UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ESTUDO FITOQUÍMICO, ATIVIDADE ANTIPROMASTIGOTA
E CITOTOXICIDADE DE Himatanthus articulatus (Vahl)
Woodson (Apocynaceae)
Rosana Cristiane da Silva Monteiro
Belém-PA
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIENCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ESTUDO FITOQUÍMICO, ATIVIDADE ANTIPROMASTIGOTA
E CITOTOXICIDADE DE Himatanthus articulatus (Vahl)
Woodson (Apocynaceae)
Autor: Rosana Cristiane da Silva Monteiro
Orientadora: Profa. Dr.a Maria Fâni Dolabela
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Belém-PA
2016
FOLHA DE APROVAÇÃO
Rosana Cristiane da Silva Monteiro ESTUDO FITOQUÍMICO, ATIVIDADE ANTIPROMASTIGOTA E CITOTOXICIDADE
DE Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson (Apocynaceae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Instituto Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
Aprovado em:
Banca Examinadora
Profa. Dra. Maria Fâni Dolabela (Orientadora) Instituição: Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas UFPA
Ass.:______________________
Prof. Dr. Flavio de Vasconcelos Instituição: Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas UFPA
Ass:_______________________
Prof. Luiz Carlos de Souza Rodrigues Instituição: Faculdade de Ciências Farmacêuticas – ICS - UFPA
Ass:_______________________
Profa. Dra. Ana Cristina Baetas Gonçalves (Suplente) Instituição: Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas UFPA
Ass:______________________
Belém- PA 2016
DEDICATÓRIA
“Não deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impeça de
tentar. Desconfie do destino e acredite em você. Gaste mais horas realizando que
sonhando, fazendo que planejando, vivendo que esperando porque, embora quem
quase morre esteja vivo, quem quase vive já morreu.”
Sarah Westphal
“Se não puder voar, corra, se não puder correr, ande, se não puder andar, rasteje,
mas continue em frente de qualquer jeito.”
Martin Luther King
Dedico este trabalho ao meu filho João Lucas Monteiro de Macedo (in
memoriam), meu amor, meu anjo, que me ensinou que a vida é o presente, que se
deve amar agora e que o amanhã, a Deus pertence e de nada vale viver se não
existe fé e esperança.
Dedico também ao meu marido Marcos André Pimentel de Macedo por todo
amor e compreensão, por estar do meu lado nos momentos mais difíceis e me
apoiar em tudo. Muito obrigada amor.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradecer a Deus por estar presente em todos os momentos
da minha vida, por ter me orientado nos momentos mais difíceis, por ter segurado na
minha mão e me dado forças para continuar e por ter colocado pessoas
maravilhosas nesta jornada, que me ajudaram a chegar até aqui.
Agradeço com muito amor ao meu marido Marcos André Pimentel de
Macedo, por seu companheirismo, incentivo e paciência. Aos meus pais Elza Maria
da Silva Monteiro e Valter Monteiro, meus irmãos Walter Vinicius da Silva Monteiro,
Elaine Cristina da Silva Monteiro e Ednelson da Silva Monteiro por todo o incentivo,
apoio, força e por todo amor que vocês dedicam a mim e por serem uma família
maravilhosa.
A minha querida orientadora Maria Fâni Dolabela, por ter me aceitado como
orientanda, por ter me ensinado, por ter acreditado em mim, pelo apoio e incentivo
nos momentos difíceis, pela paciência e compreensão, obrigada por tudo, você é
uma pessoa muito admirável, sábia e cheia de luz.
Aos professores que contribuíram com base científica: José Luiz Fernandes
Vieira, Marly de Fátima Carvalho de Melo, Luiz Carlos de Souza Rodrigues,
Roseane Maria Ribeiro Costa, José Otávio Carréra Silva Junior, Fernando Tobias
Silveira (IEC), Andrey Moacir do Rosário Marinho, Flavio de Vasconcelos, Jaqueline
Rodrigues da Silva e demais professores do Programa de Pós-graduação em
Ciências Farmacêuticas do Instituto de Ciências da Saúde da UFPA.
Agradeço em especial aos amigos do mestrado da UFPA Valdicley Vieira
Vale, João Victor da Silva, Kelly Cristina de Albuquerque Freitas e Heliton Patrick
Cordovil Brigido que muito contribuíram para a realização deste trabalho, muito
obrigada pelo apoio e companheirismo de vocês, por toda ajuda que me
concederam, por serem pessoas incríveis, sempre dispostas a ajudar, que Deus os
abençoe sempre.
Aos amigos da turma do mestrado, Denise Maria Loureiro Contente, Marcus
Vinícius Dias de Lima, Rayanne Rocha Pereira e Ana Carla Godinho Pinto, pela
amizade, pelo incentivo, pelas trocas de conhecimento e pelas conversas.
Aos amigos do trabalho Izameire Moraes Corrêa, Nair Freitas Castro e Ana
Lucia do Nascimento Moraes pelo apoio e contribuição na realização deste trabalho.
Aos colegas da Universidade Federal do Pará Diele Magno do Rosário,
Andreza do Socorro Silva da Veiga, Rosana Moura Sarmento, Milena Cristina
Martins da Silva, Erica Vanessa Souza Costa, Josiwander Miranda Carvalho, Jorge
Dores Rissino, Antônio Taylon Aguiar Gomes, Raimundo Nonato Barbosa Pires
(IEC), Cliciane Sarrazin, Brasília Quaresma e demais colegas da UFPA que
contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho. Meus queridos
amigos e colaboradores, muito obrigada por tudo.
.
RESUMO
MONTEIRO, R.C.S. Estudo fitoquímico, atividade antipromastigota e
citotoxicidade de Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson (Apocynaceae). 106
f. Dissertação de Mestrado, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal do Pará, Belém, 2016.
O presente estudo avaliou a atividade antipromastigota e citotoxicidade do extrato etanólico obtido de cascas de Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson, frações e substância isolada. O extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus (EEHA) foi obtido por maceração, sendo fracionado em coluna cromatográfica aberta, contendo como fase estacionária, sílica gel e como fase móvel, solventes de polaridade crescente. O extrato e frações foram submetidos ás análises em Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Arranjos Diodos (CLAE-DAD). Na avaliação da atividade antileishmania utilizou-se a cepa das formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, sendo avaliada a viabilidade dos parasitos após 24h de tratamento. A citotoxicidade foi avaliada através do ensaio de viabilidade celular, sendo utilizada Linhagem Celular THP-1. O EEHA (16,82%), fração hexano (FrHex EEHA; 0,2%), fração diclorometano (FrDcl EEHA; 9,6%), fração acetato de etila (FrAct EEHA; 2,4%) e fração metanólica (FrMet EEHA: 72,6%) foram submetidos a análise em CCD, sendo detectada uma mancha sugestiva de iridoide no EEHA e FrMet EEHA. O EEHA e FrMet EEHA apresentaram um pico intenso em CLAE-DAD, cujo espectro em UV sugeriu tratar-se de iridoide. O fracionamento da FrMet EEHA levou ao isolamento do plumierídeo, identificado através de técnicas espectrométricas (CLAE-DAD e RMN). Na avaliação da atividade antileishmania, o EEHA, FrHex EEHA, FrDcl EEHA, FrAct EEHA, FrMet EEHA e plumierídeo mostraram-se inativos
em formas promastigotas de L. amazonensis (CI50> 200g/mL). No entanto, a FrAct EEHA inibiu 37,29% das formas promastigotas na concentração de 200 µg/mL. Em relação à citotoxicidade, o EEHA, FrAct EEHA, FrMetEEHA e plumierídeo exibiram pouca citotoxicidade (CC50> 500µg/mL) e apresentaram índice de seletividade superior a 2,5. Em síntese, as amostras foram inativas em formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis. Entretanto, mostraram-se pouco tóxicas para macrófagos. Palavras-chave: Apocynaceae, Himatanthus articulatus, iridóides, plumierídeo, atividade antileishmania.
ABSTRACT
MONTEIRO, R.C.S. Phytochemical study, anti promastigote activity and
cytotoxicity Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson (Apocynaceae). 106 f.
Master Thesis, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal do Pará, UFPA, 2016.
This study evaluated the anti promastigote activity and cytotoxicity of ethanol extract obtained from bark Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson, fractions and isolated substance. The ethanol extract obtained by maceration of the powder from bark of H. articulatus (EEHA). The ethanol extract fractionated in chromatographic column containing as stationary phase silica gel and as the mobile phase solvents of increasing polarity. The extract and fractions were submitted to analysis on Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance Liquid Chromatography Coupled with Diodes Arrangements (HPLC-DAD). The anti promastigote activity was performed in promastigotes of Leishmania (L.) amazonensis. Activity was evaluated after 24 hours of treatment. Cytotoxicity was assessed by cell viability assay being used THP-1 Cell Line. The EEHA (16,82%), hexane fraction (FrHex EEHA; 0.2%), dichloromethane fraction (FrDcl EEHA; 9.6%), ethyl acetate fraction (FrAct EEHA; 2.4%) and methanol fraction (FrMet EEHA: 72, 6%) were subjected to analysis in CCD, EEHA and FrMet EEHA were detected a spot suggestive of the iridoid. The EEHA and FrMet EEHA showed an intense peak in HPLC-DAD, whose spectrum UV suggested that this is iridoid. Fractionation of FrMet EEHA led to the isolation of plumieride identified by spectrometric techniques (HPLC-DAD and NMR). In evaluating Leishmania activity, EEHA, FrHexEEHA, FrDclEEHA, FrAct EEHA, FrMetEEHA and plumieride were inactive in promastigotes of Leishmania amazonensis (IC50> 200µg / mL). However, FrAct EEHA inhibited 37,29% of the promastigotes at a concentration of 200µg/mL. In relation to cytotoxicity, EEHA, FrAct EEHA, FrMet EEHA and plumieride exhibited low cytotoxicity (CC50> 500μg / mL), and showed selectivity index greater than 2.5. In summary, the samples were inactive promastigote forms of Leishmania (L.) amazonensis. However, they proved to be slightly toxic to macrophages line.
Keywords: Apocynaceae, Himatanthus articulatus, iridoids, plumieride, antileishman
activity.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Estruturas químicas da plumericina (1) e isoplumericina (2) 20
Figura 02: Formas de Leishmania sp. (A) Promastigotas e (B) Amastigotas.
24
Figura 03: Ciclo de vida da Leishmania spp 26 Figura 04: Estruturas químicas do Antimoniato N-metil glucamina (3) e
Estibogluconato de sódio (4) 30
Figura 05: Estrutura química da Anfotericina B (5) 31 Figura 06: Estrutura química da Paromomicina (6) e Isotionato de
pentamidina (7) 32
Figura 07: Estrutura química da Miltefosina (8) 33 Figura 08: Estrutura química do Cetoconazol (9), Fluconazol (10) e
Itraconazol (11) 34
Figura 09: Estrutura química da Fulvoplumericina (12) 38 Figura 10: Estrutura química do 15 - Desmetilplumierídeo (13),
Plumierídeo (14) e Isoplumierídeo (15) 39
Figura 11: Estruturas químicas do Ácido 2’ -O- metilperlatólico (16), Ácido confluêntico (17), Ácido β – diidroplumericina (18), Ácido vanílico (19), Ácido ρ – coumárico (20), Ácido ρ – hidroxibenzóico (21)
40
Figura 12: Estruturas químicas do Cinamato de lupeol (22), Cinamato de α-amirina (23), Acetato de lupeol (24)
41
Figura 13: Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson (Exsicata) 51 Figura 14: Coluna Cromatográfica aberta do extrato etanólico de
Himatanthus articulatus (EEHA) 52
Figura 15: Fluxograma de atividades envolvidas no presente trabalho 55 Figura 16: Desenho da placa de cultura de 96 poços com as
substâncias testadas, representadas por cores 57
Figura 17: Cromatografia em Camada Delgada do Extrato (EEHA), Frações (FrHex EEHA, FrDcl EEHA, FrAct EEHA, FrMet EEHA) e Substância Isolada (SI) de Himatanthus articulatus
64
Figura 18: Perfil cromatográfico em CLAE da solução extrativa de Alamanda cathartica obtida por maceração dinâmica (230 nm– plumierídeo)
65
Figura 19: Cromatograma do extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus em estudo de Vale e colaboradores (2015)
65
Figura 20: Cromatogramas e espectros (UV 230 nm) do extrato etanólico, das frações diclorometano, acetato de etila e metanólica, obtidos das cascas de Himatanthus articulatus
67
Figura 21: Cromatograma e espectro (UV 230 nm) da substância isolada (SI), obtida da fração metanólica do extrato etanólico de H. articulatus
68
Figura 22: Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 1H (CD3OD, 300 MHz) da substância isolada (SI) obtida da fração metanólica do extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus
71
Figura 23: Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 13C (CD3OD, 300 MHz) da substância isolada (SI) obtida da fração metanólica do extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus
74
Figura 24: Atividade antipromastigota do extrato etanólico, frações e plumierídeo obtidos das cascas de H. articulatus
80
Figura 25: Ensaio de citotoxicidade do extrato etanólico, fração acetato de etila, fração metanólica e plumierídeo obtidos das cascas de H. articulatus
83
LISTA DE QUADROS
Quadro 01: Relação taxonômica da Leishmania 23 Quadro 02: Valores de CIM e CI50 para leitura dos resultados 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Condições cromatográficas empregadas nas análises por CLAE-DAD
54
Tabela 02: Rendimento do extrato etanólico e frações obtidas das cascas de Himatanthus articulatus
63
Tabela 03: Resultados obtidos em CLAE-DAD (UV 230 nm) comparados a literatura
66
Tabela 04: Resultados de CCD e CLAE-DAD obtidos do extrato etanólico e frações (FrDcl EEHA, FrAct EEHA, FrMet EEHA) obtidas das cascas de Himatanthus articulatus
68
Tabela 05: Deslocamentos químicos em RMN1H (300 MHz e CD3OD) da substância isolada (SI) obtida da fração metanólica do extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus comparados a dados obtidos da literatura
70
Tabela 06: Deslocamentos químicos em RMN13C (300 MHz e CD3OD) da substância isolada (SI) obtida da fração metanólica do extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus comparados a dados obtidos da literatura
73
Tabela 07: CI50 do extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus, suas frações e plumierídeo
79
Tabela 08: CC50 do extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus, fração acetato de etila, fração metanólica e plumierídeo em macrófagos
82
Tabela 09: CI50 e CC50 do extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus, fração acetato de etila, fração metanólica e plumierídeo
84
Tabela 10: Comparação da atividade antipromastigota, citotoxicidade e índice de seletividade de H. articulatus
85
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
% Porcentagem °C Graus Celsius µM Micrometros CCD Cromatografia em Camada Delgada CI50 Concentração Inibitória mínima 50% CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Detector de Arranjos
Diodos cm Centímetro DMSO Dimetilsulfóxido EEHA Extrato etanólico de Himatanthus articulatus FrAct EEHA Fração Acetato de Etila obtida do extrato etanólico de Himatanthus
articulatus FrDcl EEHA
Fração Diclorometano obtida do extrato etanólico de Himatanthus articulatus
FrHex EEHA Fração Hexânica obtida do extrato etanólico de Himatanthus articulatus
FrMet EEHS Fração metanólica obtida do extrato etanólico de Himatanthus articulatus
g Grama Kg Quilograma L Litro LC Leishmaniose cutânea LCD Leishmaniose cutâneo-difusa LMC Leishmaniose muco-cutânea LTA Leishmaniose tegumentar americana LVA Leishmaniose visceral americana m Metros MAO -A Monoamina oxidase A MAO -B Monoamina oxidase B MeOH Metanol mg Miligrama Min Minuto mL Mililitro mm Milímetro nmol Nanomol OMS/WHO Organização Mundial de Saúde. OPAS Organização Panamericana de Saúde pH Potencial hidrogeniônico Rf Fator de Retenção RMN Ressonância Magnética Nuclear rpm Rotação por minuto RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 Sb+5 Antimonial Pentavalente TBARS Substância que reagem ao ácido tiobarbitúrico Tr Tempo de Retenção µg Micrograma μL Microlitro
μm Micrómetro UV Ultravioleta UPLC-PDA-MS/ESI
Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector de arranjos de diodo e massas por eletrospray
VERO Células renais de macaco-verde africano
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17 2 REVISÃO DE LITERATURA 22 2.1 Leishmania 22 2.2 A família Apocynaceae e o gênero Himatanthus 35 3 OBJETIVOS 43 3.1 Objetivo geral 43 3.2 Objetivos específicos 43 4 MATERIAL E MÉTODOS 44 4.1 MATERIAL 44
4.1.1 Equipamentos 44 4.1.2 Solventes, Reagentes e outros 45 4.1.3 Fármacos, meios de cultura e corantes 46 4.1.4 Materiais plásticos e metal 46 4.1.5 Vidrarias 47 4.2 Reveladores utilizados na prospecção fitoquímica para
cromatografia em camada delgada (CCD) 48
4.2.1 ANISALDEÍDO – ÁCIDO SULFÚRICO 48 4.2.2 REAGENTE DRAGENDORFF 48 4.3 Meios de Cultivo 48
4.3.1 Meio NOVY – NICOLLE – MCNEAL (NNN) 48 4.3.2 Meio incompleto de RPMI 1640 (ROSWELL PARK MEMORIAL
INSTITUTE) com L-glutamina 49
4.3.3 Meio completo de RPMI 1640 (ROSWELL PARK MEMORIAL INSTITUTE)
49
4.3.4 Meio completo de RPMI 1640 (ROSWELL PARK MEMORIAL INSTITUTE) com L-glutamina modificado para cultivo de células THP-1
49
4.4 MATERIAL BIOLÓGICO 50 4.4.1 Espécie do gênero Leishmania 50 4.4.2 Células THP-1 50 4.5 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL 50 4.6 MÉTODOS 51 4.6.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS 51
4.6.1.1 Obtenção do extrato etanólico da casca da Himatanthus articulatus 51 4.6.1.2 Ensaios de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a
Detector de Arranjo de Diodo (CLAE-DAD) 53
4.6.1.3 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C 54 4.7 AVALIAÇÃO BIOLÓGICA 56 4.7.1 Cultivo das formas promastigotas de Leishmania (L) amazonensis 56 4.7.2 Ensaio da Atividade Antipromastigota 56 4.7.3 Ensaio de viabilidade celular 58 4.7.3.1 Descongelamento 58 4.7.3.2 Cultivo Celular 58 4.7.3.3 Criopreservação 59 4.7.3.4 Diferenciação celular 59 4.7.3.5 Ensaio de viabilidade celular 60 4.7.3.6 Determinação do Índice de Seletividade (IS) 61
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 62 5.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS 62 5.2 ATIVIDADE BIOLÓGICA 75
5.2.1 Atividade antipromastigota 75 5.2.2 Citotoxicidade 81 5.2.3 Análise do potencial biológico de H. articulatus 84 6 CONCLUSÃO 86 7 REFERÊNCIAS 87
17
1 INTRODUÇÃO
A leishmaniose ocasiona de 20.000 a 30.000 óbitos associados a 1,3
milhões de novos casos a cada ano. Afeta em maior parte, a população mais
carente do mundo, aliada a fome, mudança de populações, condições
precárias de habitação, sistema de defesa do organismo debilitado, carência de
recursos, mudanças ambientais bruscas, entre elas estão o desmatamento,
criação de barragens, técnicas de irrigação e edificação de cidades (WHO,
2016).
Estas condições de vulnerabilidade social são mais frequentes nos
países em desenvolvimento, sendo considerada uma doença negligenciada no
mundo (WHO, 2016). A leishmaniose é endêmica em 88 países de áreas
tropicais e subtropicais (WHO, 2009).
Normalmente nas Américas, a Leishmaniose tegumentar ocorre em 18
países, onde foram notificados 743.970 casos, no período de 12 anos (2001 a
2013), com média de 57.228 casos por ano. No ano de 2013 foram registrados
47.492 casos da doença em 16 países, não incluindo notificações de
Venezuela e Guiana Francesa. O Brasil e os países da sub-região Andina
concentram o maior número de casos (78,8%; PAHO/OMS, 2015).
Entre os anos de 2010 a 2013, observou-se uma diminuição de 19,2%
de casos notificados, principalmente em países como Brasil, Colômbia,
Nicarágua, Panamá, Peru, Equador, Paraguai e Argentina (PAHO/OMS, 2015).
A forma tegumentar da doença é a mais prevalente, com maior número
de casos. O Brasil concentrou 38,4% (18.226) das notificações em 2013, em
especial na Região Amazônica (PAHO/OMS, 2015). No ano de 2014 foram
registrados 20.296 casos da doença no Brasil, com prevalência na Região
Norte (10.387 casos – 51,5%; BRASIL, 2014).
Em contrapartida, a Leishmaniose visceral foi referida em 12 países das
Américas, com 45.490 casos notificados entre os anos de 2001 a 2013, com
média de 3.499 casos ao ano. O Brasil foi o país que apresentou o maior
número de notificações em 2013, registrando 3.253 casos (96%) com taxa de
4,53 por 100.000 habitantes, de um total de 3.389 casos registrados em 8
países, seguido do Paraguai (3,2%) e Colômbia (0,4%; PAHO/OMS, 2015).
18
Em 2014, foram registrados 3.453 casos no Brasil, no entanto, a maior parte
das notificações ocorreu na Região Nordeste (2.022 casos; BRASIL, 2014).
A leishmaniose é causada por protozoários flagelados da ordem
Trypanosomatida, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania (COX, 2005;
LAISON e SHAW, 2005 apud LAINSON, 2010). Pode produzir infecção sem
manifestação de sintomas ou subclínica, ou apresentar sintomas intensos de
comprometimento cutâneo e das mucosas, com auto cura no período de 3 a 18
meses, podendo ocasionar cicatrizes desfigurantes, ou até mesmo, causar a
forma visceral, caracterizada por uma supressão sistêmica generalizada, de
evolução fatal se não for tratada (BALAÑA – FOUCE et al.1998; MISHRA et
al.2009a).
Dessa forma, se distribui em dois grupos: Leishmaniose tegumentar
americana (LTA), a qual inclui as formas de leishmaniose cutânea (LC),
leishmaniose cutâneo-difusa (LCD) e leishmaniose muco-cutânea (LMC) e a
leishmaniose visceral (LV) (BALAÑA – FOUCE et al. 1998; DESJEUX 2004,
AZEREDO-COUTINHO, 2007; REY, 2008).
O tratamento de primeira escolha da leishmaniose é realizado com
antimonial pentavalente, encontrado nas formas de antimoniato de N-
metilglucamina e o estibogluconato de sódio, sendo apenas o primeiro
comercializado no Brasil. Esta terapêutica é eficaz no tratamento de
leishmaniose cutânea, muco-cutânea e visceral, provocando rápida diminuição
dos sintomas clínicos e hematológicos da doença e ocasionando a morte do
parasita (GONTIJO et al. 2003).
Como o tratamento é realizado com altas doses de antimônio, torna-se
uma terapia agressiva, com alta toxicidade, apresentando como efeitos
colaterais artralgias, astenia, mialgias, alterações cardiológicas, hepáticas e
hematológicas, náuseas e vômito (OLIVEIRA-NETO et al. 2000). Pode
apresentar falhas no tratamento e possível aumento das formas parasitárias
resistentes, ocasionados pela administração de doses baixas e terapias
descontínuas, devido ao extenso período de utilização do fármaco (BERMAN e
WYLER, 1980; BALAÑA – FOUCE et al. 1998).
Fármacos de segunda escolha têm sido utilizados na terapia das
diferentes formas de leishmaniose, entre eles estão a anfotericina B,
19
pentamidina, paromomicina e o mitelfosine (BALAÑA – FOUCE et al. 1998;
FISCHER et al. 2001).
A anfotericina B, antibiótico antifúngico, tem sido recomendado na
terapêutica da leishmaniose muco-cutânea americana, sendo empregado em
casos onde não há resposta ao tratamento com antimoniais. No entanto,
apresenta nefrotoxicidade, levando a redução de potássio e magnésio no
organismo. Apesar disso, apresenta formulações lipossomais, as quais foram
desenvolvidas com o objetivo de diminuir os efeitos adversos do tratamento
(YARDLEY e CROFT, 2000; DORA e SOUZA, 2005).
Devido à complexidade do tratamento, relacionada aos efeitos
secundários, originados pela elevada toxicidade dos fármacos utilizados
(BERMAN, 1997) e da crescente resistência do parasito, sendo esta
ocasionada pela falta de monitoramento terapêutico, alto custo dos
medicamentos, monoterapia, carência de estudos de marcadores moleculares
relacionados à resistência leishmanicida de fármacos e baixa resposta
terapêutica de pacientes portadores de HIV (OLIVEIRA-NETO et al. 2000),
torna-se de suma importância à busca de novos fármacos, incluindo os
medicamentos fitoterápicos.
Diferentes espécies vegetais são utilizadas na medicina tradicional, para
o tratamento de feridas de difícil cicatrização e/ou antiúlcera, e na terapia da
leishmaniose cutânea, como exemplo, citam-se as espécies Plectranthus
amboinicus (Lamiaceae; FRANCA et al. 1996; LORENZI e MATOS, 2002),
Mentha X piperita (Lamiaceae; MCKAY e BLUMBERG, 2006), além da
Himatanthus articulatus, caracterizada como sinonímia de Himatanthus
sucuuba (SPINA, 2004).
A H.sucuuba (H.articulatus) é conhecida no norte do Brasil, como
sucuuba, janaguba ou sucuba (VAN DEN BERG, 1982), sendo utilizada na
medicina popular para tratamento de úlcera e como afrodisíaca e seu látex,
usado como antitumoral (VAN DEN BERG, 1984). No Peru, utiliza-se a infusão
da casca na cicatrização de feridas, furúnculos e tumores, no tratamento de
artrite e inchaços e como laxante, vermífugo (PERDUE e BLOMSTER, 1978),
analgésico, anti-inflamatório (MIRANDA et al. 2000) e antimalárico (MILLIKEN,
1995).
20
O extrato etanólico da casca de H.sucuuba (H.articulatus) mostrou-se
ativo contra formas amastigotas (CI50=5µg/ml) e promastigotas (CI50=20µg/ml)
de Leishmania amazonensis. Após o fracionamento do extrato etanólico, as
substâncias plumericina (1) e isoplumericina (2) foram avaliadas quanto à
citotoxicidade em macrófagos peritoneais, obtendo-se CC50 de 1,86 µM. A
plumericina foi ativa contra as formas amastigotas, sendo o CI50 de 0,9 µM
(CASTILLO et al. 2007). Quando se avalia o índice de seletividade, observa-se
que esta substância foi mais tóxica para o parasita e menos ativa no
macrófago.
COOCH3
HH
O
O
O
O
H
COOCH3
HH
O
O
O
O
H
(1) (2)
Figura 01: Estruturas químicas da plumericina (1) e isoplumericina (2)
Estes resultados sugerem que talvez o isolamento da substância tenha
contribuído para a atividade antileishmania e citotoxicidade. Visando obter uma
fração mais ativa, que o extrato etanólico da H.articulatus para atividade
promastigota e com menor citotoxicidade, realizou-se esse estudo.
Entretanto, este trabalho se fundamentou em dados etnobotânicos, que
mostraram em estudos anteriores à utilização da espécie H.sucuuba
(H.articulatus) como cicatrizante no tratamento de feridas e ulceras (PERDUE e
BLOMSTER, 1978; VAN DEN BERG, 1984), além das substâncias isoladas,
plumericina e isoplumericina, que exibiram atividade antileishmania (CASTILLO
et al. 2007).
21
Novas estratégias podem ser adotadas em busca de novos fármacos,
que possam suprir as diversas dificuldades da terapia convencional, assim
torna-se necessário não só a identificação de novas espécies de plantas já
utilizadas na cicatrização e tratamento de feridas e úlceras, mas também o
estudo biomonitorado destas espécies, que visem uma valiosa contribuição na
investigação do fracionamento do extrato etanólico e que possam originar
frações ativas e com menor citotoxicidade.
22
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 LEISHMANIA
Em 1827, ocorreu a primeira citação sobre a existência da leishmaniose
no Brasil, descrita no livro de Tello, com o título “Antigüidade de La Syphilis en
el Perú”, relatando a viagem do Frey dom Hipólito Sanchez Rangel de Fayas y
Quiros pelas regiões do vale amazônico, constatando nestas localidades, a
presença de pessoas com feridas na boca e nariz e úlceras nos braços e
pernas, associando estas moléstias à picada de insetos (COSTA, 1992).
O dermatologista Achille Breda foi pioneiro em identificar e caracterizar
clinicamente a leishmaniose muco-cutânea americana, após ter tratado 18
emigrantes italianos, que haviam chegado de São Paulo, com sintomas da
doença, sendo denominada por alguns cientistas como “doença de Breda”
(PAMPLIGLIONE, 1979).
O britânico David Douglas Cunningham, em 1885, constatou formas
amastigotas do parasita, causador da leishmaniose, em exame de biópsia,
descrevendo-as como corpúsculos peculiares e associando-as a plasmódio e
ameba (CUNNINGHAM, 1885 apud SOUSA, 2009), no entanto, foi James
Holmer Wright que identificou o agente causador da leishmaniose visceral em
1903, através de técnica de coloração de Romanousk, modificada por ele em
1902 (WRIGHT, 1903 apud SOUSA, 2009).
No Brasil, em 1911, o médico Gaspar de Oliveira Vianna, identificou a
espécie Leishmania (V.) brasiliensis, ao examinar o esfregaço de um paciente
natural de Minas Gerais, que apresentava lesões no rosto, braços e pernas. Na
ocasião, descreveu a forma amastigota do parasita, como ovóide, com
protoplasma corando-se em róseo, núcleo e blefaroplasto corando-se em
vermelho escuro e filamento corando-se em vermelho brilhante. Era um caso
típico de leishmaniose cutânea disseminada (VIANNA, 1911 apud SOUSA,
2009).
Os protozoários causadores da leishmaniose fazem parte do reino
Protozoa, filo Euglenozoa, classe Kinetoplastea, ordem Trypanosomatida e
família Trypanosomatidae (LAINSON, 2010), conforme relação taxonômica
descrita a seguir (Quadro 1).
23
Quadro 1: Relação taxonômica da Leishmania
Reino PROTOZOA Goldfuss,1818
Filo EUGLENOZOA Cavalier-Smith, 1998
Classe KINETOPLASTEA Honigberg, 1963
Ordem TRYPANOSOMATIDA Kent, 1880
Família TRYPANOSOMATIDAE Doflein,1901
Gênero Leishmania Ross,1903
Subgênero Leishmania Ross, 1903
Subgênero Viannia Lainson & Shaw, 1987
Fonte: COX, 2005; LAINSON e SHAW, 2005 apud LAINSON, 2010
As formas clínicas da doença desenvolvidas no indivíduo parasitado
diferem de acordo com a espécie de Leishmania infectante e também estão
relacionadas à exposição do hospedeiro ao protozoário (SARAIVA et al. 1989).
A leishmaniose tem sido dividida em dois grupos, relacionados de
acordo com a região geográfica onde a infecção é adquirida. A leishmaniose do
“Velho Mundo” relaciona-se a doenças ocasionadas por espécies encontradas
na Bacia do Mediterrâneo, Oriente Médio e África, enquanto que, a
leishmaniose do “Novo Mundo” refere-se a infecções transmitidas por espécies
localizadas no México, América Central e América do Sul (CONSUELO e
NOAH, 2009).
O gênero Leishmania foi subdividido em dois subgêneros, Leishmania e
Viannia (LAINSON et al. 1986). O subgênero Leishmania compreende as
espécies Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, L. (L.) infantum infantum
(LAINSON e SHAW, 2005 apud LAINSON, 2010), L.(L.) donovani, L.(L.)
tropica, L.(L.) mexicana, L. (L.) pifanoi, L. (L.) amazonensis, L. (L.) garnhami e
L. (L.) venezuelensis (LAINSON, 2010).
O subgênero Viannia inclui as espécies Leishmania (Viannia)
braziliensis, L. (V.) peruviana, L. (V.) guyanensis, L. (V.) panamensis, L. (V.)
lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi, L. (V.) colombiensis e L. (V.) lindenbergi
(LAINSON, 2010).
Os agentes responsáveis pela leishmaniose são unicelulares
heteroxênicos, apresentando duas morfologias, diferenciadas pelo habitat e
24
movimento do parasita, sendo a forma promastigota, móvel e flagelada,
caracterizada pelo ciclo de vida extracelular e a forma amastigota, imóvel, com
ciclo de vida intracelular (PESSOA e MARTINS, 1982; RATH et al. 2003).
A forma promastigota caracteriza-se por apresentar corpo alongado,
medindo em torno de 5 a 20 µm de comprimento e 1 a 4 µm de largura,
apresenta núcleo na região mediana da célula, flagelo livre, medindo até 20 µm
de comprimento, cinetoplasto em formato de bastonete curto, anterior ao
núcleo (Figura 2-A). A forma amastigota apresenta corpo ovóide, medindo em
torno de 2 a 4 µm de comprimento, flagelo interno, denominado bolso flagelar,
localizado na invaginação da membrana e cinetoplasto adjacente ao núcleo
(Figura 2-B; CUNNINGHAM, 1885 apud SOUSA, 2009; VANNIER SANTOS et
al. 2002; REY, 2008).
A B
Figura 2 – Formas de Leishmania sp. (A) Promastigota e (B) Amastigotas
Fontes: http://fcfrp.usp.br/dactb/Parasitologia/Arquivos/Genero_Leishmania.htm www.fiocruz.br/ioc/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=315&sid=32
O parasita do gênero Leishmania apresenta ciclo biológico heteroxênico.
A fêmea do mosquito flebotomíneo do gênero Lutzomya, Família Psychodidae
e Subfamília Phlebotominae, durante a hematofagia, retira do animal ou
indivíduo parasitado, macrófagos contendo formas amastigotas da Leishmania
(Figura 3 - 5 e 6). Estas formas evoluem no interior do tubo digestivo do inseto
e migram para a porção anterior do estômago, onde os macrófagos se rompem
e liberam-nas. Durante a migração diferenciam-se em formas promastigotas,
25
sofrendo divisão binária, até se transformarem em promastigotas metacíclicas,
formas infectantes para vertebrados (Figura 3 - 7 e 8; VANNIER SANTOS et al.
2002; GONTIJO et al. 2003; BRASIL, 2006).
O vetor infectado, ao realizar o repasto sanguíneo, inocula na pele do
hospedeiro vertebrado, formas infectantes (Figura 3 - 1), que têm como habitat
os macrófagos e outras células do sistema fagocítico mononuclear (Figura 3 -
2; VANNIER SANTOS et al. 2002; GONTIJO et al. 2003). Nestas células, as
promastigotas adaptam-se, sendo capazes de impedir vários mecanismos de
defesa celular, que deveriam ocasionar a lise da célula (PETERS et al. 2008).
A promastigota metacíclica é envolvida por um vacúolo parasitóforo, que
adere nos lisossomos, permitindo a passagem de enzimas para o fagossomo.
Esses vacúolos são acidificados, contendo muitas enzimas lisossomais e
marcadores fagolisossomais em suas membranas. As promastigotas então se
diferenciam em amastigotas, multiplicando-se por divisão binária no vacúolo
digestivo (Figura 3 - 3), até rompimento dos macrófagos, ocasião em que os
parasitos são liberados e infectam novas células, aumentando a infecção por
disseminação hematogênica (Figura 3 - 4; GONTIJO et al. 2003; NEVES, 2005;
BRASIL, 2006).
Os flebótomos são contaminados pela ingestão de células, contendo
formas amastigotas, enquanto realizam o repasto sanguíneo (Figura 3 - 5). As
amastigotas diferenciam-se em promastigotas procíclicas (não infectivas),
multiplicando-se por divisão binária no trato digestivo do vetor, onde sofrem
metaciclogênese no proventrículo e esôfago e se diferenciam em
promastigotas metacíclicas (infectivas; Figura 3 - 7; SACKS e KAMHAWI, 2001;
CDC, 2014).
26
Figura 3 – Ciclo de vida da Leishmania spp.
Fonte: Adaptado do CDC, 2014.
27
As espécies do gênero Leishmania são disseminadas por dípteros da
subfamília Phlebotominae, através da picada de fêmeas infectadas, que no
Novo Mundo pertencem aos gêneros Lutzomyia e no Velho Mundo ao gênero
Phlebotomus (VANNIER SANTOS et al. 2002).
Os vetores são conhecidos popularmente como birigui, mosquito palha,
tatuquiras, entre outros. Atualmente, as espécies Lutzomyia longipalpis,
transmissora de L.(L.) chagasi no Brasil e Lutzomyia cruzi estão associadas
com a transmissão da doença (BRASIL, 2006).
Os dois tipos gerais da doença são a leishmaniose tegumentar
americana (LTA) e a leishmaniose visceral americana (LVA; RODRIGUES et al.
2011). A LTA apresenta várias formas clínicas que estão associadas aos
distintos subgêneros e espécies de Leishmania, como a leishmaniose cutânea
(LC), leishmaniose cutâneo-difusa (LCD) e leishmaniose muco-cutânea (LMC;
BALAÑA – FOUCE et al. 1998; DESJEUX, 2004; AZEREDO-COUTINHO,
2007; REY, 2008).
A leishmaniose cutânea (LC) compreende as espécies do subgênero
Leishmania (L.(L.) amazonensis, L.(L.) mexicana, L.(L.) venezuelensis, L.(L.)
pifanoi, L.(L.) garnhami) e do subgênero Viannia (L. (V.) braziliensis, L. (V.)
panamensis, L. (V.) peruviana, L. (V.) guyanensis, L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi,
L. (V.) shawi, L. (V.) colombiensis, L. (V.) lindenbergi) peculiares do Novo
Mundo (LAINSON, 2010), sendo diagnosticada pelo aparecimento de lesões na
pele, associadas a úlceras crônicas, de difícil cicatrização. Podem ocorrer
principalmente no local de inoculação das formas infectantes, com provável
aparecimento de numerosas lesões, consequência de múltiplas picadas do
flebotomíneo, sendo este estágio considerado o mais grave da doença
(MARZOCHI, 1992; REY, 2008).
Assim como a LC, a leishmaniose cutâneo-difusa (LCD), também está
relacionada ao Novo Mundo, compreendendo as espécies L.(L.) amazonensis,
L.(L.) mexicana e L.(L.) venezuelensis, apresenta evolução crônica, com
polimorfismo lesional e surgimento de lesões nodulares, que disseminam no
corpo, além de infiltração da mucosa nasal, sendo estas manifestações
clínicas, semelhantes a da hanseníase virchowiana, sem comprometimento
visceral (COSTA et al.1992; HERWALDT, 1999; GONJITO e CARVALHO,
2003).
28
A leishmaniose muco-cutânea (LMC), causada pelas espécies L. (L.)
amazonensis, L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) panamensis
(LAINSON, 2010), caracteriza-se pelo aparecimento de lesões faciais, que
cicatrizam e em momento posterior, ressurgem, sobretudo, nas mucosas do
nariz e boca, podendo ocasionar destruição da cavidade nasal, além do
aparecimento de lesões nodulares, com posterior ulceração e provável risco de
deformação permanente (HERWALDT, 1999; GOMES et al. 2004).
A leishmaniose tegumentar tornou-se uma enfermidade de considerável
interesse na modernidade, devido sua alta incidência e mortalidade,
apresentando grande distribuição com ocorrência na Ásia, Europa, Oriente
Médio, África e Américas (BRASIL, 2006; LAINSON, 2010).
No Brasil, observou-se uma diminuição do número de casos registrados
da doença, comparando dados notificados nos últimos 10 anos, que foram de
28.737 casos em 2004, 21.824 em 2009 e 20.296 em 2014 (PAHO/WHO,
2015). Entretanto, ocorreu expansão geográfica da LTA, sendo atualmente
constatada em todas as Unidades Federativas. Em 2014, a maior densidade de
casos foi na Região Norte (10.387), sendo 41% notificados no Pará (4.356),
seguido do Amazonas com 17% (1.801) e Rondônia com 11% (1.148) dos
casos (PAHO/WHO, 2015).
Nas Américas foram encontradas 14 espécies dermotrópicas de
Leishmania, que infectam o homem e 7 espécies relacionadas a animais. No
Brasil foram evidenciadas oito espécies, sete do subgênero Viannia e uma do
subgênero Leishmania (LAINSON, 2010), sendo as espécies L. (V.)
braziliensis, L.(V.) guyanensis e L.(L.) amazonenses mais encontradas
(BRASIL, 2007).
As espécies de flebotomíneos responsáveis pela disseminação da LTA
no Brasil, são Lutzomyia flaviscutellata, L. whitmani, L. umbratilis, L. intermedia,
L. wellcomei e L. migonei (BRASIL, 2007).
A leishmaniose visceral americana (LVA) ou Calazar é transmitida no
Velho Mundo pelas espécies L. (L.) donovani e L. (L.) infantum infantum e nas
Américas pela espécie L.(L.) infantum chagasi (LAINSON, 2010). É
considerada a forma mais grave da doença, de evolução crônica sistêmica,
apresentando sintomas como febre irregular, fraqueza e perda de peso, com
aparecimento de anemia, esplenomegalia, hepatomegalia e
29
micropoliadenomegalia, se não tratada pode levar a morte (BARONE, 1982;
BALAÑA-FOUCE et al. 1998; HERWALDT, 1999; LAINSON, 2010).
Em 1984, no estado do Pará, município de Santarém, ocorreu surto
epidêmico de leishmaniose visceral, com 94 casos humanos, sendo que 85
foram identificados em área urbana do referido município (BRAUN, 2000).
Conforme o Ministério da Saúde, entre os anos de 2012 a 2014,
ocorreram 9.744 casos de LVA no Brasil, com maior número de notificações na
Região Nordeste (5.076). Em 2014, foram identificados registros da doença em
24 estados brasileiros, com total de 3.453 casos, sendo 58% da Região
Nordeste e 13% da Região Sudeste, com maior incidência no Maranhão (530
casos), seguido do Ceará (466 casos) e Bahia (431 casos; PAHO/WHO, 2015).
Crianças com menos de 10 anos são as mais afetadas pela doença
(54,4%), resultante da imaturidade imunológica celular, agravada pela
desnutrição, frequente em áreas endêmicas, assim como a alta exposição ao
vetor no peridomicílio. Em relação ao sexo, o masculino foi o mais atingido com
60% dos casos (BRASIL, 2006).
Os vetores transmissores da LVA no Velho Mundo são do gênero
Phlebotomus e no Novo Mundo Lutzomyia, dípteros da família Psychodidae,
sendo a espécie de flebotomíneo Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis principal
responsável por toda disseminação geográfica de L. (L.) infantum chagasi
(LAINSON e SHAW, 1987; HERWALDT, 1999, LAINSON, 2010). No Brasil, as
espécies Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi são as responsáveis pela
transmissão da doença (LAINSON e SHAW, 1987; HERWALDT, 1999).
O tratamento da leishmaniose é realizado com antimonial pentavalente
(Sb+5), fármaco de primeira escolha, encontrado em duas formas: o
Antimoniato de N-metilglucamina (Glucantine - 3) e o Stibogluconato de sódio
(Pentostan - 4), no entanto, o último não é comercializado no Brasil. O
tratamento das leishmanioses com os antimoniais possuem algumas
desvantagens como respostas mais tardias e probabilidade de reincidência
(HERWALDT, 1999; GONTIJO et al. 2003).
30
CH2NHCH3+
HCOH
HOCH
HCOH
HCOH
CH2OH
(OH)2SbO-
CH2OH
HCOH
HCO
HCO
HCO
COO-
Sb
OH
O Sb
O-
OCH
OCH
OCH
COO-
HCOH
CH2OH
3Na+
(3) (4)
Figura 04: Estruturas químicas do Antimoniato N-metil glucamina (3) e Estibogluconato de sódio (4)
Os antimoniais pentavalentes apresentam mecanismo de ação ainda
pouco esclarecido, contudo é sabido que afetam os processos bioquímicos das
formas amastigotas de Leishmania (RATH et al. 2003; BRASIL, 2006).
Como a forma pentavalente é menos tóxica, é provável que seja um pró-
fármaco e ao chegar perto do sítio de ação, no interior dos macrófagos ou
próximo destes, se converta na forma trivalente mais tóxica (GOODWIN e
PAGE, 1943), responsável também pela ação terapêutica do medicamento
(RATH et al. 2003). Desta maneira, afeta o processo de glicólise e β – oxidação
de ácidos graxos, ocasionando uma redução drástica na quantidade de ATP
intracelular, resultando na morte do parasito (BALAÑA-FOUCE et al. 1998).
Segundo Bangs e colaboradores (2001), a forma amastigota é
constituída de uma metaloprotease zinco dependente, fundamental para o
crescimento do parasita, que perde sua função, se o zinco da enzima for
permutado pelo antimônio.
A Organização Mundial de Saúde juntamente com o Centro de Controle
de Doenças (CDC) dos Estados Unidos da América sugeriram doses
gradativamente maiores de antimoniais, em consequência do surgimento de
resistência em países como Índia, Quênia e Sudão (BRASIL, 2006). Entretanto,
o grande problema da utilização desses medicamentos está relacionado à
cardiotoxicidade, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade, que representam uma
importante restrição ao seu uso, principalmente em pacientes mais idosos,
sendo proibido em gestantes por serem drogas abortivas (GONTIJO et al.
2003).
31
A anfotericina B (5), antibiótico poliênico, oriundo da cepa de
Streptomyces nodosus, é um antifúngico recomendado para o tratamento de
leishmaniose mucocutânea americana (RATH et al. 2003). O ergosterol,
esteróide de 28 carbonos, é o principal integrante da membrana plasmática da
Leishmania e dos fungos, enquanto que na membrana plasmática de células
animais, este constituinte é representado pelo colesterol (BEZERRA et al.
2004; CAMPBELL e FARRELL, 2007).
H3C O
O OH OH O
OH
OH OH
OHOH
COOHH
O
H3C
CH3
HO
O
OH
NH2
OH
CH3
(5)
Figura 05: Estrutura química da Anfotericina B (5)
O mecanismo de ação da Anfotericina está relacionado à toxicidade
seletiva, quando se liga ao éster episterol, precursor do ergosterol, na
membrana citoplasmática da Leishmania, origina poros que ocasionam a saída
de íons, alterando a permeabilidade da membrana e posteriormente matando o
parasita (ZYGMUNT, 1966; BOLARD et al. 1993; MURRAY, 2005). A
anfotericina pode atuar tanto nas formas promastigotas, como nas formas
amastigotas (AL-MOHAMMED et al. 2005).
O desoxicolato sódico da anfotericina B é utilizado quando o tratamento
com antimonial não é efetivo ou na impossibilidade de seu uso, sendo eficaz
principalmente no tratamento das lesões mucosas. Contudo, apresenta efeitos
como cardiotoxicidade e nefrotoxicidade, limitando a utilização no ambiente
hospitalar, devido sua adiministração endovenosa (GONTIJO et al. 2003). Tem
32
sido muito utilizado no tratamento de leishmaniose visceral (AMATO et al.
2000; SERENO et al. 2000).
A anfotericina B pode ocasionar várias reações adversas, sendo
considerada muito tóxica para as células do endotélio vascular. As infusões
lentas do medicamento ocasionam constantemente febre, calafrios, vômitos e
cefaleia, enquanto que, as infusões rápidas estão relacionadas com o
surgimento de nefrotoxicidade, hipocalemia e hiperpotassemia. A gravidade
dos sintomas está relacionada à ativação de citocinas, que é ocasionada pela
administração do fármaco, estimulando uma resposta pró-inflamatória. Nas
infusões lentas ocorre uma indução tardia desses mediadores (ERIKSSON et
al. 2001; GONJITO et al. 2003; FILIPPIN e SOUZA, 2006).
Outras três novas formulações, anfotericina B lipossomal, complexo de
lipídeos de anfotericina B e dispersão coloidal de anfotericina foram incluídas
no mercado e têm sido utilizadas no tratamento da leishmaniose (DORA e
SOUZA, 2005), sendo equivalentes a anfotericina B na eficácia, porém são
relativamente menos tóxicas (WHO, 2010).
O antibiótico aminoglicosídeo, paromomicina (aminosidina; 6) é outro
fármaco usado no tratamento da leishmaniose, podendo acarretar em alguns
pacientes nefrotoxicidade e ototoxidade, produzindo distúrbios de controle
motor e equilíbrio (BEZERRA et al. 2004). O tratamento da leishmaniose com
isotionato de pentamidina (7) tem sido relacionado às seguintes reações
adversas: diabetes mellitus, hipoglicemia grave, choque, miocardite e
toxicidade renal (MISHRA et al. 2009; WHO, 2010).
OH
O
O
OH
HO
HO
HONH2 O
NH2
H2N
OO
OHO
O
NH2
H2N
HO
HO
NH
H2N
O O
NH
NH2
(6) (7)
Figura 06: Estruturas químicas da Paromomicina (6) e Isotionato de pentamidina (7)
33
Ao tratamento da leishmaniose com miltefosina (8), um alquil-fosfolipídio,
tem sido atribuído as seguintes reações: problemas gastrintestinais (38%),
diarreia (20%) e teratogenia, o que restringe seu uso em grávidas e mulheres
em idade fértil (MISHRA et al. 2009; WHO, 2010).
CH3
O
P
O
O
O
N+
CH3
CH3H3C
(8)
Figura 07: Estrutura química da Miltefosina (8)
E por último, os medicamentos azois, antifúngicos orais, como o
cetoconazol (9), fluconazol (10) e itraconazol (11), que apresentam efeitos
variáveis no tratamento da leishmaniose (MISHRA et al. 2009; WHO, 2010).
O Cetoconazol é ativo contra a espécie L.major, mas é inativo nas
espécies L.tropica e L.aethiopica (WEINRAUCH et al. 1987). Em outro estudo,
todos os pacientes com leishmaniose visceral, que obtiveram cura quando
tratados com fluconazol apresentaram recidiva da doença, além de exibir fraca
atividade contra a espécie L.major e nenhuma atividade contra L.donovani
(SUNDAR et al. 1996; ALRAJHI et al. 2002).
Em estudo de Morizot e colaboradores (2007), pacientes acometidos por
L.major foram submetidos a tratamento com fluconazol e apresentaram taxa de
cura semelhante à de pacientes submetidos ao uso de placebo (44%). De
modo equivalente, ocorreu com o medicamento itraconazol, que após
tratamento de pacientes infectados por L.major, obteve-se taxa de cura (59%),
similar ao do grupo placebo testado (53%; NASSIRI-KASHANI et al. 2005).
34
N N
O
OO
O
H Cl
Cl
N
N
F
F
NN
N
OH
NN
N
(9) (10)
Cl
Cl
O
O
O
N
NN
N
N
N
N
N
O
(11)
Figura 08: Estruturas químicas do Cetoconazol (9), Fluconazol (10) e Itraconazol (11)
Desta forma, constata-se que o tratamento para leishmaniose apresenta
dificuldades, a começar pelo tratamento de primeira escolha, o medicamento
antimoniato de metilglutamina, que pode provocar graves efeitos secundários
tóxicos (LUCAS e KOLODZIEJ, 2013), apresentando eficácia variável em
consequência da baixa dosagem e interrupção do tratamento, sendo
consideráveis causas no aumento de recaídas e formas resistentes dos
parasitas (SUNDAR et al. 2001).
Portanto, a toxicidade dos fármacos utilizados é um fator a se
considerar, visto que existem muitas limitações ao uso dos mesmos, além do
alto custo e da baixa eficácia de outros medicamentos acessíveis no mercado.
Um método alternativo seria o uso de plantas medicinais na terapia das
leishmanioses, buscando espécies com atividade antileishmania e reduzidos
35
efeitos tóxicos. Na Amazônia brasileira, algumas espécies de plantas têm
mostrado atividade antileishmania e também têm sido muito utilizadas na
medicina popular. Portanto, neste trabalho, será analisada a espécie
Himatanthus articulatus, conhecida vulgarmente como “sucuuba”, pertencente
à família Apocynaceae, quanto ao seu potencial leishmanicida.
2.2 A família Apocynaceae e o gênero Himatanthus
A família Apocynaceae é prevalente nos trópicos e subtrópicos, contudo
é incomum em regiões temperadas. Abrange em torno de 250 gêneros e 2000
espécies (STRUWE et al. 1994; RIBEIRO et al. 1999).
Esta família faz parte da divisão Magnoliophyta, classe Magnoliopsida,
subclasse Asteridae e ordem Gentianales, a qual inclui as famílias
Apocynaceae, Asclepiadaceae, Gentianaceae, Loganiaceae e Saccifoliaceae
(CRONQUIST, 1988; DISTASI e HIRUMA-LIMA, 2002).
Espécies pertencentes à família Apocynaceae são vegetais laticíferos,
com ou sem ramificação, contendo látex de cor branca, com cálice constituído
de prefloração imbricada ou quincucial. As flores são actinomorfas ou
zigomorfas e as folhas são do tipo opostas, verticulares ou alternas, sem
estípulas e glândulas no limbo ou pecíolo, com inflorescência terminal, axilar ou
lateral. Os frutos são do tipo cápsula loculicida, drupóide, bacóide ou múltiplos
e possuem uma ou várias sementes, que podem ser secas ou ariladas. As
anteras são fundidas ao estilete, parcialmente férteis (BARROSO, 1991; JOLY,
1998; QUINET e ANDREATA, 2005).
Um total de 41 gêneros, com cerca de 400 espécies, foram cadastrados
como apocináceas na flora brasileira, onde 32 destas espécies foram
constatadas somente na Amazônia (CAMPBELL e HAMMOND, 1989),
apresentando como constituintes químicos ácidos fenólicos, ciclitóis,
cumarinas, glicosídeos cardioativos e cianogenéticos, saponinas, taninos e
triterpenóides (EVANS, 2002).
O gênero Himatanthus é encontrado na região Neotropical, distribuindo-
se desde o Panamá até o Sudoeste do Brasil, onde a maior parte das espécies
é encontrada na região amazônica, com ocorrência também na costa e centro-
oeste do Brasil (SPINA, 2004).
36
As árvores deste gênero possuem ramos lenhosos e podem se
desenvolver até 20m de altura. As espécies são descritas, na maioria das
vezes, como arbustos, sendo esta classificação equivocada, em razão de
constituírem um tronco delimitado e lenhoso, com ramificações terminais
(FONT QUER, 1979), além de expor floração precoce (SPINA, 2004).
As folhas são simples, alternas, com ramos congestos no ápice, podem
ser revoluta, pecioladas ou sésseis, com diferentes formas de limbo.
Apresentam inflorescências do tipo tirsóide, constituída por cincínio dicotômico,
de eixo reduzido, terminais e articuladas. Ausência de estruturas secretoras no
cálice. As sementes exibem alas envolvendo o núcleo seminífero e o limbo
foliar é composto por dobras cuticulares em torno dos estômatos (SPINA,
2004).
Os iridóides, compostos monoterpênicos com núcleo
tetraidrociclopentano-pirano, foram os metabólitos mais identificados do gênero
Himatanthus (KUBLINSKI, 2000).
O gênero Himatanthus Willd ex Schult. da família Apocynaceae s.l., está
subordinado à subfamília Rauvolfoideae e à tribo Plumerieae (ENDRESS e
BRUYNS, 2000). As espécies H. sucuuba (Spruce) Woodson e H.articulatus
(Vahl) Woodson foram inicialmente descritas como distintas, sendo a primeira
caracterizada como específica da América do Sul e a segunda do Panamá
(WOODSON, 1938).
Reavaliação da circunscrição das espécies de Himatanthus, atualizando
sua distribuição geográfica e verificando as relações filogenéticas entre os
gêneros, considerou a espécie Himatanthus sucuuba sinonímia de Himatanthus
articulatus, com fundamentação em estudos taxonômicos, micro-morfológicos e
filogenéticos (SPINA, 2004).
A H.sucuuba (H.articulatus) é uma árvore lactescente, que cresce de 8 a
20 m de altura (PLUMEL, 1991), com folhas simples, alternas e simétricas, que
medem em torno de 20 cm de comprimento por 7 cm de largura, pouco
pecioladas (LARROSA e DUARTE, 2005).
Os frutos são deiscentes e abundantes com sementes elipsoides e
secas, revestidas por uma membrana circular protetora, que favorece a
dissipação da espécie através do vento e/ou água (PLUMEL, 1991; FERREIRA
et al. 2005). Essa espécie é prevalente na bacia amazônica (PLUMEL, 1991),
37
encontrada em terra firme ou ocupando áreas mais baixas de várzea
(WITTMANN et al. 2002) .
A H.sucuuba (H.articulatus) é uma espécie encontrada na Bolívia,
Colômbia, Guiana Francesa, Peru, Panamá, Suriname e Venezuela. No Brasil
pode ser vista no Cerrado do estado de Roraima (RR) e no norte da Amazônia
(MILLIKEN, 1995; MIRANDA et al. 2000).
No Peru, a casca desta espécie é usada como infusão na cicatrização
de feridas, tumores, furúnculos, inchaços, artrite, laxante e vermífugo
(PERDUE e BLOMSTER, 1978).
Os povos indígenas Macuxi, Maiongong, Taurepang e Ingarikó
utilizavam esta planta como remédio fitoterápico (MILLIKEN, 1995). No norte
do Brasil utiliza-se a casca seca como afrodisíaca e antiúlcera e o látex como
agente antitumoral (VAN DEN BERG, 1984), sendo conhecida também como
sucuuba, janaguba ou sucuba (VAN DEN BERG, 1982).
Devido ao extenso uso popular de H. articulatus, vários estudos
fitoquímicos, farmacológicos e toxicológicos já foram realizados. Alguns
aspectos encontram-se bem elucidados, como os principais metabólitos
isolados da H.sucuuba (H.articulatus) pertencerem à classe dos iridoides
(BARRETO et al. 2007; CASTILLO et al. 2007). Esta planta possui potencial
antiparasitário (CASTILLO et al. 2007; SOARES et al. 2010) e os resultados da
toxicidade são inconsistentes (GUERRA e PETERS, 1991; VILLEGAS et al.
1997; VALE et al. 2015).
Estudo fitoquímico do extrato hexânico, obtido das cascas de H.sucuuba
(H.articulatus) levou ao isolamento da fulvoplumericina (12; PERDUE e
BLOMSTER, 1978). Esta substância apresentou atividade inibitória de CI50=45
µg/mL, da enzima transcriptase reversa (RT), presente no vírus da
imunodeficiência humana (HIV; TAN et al. 1991).
38
O
COOMe
O
(12)
Figura 09: Estrutura química da Fulvoplumericina (12)
Guerra e Peters (1991) realizaram estudos de toxicidade materna e
desenvolvimento pré-natal em ratas Wistar grávidas, administrando 80 mg/dia
da decocção das cascas de H.sucuuba (H.articulatus) do 6° ao 15° dia de
gravidez. Após comparação com o grupo controle, constataram que não foi
nocivo para o desenvolvimento fetal, não ocorrendo alteração no crescimento
das crias e não sendo observado qualquer efeito tóxico nos fetos recém-
nascidos, indicando que a preparação tem grande probabilidade de não ser
tóxica.
Em outro estudo, ratos Balb C machos foram submetidos à avaliação de
toxicidade aguda, utilizando concentrações de 0,1-1,0 mg/g de peso do extrato
de H.sucuuba (H.articulatus), em várias administrações, num período de 72
horas, sendo observado após os testes, que não apresentou toxicidade nas
cobaias (VILLEGAS et al. 1997).
No estudo de Vale e colaboradores (2015), o extrato etanólico das
cascas de H.articulatus foi submetido à avaliação de toxicidade aguda e
subcrônica, e após administração de 5,0 mg/kg em camundongos Swiss
albinos (14 dias), não foram observadas alterações clínicas,
anatomopatológicas e histopatológicas, indicando baixa toxicidade aguda. No
entanto, constatou-se alterações hematológicas e bioquímicas tóxicas, na
administração de 100mg/kg, com aumento significativo do TBARS hepático
(substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico) em ratas fêmeas, sugerindo
aumento de dano da membrana celular. Apresentou baixa citotoxicidade em
células HepG2 (CI50 > 1000 mg/mL).
Diante do exposto, os resultados de citotoxicidade necessitam ser
reavaliados, pois alguns autores apontam para nenhuma toxicidade (GUERRA
39
e PETERS, 1991; VILLEGAS et al. 1997), enquanto outros estudos sinalizam
para baixa citotoxicidade aguda, porém com alterações clínicas consideráveis
na avaliação da toxicidade subcrônica (VALE et al. 2015).
Do extrato aquoso obtido do látex de H.sucuuba (H.articulatus) foram
isolados os iridoides 15-desmetilplumierídeo (13), plumierídeo (14) e
isoplumierídeo (15; BARRETO et al. 2007).
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
HO
COOH
O
O
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
HO
O
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
HOOOH
(13) (14) (15)
Figura 10: Estruturas químicas do 15 - Desmetilplumierídeo (13), Plumierídeo (14) e
Isoplumierídeo (15)
Dois pepsídeos foram isolados da H.sucuuba (H.articulatus), o ácido 2’ -
O- metilperlatólico (16) e o ácido confluêntico (17). Estas substâncias foram
submetidas à avaliação da atividade inibitória sobre a monoamina oxidase B e
exibiram valores de CI50= 0,22µM (ácido confluêntico), com atividade de
inibição de 6,5 % (MAO-A) e 87,9% (MAO-B) e CI50= 81µM (ácido 2’ -O-
metilperlatólico), com atividade de inibição de 1,8% (MAO-B), constatando
maior potencial de inibição do ácido confluêntico. Além disso, foram ainda
isolados do extrato metanólico, o ácido β – diidroplumericina (18), ácido
vanílico (19), ácido ρ – coumárico (20), ácido ρ – hidroxibenzóico (21),
plumericina e isoplumericina (ENDO et al. 1994).
40
O
O
OO
O
O
O
CH3
H3C
H3C
H3C
H
H
O
O
CH3O
n-C5H11
OCH3
OCH3
n-C5H11
COOH
(16) (17)
COOHH
O
O
O
H
O
H
OHO
OH
O
CH3
OH
O
HO
OH
O
HO
(18) (19) (20) (21)
Figura 11: Estruturas químicas do Ácido 2’ -O- metilperlatólico (16), Ácido confluêntico (17),
Ácido β – diidroplumericina (18), Ácido vanílico (19), Ácido ρ – coumárico (20), Ácido ρ –
hidroxibenzóico (21)
Da fração hexânica de H.sucuuba (H.articulatus) foram isolados
cinamato de lupeol (22), cinamato de α-amirina (23) e acetato de lupeol (24;
FERRIGNI et al. 1976; MIRANDA et al. 2000). Esta fração foi submetida à
avaliação da atividade antiinflamatória, através de teste de edema de pata,
induzido por carragenina em ratos, apresentando inibição de 35,9% na
formação de edema, com administração de 200 mg/kg, o que não foi
observado na dosagem de 100 mg/kg. A fração contendo apenas cinamatos
inibiu o edema (50-40%) e a constrição abdominal (57,9%) com administração
oral de 100 mg/kg, exibindo maior atividade antiinflamatória (MIRANDA et al.
2000).
41
O
O
O
O
(22) (23)
COO
CH3
(24)
Figura 12: Estruturas químicas do Cinamato de lupeol (22), Cinamato de α-amirina (23),
Acetato de lupeol (24)
O extrato etanólico da casca de H.sucuuba (H.articulatus) mostrou
atividade contra formas amastigotas axênicas de Leishmania amazonensis
(CI50 = 5µg/mL). Os iridoides plumericina e isoplumericina, isolados do extrato
etanólico, apresentaram CI50 de 0,21 µM e 0,28 µM, repectivamente, exibindo
forte atividade contra formas amastigotas de L. amazonensis. Estas
substâncias foram submetidas à avaliação de citotoxicidade em macrófagos
peritoneais de ratos e células tumorais VERO e exibiram CI50 1,86 µM,
concluindo apresentarem menor toxicidade nas células do que no parasita
(amastigota; CASTILLO et al. 2007). Em síntese, estes iridoides são
promissores como leishmanicidas.
O extrato butanólico do látex da H.sucuuba (H.articulatus) foi submetido
à avaliação da atividade contra formas promastigota de L. amazonensis,
determinando-se o indice de redução da infecção dos macrófagos pelo
parasito. Observou-se que culturas tratadas com diferentes concentrações
deste extrato (100, 50 e 10mg/mL) apresentaram uma diminuição na taxa de
42
infecção, sendo observada uma redução de 100% na maior concentração. Em
relação à citotoxicidade, o extrato butanólico mostrou baixa citotoxicidade,
inibindo 14% da atividade mitocondrial dos macrófagos em concentrações de
200 µg/mL (SOARES et al. 2010).
Os extratos metanólicos das folhas da H. articulatus apresentaram
atividade contra S. Aureus. Os extratos metanólicos das cascas e folhas
inibiram o crescimento de B. subtilis e todos os extratos metanólicos e o látex
da H. articulatus mostraram ação inibitória contra Candida albicans
(SEQUEIRA et al. 2009). As atividades antifúngica e antiinflamatória desta
planta estão relacionadas à alta polaridade do metanol e sua afinidade por
alcalóides, iridoides e terpenos, entre outros (MATOS, 1989).
As atividades genotóxica e antigenotóxica do látex de H.articulatus foram
avaliadas em células do sangue e sua atividade mutagênica foi analisada na
medula óssea e em células sanguíneas de ratos, através dos ensaios de
micronúcleos e cometa. Os resultados obtidos nestes ensaios não mostraram
efeitos mutagênicos e nem genotóxicos (REBOUÇAS et al. 2011).
Foi avaliada também, a atividade antioxidante, com realização de testes
de indução de quebras de DNA, onde se constatou aumento da resistência
celular em relação a danos no DNA causados por indução de H2O2
(REBOUÇAS et al. 2011).
Como citado anteriormente, o extrato etanólico da casca e o extrato
butanólico do látex da H. articulatus apresentaram atividade nas formas
promastigotas e amastigotas da espécie Leishmania amazonensis, mas ainda
não foram realizados estudos que avaliassem o efeito do fracionamento sobre
esta atividade. Para tanto, efetuamos este estudo com o objetivo de isolar
compostos ativos de frações do extrato etanólico da H. articulatus contra
formas de L. amazonensis, com menor grau de toxicidade para as células
humanas.
43
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
Realizar estudos fitoquímicos e avaliar a atividade antipromastigota e
citotoxicidade de Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson (Apocynaceae).
3.2 Objetivos específicos
● Realizar o fracionamento do extrato etanólico de Himatanthus articulatus
frente a formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis;
● Avaliar a atividade antipromastigota de extratos e frações de Himatanthus
articulatus frente a formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis;
● Avaliar a citotoxicidade do extrato e frações de Himatanthus articulatus frente
à Linhagem Celular THP-1;
● Determinar o Índice de Seletividade do extrato e frações de Himatanthus
articulatus.
.
44
4 MATERIAL E METODOS
4.1 MATERIAL
4.1.1 Equipamentos
▪ Autoclave-Phoenix
▪ Balança analítica Mettler Toledo modelo AB204
▪ Banho Maria – SOLAB Científica SL 150
▪ Bomba de vácuo – Fabbe
▪ Bomba de vácuo modelo V700 (Buchi)
▪ Cabine de fluxo laminar vertical – Pachane, modelo PA 310
▪ Câmara de contagem Neubauer espelhada – Improved
▪ Capela de exaustão– Quimis
▪ Centrifuga de bancada p/ tubos 12x15ml, modelo EEQ9004A
▪ Centrifuga refrigerada-Cientec Equipamentos para Laboratório, modelo CT-
600R
▪ Chapa de aquecimento Quimis
▪ Contador manual de células – DIGETIMER
▪ Cromatógrafo líquido e alta eficiência (CLAE-DAD), modalidade analítica,
Waters®, equipado com injetor automático, modelo 2695, detector de arranjos
de diodos (DAD), modelo 2996, bomba modelo L-6200A, integrador, modelo C-
R4A
▪ Dessecador de vidro
▪ Destilador de água
▪ Espectro de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) Varian Mercury 300
▪ Estufa ventilada para secagem de material vegetal Fanem, modelo 501A
▪ Estufa de CO2
▪ Evaporador rotatório Buchi, modelo R114, com banho–maria modelo 480
▪ Leitura de Microplacas – ELISA Start Fax®, modelo 2100
▪ Liofilizador
▪ Microscópio invertido – Zeizz, modelo Axiovert 25
▪ Micropipetas, volume ajustável de 10 – 100 µL e de 100 – 1000 µL –
Paguepet
45
▪ Microscópio óptico Eclipse, modelo E200 – NIKON
▪ Moinho de facas, Marconi
▪ Percolador
▪ Refrigerador Consul
▪ Sistema de filtração a vácuo 250 mL, membrana 0,22 µm – TPP – Switzerland
▪ Sistema de filtração de água Millipores, Milli-Q Plus
▪ Sistema de putificação de água Millipores, Milli-Q Plus
▪ Ultrasson Thornton, modelo T14
4.1.2. Solventes, Reagentes e outros
▪ Ácido acético (Isofar®)
▪ Acetato de etila P.A – (Isofar®)
▪ Acetonitrila grau CLAE (Tedia Company®)
▪ Ácido Clorídrico (Isofar®)
▪ Ácido sulfúrico (Isofar®)
▪ Água deionizada (filtrada em sistema Milli-Qplus)
▪ Água destilada
▪ Álcool grau 96° GL (Álcool Etílico Hidratado) – Santa Cruz LTDA
▪ Álcool Metílico (Metanol) – CAQ (CASA da Química Ind. e Com. LTDA)
▪ Bicarbonato de sódio – Sigma-Aldrich
▪ Clorofórmio – D4 deuterado (Merck®)
▪ Diclorometano P.A – (Isofar®)
▪ Dimetilsulfóxido (DMSO) – Sigma- Aldrich
▪ Etanol (Souza Cruz®)
▪ Éter etílico (Isofar)
▪ Hexano P.A – CAQ (CASA da Química Ind. e Com. LTDA)
▪ Metanol (isofar®)
▪ Metanol-D4 deuterado (Merck®)
▪ Metanol grau CLAE (Tedia Company®)
▪ Sílica gel 60 (00,063-0,200mm) pra coluna cromatográfica (Merck®)
▪ Sílica gel 60 para cromatografia de camada delgada Flash (Merck®)
▪ Sílica gel para cromatografia em camada fina – Macherey-Nagel
46
▪ Sílica gel para cromatografia em coluna 63-200 mm/70-230 mesh ASTM-
Macherey-Nagel merck e mesh
4.1.3 Fármacos, meios de cultura e corantes
▪ Anfotericina B 50 mg sol. Inj. – Cristália produtos farmacêuticos
▪ Corante Azul de Tripan em solução (0,4%/100 mL) testado para cultura de
célula- Sigma-Aldrich
▪ Estreptomicina (Sulfato de estreptomicina) 200 mg/mL solução injetável –
Wyeth Whitehall
▪ Gentamicina (Sulfato de gentamicina) 80 mg/2mL solução injetável –
Novafarma Indústria Farmacêutica LTDA
▪ Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) com glutamina - Sigma –
Aldrich
▪ MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)- 2,5-difeniltetrazolium) 500 mg –
Sigma-Aldrich
▪ Penicilina g Benzatina 1.200.000 UI solução injetável - Sigma Aldrich
▪ Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Sigma - Aldrich
▪ Propilenoglicol – Vital especialidades
▪ Soro fetal bovino - Gibco
4.1.4 Materiais plásticos e metal
▪ Cuba cromatográfica
▪ Espátulas de metal
▪ Espalhador
▪ Estantes plásticas
▪ Garrafas para cultura de células suspensão estéril 12,5 cm2, 25 cm2 e 75 cm2
– Interprise Instrumentos Analíticos LTDA
▪ Membranas filtrantes Millipore, Millex F6 0,2 mm
▪ Papel alumínio comercial
▪ Papel de filtro MN 618
▪ Pipetas Pasteur de plástico
▪ Placas de cultura de células de 96 poços, fundo chato com tampa – TPP
47
▪ Placas cromatográficas de alumínio com 0,2mm de espessura contendo gel
de sílica 60 F254 Merck
▪ Ponteiras de 10 – 1000 µL e de 20 a 200µL
▪ Suporte de ferro
▪ Tubo cônico graduado 15 mL não estéril (Tipo Falcon)
▪ Tubo cônico graduado 50 mL estéril (Tipo Falcon) - Becton-Dicknson
▪ Tubos de microcentrifuga (Tubos eppendorf) de 1,5 e 2,0 mL – Alfa
4.1.5 Vidrarias
▪ Balão de fundo redondo de 100, 250 e 500 mL
▪ Bastão de vidro
▪ Balão volumétrico de 500, 1000 mL – Laborquimi
▪ Becker de 10, 50, 100, 250, 500 e 1000 mL – Satelit
▪ Condensador em bolas
▪ Cubas cromatográficas
▪ Coluna cromatográfica de vidro 100 x 2,5 cm
▪ Erlenmeyes de 50, 100, 250 e 500 mL – Vidrolabor
▪ Frascos de penicilina 50 mL
▪ Funil de separação de 250 e 2000 mL
▪ Pipetas graduadas de 1 mL, 5 mL, 10 mL – Vidrolabor
▪ Pipeta Pauster de vidro – VWR
▪ Pipetas volumétricas de 10 e 20 mL
▪ Placas cromatográficas de vidro 10x5 e 10x10 cm
▪ Placas de Petri 90x15 - PROLAB
▪ Proveta de 20, 50, 100, 250 mL, 500 mL e 100 mL – Vidrolex
▪ Tubo vial para CLAE
48
4.2 Revelador utilizado na prospecção fitoquímica por cromatografia em
camada delgada (CCD)
4.2.1 ANISALDEÍDO - ÁCIDO SULFÚRICO
Em um becker de 250 mL, 0,5 mL de anisaldeído foram misturados a 10
mL de ácido acético glacial, homogeneizou-se e adicionou-se 85mL de
metanol, seguido de 5 mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4).
Homogeneizou-se e posteriormente a solução foi conservada em frasco âmbar
sob refrigeração, na temperatura de 2-8°C (WAGNER et al. 1984).
4.2.2 REAGENTE DRAGENDORFF
Preparou-se duas soluções, utilizando-se dois becker de 100 mL. No
primeiro becker adicionou-se 0,850 g de subnitrato de bismuto, 10 mL de ácido
acético e 40 mL de água destilada. No segundo becker misturou-se 20 mL de
água destilada a 8,0 g de iodeto de potássio. Em seguida, misturaram-se as
soluções na proporção de 1:1. Da solução final, retirou-se 2,0 mL e dilui-se em
4,0 mL de ácido acético e 20 mL de água destilada (WAGNER et al. 1984).
4.3 Meios de Cultivo
4.3.1 Meio NOVY-NICOLLE-MCNEAL (NNN)
A solução foi preparada em recipentes de Erlenmeyer, onde se diluiu 14
g de Agar base e 6 g de cloreto de sódio em água destilada (900 mL). Logo
após, o composto foi aquecido até completa solubilização, passando por
autoclavação durante 15 minutos (121 °C) e colocado em banho Maria (50°C)
para esfriamento. Foi acrescentado coágulo ao composto asséptico, sendo
este obtido de 45 mL de sangue desfibrinado (coelho).
Após mistura do meio, usou-se tubos de 5 mL, os quais permaneceram
encurvados até endurecimento da solução. Posteriormente, os tubos foram
colocados na geladeira para exsudação completa do meio. Os nutrientes
49
indispensáveis para a adequada atividade do meio estão na parte difásica
(aquosa; COELHO e CARVALHO, 2005).
4.3.2 Meio incompleto de RPMI 1640 (ROSWELL PARK MEMORIAL
INSTITUTE) com L-glutamina
No preparo do meio incompleto, utilizou-se recipiente de Erlenmeyer,
onde se acrescentou 200 mL de água destilada e 10,4 g de meio RPMI 1640
(pó), realizando uma dissolução. Em seguida foi acrescentado 2 g de
bicarbonato de sódio e 10 mM de Hepes, completando um volume de 1000 mL.
Conferiu-se o pH do meio, que deve ser em torno de 7,2 (neutro), sempre
corrigido quando não for equivalente a este valor. Logo após, usou-se
membrana de 0,22 µm para fitrar e esterilizar o meio, que foi mantido em
recipientes estéreis a uma temperatura de 4°C (REBELLO, 2014).
4.3.3 Meio completo de RPMI 1640 (ROSWELL PARK MEMORIAL
INSTITUTE)
Em um recipiente de Erlenmeyer, colocou-se 20 mL de meio RPMI
incompleto, seguido de 4 mL de soro fetal bovino, desnaturado a 56°C por 2
horas, realizando-se homogeização. Em seguida adicionou-se 100 U/mL de
solução de penicilina e 50 µg/mL de gentamicina, completando-se um volume
de 40 mL de meio RPMI incompleto (MISRA et al. 2008; SILVA et al. 2012).
4.3.4 Meio completo de RPMI 1640 (ROSWELL PARK MEMORIAL
INSTITUTE) com L-glutamina modificado para cultivo de células THP-1
Utilizou-se um frasco de Erlenmeyer, onde foi adicionado 10 mM de
HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 4500 mg/L de glicose e 1500 mg/L de
bicarbonato e sódio, dissolvidos em água ultrapura. A solução foi filtrada sob
pressão, com membrana de celulose (poro 0,22 µm), em condições estéreis.
Posteriormente acrescentou-se 10% de soro fetal bovino para suplementação
do meio, além de 100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina. O pH
50
foi corrigido para 7,4, usando solução estéril de bicarbonato de sódio a 0,1
mol/L e conservado sob refrigeração (TSUCHIYA, 1982; SKUBITZ et al. 1983).
4.4 MATERIAL BIOLÓGICO
4.4.1 Espécie do gênero Leishmania
Neste estudo, os parasitas usados foram formas promastigotas de
Leishmania (L.) amazonensis, sob o registro MHOM/BR/2009/M26361, isolada
de caso humano, oriundo do município de Ulianópolis, Estado do Pará,
gentilmente cedidas pelo Dr. Fernando Tobias Silveira, pesquisador do Instituto
Evandro Chagas (IEC).
4.4.2 Células THP-1
Nos ensaios biológicos in vitro, foi utilizada linhagem celular de leucemia
monocítica aguda humana (THP-1), obtida do Banco de Células do Rio de
Janeiro (BCRJ), Lote n° 000722. A linhagem foi preservada em meio RPMI
1640 com 10% de Soro Fetal Bovino, sob temperatura de 37 ºC e atmosfera de
5% de CO2.
4.5 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL
No dia 26/04/2013 (manhã), localidade de Volta Grande do Xingu, em
Belo Monte, Serra do Pardo, na região da Terra do Meio, município de
Altamira, Estado do Pará, foram obtidas as cascas de Himatanthus articulatus
(Vahl) Woodson, sob as coordenadas S 41°10’86’’ W 41°53’51,6’’. A Dra.
Márlia Regina Coelho Ferreira realizou a especificação da espécie. A
conservação da exsicata (Figura 3) foi realizada pelo Museu Paraense Emílio
Goeldi (Herbário João Murça Pires) através do registro de n° MG 206619.
51
Figura 13: Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson (Exsicata) Fonte: VALE, 2014.
4.6 MÉTODOS
4.6.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS
4.6.1.1 Obtenção do extrato etanólico da casca da Himatanthus articulatus
O material vegetal (cascas) da H. articulatus, após lavagem em água
corrente e álcool a 70%, foi secado em estufa de ventilação de ar circulado, na
temperatura de 40°C, durante 7 dias. Posteriormente, foi triturado (moinho de
facas) e o pó obtido foi usado no processo extrativo (1000 g). Realizou-se
maceração descontínua exaustiva com etanol comercial 96 °GL (VALE et al.
2015).
Foram usados na primeira extração, 4 litros de solvente e o extrato
coletado após 24 horas. Este processo foi repetido mais oito vezes, utilizando-
se 1,5 litros de solvente, totalizando 16 litros. O material resultante foi
concentrado em evaporador rotatório, sob vácuo (50°C), para obtenção do
extrato seco, que posteriormente passou por liofilização até formação do
extrato etanólico (EEHA).
52
O extrato etanólico obtido das cascas de Himatanthus articulatus (10g),
foi submetido ao fracionamento em coluna cromatográfica aberta (altura de 73
cm e diâmetro 4 cm), utilizando como fase estacionária sílica gel e como fase
móvel, os solventes hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol (1L;
Figura 14). As soluções resultantes do fracionamento foram concentradas em
rota evaporador.
Os produtos derivados deste processo foram as seguintes frações:
fração hexânica (FrHex EEHA), fração diclorometano (FrDcl EEHA), fração
acetato de etila (FrAct EEHA) e fração metanólica (FrMet EEHA). O EEHA e
frações de H. articulatus foram submetidos a estudos de CCD e CLAE-DAD.
Na fração metanólica observou-se após análises de CCD e CLAE-DAD que
possuía, provavelmente, iridoide e por este motivo foi selecionada para o
fracionamento.
Figura 14: Coluna cromatográfica aberta do extrato etanólico de Himatanthus articulatus
(EEHA)
53
A fração metanólica foi submetida ao fracionamento em coluna
cromatográfica aberta (73,0 x 4,0 cm), contendo como fase estacionária, sílica
gel 60 de marca MERCK (0,063-0,200mm). Utilizou-se 3,5g desta fração
eluídos em solventes de polaridade crescente (fase móvel), sendo
empregados: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol.
Além dos solventes utilizados individualmente, foram também
empregadas misturas de hexano/diclorometano, diclorometano/acetato de etila,
acetato de etila/metanol e metanol/água, todos na proporção de 1:1. Todas as
subfrações foram submetidas a análises de CCD, sendo reunidas frações com
perfis semelhantes. A subfração sugestiva de iridoide foi identificada através de
métodos espectrofotométricos (VALE et al. 2015).
4.6.1.2 Ensaios de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a
Detector de Arranjo de Diodo (CLAE-DAD)
O extrato (EEHA), as frações (FrDcl EEHA, FrAct EEHA e FrMet EEHA)
e substância isolada (SI) foram submetidos a análises de Cromatografia
Liquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Arranjos Diodos (CLAE-
DAD).
As amostras (5mg/mL de acetonitrila) foram solubilizadas
completamente e centrifugadas durante 10 minutos a 10000 RPM. Utilizou-se
detector UV-DAD para realização das leituras dos cromatogramas em
comprimentos de onda de 230 nm.
Na metodologia foram utilizadas como fases móveis, acetonitrila e água
deionizada contendo 0,05% de ácido trifluoroacético (TFA), constituindo os
eluentes A e B, respectivamente. A amostra empregada (extrato, FrDcl EEHA,
FrAct EEHA, FrMet EEHA e substância isolada) foi de 20 µL, em gradiente de
5% (A), seguido de 25% (A) durante 20 minutos, 25% (A) durante 5 minutos e
por último, a 40% (A) durante 15 minutos, fluxo de 1mL/min., coluna na
temperatura de 40°C e varredura com duração de 40 minutos. A leitura
procedeu-se em UV 230 nm (Tabela 01; SILVA, 2007).
54
Tabela 01: Condições cromatográficas empregadas nas análises por CLAE-DAD
TEMPO (min)
FLUXO (mL/min)
ELUENTE A (%)
ELUENTE B (%)
0 1 5 95
20 1 25 75
25 1 25 75
40 1 40 60
Legenda: Eluente A: Acetonitrila; Eluente B: Solução aquosa de ácido trifluoroacético a 0,05% Fonte: SILVA, 2007
4.6.1.3 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C
A análise de Ressonância Magnética Nuclear foi realizada no
Laboratório de Química, do Instituto de Ciências Exatas e Naturais da UFPA,
em equipamento de espectrômetro Varian Mercury 300.
55
Figura 15: Fluxograma de atividades envolvidas no presente trabalho
Cascas de Himatanthus articulatus
Extrato etanólico
Fração hexano (0,2%)
Fração diclorometano (9,6%)
Fração acetato de etila (2,4%)
Fração metanólica (72,6%)
CCAS
CCD CLAE-DAD
RMN
CCD CLAE-DAD
Fração metanólica (3,5g)
CCAS CCD
Substância isolada (SI)
Atividade antipromastigota Citotoxicidade
56
4.7 AVALIAÇÃO BIOLÓGICA
4.7.1 Cultivo das formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis
As espécies de L. (L.) amazonensis foram a princípio isoladas em meio
NNN. O cultivo foi realizado em garrafas de cultura de células, adicionando 5
mL de meio RPMI completo e 100 L da solução de promastigotas,
posteriormente mantidas em incubadora (25°C ± 1°C). Nas passagens
consecutivas, utilizou-se uma suspensão de parasita em meio RPMI, na
proporção de 1:1, entretanto, a viabilidade dos parasitas foi analisada a cada
cultivo.
A curva de crescimento foi realizada durante 10 dias ininterruptos, com
intervalo de 24 horas e as contagens das promastigotas foram realizadas em
câmara de Neubauer. A quantificação se procedeu nos quatro quadrantes
laterais, acrescentando na contagem, parasitas que estavam sobre a linha e
não incluindo rosetas e emaranhados. A média dos quatro quadrantes avaliou
o crescimento e reprodução das formas promastigotas de L. (L.) amazonensis
(URDAPILLETA, 2006).
4.7.2 Ensaio da Atividade Antipromastigota
Para realização deste teste, utilizaram-se formas promastigotas de L.
(L.) amazonensis, obtidas no quinto dia de crescimento (fase logarítmica). O
cultivo foi centrifugado por 10 minutos a 3500 RPM. O “pellet” formado foi
ressuspendido em meio completo (1,0 mL), seguido de contagem em câmara
de Neubauer. A concentração de promastigotas foi ajustada para 5x106
parasitas por poço (MOREIRA, 2007).
As placas de 96 poços foram pré-dosificadas com o extrato (EEHA),
frações (FrHex EEHA, FrDcl EEHA, FrAct EEHA e FrMet EEHA) e substância
isolada (SI), nas concentrações de 200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125 µg/mL
(VEIGA, 2013). O controle negativo (suspensão de promastigotas e RPMI),
controle do solvente (MeOH volatilizado, suspensão de promastigota e RPMI) e
o controle positivo (suspensão de promastigotas e Anfotericina B, nas
concentrações de 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,5625; 0,78125 e 0,3906 µg/mL;
57
VEIGA, 2013) foram aplicados em triplicata, assim como todas as amostras e
na mesma quantidade (10 µL- Figura 16). A suspensão de parasitas foi
distribuída nos poços (100 µL), com exceção do branco (meio RPMI). A placa
foi incubada por 24h (26 °C).
Passado este período, foi acrescentado em cada poço, 10µL de MTT
(5mg/ml), sendo a placa protegida da luz e incubada por 4h (26°C). Decorrido
este tempo, realizou-se aplicação de 10µL de Dimetilsulfóxido (DMSO), com
agitação manual até completa solubilização dos cristais de formazam (MOTA et
al. 2015).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Figura 16 - Desenho da placa de cultura de 96 poços com as substâncias testadas, representadas por cores. Legenda:
Controle Negativo Controle de Solvente Branco
Controle Positivo Extrato Etanólico Frações
Substância Isolada
Realizou-se a leitura em espectrofotômetro de escaneamento multipoços
(leitor de placas ELISA), através de comprimento de onda 490 nm. A
porcentagem de promastigotas viáveis foi determinada pela fórmula descrita a
seguir (NGURE et al. 2009).
58
Legenda: Abs= Absorbância
A Concentração Inibitória 50% ou CI50 foi calculada pelo programa
GraphPad Prism versão 6.0.
Quadro 2: Valores de CIM e CI50 para leitura dos resultados
CIM/CI50 (µg/mL) RESULTADOS
Menor ou igual a 100 Ativo Entre 101 - 200 Moderadamente ativo Acima de 200 Inativo
Fonte: MOTA, 2015
4.7.3 Ensaio de viabilidade celular
4.7.3.1 Descongelamento
O frasco de criotubo foi retirado do nitrogênio líquido e levado para o
banho-maria (2min/37°C). Em seguida, as células THP-1 foram centrifugadas
por 5 minutos (1200rpm). O sobrenadante foi desprezado e o sedimento
ressuspendido em 15 mL de meio completo (pH 7,4), sendo distribuído em
garrafas (50 cm2), que foram incubadas em atmosfera de CO2 (5%) a 37°C
(TSUCHIYA et al. 1982; SKUBITZ et al. 1983).
4.7.3.2 Cultivo Celular
O cultivo foi centrifugado durante 10 minutos (1200 rpm). Do sedimento,
foi retirado 10µL e adicionado a 90µL de uma suspensão aquosa de 0,4% de
Azul de Tripan. A contagem foi realizada em câmara de Neubauer, utilizando
os quatro quadrantes laterais e quantificando células mortas (coradas em azul)
% VIABILIDADE= Abs. dos poços com amostra – Abs. dos reagentes (branco) ×100
Abs. dos poços sem amostra – Abs. dos reagentes (branco)
59
e células vivas (translúcidas; FRESHNEY, 2010). O cálculo da porcentagem de
células viáveis realizou-se de acordo com a fórmula descrita a seguir.
Legenda: %- porcentagem
Após contagem, o sedimento foi ressuspendido, a uma densidade de 2 -
4 x 105 células viáveis/mL, em meio RPMI. A suspensão foi distribuída em
garrafas (50 cm2), sendo estas, incubadas em atmosfera úmida de CO2 (5%) e
temperatura de 37ºC. O meio de cultura foi substituído a cada 2 ou 3 dias.
Após obtenção da concentração celular (8×105 células/mL), foram realizadas
subculturas, evitando que a concentração ultrapassasse 1×106 células/mL
(Banco de Células do Rio de Janeiro - BCRJ).
4.7.3.3 Criopreservação
A suspensão de células foi centrifugada por 5 minutos (1000 rpm), com
descarte do sobrenadante e ressuspensão do sedimento em 95% de soro fetal
bovino e 5% de DMSO. Desta suspensão, transferiu-se 1,0 mL para o criotubo,
sendo armazenado em freezer (over night), a uma temperatura de – 80°C.
Após esse período, o criotubo foi transferido para o tanque de nitrogênio
líquido, podendo permanecer congelado por 6 meses (TSUCHIYA et al. 1982;
SKUBITZ et al. 1983).
4.7.3.4 Diferenciação celular
Este procedimento foi realizado conforme metodologia de Daigneault e
colaboradores (2010), onde células monocíticas THP-1 foram tratadas pelo
éster de forbol - PMA (forbol 12-miristato 13-acetato; 0,2 nmol/mL) para se
diferenciarem em células com características de macrófagos. As placas foram
incubadas por 3 dias, em estufa com 5% de CO2, a temperatura de 37ºC.
% DE CÉLULAS VIÁVEIS = nº de células vivas (não-coradas) x 100
nº total de células contadas (coradas e não coradas)
60
Passado o período de incubação, as placas foram observadas em
microscópio invertido, para visualização da aderência das células diferenciadas
(macrófagos). Posteriormente, o agente indutor PMA foi removido, realizando
em seguida duas lavagens com meio RPMI (37°C), com a finalidade de
eliminar eventuais células em suspensão (TEMPONE et al. 2004). Após estas
lavagens, realizou-se o ensaio de citotoxicidade.
4.7.3.5 Ensaio de viabilidade celular
O extrato etanólico (EEHA), frações (FrAct EEHA, FrMet EEHA) e
substância isolada (SI) de H. articulatus foram avaliados em células THP-1,
utilizando ensaio colorimétrico de viabilidade celular MTT (brometo de 3 - (4,5-
dimetiltiazol-2-il) - 2,5- difeniltetrazólio; MOSMANN,1983).
As amostras foram diluídas em meio RPMI, sendo obtidas as seguintes
concentrações: 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 e 7,8125 μg/mL (VEIGA,
2013), as quais foram distribuídas nas placas (100 μL/ poço), contendo células
THP-1, convertidas em macrófagos (2x105 células/poço). As placas foram
incubadas por 24 horas, em atmosfera de CO2 (5%) a 37°C.
O preparo do controle negativo consistiu de suspensão de macrófagos e
meio RPMI completo. O controle do solvente constituiu-se de propilenoglicol,
suspensão de macrófagos e meio RPMI. No controle positivo foram usadas
concentrações de 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 e 1,562 μg/mL de Anfotericina
B e suspensão de macrófagos e no branco utilizou-se apenas meio completo.
Após o tempo de incubação (24h), foi acrescentado MTT (10 µL/poço de
solução contendo 5mg/mL), preservando a placa da incidência de luz. Em
seguida, a placa foi armazenada por 4 horas em estufa, a 37°C. Transcorrido o
período de incubação, administrou-se 10 μL de DMSO em todos os poços,
seguido de leve agitação manual durante 5 minutos. As placas foram lidas em
aparelho ELISA, através de comprimento de onda de 490 nm.
A viabilidade das células está diretamente relacionada ao metabolismo
do MTT, sendo proporcional a absorbância gerada. O cálculo porcentual da
viabilidade celular foi determinado em comparação aos controles positivos,
conforme fórmula a seguir (MOSMANN, 1983). A Concentração Citotóxica 50%
61
(CC50) em células THP-1 diferenciadas em macrófagos foi avaliada a partir do
percentual de células viáveis em comparação aos controles positivos.
Legenda: ABS- absorbância
Para determinação da Concentração Citotóxica 50% (CC50) utilizou-se
programa GraphPad Prism versão 6.0
4.7.3.6 Determinação do Índice de Seletividade (IS)
O Índice de Seletividade foi determinado para avaliar o nível de
segurança das amostras, com atividade antileishmania em macrófagos, sendo
calculado através da razão entre a concentração citotóxica (CC50) em
macrófagos (células THP-1) e a concentração inibitória (CI50) para
L.amazonensis. Foi utilizada a fórmula, a seguir descrita (REIMÃO, 2009).
Os resultados do Índice de Seletividade foram avaliados através da
comparação de seus valores a 1, determinando que IS maior que 1, significa
que a amostra em análise é mais tóxica para o parasita do que para o
macrófago. Valores do IS menor que 1, significam que a amostra é mais tóxica
para o macrófago do que para o parasita. Valores altos de IS significam maior
seletividade da amostra, com pouca toxicidade para o macrófago (REIMÃO,
2009).
% VIABILIDADE = ABS. POÇOS COM AMOSTRA ˗ ABS. REAGENTES (BRANCO) X 100
ABS. POÇOS SEM AMOSTRA – ABS. REAGENTES (BRANCO)
IS= CC50 em macrófagos
CI50 contra o parasita
62
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS
Das cascas de H. articulatus obteve-se o extrato etanólico (rendimento=
16,82%). Estudo anterior, o rendimento do extrato etanólico, obtido das cascas
de H. articulatus, foi de 3,64% (VILHENA, 2012).
As diferenças de rendimentos de extratos vegetais estão relacionadas a
fatores como, o tamanho das partículas dos pós, que devem ser homogêneas e
com classificação de tamanho acima de fino, para obtenção de extrações
eficazes. Entretanto, partículas muito finas podem sofrer compactação e
ocasionar obstrução do percolador (LIST e SCHMIDT, 2000; BRANDÃO,
2007), além de acarretar perda de moléculas orgânicas no processo de
extração (PELISSARI, 2008).
Além disso, os processos extrativos adotados também influenciam no
rendimento. No presente estudo utilizou-se a maceração exaustiva, enquanto
que no estudo de Vilhena (2012) apenas a maceração. Neste caso, não há
troca do líquido extrator, podendo ocorrer à saturação deste, não ocorrendo à
completa exaustão da matéria prima (VOIGT, 1993; NAVARRO, 2005).
O extrato etanólico de H. articulatus (EEHA) foi submetido ao
fracionamento em cromatografia de coluna cromatográfica aberta, utilizando
como fase estacionária, sílica gel e como fases móveis, solventes de
polaridade crescente, com obtenção das seguintes frações: fração hexânica
(FrHex EEHA), fração diclorometano (FrDcl EEHA), fração acetato de etila
(FrAct EEHA) e fração metanólica (FrMet EEHA).
A Tabela 02 mostra os rendimentos obtidos em cada fração, sendo a
fração metanólica majoritária (72,62%) e a fração hexânica minoritária (0,2%).
Estes resultados sugerem que o extrato etanólico de H. articulatus deve possuir
majoritariamente substâncias com maior polaridade.
Em estudo realizado por Vale (2014), as frações eluídas com solventes
de maior polaridade foram as de melhor rendimento. Estes resultados
confirmam os rendimentos obtidos no presente estudo, onde se observou que a
fração metanólica apresentou maior rendimento.
63
Tabela 02: Rendimento do extrato etanólico e frações obtidas das cascas de Himatanthus articulatus
AMOSTRAS RENDIMENTO %
EEHA 168,21 g 16,82%
FrHex EEHA 0,0202 g 0,2%
FrDcl EEHA 0,9606 g 9,6 %
FrAct EEHA 0,2402 g 2,4 %
FrMet EEHA 7,2624 g 72,62 %
Legenda: EEHA – Extrato Etanólico de H.articulatus; FrHex EEHA – Fração Hexânica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrDcl EEHA – Fração Diclometano obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrAct EEHA – Fração Acetato de Etila obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrMet EEHA – Fração Metanólica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus
O extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus e frações foram
submetidos às análises em CCD (Figura 17). O EEHA e FrMet EEHA
apresentaram um constituinte (Rf= 0,5) com Rf semelhante ao plumierídeo.
Nas frações hexânica e diclorometânica não foram observados sinais
sugestivos de plumierídeo ou iridoide. A fração acetato de etila parece conter
um baixo teor deste constituinte (Figura 17).
Em outro estudo, a fração acetato de etila, obtida do extrato etanólico de
cascas de H. articulatus, foi submetida ao fracionamento em coluna
cromatográfica aberta, utilizando como fase estacionária sílica gel e fase
móvel, solventes de polaridade crescente. A fração 6 (acetato de etila: metanol
– 1:1) originou uma subfração de maior massa, que foi submetida à análise
espectrofotométrica, sendo identificada como plumierídeo (VALE, 2014; VALE
et al. 2015). A premissa deste trabalho é que o extrato etanólico, frações
acetato de etila e metanólica possuam o iridoide plumierídeo.
64
Figura 17: Cromatografia em Camada Delgada do Extrato (EEHA), Frações (FrHex EEHA, FrDcl EEHA, FrAct EEHA, FrMet EEHA) e Substância Isolada (SI) de Himatanthus articulatus Legenda: 1- EEHA=Extrato Etanólico obtido das cascas de H.articulatus; 2- FrHex EEHA=Fração Hexânica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; 3- FrDcl EEHA=Fração Diclorometano obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; 4- FrAct EEHA=Fração Acetato de Etila obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; 5- FrMet EEHA=Fração Metanólica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; 6- SI=Substância Isolada obtida da Fração Metanólica de H.articulatus
Após análise em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a
Arranjos Diodos (CLAE-DAD), o EEHA apresentou pico de maior intensidade
em tempo de retenção (Tr) de 15,316 min. A análise do espectro em
ultravioleta, do pico majoritário, sugeriu um cromóforo relacionado aos
iridoides, pois apresentou um máximo de absorbância em 230 nm (Figura 20 -
A).
Em outros estudos, o plumierídeo apresentou espectro em ultravioleta
com λ máx 230 nm (Figura 18; MULLER, 2013) e λ máx 213,1 nm (Figura 19;
VALE et al. 2015), semelhantes ao do presente estudo (Tabela 3). De acordo
com Plouvier e Faure-Bonvin (1971), os cromóforos de iridoides apresentam
absorção em ultravioleta de 210 – 230 nm. Quando se relacionada os dados
1 2 3 4 5 6
65
obtidos em CCD, observa-se que existe uma compatibilidade de resultados,
visto que também foi detectado iridoide neste extrato (Tabela 3).
Figura 18: Perfil cromatográfico em CLAE da solução extrativa de Alamanda cathartica obtida por maceração dinâmica (230 nm– plumierídeo) Condição de eluição: detecção em 230 nm; fluxo = 0,5 mL/min, temperatura = 20°C Fonte: MÜLLER, 2013
Figura 19: Cromatograma do extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus em estudo de Vale e colaboradores (2015) Condição de eluição: detecção em 220 nm; fluxo = 1mL; volume de injeção= 20 µL; temperatura= 40
o C; gradiente linear 5 a 95% empregando agua deionizada e ácido fosfórico
0,1% (eluente A) e acetonitrila (eluente B) Fonte: VALE et al. 2015
Conforme dito anteriormente, o extrato etanólico das cascas de
H.articulatus foi submetido ao fracionamento sendo obtidas 4 frações. A fração
hexânica, devido ao baixo rendimento, não foi possível realizar os estudos em
CLAE-DAD e avaliação de viabilidade celular. O baixo rendimento dessa fração
pode estar relacionado ao tipo de extrato utilizado neste estudo, isto é, o
etanol, que é muito eficiente na extração de substâncias de média polaridade.
66
A FrDcl EEHA identificou pico com tempo de retenção de 21,913 min. e
com λ máx 233,6 nm. Devido ser muito preliminar este estudo, não foi possível
relacionar a algum metabolito secundário. Quando se relaciona aos resultados
obtidos em CCD e CLAE-DAD, pode-se sugerir que a fração diclorometano não
deve possuir iridoide (Figura 20 - B).
A FrAct EEHA apresentou pico majoritário em Tr 2,981 min, com
absorção no ultravioleta λ = 206,7, 260,7 e 294,9 nm (Figura 20 - C). Este
espectro e os demais sugerem que esta fração, provavelmente, não possua
iridoides. Em relação aos estudos em CCD, os dados sugerem a presença de
iridoides, entretanto não deve ser a substância majoritária (Figura 17).
Na FrMet EEHA foi observado um pico no Tr 3,114 min, com absorção
em UV 236,0 nm, sendo sugestivo de iridoide (Figura 20 - D, Tabela 3).
Quando se compara ao espectro em ultravioleta da substância isolada (SI; Tr
2,997 min, UV 228,9 nm), observa-se que os tempos de retenção e max. são
próximos (Figura 21). Quando se analisa o cromatograma desta amostra,
parece que o iridoide é majoritário e a fração apresenta baixa complexidade.
Tabela 3: Resultados obtidos em CLAE-DAD (UV 230 nm) comparados a literatura
AMOSTRAS TR (min.) UV (nm) OUTROS ESTUDOS
REFERÊNCIA
EEHA 15,316 230,1 Iridoide VALE et al.
2015
FrDcl EEHA 21,913 233,6 - -
FrAct EEHA 2,981 206,7 260,7 294,5
- -
FrMet EEHA 3,114 236,0 Iridoide VALE et al.
2015
SI 2,997 228,9 Plumerideo: UV
semelhante VALE et al.
2015
Legenda: EEHA- Extrato Etanólico obtido das cascas de H.articulatus; FrDcl EEHA - Fração Diclorometano obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrAct EEHA-Fração Acetato de Etila obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrMet EEHA-Fração Metanólica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; SI= Substância Isolada obtida da Fração Metanólica de H.articulatus
67
Figura 20: Cromatogramas e espectros (UV 230 nm) do extrato etanólico, das frações diclorometano, acetato de etila e metanólica, obtidos das cascas de Himatanthus articulatus. Legenda: A=Extrato etanólico de Himatanthus articulatus; B= Fração diclometano obtida do extrato etanólico de Himatanthus articulatus; C= Fração acetato de etila obtida do extrato etanólico de Himatanthus articulatus; D= Fração metanólica obtida do extrato etanólico de Himatanthus articulatus
68
Figura 21: Cromatograma e espectro (UV 230 nm) da substância isolada (SI), obtida da fração metanólica do extrato etanólico de H. articulatus
Baseado em estudos anteriores, a atividade leishmanicida esta
relacionada a presença de iridoides (CASTILLO et al. 2007). Quando se
relaciona os resultados obtidos neste estudo em CCD e CLAE-DAD, observa-
se que estes metabolitos estão presentes na fração metanólica (Tabela 4).
Esta fração foi selecionada para a próxima etapa do estudo fitoquímico,
onde realizou-se o fracionamento em coluna cromatográfica aberta e
identificação do constituinte majoritário através de técnicas
espectrofotométricas.
Tabela 4: Resultados de CCD e CLAE-DAD obtidos do extrato etanólico e frações (FrDcl EEHA, FrAct EEHA, FrMet EEHA) obtidas das cascas de Himatanthus articulatus
DETECÇÃO DE IRIDOIDE
AMOSTRA CCD CLAE-DAD
EEHA + +
FrDcl EEHA - -
FrAct EEHA + -
FrMet EEHA + +
Legenda: EEHA- Extrato Etanólico obtido das cascas de H.articulatus; FrDcl EEHA - Fração Diclorometano obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrAct EEHA-Fração Acetato de Etila obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrMet EEHA-Fração Metanólica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus
69
A FrMet EEHA foi submetida ao fracionamento em coluna
cromatográfica aberta, utilizando como fase estacionária sílica gel e como fase
móvel, solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de
etila e metanol), originando uma subfração (acetato de etila: metanol),
denominada SI (substância isolada), que apresentou características
cromatográficas (1 mancha em CCD – Figura 17) sugestiva de substância com
alto teor de pureza.
A SI foi submetida a análises de Ressonância Magnética Nuclear, sendo
observados os seguintes sinais no espectro de RMN1H: duplo dupleto,
apresentando um sinal em 5,28 ppm (J=4,8 Hz), relacionado ao H-1 (carbono
metínico) e outro em 7,46 ppm (J=1,8 Hz), relacionado ao H-10 (carbono
metínico); múltiplos sinais em 3,93 ppm, relacionados ao H-5; duplo dupleto
(6,465 ppm – J=5,7 e J=2,7 Hz) referente ao H-6; duplo dupleto em 5,525 ppm
(J=5,7 e 2,1 Hz) e 4,55 ppm (J=6,6 e 1,2 Hz), característicos do H-7 e H-13,
respectivamente (Figura 22; Tabela 5).
Foi também observado um dupleto em 7,40 ppm (J=1,5 Hz) relacionado
ao H-3 (carbono metínico); um sinal duplo em 1,43 ppm (J= 6,6 Hz),
característico do H-14 (grupo metila); um sinal simples em 3,741 ppm,
característico do H-16 (grupo metoxila) e um dupleto em 4,68 ppm (H-1’-J=7,8
Hz; Figura 22; Tabela 5).
Os hidrogênios da beta-glicose estão localizados entre os sinais 3,0 a
4,5 ppm (Figura 22; Tabela 5; MORAGAS, 2006).
Os resultados dos deslocamentos químicos dos hidrogênios, obtidos
neste trabalho, foram comparados a outros estudos (MORAGAS, 2006; VALE
et al. 2015) e observou-se grande similaridade entre os resultados, de acordo
com a tabela 5. Este estudo foi realizado em espectro de RMN 300 MHz, sendo
utilizado o solvente CD3OD (metanol deuterado).
70
Tabela 5: Deslocamentos químicos em RMN1H (300 MHz e CD3OD) da substância isolada (SI)
obtida da fração metanólica do extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus comparados a dados obtidos da literatura
POSIÇÃO PRESENTE
ESTUDO MORAGAS, 2006 VALE et al. 2015
H 300 MHz (CD3OD)
δ (ppm) 400 MHz (CD3OD)
δ (ppm)*
200 MHz (CD3OD) δ (ppm)
*
1 5,28 d; J=4,8 Hz 5,25 d; J=4,8 Hz 5,27 d, J=6 Hz
3 7,46 d; J=1,8 Hz 7,49 d; J=1,2 Hz 7,37 s
5 3,93 m 3,92 dd; J=8; 1,6 Hz 3,89 d; J=12 Hz
6 6,46 dd; J=5,7; 2,7 Hz 6,45 dd, J=5,6; 2,4 Hz 6,4 dd, J=2; 4 Hz
7 5,52 dd; J=5,7; 2,1 Hz 5,51 dd; J=5,6; 2,0 Hz 5,5 dd; J=6; 4 Hz
9 - 2,94 dd; J=8,0; 4,4 Hz 3,2 dd; J=8; 4 HZ
10 7,40 d; J=1,5 Hz 7,35 d; J=1,2 Hz 7,51 s
13 4,55 dd; J=6,6; 1,2 Hz 4,55 q; J=6,4 Hz -
14 1,43 d; J=6,6 Hz 1,40 d; J=6,4 Hz 1,42 d; J=6 Hz
16 3,74 s 3,74 s 3,67 s
1’ 4,68 d; J=7,8 Hz 4,68 d; J=8,0 Hz 4,7 d
Legenda: J= Constante de acoplamento, MHz e Hz= frequência, d= dupleto, dd= duplo dupleto,
m= multipleto, q= quadripleto, s= simpleto, * Dados da literatura.
71
Figura 22: Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 1H (CD3OD, 300 MHz) da substância isolada (SI) obtida da fração metanólica do extrato etanólico
das cascas de Himatanthus articulatus.
H-1
H-10
H-5
H-6 H-7
H-13
H-3 H-14
H-1’
H-16
72
Após análises do espectro de RMN13C foram identificados 21 sinais
(Figura 23). Os carbonos C-1(carbono metínico), C-3 (carbono metínico) e C-4
(carbono quaternário), correspondem aos sinais 94,1 ppm, 152,4 ppm e 111,0
ppm, respectivamente, e equivalem ao núcleo ciclopentanodiidropirano
(MORAGAS, 2006).
O C-6 refere-se ao sinal 141,3 ppm e C-7 refere-se ao sinal 129,9 ppm,
e são característicos de carbonos sp2 (dupla ligação). Os sinais 40,3 ppm, 50,5
ppm, 63,4 ppm, 22,4 ppm, correspondem aos C-5, C-9, C-13 e C-14, nesta
ordem. Os C-8 (97,8 ppm) e C-11(138,6 ppm) equivalem aos carbonos
quartenários e o C-10 (150,2 ppm) refere-se ao carbono metínico (MORAGAS,
2006).
O C-12 (172,7 ppm) corresponde ao carbono carbonílico (C=O),
característico de lactonas (GRAEBNER, 2003; MORAGAS, 2006). Os C-15
(168,4 ppm) e C-16 (51,9 ppm) são específicos de éster. Os carbonos C-1’, C-
2’, C-3’, C-4’, C-5’ e C-6’ apresentam sinais característicos da beta-glicose
(MORAGAS, 2006). Estes resultados foram comparados a dados da literatura
(MORAGAS, 2006; VALE et al. 2015) e constatou-se equivalência dos
deslocamentos químicos dos carbonos, conforme especificado na tabela 6.
73
Tabela 6: Deslocamentos químicos em RMN13
C (300 MHz e CD3OD) da substância isolada (SI) obtida da fração metanólica do extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus comparados a dados obtidos da literatura
POSIÇÃO PRESENTE
ESTUDO MORAGAS, 2006 VALE et al. 2015
C 300 MHz (CD3OD)
δ (ppm) 400 MHz (CD3OD)
δ (ppm)*
200 MHz (CD3OD) δ (ppm)
*
1 (CH) 94,1 94,2 94,2
3 (CH) 152,4 152,5 152,6
4 (C) 111,0 111,0 111,1
5 (CH) 40,3 40,4 40,46
6 (CH) 141,3 141,4 141,5
7 (CH) 129,9 130,0 130
8 (C) 97,8 97,9 97,9
9 (CH) 50,5 50,6 50,6
10 (CH) 150,2 150,2 150,3
11 (C) 138,6 138,2 138,6
12 (C=O) 172,7 172,7 172,8
13 (CH) 63,4 63,5 63,6
14 (CH3) 22,4 22,4 22,5
15 (C) 168,4 168,4 168,5
16 (O=CH3) 51,9 51,9 52,1
1’ (CH) 100,0 100,1 100,1
2’ (CH) 74,6 74,6 74,7
3’ (CH) 78,4 78,4 77,8
4’ (CH) 71,2 71,3 71,3
5’ (CH) 77,7 77,8 78,9
6’ (CH2) 62,5 62,5 61
Legenda: MHz= frequência, * Dados da literatura.
74
Figura 23: Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 13
C (CD3OD, 300 MHz) da substância isolada (SI) obtida da fração metanólica do extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus. Legenda: C- Carbono
C-12 C-15
C-3 C-10
C-6 C-11
C-7 C-4
C-1’ C-8
C-1
C-5’ C-2’
C-13 C-6’ C-9
C-16 C-5
C-14
C-3’
C-4’
O
O
O
O
O
O
O
OH
OH
OH
OH
HO
6’
4’
3’
5’
2’
1’
3
4
5
9 8
6
7
10
11
12
13
14
15
16
1
75
Baseado nos resultados de RMN obtidos neste trabalho e após
comparação a dados da literatura, pode-se dizer que a substância isolada (SI)
neste estudo é o iridoide plumierídeo. Barreto e colaboradores (2007) isolaram
da fração aquosa obtida das cascas e látex de Himatanthus sucuuba
(articulatus), através de técnicas cromatográficas, o iridóide plumierídeo.
Oliveira (2013) isolou, identificou e quantificou o plumierídeo, realizando
análises cromatográficas, com padrões anteriormente isolados, de diferentes
espécies do gênero Himatanthus. O extrato das cascas de H. bracteatus
apresentou concentração de 0,182 mg/mL do iridoide plumierídeo, o extrato
dos frutos de H. drasticus exibiu concentração de 0,356 mg/mL, sementes e
cascas exibiram concentrações de 0,020 mg/mL. A espécie H.obovatus
apresentou concentração de 0,036 mg/mL de plumierídeo no extrato das
cascas, enquanto que nos frutos, cascas e folhas de Himatanthus sucuuba
(articulatus), a concentração foi de 0,283 mg/mL, 0,267 mg/mL e 0,034 mg/mL,
respectivamente.
Ao comparar com a plumieridina, outro iridóide isolado no referido
estudo, com concentrações de 0,282 mg/mL nas raizes e de 0,207 mg/mL nas
cascas da raiz de H.sucuuba (articulatus), além da constatação de baixas
concentrações de outros iridóides, Oliveira (2013) comprovou que o
plumierídeo é uma substância majoritátia nas espécies de H. sucuuba
(articulatus), H. bracteatus, H. drasticus e H. obovatus. Estes resultados
corroboram com o presente estudo.
5.2 ATIVIDADE BIOLÓGICA
5.2.1 Atividade antipromastigota
A atividade antipromastigota de H. articulatus foi avaliada, sendo obtido
resultado negativo (CI50> 100 µg/mL). Entretanto, este estudo avaliou somente
o extrato etanólico obtido do córtex da planta (KVIST et al. 2006). A premissa
inicial deste trabalho foi que o fracionamento pudesse contribuir para a
atividade antileishmania. Também, pensava-se que frações ricas em iridoides
fossem ativas no parasito da Leishmania.
76
Na avaliação da atividade antipromastigota do extrato, frações de
Himatanthus articulatus e plumierídeo, utilizou-se parasitas no quinto dia de
cultivo (fase logarítmica de crescimento). De acordo com Campos (2008), a
fase log de crescimento da promastigota foi até o sexto dia de cultivo, porém
em estudo de Veiga (2013), essa fase ocorreu entre o quarto e o quinto dia de
cultivo, apresentando pico de concentração mais elevado no quinto dia.
O extrato etanólico obtido das cascas de H.articulatus mostrou-se inativo
frente às formas promastigotas de L.amazonensis (CI50 > 200 µg/mL, Tabela 7,
Figura 24-A). Estudo anterior, o extrato etanólico de H. sucuuba (articulatus) foi
ativo contra formas promastigota (CI50= 20 µg/mL) e amastigota (CI50= 5 µg/mL;
CASTILLO et al. 2007).
Estas respostas contraditórias podem estar relacionadas a diferenças na
composição dos extratos. Sabe-se que a época e local da coleta podem
influenciar na composição química da planta e consequentemente, em sua
atividade biológica. Hogedal e Molgaard (2000) realizaram estudos de variação
sazonal e diurna em iridoides isolados de Antirrhinum majus e observaram que
a quantidade de compostos secundários variava de 20 a 60 mg/g de matéria
seca durante o dia, apresentando variação bimodal acentuada na quantidade
de iridoides durante o verão.
Muitas vezes o fracionamento pode contribuir positivamente para a
atividade, significando dizer que o extrato pode ser inativo e suas frações ativas
(DOLABELA, 2007). O fato do extrato não ser ativo nas formas promastigotas,
não significa que ele não tenha atividade na Leishmania. Pois pode ocorrer
atividade seletiva para a forma amastigota.
Estudo anterior do extrato etanólico das cascas de H.sucuuba
(articulatus) demonstrou forte atividade sobre formas amastigotas de
L.amazonensis (CI50 5µg/mL). A atividade antiamastigota foi atribuída aos
iridóides plumericina (CI50 0,21 µM) e isoplumericina (CI50 0,28 µM). Estes
iridoides também apresentaram atividade contra formas promastigotas (CI50
20µg/mL; CASTILHO et al. 2007).
Visando avaliar se o fracionamento contribui positivamente para a
atividade antipromastigota, o extrato etanólico foi fracionado em coluna
cromatográfica aberta. Todas as frações foram submetidas aos ensaios para
atividade antipromastigota.
77
A fração hexânica mostrou-se inativa nesta forma do parasito (CI50 >
200µg/mL; Tabela 7; Figura 24-A). Em estudos anteriores, nesta fração foram
identificadas as substâncias: cinamato de α-amirina, cinamato de lupeol e
acetato de lupeol, através de técnicas cromatográficas. Estes metabólitos
apresentaram ação na fase aguda de processos inflamatórios (MIRANDA et al.
2000).
Até o presente, não foi relatado à atividade desta fração na forma
promastigota, porém a atividade antipromastigota do lupeol já foi descrita. No
extrato hidroalcoólico de própolis marrom, esta substância foi identificada como
majoritária, sendo ativa contra formas promastigotas de L. amazonensis (CI50
4,96 µg/mL; SANTANA, 2010). Logo, torna-se necessário a avaliação desta
fração na forma amastigota de L. amazonensis. Infelizmente, devido o baixo
rendimento dessa fração não foi possível realizar o seu fracionamento.
A fração diclorometano não foi ativa em formas promastigotas de L.
amazonensis (CI50 > 200µg/mL; Tabela 7, Figura 24-A). Estudos fitoquímicos
realizados com a fração diclorometano, obtida do extrato etanólico de
H.articulatus, sugerem presença de alcaloides (VALE, 2014). No presente
estudo, a fração diclorometano foi submetida à análise em CLAE-DAD,
entretanto nenhum dos espectros em ultravioleta sugere a presença deste
metabólito.
A atividade antiamastigota do extrato alcaloídico das cascas do caule de
Aspidosperrma ramiflorum (Apocynaceae), ramiflorina A e B, foi avaliada contra
Leishmania brasiliensis e L. amazonensis. O extrato teve maior efetividade
contra L. amazonensis do que contra a L. brasiliensis (CI50 < 47 g/mL). Fato
semelhante foi observado para a ramiflorina A (CI50 = 16,3 + 1,6 g/mL) e
ramiflorina B (CI50 = 4,9 + 0,9 g/mL; TANAKA et al. 2007; FERREIRA et al.
2004).
A fração acetato de etila não apresentou atividade contra formas
promastigotas de L. amazonensis (CI50 > 200µg/mL; Figura 24-B, Tabela 7).
Após análise das porcentagens de inviabilidade do parasita no teste
antipromastigota desta fração, observou-se que a concentração 200 µg/mL
inibiu 37,29% das formas promastigotas (Figura 24-B, Tabela 7).
78
Os teores de iridoide parecem ser reduzidos, por isso, optou-se pelo
fracionamento da fração metanólica. A atividade antiamastigota da plumericina
(iridoide) já foi descrita (CASTILLO et al. 2007), sendo sua ação semelhante ao
efeito da anfotericina B.
A plumericina, assim como o seu isômero, a isoplumericina (VALE,
2014), são compostos químicos que apresentam Coeficiente de Partição igual
a 0.8, de baixa polaridade e caráter hidrofóbico (TAVARES, 2004; PUB CHEM,
2016). Portanto, são substâncias apolares, que podem atravessar facilmente a
membrana plasmática do parasita do gênero Leishmania, uma vez que são
capazes de se solubilizarem na bicamada lipídica, que apresenta a porção
interna constituída de hidrocarboneto apolar com cadeias saturadas e
insaturadas de ácidos graxos e colesterol, além de lipídeos (CAMPBELL e
FARRELL, 2007).
Parece que a plumericina possui seletividade para a forma amastigota
(Tabela 10) e baixa citotoxicidade (CASTILLO et al. 2007). Estas
características sugerem que esta substância possua elevado potencial
leishmanicida.
Diferentemente do que acontece com o plumierídeo, que apresenta em
sua composição química cinco grupos oxigênio-hidrogênio (–OH; VALE, 2014),
o que torna a substância muito polar, com Coeficiente de Partição equivalente
a -1.2 e valor de LogP menor que 1, de caráter hidrofílico (TAVARES, 2004;
PUB CHEM, 2016), característica que pode dificultar sua passagem através da
membrana do parasita, que é permeável para moléculas lipossolúveis e
impermeável para moléculas polares (CAMPBELL e FARRELL, 2007).
A fração metanólica apresenta altos teores de iridoides, entretanto foi
inativa em promastigota de L. amazonensis (Tabela 7; Figura 24-B). Outro
estudo observou fato muito semelhante, frações polares obtidas de Jacaranda
puberula foram inativas em formas promastigota de Leishmania (NAKAMURA
et al. 2006), enquanto que extratos com menor polaridade mostraram elevada
atividade antileishmania (PASSERO et al. 2007).
Desta maneira, características lipofílicas parecem ser requeridas para a
interação com o parasita, uma vez que a atividade dos compostos diminui com
o aumento da polaridade (FERRARINI et al. 2008).
79
Apesar da premissa inicial, de que o iridoide possui atividade contra
formas promastigota, o plumierídeo foi inativo (CI50 > 200µg/mL; Tabela 7;
Figura 24-B). Este iridoide foi isolado da fração metanólica, isto se deve a sua
polaridade elevada. Substâncias com elevada polaridade não conseguem
atravessar livremente a membrana do parasito, por isso possuem baixa
atividade.
Estudos de predição de atividades biológicas sugerem que os iridoides
possuem atividade inibitória sobre as CYP, talvez este seja o mecanismo
envolvido nas atividades antileishmania. Logo se torna essencial que a
substância consiga atravessar a membrana para atingir seu sitio de ligação.
Tabela 7: CI50 do extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus, suas frações e plumierídeo
AMOSTRA L.amazonensis
CI50 (µg/mL)
EEHA >200
FrHex EEHA >200
FrDcl EEHA >200
FrAct EEHA >200
FrMet EEHA >200
Plumierídeo >200
Anfotericina B >25
Legenda: EEHA- Extrato Etanólico obtido das cascas de H.articulatus; FrHex EEHA- Fração hexânica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrDcl EEHA - Fração Diclorometano obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrAct EEHA-Fração Acetato de Etila obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrMet EEHA-Fração Metanólica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus
80
Figura 24: Atividade antipromastigota do extrato etanólico, frações e plumierídeo obtidos das casca de H. articulatus Legenda: PLACA A: EEHA= Extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus; FrHex EEHA= Fração Hexânica obtida do extrato etanólico de H. articulatus e FrDcl EEHA= Fração Diclorometano obtida do extrato etanólico de H. articulatus nas concentrações de 200 µg/mL (B), 100 µg/mL (C), 50 µg/mL (D), 25 µg/mL (E), 12,5 µg/mL (F), 6,25 µg/mL (G) e 3,125 µg/mL (H); PLACA B: FrAct EEHA= Fração Acetato de Etila obtida do extrato etanólico de H. articulatus; FrMet EEHA= Fração Metanólica obtida do extrato etanólico de H. articulatus e PLUM= Plumierídeo nas concentrações de 200 µg/mL (B), 100 µg/mL (C), 50 µg/mL (D), 25 µg/mL (E), 12,5 µg/mL (F), 6,25 µg/mL (G) e 3,125 µg/mL (H); C.NEG= Controle negativo; C.SOL= Controle do solvente; BRA= Branco; C.POS= Controle positivo (Anfotericina B) nas concentrações de 25 µg/mL (B), 12,5 µg/mL (C), 6,25 µg/mL (D), 3,125 µg/mL (E), 1,5625 µg/mL (F), 0,78125 µg/mL (G) e 0,3906 µg/mL (H).
C.NEG C.SOL BRA
PLUM FrMet EEHa FrAct EEHA C.POS
C.NEG
C.SOL
BRA
C.POS
EEHA FrHex EEHA FrDcl EEHA
A
B
25 µg/mL B
12,5 µg/mL C
6,25 µg/mL D
3,125 µg/mL E
1,562 µg/mL F
0,781 µg/mL G
0,390 µg/mL H
200 µg/mL
100 µg/mL
50 µg/mL
25 µg/mL
12,5 µg/mL
6,25 µg/mL
3,125 µg/mL
200 µg/mL
100 µg/mL
50 µg/mL
25 µg/mL
12,5 µg/mL
6,25 µg/mL
3,125 µg/mL
25 µg/mL
12,5 µg/mL
6,25 µg/mL
3,125µg/mL
1,562µg/mL
0,781µg/mL
0,390µg/mL
81
5.2.2 Citotoxicidade
Apesar de não ter sido observada atividade significativa em formas
promastigota de L. amazonensis, realizou-se a avaliação da citotoxicidade
sobre macrófagos.
O extrato etanólico (EEHA), fração acetato de etila (FrAct EEHA), fração
metanólica (FrMet EEHA) e plumierídeo não exibiram atividade citotóxica em
células THP-1, nas concentrações empregadas neste trabalho, apresentando
CC50 > 500 µg/mL, assim como a Anfotericina B (controle positivo), que
também não expressou citotoxicidade, com CC50 > 100 µg/mL (Tabela 8,
Figura 25). Resultado semelhante foi constatado com extrato obtido do látex de
H. sucuuba (articulatus). Este não foi tóxico para macrófagos peritoneais,
sendo sua CC50> 200mg/mL (SOARES et al.2010).
O extrato etanólico de H. articulatus não foi tóxico para células HepG2
(CC50 > 1000 µg/mL). Estudo in vivo demonstrou que camundongos tratados
com dose 5000 mg/kg (VO) do extrato, não expressaram nenhuma alteração
clínica em um período de 14 dias, além de não ter havido alterações
anatomopatológicas ou mortes durante o ensaio, sugerindo toxidade aguda
reduzida da espécie (VALE et al. 2015).
Em ensaios de toxicidade aguda realizados por Sousa e colaboradores
(2010), o extrato de Himatanthus drasticus revelou reduzida toxicidade, quando
administrado via oral em camundongos albinos suíços, na concentração de
2000 mg/Kg. Estas respostas divergentes podem estar relacionadas ao fato de
serem espécies diferentes.
Ratas prenhas foram submetidas a tratamento com decocção das
cascas de Himatanthus sucuuba (articulatus; 40mg/ 12 em 12h/10 dias),
apresentando baixa toxicidade reprodutiva e teratogênica, propondo que o
tratamento humano seja seguro (GUERRA e PETERS, 1991).
Visando avaliar a toxicidade acumulativa, camundongos foram tratados
por 38 dias com extrato etanólico de H. articulatus. Estes não apresentaram
alterações clínicas e nem alterações histopatológicas significativas (VALE et al.
2015). Todos estes resultados corroboram com os resultados obtidos no
presente estudo, esta planta deve possuir baixa toxicidade.
82
Células THP-1, diferenciadas em macrófagos, apresentaram neste
estudo, 92,9% e 93,4% de viabilidade celular, quando foram expostas a
concentrações de 500 e 250 µg/mL do EEHA, respectivamente. Na fração
acetato de etila (FrAct EEHA), as mesmas concentrações apresentaram 84% e
89% de células viáveis, nesta ordem.
A fração metanólica (FrMet EEHA) exibiu viabilidade de 80,9 % (500
µg/mL) e 90,9% (250 µg/mL) e quando as referidas células foram submetidas a
concentrações de 500 e 250 µg/mL do plumierídeo, expressaram 81 e 84,3%
de viabilidade celular, na devida ordem. Quando se comparou os resultados do
EEHA, FrAct EEHA, FrMet EEHA e plumierídeo com os resultados obtidos do
padrão contendo Anfotericina, concentrações de 500 µg/mL (92,9%) e 250
µg/mL (96,7%), constatou-se equivalência nas porcentagens.
Em outro estudo, observou-se viabilidade celular de 75 e 82%, quando
macrófagos peritoneais foram testados com concentrações de 200 e 100 µg/mL
do látex de Himatanthus sucuuba (articulatus) durante 24h, nesta ordem
(SOARES et al., 2010).
Tabela 8: CC50 do extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus, fração acetato de etila, fração metanólica e plumierídeo em macrófagos
AMOSTRA MACRÓFAGOS
CC50 (µg/mL)
EEHA >500
FrAct EEHA >500
FrMet EEHA >500
Plumierídeo >500
Anfotericina B >100
Legenda: EEHA- Extrato Etanólico obtido das cascas de H.articulatus; FrAct EEHA-Fração Acetato de Etila obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus; FrMet EEHA-Fração Metanólica obtida do Extrato Etanólico de H.articulatus
83
C.NEG C.SOL BRA
C.POS EEHA FrAct EEHA PLUM
C.NEG C.SOL BRA
C.POS FrMet EEHA PLUM Figura 25: Ensaio de citotoxicidade do extrato etanólico, fração acetato de etila, fração metanólica e plumierídeo obtidos das cascas de H. articulatus Legenda: PLACA A: EEHA= Extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus, FrAct EEHA= Fração Acetato de Etila obtida do extrato etanólico de H. articulatus e PLUM= Plumierídeo nas concentrações de 500 µg/mL (B), 250 µg/mL (C), 125 µg/mL (D), 62,5 µg/mL (E), 31,25 µg/mL (F), 15,625 µg/mL (G) e 7,8125 µg/mL (H); PLACA B: FrMet EEHA= Fração Metanólica obtida do extrato etanólico de H. articulatus e PLUM= Plumierídeo nas concentrações de 500 µg/mL (B), 250 µg/mL (C), 125 µg/mL (D), 62,5 µg/mL (E), 31,25 µg/mL (F), 15,625 µg/mL (G) e 7,8125 µg/mL (H); C.NEG= Controle negativo; C.SOL= Controle do solvente; BRA= Branco; C.POS= Controle positivo (Anfotericina B) nas concentrações de 100 µg/mL (B), 50 µg/mL (C), 25 µg/mL (D), 12,5 µg/mL (E), 6,25 µg/mL (F), 3,125 µg/mL (G) e 1,562 (H) µg/mL.
A
B
500 µg/mL
250 µg/mL
125 µg/mL
62,5 µg/mL
31,25 µg/mL
15,62 µg/mL
7,812 µg/mL
100 µg/mL
50 µg/mL
25 µg/mL
12,5µg/mL
6,25µg/mL
3,125µg/mL
1,562µg/mL
500 µg/mL
250 µg/mL
125 µg/mL
62,5 µg/mL
31,25 µg/mL
15,62 µg/mL
7,812 µg/mL
100 µg/mL B
50 µg/mL C
25 µg/mL D
12,5 µg/mL E
6,25 µg/mL F
3,125µg/mL G
1,562µg/mL H
84
5.2.3 Análise do potencial biológico de H. articulatus
Os resultados do Índice de Seletividade (IS) das amostras de EEHA,
FrAct EEHA, FrMet EEHA e plumierídeo de H.articulatus foram superiores a 2,5
(Tabela 9). O índice de seletividade é o primeiro parâmetro utilizado para
sugerir a segurança de uma substância, isto é quanto maior for este índice
maior será sua segurança.
Tabela 9: CI50 e CC50 do extrato etanólico obtido das cascas de H. articulatus, fração acetato de etila, fração metanólica e plumierídeo
Amostras Leishmania
amazonensis CI50 (µg/mL)
Células THP-1 (macrófagos) CC50 (µg/mL)
Índice de Seletividade (IS)
EEHA >200 >500 >2,5
FrAct EEHA >200 >500 >2,5
FrMet EEHA >200 >500 >2,5
Plumierídeo >200 >500 >2,5
Anfotericina B >25 >100 >2,5
Legenda: CI50= Concentração inibitória 50%; CC50= Concentração citotóxica 50%; IS= Índice de
Seletividade; EEHA= Extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus; FrAct EEHA=
Fração acetato de etila obtida do extrato etanólico das cascas de Himatanthus articulatus;
FrMet EEHA= Fração metanólica obtida do extrato etanólico das cascas de Himatanthus
articulatus
Quando se compara os resultados obtidos neste trabalho, observa-se
que o extrato etanólico de H. articulatus, frações acetato de etila, fração
metanólica e plumierídeo são pouco tóxicos. Estes possuem certa seletividade
para a forma amastigota, vale ressaltar que esta é a forma responsável pelos
sinais e sintomas da doença. Em relação à obtenção do extrato do látex ou das
cascas, parece que os constituintes químicos presentes no látex são mais
promissores que os presentes nas cascas (Tabela 10).
Estes resultados (Tabela 10) validam o uso popular da H.articulatus na
Amazônia Brasileira, isto é, o seu látex é utilizado para o tratamento de
85
úlcera/feridas (VAN DEN BERG, 1984). Isolar e identificar o constituinte
responsável pela atividade leishmanicida é extremamente urgente e
importante.
Tabela 10: Comparação da atividade antipromastigota, citotoxicidade e índice de seletividade de H. articulatus
Amostras Promastigota (CI50 µg/mL)
Amastigota (CI50 µg/mL)
Citotoxicidade (CC50 µg/mL)
Índice de Seletividade
(IS)
EEHA >200 ND >500 ND
EEHA 202 5
2 ND ND
EBLHA1 ND 15,7
1 >200
1 >12,7
1
FrHex EEHA >200 ND ND ND
FrDcl EEHA >200 ND ND ND
FrAct EEHA >200 ND >500 >4
FrMet EEHA >200 ND >500 ND
Plumierídeo >200 ND >500 ND
Plumericina 0,9 µM (261)2 0,21 µM (60,9)
2 1,86 µM (539,4)
2 2,1/8,9
2
Isoplumericina ND 0,28 µM (81,6)2 1,86 µM (539,4)
2 6,6
2
Legenda: EEHA= extrato etanólico das cascas de H. articulatus; EBLHA= extrato butanólico do látex de H.sucuuba (articulatus); FrHex EEHA= Fração Hexânica do extrato etanólico de H. articulatus; FrDcl EEHA= Fração Diclorometano do extrato etanólico de H. articulatus; FrAct EEHA= Fração Acetato de Etila do extrato etanólico de H. articulatus; FrMet EEHA= Fração Metanólica do extrato etanólico de H. articulatus; ND= Não determinado 1-SOARES et al. 2010; 2- CASTILLO et al. 2007
.
86
6 CONCLUSÃO
No presente estudo, as cascas de Himatanthus articulatus originaram
um extrato etanólico de bom rendimento (16,82%), quando comparado a outro
trabalho. Após fracionamento, obteve-se como fração majoritária, a metanólica
(73,62%), sugerindo que esta planta tem predominância de substâncias com
alta polaridade.
Da fração metanólica foi isolada uma substância identificada por
análises espectrométricas como o iridoide plumierídeo, sendo este metabólito
majoritário na espécie H.articulatus.
O extrato etanólico das cascas de H.articulatus e suas frações
(hexânica, diclorometânica, acetato de etila e metanólica) não foram ativos
contra formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis, apresentando
CI50 >200 µg/mL, porém a fração acetato de etila inibiu 37,29% destas formas.
Entretanto, o responsável por esta inibição não é o plumierídeo, já que
apresentou CI50 >200 µg/mL. Esta atividade pode estar relacionada a outros
iridoides presentes na fração.
O fracionamento do extrato etanólico não interferiu na citotoxicidade,
visto que as frações acetato de etila e metanólica apresentaram CC50 > 500
µg/mL, além do plumierídeo e extrato etanólico, sugerindo que apresentaram
baixa toxicidade para o macrófago.
É de suma importância o estudo biomonitorado de espécies vegetais
para o isolamento e identificação de metabólitos secundários com forte
atividade leishmanicida e pouca citotoxicidade.
87
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