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Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1)
QFB Elizabeth Ernestina Godoy Lozano
D i r e c t o r :D r. D a n i e l E . N o y o l a C h e r p i t e l
A s e s o r e s :D r. C h r i s ti a n A . G a r c í a S e p ú l v e d a D r. F l a v i o M a r tí n e z M o r a l e s
Defensa de Tesis
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2
Infecciones Respiratorias Agudas• IRAS son causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo.• En México
▫ 3° causa de muerte en niños <5años▫ Tasa de mortalidad 2005
18.8 por 100 000 habitantes • En niños menores de 5 años
▫ Tasa de mortalidad 2008 28.8 por 100 000 habitantes
• Los principales virus que causan IRAS son:
Virus de influenza A y BRinovirus VSR hMPVParainfluenza 1-4
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Genómica de influenza A
Segmento Nombre de la proteína Longitud (nt)
1 PB2 Subunidad 2 de la polimerasa 2341
2 PB1 Subunidad 1 de la polimerasa 2341
3 PA Subunidad de la polimerasa 2233
4 HA Hemaglutinina 1778
5 NP Nucleoproteína 1565
6 NA Neuraminidasa 1413
7M1 Proteína de Matriz
1027M2 Proteína integral de
membrana
8NS1 Proteína no-
estructural 1 890NS2 Proteína no-
estructural 2
13,588 nt
Brown EG. Influenza virus genetics. Biomed & Pharmacother. 2000; 54:196-209
50-120 nm
Complejo Ribonucleoproteico
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4
Variación genéticaDrift Antigénico
Derivación antigénicaShift Antigénico
Desplazamiento antigénico
• Cambios genéticos puntuales que llevan a modificaciones antigénicas menores.▫ Epidemias
• Cambios genéticos por rearreglo que llevan a modificaciones antigénicas mayores. ▫ 10-40 años▫ Rearreglo entre virus de
influenza humana y otras especies
▫ Pandemias
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5
Influenza A (H1N1) pandémica• Marzo-abril 2009▫ Neumonías atípicas▫ Adultos jóvenes
• Nueva variante de la influenza A• 11 junio 2009 Nivel 6• Primera pandemia del Siglo XXI
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6
Justificación
Problema de salud pública
Infecciones respiratorias y del
virus de influenza A
Cambios y diferencias
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7
Objetivo general
•Definir las características epidemiológicas, virológicas y
genómicas de cepas de la nueva variante del virus de
influenza A (H1N1) responsables de pandemia en la
ciudad de San Luis Potosí.
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Objetivos particulares1. Realizar un análisis epidemiológico de la nueva
variante del virus de influenza A (H1N1).
2. Conocer las secuencias del genoma completo de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).
3. Realizar un análisis de polimorfismos de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).
4. Realizar un análisis filogenético de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1).
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9
Materiales y métodos
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Muestras
Sospecha de infección
Hospital Central “Dr. Ignacio Morones Prieto”
Laboratorio de Virología, departamento de
Microbiología, UASLP.
Exudado faríngeo, nasofaríngeo y lavado
nasofaríngeo
n=706
Extracción RNA viral
High Pure Viral RNA kit; Roche Diagnostics
Síntesis de cDNA
Transcriptasa reversa
Oligonucleótido UniFlu-RT
Detección influenza A(H1N1) pandémica
PCR anidada
8(NS)
Amplicón 429pb
Gómez-Gómez (2010)
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Diseño de oligonucleótidos• Obtener secuencias “Influenza Virus Resource” NCBI
• Alineamiento Clustal W
• Robinson´s Alignment Reformatting
• Hairpins, homodímeros, heterodímeros y específicidad
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12
Oligonucleótidos de amplificación genómica completa
Segmento Nombre Secuencia5’→3’
Tamaño amplicón (bp)
Tm (°C) Referencia
1 (PB2)SwPB2-F ATGGAGAGAATAAAAGAAC
2279 58
(Garcia-Sepulveda,
2009)
SwPB2-R TAATTGATGGCCATCC
2 (PB1)SwPB1-F ATGGATGTCAATCCGA
2273 56SwPB1-R TATTTTTGCCGTCTGAG
3 (PA)SwPA-F ATGGAAGACTTTGTGC
2151 59SwPA-R CTACTTCAGTGCATGTG
4 (HA)SwHA-F ATGAAGGCAATACTAGTAG
1696
56
SwHA-R CATATTCTACACTGTAGAGAC
5 (NP)SwNP-F ATGGCGTCTCAAGG
1496SwNP-R TCAACTGTCATACTCCTC
6 (NA)SwNA-F ATGAATCCAAACCAAAAG
1409SwNA-R TTACTTGTCAATGGTAAATG
7 (M)SwMP-F TAACCGAGGTCGAAA
970SwMP-R TACTCTAGCTCTATGTTGA
8 (NS)SwNS-F ATGGACTCCAACACC
890SwNS-R TTAAATAAGCTGAAACGAG
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13
Oligonucleótidos para secuenciación genómica
1 1746
Frg 1Frg 2
Frg 3Frg 4
pb
115 pb83 pb 122 pb
61 pb
55 pb
4(HA)
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Segmento Nombre Secuencia5’→3’
Tamaño amplicón
(bp)Referencia
1 (PB2)
SwPB2-F1 AAAGAACTGAGAGATCTA 504
(Godoy-Lozano, 2009)
SwPB2-R1 CCACTTCATTTGGGAASwPB2-F2 AGGTTGAAACATGGTACC 740SwPB2-R2 GCTCTTCTCCCAACCASwPB2-F3 GCTAACGGGCAACCT 889SwPB2-R3 CACATTCACAGTCAATGAGGSwPB2-F4 CCTAAGGCAACCAGAAGC 491SwPB2-R4 TGGCTGTCAGTAAGTATGCTAG
2 (PB1)
SwPB1-F1 ATGGATGTCAATCCGACTC 616SwPB1-R1 CTATTGTTCTTTGCGTGACCSwPB1-F2 AGGAAGGCTAATAGATTTCTTA 639SwPB1-R2 AGCATTTCTGCTGGTATSwPB1-F3 GAGTGGTTCAGAAACATC 738SwPB1-R3 TAACTCAAATGATCTTCTCGTSwPB1-F4 CAGATGGCTCTTCAATTGT 639SwPB1-R4 TTTTTGCCGTCTGAGTTC
3 (PA)
SwPA-F1 GGAAGACTTTGTGCGAC 703SwPA-R1 TCCATCTACATAGGCTCTAAASwPA-F2 CAGTAGGAGTCTATGGGAT 607SwPA-R2 TTTGCAGTCATCAAAGTCTASwPA-F3 TTGGAAGCAGGTGCT 700SwPA-R3 GGTTCCATTGGTTCTCACSwPA-F4 TGATGTGGTGAACTTTGTAAG 600SwPA-R4 AGTGCATGTGTGAGGA
4 (HA)
SwHA-F1 CCGCAAATGCAGACACAT 510SwHA-R1 TTAATGTAGGATTTGCTGASwHA-F2 GGCCCAATCATGACTCGA 501SwHA-R2 AGGCTGGTGTTTATAGCACCSwHA-F3 CCGAGATATGCATTCGC 636SwHA-R3 CGTTTCCAATTTCCTTGGCSwHA-F4 TTGATGATGGTTTCCT 387SwHA-R4 TTAGAGCACATCCAGAAA
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Amplificación genómica•PCR anidada•Taq:Pfu•Secuenciación Programa de Termociclaje
Primera y segunda PCR
°C Tiempo Ciclos
95 5 min 1
95 20 seg35Tm 30 seg
72 90 seg72 5 min
14 5 min
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Secuenciación genómica• Laboratorio Nacional de Genómica para la
Biodiversidad del CINVESTAV-Irapuato•Electroferogramas▫4peaks
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17
Mutaciones asociadas a la resistencia a fármacos
•Zanamivir▫D-151▫N, G, E o V
•Oseltamivir▫H274Y y E119V
Neuraminidasa
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Análisis bioinformático• Homología▫ BLAST
• dN/dS▫ “Codon-based Z-test of selection”▫ “Position-wise based selection estimation (HyPhy)”▫ MEGA 5
• Recombinación y similaridad▫ SimPlot versión 3.5.1
• Modelo evolutivo▫ FindModel
• Inferencia del ancestro común más reciente▫ BEAST v1.5.4, Tracer v1.5▫ TreeeAnnotator v1.5.4, FigTree v1.3.1
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Resultados y discusión
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Epidemiología• 1° marzo 2009- 9 abril 2010• 706 muestras
• 133 (18.8%) positivas• 17 muestras
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21
Secuencias generadas• 2 genomas completos• 7 parciales
▫ 8(NS)• 8 parciales
▫ Mas de 1 segmento• Superposición para generar secuencia completa
▫ Sin ambigüedad
Segmento No.
1(PB2) 11
2(PB1) 11
3(PA) 11
4(HA) 9
5(NP) 11
6(NA) 10
7(M) 9
8(NS) 7
99% similitud
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22
dN/dS• Hipótesis de neutralidad
▫ dN/dS=0 • Hipótesis de selección
purificadora▫ dN<dS
• Hipótesis de selección positiva▫ dN>dS
1 21 41 61 81 101 121 141 161 181 201 221 241 261 281 301 321 341 361 381 401 421 441 461 481 501 521 541 561
-4-3.5
-3-2.5
-2-1.5
-1-0.5
00.5
1
Hemaglutinina (HA) dN-dS
Proteína Valor p Hipótesis
PB2 0.001
Selección purificadora
PB1 0.00003
PA 0.004
HA 0.0004
NP 0.0001
NA 0.04
M1 0.008
M2 0.162
NS1 0.341
NS2 0.148
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23
•Cepas circulantes en una misma temporada son muy parecidas.
•El virus tiende a la conservación después de venir de una serie de cambios que provocaron que el virus saltara de hospedero a hospedero.
•dN/dS Selección purificante
•Un año de circulación.
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24
Análisis de similitud• Secuencias consenso por hospedero
Locales
Porcino
Humano
Aviar
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25
Análisis de similitud• Secuencias consenso por subtipo
LocalesH1
H2H5
H9H4H3
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26
Análisis de similitud• Secuencias consenso por región geográfica
LocalesNorte América
Asia
Europa
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27
Análisis de Bootscan
Norte América
Europa
Asia
• Secuencias consenso por región geográfica
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28
Origen geográfico
Segmento Hospedero Origen geográfico1(PB2) porcinos Asia2(PB1) humanos Oceanía3(PA) aves Norte América4(HA) porcinos Asia5(NP) porcinos Asia6(NA) aves Europa7(MP) aves Asia8(NS) porcinos Norte América
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29
Fraser C. Pandemic Potencial of a Strain of Influenza A (H1N1): Early Findings. Sciencexpress. 11 Mayo 2009.
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30
Eventos de recombinación
Segmento Recombinación Similitud Similitud de secuencia restante
1(PB2) 876-1124 porcinos Asia porcinos Norte América
3(PA) 1-2771014-1170
aves Europaaves Oceanía aves Norte América
4(HA) 1-300 porcinos Europa porcinos Norte América
6(NA) 1-2531330-1349
aves Oceaníaaves Sudamérica aves Europa
7(MP) 196-225850-1027
aves Oceaníaaves Europa aves Asia
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31
•Mutaciones puntuales•He et al., 2009 ▫Recombinación
▫Diversidad mayor en virus de la influenza aviar.
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32
•No existe ningún otro reporte que documente recombinación entre cepas de influenza.
•Nosotros encontramos:▫Recombinación de cepas de distintas regiones.▫Virus de influenza humana.
•Estos datos indican que además de la derivación y desplazamiento antigénico la diversidad genética de influenza también puede generarse por recombinación.
•Se desconoce el impacto de este mecanismo en la generación de nuevas variantes de influenza.
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Ancestro común más reciente
JUL AGO SEP OCT NOV DIC ENE FEB MAR 2008 2009
7(M1)
6(NA)
3(PA)
2(PB1)5(NP)
1(PB2)4(HA)
8(NS1)
7(M2)8(NS1)
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34
Ancestro común más recienteSegmento Smith (2009) Godoy (2010)
1(PB2) 9 SEP 2008 11 ENE 2009
2(PB1) 24 OCT 2008 16 DIC 2008
3(PA) 7 OCT 2008 2 NOV 2008
4(HA) 28 AGO 2008 30 ENE 2009
5(NP) 27 MAR 2008 20 DIC 2008
6(NA) 8 AGO 2008 19 OCT 2008
7(M1)3 AGO 2008
8 JUL 2008
7(M2) 16 MAR 2009
8(NS1)21 MAY 2008
21 FEB 2009
8(NS2) 22 MAR 2009
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35
•El MRCA estima la fecha más probable en que el ancestro putativo comenzó a circular.
•A medida que más información se compara, la estimación se vuelve más refinada.
•Nuestro estudio incluye solamente secuencias mexicanas.
•Periodo de estudio: 30 marzo 2009 - 9 abril 2010
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36
Tasas de mutación global
Segmento Tasa de mutación x 10-3(s/s/a) §1(PB2) 6.32
2(PB1) 5.31
3(PA) 4.22
4(HA) 17.6
5(NP) 6.53
6(NA) 6.30
7(M1) 5.09
7(M2) 49.5
8(NS1) 17.7
8(NS2) 58.5 § Substituciones nucleotídicas por sitio por año.
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37
Mutación por posición codónicaPA
NS1
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38
Tasa de mutación•Es mayor a lo anteriormente reportado.•El virus está evolucionando rápidamente.•Etapas tempranas de la evolución del virus hay una
gran diversidad.•Posteriormente predomina la cepa biológicamente
más exitosa.
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39
Resistencia a antivirales
•No se encontraron las mutaciones▫Zanamivir 151▫Oseltamivir 119 y 274
•Presión selectiva•Harvala (2010)▫Cepas resistentes a oseltamivir
•OMS▫11 agosto 2010▫120 cepas resistentes a oseltamivir
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40
Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad
0.0 100 200 300 400
5(NP)
445
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41
0.0 100 200 300 400
M1
437
Árboles filogenéticos de cladas de máxima credibilidad
![Page 42: Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1 )](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062323/56816013550346895dcf13e5/html5/thumbnails/42.jpg)
42
•Proceso evolutivo ▫Perpetuarse.
•Al principio de la pandemia se originó un número elevado de experimentos biológicos destinados a generar mucha diversidad con la posibilidad de que alguna de las cepas lograra colonizar a un hospedero y convertirse en una cepa biológicamente exitosa.
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43
Conclusión•MRCA es más reciente.• La tasa de mutación global es mayor.•No se encontraron mutaciones que confieren
resistencia a antivirales.• La recombinación de segmentos del virus de la
influenza entre cepas circulantes en diversas regiones y hospederos es una posible manera en la que se puede explicar la diversidad de estos virus.
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Actividades realizadas durante la maestríaFebrero 2009 SLP,SLPCurso sobre Infecciones Virales: Epidemiología, diagnóstico molecular y aplicación clínica
Junio 2009 SLP,SLPCurso sobre la Tecnología del ADN Recombinante: Producción y purificación de Taq ADN polimerasa
Septiembre 2009 SLP,SLPAsistente a la I Reunión Académica de Enfermedades infecciosas y su prevención y a la 8ª Reunión Internacional de vacunas
Octubre 2009 Guadalajara, JaliscoAsistente al XXXIV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica
Octubre 2009 SLP, SLPParticipación como ponente durante la 16ª Semana de Ciencia y Tecnología
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Noviembre 2009 Merida, YucatánAsistente al VI Congreso Nacional de Virología
Mayo 2010 Guadalajara, JaliscoCartel XXXV Congreso Nacional de Infectología y Microbiología Clínica “Hospitalización asociada a infección por virus de influenza pandémica A(H1N1) 2009 e influenza estacional en pacientes menores de 5 años”. Godoy-Lozano; Contreras-Treviño; Aranda-Romo; Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Hernández-Salinas; Barrios-Compeán; Ochoa-Pérez; García-Sepúlveda; Noyola-Cherpitel. Facultad de Medicina. UASLP. SLP,SLP.
Aportaciones a GenBankGU811749, GU811750, GU811751, GU811752, GU811753, GU811754, GU811755, GU811756, GU811757, GU811758.
![Page 46: Epidemiología, virología y genómica de la nueva variante del virus de influenza A (H1N1 )](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062323/56816013550346895dcf13e5/html5/thumbnails/46.jpg)
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Manuscritos•Pandemic influenza A(H1N1) 2009 and respiratory
syncytial virus associated hospitalizations. Lovato-Salas; Matienzo-Serment; Monjarás-Ávila, Godoy-Lozano, Comas-García; Aguilera-Barragán; Durham-González; Contreras-Vidales; Ochoa-Pérez; Gómez-Gómez; García-Sepúlveda; Noyola . En revisión en Journal of Infection.
•Viral DNA Extractions from Blood Using Laudry Detergent. Guerra-Palomares; Godoy-Lozano; Noyola; García-Sepúlveda. En revisión en Nucleid Acid Research.
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•CONACYT•Asesores• Laboratorio de Virología •Familia•Amigos
Agradecimientos
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Gracias