UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des SciencesBiologique
Mémoire Envuedel’obtentiondudiplômede
MASTERACADEMIQUE
Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie
Filière: Biologie
Spécialité : Microbiologie fondamentale et Appliquée
Présente par : BENEDDINE Hadjer
DJEBRIT Cheuaiba
Thème
Soutenu publiquement
Mardi le : 09/06/2015 à 09h
Devant le jury :
Année universitaire : 2014/2015
UKM Ouargla Présidente Professeur Mme
.SIBOUKEUR Oumelkheir
UKM Ouargla Examinatrice M.A. A Mme
. SIBOUKEUR Amina
UKM Ouargla Promotrice M.A. B Melle
.SOUID Wafa .A
UKM Ouargla Co-promotrice M.C.A Mme
. BOUDJENAH Saliha
Etude de l’activité antimicrobienne des quelques souches
lactobacilles isolées à partir du lait de chamelle vis-à-vis des
quelques souches pathogènes ciblées
Remerciements
Avant tout, nous remercions Dieu le tout puissant, le Miséricordieux, de nous
avoir donné le courage, la force, la santé et la persistance.
Nous remercions notre promotrice Melle SOUID Wafa, Maître assistante à
l’université KASDI MERBAH D’OUARGLA, pour l’honneur qu’elle nous a fait en
dirigeant ce travail, pour ses aides, ses conseils, tout au long de l’élaboration de
ce modeste travail
A Mme SIBOUKEUR Oumelkheir, nous adressons nos remerciements les plus
sincères pour l’honneur qu’elle nous fait en acceptant de présider ce jury.
A Mme SIBOUKEUR Amina. Qui nous a fait l’honneur de bien vouloir accepter
de juger ce travail.
Au personnel des laboratoires pédagogiques, surtout Karima, Amel, Zineb,
Houda, Bahria et Hasina.
Enfin, nous remercions, tous ceux qui de près ou de loin, ont contribué à la
réalisation de ce travail.
Dédicace
Grace Allah
Je dédie ce modeste travail :
A mes parents :
*Ma chère mère BENSAHA Amoura, pour l’affection et l’amour qu’elle n’a
donné le courage et la force dans les moments les plus difficiles.
*Mon père Abdellah, pour son soutien moral et ses conseils les plus précieux qui
m’ont servi dans ma vie et son encouragement sans limite.
**A mes chères frères :Noureddine, Abdelkader, Hadjehossine et Mohamed
**A mes chères sœurs :Fatima Z, Hania,Farida, Oum-Elkhier, Karima et
Zaienab
** A mes chérs petits nevaux : Nour-el yakin, khadidja et mohamed el-Amine
**A toutes les familles :Djebrit et Bensaha
A tous mes amis et particulièrement à RamdaniKhadidja, Beneddine Hadjer
Hadji Mariem,Benfardiahadjer, Sara,Hamida.
CHEUAIBA
Dédicace
Je dédie ce modeste travail
Aux deux êtres les plus chérs au monde qui ont souffert nuit et jour
Pour nous couvrir de leur amour : mes parents.
A mon père pour sa patience avec moi et sonencouragement.
A ma source de bonheur la prunelle de mes yeux ma mère
Que le bon dieu vous garde en bonne santé.
A mes très chères frères : Ahmed Zakaria et Mohammed nadir .
A mes très chères sœurs : Noura, Zineb, Meriem, kawther
Et ma nièce : Touba.
Ama chère binôme : Cheuaiba
A mes chères amies : Souhir, Asma, Samira, Sara
Hadjer
Liste des abréviations
BL : bactérie lactique
Sp : espèce
ADH : Arginine di hydrolase
ADN : Acide désoxyribonucléique
ARN : Acide ribonucléique
NaCl : Chlorure de sodium
μl : microlitre
Lb: lactobacille
S; souche
MRS: De Man, Rogosa et Sharpe
Ppm: Partie pour million
Liste de photos
N° Intitulé
Page
01 Observation au microscope électronique du genre Lactobacillus 14
02 Aspect macroscopique sur milieu MRS des souches de Lactobacillus après 24h
d’incubation à 30 °C- 37 °C 30
03 Observation microscopique des souches Lactobacillus après la coloration de
Gram (Gx100) 30
04 Test de type fermentaire des souches (S1 ; S2 ; S3 et S4) 31
05 Croissance en présence 6.5% Na Cl pour les souches S1 ; S2 ; S3 et S4 32
06 Croissance en température 10 °C des souches S1 ; S2 ; S3 et S4 32
07 Croissance en température 15 °C des souches S1 ; S2 ; S3 et S4 33
08 Croissance en température 37 °C des souches S1 ; S2 ; S3 et S4 33
09 Croissance en température 45 °C des souches S1 ; S2 ; S3 et S4. 34
10 test d’ADH sur milieu M16 au bleu de bromotémol
34
11 test d’ADH sur milieu ADH (base de falkow) 34
12 Test de sucre de souche 01 ,02 et 03 35
13 Test de sucre de souche S4 35
14 Inhibition obtenue par les souches (Lb1, Lb2 et Lb3) vis -à-vis E.coli 37
15 Inhibition obtenue par les souches (Lb 2, Lb3) vis-à-vis Streptococcus sp. 37
16 Inhibition obtenue par les souches (Lb1, Lb3) vis –à-vis Staphylococcus aureus 37
17 L’activité antibactérienne de surnageant de lactobacilles (MRS normal et MRS
non taponné) contre E .coli
40
18 l’activité antibactérienne de surnageant de lactobacilles (MRS normal et MRS
non taponné) contre Streptococcus sp.
41
19 l’activité antibactérienne de surnageant de lactobacilles (MRS normal et MRS
non taponne) contre Staphylococcus 41
20 résultat de présence des bactériophages contre Staphylococcus aureus 41
21 l’inhibition du surnageant (S : normal, C : chauffé et p : traité par enzyme
pepsine) de lactobacille contre E. coli
42
22 l’inhibition du surnageant (S : normal, C : chauffé et p : traité par enzyme
pepsine) de lactobacille contre Staphylococcus sp.
43
23 l’inhibition du surnageant (S : normal, C : chauffé et p : traité par enzyme pepsine) de
lactobacille contre Streptococcus sp
44
Liste des tableaux
N° Titre des tableaux Phage
01 . Composition chimique globale (%) du lait de chamelle comparaison avec
le lait de vache. (SIBOUKEUR, 2007)
05
02 Flore indigène du lait cru 06
03 tableau synthétique le différent effet thérapeutique étudie dans le cas du lait
d de chamelle
07
04 les caractéristiques des lactobacillus 16
05 Les appareillages et petit matériel utilisées 20
06 Les souches pathogènes utilisées 21
07 isolement des bactéries lactiques 21
08 Critères morphologiques, le gram et le test de la catalase des quatre souches
isolé
30
09 Croissance à différentes températures des quatre souches isolées 32
10 Profils fermentaires des lactobacilles isolés 34
11 caractéristiques biochimiques et physiologiques des quatre souches isolées 35
12 Mesure le diamètre de zone inhibition des souches lactobacilles 38
13 Mesure de diamètre de zone inhibition des souches lactobacilles sur E. coli
à milieu MRS normal et MRS tamponné
39
14 Mesure de diamètre de zone inhibition des souches lactobacilles sur
Streptococcus sp. Sur milieu MRS normal et MRS tamponné
40
15 Mesure diamètre de zone inhibition des souches lactobacilles sur
Staphylococcus aureus sur milieu MRS normal et MRS tamponné
40
16 Détermination la nature de substance inhibitrice traitée par le chauffage et
la pepsine contre E.coli
42
17 Détermination de la nature de substance inhibitrice traitée par le chauffage
et la pepsine contre Staphylococcus aureus
43
18 Détermination la nature de substance inhibitrice traite par le chauffage et la
pepsine contre Streptococcus sp
43
Liste des figures
N° Titre des Figures Page
01 Principales voies assurant le transport et le métabolisme du glucose par
les bactéries lactiques
10
02 Distances phylogénétiques entre principaux les genres constituant les
BL basées sur les séquences des ARNr 16S ARNr, montrant les
principaux groupes phylogénétiques de bactéries lactiques à faible %
G+C et les genres Gram positifs non reliés
BifidobacteriumetPropionibacterium (HOLZAPFEL et al, 2001)
11
03 Protocole d’isolement des souches lactiques 23
04 protocole de fermentation des hydrates de carbones 25
05 Recherche des substances antimicrobiennes 26
06 Distribution du pourcentage des isolats lactiques sur milieux
MRS solide
31
Tables des matières
Remerciements Dédicace
Résumé
Abstract
مهخص
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations
Introduction 01
I. Synthèse bibliographique
1.1Aperçu sur le dromadaire 03
1.2. Lait de chamelle 03
1.2.1 Définition de lait 03 1.2.2 Lait de chamelle 04
1.2.3. Caractéristiques générales du lait de chamelle 04
1.2.4. Composition du lait de chamelle 04
1.2.5. La Microflore du lait 05
La microflore contaminant 05
La microflore contaminant 06
1.2.6. Propriétés thérapeutiques et antimicrobiennes du lait de chamelle 07
1.3. Les bactéries lactiques 08
1.3.1. Caractéristiques générales des Bactéries Lactiques 08
1.3.2. Classification des bactéries lactiques 09
1.3.4 Principaux genre 12
1.3.4.1.Streptococcus 12
1.3.4.2. Lactococcus 12
1.3.4.3. Leuconostoc 12
1.3.4.4.Enterococcus 13
1.3.4.5.Lactobacilus 13
1.3.5. Utilisation des lactobacilles en industrie laitière 14
1.3.6. Effets des lactobacilles sur la santé 14
1.4. Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques 15
1.4.1. Les acides organiques 15
1.4.2 Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) 15
1.4.3. Le dioxyde de carbone 17
1.4.4. Le diacétyl 17
1.4.5. Reutérine 17
1.4.6. Les bactériocines 17
Chapitre 2 Matériel & Méthodes
1.1. Matériel 20
1.2. Milieu culture 20
2. Méthodes 20
2.1. Provenance de l’échantillon du lait 20
2.2. Souches bactériennes utilisés 21
2.2.1. Souches pathogènes 21
2.2.2. Isolement et culture des Lactobacilles 21
2.3. Purification et conservation des souches 21
2.4. Identification des isolats 22
2.4.1. Critères morphologie 22
2.4.1.1Caractéristiques macroscopiques 22
2.4.1.2Caractéristiques microscopiques 22
2.4.2. Critères physiologique et biochimique 22
2.4.2.1.Test de la catalase 22
2.4.2.2.Type fermentaire 22
2.4.2.3.Croissance en présence de 6.5 % de Na Cl 23
2.4.2.4.Croissance à différentes température 24
2.4.2.5.Hydrolyse de l’arginine (ADH) 24
2.4.2.6.Fermentation des sucres 24
2.5. Étude de l’activité antibactérienne des souches bactériennes isolées 26
2.6. Mesure de diamètre des zones d'inhibition 27
2.7. Détermination de la nature des substances antimicrobiennes 27
2.7.1. Inhibition due à la production d'acides organiques 27
2.7.2. Inhibitions dues à la présence de phages lysogènes 27
2.7.3. Inhibition due à la présence de substance protéique 28
2.7.3.1. Action de protéase 28
2.7.3.2. Stabilité thermique 28
Chapitre2 Résultats et Discussion
3-1-Isolement et culture des Lactobacilles 30
3.1.1. Aspect macro et micro des Lactobacilles isolées 30
3.2 .L’identification des isolats 31
3.2.1. Type fermentaire 31
3.2.2. Croissance du milieu hyper Sallé à 6.5% NaCl 32
3.2.3. Croissance à différent température 32
3.2.4. Le test de l'ADH 33
3.2.5. La fermentation des hydrates de carbones 34
4. L’activité antibactérienne des souches 36
4.1. La nature de la substance antimicrobienne des Lactobacilles 38
4.4. L’inhibition due à acides organiques 39
4.5.L’inhibition due au bactériophage 41
4.6. L’Effiat d’enzyme protéolytique sure les substances inhibitrices 42
Conclusion 47
Référence bibliographique 50
Annexe 62
Introduction
Introduction
1
Introduction :
La résistance bactérienne aux agents antimicrobiens apparaît de nos jours comme une
des préoccupations majeures de santé publique. Les bactéries pathogènes sont à l’origine de
diverses pathologies et intoxication alimentaires. L'émergence et la dissémination de souches
bactériennes résistantes résultent de l'usage anarchique et abusif des antibiotiques
(PERRETEN et al, 1997).
Les études ont démontré que le lait camelin était sujet à une autoépuration qui lui
permet d’éliminer la flore pathogène. Le lait de chamelle a la capacité à inhiber la croissance
des micro-organismes pathogènes par rapport à celle des autres mammifères et sa capacité à
inhiber les Gram positif et Gram négatif pathogènes qui préoccupe la sécurité alimentaire. Il
contient de nombreuses substances qui ont des propriétés antibactériennes et antivirales
(OMER et ELTINAY, 2008 ; BARBOUR et al, 1984).
Durant l’entreposage du lait camelin à la température ambiante (fermentation
spontanée), il a été constaté que le taux de bactéries lactiques augmentait et que celui des
bactéries de contamination a tendance à diminuer (SIBOUKEUR, 2007).
Les bactéries lactiques sont largement impliquées dans la fabrication de produits
laitiers fermentés (PLF), et jouent un rôle majeur dans leur conservation et contribuent à
l’inhibition des germes contaminants (GUESSAS, 2007).Cette préservation est conférée par
la production de plusieurs métabolites ayant une activité antimicrobienne tels que les acides
organiques, le peroxyde d’hydrogène et les bactériocines (DORTU et THONART, 2009;
MORAES et al, 2010).
Ce travail consiste à étudier l’activité antimicrobienne des Lactobacilles isolés à partir
de lait chamelle vis-à-vis des souches pathogènes isolées au niveau des laboratoires des
analyses médicales de Ouargla, le travail consiste à :
Isoler et purifier des souches de lactobacilles à partir du lait de chamelle de la région
d'Ouargla;
Identifier et conserver les isolats;
Étudier l’activité antibactérienne des souches de lactobacilles isolées vis-à-vis les
souches pathogènes collectées au niveau des laboratoires d'analyses médicales ;
Déterminer la nature chimique de ces substances antibactériennes produites.
Chapitre Synthèse bibliographique
Chapitre Synthèse bibliographique
3
I. Synthèse bibliographique
1.1Aperçu sur le dromadaire
Le nom « dromadaire » dérive du terme grecque « dromados » qui veut dire course. Il
est donné à l’espèce de chameau à une seule bosse, appartenant au genre Camelus de la
famille des Camelidae et dont le nom scientifique est Camelus dromedarius. Le dromadaire
vit dans les régions chaudes, arides et semi-arides de la planète. Il serait originaire de
l’Amérique du Nord où le plus ancien fossile de Camelidae a été trouvé et d’où il aurait
rejoint l’Asie et l’Afrique, à la suite des glaciations qui sévirent dans pratiquement la quasi-
totalité de l’hémisphère nord de la planète durant l’ère tertiaire (ZEUNER, 1963).
Selon les statistiques de la FAO (2008), la population cameline mondiale s’élève à environ 20
millions de têtes dont plus de 15 millions sont recensées en Afrique et 3,6 millions en Asie.
La grande majorité de cette population (84%) sont des dromadaires (Camelus dromedarius)
qui vivent dans les régions arides du nord et du nord-est de l’Afrique. Le reste (6%) est des «
bactrians » (Camelus bactrianus) qui sont des chameaux à deux bosses peuplant les régions
froides de l’Asie. Ce nom leur a été donné, par référence à la région de "Baktriane", située au
nord de l’Afghanistan, où cette espèce était initialement implantée (FARAH, 1993).
L'effectif camelin algérien est réparti sur 17 wilayates, avec 75% du cheptel dans huit
wilayates sahariennes : Ouargla, Ghardaia, El-Oued, Tamanrasset, Illizi, Adrar, Tindouf et
Béchar et 25% du cheptel dans neuf wilayates steppiques : Biskra, Tebessa, Khenchela,
Batna, Djelfa, El-Bayad, Naâma, Laghouat et M'sila.(SIBOUKEUR, 2011)
Le dromadaire joue un rôle social et économique primordial car il a toujours été associé aux
formes de vie dans les zones pastorales arides et semi-arides. Il répond en effet aux multiples
besoins de ces populations en leur fournissant du lait et de la viande et en leur servant comme
moyen utilisé dans le transport et pour les travaux agricoles. Ses poils sont en outre utilisés
dans la confection des vêtements et des tentes et sa peau dans la fabrication des chaussures,
des ceintures…etc. (SIBOUKEUR, 2007).
1.2. Lait de chamelle
1.2.1 Définition de lait
Le lait est le produit de sécrétion des mammaire des mammifères, comme la vache, la
chèvre et la brebis, destiné à l’alimentation du jeune animal né. Du point de vue
physicochimique, le lait est un produit très complexe. une connaissance approfondie de sa
composition, de sa structure et de ses propriété physiques et chimiques est indispensable à la
Chapitre Synthèse bibliographique
4
compréhension des transformations, du lait et des produits obtenus lors différents traitements
industriels. (VIGNOLA, 2002)
1.2.2 Lait de chamelle
Le lait de chamelle, comme celui des autres mammifères, est un milieu de composition
chimique et physique complexe qui permet au jeune chamelon de couvrir ses besoins
énergétiques et nutritionnels pendant la première étape de son existence (SBOUI et al., 2009).
Le lait de chamelle frais ou fermenté ont été reconnus depuis longtemps à offrir un
traitement potentiel pour une série de maladies telles que l'hydropisie, la jaunisse, la
tuberculose, l'asthme et la leishmaniose ou kala-azar (ABDELGADIR et al, 1998;
SHALASH, 1984).
1.2.3. Caractéristiques générales du lait de chamelle
Le lait de chamelle, est généralement blanc opaque. Il a un goût sucré et piquant parfois
salé à cause du type des plantes broutées dans le désert par la chamelle, c’est pour ça que les
changements de goût du lait sont causés par les types de fourrages et la disponibilité d’eau, il
est mousseux lorsqu’il est secoué légèrement. (BELLIL, 2013), comparé au lait de vache, le
lait de chamelle s’acidifie très peu. Il peut être conserve longtemps sans réfrigération (3 jours
à 30°C et 2 semaines à 7°C) (SENOUSSI, 2011), La valeur moyenne du pH du lait de
chamelle cru analysé, est égale à 6,37± 0,06, et acidité titrable de l'ordre de18°D ±0,79
(CHETHOUNA, 2011)
La densité du lait chamelle oscille entre 1.025 à 1.032 avec une moyenne de 1.029.
L'écrémage du lait augmente sa densité. Celle-ci s'accroît d'autant plus que la quantité de
matière grasse est réduite (FARAH et BACHMANN, 1987)
1.2.4. Composition du lait de chamelle
La composition chimique globale du lait de chamelle en relation avec sa valeur nutritionnelle
a fait l’objet de plusieurs rapports (Tableau 01). Les teneurs indiquées sont des teneurs
importantes et équilibrées en nutriments de base (protéines, matière grasse et lactose) avec des
proportions similaires à celles présentes dans le lait de vache. Les teneurs en protéines et en
matière grasse varient respectivement de 2,5 à 4% et de 1,1 à 4,6% (avec une fréquence
élevée à des taux supérieurs à 3%), alors que la teneur en lactose fluctue entre 2,5 et 5,6%
(SIBOUKEUR ,2007).
Chapitre Synthèse bibliographique
5
Tableau01 : Composition chimique globale (%) du lait de chamelle selon différents
auteurs source (SIBOUKEUR, 2007); comparaison avec le lait de vache.
Origine Constituants
Références
Lait de
Chamelle
Eau MST Lactose MG Protéines
90,2 9.8 4,2 3.2 2.7 DESAL et al, 1982
88,1 11.9 4,4 3.6 2.9 SAWAYA et al, 1984
87.0 13.0 5,6 3.3 3.3 GNAN et SHEREHA,1986
87.4 13.4 4,8 3.2 4.0 ABDEL-RAHIM, 1987
89.1 10.9 3,9 3.5 3.4 HASSAN et al, 1987
87.8 12.2 5,2 3.2 3.1 FARAH et RÜEGG, 1989
86.6 13. 5,5 3.5 3.3 BAYOUMI, 1990
88.3 10.9 4,1 3.1 2.8 ELAMIN et WILCOX, 1992
91.3 8.7 4,5 1.1 3.2 MEHAIA, 1992
88.0 11.9 4,7 3.9 2.5 MEHAIA, 1993a
87.8 12.1 4,9 3.2 3.2 ABU-LEHIA, 1994
87.3 12.6 4,5 3.4 3.3 KAMOUN, 1994
86.9 13.1 4,9 4.6 3.0 LARSSON-RAZNIKIEWICZ
et MOHAMED, 1994
90.5 9.5 3,7 3.0 2.7 ZIA-UR-RAHMAN et
STRATEN, 1994
90.0 10.0 2,5 3.3 3.3 GORBAN et IZZELDIN,
1997
Lait de
Vache
87,0
–
87,5
12,5 –
13,0
4,8 –
5,0
3,4 –
4,4 2,9 – 3,5 MIETTON et al, 1994
N.B : MST = matière sèche totale – MG = matière grasse
1.2.5. La Microflore du lait
Les micro-organismes du lait sont répartis en deux grandes classes :
La microflore indigène ou originelle: Le lait contient peu de microorganismes
lorsqu’il est prélevé dans des conditions aseptiques, à partir d’un animal sain, il devrait
contenir moins de 5000 germes/ml et moins de 1 coliforme/ml. Les genres dominants
en sont principalement des microorganismes mésophiles (Micrococcus sp.,
Lactobacillus, Streptococcus ou Lactococcus et les bactéries à Gram négatif) voir
tableau 02((LAMONTAGNEet al ., 2002).
Chapitre Synthèse bibliographique
6
Tableau 02 : Flore indigène du lait cru
Microorganismes Pourcentage(%)
Micrococcus 30-90
Lactobacillus 10-30
Streptococcus/Lactococcus < 10
Bactérie Gram négative < 10
La microflore contaminant Ensemble des micro-organismes contamine le collecte
jusqu’à la consommation, elle peut se composer d’une flore d’altération qui causera des
défauts sensoriels ou qui réduira la durée de conservation des produits et d’une flore
pathogène, capable de provoquer des malades chez les personnes qui consomment ces
produits laitiers (LAMONTAGNE et al, 2002).
Le lait au cours de la traite, du transport et du stockage à la ferme ou à l’usine, est contaminé
par une grande variété de microorganismes (LARPENT J-P., 1997).
Les principales sources de contamination sont les suivantes :
fèces et téguments de l’animal : coliformes, Bacillus, Clostridium, Salmonella ;
sol : Streptomyces, bactéries sporulées, spores de champignons ;
litières et aliments : flore banale, lactobacilles, Clostridiabutyriques (ensilage);
air et eau : flores diverses ;
équipement de traite et de stockage du lait : flore lactique, microcoques,
lactobacilles, Chromobacterium, Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium,
Acinitobacter, levures ;
manipulateurs : staphylocoques des mains, germes d’expectoration et de
contamination fécale ;
vecteurs divers : insectes en particulier.
Les principaux micro-organismes d’altération rencontrés ou sont: Pseudomonas sp.,
Proteussp.,coliformes, principalement E. coli, Enterobacter, les sporulés, tels que Bacillus sp.,
Clostridium et certaines levures et moisissures (MAMI ,2013).D’autres microorganismes
peuvent se trouver dans le lait lorsqu’il est issu d’un animal malade : ils sont généralement
pathogènes et dangereux. Il peut s’agir par exemple d’agents de mammites. Les mammites sont
dues à des infections par Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli,
Corynebacterium bovis ou Corynebacterium pyogenes, Mycoplasma, Nocardiaas teroides
(BELARBI, 2011).
Chapitre Synthèse bibliographique
7
1.2.6. Propriétés thérapeutique et antimicrobiennes du lait de chamelle
Le lait de chamelle est apprécié traditionnellement pour ses propriétés anti-infectieux,
Anticancéreuse, antidiabétique et plus généralement comme reconstituant chez les malades
convalescents. Ces propriétés relèvent cependant le plus souvent d’observations empiriques
dont les fondements scientifiques mériteraient d’être précisés. Ces observations, bien
qu’empiriques, peuvent être reliées à la composition du lait de chamelle. Certains des
composants tant sur le plan quantitatif que qualitatif pourraient être associés à ces propriétés
particulièrement les facteurs antibactériens, l’insuline et la vitamine C(CHETHOUNA,
2011).Le lait de chamelle possèderait un effet antimicrobien contre les bactéries GRAM
positive et GRAM négative, parmi ces bactéries on trouve Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus et Salmonella typhimurium (EL- AGAMY et al,
1992 ;BENKERROUM, MEKKAOUI, BENNANI, & KAMAL, 2004;)(tableau03). Cette
activité est attribuée à la présence dans le lait de chamelle de substances antimicrobiennes
telles que le lysozyme, le peroxyde d’hydrogène, la lactoferrine, la Lactoperoxydase et les
immunoglobulines (EL-AGAMY et al, 1992)
Tableau 03 : Tableau synthétique les différents effet thérapeutique étudie dans le cas du
lait de chamelle (selon différents auteurs cité par SNOUSSI,2011).
Aspect étudie Effetobservé et interpretations Auteur
Diabetes Hypoglycémie (teneur élevée
d’insuline dans le lait
ZAGORSKY et al. , (1998)
AGRAWAL et al ., (2003)
WERNERY et al. , (2006)
Complications de
diabètes
Diminution du stress oxydatif et
prévention des nephro-pathologies
(teneur élevées en antioxydants)
Vitamine C
AGRAWAL et al ( 2009)
AL SAID EL-SHARBINI et al
(2010)
AMALHASSAN et BAYOUMI
(2010)
Allergie au lait
Effet hypoallergique (absence de
la B-Lg présence d’une caséine α S
différents de la caséine bovine)
SHABO et al (2005)
Infection Effet anti-infectieux (activité
antimicrobienne et anti virale)
MAL et al (2006)
MONA et al(2010)
Chapitre Synthèse bibliographique
8
Tumeur
Effet anti-tumoral (contrôle des
processus tumoraux par
stimulation de la défense
immunitaire)
MAGJEED et al (2005)
QUTTASALWA et KURDI LINA
(2005)
Toxicité aux métaux
lourds
Effet protecteur contre la toxicité à
l’aluminium et au cadmium AL-HASHEM et al, 2009
1.3. Les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont de très anciens microorganismes dont les ancêtres ont pu
voir le jour il y a trois milliards années. Elles seraient donc apparues avant les cyanobactéries
photosynthétiques qui ont transformé l’atmosphère terrestre ancienne sans oxygène en
atmosphère aérobie et dont les fossiles bien conservés datent d’environ 2,7milliards d’années.
(DRIDER et PREVOS, 2009).
Les bactéries lactiques constituent un groupe hétérogène, qui n’est pas clairement défini
du point de vue taxonomique. Elles rassemblent en effet un certain nombre de genres qui se
caractérisent par la production, liée à un métabolisme exclusivement fermentaire, de quantités
importantes d’acide lactique à partir des sucres. La fermentation est dite : homolactique si
l’acide lactique est pratiquement le seul produit formé et hétérolactique si d’autres composés
sont aussi présents (acide acétique, éthanol, CO2 …etc.)(LEVEAU et BOUIX, 1993 ; PILET
et al, 2005).
Les bactéries lactiques sont généralement associées aux habitats riches en nutriments
comme divers produits alimentaires (lait, viande, boisson, végétaux), mais d’autres sont aussi
membres de al la flore normale de la bouche, de l’intestin et du vagin des mammifères
(SALMINEN, 2004 et AUDISIO et al, 2010).
1.3.1. Caractéristiques générales des Bactéries Lactiques
La première définition de bactéries lactiques (BL), basée sur la capacité des bactéries de
fermenter et de coaguler le lait, englobait les coliformes et bactéries lactiques. En 1901,
BEIJERINCK observe que les lactobacilles sont des bactéries à Gram positif, ce qui séparera
définitivement les bactéries lactiques (à Gram positif) des bactéries coliformes (STILES et
HOLZAPFEL, 1997).Elles sont à Gram positif, généralement immobiles, asporulées,
catalase négative, oxydase négative généralement nitrate réductase négative. Ce sont des
bactéries anaérobies facultatives. Elles ont des exigences nutritionnelles complexes pour les
acides aminés, les peptides, les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides
fermentescibles (DELLAGLIO et al, 1994 ; HOGG, 2005).
Chapitre Synthèse bibliographique
9
Les BL sont trouvées dans diverses niches écologiques, tel que le lait, ainsi que
certaines nourritures, la bouche, les régions gastro-intestinales et urogénitales des humains et
des animaux (LOPEZ-DIAZ et al, 2000; NAVARRO et al, 2000; EL SHAFEI et al., 2000
et MATHARA et al., 2004).
Les bactéries lactiques sont un groupe hétérogène de microorganismes produisant de
l’acide lactique comme produit principal du métabolisme fermentaire. Selon le type de
fermentation préférentiellement utilisé, les bactéries lactiques sont dites :
- homofermentaire : l’acide lactique est le seul produit de la fermentation du glucose
- hétérofermentaires facultatif : la fermentation du glucose aboutit à la formation d’acide
lactique ou de l’acide lactique et de l’acide acétique
- hétérofermentaires strict : elles produisent, en plus de l’acide lactique, de l’acide acétique ou
de l’éthanol et du CO2
Elles sont classées en plusieurs genres : Aerococcus, Alloiococcus, Atopobium,
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weisella (POT, 2008).
1.3.2. Classification des bactéries lactiques
La classification phénotypique des bactéries lactiques est largement basée sur la
morphologie, le mode de fermentation de glucose, la croissance à différentes températures, la
capacité de croissance à de hautes concentrations de sel (6.5%, 18%), la tolérance aux pH
acides, alcalins et à l’éthanol, la configuration de l'acide lactique produit à partir de glucose,
l’hydrolyse de l’arginine, la formation d’acétone, etc. Les marqueurs chimiotaxonomique
comme la composition en acides gras et les constituants de la paroi cellulaire peuvent aussi
être utiles dans la classification (KÖNIG et FRÖHLICH, 2009). Les BL appartiennent
toutes au groupe des bactéries à Gram positif, mais si la plupart d’entre elles appartiennent au
groupe des bactéries à Gram positif à bas %G+C (phylum des Firmicutes), le genre
Bifidobacterium appartient au groupe des bactéries à Gram positif à haut %G+C (phylum des
Actinomycètes ; Figure 02) (HOLZAPFEL et al, 2001).
L’analyse comparative des séquences d’ARN ribosomal 16S a entrainé des changements
importants dans la taxonomie des bactéries lactiques (SALMINEN et al., 2004).
Chapitre Synthèse bibliographique
10
Figure 1 : Principales voies assurant le transport et le métabolisme du glucose par les
bactéries lactiques (DESMAZEAUD et De ROISSART, 1994).
Chapitre Synthèse bibliographique
11
Figure 2 : Distances phylogénétiques entre les genres principaux constituant les BL basées
sur les séquences des ARNr 16S ARNr, montrant les principaux groupes phylogénétiques de
bactéries lactiques à faible % G+C et les genres Gram positifs non reliés Bifidobacterium et
Propionibacterium (HOLZAPFEL et al, 2001)
D’après LUDWIG et al. (2008), le phylum Firmicutescomprend trois classes : Bacilli,
Clostridia et Erysipelotrichi. Appartenant à la classe Bacilli, les bactéries lactiques sont
divisées en trois familles:
Famille des Lactobacillaceae comportant les Lactobacillus, Paralactobacillus et
Pediococcus.
Famille des Leuconostocaceae contenant les Leuconostoc, Oenococcus et Weissella.
Famille des Streptococcaceae comprenant les Streptococcus, Lactococcus et Lactovum
Historiquement, le genre Bifidobacterium était aussi considéré comme faisant partie du
groupe des bactéries lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et
Chapitre Synthèse bibliographique
12
biochimiques et à sa présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastro-
intestinal (KLEIN et al, 1998).
1.3.4 Principaux genre
La classification actuelle des bactéries lactiques fait apparaître douze genres qui incluent
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Pediococcus, Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella
(STILES et Holzapfel, 1997)
1.3.4.1 Streptococcus
Les cellules de ce genre sont immobiles, sphériques ou ovoïdes qui ont un diamètre
inférieur à 2μm avec une disposition en paires ou en chaines longues. La fermentation des
carbohydrates produit principalement de l’acide lactique mais il n’y a pas de production de
gaz. Le peptidoglycane est du groupe A et leur température optimale de croissance est 37°C.
Elles sont incapables de se développer à 15°C et à pH: 9.6. Beaucoup d’espèces sont
commensales ou parasites de l’homme et des animaux et certaines sont hautement pathogènes
1.3.4.2 Lactococcus
Le groupe de lactocoques correspond aux streptocoques mésophiles de la flore lactique.
Elles sont généralement microaérophiles et se développent à 30°C. Leur fermentation des
sucres est homolactique et donne de l’acide lactique comme produit final.
Les lactocoques peuvent se trouver dans les aliments comme les produits laitiers, elles
sont utilisées dans l’industrie agroalimentaire, les espèces les plus importantes sont:
Lactococcus lactis et Lactococcus cremoris (STILES et HOLZAPFEL, 1997).
1.3.4.3. Leuconostoc
Le genre Leuconostoc a été défini par Van Thieghem en 1878. Ce genre a auparavant
inclus des coccobacilles hétérofermentaires, produisant uniquement de l’acide lactique, et ne
produisant pas d’ammoniaque à partir de l’arginine. Leur température optimale de croissance
se situe entre 25°C et 30°C, et leurs conten G+C sont assez voisins (37 à 45%) (GARVIE,
1986). Leur croissance est toujours lente. Ils ne sont pas hémolytiques ni pathogènes. Ces
espèces sont caractérisées par la production à partir du citrate du lait de diacétyle et parfois
par la synthèse de dextranes et de lévanes extracellulaires en présence de saccharose (Novel
G., 1993).Les études phylogénétiques des Leuconostoc montrent une diversité dans ce genre
(EOM et al., 2007).
Chapitre Synthèse bibliographique
13
1.3.4.4. Enterococcus
Ce genre regroupe les streptocoques fécaux qui représentent une hémolyse de type λ et
β et qui appartiennent au groupe D. Ce sont des commensaux de l’intestin. Les espèces
rencontrées dans l’alimentation sont essentiellement En. Faecalis et les espèces proches. Les
entérocoques sont des coques qui peuvent être mobiles, homofermentaires, généralement
différenciés par la fermentation de l’arabinose et le sorbitol, ils croissent entre 10°C et 45°C
(TAMIME, 2002 ; HO et al, 2007).
1.3.4.5. Lactobacilus
Le genre Lactobacillus représente le plus large groupe des bactéries lactiques, il
contient le plus grand nombre d’espèces qui peuvent êtres isolées de différents biotopes
(humains, animaux, souvent allongés, à Gram positives, parfois groupés en paires ou en
chaines. Elles sont catalase négatives, microaérophiles, non sporulés et habituellement
immobile (photo 01).(SIEGUMFELDT et al,2000).
L’hétérogénéité des espèces est illustrée par le contenu en G + C qui peut varier de 32 à
53 % (SCHLEIFER et STACKEBRANDT, 1983 ; Pilet M-F. et al, 2005).chez les
lactobacilles. Le métabolisme des sucres chez Lactobacillus est hétéro- ou homofermentaire.
Certaines souches sont thermophiles, d’autres mésophiles (NANNEN et al, 1991).Les espèces
homofermentaires strictes fermentent les hexoses en acide lactique en utilisant la voie EMP
(Embden-Meyerhoff Parnas),Ce genre est subdivisé en trois groupes (Tableau 4):
Groupe I : anciennement appelé Thermobacterieum. Ces bactéries ont un métabolisme
strictement homofermentaire (ni les pentoses, ni le gluconate ne sont fermentés). Ces
bactéries possèdent une fructose 1-6 disphosphatealdolase et une phosphofructokinase. Elles
se développent à 15 °c, Lbkefirgranum est voisine de Lb. acidophilus et de Lb. intestinalis,
Lb. Acetotolerans résiste à l’acide acétique Lb. Animalis, Lb odontolyticus, Lb
manihotivorans, Lb. Inerssont des especes récemment définies(LARPENT,2000).
Groupe II: anciennement appelé Streptobacterium. Rassemble les lactobacilles
hétérofermentaires facultatifs et mésophiles qui se développent à 15°C. Les hexoses sont
fermentés par la voie d’Embden-Meyerhof, en produisant exclusivement de l’acide lactique
(mais pour certaines souches : du lactate, de l’acétate, de l’éthanol et du formiate), celle des
pentoses et du gluconate peuvent être dégradés par la voie hétérofermentaire avec une
production d’acide lactique et d’acide acétique par une phosphokétolase inductible. Leurs
cellules sont courtes, souvent arrangées en filaments (BOUTTAZZI, 1988; LARPEN, 2000).
Chapitre Synthèse bibliographique
14
Groupe III : anciennement appelé Betabacterium. Ces espèces ont un métabolisme
strictement hétérofermentaire. La fermentation des hexoses produit de l’acide lactique, de
l’acide acétique (ou de l’éthanol) et du CO2, celle des pentoses, de l’acide lactique et de
l’acide acétique. Ces bactéries possèdent une phosphokétolase (tableau03). C’est un groupe
qui rassemble des espèces relativement hétérogènes, surtout mésophiles. Les cellules sont
courtes, droites et séparées (BOUTTAZZI, 1988).
Photo01 : Observation au microscope électronique du genre Lactobacillus (GAGNON,2007).
1.3.5 Utilisation des lactobacilles en industrie laitière
En fromagerie, les lactobacilles sont généralement utilisés pour la préparation de pâtes
dures ou semi-dures typiques des fromages suisses et italiens (ALICE et SANCHEZ-
RIVAS, 1997). Jusqu'aux années 80, quelques espèces de Lactobacillus étaient considérées
comme des contaminants (Non- Starter Lactic Acid Bacteria ou NSLAB ; BOYD et al, 2000).
Dans les années 1990, plusieurs auteurs ont démontré que ces espèces participaient à
l'affinage des fromages par leur activité protéolytique, et la formation d'arômes qui en résulte
(LANE et al, 1996 ; LYNCH et al., 1996). Cependant, l'arrivée des techniques de traitement
du lait de fromagerie, telle que la pasteurisation à basse température couplée à la
microfiltration, a contribué à une diminution significative dans le lait de ces NSLAB. Cette
constatation a incité les producteurs de ferments fromagers à développer et commercialiser de
nouvelles cultures, dites auxiliaires, contenant des souches de Lactobacillus capables
d'accentuer et d'accélérer l'affinage des fromages (EL SODA et al, 2003).
1.3.6. Effets des lactobacilles sur la santé
Depuis Metchnikoff et ses théories sur l'effet bénéfique des ferments lactiques, l'effet
probiotique de certains lactobacilles a été et est encore largement étudié (ISOLAURI et
al.,2004). Un des effets majeurs des lactobacilles sur la santé humaine décrits dans la
littérature est leur rôle antagoniste vis à vis des bactéries pathogènes (SERVIN, 2004). Les
Chapitre Synthèse bibliographique
15
effets des lactobacilles sur les bactéries pathogènes reposent sur différentes propriétés telles
que la capacité à adhérer aux cellules et d'inhiber ainsi l'adhésion des pathogènes, l'inhibition
de la croissance des pathogènes, la capacité d'entrer en compétition avec les pathogènes pour
les ressources nutritives et la modulation de la réponse immunitaire de l'hôte (REID et
BURTON, 2002). Aujourd'hui, le débat reste encore ouvert sur l'innocuité des probiotiques,
qui pourraient être des opportunistes notamment chez les patients immuno-déprimés
(CANNON et al, 2005).
1.4. Les propriétés antimicrobiennes des bactéries lactiques
On reconnait depuis longtemps, aux bactéries lactiques, la propriété de produire des
substances antibactériennes leur permettant de se développer préférentiellement dans divers
écosystèmes. L’activité antagoniste des bactéries lactiques est due aux métabolites excrétés :
l’acide lactique et autre acides organiques, peroxyde d’hydrogène, Le dioxyde de carbone, Le
diacétyl, La reutérine et les bactériocines (LEVEAU et al. 1991 ; KLAENHAMMER et al.
1994 ; De VUYST et LEROY, 2007).
1.4.1. Les acides organiques
Il est excrété par les bactéries lactiques assurant deux importantes fonctions
antimicrobiennes. Sous leur forme indissociée, ils traversent passivement la membrane
cytoplasmique et pour de fortes concentrations d’acides, le milieu intracellulaire peut
s’acidifier à un point tel que les fonctions cellulaires sont inhibées et le potentiel membranaire
annulé (KASET, 1987 ; KLAENHAMMER et al, 1994).
1.4.2 Le peroxyde d’hydrogène (H2O2)
En présence d’oxygène, les bactéries lactiques sont capables de produire du peroxyde
d’hydrogène par l’action des oxydases, de flavoprotéines et du super oxydedismutase.
Comme les bactéries lactiques ne produisent pas de catalase à cause de l’absence d’une source
hème, cela permet l’accumulation du peroxyde d’hydrogène, mais pas dans des quantités
significatives, parce qu’il est quand même décomposé par des peroxydases et
pseudocatalases. Son effet bactéricide a été attribué à son pouvoir oxydant (SALMINEN et
al. 1998). En effet, JUVEN et PIERSON (1996) ont démontrés son effet cytotoxique sur la
cellule bactérienne qui génère des espèces hautement toxiques, telles que le radical hydroxyle
qui est à la base de l’oxydation des biomolécules (TAYLOR, 2005). De plus certaines
réactions produisant H2O2 font disparaître l’oxygène, créant un environnement anaérobie non
favorable à certains micro-organismes (SALMINEN et al. 1998).
Chapitre Synthèse bibliographique
16
Tableau 04 : les caractéristiques des lactobacillus (GUIROUD, 2003).
V : variable ; R : riboflavine ; P :pyridoxal ; F : acide folique ; B : vitamine B12 ;T :
thymidine ; . : non déterminé ;*voisine de L.trichodes ;**voisine de L. desidiosus ; ***= L.
casie ****= L.rhamnsus ; °= L. tolerans ; L. paracaseitolerans ;°°voisine de L. lechmanii
°°°voisine de L. jugurti.
Chapitre Synthèse bibliographique
17
Le peroxyde d’hydrogène confère aux bactéries lactiques un avantage de compétition
puisqu’il a été démontré qu’elles sont moins sensibles que d’autres bactéries à ses effets, mais
l’effet inhibiteur du peroxyde d’hydrogène reste généralement faible (ADAMS et MOSS,
2008). Le peroxyde d’hydrogène est une substance de préservation utilisée depuis longtemps
pour le lait cru, dans des conditions où il peut être difficile de refroidir le lait rapidement. La
concentration de H2O2 requise est de 300 à 800 ppm (GUIZANI, 2007).
1.4.3. Le dioxyde de carbone
Le dioxyde de carbone est produit principalement par les LB hétérofermentaires. Il peut
jouer un rôle en créant un environnement anaérobie qui inhibe les décarboxylations
enzymatiques, et l'accumulation de CO2 dans la bicouche lipidique de la membrane peuvent
provoquer un dysfonctionnement de la perméabilité (AMMOR et al, 2006). Le CO2 peut
effectivement inhiber la croissance de micro-organismes colonisant de nombreux produits
alimentaires, notamment des bactéries psychrotrophes Gram-négatives (Farber, 1991).
1.4.4. Le diacétyl
Il est produit par des souches de Lc. Lactissub sp. lactisbiovar. Diacetylactis par la
fermentation du citrate (LINDGREN et DOBROGOSZ, 1990 ; COGAN et HILL, 1993). Il
est responsable de l'arôme et de la saveur du beurre et de quelques autres produits laitiers
fermentés. (EARNSHAW, 1992).
Les concentrations nécessaires à l’obtention d’une inhibition sont de l’ordre de 100 ppm,
et sont supérieures à celles présentes dans le beurre et susceptibles de provoquer son arôme (2
à 7 ppm) (CAPLICE et FITZGERALD, 1999).
1.4.5. Reutérine
AXELSSON et al, (1989) ont mis en évidence l’action inhibitrice d’une substance
produite par Lactobacillus reuteri. Cette substance (reutérine) a été purifiée et identifiée. La
reutérine (ou 3-hydroxypropionaldehyde) est une substance antimicrobienne qui est produite
comme métabolite intermédiaire pendant la fermentation anaérobique du glycérol. La
reutérine a un large spectre d’activité. Elle a une action contre les procaryotes (Gram-positif
ou Gram-négatif), les eucaryotes, les virus, les champignons et les protozoaires. Elle interfère
avec la réplication de l’ADN. Elle a des applications aussi bien dans le domaine médical que
dans le domaine alimentaire (VOLLENWEIDER, 2004)
1.4.6. Les bactériocines
La détection de la première bactériocine remonte à 1925 par ANDRE GRATIA qui a
observé que la croissance de certaines souches d'Escherichia coli a été inhibée en présence
d'un composé antibactérien, dont il a donné le nom de colicin V. La découverte d'une
Chapitre Synthèse bibliographique
18
bactériocine chez les lactocoques remonte à 1933. À cette époque, WHITEHEAD (1933)
avait observé dans un lot de lait spécifique que la présence de deux souches de lactocoques
inhibait la croissance d'un ferment de culture fromagère. En 1953, Jacob et al. proposèrent le
terme général « Bactériocine ». Les bactériocines diffèrent de la plupart des antibiotiques
thérapeutiques par leur composition protéique et possèdent généralement une spécificité
d'action étroite contre les mêmes espèces (TAGG et al. 1976). Différentes définitions des
bactériocines ont été données au cours du temps. Cependant, la définition qui reste la plus
largement acceptée est celle de KLAENHAMMER (1988) qui définit les bactériocines
comme des protéines, ou complexes de protéines, avec une activité bactéricide contre des
espèces proches de la souche productrice. Les bactériocines représentent une large classe de
substances antagonistes qui varient considérablement du point de vue de leur poids
moléculaire, de leurs propriétés biochimiques, de leur spectre d’action et de leur mode
d’action (KLAENHAMMER, 1988). Toutes les bactériocines produites par des bactéries
lactiques décrites jusqu’à présent ont une activité dirigée contre les bactéries Gram-positive.
Aucune bactériocine produite par des bactéries lactiques avec une activité contre des bactéries
Gram-négatif n’a été décrite. En effet, la membrane externe des bactéries Gram-négatif ne
permet pas aux bactériocines d’atteindre la membrane interne, siège de leur activité.
Chapitre II
Matériel et méthodes
Chapitre II Matériel et méthodes
20
II. Matériel et méthodes
2.1.1. Matériel
Tableau05 : Les appareillages et petit matériel utilisées
Appareillage petit matériel
Autoclave
Plaque Chauffante
Bain Marie
Réfrigérateur
Balance Electrique Etuve
Centrifugeuse
Micropipette
pH-mètre
Hotte
Four pasteur
Boite de Pétri
Pipette Pasteur
Tube à Essai
Tube Eppendorf
Tube de centrifugation
Erlen Meyer
Pipettes Graduées
Tube à Hémolyse
2.1.2. Milieux de culture
Milieu MRS (gélosé +bouillon)
Milieu MRS-ev-BCP
Milieu de falkow
Gélose nutritive
Bouillon nutritive
Milieu Müller-Hinton
Lait écrémé
2.2. Méthodes
2.2.1. Provenance de l'échantillon du lait
L’échantillon de lait cru de chamelle provient de la région de Hassi Messaoud wilaya
d’Ouargla. Il a été prélevé dans des conditions d’asepsie dans des flacons stériles de 250 ml.
Le lait est conservé à 4 °C au niveau de laboratoire.
2.2. Souches bactériennes utilisées
2.2.1. Souches pathogènes
Pour les tests de l'activité antibactérienne, nous avons utilisés quatre souches
bactériennes pathogènes. Ces bactéries sont fréquemment les plus isolées au niveau des
laboratoires d’analyses médicales d’Ouargla :
Chapitre II Matériel et méthodes
21
Tableau06 : Les souches pathogènes utilisées
Souches
pathogènes Prélèvement Provenance Milieu d'isolement
Escherichia coli. Urinaire Centre Médical de Diagnostic et
Analyses Médicales Ibn Sina C.L.D gel
Staphylococcus
aureus Vaginale Centre Médical de Diagnostic et
Analyses Médicales Ibn Sina
Gélose de sang / C.L.D
gel
Pseudomonas sp. Urinaire Centre Médical de Diagnostic et
Analyses EL-Morchid C.L.D gel
Streptococcus sp. Vaginale Centre Médical de Diagnostic et
Analyses EL-Morchid
Gélose de sang / C.L.D
gel
2.2.2. Isolement et culture des Lactobacilles
L’échantillon du lait est répartie en tube stériles à raison de 10 ml par tube .des dilutions
décimales (10-1
-104) du lait sont réalisé dans l'eau physiologiques à partir de 1 ml de la
suspension mère. 1ml de chaque dilution et ensemencé dans la masse de milieu MRS gélosé
puis les boites sont incubés à deux température comme suit :
Tableau07 : isolement des bactéries lactiques (BADIS et al, 2004)
Milieux d’isolement Bactéries T °C/durée Incubation
MRS Lactobacillus 37 °C/24-72h aérobiose /anaérobiose
MRS Lactobacillus 30 °C/24-72h aérobiose /anaérobiose
T°C : température optimale de croissance.
2.3. Purification et conservation des souches
Après la croissance bactérienne,2 à3 colonies sont prélevés et sur les quelles on effectue
une coloration du GRAM et une recherche de la catalase .Seules les bactéries Gram +, de
forme bacillaire et catalase – sont retenues et repiquées sur milieu MRS gélosé. Après
purification, les souches sont conservées par deux méthodes :
Conservation à courte terme il s'agit d'une conservation des bactéries dans des tubes de
gélose MRS inclinée. Après l’incubation entre 30 °C et 37 °C pendant 24h, les tubes sont
conservée à +4 °C (SAIDI et al. 2002)
Chapitre II Matériel et méthodes
22
Conservation à longue terme à partir d'une culture bactérienne de 18à 48 h sur milieu
liquide, les cellules sont récupérées par centrifugation à 4000t/min pendant 10min.aprés avoir
éliminé le surnageant, les cellules sont lavées deux Fois avec de l'eau physiologique stérile le
culot est additionné au milieu de conservation (70% de lait écrémé et 30% de glycérol). Le
mélange est conservés à - 20°C dans des tubes Eppedorf (SAIDI et al. 2002).
Observation maroscopique
Purification et Conservation Identification
Échantillon de lait chamelle
Dilutions décimales
1 ml
Incubation 37 °C à24-72h
Incubation 30 °C à 24-72h
à24-72h Milieu MRS
10-4
1 ml 1 ml
10-3
10-2
10-1
Figure (03) : Protocole d’isolement des souches lactiques
Chapitre II Matériel et méthodes
23
2.4. Identification des isolats
2.4.1. Critères morphologique
Caractéristiques macroscopiques
L’examen macroscopique est portée sur l’observation macroscopique qui permet de
décrire l’aspect des colonies bactériennes (la forme, taille, pigmentation …)
Caractéristiques microscopiques :
La coloration de Gram a été utilisée pour classer les bactéries selon leur Gram et leur
morphologie sous microscope optique.
2.4.2. Critères physiologique et biochimique
Test de la catalase
Le test catalase sert à démontrer si la bactérie possède le catalase servant à décomposer
le peroxyde d’hydrogène. L’activité catalytique consiste à prélever une colonie sur gélose
MRS et dissociée dans une goutte d'eau oxygénée (H2O2). L’apparition de bulles d’air
révèlent le dégagement d'oxygène, la souche est dite catalase positif (AHMED et IRENE,
2007).
Type fermentaire
Ce test permet de classer les bactéries en hétérofermentaires ou homofermentaire. On
ensemence abondamment un tube de 10 ml de bouillon MRS par la souche étudiée, dans le
milieu on introduit une cloche de Durham, le CO2 dégagé par les bactéries hétérofermentaire
s’accumule dans la cloche après l’incubation 30 °C et 37 °C pendant 24 à 48h.
Croissance en présence de 6.5 % de Na Cl
Un tube de 10 ml de MRS à 6 ,5% de Na Cl est ensemencé par un quelques gouttes de
la culture bactérienne et incubé à 30 °C ou 37 °C pendant 2 à 3 jours. La croissance est
comparée à celle d’un tube témoin sans de bactéries. La croissance bactérienne se traduit par
la formation des troubles. (GUIRAUD. 2003)
Croissance à différentes température
Ce test est important car il permet de distinguer les bactéries lactiques mésophiles des
bactéries lactiques thermophiles (LEVEAU et al ., 1991). L’aptitude à la culture est testée à
Chapitre II Matériel et méthodes
24
10 °C ,15 °C, 37°C et 45 °C pour lactobacilles et sur milieu MRS liquide (MAN et al. 1960)
.La croissance est appréciée par l’apparition d’un trouble.
Hydrolyse de l’arginine (ADH)
Elle est mise en évidence sur milieu ADH (milieu de Falkow). Pour chaque souche
isolée ensemencé, un tube et un tube témoin (milieu sans arginine), recouvrir le milieu avec
une goutte d’huile de paraffine stérile. Après 2 à 4 jours d’incubation à 30 °C et 37 °C, la
culture dans la tube témoin se manifeste par un virage au jaune du à l’acidification du milieu
(métabolisme de glucose) (LARPENT –GOURGAUD et al. 1997 ; CARR et al. 2002). La
dégradation de l’arginine, aboutissant à la formation d’ammoniaque, est révélée par
L’alcalinisation du milieu qui devient vert.
Fermentation des sucres
Il s’agit d’apprécier l’aptitude des souches à métaboliser divers substrats carbonés en
particulier les sucres. Ce test est réalisé en galeries classiques des tubes sur bouillon MRS
sans extrait de viande (MRS-ev -BCP) selon LEVEAU et al. (1991) additionné d’un
indicateur de pH (bleu de bromotymol 0 .04% ) ,le glucose du milieu MRS est remplacé par
les hydrates de carbone à tester , les solutions des sucres (maltose ,fructose , xylose , lactose ,
galactose , glucose , arabinose , saccharose , rhamnose ,raffinose ) sont stérilisées, après ils
ont introduit dans le milieu avec une concentration finale de 1% .Une culture bactérienne de
24h et centrifugée à 4000 tr /min pendant 20min, le culot est rincé 2 fois à l’eau physiologique
stérile, une suspension est réalisé avec l’eau physiologie stérile 0,1ml de cette suspension est
ensemencé dans 2ml de milieu MRS-ev-BCP- sucre dans des tubes stériles ou sur plaque
d'ELISA .Après l’incubation pendant 48h à 72 h, le développement de la culture et le virage
au jaune de l’indicateur coloré et l'acidification du milieu traduit la fermentation du sucre.
Chapitre II Matériel et méthodes
25
Sans extrait de Viande
+ Bleu bromotymol
+Solution de sucre
0 .1ml
Sucres
les souches
PLQUE d’Elissa
Figure(04) : protocole de fermentation des hydrates de carbones.
Culture bactérienne de 24h
Centrifugation
4000tr /min pendant 15min
Rinçage 2 fois du culot
Suspension
Culot + l’eau physiologique
Milieu MRS
MRS -ev
MRS -ev BCP
Recouvrir avec de l’huile de vaseline
Incubation 48h-72h
Virage au jaune de l’indicateur
=Fermentation de sucre
Chapitre II Matériel et méthodes
26
2.5.Étude de l’activité antibactérienne des souches bactériennes isolées
Cette étude est réalisée par la méthode indirecte des puits préconisée par BAREFOOT
et al. en (1983). La méthode consiste à mettre le surnageant de la souche lactique en contact
avec la souche indicatrice pathogène .Les souches lactiques produisent des substances
pouvant diffuser dans le milieu de culture solide. Les bactéries lactiques sont repiquées dans
le milieu MRS liquide et incubées pendant une période de 18h à30°C et 37°C. Après
incubation une centrifugation réfrigérée (4°C) est réalisée à 4000 tr /min pendant 15min. Des
puits de 5mm de diamètre sont creusés stérilement à l’aide de pipette de Pasteur sur la gélose
MULLER-HINTON inoculé par la souche inductrice (pathogène). Les puits100ul du
surnageant de la culture lactique. Les boites de pétri sont mises à une température de + 4 °C
/4h pour permettre la bonne diffusion de la substance antimicrobienne (DOUMADJI et al. ,
2010). Les boites sont incubées à 37 °C. La présence de zone inhibition formées autour des
puits est examinée après 24h à48 h d'incubation (HWANHLEM et al.2011).
Culture de la
souche isolée l18h
100 µl de surnageant
Surnageant
Centrifugation 4 °C à
4000tr/ Pd15 min
Culot Milieu Muller - Hinton
ensemence avec de souche
indicatrice
Incubation
24h à 37°C
Zone d’inhibitrice
Figure :( 05) Recherche des substances
antimicrobiennes
Culture bactérienne
Chapitre II Matériel et méthodes
27
2.6. Mesure de diamètre des zones d'inhibition
L'effet antibactérien des surnageant des lactobacilles isolées est mis en évidence par
l'apparition d'une zone d'inhibition (zone claire) autour du puits. La lecture de l’activité
inhibitrice se fait par la mesure du diamètre d’inhibition autour du puits (Zi), exprimée en mm
(ALLOUACHE et al . , 2010).
Une inhibition est considérée positive si le diamètre est supérieur à 2 mm THOMPSON
et al, (1996) cité par DOUMANDJI et al (2010). La mesure du diamètre d’inhibition (Zi) est
effectuée selon la formule suivante:
Zi en (mm) = diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm) – diamètre de puits (9 mm)
2.7. Détermination de la nature des substances antimicrobiennes
Les inhibitions de la croissance des souches indicatrices peuvent être dues à
l'acidification de milieu, à la présence de phages, à la synthèse de bactériocines ou à la
production de peroxyde d'hydrogène .Ce dernier son effet est exclu car la plupart des souches
indicatrices pathogènes utilisées sont catalase + (sauf la souche Streptococcussp.qui est
dépourvue d'une catalase).
2.7.1. Inhibition due à la production d'acides organiques
L'étude de l'effet des acides organiques sur la croissance des souches pathogènes est
réalisée en milieu MRS tamponné (ph est ajusté à 7 par l'emploie d'un tampon phosphate de
0.1 M).Nous avons procédé à la même technique de BAREFOOT et al. (1983) puis la lecture
des boites se fait après incubation à 37°C pendant 24h .la lecture est réalisée par
comparaison avec le milieu témoin non tamponné on notant la présence ou l'absence des
zones d'inhibition.
2.7.2. Inhibition due à la présence de phage lysogène
Nous avons effectué ce test pour mettre en évidences la supposition d'une inhibition
causés par les phages bactériens. A l'aide d'une pipette pasteur on découpe un fragment de
zone d'inhibition et on le suspendre dans une solution constitué par 1 ml de tampon phosphate
stérile à 0.1 M et de 50 µl de chloroforme. Après agitation et décantation, on prélève300µl
de ce mélange et on l'ajoute à 7.5 ml de gélose molle contenant 0.1ml de souche indicatrice.
Le milieu est coulé dans des boites de pétri et incubé à 37°C pendant 24à 48h. La présence de
plaque de lyse indique la présence de phage (MAMI, 2013).
Chapitre II Matériel et méthodes
28
2.7.3. Inhibition due à la présence de substance protéique
2.7.3.1. Action de protéase : Le surnageant des souches lactiques sont traités par la pepsine
dont l'enzyme (250 µl) est mélangé avec le surnageant (500 µl) puis l'activité résiduelle du
surnageant est testé on utilisant la technique des puits après 24h d'incubation à 37°C. La
présence ou l'absence des zones d'inhibition est marqué.
2.7.3.2. Stabilité thermique: l'effet de température sur l'activité antibactérienne des
surnageant est étudier après chauffage chauffé à 100°C pendant 30min au bain marie.
L'activité résiduelle est testée par la technique des puits après 24 h d'incubation.
Chapitre III Résultats et discussion
Chapitre III Résultats et discussion
30
3.1. Isolement et culture des Lactobacilles
3.1.1. Aspect macro et micro des Lactobacilles isolées
On a isolé 14 souches lactiques après l’incubation à 30 °C et 37 °C pendant 48h. Les
cellules obtenus sur milieu MRS solide ont des formes (Ovale, Ronde, Bacille) et de couleur
Blanchâtre ou Crème. La taille est d'environ 1mm à 2.5mm. Après coloration de GRAM et
test de catalase on a criblé 04 souche ayant un Gram positif ( photo04 ), catalase négatif et
de forme bacillaire (tableau 07 ) .les souches poussent également sur MRS liquide ( photo 02
),La croissance en milieu MRS liquide est caractérisée par l’apparition du trouble au fond du
tube (KIHAL, 1996 ; CARR et al. ,2002) . Les souches sont par la suite soumises à une série
de tests d’identification morphologiques, physiologiques et biochimiques.
Tableau 08: Critères morphologiques, la coloration Gram et le test de la catalase des
quatre isolats
Code de souche Gram Catalase Forme
S1 + - Bâtonnet
S2 + - Bâtonnet
S3 + - Bâtonnet
S4 + - Bâtonnet
S1 S2 S3 S4
Photo (02) : Aspect macroscopique sur milieu MRS des souches de Lactobacillus après 24h
d’incubation à 30 °C- 37 °C.
S1 S2 S3 S4
Photo (03) : Observation microscopique des souches Lactobacillus après la coloration de
Gram (Gx100)
Chapitre III Résultats et discussion
31
Figure (06) : Distribution du pourcentage des isolats lactiques sur milieux MRS solide
La présence de divers genres de bactéries lactiques dans le lait de chamelle était
prévisible car des bactéries lactiques ont été trouvées dans la microflore de tous les laits,
quelle que soit l’origine de ces laits (ovine, caprine, bovine, …). Les résultats de notre étude
indiquent que les lactobacilles sont présents dans l'échantillon du lait camelin étudié avec un
pourcentage important (28 .58%) à l'égard des autres souches lactiques. Les études de
KHEDID et al.2009 ont montré, après analyse de la flore du lait de chamelle des régions
arides du Maroc, que le plus grand nombre d'espèces présentent dans les laits analysés
appartenaient au genre Lactobacillus .alors que le genre lactobacillus ne présente que 18,5 %
des bactéries lactiques isolées à partir d'un échantillon du lait camelin issue des régions de
Timimoune et Béchar (Sud-ouest algérien) étudiée par KARAM et al. En 2005. Cela est sans
doute relier avec les conditions alimentaires des animaux.
3.2 .L’identification physico-chimique des isolats
Les quatre souches isolées ont soumis à une série des tests d’identification.
Type fermentaire
Le résultat de type fermentaire indiquent que les souches 01 ,02et 03 sont
hétérofermentaires alors que la souche 4 est homofermentaire (Photo04).
Photo (04) : Test de type fermentaire des souches (S1 ; S2 ; S3 et S4)
lactobacille28,58
autres bactéries lactiques
71,42
T S4 S1 S2 S3
Chapitre III Résultats et discussion
32
Croissance en milieu hyper Salé à 6.5% NaCl
Nous avons remarqué que toutes les souches testées n’ont pas poussé sur milieu MRS
en présence de 6 .5% de Na Cl. (photo 05).
Photo (05) : Croissance en présence 6.5% Na Cl pour les souches S1 ; S2 ; S3 et S4
Croissance à différentes températures
Cette étude est réalisée à 10 ,15 ,37 et à 45°C pendant 24h (BADIS et al. 2004). Ce
test permet de faire la différence entre la flore thermophile et mésophile. Les quatre souches
isolées poussent bien à 15 °C et 45 °C après 24h d’incubation, sauf la souche 04 qui ne pousse
pas à 15°C. Donc les souches (01 ,02 et 03) sont de type mésophile CARR et al (2002)
alors que la souche S4 est qualifiée thermophile.(Tableau09).
Tableau09 : Croissance à différentes températures des 04 souches isolées.
Souche 10 °C 15 °C 37 °C 45 °C Type
S1 + + + - Mésophile
S2 + + + - Mésophile
S3 + + + + Mésophile
S4 + - - + Thermophile
Photo (06) : Croissance en température 10 °C des souches S1 ; S2 ; S3 et S4
T S1 S2 S3 S4
Chapitre III Résultats et discussion
33
Photo (07) : Croissance en température 15 °C des souches S1 ; S2 ; S3 et S4
Photo (08) : Croissance en température 37 °C des souches S1 ; S2 ; S3 et S4
Photo(09) : Croissance en température 45 °C des souches S1 ; S2 ; S3 et S4.
Le test de l'ADH
L’activité de l’arginine déshydrogénase est effectuée sur les quatre souches, sur milieu ADH
(base de falkow) et sur milieu M16 au bleu de bromotymol. La souche (01,02 et03) n’ont pas
la capacité d’hydrolyser l’arginine donc dépourvues d ’ADH .alors que seule la souche S4
qui est ADH positive, possédant l’ADH (photo 11 et 12).
T S1 S2 S3 S4
T S1 S2 S3 S4
Chapitre III Résultats et discussion
34
Photo (10) : Test d’ADH sur milieu M16 au bleu de bromatémol
Photo (11): Test d’ADH sur milieu ADH (base de Falkow)
La fermentation des hydrates de carbones
L’identification est complétée avec l’étude de la fermentation des hydrates de
carbones par les souches isolées. Les résultats ont été présentés dans le tableau(10) et les
photos (12 ,13)
Tableau10: Profils fermentaires des isolats (+ : dégrade le sucre, - : ne dégrade pas le sucre,
ND : non déterminé)
Souches
Sucres
Souche 01 Souche 02 Souche 03 Souche 04
Xylose(XY) + - + +
Rhamnose(RH) + + + -
Sorbitol(SO) + + + ND
Lactose(LA) - - - ND
Arabinose(AR) - + + ND
D- Mannitol (D-L) + + + -
Saccharose(SA) - - + +
Threalose(TR) - + - +
Glucose(GL) + + + -
Maltose(MA) + + - +
Sucrose(SUC) - - - ND
T S1 S2 S3 S4
T S1 S2 S3 S4
Chapitre III Résultats et discussion
35
T
S1
S2
S3
Photo (12) : Test de fermentation les sucres de souche 01 ,02 et 03.
Photo(13): Test de fermentation les sucres de souche
Tableau 11: Caractéristiques biochimiques et physiologiques des quatre souches isolées.
Souche
Test
S1 S2 S3 S4
Tes
t p
hysi
olo
giq
ue
Type
fermentaire
Hétérofermentaire Hétérofermentaire Hétérofermentaire Homofermentaire
Croissance
sur milieu en
présence
NaCl
- - - -
Croissance à
10 °C + + + +
Croissance à
15°C + + + -
Croissance à
37 °C + + + -
Croissance à
45 °C - - + +
Hydrolyse
Arginine - - - +
Tes
t
bio
ch
imiq
u
e
Xylose + - + +
Rhamnose + + + -
Sorbitol + + + ND
XY RH SO LA AR D-L SA TR GL MA SUC
T XY RH SO LA AR D-M SA TR GL MA SU
Chapitre III Résultats et discussion
36
Lactose - - - ND
Arabinose - + + ND
D-Mannitol + + + -
Saccharose - - + +
Threalose - + - +
Glucose + + + -
Maltose + + - +
Sucrose - - - ND
L’identification de l’espèce repose sur la comparaison de divers caractères
phénotypiques de la souche à étudier vis-à-vis de ceux d’une souche de référence (VANDEN
BERG et al, 1993; CARR et al, 2002; PARADA et al, 2007).L’identification des souches
isolées est basée sur leurs profils fermentaire, elles sont classées comme suit selon
GUIRAUD(2003) :
La souche S1 (Lb1) est une souche mésophile, ADH – et incapable de dégrader ni le
lactose ni l'arabinose. C'est une souche hétérofermentaire fait partie au groupe
Betabacterium des lactobacilles. elle est classée parmi l'espèce Lactobacillus viridiscens.
La souche S2 (Lb 2) est une souche hétérofermentaire, ADH- et mésophile. elle fermente
le glucose, l'arabinose et le mannitol. Elle est classée dans le groupe de Betabacterium parmi
l'espèce Lactobacillus hilgardii.
La souche S3 (Lb 3) est mésophile, ADH – et hétérofermentaire. Elle dégrade le saccharose
et le glucose et ne fermente pas le lactose, on l'a classée comme Lactobacillus cellobiosus.
La souche S4 (Lb 4) est une souche thermophile, ADH+ et capable de dégrader la majorité
des sucres utilisés .Elle est classée dans le groupe Thermobacterium des lactobacilles parmi
l'espèce Lactobacillus delbrueckii.
3.4. Activité antibactérienne des lactobacilles isolés
Le lait de chamelle est un aliment clé des zones arides et semi-arides ou il couvre leur
besoins nutritionnels qualitatifs et quantitatifs. Les peuplades nomades anciennes imaginent
que le lait de chamelle à plusieurs vertus thérapeutiques. Cette observation empirique à été
scientifiquement démontrée, il a une forte activité antimicrobienne par rapport à celle des
autres mammifères et sa capacité à inhiber les Gram positif et Gram négatifs pathogènes qui
préoccupe la sécurité alimentaire (BARBOUR et al. 1984).
Dans le présent travail, Les quatre souches isolées du lait chamelle ont été testées pour
leur capacité à inhiber des bactéries pathogènes à Gram négatif : Escherichia coli,
Pseudomonas sp. Et des souches à Gram positif : Staphylococcus aureus et Streptococcussp.
L’agent inhibiteur a été recherché dans le surnagent de culture des quatre souches lactiques
Chapitre III Résultats et discussion
37
suivant la méthode de diffusion à partir des puits préconisée par BAREFOOT et al. en 1983.
Après un délai de 24h on a remarqué que l’activité inhibitrices des souches est présente dans
leur surnagent, ce qui confirme que la substance inhibitrice est secrétée à l’extérieur de la
cellule. Les souches étudiées sont douées d'une activité antibactérienne vis -à- vis les
souches pathogènes utilisées (Photo15, 16,17) et les diamètres des zones d'inhibition sont
mesurées (tableau 11).
Photo(14) : Inhibition obtenue par les souches (Lb1, Lb2 et Lb3) vis -à-vis E.coli
Photo(15) : Inhibition obtenue par les souches (Lb2, Lb3) vis-à-vis Streptococcussp.
Photo(16) : Inhibition obtenue par les souches (Lb1, Lb3) vis –à-vis Staphylococcus aureus
Zone d’inhibition
Lb1 Lb2 Lb3
Zone d’inhibition
Lb2 Lb3
Lb1 Lb3
Zone d’inhibition
Chapitre III Résultats et discussion
38
Tableau12 : mesure le diamètre de zone inhibition des souches lactobacilles
Les souches Diamètre de la zone d’inhibition en mm
indicatrices
inhibitrices
E. coli Staphylococcus
aureus
Streptococcus. Sp Pseudomonas sp.
Lb 1 33 1 0 0
Lb 2 11 0 10 0
Lb 3 4 3 2 0
Lb 4 0 0 0 0
L’inhibition est notée positive lorsqu’elle est supérieure à 1 mm selon SCHILLINGER et
LUCKE (1989).D'après cette étude, les diamètres de zones d'inhibition varient de 1 à 33 mm
alors les inhibitions sont notés positifs.
D'après les résultats d'inhibition on note que Les souches Lb1, Lb2 et Lb3 ayant une activité
antibactérienne vis –à –vis les souches E. coli, Staphylococcus aureus et Streptococcus sp. La
croissance de Staphylococcus aureus et la croissance d’Escherichia coli sont inhibés par le genre
Lactobacillus avec un spectre d’activité important avec un diamètre de 10 mm selon
BELARABI en 2012.
La souche Lb4 ne présente aucune activité antibactérienne contre les souches pathogènes
utilisées. Alors n'a aucun effet antagoniste vis-à-vis ces souches.
Les quatre souches de lactobacilles n'ont pas une activité antibactérienne vis –à-vis la
souche Pseudomonas sp. Alors que La souche pathogène la plus inhibée par les trois souches
lactiques est E.coli .l'inhibition des souches d'E.coli par certains souches de genre Lactobacillus a
été déjà décrite par plusieurs travaux (TODOROV et al. , 2004 et KARTHIKYEN et SANTOS
,2009).
Identification de la nature de l'agent antibactérien des Lactobacilles
L'inhibition des bactéries pathogènes par les bactéries lactiques peut avoir plusieurs
origines parmi lesquelles, nous pouvons mentionner la production d’acides organiques, de
peroxyde d’hydrogène, de phages et/ou de bactériocines (GUESSAS et al., 2005 ; Todorov
et DICKS, 2005; Moreno et al., 2000; Navarro et al., 2000; Rodriguez et al., 2002;
MALDONADO et al., 2003 ).
L’inhibition due aux acides organiques
L’évaluation des résultats obtenus avec le milieu MRS normal (non tamponné) et le milieu
MRS tamponné à pH 7 nous ont permis de déterminer si la production d’acides est un facteur
Chapitre III Résultats et discussion
39
actif des inhibitions enregistrées. Le milieu tamponné (tampon phosphate de sodium 0,1 M,
pH 7) maintient le pH constant (SAMBROOK et al. ,1986) afin d'éliminer l'effet de l'acidité
produite dans le milieu.
L’inhibition d'E.coli par acides organiques
Tableau13 : mesure de diamètre de zone inhibition des souches lactobacilles sur E.coli à
milieu MRS normal et MRS tamponné
Les souches
les milieux
Lb1 Lb2 Lb3
MRS (pH 6.2) 17mm 9mm 2mm
MRS tamponné (pH 7) 4mm 0mm 0mm
Photo(17) : Activité antibactérienne de surnageant de lactobacilles (MRS Témoin et MRS
non taponne) contre E .coli
Le résultat d’inhibition contre E.coli par les surnageant (de milieux MRS tamponné et MRS
non tamponné) ont montré clairement que Lactobacillus viridiscens(Lb1) inhibe la souche E.
coli même en milieu tamponné mais la zone d'inhibition obtenue par le surnageant normale
était grande que celle obtenue par le surnageant de milieu tamponnée. Alors le surnageant
de Lb1 contiens des substances inhibitrices de nature acides organiques ainsi que d'autres
substances, cette résultat a été décrit par plusieurs travaux (TODOROV et al, 2004 ;
KARTHIKEYAN et SANTOSH, 2009 ; MAMI, 2013).
Alors que les zones d'inhibition obtenue par des surnageant des souches lb2 et lb3 sont
disparues sur milieu MRS tamponné, cela s'explique par le fait que les souches lb2 et lb3
inhibent la souche E.coli par production des acides organiques (photo 17) et (Tableau 13 ) .
Zone d’inhibition
Lb1 Lb2 Lb3
T N
T
N
T
N
Chapitre III Résultats et discussion
40
L’inhibition de Streptococcus sp par acides organiques
Tableau14 : mesure de diamètre de zone inhibition des souches lactobacilles sur
Streptococcus sp. Sur milieu MRS Témoin et MRS tamponné
Les souches
les milieux
Lb2 Lb3
MRS (pH6.2) 3mm 4mm
MRS tamponné (pH 7) 0mm 2mm
Photo(18) : l’activité antibactérienne de surnageant de lactobacilles (MRS normal et MRS
non taponne) contre Streptococcus sp.
Les résultats montrent que la souche Lb1 inhibe la souche Streptococcus sp. Par production
des acides organique car aucune zone d'inhibition obtenue par MRS tamponné n'a été
marquée .la souche Lb3 inhibe la croissance de Streptococcus sp. Par production des acides
organiques et d’autres substances antimicrobiennes car la zone d’inhibition est présent sur
MRS tamponné mais avec un diamètre réduit (Photo18)
L’inhibition de Staphylococcus aureus par production des acides organiques
Tableau15 : mesure diamètre de zone inhibition des souches lactobacilles sur Staphylococcus
aureus sur milieu MRS Témion et MRS tamponné
Les souches
les milieux
Lb1 Lb3
MRS (pH 6.2) 2mm 4mm
MRS tamponné (pH 7) 0mm 0mm
Zone d’inhibition
T
N
T
N
Lb2 Lb3
Chapitre III Résultats et discussion
41
Photo(19) :l’activité antibactérienne de surnageant de lactobacilles (MRS normal et MRS non
taponne) contre Staphylococcus aureus
Les souches Lb2 et Lb3 ont une activité antibactérienne par production des acides organiques
vis –à-vis la souche Staphylococcus aureus parce que les zones d'inhibition contre cette
dernière sont disparues par l'utilisation des surnageants de MRS tamponné. (GUESSASet al.,
2005) ont affirmé que l’activité antagoniste des LB contre Staphylococcus aureus est due
majoritairement à la diminution du pH résultante de la production des acides organiques.
L’inhibition due au bactériophage
Plage de lyse
Photo (20) résultat de présence des bactériophages contre Staphylococcus aureus
Les phages peuvent être l'origine des inhibitions dans la croissance bactérienne (DAVIES ET
GASSON, 1980), Le test des phages s’est révélé négatif pour les souches pathogènes
utilisées, aucune plage de lyse n’est apparue après incubation. Sauf sur la souche
Staphylococcus aureus où on a marqué la présence de plage de lyse (photo 21) alors la
souche de Staphylococcus aureus utilisée possède des phages lysogènes.
Zone d’inhibition
T
N
T
N
Lb1 Lb3
Chapitre III Résultats et discussion
42
L'inhibition due à une substance de nature protéique
D'après Les résultat obtenus, après traitement des surnageants avec l’enzyme pepsine et
chauffage du surnageant à 100°C pendant 30 min, on a constaté que l'inhibition des souches
pathogènes utilisés peut être due à la présence des bactériocines. Les bactériocines sont des
substances protéique produites par la bactérie lactique et secréter dans le milieu extérieur
(HUGAS et al. 2003).Si le halo d’inhibition disparait en présence de l’action d’une enzyme
protéolytique, l’agent inhibiteur est de nature protéique (Callewaert et De VUYST, 2000;
ASLIM et al. 2005).
Inhibition Sur E. coli :
Tableau 16 : Détermination la nature de substance inhibitrice traitée par le chauffage et la
pepsine contre E.coli
Surnageant
Lactobacilles
Surnageant traité
par pepsine
Surnageant chauffé
à 100°c pendant
30min
Surnageant
Témoin
Lb1 - - +
Lb2 - - +
Lb3 - - +
S p c
P s s
C c p
Lb1 Lb2 Lb3
Photo (21): l’inhibition du surnageant (S : normal, C : chauffé et P : traité par enzyme
pepsine) de lactobacille contre E. coli
Notre résultat montre clairement que les surnageants de lactobacilles Lb1, Lb2 et Lb3
perdre leur activité inhibitrice contre E .coli après chauffage et traitement par la pepsine.
Donc les trois souches produisent des substances de nature protéique vis- à-vis E. coli.
(Photo21) et (Tableau16).
Zone d’inhibition
Chapitre III Résultats et discussion
43
Inhibitions vis –à-vis Staphylococcus aureus et Streptococcus sp.
Tableau 17 : Détermination de la nature de substance inhibitrice traitée par le chauffage et la
pepsine contre Staphylococcus aureus.
Surnageant
Lactobacilles
Surnageant traité
par pepsine
Surnageant chauffé
à 100°c pendant
30min
Surnageant
Témoin
Lb1 + - +
Lb3 + + +
Photo (22) : l’inhibition du surnageant (S : normal, f : chauffé et p : traité par enzyme
pepsine) de lactobacille contre Staphylococcus aureus.
Tableau 18 : Détermination la nature de substance inhibitrice traite par le chauffage et la
pepsine contre Streptococcus sp.
Surnageant
Lactobacilles
Surnageant traité
par pepsine
Surnageant chauffé
à 100°c pendant
30min
Surnageant
Témoin
Lb2 + + +
Lb3 + - +
S
Zone d’inhibition
Lb1 Lb3L Lb3
p
C
S
p
C
Chapitre III Résultats et discussion
44
Photo (23) : l’inhibition du surnageant (S : normal, C : chauffé et P : traité par enzyme
pepsine) de lactobacille contre Streptococcus sp
La souche Lb 1 a perdu son activité inhibitrice sur Staphylococcus aureus après
traitement thermique, alors que le traitement avec la pepsine n'a aucun effet sur la substance
produite. Cette inhibition est peut être due alors à une substance protéique de nature
bactériocine insensible à la pepsine. Alors que la substance inhibitrice produite par la souche
Lb3 vis-à-vis Staphylococcus aureus ne peut être jamais de nature protéique car le traitement
thermique et enzymatique n'ont aucun effet sur son activité.
Les résultats montrent que la souche Lb2 produit une substance non protéique contre
Streptococcus sp.
Car l'activité antibactérienne de la souche n'était pas sensible à l'effet de chauffage et de
traitement enzymatique. La souche Lb3 inhibe la croissance de Streptococcus sp. Par
production de substance de nature protéique insensible à l'effet de la pepsine.
Les bactéries Gram+ sont généralement plus sensibles à l’effet bactéricide des bactéries
lactiques, Les bactériocines sont surtout actives sur les pathogènes à Gram+ et agissent en
formant des pores dans la membrane cytoplasmique qui entraînent des perturbations des
fonctions cellulaires (LABIOUI et al. 2005).
D'après les résultats de détermination de la nature de l'agent antibactérien on a constaté que :
Les trois souches lactiques isolées (Lactobacillus viridiscens Lb1, Lactobacillus
hilgardii Lb2 et Lactobacillus cellobiosus Lb3) sont douées d'une activité
antimicrobienne par production des acides organiques, de peroxyde d'hydrogène et
/ou production des bactériocines.
L'inhibition et la nature des agents antibactériens produits par les trois lactobacilles
Lb1, Lb2 et Lb3 se diffèrent contre les souches pathogènes utilisés.
Les trois souches lactiques produisent des acides organiques et une substance de
nature protéique inhibant la croissance de la souche E. coli. , et comme les
Zone d’inhibition
Lb2 Lb3
S
p
C
S
p
C
Chapitre III Résultats et discussion
45
bactériocines sont de nature protéique et sont sensibles à l'effet des protéases, sa nous
permettra de classer la substance inhibitrice produite comme bactériocine.
Streptococcus sp.est inhibée par des acides organiques produites par les souches Lb1
et Lb3 ainsi que par une substance thermosensible de nature protéique produit par
Lb3, ou bien par l'effet de l' H2O2qui son effet n'est pas négligeable car la souche est
catalase négative, le peroxyde d'hydrogène peut être une origine d'inhibition chez les
bactéries lactiques selon (MORENO el al 1999).
Staphylococcus aureus est sensible à l'effet des acides organiques produites par les
souches Lb2 et Lb3,à l'effet des bactériophages ainsi que l'effet d'une substance
protéique thermosensible produit par la souche Lb1.
Il est à noter que parmi les 4 souches des lactobacilles isolées dans cette étude, 3 souches ont
un effet antagoniste contre les bactéries indésirables testées avec un spectre d’activité large.
Ceci peut expliquer la longue durée de conservation du lait de chamelle et son intérêt
thérapeutique (HASSAN et al. 2008).
Conclusion
Conclusion
47
Conclusion :
L’isolement et l’identification des bactéries lactiques appartenant au genre
Lactobacillus a été effectué à partir du lait chamelle provient de la région de Hassi Messaoud
wilaya d’Ouargla. 04 souches Isolats ont été caractérisés par leur forme de bâtonnet, gram
positif, catalase négative. Ces 4 isolats sont retenus et ont subi des tests physiologiques et
biochimiques pour identification de l’espèce. Les espèces révélées sont: Lb 1(Lactobacillus
viridiscens) ; Lb2 (Lactobacillus hilgardii) ; Lb 3(Lactobacillus cellobiosus) ; Lb
4(Lactobacillus delbrueckii).
Les Lactobacillus identifiées ont été testées pour déterminer leurs activités
antimicrobiennes vis-à-vis des souches à Gram+ (Staphylococcus aureus et Streptococcussp.)
et à Gram- (Escherichia coli et Pseudomonas sp.). Les résultats d'inhibition révèlent que
Les souches Lb1, Lb2 et Lb3 ayant une activité antibactérienne vis –à –vis les souches E.
coli, Staphylococcus aureus et Streptococcus sp. La souche Lb4 ne présente aucune activité
antibactérienne contre les souches pathogènes utilisées. Les quatre lactobacilles n'ont pas une
activité antibactérienne vis –à-vis la souche Pseudomonas sp.
D'après les résultats de détermination de la nature de l'agent antibactérien on a constaté
que Les trois souches lactobacilles isolées Lactobacillus viridiscens (Lb1), Lactobacillus
hilgardii (Lb2) et Lactobacillus cellobiosus (Lb3) produisent des acides organiques et une
substance de nature protéique inhibant la croissance de la souche E. coli .alors que la
croissance de la souche Streptococcus sp.est inhibée par des acides organiques produites par
les souches (Lactobacillus hilgardii Lb2et Lactobacillus cellobiosus Lb3) ainsi que par
substance thermosensible de nature protéique, l'effet de l' H2O2sur la souche Streptococcus
sp.estnon exclu car la souche est catalase négative. La souche de Staphylococcus aureus est
sensible à l'effet des acides organiques produites par les souches Lactobacillus cellobiosus
et Lactobacillus viridiscens, la souche est sensible également à l'effet des bactériophages
ainsi que l'effet d'une substance protéique thermosensible produit par la souche Lactobacillus
viridiscens Lb1.
Ces observations ouvrent des perspectives futures :
Application du génie génétique pour l’identification des souches lactiques isolées
Conclusion
48
Il serait intéressant de faire une caractérisation plus poussée et une purification des
substances inhibitrices produites par les souches de lactobacillus. Des études plus
approfondies doivent être menées pour caractériser l’agent inhibiteur.
Possibilités de développer un levain lactique local, constitué par les souches isolées,
ayant une activité antimicrobienne satisfaisante vis-à-vis des germes nuisibles.
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Annexes
Annexes
62
Annexe0 1 : Milieux de culture
Milieux MRS (De man Rogossa et sharp, 1960) : est utilisé pour la culture des Lactobacilles.
Ingrédients Piods g/ml
Extrait de viande
Extrait de levure
Peptone
Glucose
Tween 80
Citrate de sodium
Acétate de sodium
Sulfate de manganèse
Phosphate potassique
Eau distillée
pH 7,2
Autoclavage 120°C pendant 20 min
10g
2g
10 g
20g
1mg
2g
1g
0,05g
2g
1000ml
MILIEUM17 (TERZAGHI ET SANDINE, 1975)
Ingrédients Piods g/ml
Peptone de caséine
PEPTONE PEPSIQUE DE VIANDE
PEPTONE PAPAÏNE DE SOJA
Extrait de levure
EXTRAIT DE VIANDE
B-GLYCEROPHOSPHATE
MGSO
LACTOSE
ACIDE ASCORBIQUE
AGAR-AGAR
EAU DISTILLEE
pH7.2
Autoclavage 120°C, 20 min
10 g
2,5 g
5 g
2,5 g
5 g
19 g
4 0,25 g
5 g
0,5 g
20 g
1000 ml
Annexes
63
Milieu Base Falkow
Ingrédients Piods g/ml
Extrait de levure
Peptone
Glucose
Bleu de bromatémol
Arginine
Autoclavage 120°C pendant 20 min
3g
5 g
1g
0,02 g
0.05g
Milieu MRS-BCP Sans Extrait De Viande
Ingrédients Piods g/ml
Extrait de levure
Extrait de viande
Peptone
Acétate de sodium
Citrate de sodium
Glucose
KH2PO4
MgSO4
MnSO4
Bleu de bromatémol
Eau distillée
pH 6,8
Autoclavage 120°C, 20 min
5 g
10 g
10 g
5 g
2 g
20 g
2 g
0, 25 g
0, 05 g
0,025 mg
1000 ml
Annexes
64
Gélose nutritif (GN) :
Ingrédients Piods g/ml
Peptone
Extrait de viande
Extrait de levure
NaCl
Agar
Eau distillée
pH 7
Autoclavage durant 15 min à 121°C.
5g
1g
2g
5g
15g
1000 ml
Milieu Mueller-Hinton (Mueller et Hinton, 1941)
Ingrédients Piods g/ml
Infusion de viande de bœuf
Peptone de caséine
Amidon de mais
Agar-agar
pH7.4
Autoclavage 120°C, 20 min
3000 cm3
17,5 g
1,5 g
17 g
MRS tamponnée à pH 7:
Ingrédients Piods g/ml
Milieu MRS (Man, Rogossa et Sharpe,
1960) + Tampon phosphate :
Phosphate monopotassique
Phosphate disodique
Autoclave 20min à 120°C
5 4 g/l
17,8 g/l
Annexes
65
Milieu lait écrémé :
Ingrédients Piods g/ml
Lait écrémé
Eau distillée
La stérilisation à 110°C Pd 10 min
10g
100 ml
Ingrédients Piods g/ml
Extrait De Viande
Extrait De Levure
Peptone
Chlorure De Sodium
pH 7.4
Autoclavage 120°C, 20 min
1 g
2 g
5 g
5 g
Tampon phosphate :
Ingrédients Piods g/ml
KH2PO4
Na2HPO4
Eau distillé
Autoclavage 120°C pendant 20 min
13,697g
17,814g
1000ml
Annexe0 2 : Les Coloration de Gram
Coloration de Gram (Larpent et Larpent, 1990) Sur les frottis fixés, on ajoute quelques gouttes
de violet de gentiane qu’on laisse agir 1minute. Le colorant est jeté, et la préparation est
recouverte du lugol (solution aqueuse d’iode et d’iodure de potassium) pendant 30 secondes,
l’opération est répétée une deuxième fois. Ensuite, la préparation est décolorée à l’alcool 90°. On
rince avec de l’eau distillée. En fin, quelques gouttes de fuchsine de Ziehl sont versées sur la
lame qu’on laisse agir 1minutes. La lame est lavée à l’eau distillée. Après séchage, on passe à
l’observation microscopique à l’immersion
Annexes
66
Annexe0 3 : Les appareils
Balance (DENVER Instrument) PH mètre(Enolab)
Microscopie Optique(Euromex) Centrifugation Réfrigère(Hettich)
Incubateur agitateur(Heidolphuninax) Hotte
Etuve Four pasteur(Heraeus)
Annexes
67
Centrifugation Micropipette
Plaque chouffants (VelpScientifica) Autoclave (Systec)
Résume
Nous avons isolé et identifié quatre souches de lactobacilles à partir d’un échantillon de lait de chamelle cru provient de la région de Hassi Massoud wilaya d’Ouargla, afin de tester leur activité antibactérienne vis -à-vis des souches pathogènes isolées au niveau des laboratoires d’analyses médicales. Les résultats d’identification obtenus nous ont permis d’identifier les isolats comme suit : La souche S1 (Lb1) Lactobacillus viridiscens, la souche S2 (Lb 2) Lactobacillus hilgardii, la souche S3 (Lb 3) Lactobacillus cellobiosus et la souche S4 (Lb 4) Lactobacillus delbrueckii. Les 04 souches ont été testées pour leur effet antibactérien à l’encontre de Staphylococcus aureus et Escherichia coli, Pseudomonas sp. Et Streptococcus sp. L’interaction de nos souches lactiques avec les bactéries pathogènes était détectée par technique des puits sur milieu gélosé dont la formation des halos autours des puits indique la présence d'inhibition. D'après les résultats on note que Les souches Lb1, Lb2 et Lb3 ayant une activité antibactérienne vis –à –vis les souches E. coli, Staphylococcus aureus et Streptococcus sp.La mesure des diamètres d'inhibition révèle des diamètres qui se varient de 1 à 33 mm. Alors que la souche Lb4 ne présente aucune activité antibactérienne contre les souches pathogènes utilisées. L'inhibition et la nature des agents antibactériens produits par les trois lactobacilles Lb1, Lb2 et Lb3 se changementt contre les souches pathogènes utilisés. L'effet des acides organiques sur les souches pathogènes est majoritaire car les trois souches E. coli, Staphylococcus aureus et Streptococcus sp. Sont inhibées par des acides organiques produites par Lb1, Lb2 et Lb3. L'effet des bactériocines est aussi aperçu car une substance de nature protéique thermosensible est responsable de l'inhibition des souches pathogènes utilisées. Mots-clés: Lactobacilles ; Lactobacillus ; Bactériocines ; activité antibactérienne ; lait de chamelle.
Summury
We have isolated and identified four strains of lactobacilli from a sample of raw camel milk comes from the region of HassiMassoudwilaya of Ouargla, to test their antibacterial activity against isolated pathogenic strains isolated from medical laboratories. The identification results allowed us to identify the isolates as follows: S1 strain (Lb1) Lactobacillus viridiscens, S2 strain (Lb 2) Lactobacillus hilgardii, S3 strain (Lb 3) Lactobacillus cellobiosus and the last strain S4 ( 4 lb) Lactobacillus delbrueckii. The 04 strains were tested for their antibacterial effects against Staphylococcus aureus,Escherichia coli, Pseudomonas sp. andStreptococcus sp. The interaction of our lactic strains with pathogenic bacteria was detected by well diffusion technique on agar medium including forming halos around wells indicates the presence of inhibition. From the results we note that the strains Lb1, Lb2 and Lb3 having antibacterial activity againstE. coli strains, Staphylococcus aureus and Streptococcus sp. The measurement of inhibition diameters reveals diameters which range from 1 to 33 mm. While Lb 4 strain exhibits no antibacterial activity against the pathogenic strains used. Inhibition and nature of antibacterial agents produced by the three lactobacilli Lb1, Lb2 and Lb3 isdifferent against pathogenic strains used. The effect of organic acids on pathogenic strains prevails because the three strains E. coli, Staphylococcus aureusand Streptococcus sp.Are inhibited by organic acids produced by Lb1, Lb2 and Lb3. The effect of bacteriocins is also realized as a heat-sensitive protein substance is responsible for inhibition of pathogenic strains used. Keywords: lactobacilli; Lactobacillus; Bacteriocins; antibacterial activity; camel milk.
الملخص
سالالخ تكرٍرٌا مه ػٍىاخ دهٍة واقح مأخىرج مه مىطقح داسً مسؼىد ورقهح ورنك مه اجم اخرثار قذرذها ػهى كثخ ومى انثكرٍرٌا 4قمىا تؼسل
.أثثرد انىرائج أن انسالالخ انمؼسونحمه دهٍة انىاقح ذصىف كانرانً .انممرضحانمؼسونح مه مخاتر انرذانٍم انطثٍح
Lb4Lactobacillus و Lb3Lactobacillus cellobiosus و Lb2 Lactobacillus hilgardii و Lb1Lactobacillus viridiscensانسالنح
delbrueckii. :جرتد كم مه األرتغ سالالخ نمؼرفح وشاطها انمضاد نىمى كم مه
Staphylococcus aureus ,Escherichia coli, Pseudomonas sp., Streptococcus sp
. ذشكم هاالخ دىل انثقة دنٍم ػهى دذوز إػاقح, انرفاػم تٍه سالنرىا انهثىٍح و انثكرٍرٌا انممرضح ذم اخرثارهاترقىٍح انثقة فً وسظ زرع صهة
:ذمهك وشاط مضاد نهسالالخLb3 وLb1Lb2مه انىرائجانمذصم ػهٍها والدظ أن انسالالخ
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, وStreptococcus sp ووالدظ , مهم33-1إن دساب أقطار انرثثٍظ ٌكشف ػه أقطار ذرراوح تٍه
نم ذظهر أي وشاط مؼٍق ضذ انثكرٍرٌا انممرضح انمسرؼمهحLb4أٌضا أن انسالنح
ذأثٍر . انمخرهفح ضذ انثكرٍرٌا انممرضح انمسرؼمهح Lb3 وLb2, Lb1انرثثٍظ وطثٍؼح انؼىامم انمضادج نهجراثٍم وانمىرجح مه طرف انثالز سالالخ
Escherichia coliثالز سالالخالاألدماض انؼضىٌح ػهى انسالالخ انمسثثح نألمراض ٌسىد ألن Staphylococcus aureus و Streptococcus spثثظ ومىها تفؼم األدماض انؼضىٌح انمىرجح مه طرف Lb2 , Lb1وLb3 . وذأثٍر
bactériocinesأيضاباعتبارهمادةالبروتينيةالحساسةللحرارةهيالمسؤولةعنتثبيطالسالالتالمسببةلألمراضالمستخدمة.
.، انىشاط انمضاد نهثكرٍرٌا، دهٍة انىاقحLactobacillus ،Lactobacillus ،Bacteriocins:الكلمات المفتاحية