![Page 1: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/1.jpg)
Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella
suis
![Page 2: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/2.jpg)
Les bactéries Gram négatives possèdent plusieurs systèmes pour transférer le matériel génétique.
L’un de ces mécanismes est le système de conjugaison.
![Page 3: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/3.jpg)
Ce mécanisme a été détourné par différentes bactéries pour d’autres transferts de macromolécules que
celui de matériel génétique = système de sécrétion de type IV
![Page 4: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/4.jpg)
Echantillon des systèmes de sécrétion de type IV
(Covacci et al, 1999)
![Page 5: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/5.jpg)
Schéma hypothétique du système de sécrétion de type IV chez Agrobacterium tumefaciens
IM
OM
PP
ext.
CP
B 7
B9
B 7
B9
SS
S
S
B4NTPB6
D4B3
NTP
B8 B11
NTP
B5 B5
B10
B2
Les composants du système de sécrétion sont codés par un opéron nommé virB
(Covacci et al, 1999)
B1
![Page 6: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/6.jpg)
La bactérie d ’intérêt dans ce travail est Brucella suis.
- Coccobacille Gram-négatif - Zoonose affectant quelquefois l ’homme. - Pathogène intracellulaire - Famille des -2 Protéobactériacées comme Agrobacterium tumefaciens
Cette bactérie se développe, in vitro, dans les cellules HeLa et dans les macrophages, grâce à une déviation de la voie classique d’endocytose.
![Page 7: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/7.jpg)
Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp
endocytose
Dégradation enzymatique
Interaction
phagosomeEndosome précoce
Endosome tardif
Lysosome
Brucella
Interaction
Autophagosome
Vacuole de réplication
Reticulum endoplasmiqueIntervention du
système de type IV
![Page 8: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/8.jpg)
Les ORFs de ces deux opérons partagent un pourcentage d ’identité moyen de 26% (19,5 à 31 %)
(O ’Callaghan et al, 1999)
![Page 9: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/9.jpg)
Objectif de ce travail :
Utilisation d ’une approche bioinformatique en vue de voir si on peut appliquer le schéma du système de sécrétion de type IV d’Agrobacterium tumefaciens à Brucella suis.
![Page 10: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/10.jpg)
Les étapes suivies :
1) Collecter des informations au départ des séquences protéiques : - les localisations cellulaires - les motifs - les structures secondaires et tertiaires 2) Analyse plus approfondie de composants pour lesquels nous aurons pu proposer une fonction
![Page 11: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/11.jpg)
La méthodologie :
1) Recherche d’homologues (Blast)
- Banque non redondante - Banque de structures (PDB)- Banque d’ESTs humaines
Les composants des systèmes de type IVLa relation structure/fonctionInteraction avec l’hôte
2) Prédiction de localisation sub-cellulaire (PSORT)
- 4 localisations- Ne prédit pas encore la sécrétion- Prédictions fiables (cas-tests)- Localise une peu trop souvent en membrane interne
![Page 12: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/12.jpg)
La méthodologie (suite) :
4) Prédiction de structures secondaires (PHD)
- Localisation des structures secondaires- Prédiction d’hélices transmembranaires- Prédiction des résidus enfouis et exposés- Validation des localisations sub-cellulaires
3) Détection de motifs
a) Caractérisation d’une famille protéique (Blocks)b) Recherche de motifs fonctionnels (Prosite)
![Page 13: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/13.jpg)
La méthodologie (fin) :
5) Prédiction de structures tertiaires (3D-PSSM, Ucla-Doe)
- Similarité de repliement protéique Relation structure / fonction
![Page 14: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/14.jpg)
Résultats du débroussaillage du système de sécrétion de type IV chez B. suis
IM
OM
PP
ext.
CP
B 7
B9
B 7
B9
S
S
SS
B4NTP
B6
D4B3
NTP
B8 B11
NTP
B5 B5
B10
B2
Agrobacterium tumefaciensBrucella
suis
IM
OM
PP
ext.
CP
B 7
B9
B 7
B9
B4NTP
B6B3 B8 B11
NTP
B5 B5
B10
B2
orf12 ?
B1
![Page 15: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/15.jpg)
- 8 protéines du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens peuvent être transposées à B. suis.- Des fonctions ont pu être proposées ou renforcées pour deux composants du système : VirB1 et VirB5.
Conclusions du débroussaillage :
![Page 16: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/16.jpg)
La protéine VirB1 et son homologie avec les lysozymes
![Page 17: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/17.jpg)
La fonction proposée, dans la littérature, pour VirB1 est la
dégradation du peptidoglycane qui est aussi une des fonctions que remplissent les lysozymes.
![Page 18: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/18.jpg)
Les topologies de VirB1 et du lysozyme sont comparables
C N
C
N
Lysozyme VirB1
![Page 19: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/19.jpg)
Lysozyme complexé avec du NAG
![Page 20: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/20.jpg)
La protéine VirB5 et son homologie avec la MAP1A (Microtubule Associated
Protein 1A)
![Page 21: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/21.jpg)
VirB5 ne partage pas le motif de liaison aux microtubules.
Domaines identifiés sur la MAP1A (2805 aa)(ProDom)
PD000002
(K/R)(K/R)(D/E)Motif de liaison aux
microtubules
Ce qui s ’aligneÀ VirB5
N C
![Page 22: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/22.jpg)
Ce bloc PD000002 est conservé par beaucoup d’autres familles protéiques. Il s ’agit en fait d’un
coiled coil
![Page 23: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/23.jpg)
Voici un échantillon des protéines quipartagent ce motif coiled coil:
Protéines liant l’ADN :- protéines activatrices- élément de dimérisation de facteurs de transcription
Famille des v-SNARE et t-SNARE
Intéressant
Protéines fibreuses
Apolipoprotéines
![Page 24: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/24.jpg)
Schéma d’interaction entre v-SNARE et t-SNARE
Membrane vacuolaire
Membrane organiteRE, Golgi
![Page 25: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/25.jpg)
Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp
endocytose
Dégradation enzymatique
Interaction
phagosomeEndosome précoce
Endosome tardif
Lysosome
Brucella
Interaction
Autophagosome
Vacuole de réplication
Reticulum endoplasmiqueIntervention du
système de type IV
![Page 26: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/26.jpg)
Conclusions :
- Nous avons pu transposer 8 composants du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens à B. suis.- VirB1 dégraderait le peptidoglycane- VirB5 est le candidat préférentiel pour le détournement du trafic intracellulaire- Discussion sur la méthode employée
![Page 27: Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062417/551d9db9497959293b8dd013/html5/thumbnails/27.jpg)
Perspectives :
- Validation de la fonction enzymatique de VirB1 en mutant les résidus conservés dans le site actif d’un lysozyme (mutagenèse dirigée)- Validation de la fonction de VirB5 par différentes manipulations (co-immunoprécipitation, …).- Analyse approfondie d’autres composants du complexe.