaines αβγ (IB) par SAXS
Courbe de diffusion de αβγ:
La présence d’oligomères dans les échantillons de αβγ empêche la modélisation de la partie extracellulaire de DivIB
α
β
γ
30/44
β S. pneumoniaeβγ S. pneumoniaeαβγ S. pneumoniae
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II. La partie extracellulaire de DivIB
Conclusions sur la partie extracellulaire de DivIB
• Le domaine central (β) est structuralement proche du domaine d’E. coli;
• Le domaine C-ter (γ) est modélisé par une petite boule accrochée à une extrémité du domaine centrale;
• Le domaine N-ter (α) est peu stable face à la dégradation et induit des oligomères.
• La partie extracellulaire de DivIB est organisée en trois domaines;
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II. La partie extracellulaire de DivIB
Discussion sur la partie extracellulaire de DivIB
Quelle est la longueur réelle du domaine central, β, de la partie extracellulaire de DivIB?
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Présentation du plan
IntroductionContexte biologique
Présentation du modèle utilisé
RésultatsI. Le complexe contraint EC/KLII. La partie extracellulaire de DivIBIII. L’interaction entre le complexe EC/KL et la partie extracellulaire de DivIB
Conclusion, perspectives, collaborations
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La partie extracellulaire de DivIB complexée avec EC/KL
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Spectre HSQC de IB (ou αβγ) 15N :
IB
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IB
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Le complexe est de grande taille et le domaine β est impliqué dans l’interaction
Addition de EC/KL non marqué
Spectre HSQC de IB (ou αβγ) 15N :
La partie extracellulaire de DivIB complexée avec EC/KL
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Détermination de l’épitope d’interaction sur β
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Spectre HSQC de β 15N et 2H :
β
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Détermination de l’épitope d’interaction sur β
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Addition de EC/KL non marqué
Des résidus de β impliqués dans l’interaction avec EC/KL sont identifiés
Spectre HSQC de β 15N et 2H :
β
β
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Détermination de l’épitope d’interaction sur β
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Représentation de l’épitope d’interaction de β de S. pneumoniae avec EC/KL, sur la structure de β d’E. coli1:
1 Cette représentation repose sur un alignement des séquences primaires de DivIB de S. pneumoniae, de G. stearothermophilus et d’E. coli réalisé par alignement des éléments structuraux des protéines de G. stearothermophilus et d’E. coli 35/44
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L’interaction de EC/KL avec la partie extracellulaire de DivIB
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Faible sensibilité des spectres HSQC
=> anisotropie importante du complexe ?
Délimitation de régions C-terminales de DivIC et de FtsL : (sur la base de la prédiction de la formation d’un « coiled-coil »)
IBE CLK
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III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Test d’interaction des complexes tronqués avec βγ:
EC/KL EC*/KL
Les régions C-terminales de DivIC et FtsL sont essentielles à l’interaction avec βγ
Cartographie des régions d’interaction de EC/KL par Biacore
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EC/KL*
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III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Détermination des constantes d’interaction par Biacore
EC/KL
La constante de dissociation du complexe βγ/EC/KL est de 220 nM
Interaction de βγ à différentes concentrations avec EC/KL:
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Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Détermination de la masse de mélange de βγ et EC/KL:
I(0) = f1. M. c
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βγ : EC/KL 0 : 1 1 : 1 1 : 0
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Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Détermination de la masse de mélange de βγ et EC/KL:
I(0) = f1. M. c
39/44
βγ : EC/KL 0 : 1 1 : 1 1 : 0
I(0) (.10-3) 201 ± 10 305 ± 10 85 ± 9
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Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Détermination de la masse de mélange de βγ et EC/KL:
I(0) = f1. M. c
βγ : EC/KL 0 : 1 1 : 1 1 : 0
I(0) (.10-3) 201 ± 10 305 ± 10 85 ± 9
Mapp (kDa) 55,4 ± 8,3 46,2 ± 6,1 22,3 ± 4,6
Mdimère = 25
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55,4 ± 8,3 22,3 ± 4,6 46,2 ± 6,1
=> l’association de βγ avec le complexe EC/KL dissocie le tétramère ?
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Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Simulation de composition des échantillons:
0,27 mM
=> Courbe de diffusion de βγ/EC/KL !
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Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Courbe de diffusion de βγ/EC/KL:
=> Modelisation ab initio
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Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Modélisation basse résolution de βγ/EC/KL:
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Étude structurale du complexe βγ/EC/KL par SANS
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
Modélisation basse résolution de βγ/EC/KL:
βγ semble se localiser à l’extrémité du complexe EC/KL
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Conclusions sur l’interaction entre IB et EC/KL
III. Étude sur l’interaction entre la partie extracellulaire de DIvIB et le complexe contraint EC/KL
• Les régions C-terminales de DivIC et de FtsL sont essentielles à l’interaction avec la partie extracellulaire de DivIB
• Des résidus du domaine central de la partie extracellulaire de DivIB sont impliqués dans l’interaction avec les parties extracellulaires de DivIC et de FtsL
• Les domaines central et C-terminal se localisent à l’extrémité du complexe EC/KL
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Conclusion générale et perspectives
DivIB : - tester l’importance relative des résidus de l’épitope d’interaction,
DivIB/DivIC/FtsL: - augmenter la résolution du modèle basse résolution.
DivIC/FtsL : - identifier les résidus critiques des régions C-terminales,
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Collaborations
Institut de Biologie Structurale:
LRMN: Jean-Pierre Simorre LEM: Nicole ThielensThomas Kern Jean-Pierre AndrieuCécile Guistini
LBM: Christine Ebel LSMP: Bernard DubletAline Appourchaux Eric Forest
LPM: Isabelle Petit RoBioMol: Benoit Gallet Marjolaine Noirlerc-Savoye
LIM: tous!
Institut Laue Langevin:
D-Lab: Michael HaertleinMartine Moulin
D22: Phill Callow
European Synchrotron Radiation Facility:
ID02: Anuj ShuklaTheyencheri NarayananStéphanie Finet
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![Page 66: Étude structurale dun complexe de trois protéines de la division de S. pneumoniae, DivIB, DivIC et FtsL Soizic MASSON Directeurs de thèse : André Zapun,](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062404/551d9d82497959293b8bb90a/html5/thumbnails/66.jpg)
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