Emissionen im Fahrzeug innenraum
Analyse von Werkstoffmaterialiennach VDA278 mit Thermodesorption
UV-1900
UV-Vis-Spektroskopie ndash schnellund einfach wie noch nie
50 Jahre Shimadzu in Europa
Meilensteine in Entwicklung undTechnologie
Pharmaceutical
Plastics and Rubber
INHALT
Clinical
Chemical PetrochemicalBiofuel and Energy
In jedem Ozean in jeder Tiefe ndashMikrofasern und Mikroplastik 2
Restlos rein ndash TOC-Analytik fuumlr die Reinigungsvalidierung in der pharmazeutischen Industrie 8
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Pro ben und Bau -teilen 10
Analyse von VOC- und SVOC-Emis sionen im Fahrzeug innenraumndash Werkstoffpruumlfung nach VDA278mit Thermodesorption 16
Oumll im Wasser ndash Schnelle und effi-ziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53 18
Die Qual der Wahl ndash Nicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbeTrenn verhalten 21
Derivatisierung mit Pyryliumsalzenndash Houmlhere Empfindlichkeit beiPeptid analysen mit LC-MSMS 26
APPLIKATION
ALSACHIM Hochwertige Grund-kom ponenten fuumlr die Antibiotika-forschung 5
50 Jahre Shimadzu in Europa ndashMeilensteine in Entwicklung undTechnologie 14
Die Zukunft der Massenspek tro -metrie fuumlr das toxikologischeScreening 24
AKTUELLES
MAumlRKTE
UV-1900 Perfekt fuumlr alle Analyse an for -derungen ndash UV-Vis-Spektroskopie ndashschnell und einfach wie noch nie 6
PRODUKTE
SHIMADZU NEWS 22018
Food Beverages Agriculture
Environment
Automotive
In jedem Ozean in jederTiefe ndash Mikrofasern undMikroplastikMikro-FTIR-Analytik an kleinsten Partikeln aus der Tiefsee bis zum Polareis
A uf allen Kontinenten fin-den Naturwissenschaftlerpolymere Mikropartikel in
Lebewesen ndash auch in der Welt derMeerestiere etwa im Polar dorsch(Boreogadus saida) oder in Tief -seefloumlhen (Lysianassoidea amphi-pods) die ein wich tiges Glied inder Nah rungs kette von FischenPingui nen Seevoumlgeln oder Rob -ben sind Zwei Arbeits gruppen(New castle University Groszlig -britan nien und WageningenMarine Research Niederlande)untersuchten die Mageninhalteder jeweiligen Tier art Und beideGruppen wurden fuumlndig Mikro -partikel um 100 microm Groumlszlige wur-den isoliert
Polardorsch vom Nordpol
Der Arktische Ozean wird oft alsungestoumlrte und unberuumlhrte Naturerfahren Jedoch ist die Arktiskein geschlossenes Sys tem son-dern vom Menschen beeinflusstzum Beispiel durch Klimawandeloder Umweltver schmutzung Inden letzten Jahren wurde in derNaumlhe des Spitzbergen-Archipelsim arktischen Ozean ein zusaumltz-licher Meereswirbel (Gyre) be -schrieben der aus den suumldlichenstaumlrker urbanisierten Gebietenden marinen Plastikabfall ansam-melt Auch im Meereis selbstwurden Plastikruumlckstaumlnde gefun-den Da das Eis schmilzt koumlnnendie im Meereis eingefangenenKunst stoffteilchen freigesetztwerden und stehen fuumlr Organis -men zur Verfuumlgung die unterdem Meer eis leben und sichernaumlhren
Einer dieser Organismen ist derPolardorsch eine Fischart die
ihre ersten Jahre unter demMeer eis verbringt Sie ernaumlhrtsich von kleinen Krebstieren unddient als wichtige Beute fuumlr grouml-szligere Tiere wie Seevoumlgel undMeeressaumluger Der Polardorschwird darum als Schluumlsselspeziesdes arktischen Oumlkosystems ange-sehen Fuumlr diese Studie wurdeder Fisch direkt unter demMeereis des Eurasischen Beckensund in offenem Wasser rund umSpitz bergen gefangen [1]
Tiefseeshrimps ndash OrdnungFlohkrebse (Amphipoda)
Die Universitaumlt von Newcastlenutzte Tauchsonden um mobilemaritime Organismen in denextremen Tiefen der See einzu-sammeln Proben wurden ineiner Tiefe von 11000 m imMarianen-Graben genommeneine Tiefsee rinne im westlichenPazifik direkt oumlstlich der mikro-nesischen Inseln sowie in ande-
85deg N
85deg N
80deg N 75deg N
0deg 10deg E 20deg E 30deg E 40deg E
170deg W 170deg E 160deg E 150deg E 140deg E 130deg E 120deg E180deg
Mineraloumllruumlckstaumlnde in Lebensmit teln ndash MOSH-MOAH-Bestim mung 12
FUumlR SIE GELESEN
Abbildung 1 Fundorte der Polardorschproben
APPLIKATION
3SHIMADZU NEWS 22018
ren Graumlben im Pazi fik mit Tiefenbis zu 7000 m Die meisten Orga -nismen waren LysianassoideaAmphipoden Kreatu ren die andie Bedingungen der Tiefsee ange-passt sind Es wurde herausgefun-den dass diese Lebe wesen aus derTiefsee sogar in der Lage sindEnzyme zu entwickeln die Holz -fasern verdauen [2]
Probenvorbereitung
Die groumlszligte Problematik derMikro partikelanalyse ist die Kon -tamination der Proben durch elek-trostatisch aufgeladene Parti keldie die Probe anfliegen oder Parti -
kel die der Mensch (Schuppenund Fasern) mit sich traumlgt EinigeKunststoff-Teilchen sogenannteMikrofasern zum Beispiel ausKleidung werden nicht nur vonTieren aufgenommen sondernsind so leicht dass sie in der Luftschweben koumlnnen Eine Unter -schei dung zwischen Fasern diedurch Tiere selbst oder durchLuftverunreinigungen in die Pro -be geraten ist nicht moumlglich [1]
Die Reinigung der Mikropartikelist eine weitere schwierige Frage -stellung Behandelt man die Pro -ben chemisch um alle proteinaumlhn-lichen Ruumlckstaumlnde zu entfernen
oder waumlscht man die Proben ein-fach mit Wasser Bei der chemi-schen Reinigung koumlnnen Informa -tionen uumlber anhaftende Chemi -kalien verloren gehen bei derReinigung mit Wasser bleibendiese Informationen erhalten aberdie Reinigung ist moumlglicherweiseweniger gruumlndlich Die Mikropar -tikel aus dem Flohkrebs wurdenmit einer KOH-Loumlsung (Kalium -hydroxid) bearbeitet die alleorganischen Anhaftungen aufloumlstohne den Kunststoff selbst anzu-greifen Die Partikel aus demPolardorsch wurden mit Wassergereinigt
Analyse mit Infrarotmikro -spektroskopie
Die Definition eines Mikropar ti -kels variiert von Veroumlffentlichungzur Veroumlffentlichung Partikel immicrom-Bereich sind hier der Anlasszur Beschreibung einer Mess tech -nik die dem Erscheinungsbild derProben gerecht wird Die Infra rot -spektroskopie ist die Methode derWahl
Mit dem FTIR-Geraumlt IRTracer-100 dem InfrarotmikroskopAIM-9000 und der DiamantzelleDC3 von Specac wurden dieUntersuchungen der Mikropar -tikel durchgefuumlhrt Je nach ihremAussehen wurden Einzelpunkt -mes sungen oder Flaumlchenanalysen(Mapping) ausgefuumlhrtMit der Dia -mantzelle werden kleine unebenePartikel plan und bis zur Transpa -renz gedruumlckt Somit koumlnnenPartikel im Durchlichtverfah renanalysiert werden Die gemesse-nen Infrarot-Spektren wurden mitSpektrenbibliotheken unterschied-
lichster Herkunft (ShimadzuSadtler STJapan-Europe undanderen) identifiziert
Studium der Plastikaufnahme
Zur Untersuchung der potenziel-len Beziehung zwischen Kunst -stoff in Meereis und der Einnah mevon Kunststoff durch Fischewurde in 72 Polardorsch-Maumlgennach Kunststoff gesucht Von den72 Fischen wurden zwei Indivi -duen (28 der gesammeltenProbe) mit jeweils einem kleinenPlastikpartikel gefunden DiesesErgebnis ist vergleichbar mit Ein -
nahmeraten bei Fischen aus nor-wegischen und kanadischenGewaumlssern Der in Abbildung 2gezeigte blaue Partikel von 200 micromwurde infrarotmikroskopisch ana-lysiert Das Ergebnis der Durch -lichtmessung ergab dass der Par -tikel aus einer Kombination ausanorganischen (Kaolin) und poly-merbasierenden Stoffen (PMMA)besteht (Abbildung 5 Seite 4)Das Infra rotspektrum (Transmis -sion) des roten Partikels in Abbil -dung 2 ist das Ergebnis aus einerMischung von Epoxidharz undAcryl basierendem Klebstoff [2]
Abbildung 5 zeigt exemplarischdie Analyse des blauen PartikelsMit der Bibliotheksfunktion wur-den die HauptkomponentenPMMA (Polymethylmethacrylat)und Kaolin des Partikels identifi-ziert Oben in der Abbildung istdas Kaolin dargestellt in der Mit -te das Transmissionsspektrum
Abbildung 2 Zwei der gefundenen Partikel aus Polardorsch-Maumlgen
Abbildung 3 Tauchsonde die bei den Arbeiten in der Tiefsee zum Einsatz gelangte
Abbildung 4 Hirodelleas gigas als Beispiel der Ordnung Amphipode
des Mikropartikels und unten dasSpektrum von PMMA
Der Magen eines Tiefseeshrimpsenthielt einen Partikel bestehendaus bdquoPolyethylenldquo der partiell voneiner Mischung aus Organik undAnorganik umhuumlllt war (Abbil -dung 6) Polyethylen ist als Poly -mer von Natur aus sehrleicht mit seiner Dichteunter 1 (Tabelle 1) undschwimmt eigentlich inoberen Gewaumlsser schich tenVermut lich durch Anla ge -rung von kleinen Was ser -tieren und deren Skeletteoder anderen aumluszligeren Ein -fluumlssen ist dieser Partikeldoch bis in die unterenMeerwasser schich ten ge -langt In Abbildung 6 istoben rechts in der Ansichtdes Parti kels der Mess fleckvon 15 x 15 microm zu er ken -nen Es ist eine Trans mis -sions aufnahme eines Par -ti kels von 100 microm derdurch das Glaumltten mit derDia mant zelle verbreitertwurde
Wie in der Abbildungdeutlich zu sehen ist derPartikel mit einer Koronaversehen Die Messungergab dass es sich um
dieser Kranz wiedergegeben wer-den
Fazit ndash Kunststoff als zusaumltz -licher Stressfaktor
Die Ergebnisse zeigen dass dieAuswirkungen von Kunststoff-Verschmutzung den ArktischenOzean sowie die Tiefsee erreichthaben und dass Fische und Am -phipode Kunststoff-Teilchenbegegnen koumlnnen Die Folgen derEinnahme von Plastikpartikelnbleiben unklar
Zusammen mit anderen Faktorenwie dem Klimawandel der zuneh-menden Schifffahrt und der Aus -weitung der Fischerei kann diePlastik-Verschmutzung ein zu -saumltzlicher Stressfaktor des sensi-blen Oumlkosystems der Arktis sein[1]
In der Tiefsee ist zu erwarten dassPlastik einmal am Tiefseebodenangekommen dort auch bleibtDaraus resultiert eine Anreiche -rung am Meeresboden Dies ist einErgebnis das alarmiert Fasern ausdem Magen eines Tieres zu isolie-ren das in 11 km Tiefe lebt zeigt
bereits die Folgen desMikroplas tik problems [3]
Vielen Dank anDr Alan Jamieson Newcastle
University UK und Dr Robert
Keighley Shimadzu UK fuumlr die
Ergebnisse der Amphipoden ana -
lysen Susanne Kuumlhn et al fuumlr
die Ergebnisse der Polardorsch -
analy sen
AutorenSusanne Kuumlhn Wageningen Marine
Research Niederlande
Alan Jamieson New Castle
University Groszligbritannien
Robert Keighley SUK
Groszligbritannien
Marion Egelkraut-Holtus Shimadzu
Europa GmbH Deutschland
einen Kranz aus CaCO3 (Calci um -carbonat) handelt (Ab bildung 7)Auf Grund der klaren Darstel lungwurde da her der Partikel in einerFlaumlchen messung (Screening Map -ping) abgetastet (Abbildung 8) Inder Mapping-Sicht eingestellt aufdie carbonylische Bande vomCaCO3 kann sehr anschaulich
APPLIKATION
4 SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Plastic ingestion by juvenile polar cod
(Boreogadus saida) in the Arctic Ocean
Susanne Kuumlhn Fokje L Schaafsma
Bernike van Werven Hauke Flores
Melanie Bergmann Marion Egelkraut-
Holtus Mine B Tekman Jan A van
Franeker Polar Biology
httpsdoiorg101007s00300-018-
2283-8 2018
[2] National Geographic News August 30
2012
[3] httpsnewsskycomstoryplastic-
pollution-reaches-oceans-deepest-parts-
11127144
Abbildung 5 Analyse der im Polardorsch gefundenen Proben
Abbildung 7 Spektren der Tiefseefloh -
krebs-Proben
Dichte in gcm3 0915 - 0935 094 - 097 087 - 094 118 - 119 1027
Eigenschaft PE-LD PE-HD PE-LLD PMMA Meerwasser (Temperatur ~10 degC Salzgehalt 35 gl)
Tabelle 1 Dichte von Meerwasser Polyethylenen (PE) und Polymethylmetacrylat (PMMA) [Wikipedia]
001020304050607080910
3000
CalciumcarbonatCaCO3
1900 1300 700
Abs
cm-1
Abbildung 8 FTIR-Mapping Tiefseefloh -
krebs
Abbildung 8a Skalierung des FTIR-
Mapping
Abbildung 6 Bild des Partikels mit der CCD-Kamera des
Infrarotmikroskops AIM-9000
AKTUELLES
5SHIMADZU NEWS 22018
A LSACHIM ein Unterneh -men der Shimadzu-Gruppehat ein vollstaumlndiges Spek -
trum stabiler isotopenmarkierterinterner Antibiotika-Standardsvorgestellt um pharmazeutischeIndustrie und Kliniken bei derEntwicklung einer therapeuti-schen Medikamentenuumlberwachung(Therapeutic Drug Monitoring)zu unterstuumltzen Hierzu gehoumlrenspezifisch markierte Verbindungenwie Tazobactam Avibactam oderCeftolozan und Ceftarolin
Als ein weltweiter Marktfuumlhrerfuumlr die Synthese stabiler isotopen-markierter interner Standards(13C 2H 15N) stabiler markierterGrundkomponenten pharmazeu-
tischer Wirkstoffe sogenannterAPI (Active PharmaceuticalIngredients) und Metaboliten fuumlrbioanalytische Untersuchungen istALSACHIM seit 2017 Teil derShimadzu-Gruppe
Die ALSACHIM-Produkte er -gaumlnzen das Shimadzu-Angebot fuumlrden klinischen Markt ndash Komplett -loumlsungen aus Hardware Softwareund Anwendungs-Kits
Seit 13 Jahren beliefert das inFrankreich beheimatete Unterneh -men Kunden weltweit ausGesund heitswesen Lebensmittelund Umwelt darunter die phar-mazeutische und biotechnologi-sche Industrie klinische und bioa-
nalytische Forschungseinrichtun -gen (CROs) und Forschungsinsti -tute
Hochwertige Grundkompo nen -ten fuumlr Antibiotika
Durch seine Marktnaumlhe und FampE-Staumlrke hat ALSACHIM wichtigeisotopenmarkierte Grundkompo -nenten fuumlr Antibiotika entwickeltAlle fuumlhrenden Akteure im Ge -sundheitsbereich arbeiten an The -men wie Antibiotika-ResistenzAntibiotika-Ruumlckstaumlnde im Blutoder Antibiotika-Kombinationen
ALSACHIM hat stabile isotopen-markierte interne Standards fuumlrunterschiedliche Antibiotika-
Familien vorgestellt etwa fuumlrBeta-Lactame CephalosporinCarbapenem oder Penicillin DerUmfang von markierten und un -markierten Antibiotika-Molekuumllenhat sich nun erweitert auf hoch-wertige isotopenmarkierte Analy -sestandards wie Amoxicillin-d4Avibactam-13C5 Cefepim-13Cd3Cefotaxim-13Cd3 Ceftarolin-13Cd3 Ceftazidim-d6 Ceftolo -zan-d2-15N2 Cloxacillin-d5Fluocloxalilin-13C4-15N (Fluclo -xacillin-13C4-15N) Meropenem-d6 oder Tazobactam-13C2-15N2
Hochwertige Grundkomponentenfuumlr die AntibiotikaforschungALSACHIM unterstuumltzt Pharma-Unternehmen und deren FampE von Antibiotika
PRODUKTE
6 SHIMADZU NEWS 22018
D as neue UV-1900-Spektro -photometer verbindet einhochentwickeltes optisches
Doppelstrahlsystem mit der paten -tierten Lo-Ray-Lighreg-Beugungs -gitter-Technologie in einemCzerny-Turner-MonochromatorDiese Technik gewaumlhrleistet gerin-ges Streulicht und hohe photome-trische Reproduzierbarkeit die indieser Geraumlteklasse bisher nichtbekannt war Das UV-1900 isthoumlchst effizient dank der schnell-sten Scan-Funktion von 29000nmmin es dauert nur drei Sekun -
den uumlber alle Wellenlaumlngenberei -che zu messen Aufgrund derSteuerung uumlber das nutzerfreund-liche Farb-Touch-Panel und dieneue LabSolutions UV-Vis-Soft -ware ist das UV-1900 perfektgeeignet die Laborarbeit zu opti-mieren
Hightech bietet bisher nichtdagewesene Geraumltefaumlhigkeiten
Das Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitteraus den High-End-Modellen bie-tet fuumlr das UV-1900 das geringste
UV-1900 Perfekt fuumlr alleAnalyse anfor derungenUV-Vis-Spektroskopie ndash schnell und einfach wie noch nie
Streulicht seiner Klasse (wenigerals 05 bei 198 nm) Die hohephotometrische Reproduzier bar -keit und Genauigkeit bieten einender groumlszligten Linearitaumltsbereiche(Abbildung 2)
Das optische System des UV-1900hat die houmlchste Aufloumlsung seinerKlasse (1 nm) und gewaumlhrleistetdie maximale von den Arzneibuuml -chern vieler Laumlnder verlangteMess genauigkeit Daruumlber hinausermoumlglicht die neue ultra-schnelleScan-Funktion eine genaue Mes -sung mit der erstaunlichen Ge -
schwindigkeit von 29000 nmmindurchzufuumlhren Dies verkuumlrzt dieAnalysedauer erheblich und er -moumlglicht es auch chemische Reak -tionen nachzuverfolgen
Perfekt fuumlr alleAnalyseanforderungen
Uumlber das Farb-Touch-Panel laumlsstsich die Programmoberflaumlche intu -itiv bedienen ndash uumlber Stift oderFingerspitze Auch ohne PC sindalle gaumlngigen Programme verfuumlg-bar bdquoPhotometrieldquo bdquoSpektrumldquobdquoQuantifizierungldquo bdquoKinetikldquobdquoZeitverlaufldquo und bdquoBiomethodeldquozur DNA- und Proteinquan tifi -zierung Die programmeigenen
Pruumlf- und Sicherheitsfunktionenerfuumlllen die Anforderungen ausArzneibuumlchern GLPGMP FDAund andere RechtsvorschriftenDes Weiteren nimmt die Proben -kammer verschiedenstes Zubehoumlrauf wie Ansaugeinheit Tempera -tur steuerung oder Reflexions mess -einsatz
UV-Vis-Spektrophotometer UV-1900
Abbildung 1 Verbesserte Bedienung uumlber Farb-Touch-Panel
000
050
100
150
200
250
300
000 100 200 300
Konzentration (mgml)
Abs
Abbildung 2 Die Eichkurve des UV-1900 (schwarze Linie) ist linearer als der
Kurvenverlauf eines Geraumlts mit 1 Streulicht (rote Linie)
Abbildung 3 Intuitiver
Programmaufbau
PRODUKTE
7SHIMADZU NEWS 22018
Damit eignet sich das UV-1900perfekt fuumlr Applikationen wieNahrungsmittel Pharmaka oderChemie Der gesamte Spektral -bereich laumlsst sich in Sekunden -schnelle scannen Waumlhrend bisherfuumlr Zeitverlauf-Messungen die In -tensitaumlt nur bei einer entscheiden-den Wellenlaumlnge beobachtet wer-den konnte laumlsst sich nun die Aumln -derung des gesamten Absorp tions -spektrums untersuchen
LabSolutions UV-Vis fuumlr erweiterte Moumlglichkeiten
Die neue LabSolutions UV-Vis-Software unterstuumltzt alle Funktio -nen des UV-1900 und verbessertdie Arbeitseffizienz Die eindeuti-ge und einfache Programmge stal -tung ist aus der LabSolutions-Familie bekannt (LabSolutions IRLabSolutions RF) System- undMesskonfiguration fuumlr den Ar -beitsablauf werden durch einfachnachvollziehbare Fenster undselbsterklaumlrende Symbole opti-miert
Verschiedene Programme sinduumlber den LabSolutions Managererreichbar Vom Start an sindbdquoSpektrumldquo bdquoQuantifizierungldquobdquoPhotometrieldquo und bdquoZeitverlaufldquoverfuumlgbar Eine neue spektraleAuswertungsfunktion vereinfachtdie Qualitaumltskontrolle mit einerautomatischen Proben-EvaluationWeitere optionale Programme las-sen sich hinzufuumlgen wie zumBeispiel bdquoFarbanalyseldquo
Multiple Datensaumltze lassen sicheinfach per Einzelklick auf andereFormate wie Batch-Text oderMicrosoft Excel exportierenZudem unterstuumltzt LabSolutionsUV-Vis die Anwender mit bedien-erfreundlichen Funktionen wieEchtzeitanzeige von Konzen tra -tionen oder automatische Bestim -mung von optimalen Parameternzur Peak-Detektion
Die LabSolutions DB und CS-Plattform von Shimadzu stellt dieUumlbereinstimmung mit den ERES-Vorschriften sicher DieseWerkzeuge liefern eine Projekt-Managementfunktion ausgerichtet
Abbildung 5 LabSolutions DB oder CS Projekt-Management
Abbildung 6 Gestaltung und Evaluationsfunktion der neuen LabSolutions UV-Software
Abbildung 4 Kinetische Untersuchung der Agglomeratbildung von Silber-
Nanopartikeln
05
10
300 400 500 600 700 800
Wellenlaumlnge (nm)
Exti
nkti
on (a
u)
auf Aufgaben und SystembetriebDiese Funktionen erlauben Geraumlte-und AnwendermanagementSicherheitsstrategie und Datenver -arbeitung auf der Grundlage vonEinzelprojekten wobei die Effi -zienz von Datenabfragen undManagementaufgaben verbessertwird
Fazit
Das neue UV-1900 setzt einenneuen Maszligstab fuumlr kompakte UV-Vis-Spektrophotometer
Die Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitter-Technologie in diesem Zwei strahl -geraumlt ermoumlglicht ausgezeichnetephotometrische Werte wobei einFarb-Touch-Panel und die Anbin -dung an LabSolutions UV-Viseinen einfachen fortschrittlichen
Arbeitsablauf bieten ndash als Einzel -platzloumlsung oder uumlber PC-Steuer -ung und dabei voll kompatibelmit der UV-Probe-Software
Durch das breite Angebot anMessablaumlufen und die Uumlberein-stimmung mit internationalenRichtlinien und Vorgaben eignetsich das UV-1900 fuumlr zahlreicheAnwendungsfelder
APPLIKATION
8 SHIMADZU NEWS 22018
I n der Herstellung von Arznei -mitteln sind houmlchste Reinheitund sorgfaumlltigster Umgang mit
Substanzen und Wirkstoffen wich -tige Voraussetzungen Dazu zaumlhltbesonders Produktionsresteeffektiv zu entfernen Denn nureine gut gereinigte Anlage verhin-dert die Kontamination und Ver -faumllschung des produzierten Medi -kaments und traumlgt somit zurSicherheit der Patienten bei
1988 kam es zum Beispiel zu ei -nem Ruumlckruf von 200 Mio Doseneines Cholesterinsenkers ndash er warmit Pestiziden verunreinigt Eswird angenommen dass es zueiner Kreuzkontamination kamals Loumlsemittelfaumlsser aus der Pesti -zidherstellung erneut in der Wirk -stoffproduktion genutzt wurdenDer Wirkstoff wurde zur Endfer -tigung an eine weitere Einrichtunggeliefert wo es letztendlich zurVerunreinigung von komplettenArzneimittel-Chargen kam ndash aneinem Standort an dem normaler-weise keine Pestizide hergestelltwerden Der Wirkstoff-Herstellerfuumlhrte zu dieser Zeit weder ausrei-chende Kontrollen durch nochgab es validierte Reinigungspro -zesse
Behoumlrdliche Anforderungen
Die wesentlichen behoumlrdlichenAnforderungen an die Anlagen -reinigung wurden daraufhin imJahr 1993 im bdquoGuide to Inspec -tions ndash Validation of cleaning pro-cesses (793)ldquo der amerikanischenLebensmitteluumlberwachungs- undArzneimittelbehoumlrde FDA klarerbehandelt Hier werden dokumen-tierte Beweise verlangt dass einzugelassenes Reinigungsverfahrenkonsistent aktive pharmazeutischeInhaltsstoffe (API) Prozess ruumlck -staumlnde Reinigungsmittel undmikrobielle Verunreinigungen aufProduktkontaktflaumlchen des Her -stellungs-Equipments auf ein ak -zeptables Niveau fuumlr die Verarbei -tung von Arzneimitteln reduziertBesonders wichtig ist dies bei derProduktion von Wirkstof fen inBatch-Prozessen da hier dieAnla ge fuumlr verschiedene Pro dukteverwendet wird und eine Konta -mi nation der Folgeprodukte zuvermeiden ist
Nachdem eine Charge des Wirk -stoffs in die Weiterverarbeitung
Dies ist eine be sonders einfacheleicht automatisierbare undschnelle Methode
Reinigungsverfahren Clean out of Place
Fuumlr die COP-Reinigung muss dieAnlage auseinander gebaut unddie Komponenten einzeln gerei-nigt werden Diese Vorgehens wei -se ist zeit- und personalintensiverAufgrund der individuellen Reini -gung ist dieses Verfahren nichtstandardisierbar Vorteilhaft sindallerdings die geringeren Anschaf -fungskosten der Anlage und dieMoumlglichkeit der visuellen Begut -achtung
Im Falle der COP-Reinigung wirdder Wischtest (Swab) fuumlr die Be -probung von sichtbaren Ruumlck -staumlnden verwendet (Abbildung 1)Dazu zaumlhlen Uumlberzuumlge KrustenAnbackung in Winkeln und Eckenund besonders schwer loumlslicheSubstanzen Der verwendete Swabkann in einem Loumlsungsmittelextrahiert werden anschlieszligendwird die Extraktionsloumlsung analy-tisch bestimmt Wird Wasser alsLoumlsungsmittel fuumlr die Extraktionverwendet bietet sich fuumlr dieanschlieszligende Analyse die TOC-Analytik an Alternativ kann derSwab auch direkt (bei Verwendungeines kohlenstofffreien Swab) miteinem TOC-Feststoffmodul ver-messen werden
Einsetzbare Analysenmethoden
Um den Erfolg des Reinigungsver -fahrens zu belegen stehen ver-schiedene analytische Methodenzur Verfuumlgung die sich jedoch inEmpfindlichkeit und Spezifitaumltunterscheiden Uumlbliche Methodensind in Tabelle 1 abgebildet
Reinigungsverfahren Clean in Place
Die CIP-Reinigung (clean in place)erfolgt automatisch und ohneZerlegung der Anlage Dafuumlr mussdas System im CIP-Design ausge-ruumlstet sein Dies beinhaltet dieVerwendung von SpuumllkoumlpfenAuffangbehaumlltern die Vermeidungvon Totraumlumen und Recycling-Moumlglichkeiten des Reinigungs -mittels Weil Zeit und Temperatursowie Reinigungsmittel undLoumlsungsmittelverbrauch optimiertsind ist die CIP-Reinigung sehreffektiv Die automatische Reini -gung ermoumlglicht auszligerdem einestandardisierte und dadurch leicht
zu validierende ProzedurIm Falle der CIP-Reini -gung wird die Spuumll fluumls sig -keit des letzten Spuumllgangs(Final Rinse) als Probegenommen und analysiert
geht werden die verwendetenArbeitsmittel gereinigt etwa Reak -toren oder Fermenter so dass dernaumlchste Batch produziert werdenkann Der eigentliche Reini gungs -vorgang ist in der Regel strengfestgelegt und wird an schlieszligendanalytisch uumlberpruumlft und doku-mentiert So wird eine Probe ausder Anlage auf bestimmte Para -meter untersucht Bleibt ein fest-gelegter Grenzwert unterschrittengilt die Anlage als gereinigt undkann erneut eingesetzt werdenDieser Vorgang nennt sich Reini -gungsvalidierung Das verwendeteReinigungsverfahren hat groszligenEinfluss auf die Art der zu nut-zenden Probennahmetechnik
Restlos reinTOC-Analytik fuumlr die Reinigungs -validie rung in der pharmazeutischenIndustrie
Abbildung 1 Shimadzu
Easy Wiper Swab
Abbildung 2 TOC-L mit SSM-5000A
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
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SteBLife ndash A new short-time procedure
for the calculation of S-N curves and
failure probabilities Mater Test 60
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625-630
len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
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bull P Starke A Baumlumchen
H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
httpswwwhanser-elibrarycomtoc
mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
200000
300000
400000
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650000
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
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1200000
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10 30 50 70 90 110 130 150 170
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
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450000
500000
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650000
700000
750000
800000
uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
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450000
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600000
650000
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750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
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70000
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200000
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400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
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00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
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2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
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e In
tens
itaumlt
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]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
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Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
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]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
Pharmaceutical
Plastics and Rubber
INHALT
Clinical
Chemical PetrochemicalBiofuel and Energy
In jedem Ozean in jeder Tiefe ndashMikrofasern und Mikroplastik 2
Restlos rein ndash TOC-Analytik fuumlr die Reinigungsvalidierung in der pharmazeutischen Industrie 8
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Pro ben und Bau -teilen 10
Analyse von VOC- und SVOC-Emis sionen im Fahrzeug innenraumndash Werkstoffpruumlfung nach VDA278mit Thermodesorption 16
Oumll im Wasser ndash Schnelle und effi-ziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53 18
Die Qual der Wahl ndash Nicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbeTrenn verhalten 21
Derivatisierung mit Pyryliumsalzenndash Houmlhere Empfindlichkeit beiPeptid analysen mit LC-MSMS 26
APPLIKATION
ALSACHIM Hochwertige Grund-kom ponenten fuumlr die Antibiotika-forschung 5
50 Jahre Shimadzu in Europa ndashMeilensteine in Entwicklung undTechnologie 14
Die Zukunft der Massenspek tro -metrie fuumlr das toxikologischeScreening 24
AKTUELLES
MAumlRKTE
UV-1900 Perfekt fuumlr alle Analyse an for -derungen ndash UV-Vis-Spektroskopie ndashschnell und einfach wie noch nie 6
PRODUKTE
SHIMADZU NEWS 22018
Food Beverages Agriculture
Environment
Automotive
In jedem Ozean in jederTiefe ndash Mikrofasern undMikroplastikMikro-FTIR-Analytik an kleinsten Partikeln aus der Tiefsee bis zum Polareis
A uf allen Kontinenten fin-den Naturwissenschaftlerpolymere Mikropartikel in
Lebewesen ndash auch in der Welt derMeerestiere etwa im Polar dorsch(Boreogadus saida) oder in Tief -seefloumlhen (Lysianassoidea amphi-pods) die ein wich tiges Glied inder Nah rungs kette von FischenPingui nen Seevoumlgeln oder Rob -ben sind Zwei Arbeits gruppen(New castle University Groszlig -britan nien und WageningenMarine Research Niederlande)untersuchten die Mageninhalteder jeweiligen Tier art Und beideGruppen wurden fuumlndig Mikro -partikel um 100 microm Groumlszlige wur-den isoliert
Polardorsch vom Nordpol
Der Arktische Ozean wird oft alsungestoumlrte und unberuumlhrte Naturerfahren Jedoch ist die Arktiskein geschlossenes Sys tem son-dern vom Menschen beeinflusstzum Beispiel durch Klimawandeloder Umweltver schmutzung Inden letzten Jahren wurde in derNaumlhe des Spitzbergen-Archipelsim arktischen Ozean ein zusaumltz-licher Meereswirbel (Gyre) be -schrieben der aus den suumldlichenstaumlrker urbanisierten Gebietenden marinen Plastikabfall ansam-melt Auch im Meereis selbstwurden Plastikruumlckstaumlnde gefun-den Da das Eis schmilzt koumlnnendie im Meereis eingefangenenKunst stoffteilchen freigesetztwerden und stehen fuumlr Organis -men zur Verfuumlgung die unterdem Meer eis leben und sichernaumlhren
Einer dieser Organismen ist derPolardorsch eine Fischart die
ihre ersten Jahre unter demMeer eis verbringt Sie ernaumlhrtsich von kleinen Krebstieren unddient als wichtige Beute fuumlr grouml-szligere Tiere wie Seevoumlgel undMeeressaumluger Der Polardorschwird darum als Schluumlsselspeziesdes arktischen Oumlkosystems ange-sehen Fuumlr diese Studie wurdeder Fisch direkt unter demMeereis des Eurasischen Beckensund in offenem Wasser rund umSpitz bergen gefangen [1]
Tiefseeshrimps ndash OrdnungFlohkrebse (Amphipoda)
Die Universitaumlt von Newcastlenutzte Tauchsonden um mobilemaritime Organismen in denextremen Tiefen der See einzu-sammeln Proben wurden ineiner Tiefe von 11000 m imMarianen-Graben genommeneine Tiefsee rinne im westlichenPazifik direkt oumlstlich der mikro-nesischen Inseln sowie in ande-
85deg N
85deg N
80deg N 75deg N
0deg 10deg E 20deg E 30deg E 40deg E
170deg W 170deg E 160deg E 150deg E 140deg E 130deg E 120deg E180deg
Mineraloumllruumlckstaumlnde in Lebensmit teln ndash MOSH-MOAH-Bestim mung 12
FUumlR SIE GELESEN
Abbildung 1 Fundorte der Polardorschproben
APPLIKATION
3SHIMADZU NEWS 22018
ren Graumlben im Pazi fik mit Tiefenbis zu 7000 m Die meisten Orga -nismen waren LysianassoideaAmphipoden Kreatu ren die andie Bedingungen der Tiefsee ange-passt sind Es wurde herausgefun-den dass diese Lebe wesen aus derTiefsee sogar in der Lage sindEnzyme zu entwickeln die Holz -fasern verdauen [2]
Probenvorbereitung
Die groumlszligte Problematik derMikro partikelanalyse ist die Kon -tamination der Proben durch elek-trostatisch aufgeladene Parti keldie die Probe anfliegen oder Parti -
kel die der Mensch (Schuppenund Fasern) mit sich traumlgt EinigeKunststoff-Teilchen sogenannteMikrofasern zum Beispiel ausKleidung werden nicht nur vonTieren aufgenommen sondernsind so leicht dass sie in der Luftschweben koumlnnen Eine Unter -schei dung zwischen Fasern diedurch Tiere selbst oder durchLuftverunreinigungen in die Pro -be geraten ist nicht moumlglich [1]
Die Reinigung der Mikropartikelist eine weitere schwierige Frage -stellung Behandelt man die Pro -ben chemisch um alle proteinaumlhn-lichen Ruumlckstaumlnde zu entfernen
oder waumlscht man die Proben ein-fach mit Wasser Bei der chemi-schen Reinigung koumlnnen Informa -tionen uumlber anhaftende Chemi -kalien verloren gehen bei derReinigung mit Wasser bleibendiese Informationen erhalten aberdie Reinigung ist moumlglicherweiseweniger gruumlndlich Die Mikropar -tikel aus dem Flohkrebs wurdenmit einer KOH-Loumlsung (Kalium -hydroxid) bearbeitet die alleorganischen Anhaftungen aufloumlstohne den Kunststoff selbst anzu-greifen Die Partikel aus demPolardorsch wurden mit Wassergereinigt
Analyse mit Infrarotmikro -spektroskopie
Die Definition eines Mikropar ti -kels variiert von Veroumlffentlichungzur Veroumlffentlichung Partikel immicrom-Bereich sind hier der Anlasszur Beschreibung einer Mess tech -nik die dem Erscheinungsbild derProben gerecht wird Die Infra rot -spektroskopie ist die Methode derWahl
Mit dem FTIR-Geraumlt IRTracer-100 dem InfrarotmikroskopAIM-9000 und der DiamantzelleDC3 von Specac wurden dieUntersuchungen der Mikropar -tikel durchgefuumlhrt Je nach ihremAussehen wurden Einzelpunkt -mes sungen oder Flaumlchenanalysen(Mapping) ausgefuumlhrtMit der Dia -mantzelle werden kleine unebenePartikel plan und bis zur Transpa -renz gedruumlckt Somit koumlnnenPartikel im Durchlichtverfah renanalysiert werden Die gemesse-nen Infrarot-Spektren wurden mitSpektrenbibliotheken unterschied-
lichster Herkunft (ShimadzuSadtler STJapan-Europe undanderen) identifiziert
Studium der Plastikaufnahme
Zur Untersuchung der potenziel-len Beziehung zwischen Kunst -stoff in Meereis und der Einnah mevon Kunststoff durch Fischewurde in 72 Polardorsch-Maumlgennach Kunststoff gesucht Von den72 Fischen wurden zwei Indivi -duen (28 der gesammeltenProbe) mit jeweils einem kleinenPlastikpartikel gefunden DiesesErgebnis ist vergleichbar mit Ein -
nahmeraten bei Fischen aus nor-wegischen und kanadischenGewaumlssern Der in Abbildung 2gezeigte blaue Partikel von 200 micromwurde infrarotmikroskopisch ana-lysiert Das Ergebnis der Durch -lichtmessung ergab dass der Par -tikel aus einer Kombination ausanorganischen (Kaolin) und poly-merbasierenden Stoffen (PMMA)besteht (Abbildung 5 Seite 4)Das Infra rotspektrum (Transmis -sion) des roten Partikels in Abbil -dung 2 ist das Ergebnis aus einerMischung von Epoxidharz undAcryl basierendem Klebstoff [2]
Abbildung 5 zeigt exemplarischdie Analyse des blauen PartikelsMit der Bibliotheksfunktion wur-den die HauptkomponentenPMMA (Polymethylmethacrylat)und Kaolin des Partikels identifi-ziert Oben in der Abbildung istdas Kaolin dargestellt in der Mit -te das Transmissionsspektrum
Abbildung 2 Zwei der gefundenen Partikel aus Polardorsch-Maumlgen
Abbildung 3 Tauchsonde die bei den Arbeiten in der Tiefsee zum Einsatz gelangte
Abbildung 4 Hirodelleas gigas als Beispiel der Ordnung Amphipode
des Mikropartikels und unten dasSpektrum von PMMA
Der Magen eines Tiefseeshrimpsenthielt einen Partikel bestehendaus bdquoPolyethylenldquo der partiell voneiner Mischung aus Organik undAnorganik umhuumlllt war (Abbil -dung 6) Polyethylen ist als Poly -mer von Natur aus sehrleicht mit seiner Dichteunter 1 (Tabelle 1) undschwimmt eigentlich inoberen Gewaumlsser schich tenVermut lich durch Anla ge -rung von kleinen Was ser -tieren und deren Skeletteoder anderen aumluszligeren Ein -fluumlssen ist dieser Partikeldoch bis in die unterenMeerwasser schich ten ge -langt In Abbildung 6 istoben rechts in der Ansichtdes Parti kels der Mess fleckvon 15 x 15 microm zu er ken -nen Es ist eine Trans mis -sions aufnahme eines Par -ti kels von 100 microm derdurch das Glaumltten mit derDia mant zelle verbreitertwurde
Wie in der Abbildungdeutlich zu sehen ist derPartikel mit einer Koronaversehen Die Messungergab dass es sich um
dieser Kranz wiedergegeben wer-den
Fazit ndash Kunststoff als zusaumltz -licher Stressfaktor
Die Ergebnisse zeigen dass dieAuswirkungen von Kunststoff-Verschmutzung den ArktischenOzean sowie die Tiefsee erreichthaben und dass Fische und Am -phipode Kunststoff-Teilchenbegegnen koumlnnen Die Folgen derEinnahme von Plastikpartikelnbleiben unklar
Zusammen mit anderen Faktorenwie dem Klimawandel der zuneh-menden Schifffahrt und der Aus -weitung der Fischerei kann diePlastik-Verschmutzung ein zu -saumltzlicher Stressfaktor des sensi-blen Oumlkosystems der Arktis sein[1]
In der Tiefsee ist zu erwarten dassPlastik einmal am Tiefseebodenangekommen dort auch bleibtDaraus resultiert eine Anreiche -rung am Meeresboden Dies ist einErgebnis das alarmiert Fasern ausdem Magen eines Tieres zu isolie-ren das in 11 km Tiefe lebt zeigt
bereits die Folgen desMikroplas tik problems [3]
Vielen Dank anDr Alan Jamieson Newcastle
University UK und Dr Robert
Keighley Shimadzu UK fuumlr die
Ergebnisse der Amphipoden ana -
lysen Susanne Kuumlhn et al fuumlr
die Ergebnisse der Polardorsch -
analy sen
AutorenSusanne Kuumlhn Wageningen Marine
Research Niederlande
Alan Jamieson New Castle
University Groszligbritannien
Robert Keighley SUK
Groszligbritannien
Marion Egelkraut-Holtus Shimadzu
Europa GmbH Deutschland
einen Kranz aus CaCO3 (Calci um -carbonat) handelt (Ab bildung 7)Auf Grund der klaren Darstel lungwurde da her der Partikel in einerFlaumlchen messung (Screening Map -ping) abgetastet (Abbildung 8) Inder Mapping-Sicht eingestellt aufdie carbonylische Bande vomCaCO3 kann sehr anschaulich
APPLIKATION
4 SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Plastic ingestion by juvenile polar cod
(Boreogadus saida) in the Arctic Ocean
Susanne Kuumlhn Fokje L Schaafsma
Bernike van Werven Hauke Flores
Melanie Bergmann Marion Egelkraut-
Holtus Mine B Tekman Jan A van
Franeker Polar Biology
httpsdoiorg101007s00300-018-
2283-8 2018
[2] National Geographic News August 30
2012
[3] httpsnewsskycomstoryplastic-
pollution-reaches-oceans-deepest-parts-
11127144
Abbildung 5 Analyse der im Polardorsch gefundenen Proben
Abbildung 7 Spektren der Tiefseefloh -
krebs-Proben
Dichte in gcm3 0915 - 0935 094 - 097 087 - 094 118 - 119 1027
Eigenschaft PE-LD PE-HD PE-LLD PMMA Meerwasser (Temperatur ~10 degC Salzgehalt 35 gl)
Tabelle 1 Dichte von Meerwasser Polyethylenen (PE) und Polymethylmetacrylat (PMMA) [Wikipedia]
001020304050607080910
3000
CalciumcarbonatCaCO3
1900 1300 700
Abs
cm-1
Abbildung 8 FTIR-Mapping Tiefseefloh -
krebs
Abbildung 8a Skalierung des FTIR-
Mapping
Abbildung 6 Bild des Partikels mit der CCD-Kamera des
Infrarotmikroskops AIM-9000
AKTUELLES
5SHIMADZU NEWS 22018
A LSACHIM ein Unterneh -men der Shimadzu-Gruppehat ein vollstaumlndiges Spek -
trum stabiler isotopenmarkierterinterner Antibiotika-Standardsvorgestellt um pharmazeutischeIndustrie und Kliniken bei derEntwicklung einer therapeuti-schen Medikamentenuumlberwachung(Therapeutic Drug Monitoring)zu unterstuumltzen Hierzu gehoumlrenspezifisch markierte Verbindungenwie Tazobactam Avibactam oderCeftolozan und Ceftarolin
Als ein weltweiter Marktfuumlhrerfuumlr die Synthese stabiler isotopen-markierter interner Standards(13C 2H 15N) stabiler markierterGrundkomponenten pharmazeu-
tischer Wirkstoffe sogenannterAPI (Active PharmaceuticalIngredients) und Metaboliten fuumlrbioanalytische Untersuchungen istALSACHIM seit 2017 Teil derShimadzu-Gruppe
Die ALSACHIM-Produkte er -gaumlnzen das Shimadzu-Angebot fuumlrden klinischen Markt ndash Komplett -loumlsungen aus Hardware Softwareund Anwendungs-Kits
Seit 13 Jahren beliefert das inFrankreich beheimatete Unterneh -men Kunden weltweit ausGesund heitswesen Lebensmittelund Umwelt darunter die phar-mazeutische und biotechnologi-sche Industrie klinische und bioa-
nalytische Forschungseinrichtun -gen (CROs) und Forschungsinsti -tute
Hochwertige Grundkompo nen -ten fuumlr Antibiotika
Durch seine Marktnaumlhe und FampE-Staumlrke hat ALSACHIM wichtigeisotopenmarkierte Grundkompo -nenten fuumlr Antibiotika entwickeltAlle fuumlhrenden Akteure im Ge -sundheitsbereich arbeiten an The -men wie Antibiotika-ResistenzAntibiotika-Ruumlckstaumlnde im Blutoder Antibiotika-Kombinationen
ALSACHIM hat stabile isotopen-markierte interne Standards fuumlrunterschiedliche Antibiotika-
Familien vorgestellt etwa fuumlrBeta-Lactame CephalosporinCarbapenem oder Penicillin DerUmfang von markierten und un -markierten Antibiotika-Molekuumllenhat sich nun erweitert auf hoch-wertige isotopenmarkierte Analy -sestandards wie Amoxicillin-d4Avibactam-13C5 Cefepim-13Cd3Cefotaxim-13Cd3 Ceftarolin-13Cd3 Ceftazidim-d6 Ceftolo -zan-d2-15N2 Cloxacillin-d5Fluocloxalilin-13C4-15N (Fluclo -xacillin-13C4-15N) Meropenem-d6 oder Tazobactam-13C2-15N2
Hochwertige Grundkomponentenfuumlr die AntibiotikaforschungALSACHIM unterstuumltzt Pharma-Unternehmen und deren FampE von Antibiotika
PRODUKTE
6 SHIMADZU NEWS 22018
D as neue UV-1900-Spektro -photometer verbindet einhochentwickeltes optisches
Doppelstrahlsystem mit der paten -tierten Lo-Ray-Lighreg-Beugungs -gitter-Technologie in einemCzerny-Turner-MonochromatorDiese Technik gewaumlhrleistet gerin-ges Streulicht und hohe photome-trische Reproduzierbarkeit die indieser Geraumlteklasse bisher nichtbekannt war Das UV-1900 isthoumlchst effizient dank der schnell-sten Scan-Funktion von 29000nmmin es dauert nur drei Sekun -
den uumlber alle Wellenlaumlngenberei -che zu messen Aufgrund derSteuerung uumlber das nutzerfreund-liche Farb-Touch-Panel und dieneue LabSolutions UV-Vis-Soft -ware ist das UV-1900 perfektgeeignet die Laborarbeit zu opti-mieren
Hightech bietet bisher nichtdagewesene Geraumltefaumlhigkeiten
Das Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitteraus den High-End-Modellen bie-tet fuumlr das UV-1900 das geringste
UV-1900 Perfekt fuumlr alleAnalyse anfor derungenUV-Vis-Spektroskopie ndash schnell und einfach wie noch nie
Streulicht seiner Klasse (wenigerals 05 bei 198 nm) Die hohephotometrische Reproduzier bar -keit und Genauigkeit bieten einender groumlszligten Linearitaumltsbereiche(Abbildung 2)
Das optische System des UV-1900hat die houmlchste Aufloumlsung seinerKlasse (1 nm) und gewaumlhrleistetdie maximale von den Arzneibuuml -chern vieler Laumlnder verlangteMess genauigkeit Daruumlber hinausermoumlglicht die neue ultra-schnelleScan-Funktion eine genaue Mes -sung mit der erstaunlichen Ge -
schwindigkeit von 29000 nmmindurchzufuumlhren Dies verkuumlrzt dieAnalysedauer erheblich und er -moumlglicht es auch chemische Reak -tionen nachzuverfolgen
Perfekt fuumlr alleAnalyseanforderungen
Uumlber das Farb-Touch-Panel laumlsstsich die Programmoberflaumlche intu -itiv bedienen ndash uumlber Stift oderFingerspitze Auch ohne PC sindalle gaumlngigen Programme verfuumlg-bar bdquoPhotometrieldquo bdquoSpektrumldquobdquoQuantifizierungldquo bdquoKinetikldquobdquoZeitverlaufldquo und bdquoBiomethodeldquozur DNA- und Proteinquan tifi -zierung Die programmeigenen
Pruumlf- und Sicherheitsfunktionenerfuumlllen die Anforderungen ausArzneibuumlchern GLPGMP FDAund andere RechtsvorschriftenDes Weiteren nimmt die Proben -kammer verschiedenstes Zubehoumlrauf wie Ansaugeinheit Tempera -tur steuerung oder Reflexions mess -einsatz
UV-Vis-Spektrophotometer UV-1900
Abbildung 1 Verbesserte Bedienung uumlber Farb-Touch-Panel
000
050
100
150
200
250
300
000 100 200 300
Konzentration (mgml)
Abs
Abbildung 2 Die Eichkurve des UV-1900 (schwarze Linie) ist linearer als der
Kurvenverlauf eines Geraumlts mit 1 Streulicht (rote Linie)
Abbildung 3 Intuitiver
Programmaufbau
PRODUKTE
7SHIMADZU NEWS 22018
Damit eignet sich das UV-1900perfekt fuumlr Applikationen wieNahrungsmittel Pharmaka oderChemie Der gesamte Spektral -bereich laumlsst sich in Sekunden -schnelle scannen Waumlhrend bisherfuumlr Zeitverlauf-Messungen die In -tensitaumlt nur bei einer entscheiden-den Wellenlaumlnge beobachtet wer-den konnte laumlsst sich nun die Aumln -derung des gesamten Absorp tions -spektrums untersuchen
LabSolutions UV-Vis fuumlr erweiterte Moumlglichkeiten
Die neue LabSolutions UV-Vis-Software unterstuumltzt alle Funktio -nen des UV-1900 und verbessertdie Arbeitseffizienz Die eindeuti-ge und einfache Programmge stal -tung ist aus der LabSolutions-Familie bekannt (LabSolutions IRLabSolutions RF) System- undMesskonfiguration fuumlr den Ar -beitsablauf werden durch einfachnachvollziehbare Fenster undselbsterklaumlrende Symbole opti-miert
Verschiedene Programme sinduumlber den LabSolutions Managererreichbar Vom Start an sindbdquoSpektrumldquo bdquoQuantifizierungldquobdquoPhotometrieldquo und bdquoZeitverlaufldquoverfuumlgbar Eine neue spektraleAuswertungsfunktion vereinfachtdie Qualitaumltskontrolle mit einerautomatischen Proben-EvaluationWeitere optionale Programme las-sen sich hinzufuumlgen wie zumBeispiel bdquoFarbanalyseldquo
Multiple Datensaumltze lassen sicheinfach per Einzelklick auf andereFormate wie Batch-Text oderMicrosoft Excel exportierenZudem unterstuumltzt LabSolutionsUV-Vis die Anwender mit bedien-erfreundlichen Funktionen wieEchtzeitanzeige von Konzen tra -tionen oder automatische Bestim -mung von optimalen Parameternzur Peak-Detektion
Die LabSolutions DB und CS-Plattform von Shimadzu stellt dieUumlbereinstimmung mit den ERES-Vorschriften sicher DieseWerkzeuge liefern eine Projekt-Managementfunktion ausgerichtet
Abbildung 5 LabSolutions DB oder CS Projekt-Management
Abbildung 6 Gestaltung und Evaluationsfunktion der neuen LabSolutions UV-Software
Abbildung 4 Kinetische Untersuchung der Agglomeratbildung von Silber-
Nanopartikeln
05
10
300 400 500 600 700 800
Wellenlaumlnge (nm)
Exti
nkti
on (a
u)
auf Aufgaben und SystembetriebDiese Funktionen erlauben Geraumlte-und AnwendermanagementSicherheitsstrategie und Datenver -arbeitung auf der Grundlage vonEinzelprojekten wobei die Effi -zienz von Datenabfragen undManagementaufgaben verbessertwird
Fazit
Das neue UV-1900 setzt einenneuen Maszligstab fuumlr kompakte UV-Vis-Spektrophotometer
Die Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitter-Technologie in diesem Zwei strahl -geraumlt ermoumlglicht ausgezeichnetephotometrische Werte wobei einFarb-Touch-Panel und die Anbin -dung an LabSolutions UV-Viseinen einfachen fortschrittlichen
Arbeitsablauf bieten ndash als Einzel -platzloumlsung oder uumlber PC-Steuer -ung und dabei voll kompatibelmit der UV-Probe-Software
Durch das breite Angebot anMessablaumlufen und die Uumlberein-stimmung mit internationalenRichtlinien und Vorgaben eignetsich das UV-1900 fuumlr zahlreicheAnwendungsfelder
APPLIKATION
8 SHIMADZU NEWS 22018
I n der Herstellung von Arznei -mitteln sind houmlchste Reinheitund sorgfaumlltigster Umgang mit
Substanzen und Wirkstoffen wich -tige Voraussetzungen Dazu zaumlhltbesonders Produktionsresteeffektiv zu entfernen Denn nureine gut gereinigte Anlage verhin-dert die Kontamination und Ver -faumllschung des produzierten Medi -kaments und traumlgt somit zurSicherheit der Patienten bei
1988 kam es zum Beispiel zu ei -nem Ruumlckruf von 200 Mio Doseneines Cholesterinsenkers ndash er warmit Pestiziden verunreinigt Eswird angenommen dass es zueiner Kreuzkontamination kamals Loumlsemittelfaumlsser aus der Pesti -zidherstellung erneut in der Wirk -stoffproduktion genutzt wurdenDer Wirkstoff wurde zur Endfer -tigung an eine weitere Einrichtunggeliefert wo es letztendlich zurVerunreinigung von komplettenArzneimittel-Chargen kam ndash aneinem Standort an dem normaler-weise keine Pestizide hergestelltwerden Der Wirkstoff-Herstellerfuumlhrte zu dieser Zeit weder ausrei-chende Kontrollen durch nochgab es validierte Reinigungspro -zesse
Behoumlrdliche Anforderungen
Die wesentlichen behoumlrdlichenAnforderungen an die Anlagen -reinigung wurden daraufhin imJahr 1993 im bdquoGuide to Inspec -tions ndash Validation of cleaning pro-cesses (793)ldquo der amerikanischenLebensmitteluumlberwachungs- undArzneimittelbehoumlrde FDA klarerbehandelt Hier werden dokumen-tierte Beweise verlangt dass einzugelassenes Reinigungsverfahrenkonsistent aktive pharmazeutischeInhaltsstoffe (API) Prozess ruumlck -staumlnde Reinigungsmittel undmikrobielle Verunreinigungen aufProduktkontaktflaumlchen des Her -stellungs-Equipments auf ein ak -zeptables Niveau fuumlr die Verarbei -tung von Arzneimitteln reduziertBesonders wichtig ist dies bei derProduktion von Wirkstof fen inBatch-Prozessen da hier dieAnla ge fuumlr verschiedene Pro dukteverwendet wird und eine Konta -mi nation der Folgeprodukte zuvermeiden ist
Nachdem eine Charge des Wirk -stoffs in die Weiterverarbeitung
Dies ist eine be sonders einfacheleicht automatisierbare undschnelle Methode
Reinigungsverfahren Clean out of Place
Fuumlr die COP-Reinigung muss dieAnlage auseinander gebaut unddie Komponenten einzeln gerei-nigt werden Diese Vorgehens wei -se ist zeit- und personalintensiverAufgrund der individuellen Reini -gung ist dieses Verfahren nichtstandardisierbar Vorteilhaft sindallerdings die geringeren Anschaf -fungskosten der Anlage und dieMoumlglichkeit der visuellen Begut -achtung
Im Falle der COP-Reinigung wirdder Wischtest (Swab) fuumlr die Be -probung von sichtbaren Ruumlck -staumlnden verwendet (Abbildung 1)Dazu zaumlhlen Uumlberzuumlge KrustenAnbackung in Winkeln und Eckenund besonders schwer loumlslicheSubstanzen Der verwendete Swabkann in einem Loumlsungsmittelextrahiert werden anschlieszligendwird die Extraktionsloumlsung analy-tisch bestimmt Wird Wasser alsLoumlsungsmittel fuumlr die Extraktionverwendet bietet sich fuumlr dieanschlieszligende Analyse die TOC-Analytik an Alternativ kann derSwab auch direkt (bei Verwendungeines kohlenstofffreien Swab) miteinem TOC-Feststoffmodul ver-messen werden
Einsetzbare Analysenmethoden
Um den Erfolg des Reinigungsver -fahrens zu belegen stehen ver-schiedene analytische Methodenzur Verfuumlgung die sich jedoch inEmpfindlichkeit und Spezifitaumltunterscheiden Uumlbliche Methodensind in Tabelle 1 abgebildet
Reinigungsverfahren Clean in Place
Die CIP-Reinigung (clean in place)erfolgt automatisch und ohneZerlegung der Anlage Dafuumlr mussdas System im CIP-Design ausge-ruumlstet sein Dies beinhaltet dieVerwendung von SpuumllkoumlpfenAuffangbehaumlltern die Vermeidungvon Totraumlumen und Recycling-Moumlglichkeiten des Reinigungs -mittels Weil Zeit und Temperatursowie Reinigungsmittel undLoumlsungsmittelverbrauch optimiertsind ist die CIP-Reinigung sehreffektiv Die automatische Reini -gung ermoumlglicht auszligerdem einestandardisierte und dadurch leicht
zu validierende ProzedurIm Falle der CIP-Reini -gung wird die Spuumll fluumls sig -keit des letzten Spuumllgangs(Final Rinse) als Probegenommen und analysiert
geht werden die verwendetenArbeitsmittel gereinigt etwa Reak -toren oder Fermenter so dass dernaumlchste Batch produziert werdenkann Der eigentliche Reini gungs -vorgang ist in der Regel strengfestgelegt und wird an schlieszligendanalytisch uumlberpruumlft und doku-mentiert So wird eine Probe ausder Anlage auf bestimmte Para -meter untersucht Bleibt ein fest-gelegter Grenzwert unterschrittengilt die Anlage als gereinigt undkann erneut eingesetzt werdenDieser Vorgang nennt sich Reini -gungsvalidierung Das verwendeteReinigungsverfahren hat groszligenEinfluss auf die Art der zu nut-zenden Probennahmetechnik
Restlos reinTOC-Analytik fuumlr die Reinigungs -validie rung in der pharmazeutischenIndustrie
Abbildung 1 Shimadzu
Easy Wiper Swab
Abbildung 2 TOC-L mit SSM-5000A
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
Literatur[1] P Starke A Baumlumchen H Wu H
SteBLife ndash A new short-time procedure
for the calculation of S-N curves and
failure probabilities Mater Test 60
(2018) 1-7
[2] P Starke H Wu C Boller Advanced
Evaluation of Fatigue Phenomena Using
Non-Destructive Testing Methods Adv
Mater Proc THERMEC 2016 (2016)
1841-1847
[3] WJ Dixon F Jr Massey Introduction to
statistical analysis The Maple Press
Company York (1969)
[4] JD Morrow Cyclic plastic strain energy
and fatigue of metals Internal friction
damping and cyclic plasticity Phila -
delphia PA American Society for
Testing and Materials (1964) 45-87
[5] OH Basquin The exponential law on
endurance tests Proc ASTM 10 (1910)
625-630
len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
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zu diesem Beitrag
bull P Starke A Baumlumchen
H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
httpswwwhanser-elibrarycomtoc
mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
(BFR) Stellungnahme Nr 0082010
09122010
[2] EFSA Panel on Contaminants in the
Food Chain (CONTAM) EFSA Journal
2012 10(6) 2704-2889
[3] Austrian Standards Institute OumlNORM
EN 16995 Edition 2017-08-01
[4] M Biedermann K Grob J Chromatogr
A 2012 1255 56-75
[5] M Nestola TC Schmidt J Chromatogr
A 1505 (2017) 69-76
[6] wwwbfrbunddecm343bestimmung-
von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
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200000
400000
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
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650000
700000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
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000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
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000
041
000
054
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052
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014
012
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000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
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000
000
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044
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000
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018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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ProductsliteratureGCMSC146-
E349pdf
APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
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125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
200000
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350000
400000
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500000
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600000
650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
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Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
3SHIMADZU NEWS 22018
ren Graumlben im Pazi fik mit Tiefenbis zu 7000 m Die meisten Orga -nismen waren LysianassoideaAmphipoden Kreatu ren die andie Bedingungen der Tiefsee ange-passt sind Es wurde herausgefun-den dass diese Lebe wesen aus derTiefsee sogar in der Lage sindEnzyme zu entwickeln die Holz -fasern verdauen [2]
Probenvorbereitung
Die groumlszligte Problematik derMikro partikelanalyse ist die Kon -tamination der Proben durch elek-trostatisch aufgeladene Parti keldie die Probe anfliegen oder Parti -
kel die der Mensch (Schuppenund Fasern) mit sich traumlgt EinigeKunststoff-Teilchen sogenannteMikrofasern zum Beispiel ausKleidung werden nicht nur vonTieren aufgenommen sondernsind so leicht dass sie in der Luftschweben koumlnnen Eine Unter -schei dung zwischen Fasern diedurch Tiere selbst oder durchLuftverunreinigungen in die Pro -be geraten ist nicht moumlglich [1]
Die Reinigung der Mikropartikelist eine weitere schwierige Frage -stellung Behandelt man die Pro -ben chemisch um alle proteinaumlhn-lichen Ruumlckstaumlnde zu entfernen
oder waumlscht man die Proben ein-fach mit Wasser Bei der chemi-schen Reinigung koumlnnen Informa -tionen uumlber anhaftende Chemi -kalien verloren gehen bei derReinigung mit Wasser bleibendiese Informationen erhalten aberdie Reinigung ist moumlglicherweiseweniger gruumlndlich Die Mikropar -tikel aus dem Flohkrebs wurdenmit einer KOH-Loumlsung (Kalium -hydroxid) bearbeitet die alleorganischen Anhaftungen aufloumlstohne den Kunststoff selbst anzu-greifen Die Partikel aus demPolardorsch wurden mit Wassergereinigt
Analyse mit Infrarotmikro -spektroskopie
Die Definition eines Mikropar ti -kels variiert von Veroumlffentlichungzur Veroumlffentlichung Partikel immicrom-Bereich sind hier der Anlasszur Beschreibung einer Mess tech -nik die dem Erscheinungsbild derProben gerecht wird Die Infra rot -spektroskopie ist die Methode derWahl
Mit dem FTIR-Geraumlt IRTracer-100 dem InfrarotmikroskopAIM-9000 und der DiamantzelleDC3 von Specac wurden dieUntersuchungen der Mikropar -tikel durchgefuumlhrt Je nach ihremAussehen wurden Einzelpunkt -mes sungen oder Flaumlchenanalysen(Mapping) ausgefuumlhrtMit der Dia -mantzelle werden kleine unebenePartikel plan und bis zur Transpa -renz gedruumlckt Somit koumlnnenPartikel im Durchlichtverfah renanalysiert werden Die gemesse-nen Infrarot-Spektren wurden mitSpektrenbibliotheken unterschied-
lichster Herkunft (ShimadzuSadtler STJapan-Europe undanderen) identifiziert
Studium der Plastikaufnahme
Zur Untersuchung der potenziel-len Beziehung zwischen Kunst -stoff in Meereis und der Einnah mevon Kunststoff durch Fischewurde in 72 Polardorsch-Maumlgennach Kunststoff gesucht Von den72 Fischen wurden zwei Indivi -duen (28 der gesammeltenProbe) mit jeweils einem kleinenPlastikpartikel gefunden DiesesErgebnis ist vergleichbar mit Ein -
nahmeraten bei Fischen aus nor-wegischen und kanadischenGewaumlssern Der in Abbildung 2gezeigte blaue Partikel von 200 micromwurde infrarotmikroskopisch ana-lysiert Das Ergebnis der Durch -lichtmessung ergab dass der Par -tikel aus einer Kombination ausanorganischen (Kaolin) und poly-merbasierenden Stoffen (PMMA)besteht (Abbildung 5 Seite 4)Das Infra rotspektrum (Transmis -sion) des roten Partikels in Abbil -dung 2 ist das Ergebnis aus einerMischung von Epoxidharz undAcryl basierendem Klebstoff [2]
Abbildung 5 zeigt exemplarischdie Analyse des blauen PartikelsMit der Bibliotheksfunktion wur-den die HauptkomponentenPMMA (Polymethylmethacrylat)und Kaolin des Partikels identifi-ziert Oben in der Abbildung istdas Kaolin dargestellt in der Mit -te das Transmissionsspektrum
Abbildung 2 Zwei der gefundenen Partikel aus Polardorsch-Maumlgen
Abbildung 3 Tauchsonde die bei den Arbeiten in der Tiefsee zum Einsatz gelangte
Abbildung 4 Hirodelleas gigas als Beispiel der Ordnung Amphipode
des Mikropartikels und unten dasSpektrum von PMMA
Der Magen eines Tiefseeshrimpsenthielt einen Partikel bestehendaus bdquoPolyethylenldquo der partiell voneiner Mischung aus Organik undAnorganik umhuumlllt war (Abbil -dung 6) Polyethylen ist als Poly -mer von Natur aus sehrleicht mit seiner Dichteunter 1 (Tabelle 1) undschwimmt eigentlich inoberen Gewaumlsser schich tenVermut lich durch Anla ge -rung von kleinen Was ser -tieren und deren Skeletteoder anderen aumluszligeren Ein -fluumlssen ist dieser Partikeldoch bis in die unterenMeerwasser schich ten ge -langt In Abbildung 6 istoben rechts in der Ansichtdes Parti kels der Mess fleckvon 15 x 15 microm zu er ken -nen Es ist eine Trans mis -sions aufnahme eines Par -ti kels von 100 microm derdurch das Glaumltten mit derDia mant zelle verbreitertwurde
Wie in der Abbildungdeutlich zu sehen ist derPartikel mit einer Koronaversehen Die Messungergab dass es sich um
dieser Kranz wiedergegeben wer-den
Fazit ndash Kunststoff als zusaumltz -licher Stressfaktor
Die Ergebnisse zeigen dass dieAuswirkungen von Kunststoff-Verschmutzung den ArktischenOzean sowie die Tiefsee erreichthaben und dass Fische und Am -phipode Kunststoff-Teilchenbegegnen koumlnnen Die Folgen derEinnahme von Plastikpartikelnbleiben unklar
Zusammen mit anderen Faktorenwie dem Klimawandel der zuneh-menden Schifffahrt und der Aus -weitung der Fischerei kann diePlastik-Verschmutzung ein zu -saumltzlicher Stressfaktor des sensi-blen Oumlkosystems der Arktis sein[1]
In der Tiefsee ist zu erwarten dassPlastik einmal am Tiefseebodenangekommen dort auch bleibtDaraus resultiert eine Anreiche -rung am Meeresboden Dies ist einErgebnis das alarmiert Fasern ausdem Magen eines Tieres zu isolie-ren das in 11 km Tiefe lebt zeigt
bereits die Folgen desMikroplas tik problems [3]
Vielen Dank anDr Alan Jamieson Newcastle
University UK und Dr Robert
Keighley Shimadzu UK fuumlr die
Ergebnisse der Amphipoden ana -
lysen Susanne Kuumlhn et al fuumlr
die Ergebnisse der Polardorsch -
analy sen
AutorenSusanne Kuumlhn Wageningen Marine
Research Niederlande
Alan Jamieson New Castle
University Groszligbritannien
Robert Keighley SUK
Groszligbritannien
Marion Egelkraut-Holtus Shimadzu
Europa GmbH Deutschland
einen Kranz aus CaCO3 (Calci um -carbonat) handelt (Ab bildung 7)Auf Grund der klaren Darstel lungwurde da her der Partikel in einerFlaumlchen messung (Screening Map -ping) abgetastet (Abbildung 8) Inder Mapping-Sicht eingestellt aufdie carbonylische Bande vomCaCO3 kann sehr anschaulich
APPLIKATION
4 SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Plastic ingestion by juvenile polar cod
(Boreogadus saida) in the Arctic Ocean
Susanne Kuumlhn Fokje L Schaafsma
Bernike van Werven Hauke Flores
Melanie Bergmann Marion Egelkraut-
Holtus Mine B Tekman Jan A van
Franeker Polar Biology
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pollution-reaches-oceans-deepest-parts-
11127144
Abbildung 5 Analyse der im Polardorsch gefundenen Proben
Abbildung 7 Spektren der Tiefseefloh -
krebs-Proben
Dichte in gcm3 0915 - 0935 094 - 097 087 - 094 118 - 119 1027
Eigenschaft PE-LD PE-HD PE-LLD PMMA Meerwasser (Temperatur ~10 degC Salzgehalt 35 gl)
Tabelle 1 Dichte von Meerwasser Polyethylenen (PE) und Polymethylmetacrylat (PMMA) [Wikipedia]
001020304050607080910
3000
CalciumcarbonatCaCO3
1900 1300 700
Abs
cm-1
Abbildung 8 FTIR-Mapping Tiefseefloh -
krebs
Abbildung 8a Skalierung des FTIR-
Mapping
Abbildung 6 Bild des Partikels mit der CCD-Kamera des
Infrarotmikroskops AIM-9000
AKTUELLES
5SHIMADZU NEWS 22018
A LSACHIM ein Unterneh -men der Shimadzu-Gruppehat ein vollstaumlndiges Spek -
trum stabiler isotopenmarkierterinterner Antibiotika-Standardsvorgestellt um pharmazeutischeIndustrie und Kliniken bei derEntwicklung einer therapeuti-schen Medikamentenuumlberwachung(Therapeutic Drug Monitoring)zu unterstuumltzen Hierzu gehoumlrenspezifisch markierte Verbindungenwie Tazobactam Avibactam oderCeftolozan und Ceftarolin
Als ein weltweiter Marktfuumlhrerfuumlr die Synthese stabiler isotopen-markierter interner Standards(13C 2H 15N) stabiler markierterGrundkomponenten pharmazeu-
tischer Wirkstoffe sogenannterAPI (Active PharmaceuticalIngredients) und Metaboliten fuumlrbioanalytische Untersuchungen istALSACHIM seit 2017 Teil derShimadzu-Gruppe
Die ALSACHIM-Produkte er -gaumlnzen das Shimadzu-Angebot fuumlrden klinischen Markt ndash Komplett -loumlsungen aus Hardware Softwareund Anwendungs-Kits
Seit 13 Jahren beliefert das inFrankreich beheimatete Unterneh -men Kunden weltweit ausGesund heitswesen Lebensmittelund Umwelt darunter die phar-mazeutische und biotechnologi-sche Industrie klinische und bioa-
nalytische Forschungseinrichtun -gen (CROs) und Forschungsinsti -tute
Hochwertige Grundkompo nen -ten fuumlr Antibiotika
Durch seine Marktnaumlhe und FampE-Staumlrke hat ALSACHIM wichtigeisotopenmarkierte Grundkompo -nenten fuumlr Antibiotika entwickeltAlle fuumlhrenden Akteure im Ge -sundheitsbereich arbeiten an The -men wie Antibiotika-ResistenzAntibiotika-Ruumlckstaumlnde im Blutoder Antibiotika-Kombinationen
ALSACHIM hat stabile isotopen-markierte interne Standards fuumlrunterschiedliche Antibiotika-
Familien vorgestellt etwa fuumlrBeta-Lactame CephalosporinCarbapenem oder Penicillin DerUmfang von markierten und un -markierten Antibiotika-Molekuumllenhat sich nun erweitert auf hoch-wertige isotopenmarkierte Analy -sestandards wie Amoxicillin-d4Avibactam-13C5 Cefepim-13Cd3Cefotaxim-13Cd3 Ceftarolin-13Cd3 Ceftazidim-d6 Ceftolo -zan-d2-15N2 Cloxacillin-d5Fluocloxalilin-13C4-15N (Fluclo -xacillin-13C4-15N) Meropenem-d6 oder Tazobactam-13C2-15N2
Hochwertige Grundkomponentenfuumlr die AntibiotikaforschungALSACHIM unterstuumltzt Pharma-Unternehmen und deren FampE von Antibiotika
PRODUKTE
6 SHIMADZU NEWS 22018
D as neue UV-1900-Spektro -photometer verbindet einhochentwickeltes optisches
Doppelstrahlsystem mit der paten -tierten Lo-Ray-Lighreg-Beugungs -gitter-Technologie in einemCzerny-Turner-MonochromatorDiese Technik gewaumlhrleistet gerin-ges Streulicht und hohe photome-trische Reproduzierbarkeit die indieser Geraumlteklasse bisher nichtbekannt war Das UV-1900 isthoumlchst effizient dank der schnell-sten Scan-Funktion von 29000nmmin es dauert nur drei Sekun -
den uumlber alle Wellenlaumlngenberei -che zu messen Aufgrund derSteuerung uumlber das nutzerfreund-liche Farb-Touch-Panel und dieneue LabSolutions UV-Vis-Soft -ware ist das UV-1900 perfektgeeignet die Laborarbeit zu opti-mieren
Hightech bietet bisher nichtdagewesene Geraumltefaumlhigkeiten
Das Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitteraus den High-End-Modellen bie-tet fuumlr das UV-1900 das geringste
UV-1900 Perfekt fuumlr alleAnalyse anfor derungenUV-Vis-Spektroskopie ndash schnell und einfach wie noch nie
Streulicht seiner Klasse (wenigerals 05 bei 198 nm) Die hohephotometrische Reproduzier bar -keit und Genauigkeit bieten einender groumlszligten Linearitaumltsbereiche(Abbildung 2)
Das optische System des UV-1900hat die houmlchste Aufloumlsung seinerKlasse (1 nm) und gewaumlhrleistetdie maximale von den Arzneibuuml -chern vieler Laumlnder verlangteMess genauigkeit Daruumlber hinausermoumlglicht die neue ultra-schnelleScan-Funktion eine genaue Mes -sung mit der erstaunlichen Ge -
schwindigkeit von 29000 nmmindurchzufuumlhren Dies verkuumlrzt dieAnalysedauer erheblich und er -moumlglicht es auch chemische Reak -tionen nachzuverfolgen
Perfekt fuumlr alleAnalyseanforderungen
Uumlber das Farb-Touch-Panel laumlsstsich die Programmoberflaumlche intu -itiv bedienen ndash uumlber Stift oderFingerspitze Auch ohne PC sindalle gaumlngigen Programme verfuumlg-bar bdquoPhotometrieldquo bdquoSpektrumldquobdquoQuantifizierungldquo bdquoKinetikldquobdquoZeitverlaufldquo und bdquoBiomethodeldquozur DNA- und Proteinquan tifi -zierung Die programmeigenen
Pruumlf- und Sicherheitsfunktionenerfuumlllen die Anforderungen ausArzneibuumlchern GLPGMP FDAund andere RechtsvorschriftenDes Weiteren nimmt die Proben -kammer verschiedenstes Zubehoumlrauf wie Ansaugeinheit Tempera -tur steuerung oder Reflexions mess -einsatz
UV-Vis-Spektrophotometer UV-1900
Abbildung 1 Verbesserte Bedienung uumlber Farb-Touch-Panel
000
050
100
150
200
250
300
000 100 200 300
Konzentration (mgml)
Abs
Abbildung 2 Die Eichkurve des UV-1900 (schwarze Linie) ist linearer als der
Kurvenverlauf eines Geraumlts mit 1 Streulicht (rote Linie)
Abbildung 3 Intuitiver
Programmaufbau
PRODUKTE
7SHIMADZU NEWS 22018
Damit eignet sich das UV-1900perfekt fuumlr Applikationen wieNahrungsmittel Pharmaka oderChemie Der gesamte Spektral -bereich laumlsst sich in Sekunden -schnelle scannen Waumlhrend bisherfuumlr Zeitverlauf-Messungen die In -tensitaumlt nur bei einer entscheiden-den Wellenlaumlnge beobachtet wer-den konnte laumlsst sich nun die Aumln -derung des gesamten Absorp tions -spektrums untersuchen
LabSolutions UV-Vis fuumlr erweiterte Moumlglichkeiten
Die neue LabSolutions UV-Vis-Software unterstuumltzt alle Funktio -nen des UV-1900 und verbessertdie Arbeitseffizienz Die eindeuti-ge und einfache Programmge stal -tung ist aus der LabSolutions-Familie bekannt (LabSolutions IRLabSolutions RF) System- undMesskonfiguration fuumlr den Ar -beitsablauf werden durch einfachnachvollziehbare Fenster undselbsterklaumlrende Symbole opti-miert
Verschiedene Programme sinduumlber den LabSolutions Managererreichbar Vom Start an sindbdquoSpektrumldquo bdquoQuantifizierungldquobdquoPhotometrieldquo und bdquoZeitverlaufldquoverfuumlgbar Eine neue spektraleAuswertungsfunktion vereinfachtdie Qualitaumltskontrolle mit einerautomatischen Proben-EvaluationWeitere optionale Programme las-sen sich hinzufuumlgen wie zumBeispiel bdquoFarbanalyseldquo
Multiple Datensaumltze lassen sicheinfach per Einzelklick auf andereFormate wie Batch-Text oderMicrosoft Excel exportierenZudem unterstuumltzt LabSolutionsUV-Vis die Anwender mit bedien-erfreundlichen Funktionen wieEchtzeitanzeige von Konzen tra -tionen oder automatische Bestim -mung von optimalen Parameternzur Peak-Detektion
Die LabSolutions DB und CS-Plattform von Shimadzu stellt dieUumlbereinstimmung mit den ERES-Vorschriften sicher DieseWerkzeuge liefern eine Projekt-Managementfunktion ausgerichtet
Abbildung 5 LabSolutions DB oder CS Projekt-Management
Abbildung 6 Gestaltung und Evaluationsfunktion der neuen LabSolutions UV-Software
Abbildung 4 Kinetische Untersuchung der Agglomeratbildung von Silber-
Nanopartikeln
05
10
300 400 500 600 700 800
Wellenlaumlnge (nm)
Exti
nkti
on (a
u)
auf Aufgaben und SystembetriebDiese Funktionen erlauben Geraumlte-und AnwendermanagementSicherheitsstrategie und Datenver -arbeitung auf der Grundlage vonEinzelprojekten wobei die Effi -zienz von Datenabfragen undManagementaufgaben verbessertwird
Fazit
Das neue UV-1900 setzt einenneuen Maszligstab fuumlr kompakte UV-Vis-Spektrophotometer
Die Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitter-Technologie in diesem Zwei strahl -geraumlt ermoumlglicht ausgezeichnetephotometrische Werte wobei einFarb-Touch-Panel und die Anbin -dung an LabSolutions UV-Viseinen einfachen fortschrittlichen
Arbeitsablauf bieten ndash als Einzel -platzloumlsung oder uumlber PC-Steuer -ung und dabei voll kompatibelmit der UV-Probe-Software
Durch das breite Angebot anMessablaumlufen und die Uumlberein-stimmung mit internationalenRichtlinien und Vorgaben eignetsich das UV-1900 fuumlr zahlreicheAnwendungsfelder
APPLIKATION
8 SHIMADZU NEWS 22018
I n der Herstellung von Arznei -mitteln sind houmlchste Reinheitund sorgfaumlltigster Umgang mit
Substanzen und Wirkstoffen wich -tige Voraussetzungen Dazu zaumlhltbesonders Produktionsresteeffektiv zu entfernen Denn nureine gut gereinigte Anlage verhin-dert die Kontamination und Ver -faumllschung des produzierten Medi -kaments und traumlgt somit zurSicherheit der Patienten bei
1988 kam es zum Beispiel zu ei -nem Ruumlckruf von 200 Mio Doseneines Cholesterinsenkers ndash er warmit Pestiziden verunreinigt Eswird angenommen dass es zueiner Kreuzkontamination kamals Loumlsemittelfaumlsser aus der Pesti -zidherstellung erneut in der Wirk -stoffproduktion genutzt wurdenDer Wirkstoff wurde zur Endfer -tigung an eine weitere Einrichtunggeliefert wo es letztendlich zurVerunreinigung von komplettenArzneimittel-Chargen kam ndash aneinem Standort an dem normaler-weise keine Pestizide hergestelltwerden Der Wirkstoff-Herstellerfuumlhrte zu dieser Zeit weder ausrei-chende Kontrollen durch nochgab es validierte Reinigungspro -zesse
Behoumlrdliche Anforderungen
Die wesentlichen behoumlrdlichenAnforderungen an die Anlagen -reinigung wurden daraufhin imJahr 1993 im bdquoGuide to Inspec -tions ndash Validation of cleaning pro-cesses (793)ldquo der amerikanischenLebensmitteluumlberwachungs- undArzneimittelbehoumlrde FDA klarerbehandelt Hier werden dokumen-tierte Beweise verlangt dass einzugelassenes Reinigungsverfahrenkonsistent aktive pharmazeutischeInhaltsstoffe (API) Prozess ruumlck -staumlnde Reinigungsmittel undmikrobielle Verunreinigungen aufProduktkontaktflaumlchen des Her -stellungs-Equipments auf ein ak -zeptables Niveau fuumlr die Verarbei -tung von Arzneimitteln reduziertBesonders wichtig ist dies bei derProduktion von Wirkstof fen inBatch-Prozessen da hier dieAnla ge fuumlr verschiedene Pro dukteverwendet wird und eine Konta -mi nation der Folgeprodukte zuvermeiden ist
Nachdem eine Charge des Wirk -stoffs in die Weiterverarbeitung
Dies ist eine be sonders einfacheleicht automatisierbare undschnelle Methode
Reinigungsverfahren Clean out of Place
Fuumlr die COP-Reinigung muss dieAnlage auseinander gebaut unddie Komponenten einzeln gerei-nigt werden Diese Vorgehens wei -se ist zeit- und personalintensiverAufgrund der individuellen Reini -gung ist dieses Verfahren nichtstandardisierbar Vorteilhaft sindallerdings die geringeren Anschaf -fungskosten der Anlage und dieMoumlglichkeit der visuellen Begut -achtung
Im Falle der COP-Reinigung wirdder Wischtest (Swab) fuumlr die Be -probung von sichtbaren Ruumlck -staumlnden verwendet (Abbildung 1)Dazu zaumlhlen Uumlberzuumlge KrustenAnbackung in Winkeln und Eckenund besonders schwer loumlslicheSubstanzen Der verwendete Swabkann in einem Loumlsungsmittelextrahiert werden anschlieszligendwird die Extraktionsloumlsung analy-tisch bestimmt Wird Wasser alsLoumlsungsmittel fuumlr die Extraktionverwendet bietet sich fuumlr dieanschlieszligende Analyse die TOC-Analytik an Alternativ kann derSwab auch direkt (bei Verwendungeines kohlenstofffreien Swab) miteinem TOC-Feststoffmodul ver-messen werden
Einsetzbare Analysenmethoden
Um den Erfolg des Reinigungsver -fahrens zu belegen stehen ver-schiedene analytische Methodenzur Verfuumlgung die sich jedoch inEmpfindlichkeit und Spezifitaumltunterscheiden Uumlbliche Methodensind in Tabelle 1 abgebildet
Reinigungsverfahren Clean in Place
Die CIP-Reinigung (clean in place)erfolgt automatisch und ohneZerlegung der Anlage Dafuumlr mussdas System im CIP-Design ausge-ruumlstet sein Dies beinhaltet dieVerwendung von SpuumllkoumlpfenAuffangbehaumlltern die Vermeidungvon Totraumlumen und Recycling-Moumlglichkeiten des Reinigungs -mittels Weil Zeit und Temperatursowie Reinigungsmittel undLoumlsungsmittelverbrauch optimiertsind ist die CIP-Reinigung sehreffektiv Die automatische Reini -gung ermoumlglicht auszligerdem einestandardisierte und dadurch leicht
zu validierende ProzedurIm Falle der CIP-Reini -gung wird die Spuumll fluumls sig -keit des letzten Spuumllgangs(Final Rinse) als Probegenommen und analysiert
geht werden die verwendetenArbeitsmittel gereinigt etwa Reak -toren oder Fermenter so dass dernaumlchste Batch produziert werdenkann Der eigentliche Reini gungs -vorgang ist in der Regel strengfestgelegt und wird an schlieszligendanalytisch uumlberpruumlft und doku-mentiert So wird eine Probe ausder Anlage auf bestimmte Para -meter untersucht Bleibt ein fest-gelegter Grenzwert unterschrittengilt die Anlage als gereinigt undkann erneut eingesetzt werdenDieser Vorgang nennt sich Reini -gungsvalidierung Das verwendeteReinigungsverfahren hat groszligenEinfluss auf die Art der zu nut-zenden Probennahmetechnik
Restlos reinTOC-Analytik fuumlr die Reinigungs -validie rung in der pharmazeutischenIndustrie
Abbildung 1 Shimadzu
Easy Wiper Swab
Abbildung 2 TOC-L mit SSM-5000A
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
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SteBLife ndash A new short-time procedure
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len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull P Starke A Baumlumchen
H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
httpswwwhanser-elibrarycomtoc
mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
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300000
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650000
700000
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1000000
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
(BFR) Stellungnahme Nr 0082010
09122010
[2] EFSA Panel on Contaminants in the
Food Chain (CONTAM) EFSA Journal
2012 10(6) 2704-2889
[3] Austrian Standards Institute OumlNORM
EN 16995 Edition 2017-08-01
[4] M Biedermann K Grob J Chromatogr
A 2012 1255 56-75
[5] M Nestola TC Schmidt J Chromatogr
A 1505 (2017) 69-76
[6] wwwbfrbunddecm343bestimmung-
von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
0
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400000
600000
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1400000
10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
150000
200000
250000
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400000
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500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000
uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
des Mikropartikels und unten dasSpektrum von PMMA
Der Magen eines Tiefseeshrimpsenthielt einen Partikel bestehendaus bdquoPolyethylenldquo der partiell voneiner Mischung aus Organik undAnorganik umhuumlllt war (Abbil -dung 6) Polyethylen ist als Poly -mer von Natur aus sehrleicht mit seiner Dichteunter 1 (Tabelle 1) undschwimmt eigentlich inoberen Gewaumlsser schich tenVermut lich durch Anla ge -rung von kleinen Was ser -tieren und deren Skeletteoder anderen aumluszligeren Ein -fluumlssen ist dieser Partikeldoch bis in die unterenMeerwasser schich ten ge -langt In Abbildung 6 istoben rechts in der Ansichtdes Parti kels der Mess fleckvon 15 x 15 microm zu er ken -nen Es ist eine Trans mis -sions aufnahme eines Par -ti kels von 100 microm derdurch das Glaumltten mit derDia mant zelle verbreitertwurde
Wie in der Abbildungdeutlich zu sehen ist derPartikel mit einer Koronaversehen Die Messungergab dass es sich um
dieser Kranz wiedergegeben wer-den
Fazit ndash Kunststoff als zusaumltz -licher Stressfaktor
Die Ergebnisse zeigen dass dieAuswirkungen von Kunststoff-Verschmutzung den ArktischenOzean sowie die Tiefsee erreichthaben und dass Fische und Am -phipode Kunststoff-Teilchenbegegnen koumlnnen Die Folgen derEinnahme von Plastikpartikelnbleiben unklar
Zusammen mit anderen Faktorenwie dem Klimawandel der zuneh-menden Schifffahrt und der Aus -weitung der Fischerei kann diePlastik-Verschmutzung ein zu -saumltzlicher Stressfaktor des sensi-blen Oumlkosystems der Arktis sein[1]
In der Tiefsee ist zu erwarten dassPlastik einmal am Tiefseebodenangekommen dort auch bleibtDaraus resultiert eine Anreiche -rung am Meeresboden Dies ist einErgebnis das alarmiert Fasern ausdem Magen eines Tieres zu isolie-ren das in 11 km Tiefe lebt zeigt
bereits die Folgen desMikroplas tik problems [3]
Vielen Dank anDr Alan Jamieson Newcastle
University UK und Dr Robert
Keighley Shimadzu UK fuumlr die
Ergebnisse der Amphipoden ana -
lysen Susanne Kuumlhn et al fuumlr
die Ergebnisse der Polardorsch -
analy sen
AutorenSusanne Kuumlhn Wageningen Marine
Research Niederlande
Alan Jamieson New Castle
University Groszligbritannien
Robert Keighley SUK
Groszligbritannien
Marion Egelkraut-Holtus Shimadzu
Europa GmbH Deutschland
einen Kranz aus CaCO3 (Calci um -carbonat) handelt (Ab bildung 7)Auf Grund der klaren Darstel lungwurde da her der Partikel in einerFlaumlchen messung (Screening Map -ping) abgetastet (Abbildung 8) Inder Mapping-Sicht eingestellt aufdie carbonylische Bande vomCaCO3 kann sehr anschaulich
APPLIKATION
4 SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Plastic ingestion by juvenile polar cod
(Boreogadus saida) in the Arctic Ocean
Susanne Kuumlhn Fokje L Schaafsma
Bernike van Werven Hauke Flores
Melanie Bergmann Marion Egelkraut-
Holtus Mine B Tekman Jan A van
Franeker Polar Biology
httpsdoiorg101007s00300-018-
2283-8 2018
[2] National Geographic News August 30
2012
[3] httpsnewsskycomstoryplastic-
pollution-reaches-oceans-deepest-parts-
11127144
Abbildung 5 Analyse der im Polardorsch gefundenen Proben
Abbildung 7 Spektren der Tiefseefloh -
krebs-Proben
Dichte in gcm3 0915 - 0935 094 - 097 087 - 094 118 - 119 1027
Eigenschaft PE-LD PE-HD PE-LLD PMMA Meerwasser (Temperatur ~10 degC Salzgehalt 35 gl)
Tabelle 1 Dichte von Meerwasser Polyethylenen (PE) und Polymethylmetacrylat (PMMA) [Wikipedia]
001020304050607080910
3000
CalciumcarbonatCaCO3
1900 1300 700
Abs
cm-1
Abbildung 8 FTIR-Mapping Tiefseefloh -
krebs
Abbildung 8a Skalierung des FTIR-
Mapping
Abbildung 6 Bild des Partikels mit der CCD-Kamera des
Infrarotmikroskops AIM-9000
AKTUELLES
5SHIMADZU NEWS 22018
A LSACHIM ein Unterneh -men der Shimadzu-Gruppehat ein vollstaumlndiges Spek -
trum stabiler isotopenmarkierterinterner Antibiotika-Standardsvorgestellt um pharmazeutischeIndustrie und Kliniken bei derEntwicklung einer therapeuti-schen Medikamentenuumlberwachung(Therapeutic Drug Monitoring)zu unterstuumltzen Hierzu gehoumlrenspezifisch markierte Verbindungenwie Tazobactam Avibactam oderCeftolozan und Ceftarolin
Als ein weltweiter Marktfuumlhrerfuumlr die Synthese stabiler isotopen-markierter interner Standards(13C 2H 15N) stabiler markierterGrundkomponenten pharmazeu-
tischer Wirkstoffe sogenannterAPI (Active PharmaceuticalIngredients) und Metaboliten fuumlrbioanalytische Untersuchungen istALSACHIM seit 2017 Teil derShimadzu-Gruppe
Die ALSACHIM-Produkte er -gaumlnzen das Shimadzu-Angebot fuumlrden klinischen Markt ndash Komplett -loumlsungen aus Hardware Softwareund Anwendungs-Kits
Seit 13 Jahren beliefert das inFrankreich beheimatete Unterneh -men Kunden weltweit ausGesund heitswesen Lebensmittelund Umwelt darunter die phar-mazeutische und biotechnologi-sche Industrie klinische und bioa-
nalytische Forschungseinrichtun -gen (CROs) und Forschungsinsti -tute
Hochwertige Grundkompo nen -ten fuumlr Antibiotika
Durch seine Marktnaumlhe und FampE-Staumlrke hat ALSACHIM wichtigeisotopenmarkierte Grundkompo -nenten fuumlr Antibiotika entwickeltAlle fuumlhrenden Akteure im Ge -sundheitsbereich arbeiten an The -men wie Antibiotika-ResistenzAntibiotika-Ruumlckstaumlnde im Blutoder Antibiotika-Kombinationen
ALSACHIM hat stabile isotopen-markierte interne Standards fuumlrunterschiedliche Antibiotika-
Familien vorgestellt etwa fuumlrBeta-Lactame CephalosporinCarbapenem oder Penicillin DerUmfang von markierten und un -markierten Antibiotika-Molekuumllenhat sich nun erweitert auf hoch-wertige isotopenmarkierte Analy -sestandards wie Amoxicillin-d4Avibactam-13C5 Cefepim-13Cd3Cefotaxim-13Cd3 Ceftarolin-13Cd3 Ceftazidim-d6 Ceftolo -zan-d2-15N2 Cloxacillin-d5Fluocloxalilin-13C4-15N (Fluclo -xacillin-13C4-15N) Meropenem-d6 oder Tazobactam-13C2-15N2
Hochwertige Grundkomponentenfuumlr die AntibiotikaforschungALSACHIM unterstuumltzt Pharma-Unternehmen und deren FampE von Antibiotika
PRODUKTE
6 SHIMADZU NEWS 22018
D as neue UV-1900-Spektro -photometer verbindet einhochentwickeltes optisches
Doppelstrahlsystem mit der paten -tierten Lo-Ray-Lighreg-Beugungs -gitter-Technologie in einemCzerny-Turner-MonochromatorDiese Technik gewaumlhrleistet gerin-ges Streulicht und hohe photome-trische Reproduzierbarkeit die indieser Geraumlteklasse bisher nichtbekannt war Das UV-1900 isthoumlchst effizient dank der schnell-sten Scan-Funktion von 29000nmmin es dauert nur drei Sekun -
den uumlber alle Wellenlaumlngenberei -che zu messen Aufgrund derSteuerung uumlber das nutzerfreund-liche Farb-Touch-Panel und dieneue LabSolutions UV-Vis-Soft -ware ist das UV-1900 perfektgeeignet die Laborarbeit zu opti-mieren
Hightech bietet bisher nichtdagewesene Geraumltefaumlhigkeiten
Das Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitteraus den High-End-Modellen bie-tet fuumlr das UV-1900 das geringste
UV-1900 Perfekt fuumlr alleAnalyse anfor derungenUV-Vis-Spektroskopie ndash schnell und einfach wie noch nie
Streulicht seiner Klasse (wenigerals 05 bei 198 nm) Die hohephotometrische Reproduzier bar -keit und Genauigkeit bieten einender groumlszligten Linearitaumltsbereiche(Abbildung 2)
Das optische System des UV-1900hat die houmlchste Aufloumlsung seinerKlasse (1 nm) und gewaumlhrleistetdie maximale von den Arzneibuuml -chern vieler Laumlnder verlangteMess genauigkeit Daruumlber hinausermoumlglicht die neue ultra-schnelleScan-Funktion eine genaue Mes -sung mit der erstaunlichen Ge -
schwindigkeit von 29000 nmmindurchzufuumlhren Dies verkuumlrzt dieAnalysedauer erheblich und er -moumlglicht es auch chemische Reak -tionen nachzuverfolgen
Perfekt fuumlr alleAnalyseanforderungen
Uumlber das Farb-Touch-Panel laumlsstsich die Programmoberflaumlche intu -itiv bedienen ndash uumlber Stift oderFingerspitze Auch ohne PC sindalle gaumlngigen Programme verfuumlg-bar bdquoPhotometrieldquo bdquoSpektrumldquobdquoQuantifizierungldquo bdquoKinetikldquobdquoZeitverlaufldquo und bdquoBiomethodeldquozur DNA- und Proteinquan tifi -zierung Die programmeigenen
Pruumlf- und Sicherheitsfunktionenerfuumlllen die Anforderungen ausArzneibuumlchern GLPGMP FDAund andere RechtsvorschriftenDes Weiteren nimmt die Proben -kammer verschiedenstes Zubehoumlrauf wie Ansaugeinheit Tempera -tur steuerung oder Reflexions mess -einsatz
UV-Vis-Spektrophotometer UV-1900
Abbildung 1 Verbesserte Bedienung uumlber Farb-Touch-Panel
000
050
100
150
200
250
300
000 100 200 300
Konzentration (mgml)
Abs
Abbildung 2 Die Eichkurve des UV-1900 (schwarze Linie) ist linearer als der
Kurvenverlauf eines Geraumlts mit 1 Streulicht (rote Linie)
Abbildung 3 Intuitiver
Programmaufbau
PRODUKTE
7SHIMADZU NEWS 22018
Damit eignet sich das UV-1900perfekt fuumlr Applikationen wieNahrungsmittel Pharmaka oderChemie Der gesamte Spektral -bereich laumlsst sich in Sekunden -schnelle scannen Waumlhrend bisherfuumlr Zeitverlauf-Messungen die In -tensitaumlt nur bei einer entscheiden-den Wellenlaumlnge beobachtet wer-den konnte laumlsst sich nun die Aumln -derung des gesamten Absorp tions -spektrums untersuchen
LabSolutions UV-Vis fuumlr erweiterte Moumlglichkeiten
Die neue LabSolutions UV-Vis-Software unterstuumltzt alle Funktio -nen des UV-1900 und verbessertdie Arbeitseffizienz Die eindeuti-ge und einfache Programmge stal -tung ist aus der LabSolutions-Familie bekannt (LabSolutions IRLabSolutions RF) System- undMesskonfiguration fuumlr den Ar -beitsablauf werden durch einfachnachvollziehbare Fenster undselbsterklaumlrende Symbole opti-miert
Verschiedene Programme sinduumlber den LabSolutions Managererreichbar Vom Start an sindbdquoSpektrumldquo bdquoQuantifizierungldquobdquoPhotometrieldquo und bdquoZeitverlaufldquoverfuumlgbar Eine neue spektraleAuswertungsfunktion vereinfachtdie Qualitaumltskontrolle mit einerautomatischen Proben-EvaluationWeitere optionale Programme las-sen sich hinzufuumlgen wie zumBeispiel bdquoFarbanalyseldquo
Multiple Datensaumltze lassen sicheinfach per Einzelklick auf andereFormate wie Batch-Text oderMicrosoft Excel exportierenZudem unterstuumltzt LabSolutionsUV-Vis die Anwender mit bedien-erfreundlichen Funktionen wieEchtzeitanzeige von Konzen tra -tionen oder automatische Bestim -mung von optimalen Parameternzur Peak-Detektion
Die LabSolutions DB und CS-Plattform von Shimadzu stellt dieUumlbereinstimmung mit den ERES-Vorschriften sicher DieseWerkzeuge liefern eine Projekt-Managementfunktion ausgerichtet
Abbildung 5 LabSolutions DB oder CS Projekt-Management
Abbildung 6 Gestaltung und Evaluationsfunktion der neuen LabSolutions UV-Software
Abbildung 4 Kinetische Untersuchung der Agglomeratbildung von Silber-
Nanopartikeln
05
10
300 400 500 600 700 800
Wellenlaumlnge (nm)
Exti
nkti
on (a
u)
auf Aufgaben und SystembetriebDiese Funktionen erlauben Geraumlte-und AnwendermanagementSicherheitsstrategie und Datenver -arbeitung auf der Grundlage vonEinzelprojekten wobei die Effi -zienz von Datenabfragen undManagementaufgaben verbessertwird
Fazit
Das neue UV-1900 setzt einenneuen Maszligstab fuumlr kompakte UV-Vis-Spektrophotometer
Die Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitter-Technologie in diesem Zwei strahl -geraumlt ermoumlglicht ausgezeichnetephotometrische Werte wobei einFarb-Touch-Panel und die Anbin -dung an LabSolutions UV-Viseinen einfachen fortschrittlichen
Arbeitsablauf bieten ndash als Einzel -platzloumlsung oder uumlber PC-Steuer -ung und dabei voll kompatibelmit der UV-Probe-Software
Durch das breite Angebot anMessablaumlufen und die Uumlberein-stimmung mit internationalenRichtlinien und Vorgaben eignetsich das UV-1900 fuumlr zahlreicheAnwendungsfelder
APPLIKATION
8 SHIMADZU NEWS 22018
I n der Herstellung von Arznei -mitteln sind houmlchste Reinheitund sorgfaumlltigster Umgang mit
Substanzen und Wirkstoffen wich -tige Voraussetzungen Dazu zaumlhltbesonders Produktionsresteeffektiv zu entfernen Denn nureine gut gereinigte Anlage verhin-dert die Kontamination und Ver -faumllschung des produzierten Medi -kaments und traumlgt somit zurSicherheit der Patienten bei
1988 kam es zum Beispiel zu ei -nem Ruumlckruf von 200 Mio Doseneines Cholesterinsenkers ndash er warmit Pestiziden verunreinigt Eswird angenommen dass es zueiner Kreuzkontamination kamals Loumlsemittelfaumlsser aus der Pesti -zidherstellung erneut in der Wirk -stoffproduktion genutzt wurdenDer Wirkstoff wurde zur Endfer -tigung an eine weitere Einrichtunggeliefert wo es letztendlich zurVerunreinigung von komplettenArzneimittel-Chargen kam ndash aneinem Standort an dem normaler-weise keine Pestizide hergestelltwerden Der Wirkstoff-Herstellerfuumlhrte zu dieser Zeit weder ausrei-chende Kontrollen durch nochgab es validierte Reinigungspro -zesse
Behoumlrdliche Anforderungen
Die wesentlichen behoumlrdlichenAnforderungen an die Anlagen -reinigung wurden daraufhin imJahr 1993 im bdquoGuide to Inspec -tions ndash Validation of cleaning pro-cesses (793)ldquo der amerikanischenLebensmitteluumlberwachungs- undArzneimittelbehoumlrde FDA klarerbehandelt Hier werden dokumen-tierte Beweise verlangt dass einzugelassenes Reinigungsverfahrenkonsistent aktive pharmazeutischeInhaltsstoffe (API) Prozess ruumlck -staumlnde Reinigungsmittel undmikrobielle Verunreinigungen aufProduktkontaktflaumlchen des Her -stellungs-Equipments auf ein ak -zeptables Niveau fuumlr die Verarbei -tung von Arzneimitteln reduziertBesonders wichtig ist dies bei derProduktion von Wirkstof fen inBatch-Prozessen da hier dieAnla ge fuumlr verschiedene Pro dukteverwendet wird und eine Konta -mi nation der Folgeprodukte zuvermeiden ist
Nachdem eine Charge des Wirk -stoffs in die Weiterverarbeitung
Dies ist eine be sonders einfacheleicht automatisierbare undschnelle Methode
Reinigungsverfahren Clean out of Place
Fuumlr die COP-Reinigung muss dieAnlage auseinander gebaut unddie Komponenten einzeln gerei-nigt werden Diese Vorgehens wei -se ist zeit- und personalintensiverAufgrund der individuellen Reini -gung ist dieses Verfahren nichtstandardisierbar Vorteilhaft sindallerdings die geringeren Anschaf -fungskosten der Anlage und dieMoumlglichkeit der visuellen Begut -achtung
Im Falle der COP-Reinigung wirdder Wischtest (Swab) fuumlr die Be -probung von sichtbaren Ruumlck -staumlnden verwendet (Abbildung 1)Dazu zaumlhlen Uumlberzuumlge KrustenAnbackung in Winkeln und Eckenund besonders schwer loumlslicheSubstanzen Der verwendete Swabkann in einem Loumlsungsmittelextrahiert werden anschlieszligendwird die Extraktionsloumlsung analy-tisch bestimmt Wird Wasser alsLoumlsungsmittel fuumlr die Extraktionverwendet bietet sich fuumlr dieanschlieszligende Analyse die TOC-Analytik an Alternativ kann derSwab auch direkt (bei Verwendungeines kohlenstofffreien Swab) miteinem TOC-Feststoffmodul ver-messen werden
Einsetzbare Analysenmethoden
Um den Erfolg des Reinigungsver -fahrens zu belegen stehen ver-schiedene analytische Methodenzur Verfuumlgung die sich jedoch inEmpfindlichkeit und Spezifitaumltunterscheiden Uumlbliche Methodensind in Tabelle 1 abgebildet
Reinigungsverfahren Clean in Place
Die CIP-Reinigung (clean in place)erfolgt automatisch und ohneZerlegung der Anlage Dafuumlr mussdas System im CIP-Design ausge-ruumlstet sein Dies beinhaltet dieVerwendung von SpuumllkoumlpfenAuffangbehaumlltern die Vermeidungvon Totraumlumen und Recycling-Moumlglichkeiten des Reinigungs -mittels Weil Zeit und Temperatursowie Reinigungsmittel undLoumlsungsmittelverbrauch optimiertsind ist die CIP-Reinigung sehreffektiv Die automatische Reini -gung ermoumlglicht auszligerdem einestandardisierte und dadurch leicht
zu validierende ProzedurIm Falle der CIP-Reini -gung wird die Spuumll fluumls sig -keit des letzten Spuumllgangs(Final Rinse) als Probegenommen und analysiert
geht werden die verwendetenArbeitsmittel gereinigt etwa Reak -toren oder Fermenter so dass dernaumlchste Batch produziert werdenkann Der eigentliche Reini gungs -vorgang ist in der Regel strengfestgelegt und wird an schlieszligendanalytisch uumlberpruumlft und doku-mentiert So wird eine Probe ausder Anlage auf bestimmte Para -meter untersucht Bleibt ein fest-gelegter Grenzwert unterschrittengilt die Anlage als gereinigt undkann erneut eingesetzt werdenDieser Vorgang nennt sich Reini -gungsvalidierung Das verwendeteReinigungsverfahren hat groszligenEinfluss auf die Art der zu nut-zenden Probennahmetechnik
Restlos reinTOC-Analytik fuumlr die Reinigungs -validie rung in der pharmazeutischenIndustrie
Abbildung 1 Shimadzu
Easy Wiper Swab
Abbildung 2 TOC-L mit SSM-5000A
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
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len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
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A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
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mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
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300000
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
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0
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400000
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
150000
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500000
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650000
700000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
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125000
150000
175000
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225000
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275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
200000
250000
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650000
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750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
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40000
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100000
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400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
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10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
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[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
AKTUELLES
5SHIMADZU NEWS 22018
A LSACHIM ein Unterneh -men der Shimadzu-Gruppehat ein vollstaumlndiges Spek -
trum stabiler isotopenmarkierterinterner Antibiotika-Standardsvorgestellt um pharmazeutischeIndustrie und Kliniken bei derEntwicklung einer therapeuti-schen Medikamentenuumlberwachung(Therapeutic Drug Monitoring)zu unterstuumltzen Hierzu gehoumlrenspezifisch markierte Verbindungenwie Tazobactam Avibactam oderCeftolozan und Ceftarolin
Als ein weltweiter Marktfuumlhrerfuumlr die Synthese stabiler isotopen-markierter interner Standards(13C 2H 15N) stabiler markierterGrundkomponenten pharmazeu-
tischer Wirkstoffe sogenannterAPI (Active PharmaceuticalIngredients) und Metaboliten fuumlrbioanalytische Untersuchungen istALSACHIM seit 2017 Teil derShimadzu-Gruppe
Die ALSACHIM-Produkte er -gaumlnzen das Shimadzu-Angebot fuumlrden klinischen Markt ndash Komplett -loumlsungen aus Hardware Softwareund Anwendungs-Kits
Seit 13 Jahren beliefert das inFrankreich beheimatete Unterneh -men Kunden weltweit ausGesund heitswesen Lebensmittelund Umwelt darunter die phar-mazeutische und biotechnologi-sche Industrie klinische und bioa-
nalytische Forschungseinrichtun -gen (CROs) und Forschungsinsti -tute
Hochwertige Grundkompo nen -ten fuumlr Antibiotika
Durch seine Marktnaumlhe und FampE-Staumlrke hat ALSACHIM wichtigeisotopenmarkierte Grundkompo -nenten fuumlr Antibiotika entwickeltAlle fuumlhrenden Akteure im Ge -sundheitsbereich arbeiten an The -men wie Antibiotika-ResistenzAntibiotika-Ruumlckstaumlnde im Blutoder Antibiotika-Kombinationen
ALSACHIM hat stabile isotopen-markierte interne Standards fuumlrunterschiedliche Antibiotika-
Familien vorgestellt etwa fuumlrBeta-Lactame CephalosporinCarbapenem oder Penicillin DerUmfang von markierten und un -markierten Antibiotika-Molekuumllenhat sich nun erweitert auf hoch-wertige isotopenmarkierte Analy -sestandards wie Amoxicillin-d4Avibactam-13C5 Cefepim-13Cd3Cefotaxim-13Cd3 Ceftarolin-13Cd3 Ceftazidim-d6 Ceftolo -zan-d2-15N2 Cloxacillin-d5Fluocloxalilin-13C4-15N (Fluclo -xacillin-13C4-15N) Meropenem-d6 oder Tazobactam-13C2-15N2
Hochwertige Grundkomponentenfuumlr die AntibiotikaforschungALSACHIM unterstuumltzt Pharma-Unternehmen und deren FampE von Antibiotika
PRODUKTE
6 SHIMADZU NEWS 22018
D as neue UV-1900-Spektro -photometer verbindet einhochentwickeltes optisches
Doppelstrahlsystem mit der paten -tierten Lo-Ray-Lighreg-Beugungs -gitter-Technologie in einemCzerny-Turner-MonochromatorDiese Technik gewaumlhrleistet gerin-ges Streulicht und hohe photome-trische Reproduzierbarkeit die indieser Geraumlteklasse bisher nichtbekannt war Das UV-1900 isthoumlchst effizient dank der schnell-sten Scan-Funktion von 29000nmmin es dauert nur drei Sekun -
den uumlber alle Wellenlaumlngenberei -che zu messen Aufgrund derSteuerung uumlber das nutzerfreund-liche Farb-Touch-Panel und dieneue LabSolutions UV-Vis-Soft -ware ist das UV-1900 perfektgeeignet die Laborarbeit zu opti-mieren
Hightech bietet bisher nichtdagewesene Geraumltefaumlhigkeiten
Das Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitteraus den High-End-Modellen bie-tet fuumlr das UV-1900 das geringste
UV-1900 Perfekt fuumlr alleAnalyse anfor derungenUV-Vis-Spektroskopie ndash schnell und einfach wie noch nie
Streulicht seiner Klasse (wenigerals 05 bei 198 nm) Die hohephotometrische Reproduzier bar -keit und Genauigkeit bieten einender groumlszligten Linearitaumltsbereiche(Abbildung 2)
Das optische System des UV-1900hat die houmlchste Aufloumlsung seinerKlasse (1 nm) und gewaumlhrleistetdie maximale von den Arzneibuuml -chern vieler Laumlnder verlangteMess genauigkeit Daruumlber hinausermoumlglicht die neue ultra-schnelleScan-Funktion eine genaue Mes -sung mit der erstaunlichen Ge -
schwindigkeit von 29000 nmmindurchzufuumlhren Dies verkuumlrzt dieAnalysedauer erheblich und er -moumlglicht es auch chemische Reak -tionen nachzuverfolgen
Perfekt fuumlr alleAnalyseanforderungen
Uumlber das Farb-Touch-Panel laumlsstsich die Programmoberflaumlche intu -itiv bedienen ndash uumlber Stift oderFingerspitze Auch ohne PC sindalle gaumlngigen Programme verfuumlg-bar bdquoPhotometrieldquo bdquoSpektrumldquobdquoQuantifizierungldquo bdquoKinetikldquobdquoZeitverlaufldquo und bdquoBiomethodeldquozur DNA- und Proteinquan tifi -zierung Die programmeigenen
Pruumlf- und Sicherheitsfunktionenerfuumlllen die Anforderungen ausArzneibuumlchern GLPGMP FDAund andere RechtsvorschriftenDes Weiteren nimmt die Proben -kammer verschiedenstes Zubehoumlrauf wie Ansaugeinheit Tempera -tur steuerung oder Reflexions mess -einsatz
UV-Vis-Spektrophotometer UV-1900
Abbildung 1 Verbesserte Bedienung uumlber Farb-Touch-Panel
000
050
100
150
200
250
300
000 100 200 300
Konzentration (mgml)
Abs
Abbildung 2 Die Eichkurve des UV-1900 (schwarze Linie) ist linearer als der
Kurvenverlauf eines Geraumlts mit 1 Streulicht (rote Linie)
Abbildung 3 Intuitiver
Programmaufbau
PRODUKTE
7SHIMADZU NEWS 22018
Damit eignet sich das UV-1900perfekt fuumlr Applikationen wieNahrungsmittel Pharmaka oderChemie Der gesamte Spektral -bereich laumlsst sich in Sekunden -schnelle scannen Waumlhrend bisherfuumlr Zeitverlauf-Messungen die In -tensitaumlt nur bei einer entscheiden-den Wellenlaumlnge beobachtet wer-den konnte laumlsst sich nun die Aumln -derung des gesamten Absorp tions -spektrums untersuchen
LabSolutions UV-Vis fuumlr erweiterte Moumlglichkeiten
Die neue LabSolutions UV-Vis-Software unterstuumltzt alle Funktio -nen des UV-1900 und verbessertdie Arbeitseffizienz Die eindeuti-ge und einfache Programmge stal -tung ist aus der LabSolutions-Familie bekannt (LabSolutions IRLabSolutions RF) System- undMesskonfiguration fuumlr den Ar -beitsablauf werden durch einfachnachvollziehbare Fenster undselbsterklaumlrende Symbole opti-miert
Verschiedene Programme sinduumlber den LabSolutions Managererreichbar Vom Start an sindbdquoSpektrumldquo bdquoQuantifizierungldquobdquoPhotometrieldquo und bdquoZeitverlaufldquoverfuumlgbar Eine neue spektraleAuswertungsfunktion vereinfachtdie Qualitaumltskontrolle mit einerautomatischen Proben-EvaluationWeitere optionale Programme las-sen sich hinzufuumlgen wie zumBeispiel bdquoFarbanalyseldquo
Multiple Datensaumltze lassen sicheinfach per Einzelklick auf andereFormate wie Batch-Text oderMicrosoft Excel exportierenZudem unterstuumltzt LabSolutionsUV-Vis die Anwender mit bedien-erfreundlichen Funktionen wieEchtzeitanzeige von Konzen tra -tionen oder automatische Bestim -mung von optimalen Parameternzur Peak-Detektion
Die LabSolutions DB und CS-Plattform von Shimadzu stellt dieUumlbereinstimmung mit den ERES-Vorschriften sicher DieseWerkzeuge liefern eine Projekt-Managementfunktion ausgerichtet
Abbildung 5 LabSolutions DB oder CS Projekt-Management
Abbildung 6 Gestaltung und Evaluationsfunktion der neuen LabSolutions UV-Software
Abbildung 4 Kinetische Untersuchung der Agglomeratbildung von Silber-
Nanopartikeln
05
10
300 400 500 600 700 800
Wellenlaumlnge (nm)
Exti
nkti
on (a
u)
auf Aufgaben und SystembetriebDiese Funktionen erlauben Geraumlte-und AnwendermanagementSicherheitsstrategie und Datenver -arbeitung auf der Grundlage vonEinzelprojekten wobei die Effi -zienz von Datenabfragen undManagementaufgaben verbessertwird
Fazit
Das neue UV-1900 setzt einenneuen Maszligstab fuumlr kompakte UV-Vis-Spektrophotometer
Die Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitter-Technologie in diesem Zwei strahl -geraumlt ermoumlglicht ausgezeichnetephotometrische Werte wobei einFarb-Touch-Panel und die Anbin -dung an LabSolutions UV-Viseinen einfachen fortschrittlichen
Arbeitsablauf bieten ndash als Einzel -platzloumlsung oder uumlber PC-Steuer -ung und dabei voll kompatibelmit der UV-Probe-Software
Durch das breite Angebot anMessablaumlufen und die Uumlberein-stimmung mit internationalenRichtlinien und Vorgaben eignetsich das UV-1900 fuumlr zahlreicheAnwendungsfelder
APPLIKATION
8 SHIMADZU NEWS 22018
I n der Herstellung von Arznei -mitteln sind houmlchste Reinheitund sorgfaumlltigster Umgang mit
Substanzen und Wirkstoffen wich -tige Voraussetzungen Dazu zaumlhltbesonders Produktionsresteeffektiv zu entfernen Denn nureine gut gereinigte Anlage verhin-dert die Kontamination und Ver -faumllschung des produzierten Medi -kaments und traumlgt somit zurSicherheit der Patienten bei
1988 kam es zum Beispiel zu ei -nem Ruumlckruf von 200 Mio Doseneines Cholesterinsenkers ndash er warmit Pestiziden verunreinigt Eswird angenommen dass es zueiner Kreuzkontamination kamals Loumlsemittelfaumlsser aus der Pesti -zidherstellung erneut in der Wirk -stoffproduktion genutzt wurdenDer Wirkstoff wurde zur Endfer -tigung an eine weitere Einrichtunggeliefert wo es letztendlich zurVerunreinigung von komplettenArzneimittel-Chargen kam ndash aneinem Standort an dem normaler-weise keine Pestizide hergestelltwerden Der Wirkstoff-Herstellerfuumlhrte zu dieser Zeit weder ausrei-chende Kontrollen durch nochgab es validierte Reinigungspro -zesse
Behoumlrdliche Anforderungen
Die wesentlichen behoumlrdlichenAnforderungen an die Anlagen -reinigung wurden daraufhin imJahr 1993 im bdquoGuide to Inspec -tions ndash Validation of cleaning pro-cesses (793)ldquo der amerikanischenLebensmitteluumlberwachungs- undArzneimittelbehoumlrde FDA klarerbehandelt Hier werden dokumen-tierte Beweise verlangt dass einzugelassenes Reinigungsverfahrenkonsistent aktive pharmazeutischeInhaltsstoffe (API) Prozess ruumlck -staumlnde Reinigungsmittel undmikrobielle Verunreinigungen aufProduktkontaktflaumlchen des Her -stellungs-Equipments auf ein ak -zeptables Niveau fuumlr die Verarbei -tung von Arzneimitteln reduziertBesonders wichtig ist dies bei derProduktion von Wirkstof fen inBatch-Prozessen da hier dieAnla ge fuumlr verschiedene Pro dukteverwendet wird und eine Konta -mi nation der Folgeprodukte zuvermeiden ist
Nachdem eine Charge des Wirk -stoffs in die Weiterverarbeitung
Dies ist eine be sonders einfacheleicht automatisierbare undschnelle Methode
Reinigungsverfahren Clean out of Place
Fuumlr die COP-Reinigung muss dieAnlage auseinander gebaut unddie Komponenten einzeln gerei-nigt werden Diese Vorgehens wei -se ist zeit- und personalintensiverAufgrund der individuellen Reini -gung ist dieses Verfahren nichtstandardisierbar Vorteilhaft sindallerdings die geringeren Anschaf -fungskosten der Anlage und dieMoumlglichkeit der visuellen Begut -achtung
Im Falle der COP-Reinigung wirdder Wischtest (Swab) fuumlr die Be -probung von sichtbaren Ruumlck -staumlnden verwendet (Abbildung 1)Dazu zaumlhlen Uumlberzuumlge KrustenAnbackung in Winkeln und Eckenund besonders schwer loumlslicheSubstanzen Der verwendete Swabkann in einem Loumlsungsmittelextrahiert werden anschlieszligendwird die Extraktionsloumlsung analy-tisch bestimmt Wird Wasser alsLoumlsungsmittel fuumlr die Extraktionverwendet bietet sich fuumlr dieanschlieszligende Analyse die TOC-Analytik an Alternativ kann derSwab auch direkt (bei Verwendungeines kohlenstofffreien Swab) miteinem TOC-Feststoffmodul ver-messen werden
Einsetzbare Analysenmethoden
Um den Erfolg des Reinigungsver -fahrens zu belegen stehen ver-schiedene analytische Methodenzur Verfuumlgung die sich jedoch inEmpfindlichkeit und Spezifitaumltunterscheiden Uumlbliche Methodensind in Tabelle 1 abgebildet
Reinigungsverfahren Clean in Place
Die CIP-Reinigung (clean in place)erfolgt automatisch und ohneZerlegung der Anlage Dafuumlr mussdas System im CIP-Design ausge-ruumlstet sein Dies beinhaltet dieVerwendung von SpuumllkoumlpfenAuffangbehaumlltern die Vermeidungvon Totraumlumen und Recycling-Moumlglichkeiten des Reinigungs -mittels Weil Zeit und Temperatursowie Reinigungsmittel undLoumlsungsmittelverbrauch optimiertsind ist die CIP-Reinigung sehreffektiv Die automatische Reini -gung ermoumlglicht auszligerdem einestandardisierte und dadurch leicht
zu validierende ProzedurIm Falle der CIP-Reini -gung wird die Spuumll fluumls sig -keit des letzten Spuumllgangs(Final Rinse) als Probegenommen und analysiert
geht werden die verwendetenArbeitsmittel gereinigt etwa Reak -toren oder Fermenter so dass dernaumlchste Batch produziert werdenkann Der eigentliche Reini gungs -vorgang ist in der Regel strengfestgelegt und wird an schlieszligendanalytisch uumlberpruumlft und doku-mentiert So wird eine Probe ausder Anlage auf bestimmte Para -meter untersucht Bleibt ein fest-gelegter Grenzwert unterschrittengilt die Anlage als gereinigt undkann erneut eingesetzt werdenDieser Vorgang nennt sich Reini -gungsvalidierung Das verwendeteReinigungsverfahren hat groszligenEinfluss auf die Art der zu nut-zenden Probennahmetechnik
Restlos reinTOC-Analytik fuumlr die Reinigungs -validie rung in der pharmazeutischenIndustrie
Abbildung 1 Shimadzu
Easy Wiper Swab
Abbildung 2 TOC-L mit SSM-5000A
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
Literatur[1] P Starke A Baumlumchen H Wu H
SteBLife ndash A new short-time procedure
for the calculation of S-N curves and
failure probabilities Mater Test 60
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len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
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H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
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mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
200000
300000
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
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0
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
150000
200000
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350000
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500000
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650000
700000
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800000
uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
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125000
150000
175000
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225000
250000
275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
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600000
650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
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70000
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100000
200000
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400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
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[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
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[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
PRODUKTE
6 SHIMADZU NEWS 22018
D as neue UV-1900-Spektro -photometer verbindet einhochentwickeltes optisches
Doppelstrahlsystem mit der paten -tierten Lo-Ray-Lighreg-Beugungs -gitter-Technologie in einemCzerny-Turner-MonochromatorDiese Technik gewaumlhrleistet gerin-ges Streulicht und hohe photome-trische Reproduzierbarkeit die indieser Geraumlteklasse bisher nichtbekannt war Das UV-1900 isthoumlchst effizient dank der schnell-sten Scan-Funktion von 29000nmmin es dauert nur drei Sekun -
den uumlber alle Wellenlaumlngenberei -che zu messen Aufgrund derSteuerung uumlber das nutzerfreund-liche Farb-Touch-Panel und dieneue LabSolutions UV-Vis-Soft -ware ist das UV-1900 perfektgeeignet die Laborarbeit zu opti-mieren
Hightech bietet bisher nichtdagewesene Geraumltefaumlhigkeiten
Das Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitteraus den High-End-Modellen bie-tet fuumlr das UV-1900 das geringste
UV-1900 Perfekt fuumlr alleAnalyse anfor derungenUV-Vis-Spektroskopie ndash schnell und einfach wie noch nie
Streulicht seiner Klasse (wenigerals 05 bei 198 nm) Die hohephotometrische Reproduzier bar -keit und Genauigkeit bieten einender groumlszligten Linearitaumltsbereiche(Abbildung 2)
Das optische System des UV-1900hat die houmlchste Aufloumlsung seinerKlasse (1 nm) und gewaumlhrleistetdie maximale von den Arzneibuuml -chern vieler Laumlnder verlangteMess genauigkeit Daruumlber hinausermoumlglicht die neue ultra-schnelleScan-Funktion eine genaue Mes -sung mit der erstaunlichen Ge -
schwindigkeit von 29000 nmmindurchzufuumlhren Dies verkuumlrzt dieAnalysedauer erheblich und er -moumlglicht es auch chemische Reak -tionen nachzuverfolgen
Perfekt fuumlr alleAnalyseanforderungen
Uumlber das Farb-Touch-Panel laumlsstsich die Programmoberflaumlche intu -itiv bedienen ndash uumlber Stift oderFingerspitze Auch ohne PC sindalle gaumlngigen Programme verfuumlg-bar bdquoPhotometrieldquo bdquoSpektrumldquobdquoQuantifizierungldquo bdquoKinetikldquobdquoZeitverlaufldquo und bdquoBiomethodeldquozur DNA- und Proteinquan tifi -zierung Die programmeigenen
Pruumlf- und Sicherheitsfunktionenerfuumlllen die Anforderungen ausArzneibuumlchern GLPGMP FDAund andere RechtsvorschriftenDes Weiteren nimmt die Proben -kammer verschiedenstes Zubehoumlrauf wie Ansaugeinheit Tempera -tur steuerung oder Reflexions mess -einsatz
UV-Vis-Spektrophotometer UV-1900
Abbildung 1 Verbesserte Bedienung uumlber Farb-Touch-Panel
000
050
100
150
200
250
300
000 100 200 300
Konzentration (mgml)
Abs
Abbildung 2 Die Eichkurve des UV-1900 (schwarze Linie) ist linearer als der
Kurvenverlauf eines Geraumlts mit 1 Streulicht (rote Linie)
Abbildung 3 Intuitiver
Programmaufbau
PRODUKTE
7SHIMADZU NEWS 22018
Damit eignet sich das UV-1900perfekt fuumlr Applikationen wieNahrungsmittel Pharmaka oderChemie Der gesamte Spektral -bereich laumlsst sich in Sekunden -schnelle scannen Waumlhrend bisherfuumlr Zeitverlauf-Messungen die In -tensitaumlt nur bei einer entscheiden-den Wellenlaumlnge beobachtet wer-den konnte laumlsst sich nun die Aumln -derung des gesamten Absorp tions -spektrums untersuchen
LabSolutions UV-Vis fuumlr erweiterte Moumlglichkeiten
Die neue LabSolutions UV-Vis-Software unterstuumltzt alle Funktio -nen des UV-1900 und verbessertdie Arbeitseffizienz Die eindeuti-ge und einfache Programmge stal -tung ist aus der LabSolutions-Familie bekannt (LabSolutions IRLabSolutions RF) System- undMesskonfiguration fuumlr den Ar -beitsablauf werden durch einfachnachvollziehbare Fenster undselbsterklaumlrende Symbole opti-miert
Verschiedene Programme sinduumlber den LabSolutions Managererreichbar Vom Start an sindbdquoSpektrumldquo bdquoQuantifizierungldquobdquoPhotometrieldquo und bdquoZeitverlaufldquoverfuumlgbar Eine neue spektraleAuswertungsfunktion vereinfachtdie Qualitaumltskontrolle mit einerautomatischen Proben-EvaluationWeitere optionale Programme las-sen sich hinzufuumlgen wie zumBeispiel bdquoFarbanalyseldquo
Multiple Datensaumltze lassen sicheinfach per Einzelklick auf andereFormate wie Batch-Text oderMicrosoft Excel exportierenZudem unterstuumltzt LabSolutionsUV-Vis die Anwender mit bedien-erfreundlichen Funktionen wieEchtzeitanzeige von Konzen tra -tionen oder automatische Bestim -mung von optimalen Parameternzur Peak-Detektion
Die LabSolutions DB und CS-Plattform von Shimadzu stellt dieUumlbereinstimmung mit den ERES-Vorschriften sicher DieseWerkzeuge liefern eine Projekt-Managementfunktion ausgerichtet
Abbildung 5 LabSolutions DB oder CS Projekt-Management
Abbildung 6 Gestaltung und Evaluationsfunktion der neuen LabSolutions UV-Software
Abbildung 4 Kinetische Untersuchung der Agglomeratbildung von Silber-
Nanopartikeln
05
10
300 400 500 600 700 800
Wellenlaumlnge (nm)
Exti
nkti
on (a
u)
auf Aufgaben und SystembetriebDiese Funktionen erlauben Geraumlte-und AnwendermanagementSicherheitsstrategie und Datenver -arbeitung auf der Grundlage vonEinzelprojekten wobei die Effi -zienz von Datenabfragen undManagementaufgaben verbessertwird
Fazit
Das neue UV-1900 setzt einenneuen Maszligstab fuumlr kompakte UV-Vis-Spektrophotometer
Die Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitter-Technologie in diesem Zwei strahl -geraumlt ermoumlglicht ausgezeichnetephotometrische Werte wobei einFarb-Touch-Panel und die Anbin -dung an LabSolutions UV-Viseinen einfachen fortschrittlichen
Arbeitsablauf bieten ndash als Einzel -platzloumlsung oder uumlber PC-Steuer -ung und dabei voll kompatibelmit der UV-Probe-Software
Durch das breite Angebot anMessablaumlufen und die Uumlberein-stimmung mit internationalenRichtlinien und Vorgaben eignetsich das UV-1900 fuumlr zahlreicheAnwendungsfelder
APPLIKATION
8 SHIMADZU NEWS 22018
I n der Herstellung von Arznei -mitteln sind houmlchste Reinheitund sorgfaumlltigster Umgang mit
Substanzen und Wirkstoffen wich -tige Voraussetzungen Dazu zaumlhltbesonders Produktionsresteeffektiv zu entfernen Denn nureine gut gereinigte Anlage verhin-dert die Kontamination und Ver -faumllschung des produzierten Medi -kaments und traumlgt somit zurSicherheit der Patienten bei
1988 kam es zum Beispiel zu ei -nem Ruumlckruf von 200 Mio Doseneines Cholesterinsenkers ndash er warmit Pestiziden verunreinigt Eswird angenommen dass es zueiner Kreuzkontamination kamals Loumlsemittelfaumlsser aus der Pesti -zidherstellung erneut in der Wirk -stoffproduktion genutzt wurdenDer Wirkstoff wurde zur Endfer -tigung an eine weitere Einrichtunggeliefert wo es letztendlich zurVerunreinigung von komplettenArzneimittel-Chargen kam ndash aneinem Standort an dem normaler-weise keine Pestizide hergestelltwerden Der Wirkstoff-Herstellerfuumlhrte zu dieser Zeit weder ausrei-chende Kontrollen durch nochgab es validierte Reinigungspro -zesse
Behoumlrdliche Anforderungen
Die wesentlichen behoumlrdlichenAnforderungen an die Anlagen -reinigung wurden daraufhin imJahr 1993 im bdquoGuide to Inspec -tions ndash Validation of cleaning pro-cesses (793)ldquo der amerikanischenLebensmitteluumlberwachungs- undArzneimittelbehoumlrde FDA klarerbehandelt Hier werden dokumen-tierte Beweise verlangt dass einzugelassenes Reinigungsverfahrenkonsistent aktive pharmazeutischeInhaltsstoffe (API) Prozess ruumlck -staumlnde Reinigungsmittel undmikrobielle Verunreinigungen aufProduktkontaktflaumlchen des Her -stellungs-Equipments auf ein ak -zeptables Niveau fuumlr die Verarbei -tung von Arzneimitteln reduziertBesonders wichtig ist dies bei derProduktion von Wirkstof fen inBatch-Prozessen da hier dieAnla ge fuumlr verschiedene Pro dukteverwendet wird und eine Konta -mi nation der Folgeprodukte zuvermeiden ist
Nachdem eine Charge des Wirk -stoffs in die Weiterverarbeitung
Dies ist eine be sonders einfacheleicht automatisierbare undschnelle Methode
Reinigungsverfahren Clean out of Place
Fuumlr die COP-Reinigung muss dieAnlage auseinander gebaut unddie Komponenten einzeln gerei-nigt werden Diese Vorgehens wei -se ist zeit- und personalintensiverAufgrund der individuellen Reini -gung ist dieses Verfahren nichtstandardisierbar Vorteilhaft sindallerdings die geringeren Anschaf -fungskosten der Anlage und dieMoumlglichkeit der visuellen Begut -achtung
Im Falle der COP-Reinigung wirdder Wischtest (Swab) fuumlr die Be -probung von sichtbaren Ruumlck -staumlnden verwendet (Abbildung 1)Dazu zaumlhlen Uumlberzuumlge KrustenAnbackung in Winkeln und Eckenund besonders schwer loumlslicheSubstanzen Der verwendete Swabkann in einem Loumlsungsmittelextrahiert werden anschlieszligendwird die Extraktionsloumlsung analy-tisch bestimmt Wird Wasser alsLoumlsungsmittel fuumlr die Extraktionverwendet bietet sich fuumlr dieanschlieszligende Analyse die TOC-Analytik an Alternativ kann derSwab auch direkt (bei Verwendungeines kohlenstofffreien Swab) miteinem TOC-Feststoffmodul ver-messen werden
Einsetzbare Analysenmethoden
Um den Erfolg des Reinigungsver -fahrens zu belegen stehen ver-schiedene analytische Methodenzur Verfuumlgung die sich jedoch inEmpfindlichkeit und Spezifitaumltunterscheiden Uumlbliche Methodensind in Tabelle 1 abgebildet
Reinigungsverfahren Clean in Place
Die CIP-Reinigung (clean in place)erfolgt automatisch und ohneZerlegung der Anlage Dafuumlr mussdas System im CIP-Design ausge-ruumlstet sein Dies beinhaltet dieVerwendung von SpuumllkoumlpfenAuffangbehaumlltern die Vermeidungvon Totraumlumen und Recycling-Moumlglichkeiten des Reinigungs -mittels Weil Zeit und Temperatursowie Reinigungsmittel undLoumlsungsmittelverbrauch optimiertsind ist die CIP-Reinigung sehreffektiv Die automatische Reini -gung ermoumlglicht auszligerdem einestandardisierte und dadurch leicht
zu validierende ProzedurIm Falle der CIP-Reini -gung wird die Spuumll fluumls sig -keit des letzten Spuumllgangs(Final Rinse) als Probegenommen und analysiert
geht werden die verwendetenArbeitsmittel gereinigt etwa Reak -toren oder Fermenter so dass dernaumlchste Batch produziert werdenkann Der eigentliche Reini gungs -vorgang ist in der Regel strengfestgelegt und wird an schlieszligendanalytisch uumlberpruumlft und doku-mentiert So wird eine Probe ausder Anlage auf bestimmte Para -meter untersucht Bleibt ein fest-gelegter Grenzwert unterschrittengilt die Anlage als gereinigt undkann erneut eingesetzt werdenDieser Vorgang nennt sich Reini -gungsvalidierung Das verwendeteReinigungsverfahren hat groszligenEinfluss auf die Art der zu nut-zenden Probennahmetechnik
Restlos reinTOC-Analytik fuumlr die Reinigungs -validie rung in der pharmazeutischenIndustrie
Abbildung 1 Shimadzu
Easy Wiper Swab
Abbildung 2 TOC-L mit SSM-5000A
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
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for the calculation of S-N curves and
failure probabilities Mater Test 60
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len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
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A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
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mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
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0
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400000
600000
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
150000
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500000
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650000
700000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
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125000
150000
175000
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225000
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275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
200000
250000
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650000
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750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
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40000
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100000
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400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
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10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
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[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
PRODUKTE
7SHIMADZU NEWS 22018
Damit eignet sich das UV-1900perfekt fuumlr Applikationen wieNahrungsmittel Pharmaka oderChemie Der gesamte Spektral -bereich laumlsst sich in Sekunden -schnelle scannen Waumlhrend bisherfuumlr Zeitverlauf-Messungen die In -tensitaumlt nur bei einer entscheiden-den Wellenlaumlnge beobachtet wer-den konnte laumlsst sich nun die Aumln -derung des gesamten Absorp tions -spektrums untersuchen
LabSolutions UV-Vis fuumlr erweiterte Moumlglichkeiten
Die neue LabSolutions UV-Vis-Software unterstuumltzt alle Funktio -nen des UV-1900 und verbessertdie Arbeitseffizienz Die eindeuti-ge und einfache Programmge stal -tung ist aus der LabSolutions-Familie bekannt (LabSolutions IRLabSolutions RF) System- undMesskonfiguration fuumlr den Ar -beitsablauf werden durch einfachnachvollziehbare Fenster undselbsterklaumlrende Symbole opti-miert
Verschiedene Programme sinduumlber den LabSolutions Managererreichbar Vom Start an sindbdquoSpektrumldquo bdquoQuantifizierungldquobdquoPhotometrieldquo und bdquoZeitverlaufldquoverfuumlgbar Eine neue spektraleAuswertungsfunktion vereinfachtdie Qualitaumltskontrolle mit einerautomatischen Proben-EvaluationWeitere optionale Programme las-sen sich hinzufuumlgen wie zumBeispiel bdquoFarbanalyseldquo
Multiple Datensaumltze lassen sicheinfach per Einzelklick auf andereFormate wie Batch-Text oderMicrosoft Excel exportierenZudem unterstuumltzt LabSolutionsUV-Vis die Anwender mit bedien-erfreundlichen Funktionen wieEchtzeitanzeige von Konzen tra -tionen oder automatische Bestim -mung von optimalen Parameternzur Peak-Detektion
Die LabSolutions DB und CS-Plattform von Shimadzu stellt dieUumlbereinstimmung mit den ERES-Vorschriften sicher DieseWerkzeuge liefern eine Projekt-Managementfunktion ausgerichtet
Abbildung 5 LabSolutions DB oder CS Projekt-Management
Abbildung 6 Gestaltung und Evaluationsfunktion der neuen LabSolutions UV-Software
Abbildung 4 Kinetische Untersuchung der Agglomeratbildung von Silber-
Nanopartikeln
05
10
300 400 500 600 700 800
Wellenlaumlnge (nm)
Exti
nkti
on (a
u)
auf Aufgaben und SystembetriebDiese Funktionen erlauben Geraumlte-und AnwendermanagementSicherheitsstrategie und Datenver -arbeitung auf der Grundlage vonEinzelprojekten wobei die Effi -zienz von Datenabfragen undManagementaufgaben verbessertwird
Fazit
Das neue UV-1900 setzt einenneuen Maszligstab fuumlr kompakte UV-Vis-Spektrophotometer
Die Lo-Ray-Ligh-Beugungsgitter-Technologie in diesem Zwei strahl -geraumlt ermoumlglicht ausgezeichnetephotometrische Werte wobei einFarb-Touch-Panel und die Anbin -dung an LabSolutions UV-Viseinen einfachen fortschrittlichen
Arbeitsablauf bieten ndash als Einzel -platzloumlsung oder uumlber PC-Steuer -ung und dabei voll kompatibelmit der UV-Probe-Software
Durch das breite Angebot anMessablaumlufen und die Uumlberein-stimmung mit internationalenRichtlinien und Vorgaben eignetsich das UV-1900 fuumlr zahlreicheAnwendungsfelder
APPLIKATION
8 SHIMADZU NEWS 22018
I n der Herstellung von Arznei -mitteln sind houmlchste Reinheitund sorgfaumlltigster Umgang mit
Substanzen und Wirkstoffen wich -tige Voraussetzungen Dazu zaumlhltbesonders Produktionsresteeffektiv zu entfernen Denn nureine gut gereinigte Anlage verhin-dert die Kontamination und Ver -faumllschung des produzierten Medi -kaments und traumlgt somit zurSicherheit der Patienten bei
1988 kam es zum Beispiel zu ei -nem Ruumlckruf von 200 Mio Doseneines Cholesterinsenkers ndash er warmit Pestiziden verunreinigt Eswird angenommen dass es zueiner Kreuzkontamination kamals Loumlsemittelfaumlsser aus der Pesti -zidherstellung erneut in der Wirk -stoffproduktion genutzt wurdenDer Wirkstoff wurde zur Endfer -tigung an eine weitere Einrichtunggeliefert wo es letztendlich zurVerunreinigung von komplettenArzneimittel-Chargen kam ndash aneinem Standort an dem normaler-weise keine Pestizide hergestelltwerden Der Wirkstoff-Herstellerfuumlhrte zu dieser Zeit weder ausrei-chende Kontrollen durch nochgab es validierte Reinigungspro -zesse
Behoumlrdliche Anforderungen
Die wesentlichen behoumlrdlichenAnforderungen an die Anlagen -reinigung wurden daraufhin imJahr 1993 im bdquoGuide to Inspec -tions ndash Validation of cleaning pro-cesses (793)ldquo der amerikanischenLebensmitteluumlberwachungs- undArzneimittelbehoumlrde FDA klarerbehandelt Hier werden dokumen-tierte Beweise verlangt dass einzugelassenes Reinigungsverfahrenkonsistent aktive pharmazeutischeInhaltsstoffe (API) Prozess ruumlck -staumlnde Reinigungsmittel undmikrobielle Verunreinigungen aufProduktkontaktflaumlchen des Her -stellungs-Equipments auf ein ak -zeptables Niveau fuumlr die Verarbei -tung von Arzneimitteln reduziertBesonders wichtig ist dies bei derProduktion von Wirkstof fen inBatch-Prozessen da hier dieAnla ge fuumlr verschiedene Pro dukteverwendet wird und eine Konta -mi nation der Folgeprodukte zuvermeiden ist
Nachdem eine Charge des Wirk -stoffs in die Weiterverarbeitung
Dies ist eine be sonders einfacheleicht automatisierbare undschnelle Methode
Reinigungsverfahren Clean out of Place
Fuumlr die COP-Reinigung muss dieAnlage auseinander gebaut unddie Komponenten einzeln gerei-nigt werden Diese Vorgehens wei -se ist zeit- und personalintensiverAufgrund der individuellen Reini -gung ist dieses Verfahren nichtstandardisierbar Vorteilhaft sindallerdings die geringeren Anschaf -fungskosten der Anlage und dieMoumlglichkeit der visuellen Begut -achtung
Im Falle der COP-Reinigung wirdder Wischtest (Swab) fuumlr die Be -probung von sichtbaren Ruumlck -staumlnden verwendet (Abbildung 1)Dazu zaumlhlen Uumlberzuumlge KrustenAnbackung in Winkeln und Eckenund besonders schwer loumlslicheSubstanzen Der verwendete Swabkann in einem Loumlsungsmittelextrahiert werden anschlieszligendwird die Extraktionsloumlsung analy-tisch bestimmt Wird Wasser alsLoumlsungsmittel fuumlr die Extraktionverwendet bietet sich fuumlr dieanschlieszligende Analyse die TOC-Analytik an Alternativ kann derSwab auch direkt (bei Verwendungeines kohlenstofffreien Swab) miteinem TOC-Feststoffmodul ver-messen werden
Einsetzbare Analysenmethoden
Um den Erfolg des Reinigungsver -fahrens zu belegen stehen ver-schiedene analytische Methodenzur Verfuumlgung die sich jedoch inEmpfindlichkeit und Spezifitaumltunterscheiden Uumlbliche Methodensind in Tabelle 1 abgebildet
Reinigungsverfahren Clean in Place
Die CIP-Reinigung (clean in place)erfolgt automatisch und ohneZerlegung der Anlage Dafuumlr mussdas System im CIP-Design ausge-ruumlstet sein Dies beinhaltet dieVerwendung von SpuumllkoumlpfenAuffangbehaumlltern die Vermeidungvon Totraumlumen und Recycling-Moumlglichkeiten des Reinigungs -mittels Weil Zeit und Temperatursowie Reinigungsmittel undLoumlsungsmittelverbrauch optimiertsind ist die CIP-Reinigung sehreffektiv Die automatische Reini -gung ermoumlglicht auszligerdem einestandardisierte und dadurch leicht
zu validierende ProzedurIm Falle der CIP-Reini -gung wird die Spuumll fluumls sig -keit des letzten Spuumllgangs(Final Rinse) als Probegenommen und analysiert
geht werden die verwendetenArbeitsmittel gereinigt etwa Reak -toren oder Fermenter so dass dernaumlchste Batch produziert werdenkann Der eigentliche Reini gungs -vorgang ist in der Regel strengfestgelegt und wird an schlieszligendanalytisch uumlberpruumlft und doku-mentiert So wird eine Probe ausder Anlage auf bestimmte Para -meter untersucht Bleibt ein fest-gelegter Grenzwert unterschrittengilt die Anlage als gereinigt undkann erneut eingesetzt werdenDieser Vorgang nennt sich Reini -gungsvalidierung Das verwendeteReinigungsverfahren hat groszligenEinfluss auf die Art der zu nut-zenden Probennahmetechnik
Restlos reinTOC-Analytik fuumlr die Reinigungs -validie rung in der pharmazeutischenIndustrie
Abbildung 1 Shimadzu
Easy Wiper Swab
Abbildung 2 TOC-L mit SSM-5000A
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
Literatur[1] P Starke A Baumlumchen H Wu H
SteBLife ndash A new short-time procedure
for the calculation of S-N curves and
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(2018) 1-7
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delphia PA American Society for
Testing and Materials (1964) 45-87
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endurance tests Proc ASTM 10 (1910)
625-630
len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull P Starke A Baumlumchen
H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
httpswwwhanser-elibrarycomtoc
mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
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300000
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650000
700000
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
(BFR) Stellungnahme Nr 0082010
09122010
[2] EFSA Panel on Contaminants in the
Food Chain (CONTAM) EFSA Journal
2012 10(6) 2704-2889
[3] Austrian Standards Institute OumlNORM
EN 16995 Edition 2017-08-01
[4] M Biedermann K Grob J Chromatogr
A 2012 1255 56-75
[5] M Nestola TC Schmidt J Chromatogr
A 1505 (2017) 69-76
[6] wwwbfrbunddecm343bestimmung-
von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
0
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400000
600000
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
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75000
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225000
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275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
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800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
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40000
50000
60000
70000
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0
100000
200000
300000
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600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
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10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
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[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
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[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
8 SHIMADZU NEWS 22018
I n der Herstellung von Arznei -mitteln sind houmlchste Reinheitund sorgfaumlltigster Umgang mit
Substanzen und Wirkstoffen wich -tige Voraussetzungen Dazu zaumlhltbesonders Produktionsresteeffektiv zu entfernen Denn nureine gut gereinigte Anlage verhin-dert die Kontamination und Ver -faumllschung des produzierten Medi -kaments und traumlgt somit zurSicherheit der Patienten bei
1988 kam es zum Beispiel zu ei -nem Ruumlckruf von 200 Mio Doseneines Cholesterinsenkers ndash er warmit Pestiziden verunreinigt Eswird angenommen dass es zueiner Kreuzkontamination kamals Loumlsemittelfaumlsser aus der Pesti -zidherstellung erneut in der Wirk -stoffproduktion genutzt wurdenDer Wirkstoff wurde zur Endfer -tigung an eine weitere Einrichtunggeliefert wo es letztendlich zurVerunreinigung von komplettenArzneimittel-Chargen kam ndash aneinem Standort an dem normaler-weise keine Pestizide hergestelltwerden Der Wirkstoff-Herstellerfuumlhrte zu dieser Zeit weder ausrei-chende Kontrollen durch nochgab es validierte Reinigungspro -zesse
Behoumlrdliche Anforderungen
Die wesentlichen behoumlrdlichenAnforderungen an die Anlagen -reinigung wurden daraufhin imJahr 1993 im bdquoGuide to Inspec -tions ndash Validation of cleaning pro-cesses (793)ldquo der amerikanischenLebensmitteluumlberwachungs- undArzneimittelbehoumlrde FDA klarerbehandelt Hier werden dokumen-tierte Beweise verlangt dass einzugelassenes Reinigungsverfahrenkonsistent aktive pharmazeutischeInhaltsstoffe (API) Prozess ruumlck -staumlnde Reinigungsmittel undmikrobielle Verunreinigungen aufProduktkontaktflaumlchen des Her -stellungs-Equipments auf ein ak -zeptables Niveau fuumlr die Verarbei -tung von Arzneimitteln reduziertBesonders wichtig ist dies bei derProduktion von Wirkstof fen inBatch-Prozessen da hier dieAnla ge fuumlr verschiedene Pro dukteverwendet wird und eine Konta -mi nation der Folgeprodukte zuvermeiden ist
Nachdem eine Charge des Wirk -stoffs in die Weiterverarbeitung
Dies ist eine be sonders einfacheleicht automatisierbare undschnelle Methode
Reinigungsverfahren Clean out of Place
Fuumlr die COP-Reinigung muss dieAnlage auseinander gebaut unddie Komponenten einzeln gerei-nigt werden Diese Vorgehens wei -se ist zeit- und personalintensiverAufgrund der individuellen Reini -gung ist dieses Verfahren nichtstandardisierbar Vorteilhaft sindallerdings die geringeren Anschaf -fungskosten der Anlage und dieMoumlglichkeit der visuellen Begut -achtung
Im Falle der COP-Reinigung wirdder Wischtest (Swab) fuumlr die Be -probung von sichtbaren Ruumlck -staumlnden verwendet (Abbildung 1)Dazu zaumlhlen Uumlberzuumlge KrustenAnbackung in Winkeln und Eckenund besonders schwer loumlslicheSubstanzen Der verwendete Swabkann in einem Loumlsungsmittelextrahiert werden anschlieszligendwird die Extraktionsloumlsung analy-tisch bestimmt Wird Wasser alsLoumlsungsmittel fuumlr die Extraktionverwendet bietet sich fuumlr dieanschlieszligende Analyse die TOC-Analytik an Alternativ kann derSwab auch direkt (bei Verwendungeines kohlenstofffreien Swab) miteinem TOC-Feststoffmodul ver-messen werden
Einsetzbare Analysenmethoden
Um den Erfolg des Reinigungsver -fahrens zu belegen stehen ver-schiedene analytische Methodenzur Verfuumlgung die sich jedoch inEmpfindlichkeit und Spezifitaumltunterscheiden Uumlbliche Methodensind in Tabelle 1 abgebildet
Reinigungsverfahren Clean in Place
Die CIP-Reinigung (clean in place)erfolgt automatisch und ohneZerlegung der Anlage Dafuumlr mussdas System im CIP-Design ausge-ruumlstet sein Dies beinhaltet dieVerwendung von SpuumllkoumlpfenAuffangbehaumlltern die Vermeidungvon Totraumlumen und Recycling-Moumlglichkeiten des Reinigungs -mittels Weil Zeit und Temperatursowie Reinigungsmittel undLoumlsungsmittelverbrauch optimiertsind ist die CIP-Reinigung sehreffektiv Die automatische Reini -gung ermoumlglicht auszligerdem einestandardisierte und dadurch leicht
zu validierende ProzedurIm Falle der CIP-Reini -gung wird die Spuumll fluumls sig -keit des letzten Spuumllgangs(Final Rinse) als Probegenommen und analysiert
geht werden die verwendetenArbeitsmittel gereinigt etwa Reak -toren oder Fermenter so dass dernaumlchste Batch produziert werdenkann Der eigentliche Reini gungs -vorgang ist in der Regel strengfestgelegt und wird an schlieszligendanalytisch uumlberpruumlft und doku-mentiert So wird eine Probe ausder Anlage auf bestimmte Para -meter untersucht Bleibt ein fest-gelegter Grenzwert unterschrittengilt die Anlage als gereinigt undkann erneut eingesetzt werdenDieser Vorgang nennt sich Reini -gungsvalidierung Das verwendeteReinigungsverfahren hat groszligenEinfluss auf die Art der zu nut-zenden Probennahmetechnik
Restlos reinTOC-Analytik fuumlr die Reinigungs -validie rung in der pharmazeutischenIndustrie
Abbildung 1 Shimadzu
Easy Wiper Swab
Abbildung 2 TOC-L mit SSM-5000A
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
Literatur[1] P Starke A Baumlumchen H Wu H
SteBLife ndash A new short-time procedure
for the calculation of S-N curves and
failure probabilities Mater Test 60
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Evaluation of Fatigue Phenomena Using
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625-630
len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull P Starke A Baumlumchen
H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
httpswwwhanser-elibrarycomtoc
mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
200000
300000
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
(BFR) Stellungnahme Nr 0082010
09122010
[2] EFSA Panel on Contaminants in the
Food Chain (CONTAM) EFSA Journal
2012 10(6) 2704-2889
[3] Austrian Standards Institute OumlNORM
EN 16995 Edition 2017-08-01
[4] M Biedermann K Grob J Chromatogr
A 2012 1255 56-75
[5] M Nestola TC Schmidt J Chromatogr
A 1505 (2017) 69-76
[6] wwwbfrbunddecm343bestimmung-
von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
0
200000
400000
600000
800000
1000000
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10 30 50 70 90 110 130 150 170
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1200000
1400000
10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
150000
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250000
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450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000
uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
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000
000
000
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044
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Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
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125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
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650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
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600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
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itaumlt
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]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
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0
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e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
9SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull SCA-130-202
TOC-Bestimmung in
der Reinigungsvali-
dierung Final Rinse File bdquo202_Reini
gungsvalidierung_Final_rinse_12Ipdfldquo
bull SCA-130-203 TOC-Bestimmung in der
Reinigungsvalidierung Swab Methode
File bdquo203_Reinigungsvalidierung_
Swab_methode_12Ipdfldquo
Mittels spezifischer Methodenwie HPLC oder GC koumlnnenWirkstoffe und Reinigungsmittelgezielt nachgewiesen werden Beimanchen chemischen Reinigungs -verfahren kann es jedoch vorkom-men dass anfaumlnglich vorhandeneKomponenten aufgrund von Zer -setzungsreaktionen nicht mehrdetektiert werden koumlnnen Wer -den zusaumltzlich Saumluren oder Lau -gen als Reinigungsmittel einge-setzt so werden zum Nachweisoft die unspezifischen ParameterpH oder Leitfaumlhigkeit verwendetDiese ermoumlglichen es jedoch nichtWirk- und Hilfsstoffe zu erfassen
Um schnell eine Aussage zu tref-fen ob die Konzentration vonWirkstoffen sowie Ruumlckstaumlndenvon Reinigungsmitteln und Hilfs -stoffen nach der Reinigung geringgenug ist bietet sich die Ermitt -lung des Summenparameters TOCan
TOC-Analytik in derReinigungsvalidierung
Die TOC-Analytik (Total Organ -ic Carbon = gesamter organischerKohlenstoff) erfasst in einer Ana -lyse den gesamten Kohlenstoff ausorganischen Verbindungen undeignet sich daher besonders dieVerunreinigung durch organischeKomponenten zu bestimmenDabei wird der Kohlenstoffanteilder Probe zu CO2 oxidiert undmit einem NDIR-Detektor (nicht
dispersiver IR-Detektor) analy-siert
Der TOC-Wert spiegelt die gesam-te organische Verunreinigungdurch das Vorprodukt die einge-setzten Hilfsmittel und die ver-bleibenden Reinigungsmittelwider Waumlssrige Proben (FinalRinse oder in Reinstwasser eluier-te Swabs) lassen sich somit schnellund einfach analysieren (Analysen -zeit ca 4 min)
Voraussetzung ist eine gute Was -ser loumlslichkeit der zu untersuchen-den Substanzen Bei nicht wasser-loumlslichen Substanzen bietet sichdie direkte Verbrennung der koh-lenstofffreien Swabs an In Tabelle2 sind beispielhaft Wiederfindungs -raten verschiedener wasserloumlsli-cher und -unloumlslicher Substanzenbei den erwaumlhnten Beprobungs -arten aufgefuumlhrt
Zwei Methoden ein Geraumlt
In der Praxis der Reinigungs-vali dierung wird zumeist eineMischung aus Swab-Methode undFinal-Rinse-Verfahren angewen-det So kann die gesamte Anlagesowie zusaumltzlich spezielle kriti-sche Stellen mit houmlchster Empfind -lichkeit untersucht werden Spuumll -waumlsser und Swab-Proben sowohlextrahiert als auch mittels direkterVerbrennung koumlnnen mit einemeinzigen TOC-Analysator unter-sucht werden
Moderne Analysatoren wie die derTOC-L Serie von Shimadzu uumlber-nehmen die Vorbereitung fluumlssigerProben automatisch (Ansaumluernund Ausgasen) Bei hohen Proben -aufkommen kann dies bereits imAutosampler durchgefuumlhrt wer-den um Zeit zu sparen
Die Systeme arbeiten mit einemhocheffektiven Platin-Katalysatorbei einer Verbrennungstemperaturvon 680 degC Eine spezielle Sprit -zeneinheit ermoumlglicht die Probenautomatisch zu verduumlnnen wennder Kalibrierbereich uumlberschrittenwird Auch Standards werden au -tomatisch verduumlnnt um Kalibrier -kurven in aumlquidistanten Konzen -trationsabstaumlnden zu erstellen
Zur direkten Verbrennung vonWischproben wird der Analysatormit dem Feststoffmodul SSM-5000A kombiniert (Abbildung 2)Hier werden Swabs direkt in einerSauerstoffumgebung bei 900 degCmit einem Katalysator verbranntDie Quantifizierung des Verbren -nungsprodukts CO2 ermoumlglicht
schlieszliglich die Bestimmung desTOC
Fazit
In der pharmazeutischen Industriewerden verschiedene Reinigungs -ver fahren eingesetzt etwa Cleanin Place oder Clean out of Placederen Validierung an bestimmteTechniken gebunden ist DieTOC-Analytik eignet sich beson-ders die Verunreinigung durchorganische Komponenten zubestimmen Das geschieht mit derFinal-Rinse-Methode oder demSwab-Verfahren mit ihren eigenenVor- und Nachteilen In der Praxisder Reinigungsvalidierung werdenbeide daher auch kombiniert an ge -wendet Mit den Systemen derTOC-L Serie laumlsst sich die Reini -gung von Produktionsanlagen inder pharmazeutischen Industriemittels beider Verfahren schnellund leicht analytisch dokumentie-ren
Tabelle 1 Analysenmethoden
Tabelle 2 Wiederfindungsraten bei verschiedenen Substanzen und Probenahmearten
TOC
pH
Leitfaumlhigkeit
UV-VIS-
Spektroskopie
Chromatographie
Nein
Nein
Nein
Ja
x
x
Wellenlaumlngenabhaumlngig
x
x
x
x
Methode Spezifisch Nachweisbare Komponenten
Wirkstoffe Reinigungsmittel
Tranexamsaumlure
Coffein wasserfrei
Propyphenazon
Nifedipin
Gentamicin Salbe
Betamethason Salbe
loumlslich
loumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
unloumlslich
1050
1080
1090
1070
44
152
1070
1090
922
899
17
75
1010
1000
1050
1060
1000
1040
Substanzname Wasserloumlslichkeit Wiederfindungsraten
Rinse Swab eluiert Swab direkt
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
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SteBLife ndash A new short-time procedure
for the calculation of S-N curves and
failure probabilities Mater Test 60
(2018) 1-7
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[5] OH Basquin The exponential law on
endurance tests Proc ASTM 10 (1910)
625-630
len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
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bull P Starke A Baumlumchen
H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
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mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
200000
300000
400000
500000
650000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
(BFR) Stellungnahme Nr 0082010
09122010
[2] EFSA Panel on Contaminants in the
Food Chain (CONTAM) EFSA Journal
2012 10(6) 2704-2889
[3] Austrian Standards Institute OumlNORM
EN 16995 Edition 2017-08-01
[4] M Biedermann K Grob J Chromatogr
A 2012 1255 56-75
[5] M Nestola TC Schmidt J Chromatogr
A 1505 (2017) 69-76
[6] wwwbfrbunddecm343bestimmung-
von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
0
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a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
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15
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(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
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[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
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020
014
031
014
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041
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014
012
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3367
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013
016
016
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013
016
016
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000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
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comsitesssi
shimadzucomfiles
ProductsliteratureGCMSC146-
E349pdf
APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
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[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
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Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
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05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
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000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
D er Zugang zu zuverlaumlssigenErmuumldungsdaten ist eineGrundvoraussetzung fuumlr
die Auslegung hochbeanspruchterBauteile Im Folgenden wird ge -zeigt wie die Potenziale zerstouml-rungsfreier und zerstoumlrender Pruumlf -verfahren genutzt werden koumlnnenum einen signifikanten Informa -tionsgewinn bezuumlglich des Ermuuml -dungsverhaltens zu erzielen waumlh-rend gleichzeitig Versuchsaufwandund -kosten zuruumlckgehen
SteBLife ist ein neues Kurzzeit ver -fahren zur Lebensdauerbe rech -nung zyklisch beanspruchterWerk stoffe welches das nichtli-neare elastisch-plastische Werk -stoffverhalten beruumlcksichtigt Eswurde am Lehrstuhl fuumlr Zerstouml -rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -sicherung der Universitaumlt desSaarlandes entwickelt Die Anzahlder erforderlichen Ermuumldungsver -suche um eine vollstaumlndige Woumlh -ler kurve zu ermitteln kann durchden Einsatz einer stufenfoumlrmigenProbe auf einige wenige Versuchereduziert werden Dies verbessertdie Effizienz signifikant im Ver -gleich zur konventionellen Vorge -hensweise bei der Ermittlung vonWoumlhlerkurven bei der ca 15 Er -muumldungsversuche erforderlichsind Nachfolgend wird dasSteBLife-Verfahren am Beispieleines normalisierten C45E-Stahls(SAE 1045) vorgestellt
Versuchsaufbau
Spannungskontrollierte Einstufen -versuche (Constant Amplitude
schied zwischen dem oberen undunteren Spannzeug waumlhrend desVersuchs auf weniger als 1 K redu -ziert [1]
Ergebnisse
Fuumlr die Temperaturmessungenwurden fuumlnf Mess- und zweiReferenzfelder mit einer Groumlszligevon jeweils 5 x 5 Pixeln entlangder Probe in der Software derInfrarotkamera definiert eine injeder Messstrecke und zwei anden Einspannschaumlften
Jede Pruumlfstrecke hat einen zylin-drischen Querschnitt mit gleichemVolumen Der Uumlbergang zwischen
des Versuchs an der Probenober -flaumlche entlang der Messstrecke(n)mittels einer Infrarotkamera er -fasst T steht in direktem Zu sam -menhang mit verformungsindu-zierten Veraumlnderungen der Mikro -struktur im verformten Werkstoff -volumen und kann zur Ermittlungder Schaumldigungsentwicklung ge -nutzt werden Der Versuchsauf -bau ist in Abbildung 1 dargestellt[1 2]
Um die mechanischen ShimadzuStandard-Spannzeuge zu thermo-statisieren wurde ein Kuumlhlsystemauf Basis eines Peltier-Elementgekuumlhlten Wasserkreislaufs ent-wickelt das den Temperatur unter -
Tests CATs) wurden an einemservohydraulischen PruumlfsystemTyp EHF-L des UnternehmensShimadzu (Maximallast 21 kNzyklisch25 kN quasistatisch) miteiner Frequenz von f = 5 Hzeiner sinusfoumlrmigen Last-Zeit-Funktion und einem Lastver haumllt -nis von R = -1 bei Raumtempe -ratur an C45E Proben durchge-fuumlhrt
Die Proben wurden bis zum Pro -benversagen oder maximal bis zueiner Grenzlastspielzahl von 2 x106 beansprucht Um das Ermuuml -dungsverhalten zu charakterisie-ren wurde die Temperaturaumlnde -rung T kontinuierlich waumlhrend
10 SHIMADZU NEWS 22018
SteBLife ndash neues Kurzzeit ver fahrenzur Lebensdauer berechnung von Werkstoffen Proben und Bau -teilenSteBLife reduziert den Versuchsaufwand zur Ermittlung von Ermuumldungsdaten umbis zu 95 unter Nutzung eines servohydraulischen Pruumlfsystems von Shimadzu
Abbildung 1 Versuchsaufbau
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
Literatur[1] P Starke A Baumlumchen H Wu H
SteBLife ndash A new short-time procedure
for the calculation of S-N curves and
failure probabilities Mater Test 60
(2018) 1-7
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Evaluation of Fatigue Phenomena Using
Non-Destructive Testing Methods Adv
Mater Proc THERMEC 2016 (2016)
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[5] OH Basquin The exponential law on
endurance tests Proc ASTM 10 (1910)
625-630
len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull P Starke A Baumlumchen
H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
httpswwwhanser-elibrarycomtoc
mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
(BFR) Stellungnahme Nr 0082010
09122010
[2] EFSA Panel on Contaminants in the
Food Chain (CONTAM) EFSA Journal
2012 10(6) 2704-2889
[3] Austrian Standards Institute OumlNORM
EN 16995 Edition 2017-08-01
[4] M Biedermann K Grob J Chromatogr
A 2012 1255 56-75
[5] M Nestola TC Schmidt J Chromatogr
A 1505 (2017) 69-76
[6] wwwbfrbunddecm343bestimmung-
von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
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200000
400000
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
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650000
700000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
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000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
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000
041
000
054
000
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052
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014
012
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109
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000
16
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053
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000
000
073
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043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
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044
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000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
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75000
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125000
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225000
250000
275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
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500000
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650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
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400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
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e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
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Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
11SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
den Pruumlfstrecken wird durch ei nenRadius mit r = 4 mm realisiert waszu einer milden Kerbe und einerdamit verbundenen Spannungs -kon zentration fuumlhrt die in derBerechnung beruumlcksichtigt wer-den muss Fuumlr homogene Werk -stoffe ist nur ein Versuch zur Er -mittlung einer Trendwoumlhler kurveerforderlich Hierfuumlr wirdSteBLifestc (s single test tc trendcurve) eingesetzt
Bei inhomogenen Werkstoffensind Streubaumlnder fuumlr unterschied-liche Ausfallwahrscheinlichkeitenals ergaumlnzende Information fuumlr dieBauteilauslegung von technischerBedeutung Mit SteBLife msb (mmultiple tests sb scatter bands)wird dieser Anforderung Rech -nung getragen indem insgesamtfuumlnf Versuche bei der gleichenBeanspruchungsamplitude durch-gefuumlhrt und die Versuchs ergebnis -se mittels einer Gauszlig schen Vertei -lung ausgewertet werden [3]
Fuumlr die SteBLifemsb-Berechnungin Abbildung 3 wurden insgesamtfuumlnf Proben zyklisch mit einemaxialen sinusfoumlrmigen Kraftverlaufund einer Kraftamplitude von Fa= 9170 kN (R = -1) auf dem ser-vohydraulischen Pruumlfsystem bean-sprucht Aufgrund der Symmetrieder Probengeometrie kann eineWechselverformungskurve fuumlr denDurchmesser 6 (T1) und jeweilszwei fuumlr die Durchmesser 62(T2) und 64 mm (T3) bei loka-len Spannungsamplituden von 360(T1) 337 (T2ou) bzw 318 MPa(T3ou) aufgenommen werdenDie fuumlnf temperaturbasiertenWechselverformungskurven sindfuumlr einen SteBLife-Versuch inAbbildung 2a dargestellt
AutorenDr-Ing Peter Starke Haoran Wu M Sc
Prof Dr-Ing Christian Boller Lehrstuhl fuumlr
Zerstouml rungsfreie Pruumlfung und Qualitaumlts -
sicherung Universitaumlt des Saar landes
wwwuni-saarlanddelehrstuhlboller
html
Mirnes Hasanbasic Shimadzu Europa GmbH
Literatur[1] P Starke A Baumlumchen H Wu H
SteBLife ndash A new short-time procedure
for the calculation of S-N curves and
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Evaluation of Fatigue Phenomena Using
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Testing and Materials (1964) 45-87
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endurance tests Proc ASTM 10 (1910)
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len Ermuumldungsproben Abbildung3 unterstreicht eindrucksvoll dassdie herkoumlmmlich ermitteltenLebensdauern durch die auf Basisvon SteBLifemsb berechnetenStreubaumlnder zuverlaumlssig beschrie-ben werden koumlnnen
Fazit
Im Rahmen der neuen Lebens -dauer berechnungsmethodeSteBLife wird eine gestufte Ermuuml -dungsprobe mit fuumlnf Pruumlf streckeneingesetzt mit der sich eine voll-staumlndige Woumlhlerkurve ermittelnlaumlsst Zudem ermoumlglicht der Ein -satz zerstoumlrungsfreier Pruumlfverfah -ren wie bspw der Thermografiedass die Werkstoff reaktion lokalin jeder Pruumlfstrecke erfasst werdenkann Hierdurch kann der Auf -wand hinsichtlich der experimen-tellen Ermittlung von Woumlhlerkur -ven um mehr als 90 reduziertwerden und bietet somit die Moumlg -lichkeit mehr ermuumldungsrelevanteParameter in Woumlhler-Daten zuberuumlcksichtigen
Mit SteBLifemsb koumlnnen Streu baumln -der fuumlr unterschiedliche Aus fall -wahrscheinlichkeiten berechnetund dabei die Anzahl der erforder-lichen Ermuumldungsversuche auflediglich vier bis fuumlnf Versuchereduziert werden Bei SteBLifestckoumlnnen Trendwoumlhlerkurven (ohneStreubaumlnder) sogar nach nur einemeinzigen Versuch berechnet wer-den wodurch sich der Ver suchs -aufwand um ca 95 reduziertwenn man zugrunde legt dass beider konventionellen Vor gehens -weise ca 15 Ermuuml dungs versuchedurchgefuumlhrt werden muumlssen
Das Probenversagen trat bei NB =52320 Zyklen auf was mit kon-ventionell durchgefuumlhrten Einstu -fenversuchen vergleichbar ist DieWechselverformungskurven derSteBLife-Versuche liefern dieDatenbasis fuumlr den a-T-Zusam -menhang Als Eingangsgroumlszlige fuumlrSteBLifemsb werden hierfuumlr dieT-Werte bei NB2 entnommenund in Form von a-T-Kurven(Abbildung 2b) aufgetragen
Zur Ermittlung der kurvenbe-schreibenden Parameter fuumlr einenWoumlhler-Datensatz wird im Folgen -den eine Kombination ausMorrow- [4] und Basquin-Glei -chung genutzt [5]
Gemaumlszlig der SteBLifemsb-Vorge -hensweise wurden die Ergebnisseder fuumlnf durchgefuumlhrten Einstu -fenversuche hinsichtlich ihrerLebensdauer sowie ihrer a-NB-Beziehung im LCF-HCF-Bereichanalysiert NB sowie die a-NB-Beziehung zeigen eine Streuungdie der Inhomogenitaumlt des Mate -rials zugeordnet werden kann Fuumlrunterschiedliche Ausfallwahr -scheinlichkeiten (Pf) koumlnnen nach-folgend aus der Gauszlig-Vertei lungzugehoumlrige Lebensdauern berech-net werden
In dem vorliegenden Beispiel wur-den Pf = 5 50 und 95 fuumlr dieErmittlung der Streubaumlnder ge -waumlhlt allerdings koumlnnen auchStreubaumlnder fuumlr andere Ausfall -wahrscheinlichkeiten berechnetwerden Die Ergebnisse derLebensdauerberechnung sind inAbbildung 3 dargestellt zusam-men mit den Lebensdauern von elfkonventionell durchgefuumlhrten Ein -stufenversuchen mit konventionel-
Abbildung 2 a) Wechselverformungskurven auf der Basis der Temperaturaumlnderung fuumlr
die stufenfoumlrmige Probegeometrie b) Spannungsamplituden-Temperatur-Kurve fuumlr einen
SteBLife-Versuch mit a = 360 MPa (bezogen auf 6 mm) fuumlr einen normalisierten C45E
370
360
350
340
330
320
310
300
20
25
15
15
5
0103 104 105 0 5 10 15 20
oslash3oslash2oslash1
a = 258 middot T011
a = 360 MPaFa = 9170 kN
T1
Ti Werte bei Nf 2
SAE 1045C45E
Lastwechselzahl Temperaturaumlnderung in K
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Tem
pera
turauml
nder
ung
in K
a b
T2o
T2u
T3o
T3u
Abbildung 3 Konventionell ermittelte Woumlhler-Daten und SteBLifemsb-Kurve mit
berechneten Streubaumlndern fuumlr unterschiedliche Ausfallwahrscheinlichkeiten aus fuumlnf
SteBLife-Versuchen fuumlr einen normalisierten C45E
400
420
380
360
340
300
320
104103 105 106
oslash3
oslash2
oslash1
a = 5 a = 743 middot Nf-00721
a = 50 a = 756 middot Nf-00719
a = 95 a = 762 middot Nf-00712
konventionelle SN-Kurvea = 751 middot Nf
-00711
SteBLifemsb-Kurven fuumlr verchiedeneAusfallwahrscheinlichkeiten (in )
SAE 1045C45E
Bruchlastspielzahl
Span
nung
sam
plit
ude
in M
Pa
Weitere Informationen
zu diesem Beitrag
bull P Starke A Baumlumchen
H Wu H SteBLife ndash
A new short-time
procedure for the calculation of S-N
curves and failure probabilities Mater
Test 60 (2018) 1-7
httpswwwhanser-elibrarycomtoc
mp602
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
500000
750000
1000000
1250000
1500000
1750000
2000000
2250000
2500000
uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155
[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
100000
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300000
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650000
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60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
(BFR) Stellungnahme Nr 0082010
09122010
[2] EFSA Panel on Contaminants in the
Food Chain (CONTAM) EFSA Journal
2012 10(6) 2704-2889
[3] Austrian Standards Institute OumlNORM
EN 16995 Edition 2017-08-01
[4] M Biedermann K Grob J Chromatogr
A 2012 1255 56-75
[5] M Nestola TC Schmidt J Chromatogr
A 1505 (2017) 69-76
[6] wwwbfrbunddecm343bestimmung-
von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
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400000
600000
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
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650000
700000
750000
800000
uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
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[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
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[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
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Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
FUumlR SIE GELESEN
M ineraloumllruumlckstaumlnde in Le -bensmitteln standen inden letzten Jahren im
oumlffentlichen Interesse Ob ReisNudeln Olivenoumll oder Schoko -lade ndash es gibt zahlreiche Beispielefuumlr Mineraloumllverunreinigungen inLebensmitteln Derzeit besteht dieHerausforderung in der flaumlchen-deckenden Praumlsenz von Mineral -oumllen in Rohstoffen bis hin zumEndprodukt Zudem gibt es einInformationsdefizit hinsichtlichRezeptur Auswirkungen auf dieGesundheit Analyse und gesetzli-chen Grenzwerten
Um von vorne zu beginnen Mi ne -raloumllkohlenwasserstoffe (MOH)werden in die zwei Gruppen dergesaumlttigten (MOSH) und aromati-schen (MOAH) Mineraloumllkohlen -wasserstoffe unterteilt Die MOSHFraktion besteht aus verzweigtenund unverzweigten offenen alsParaffine bezeichneten Kohlen -
se ist aufgrund der wirklich kom-plexen Zusammensetzung ausungeloumlsten und nicht identifizier-ten Verbindungen eine groszligeHerausforderung Als Methodeder Wahl wird eine Online-Kopp lung von HPLC-GC-FIDeingesetzt [4]
Das Konzept dieser Methodeberuht auf der Trennung desMOSH- und MOAH-Anteils mitHilfe der Normalphasen-HPLCeiner High-Volume-Injektion (450 microL pro Fraktion) auf einenZweisaumlulen-GC zur Gewinnungvon Empfindlichkeit einer weite-ren Trennung der zwei Fraktionen(zB zur Identifikation von Inter -ferenzen) und einer Detektionmittels zwei Flammenionisations -detektoren (FID) die als universel-le Detektoren eine nahezu identi-sche Response fuumlr die Verbindun -gen von Interesse liefert So ergibtsich ein vollautomatisches ge -schlossenes System ohne die Ge -fahr einer moumlglichen Probenver -un reinigung im Verlauf des Trenn-und Messprozesses Um die Elu -tion von der LC und den Transferzur GC sowie die Quantifizierungzu kontrollieren wird vor derProbenanalyse ein Mix aus neuninternen Standards zugefuumlgt
Wegen der komplexen Lebens mit -telmatrix kann eine Probenaufbe -reitung und -analyse verzwicktsein Trockene Nahrungsmittelwie Reis Nudeln oder Gewuumlrzewerden homogenisiert und mitHexanEthanol extrahiert Der
einem gesaumlttigten Ring Sie koumln-nen sich im menschlichen Orga -nismus anreichern und verursa-chen Granulome
Die MOAH Fraktion besteht ausaromatischen Stoffklassen diestark alkyliert sein koumlnnen und 1-4 Ringe besitzen Sie machen biszu 15 - 30 des gesamten Mineral -oumllanteils aus und enthalten poten-ziell mutagene und karzinogeneStoffe [1] Daher sind die ermittel-ten Werte von Mineraloumllkohlen -wasserstoffen in Lebensmitteln(Tabelle 1) nicht akzeptabel
Eine MOH-Analyse ist einegroszlige Herausforderung
Es gibt derzeit keine EU-Vor -schriften und keine zugelasseneAnalysemethode fuumlr Mineraloumll -ruumlckstaumlnde (ausgenommen fuumlrSpeiseoumll [3]) doch MOSH-Kon -zentrationen bis zu 2 mgkg undMOAH-Werte unterhalb von 05 mgkg werden als akzeptabelangesehen [1] Eine MOH-Ana ly -
was serstoffketten und zyklischenals Naphthene bezeichneten Koh -lenwasserstoffen mit mindestens
12 SHIMADZU NEWS 22018
Mineraloumllruumlckstaumlnde inLebensmittelnMOSH- und MOAH-Bestimmung mit LC-GC-Online-Verfahrenund Comprehensive Chromatographie
Abbildung 2 Reaktionsschema der Epoxidation
250000
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[min]
Abbildung 3 MOAH-Anteil einer Probe von nativem bdquoOlivenoumll Extraldquo vor (schwarze Kurve) und nach Epoxidation (violette Kurve)
Die Retentionsbereiche der internen Standards sind rot markiert Squalen blau
Abbildung 1 Das LC-GC-FID-Online-System mit GC-2010 Plus LC-20ADXR SPD-20A
und CBM-20A LITE
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
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[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
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von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
0
200000
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a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
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05
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30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000
uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
200000
225000
250000
275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
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[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
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[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
FUumlR SIE GELESEN
13SHIMADZU NEWS 22018
erhaltene Extrakt wird mit Wasserausgeschuumlttelt mit Natriumsulfatgetrocknet und das Volumen auf 1 ml eingestellt Aliquote von 50 microl Extrakt werden in die LCinjiziert und 450 microl davon werdendirekt auf die Vorsaumlulen fuumlr dieMOSH- bzw MOAH-Fraktiontransferiert
Analyse nativer Oumlle
Eine groumlszligere Herausforderungbesteht beispielsweise in der Ana -lyse nativer Oumlle weil sie natuumlrlicheOlefine enthalten koumlnnen (zumBeispiel Squalen Styrol Carote -no ide etc) die mit dem MOAH-Anteil interferieren Diese Stoumlrun -gen lassen sich durch Epoxidie -rung mit 3-Chlorperbenzoe saumlure(mCPBA) beseitigen Diese greiftan den Doppelbindungen derInterferen zen an formt darausPeroxide und beeinflusst dasRetentions verhal ten der Verbin -dungen so dass sie aus demMOAH-Transfer Fenster bdquowan-dernldquo [5]
Es ist moumlglich die Epoxidierungvollstaumlndig automatisch durchzu-fuumlhren Eine Oumllprobe wird in ein10 ml Glasflaumlschchen eingewogenund der interne Standard sowie n-Hexan werden zugefuumlgt DasFlaumlschchen wird im Autosampler-des LC-GC-Systems platziert undein 2 ml Autosampler-Vial mitNa2SO4 wird vorbereitet DerAutosampler transferiert das 10ml-Flaumlschchen zum Agitator derauf 40 degC erhitzt wird und dasEpoxidationsreagenz hinzufuumlgtDie Reaktion laumluft im Agitator bei40 degC innerhalb von 15 min ab
Anschlieszligend werden eineNa2SO3 (Natriumsulfit)-Loumlsungund Ethanol zugegeben um dieReaktion zu stoppen und die Pha -sentrennung vor dem Zentrifugie -ren zu verbessern Nach der Zen -trifugation transferiert der Auto -sampler das Vial zuruumlck zumAutosampler und ein Aliquot deroberen Hexan-Phase in das vorbe-reitete 2 ml Autosampler-Flaumlsch -chen mit dem Na2SO4 (Natri um -sulfat) Nach fuumlnf minuumltigemTrocknen wird ein 50 microl-Aliquotdieser Phase in die LC injiziertund 450 microl werden direkt auf dieVorsaumlulen fuumlr die MOSH- undMOAH-Fraktionierung transfe-riert
Abbildung 3 zeigt das Chromato -gramm des MOAH-Anteils einerProbe von nativem bdquoOlivenoumllExtraldquo Die schwarze Kurve zeigtdie Probe vor Epoxidierung Derrot markierte Bereich gibt denRetentionsbereich der internenStandards wieder Aufgrund derhohen Squalen-Konzentration(blau markiert) ist die Chromato -graphie erheblich gestoumlrt so dasssich die internen Standards nichtzur Quantifizierung nutzen lassenDie violette Kurve zeigt die glei-che Probe nach erfolgreicherEpoxidierung Uumlber 90 desSqualens wurden entfernt dieinternen Standards zeigen eineperfekte Peak-Symmetrie und eineMOAH-Verunreinigung konnte
nicht gefunden werden was imblau markierten Bereich durchSqualen uumlberdeckt wurde
bdquoFract amp Collectrdquo Ein leistungs-faumlhiges Werkzeug fuumlr Trennungund Identifikation
Es gibt aber auch Proben beidenen die Epoxidierung hinsicht-
lich Elimination von Interferenzenund anschlieszligender korrekterDatenauswertung nicht zufrieden-stellend ist Abbildung 4 zeigt einBeispiel eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor und nach Epoxi die -rung Es war unmoumlglich alleInterferenzen zu beseitigen undein auswertbares Chromatogrammzu erstellen obwohl strenge Epo -xidierungsbedingungen angewen-det wurden
In solch einem Fall wird ein lei-stungsfaumlhiges Werkzeug fuumlr Tren -nung und Identifikation einge-setzt Die MOSH- und MOAH-Anteile werden in der LC vorfrak-tioniert und mit Hilfe der soge-nannten bdquoFract amp Collectrdquo-
0
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uV
60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135
[min]
Abbildung 4 MOAH-Chromatogramme eines Kreuzkuumlmmel-Extrakts vor (schwarze Kurve) und nach (violette Kurve) Epoxidation
Tabelle 1 Ermittelte Mengen von Mineraloumllkohlenwasserstoffen in Lebensmitteln [2]
Reis
Fisch (im Vergleich zum Fettgehalt)
Kakao und Schokolade
Babynahrung (verpackt in Karton)
In Jute-Saumlcken gelagerte Produkte (Reis Kaffee Kakao)
Gebaumlck
Speiseoumll
18 - 160 mgkg
10 - 1200 mgkg
5 - 1300 mgkg
bis zu 33 mgkg
bis zu 500 mgkg
bis zu 2800 mgkg
bis zu 6000 mgkg
Methode gesammelt Danach wirdeine Comprehensive GCxGC-MSzur weiteren Trennung der vonder LC erhaltenen Fraktionen zurIdentifikation und zur Abgren -zung von Interferenzen vonMOSH und MOAH eingesetztIm vorliegenden Chromatogrammin Abbildung 5 (Seite 14) verwei-sen die rot markierten Verbin -
dungen auf die internen Standardsdie gelb markierten stehen fuumlrMono- und Diterpene Der gruumlnmarkierte Bereich zeigt deutlichdie MOAH die in den LC-GC-Chromato grammen schwerlich zuidentifizieren waren
Fuumlr eine Analyse von Schokoladeoder Schokoriegeln muumlssen Fettund natuumlrlich vorkommende n-Alkane entfernt werden Vor der Analyse erfolgt dies mit Hilfeeiner Flash-Chromatographie mitSilizium- und Aluminiumoxid [4]
Gemaumlszlig einer vorgeschlagenen Me -thode die vom Deutschen Bun des -institut fuumlr Risikobe wer tung (BfR)veroumlffentlicht wurde wird eineQuantifizierung durch Integrationder fuumlr verschiedene Molekularge -wichtsbereiche stehenden bdquohumpsldquodurchgefuumlhrt [6] Sie empfehlenfuumlr Lebensmittel kontakt-Materi -alien drei Bereiche fuumlr die MOSH-(C10-C16 C16-C25 und C25-C35)und zwei fuumlr die MOAH-Frak -tion (C10-C25 C25-C35)
Fuumlr Trockennahrung werden nurdie Bereiche bis zu C25 einbezo-gen Abbildung 6a (Seite 15) zeigtMOSH (schwarze Kurve) undMOAH (violette Kurve) einerSpaghetti-Probe mit einer MOSH-Konzen tration von 127 mgkgvon C16-C35
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
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von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
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200000
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
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000
000
036
000
000
020
014
031
014
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000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
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000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
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05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
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-50000
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15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
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100000
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800000
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100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
Windows ist Warenzeichen der MicrosoftCorporation copy2018 Apple Inc Alle Rechtevorbehalten Apple das Apple Logo Macund Mac OS sind Warenzeichen von Apple
AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
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Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
14 SHIMADZU NEWS 22018
Die internen Stan dards sind mitSymbolen markiert (schwarzeQua drate ndash interne StandardsMOSH violette Sterne ndash interneStandards MOAH)
Die Reis probe in Abbil dung 6bzeigt ebenfalls zusaumltzliche Peaksim hinteren Teil des Chro ma to -gramms Diese stammen vonnatuumlr lich vorkommenden unge-radzahligen n-Alka nen mit einerKettenlaumlnge von C21 bis C35
Zusammenfassung
Die Analytik von Mineraloumllruumlck -staumlnden in Lebensmitteln stellteine analytische Herausforderungdar Aufgrund der komplexen Le -
bensmittelmatrix sind oft Hilfs -methoden wie Epoxidierung undFlash Chromatographie erforder-lich Gleichwohl ist eine Online-Kopplung von HPLC mit GC-FID ein wertvolles Werkzeug fuumlreine schnelle und einfache Analysemit der Moumlglichkeit einer Auto -matisierung als wichtigem Erfolgs -faktor
Fuumlr Sie gelesen in chrom+foodFORUM 4-18
AutorenAo Univ Prof DI Dr Erich Leitner Andrea
Walzl BSc MSc Technische Universitaumlt Graz
Institut fuumlr Analytische Chemie und Lebensmit -
telchemie AG bdquoLebensmittelchemie und
Human senso rikldquo Stremayrgasse 92 8010 Graz
1968 ndash Shimadzu startet mit ei nemfuumlnfkoumlpfigen Team in Deutschlandund hat sich im 50 Jahr seines
Jubilaumlums in Europa zu einem europa-weiten Netzwerk entwickelt mit Nieder -lassungen und ausgesuchten Haumlndlernin 81 Staumldten in 47 Laumlndern Heutebeschaumlftigt Shimadzu auf dem Konti -nent mehr als 700 Mitarbeiter
In den ersten 25 Jahren wurde dieOrganisation auf- und ausgebaut dieEntwicklung der Geschaumlfte vorangetrie-ben und das Haumlndler-Netzwerk erwei-tert Zu Beginn standen die Maumlrkte inWesteuropa im Mittelpunkt es gababer auch erste Geschaumlftstaumltig keiten inOstdeutschland Russland und Jugos -lawien Shimadzu ist stetig gewachsenund ein wichtiger Meilen stein war1987 der Umzug von Duumls seldorf nachDuisburg in ein neu errichtetes Gebaumlu -de fuumlr die Europa-Zentrale seinerzeitmit 38 Mitarbei tern
Die Grundlage fuumlr die Fortentwicklungwaumlhrend der folgenden 25 Jahre bilde-ten die eigene Forschung amp Entwick lungsowie Produktionskapazitaumlten in Duis -burg Sie erlaubten Shimadzu die An -forderungen der Maumlrkte schneller undflexibler zu bedienen Das 6300 m2
groszlige Gebaumlude bot zudem genuumlgendFlaumlche die vorhandenen Buumlro- undProduktionsflaumlchen zukuumlnftig zu erwei-tern Das war 1992 bereits der Fall
Organisation integriert Aufgrund derschnell wachsenden Belegschaft aufuumlber 110 Beschaumlftigte bezog die deut-sche Niederlassung 2017 eigene Buumlro -flaumlchen auszligerhalb der Europa-Zentrale
Parallel zur Entwicklung der Nieder las -sungen hat Shimadzu auch sein Haumlnd -lernetzwerk in nahezu allen europaumli-schen Laumlndern ausgebaut so dass dasUnternehmen auf dem gesamten Konti -nent vertreten ist
Das Konzept von eigenstaumlndigen Toch -tergesellschaften in ausgewaumlhlten euro-paumlischen Maumlrkten ist Bestandteil derZukunftsstrategie (bdquoStrategy of theFutureldquo) von Shimadzu Sie sieht uavor in groumlszligeren Maumlrkten bzw Laumlnderneigene Einheiten zu schaffen um vorOrt neue Entwicklungen und Maumlrktebesser unterstuumltzen zu koumlnnen
Als juumlngstes Mitglied der europaumlischenShimadzu-Familie wurde 2017 ALSA-CHIM integriert ein franzoumlsisches Un -ter nehmen spezialisiert auf die Herstel -lung von stabilen isotopenmarkiertenStandards Metaboliten und pharmazeu-tischen Stoffen fuumlr analytische ZweckeDer Markenname ALSACHIM bleibt aufdem Markt praumlsent und wird mit derZeile bdquoa Shimadzu Group Companyldquoaufgeladen Mit ALSACHIM ist Shimadzuin der Lage den klinischen Markt mitKomplett loumlsungen aus Hardware
eroumlffnete Niederlassung in Groszlig bri tan -nien Milton Keynes wurde strategischgewaumlhlt Sie liegt mittig zwischen denZentren London und Birming ham
Zagreb die politische und wirtschaftli-che Hauptstadt von Kroatien ist seit1997 der Standort von ShimadzuKroatien fuumlr die Betreuung von Kundenentlang der adriatischen Ostkuumlste Ab2001 wurde das kroatische Verkaufs -gebiet um die Staaten Albanien Bos -nien-Herzegowina Bosnien Mazedo -nien Montenegro und Serbien erwei-tert Ende der 90er Jahre wurde beiBasel die Niederlassung in der Schweizgegruumlndet Das Dreilaumlndereck vonFrank reich Deutschland und derSchweiz ist eine der dynamischstenWirtschaftsregionen der Schweiz ImJahr 2002 wurde Shimadzu France oumlst-lich von Paris eroumlffnet Von dort auswird der gesamte franzoumlsische Marktbis nach Reacuteunion im Indischen Ozeanbedient
Um auch die Geschaumlftstaumltigkeit inDeutschland in diese europaumlischeStruk tur einzubinden wurde 2007 mitShimadzu Deutschland eine eigenstaumln-dige Niederlassung gegruumlndet Natuumlr -lich war Shimadzu bereits seit 1968 inDeutschland als dem groumlszligten europaumli-schen Markt geschaumlftlich praumlsent undaktiv In diesem Zuge wurden auch alleTechnischen Buumlros in die Deutschland-
Weitere 6000 m2 kamen fuumlr die Ana -lytik und die Medizintechnik hinzu Fer -ner wurde das Shimadzu Applika tions-und Trainingszentrum (ShimCAT) eroumlff-net um Anwendungsaufgaben vor Ortzu bearbeiten
Entwicklung von Shimadzu als Unternehmen
Ab den 1990er Jahren als Shimadzubereits seit 25 Jahren in Europa ansaumls-sig war ebneten der politische undgesellschaftliche Wandel in Osteuropaneue Marktchancen
Shimadzu begann seine Praumlsenz zu -naumlchst in Deutschland auszubauen underoumlffnete zusaumltzliche Technische BuumlrosIn den folgenden Jahren wurden neueFilialen und Niederlassungen in zahlrei-chen Laumlndern gegruumlndet Es begann1990 mit der Niederlassung in Oumlster-reich von dort wurden zusaumltzlich dieLaumlnder Tschechoslowakei Ungarn Ru -maumlnien und Bulgarien betreut Bereitsein Jahr darauf nahm Shimadzu Italiaseine Geschaumlfte auf ndash in Mailand demIndustrie- und Finanzzentrum des Lan -des
1992 wurde Shimadzu Benelux gegruumln-det Vom Standort im niederlaumlndischenslsquoHertogenbosch sind schnell die Wirt -schaftszentren Amsterdam Rotterdamund Bruumlssel zu erreichen Auch die 1996
50 Jahre Shimadzu in EuropaMeilensteine in Entwicklung und Technologie
Abbildung 5 Comprehensive GCxGC-MS-Chromatogramm des MOAH-Anteils des
epoxidierten Kreuzkuumlmmel-Extrakts
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
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von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
0
200000
400000
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10 30 50 70 90 110 130 150 170
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
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20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
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000
000
036
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000
020
014
031
014
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041
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054
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052
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014
012
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16
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053
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000
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073
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036
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030
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3367
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000
000
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013
016
016
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044
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000
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003
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013
016
016
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000
000
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000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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ProductsliteratureGCMSC146-
E349pdf
APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
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[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
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400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
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00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
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100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
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2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
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mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
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itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
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0
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tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
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Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
FUumlR SIE GELESEN
AKTUELLES
15SHIMADZU NEWS 22018
Literatur[1] Bundesinstitut fuumlr Risikobewertung
(BFR) Stellungnahme Nr 0082010
09122010
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Food Chain (CONTAM) EFSA Journal
2012 10(6) 2704-2889
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EN 16995 Edition 2017-08-01
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[6] wwwbfrbunddecm343bestimmung-
von-kohlenwasserstoffen-aus-mineralo-
el-oder-kunststoffenpdf [01032018]
0
200000
400000
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10 30 50 70 90 110 130 150 170
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10 30 50 70 90 110 130 150
a b
Abbildung 6 a) Spaghetti-Probe mit der MOSH-Konzentration von C16-C35 und b) Reis-Probe mit natuumlrlich vorkommenden
ungeradzahligen Alkanen
Software sowie Applikationskits zubedienen
Neue Loumlsungen fuumlr morgen
2013 wurde die 1500 msup2 groszligeShimadzu Laborwelt eroumlffnet und 2017das European Innovation Center (EUIC)Die hochmoderne Laborwelt konzen-triert sich auf die wachsenden Heraus -forderungen von Industrie und Wissen -schaft Sie bietet Demonstrations- undTestmoumlglichkeiten um die Kunden denEinsatz der Systeme so real wie moumlglicherleben zu lassen Das gesamte Produkt -angebot von Shimadzu steht fuumlr Testsund Anwendungsentwicklung zur Ver -fuumlgung Die Laborwelt ist auch dasneue Zuhause fuumlr ShimCAT
Mit seinem einzigartigen Anspruch ver-bindet das EUIC akademisch-wissen-schaftliches Know-how von Universi tauml -ten mit der Technologiekompetenz vonShimadzu um kundenorientierten Ser -vice auf ein neues Niveau zu hebenUm neue Loumlsungen fuumlr morgen zu ent-werfen kombiniert das EUIC die hoch-wertigen Analysetechnologien vonShimadzu mit wegweisenden Themenund Fachwissen aus Maumlrkten und Wis -senschaft die Meinungsfuumlhrer Vorden -ker und Experten einbringen
Technologischer Fortschritt undfortschreitende Digitalisierung
In den letzten zweieinhalb Dekaden fei-erte die Shimadzu Corporation das 60Jubilaumlum der GC-Technologie und derIR-Spektroskopie den 40 Geburtstagder HPLC sowie das 140-jaumlhrige Beste -hen des Unternehmens Shimadzu prauml-
in Sciencerdquo steht fuumlr herausragendeQualitaumlt in Technik und Service undjeden einzelnen Aspekt in der Zusam -menarbeit mit Kunden Es verdichtetden Anspruch von Shimadzu den Kon -sumenten- Patienten- und Umwelt -schutz ebenso wie Produktsicherheitstetig zu verbessern
niken verbessern Empfindlichkeit undGenauigkeit der Analyse und derMessungen
Der Markenanspruch bdquoExcellence inSciencerdquo bringt diese Leistungen undden Fortschritt auf den Punkt und gehtinhaltlich uumlber den fruumlheren bdquoSolutionsfor Sciencerdquo Ansatz hinaus bdquoExcellence
sentierte zahlreiche Weltneuheiten fuumlrdie instrumentelle Analytik sowie dieMedizintechnik ndash viele vorangetriebendurch kleinere Systeme mit geringererStandflaumlche sowie Automatisierungetwa von der Probenaufbereitung biszur Analyse Sie sorgen fuumlr houmlhere Effi -zienz und Produktivitaumlt in Labors undKliniken Insbesondere Kopplungstech -
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
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20
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00
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25
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(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
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75000
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225000
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275000
300000
uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
50000
0
-50000
100000
150000
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800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
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40000
50000
60000
70000
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0
100000
200000
300000
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600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
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10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
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[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
16 SHIMADZU NEWS 22018
Analyse von VOC- und SVOC-Emissionen im Fahrzeug -innenraumWerkstoffpruumlfung nach VDA278 mit Thermodesorption
I n den vergangenen Jahren zei-gen die Maszlignahmen die Ver -wendung von organischen
Komponenten in der Automobil -industrie zu reduzieren einenbemerkenswerten Fortschritt In Deutschland sind spezielleVDA278-Bestimmungen fuumlr leicht -fluumlchtige organische Bestandteile(Volatile Organic Compounds[VOC]) und schwerfluumlchtigeorganische Verbindungen (SemiVolatile Organic Compounds[SVOC]) fuumlr nichtmetallischeKFZ-Werkstoffe festgelegt wor-den Die Automobilherstellerwenden die VDA278 fuumlr Form -teile im Fahrzeuginnenraum ansie ermoumlglicht die Auswirkungenvon Emissionen abzuschaumltzen undProdukte zu verbessern
Neuwagen sollen moumlglichst neu-tral riechen jedoch beeinflussengroszligflaumlchige Geruchstraumlger wieTeppiche Dachhimmel oder Sitz -bezuumlge die Wahrnehmung derKun den Geruumlche im Autoinnen -raum sollen weder stoumlrend odergar schaumldlich sein sondern imIdealfall zur Kaufentscheidungbeitragen
Fuumlr die Analyse werden die Pro -ben mit Thermodesorptions ana -lyse (TD) thermisch extrahiert imGC getrennt und im Massen spek -trometer detektiert Die Probenwerden hierbei auf das TD-Roumlhr -chen aufgegeben und anschlieszligenddurch festgelegte Desorptions -programme in das GCMS einge-leitet wodurch eine sehr bequemeund schnelle Analyse von VOCund SVOC ermoumlglicht wird Daes sich bei den desorbierten orga-nischen Komponenten teilweiseum schwerfluumlchtige Verbindungenhandelt werden einige wichtigeAnforderungen an die Qualitaumltdes eingesetzten Analysesystems
gestellt um die moumlgliche bdquoVer -schleppungldquo von Probenbestand -teilen zwischen den Messungen zuverhindern
TD-30 alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift werdenuumlbertroffen
Shimadzu hat eine neue Loumlsungfuumlr die Gas- und Materialanalysevorgestellt dessen flexible Erwei -terbarkeit eine groszlige Bandbreitevon quantitativen Ana lysen unter-stuumltzt etwa in Forschung oderQualitaumltskontrolle Das neue TD-30 Desorptionssystem bietetgleich mehrere Eigenschaften wiebesonders inerte Leitungen maxi-mal verkuumlrzte Verbindungen zwi-schen GCMS und TD sowieschnelles Heizen und Kuumlhlen derTD-Roumlhrchen Eine eingebauteUumlberlappungsfunktion erhoumlhtsignifikant den ProbendurchsatzAuf diese Weise erfuumlllt der TD-30alle Anforderungen der VDA278-Vorschrift und uumlbertrifft diesesogar in allen Punkten
Gemaumlszlig VDA278 werden die Pro -ben (Gummi Plastik Leder) induumlnne Streifen geschnitten und jeetwa 30 mg der Probe wird imTD-Roumlhrchen platziert Von bei-den Seiten wird das Roumlhrchen mit
etwa 5 mg Glaswolle versehen undmit Deckeln verschlossen DieVOC- und SVOC-Komponentenwerden bei unterschiedlichenTemperaturen fuumlr je 30 min desor-biert und anschlieszligend die gesam-melten Fraktionen in das GCMSeingeleitet Die Analysebedin gun -gen sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst
Ergebnisse Evaluierung der Kalibration und derWiederfindungsraten
Die Standards fuumlr die Kalibra tions -kurven werden durch Verduumlnnungvon Toluol und n-Hexadecan mitMethanol auf 05 microgmicrol hergestelltAnschlieszligend werden 4 microl derLoumlsung auf das Tenaxreg TA-Roumlhr -chen aufgegeben und mit demGCMS vermessen um den Res -ponsefak tor (Rf) zu bestimmenDie Rfs werden spaumlter fuumlr dieQuantifi zierung der Komponen -ten in den Proben benutzt Diezugrundeliegende Formel fuumlr dieBerechnung von Rf ist folgende
Die Emission der zu bestimmen-den Komponenten wird somit wiefolgt berechnet
GCMS-System mit TD-30 Desorptionssystem
00
05
10
15
20
25
30
00
05
10
15
20
25
30
(x 10000000)
min min
Leder
Konzentration33328 microgg
Konzentration wenigerals 017 microgg
Vergleichs-StandardTIC
(x 10000000)
TIC
3000 3025 3050 3075 3000 3025 3050 3075
Abbildung 1 Chromatogramm der Lederprobe im Vergleich
Rf(ToluolC16) =mToluolC16 [microg] x 1000000
Peakflaumlche
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
000
000
000
036
000
000
020
014
031
014
000
000
000
000
000
000
041
000
054
000
000
000
052
000
000
014
012
000
000
000
000
000
109
000
000
16
000
053
000
000
000
073
017
043
026
036
060
073
030
292
018
017
015
000
3367
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
000
044
000
000
000
018
003
006
013
016
016
000
000
000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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E349pdf
APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
0
25000
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uV
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[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
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-50000
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15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
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100000uV
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0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
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10000000
12500000
15000000
17500000
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25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
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[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
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Rel
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tens
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[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
Zusaumltzlich werden die Wiederfin -dungsraten des Analysensystemsberechnet indem eine Mischungaus typischen VOC-Komponen -ten (Konzentration etwa 011 microgmicrol) hergestellt und 4 microl der Loumlsungauf das Tenax TA-Roumlhrchen auf-gegeben werden Die berechnetenWiederfindungsraten sind inTabel le 2 zusammengefasst
Analyseergebnisse fuumlr nichtmetallische Automobil-Werkstoffe
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse derquantitativen Analyse (in microgg)fuumlr VOC-Komponenten die inGummi Plastik und Leder be -stimmt worden sind Unter denberechneten Werten aus der Leder -probe ist eine sehr hohe Konzen -tration von Bis(2-ethylhexyl) -phtha lat von 33328 microgg (Tabelle3 und Abbildung 1) welches alsWeichmacher in Kunststoffen ver-wendet wird
Direkt nach dieser Probe ist einleeres TD-Roumlhrchen vermessenworden um die moumlgliche Ver -schleppung von Analyten in dieFolgemessung zu bestimmenNach der Messung ist ein Wertvon 017 microgg Bis(2-ethylhexyl) -phthalat berechnet worden was
lediglich 005 der Konzen tra -tion in der Messung davor dar-stellt (Abbildung 1) Somit konnteeine hohe Qualitaumlt des Systemsund dessen Eignung fuumlr komplexeProben der VDA278-Norm nach-gewiesen werden
Fazit
Der TD-30 ist die Revolution aufdem Markt der thermischen De -sorptionssysteme Insbesondere
Tabelle 1 Konfiguration der verwendeten Instrumente
Tabelle 2 Berechnete Wiederfindungsraten
GCMS
Thermodesorber
Software GCMS
Software TD-30
GC Saumlule
GCMS-QP2020
TD-30R
GCMSsolutionTM Ver445
TD-30 Control Software
SH-RxiTM-5Sil MS (60 m x 025 mm ID df = 025 microm) (SHIMADZU)
Desorptionstemperatur fuumlr TD-Roumlhrchen
Desorptionsflussrate fuumlr TD-Roumlhrchen
Kuumlhlung der Trap
Desorptionstemperatur der Trap
Temperatur fuumlr Joint
Temperatur der Valve
Temperatur der Transferline
90 degC fuumlr 30 min (VOC) 120 degC fuumlr 30 min (SVOC)
60 mlmin
-20 degC
280 degC fuumlr 10 min
280 degC
250 degC
280 degC
Verwendete Konfiguration der Instrumente
TD-30 Einstellungen
Control Mode
Druck
Injektionsmodus
Ofentemperatur
Pressure
200 kPa
Split 1100 (Saumlulenfluss 199 mlmin)
40 degC (3 min) ndash (10 degCmin) ndash 300 degC (135 min)
GC Einstellungen
Temperatur der Ion Source
Temperatur vom Interface
Scan Mass Range
Scan-Zeit
Scan-Geschwindigkeit
200 degC
250 degC
mz 35-400
05 sec
769 usec
MS Einstellungen
Emission [microgg] =
Rf(ToluolC16) x Peakflaumlche
1000 x Probengewicht [mg]
(Komponente)
Benzol
Toluol
p -Xylol
o -Xylol
2-Ethyl-1-Hexanol
26-Dimethylphenol
Dicyclohexylamin
1065
935
999
754
1013
942
892
Komponente Wiederfindungsrate []
das High-End Model TD-30Rsetzt neue Maszligstaumlbe in diesem
Bereich Dieses System bietet diehoumlchste Probenkapazitaumlt (120)
Delivering confidenceAutomotive
full range of analytical and testing solutions
Suspension and otherPower TransmissionSystems
Engines Motors andPower Sources
EnvironmentalConservation
Bodies and Interiors
ElectronicInstrumentationComponents
Lithium-Ion RechargeableBatteries and Fuel Cel ls
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
100000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
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000
000
036
000
000
020
014
031
014
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000
000
000
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041
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054
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000
052
000
000
014
012
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000
109
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16
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043
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036
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3367
000
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000
000
018
003
006
013
016
016
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000
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013
016
016
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000
000
000
000
000
000
011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
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uV
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
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100000
150000
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650000
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750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
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Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
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30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
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100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
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2+
7433
1+
3081
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30911+
3131
1+
3121
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mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
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e In
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itaumlt
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]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
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tens
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]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
18 SHIMADZU NEWS 22018
Oumll im WasserSchnelle und effiziente Analyse von Mineraloumllen in Umweltproben nach H53
W eltweit werden taumlglichgroszlige Mengen Rohoumll inunterschiedliche Mineral -
oumllprodukte weiterverarbeitet zumBeispiel Benzin Kerosin DieselHeiz- und Schmieroumll Mineraloumll -pro dukte sind im Wesentlichenaus zumeist gesaumlttigtenKohlenwas -serstoffen zusammengesetzt soge-nannten Mineraloumllkohlenwasser -stoffen (MKW) Bei der Produk -tion wie auch dem kommerziellenund privaten Gebrauch von Mine -raloumll produkten kommt es immerwieder zu Kontaminationen vonGe waumlssern und Boden
Da die Mineraloumllkohlenwasser -stoffe biologisch schwer abbaubarsind ist es sehr wichtig die Belas -tung von Umweltproben durchMKW zu kontrollieren Die Ana -lytik von Mineraloumllkohlenwas ser -stoffen in Trink- und Oberflaumlchen -waumlssern sowie Abwaumlssern wirddurch die Europaumlische Norm ENISO 9377-2 festgelegt im Sprach -gebrauch kurz H53 [1]
Die Wasserprobe wird extrahiertund anschlieszligend uumlber Florisilaufgereinigt um polare Substan -zen zu entfernen Die Analyse desaufgereinigten Extrakts erfolgtmittels Gas-Chromatographie mit
0
50000
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uV
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
[min]
Abbildung 1 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan C40C20 gt 098
Tabelle 3 Ergebnisse der quantitativen Analyse
C8
Toluol
C9
C11
13-Dichlorobenzol
2-Propyl-1-Pentanol
C12
Nonanal
C13
C15
C16
C18
C19
Dibutylphthalat
C20
C22
C23
C25
Bis(2-ethylhexyl)phthalat
000
035
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020
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031
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041
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052
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014
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3367
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000
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013
016
016
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000
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011
024
013
031
008
078
006
087
013
014
086
202
137
1753
128
082
082
178
33328
Komponente In VOC Fraktion [microgg]
Gummi Plastik Leder Gummi Plastik Leder
In SVOC Fraktion [microgg]auf dem Markt Zudem sorgt diehorizontale Ausrichtung der TD-Roumlhr chen fuumlr eine verschleppungs-freie Analyse
Eine Uumlberlappungsfunktion er -houmlht den Probendurchsatz Daseinzigartige Design der Transfer -verbindung ndash ohne kalte Stellenmit dem kuumlrzesten Weg zwischenTD und GCMS ndash ermoumlglichthochempfindliche Analysen uumlbereinen sehr weiten Temperatur -bereich
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APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
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[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
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250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
800000uV
15 20 25 30 35 40 45 50 55
[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
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30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
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]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
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100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
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2+
7433
1+
3081
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30911+
3131
1+
3121
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mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
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e In
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itaumlt
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]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
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ativ
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tens
itaumlt
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]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
19SHIMADZU NEWS 22018
Flammenionisationsdetektion(GC-FID) Einzelsubstanzen auf-zuschluumlsseln ist infolge der Kom -plexitaumlt der Kohlenwasserstoff -gemische nicht moumlglich Die Quan -tifizierung erfolgt daher uumlber eineIntegration der Gesamtpeakflaumlchezwischen den Markersubstanzenn-Dekan (C10) und n-Tetracontan(C40) [1]
Der so untersuchte Siedepunkts -bereich liegt zwischen 175 und 525 degC [2] Um die Konzentrationan Mineraloumll zu bestimmen wird
eine Mineraloumllmischung (Diesel-Schmieroumllmischung MineraloumllTyp A und Typ B) als externerStandard verwendet [1] Boden-und Schlammproben koumlnnen ana-log H53 bestimmt werden festge-legt durch die Europaumlische NormISO 167032011
Saumlulenschonend und wartungsfreundlich der Split-Splitlos-Injektor
Da die Bestimmung der Mineral -oumll kohlenwasserstoffe einen groszligen
Siedebereich umfasst wird dieAnalytik klassisch unter Verwen -dung eines on-column-Injektors(OCI) durchgefuumlhrt um eine dis-kriminierungsfreie Probenaufgabezu gewaumlhrleisten ISO 9377-2schreibt ein Verhaumlltnis der Alkanen-Tetracontan (C40) zu n-Eicosan(C20) von mindestens 08 vor [1]Nachteile der on-column-Injek -tion sind die hohe Matrixbelas -tung der Saumlule sowie die Verwen -dung eines Retention-Gaps Einesaumlulenschonendere und wartungs-freundlichere Alternative ist es
einen Split-Splitlos-Injektor (SPL)einzusetzen sofern dieser dieobige Anforderung erfuumlllt
In Wiederholmessungen einesAlkanstandards wurde fuumlr denNexis GC-2030 ein HighEnd-GC-System ein Verhaumlltnis C40C20 gt 098 erreicht (Abbil dung 1)sodass ausreichende Diskriminie -rungsfreiheit gegeben ist Hierbeiwurde eine konventionelle Saumlule(Rtx-5 15 m 025 mm ID 025microm Filmdicke Restek) sowie eineoptimierte Methodik hinsichtlichBasislinientrennung der Alkaneund Chromatogramm laufzeit ver-wendet (Tabelle 1 Seite 20) DieReten tionszeit des C40 betrugdabei 89 min sodass die Analytikbis C40 in weniger als 10 minabgeschlossen war
Verkuumlrzung der AnalysezeitWasserstoff als Traumlgergas
Unter Verwendung einer starkerhoumlhten Lineargeschwindigkeitkonnte die Analytik weiter be -schleunigt werden um Chromato -gramme mit Laufzeiten kleiner als65 min zu erreichen Weitere Ver -kuumlrzung bei gleichzeitiger Ver -wen dung weniger extremer Line -argeschwindigkeiten wurde durchden Einsatz von Wasserstoff alsTraumlgergas erzielt
Eine anschlieszligende Nachoptimie -rung der Saumlulendimensionen fuumlhr-te zu einer weiteren Reduktionder Analysenzeit Der Wechsel aufeine MXT-1 mit den Dimensionen15 m 025 mm ID 01 microm Film -dicke (Restek) ermoumlglichte miteiner C40-Retentionszeit von 54 min schlussendlich eine Chro -matogrammlaufzeit von untersechs Minuten (Abbildung 2Tabelle 2 Seite 20)
Dies fuumlhrte zu Injektionszyklenvon 10 min inklusive Abkuumlhl- undEquilibrierzeit Die Diskrimie -rungsfreiheit der Probenaufgabewar mit einem Verhaumlltnis C40C20 gt 090 nach wie vor gegebenWeiterhin konnte infolge dererhoumlhten Temperaturstabilitaumlt derMXT-1 die Maximaltemperaturdes Ofenprogramms erhoumlht wer-den was die Chromatogramm -laufzeit fuumlr Realproben mit Antei -len im Bereich groumlszliger C40 ver-kuumlrzt
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[min]
Abbildung 3 Chromatogramm des Kalibrationsstandards 1 mgml Mineraloumll Typ A und B in Extraktionsloumlsung mit
Retentionszeitmarker C10 und C40
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[min]
Abbildung 2 Chromatogramm eines Alkanstandards (C10 C20 bis C40 gerade Anzahl C-Atome) in Heptan fast-GC
mit Wasserstoff als Traumlgergas C4020 gt 090
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
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-10000
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0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
Basierend auf diesen Optimie -rungs ergebnissen wurden exem-plarisch Realproben vermessenUm eine Kalibrationsreihe herzu-stellen wurden ein Mineraloumll -standard Typ A und Typ B sowieeine bereits mit C10 und C40 ver-setzte Extraktionsloumlsung verwen-det beide kommerziell erhaumlltlich(Sigma Aldrich Abbil dung 3Seite 19) Dies reduzierte dennass-chemischen Arbeitsauf wandhatte je doch zur Folge dass keinHinter grundabzug aus reinemLoumlsungs mittel ohne Reten -tionszeitmarker moumlglich warStatt dessen wurde die ungespikteExtraktionsloumlsung als Konzentra -tionslevel 0 in die Kalibrations -reihe mit aufgenommen
Da die zu erwartende Konzentra -tion der Realproben nicht bekanntwar wurden zwei Kalibrierungenerstellt eine 6-Punktkalibrierungin einem Bereich von 0 bis 15 mgml sowie eine 5-Punktkalibrierungin einem groumlszligeren Bereich von 0bis 10 mgml (Abbildung 4) Fuumlrbeide Kalibrierungen wur denRegressionskoeffizienten groumlszliger09998 erhalten Die untersuchtenRealproben zeigten unterschiedli-che Mineraloumllverunreini gungen(Abbildung 5) Sie lagen mehrheit-lich im kleineren Kali brierbereicheine Probe lag jedoch etwas auszliger -halb im groumlszligeren Kali brierbereich
Fazit
Mittels eines Split-Splitlos-Injek -tors koumlnnen H53-Messungen ver-einfacht und beschleunigt werdensofern dieser die Anforderungendes ISO 9377-2 Standards erfuumlllt
Das Flaumlchenverhaumlltnis C40C20muss dafuumlr oberhalb von 08 lie-gen was der Nexis GC-2030 miteinem Verhaumlltnis groumlszliger 09 mehrals erfuumlllt Mithilfe von Wasser -stoff als Traumlgergas koumlnnen unterAuswahl einer geeigneten Saumluledie Chromatogrammlaufzeitenbei gleichbleibender Zuverlaumls sig -keit der Ergebnisse signifikant aufbis zu 6 Minuten verkuumlrzt wer-den
Literatur[1] Wasserbeschaffenheit ndash Bestimmung
des Kohlenwasserstoff-Index ndash Teil 2
Verfahren nach Loumlsemittelextraktion
und Gaschromatographie (ISO 9377-
22000) Deutsche Fassung EN ISO
9377-22000
[2] Auswertung von Mineraloumll-Gas-
Chromatogrammen Handbuch Altlas -
ten Band 3 Teil 5 Hessisches Landes -
amt fuumlr Umwelt und Geologie
20 SHIMADZU NEWS 22018
0
-10000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
0
100000
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700000
800000
90000
100000uV
uV
0500 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55[min]
Abbildung 5 Chromatogramme zweier Realproben
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
320 degC
1 microl
Splitlos
MXT-115 m 032 mm ID 01 microm df (Restek)
H2
80 cms
50 degC 07 min 95 degCmin 115 degC 65 degCmin
200 degC 55 degCmin 370 degC 022 min
FID
370 degC
Tabelle 2 Methodenparameter fast GC auf MXT-1 Saumlule
0
2500000
5000000
7500000
10000000
12500000
15000000
17500000
0
25000000
50000000
75000000
100000000
125000000
150000000
175000000
20000000
22500000
25000000
000 025 050 075 100 125
Konzentration
00 25 50 75
Konzentration
Flaumlc
he
Flaumlc
he
Abbildung 4 Kalibrationsreihen im Bereich 0 bis 15 mgml (links) sowie 0 bis 10 mgml (rechts)
Gas-Chromatograph
Injektor
Injektortemperatur
Injektionsvolumen
Splitverhaumlltnis
Saumlule
Traumlgergas
Traumlgergasgeschwindigkeit
Ofenprogramm
Detektor
Detektortemperatur
GC-2030
Split Splitlos
280 degC
1 microl
Splitlos
Rtx-5 15 m 025 mm ID 025 microm df (Restek)
He
60 cms
60 degC 1 min 45 degCmin 340 degC 3 min
FID
340 degC
Tabelle 1 Methodenparameter konventionelle GC auf Rtx-5 Saumlule
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
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(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
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AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
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ShimadzuEurope
21SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
Die Qual der WahlNicht alle C18-Saumlulen zeigen dasselbe Trennverhalten
D ie Auswahl an verschieden-sten Fluumlssigchromato gra -phie-Saumlulen ist riesig mit
sehr vielen stationaumlren Phasen zurAuswahl Selbst wenn die zu ver-wendende stationaumlre Phase klardefiniert ist gibt es zahlreiche Un -terschiede Dieser Artikel beziehtsich ausschlieszliglich auf Kieselgelbasierte stationaumlre Phasen mitC18-Modifikation auch Octadecylsilane oder ODS-Saumlulen genannt ndashder allgemeine Standard fuumlr dieUmkehrphasen-ChromatographieUm die Pro blematik an einem Bei -spiel zu erlaumlutern sind in Abbil -dung 1 zwei Chromato gram mevon unterschiedlichen Shim-packC18-Saumlulen gezeigt
Sowohl Probe als auch verwendeteMethode und Saumlulendimensionensind in diesem Beispiel identischRein chemisch betrachtet liegthier also das gleiche Trennprinzipvor ndash dennoch unterscheiden sichdie Retentionszeiten stark vonein-ander Peak 3 (Naphthalin) zeigtauf der GISS C18 eine Reten tions -zeit von 168 Minuten waumlhrend esbei Verwendung der GIST C18erst nach 250 Minuten eluiert
Die Schwierigkeit eine passendeC18-Saumlule auszusuchen ist groszligda sich unterschiedliche Saumlulenunterschiedlich verhalten koumlnnenDies haumlngt von der Art des Kiesel -
gels und dessen Herstellung absowie von Modifikation und Pack -technik der Saumlule
Hilfen um C18-Saumlulen zu verglei-chen und zu charakterisieren
Aufgrund der riesigen Saumlulen aus -wahl ist es wichtig die chemischenund physikalischen Eigen schaftenund Unterschiede der verschiede-nen stationaumlren Phasen zu verglei-chen um somit die Selektivitaumlt zucharakterisieren Dafuumlr gibt es ver -schiedene Ansaumlt ze wie zum Bei -spiel von Engel hardt McCalleyoder Tanaka veroumlffentlicht [1 2 3]Auf letzteren wird hier im Fol -gen den weiter eingegangen
Der Tanaka-Test liefert charakteri-stische Werte anhand derer sichdas Trennverhalten einer Saumlulegenauer beurteilen laumlsst Sie wer-den unter standardisierten Bedin -gungen aus den Retentionszeitenspezieller Analyten errechnetDies ermoumlglicht stationaumlre Phasenentsprechend zu vergleichen undleichter eine informierte Wahltreffen zu koumlnnen Da die Metho -den und alle anderen Parameterfuumlr den Tanaka-Test vorgeschrie-ben sind ergeben sich vergleich-bare Werte ndash selbst wenn die Mes -sungen in unterschiedlichen Labo -ren durchgefuumlhrt werden DerTanaka-Test ist somit ein nuumltzli-
ches Werkzeug um verschiedeneSaumlulen miteinander zu vergleichen
Parameter des Tanaka-Tests
Mit dem Test werden verschiedeneSaumlulencharakteristiken beschrie-ben Dazu gehoumlren die KapazitaumltHydrophobizitaumlt sterische Selek -tivitaumlt sowie Silanol-Wechselwir -kungen Diese Parameter (Tabel le1Seite 22) werden anhand der Reten -
tions zeiten geeigneter Standard -substan zen bestimmt gemessenunter vorgegebenen Analysebe -din gun gen
Ergebnisse von vielen Saumlulen an -hand des Tanaka-Tests sind einegute Hilfe herauszufinden wel-che Saumlulen in die engere Auswahlkommen Der frei zugaumlnglichebdquoColumn Selectorldquo von ACDLabs beinhaltet Tanaka-Werte vie-ler Saumlulen zum Vergleich [4] Aberauch andere Parameter und Spezi -fikationen die wichtig sind fuumlr dieAuswahl der geeigneten Trenn -saumlule fuumlr eine bestimmte Applika -tion werden im Folgenden be -schrieben und erklaumlrt
Wichtige Spezifikationen und Parameter fuumlr dieSaumlulenauswahl
Um eine geeignete stationaumlre Pha -se fuumlr ein Trennproblem auszu-waumlhlen helfen die in Tabelle 2(Seite 23) angegebenen Saumlulenpa -rameter und Spezifikationen sehrgut weiter Im Unterschied zumTanaka-Test kommen diese Wertevom Saumlulen hersteller und sinddirekt zugaumlnglich
Zusaumltzlich ist die Saumluleneffizienzwichtig Diese wird in theoreti-schen Boumlden (N) gemessen Jehoumlher die Bodenzahl destoschma ler ist der Peak undoderdesto mehr Retention erfaumlhrt erauf der Saumlule
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000uV
000 025 050 075 100 125 150 175 200 225 250 275
[min]
Abbildung 1 Vergleich von zwei unterschiedlichen stationaumlren Phasen gepackt mit C18-modifiziertem Kieselgel (GISS und GIST)
Dimensionen 20 x 100 mm 2 microm Partikelgroumlszlige Mobile Phase 35 Wasser 65 Acetonitrile Proben 1) Uracil 2) Benzoesaumlure -
methylester 3) Naphthalin
0XR-ODS III GISS
2
4
6
8
10
12
13XR-ODS III RP Shield
135
14
145
15
155
0C18-P GIST
05
1
15
2
25
355
Retentionskapazitaumltk PB
Hydrophobizitaumlt CH2
Sterische Selektivitaumlt TQ
0010203040506070809
C18-P RP Shield0
MAqC-ODS C18-AQ
051
152
253
354
455
0002004006
GISS XR-ODS III
00801
012014016018
Silanolwechselwirkungen CP
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 76
Ionenaustauschkapazitaumlt BP pH 27
Abbildung 2 Darstellung der geringsten und houmlchsten Tanaka-Parameter aus dem
kompletten Shim-pack C18-Sortiment
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
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[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
Windows ist Warenzeichen der MicrosoftCorporation copy2018 Apple Inc Alle Rechtevorbehalten Apple das Apple Logo Macund Mac OS sind Warenzeichen von Apple
AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
APPLIKATION
L = Laumlnge der SaumluleH = BodenhoumlhetR = RetentionszeitWh = Peakbreite auf halber Houmlhe
Eine schmaler Peak und damiteine houmlhere Bodenzahl kommtzustande durch eine kleine Parti -kel groumlszlige eine geringe Partikelgrouml -szligenverteilung und eine gute Pack -ungsprozedur Somit spiegelt einhoher N Wert eine gute Packungs -qualitaumlt der Saumlule wider
Ein weiterer Faktor ist die Quali -taumlt des Kieselgels Dieser Punkt istheutzutage vernachlaumlssigbar daalle modernen Saumlulen qualitativhochwertiges Kieselgel enthaltenIn der Vergangenheit kam es durchhohe Partikelgroumlszligenver teilungschlecht gepackte Saumlulenbettenund hohem Anteil an sauren Sila -nolgruppen zu breiter Peakformnicht nur fuumlr basische Analyten
Neben diesen allgemeinen Spezifi -kationen gibt es noch weitere Mo -di fikationen die das Reten tions -verhalten verschiedener C18-Saumlu -len beeinflussen Diese werden imFolgenden am Beispiel der verwen -deten Saumlulen fuumlr diesen Artikelerklaumlrt
Verwendete Saumlulen
Diese Shim-pack C18-Saumlulen wur-den fuumlr die Untersuchung genutztXR-ODS III und MAqC-ODSvon der Shim-pack G Serie GIST C18 GIST C18-AQ GISS C18GIS RP-Shield und GIS C18-PDie Shim-pack G Serie bietet einvollstaumlndiges Portfolio mit vie lenverschiedenen Dimensio nen Dieshat den Vorteil dass Trenn metho -den auf Phasen mit sehr klei nenDimensionen (UHPLC) entwik-kelt und bis hin zu sehr groszligenSaumlulen fuumlr praumlparative Anwendun -gen skaliert werden koumlnnen
Die XR-ODS III gehoumlrt zur XRSeries sie wird ausschlieszliglich mitkleinen Partikelgroumlszligen gepacktSomit ist sie fuumlr Hochdruckappli -ka tionen mit hoher Aufloumlsungund Sensitivitaumlt gut geeignet
Die MAqC-ODS ist eine C18-Saumlu -le die zusaumltzlich Metall enthaumllt
en bindungen erhaumllt die Saumlule eineandersartige Selektivitaumlt im Ver -gleich zu herkoumlmmlichen C18-Saumlulen
Bei der GIS C18-P-Saumlule ist dieC18-Modifikation polymerischgebunden statt monomerisch wiebei den meisten anderen ODS-Phasen Dadurch bietet sie einehohe sterische Selektivitaumlt fuumlr dieTrennung von planaren und nicht-planaren Analyten Ideale Anwen -dungen sind beispielsweise dieTrennung von PAKs oder Analysevon strukturaumlhnlichen Kompo -nen ten (Vitamin D2 und D3)
Messparameter und Methoden
Instrument LC-2040C 3D(Shimadzu)Saumlule Shim-pack XR-ODS III(75 mm x 20 mm ID 16 microm)Alle anderen Shim-pack C18 (150mm x 46 mm ID 5 microm)ShimadzuMobile PhaseA 20 Wasser 80 MethanolB 30 Wasser 70 MethanolC 60 Wasser 30 Methanol
10 200 mM KH2PO4 pH 27
D 60 Wasser 30 Methanol10 200 mM KH2PO4 pH 76
Ofentemperatur 40 degC
Flussrate und Injektionsvolumensind den Saumlulendimensionen ange-passt
Ergebnisse
Die Messergebnisse des Tanaka-Tests zeigen interessante Unter -
wie die GIST C18 Sie wird fuumlrschnelle Trennungen verwendetund ist ideal fuumlr LC-MS-Applika -tionen geeignet Die GISS hat mit20 nm die groumlszligte Porengroumlszlige imShim-pack Sortiment und ist da -her auch die ideale Wahl fuumlr grouml-szligere Analyten mit Molekularge -wich ten bis zu 20000 Da
Die GIS RP-Shield Saumlule hat einepolare funktionelle Gruppe diezwischen der Siliziumdioxid-Oberflaumlche und den C18-Gruppeneingebettet ist Dadurch ist sieauch unter 100 waumlssrigen Kon -ditionen stabil Die polare funk-tionelle Gruppe ist basen-deakti-viert somit bekommen vor allemsaure Analyten eine gute Peak -form Es ergibt sich also eineschwache Wechselwirkung zu ba -sischen Analyten und eine starkeWechselwirkung zu sauren Analy -ten Durch die zusaumltzliche Wech -sel wirkung von Wasserstoff bruumlck -
Durch den Metallgehalt gibt dieSaumlule Kationenaustauscheffektewas basische Substanzen staumlrkerretardiert Die Saumlule eignet sichsehr gut fuumlr die Analyse von was-serloumlslichen Vitaminen und basi-schen Komponenten
Die GIST C18-Saumlule weist einehohe Inertheit auf Sogar ionischeKomponenten koumlnnen mit sym-metrischen Peaks und hoher Re -pro duzierbarkeit gemessen wer-den
Verglichen mit konventionellenC18-Saumlulen zeigt die GIST C18-AQ Saumlule eine sehr gute Retentiongegenuumlber hydrophilen polarenAnalyten Auszligerdem kann mansie mit 100 waumlssriger mobilerPhase verwenden ohne dass einVerlust von Retention auftritt
Die GISS C18-Saumlule hat die gleicheInertheit sowie Stabilitaumltsbereich
22 SHIMADZU NEWS 22018
K PB
K Pentylbenzol
CH2
TO
k Triphenylen o-terphenyl
CP
k Koffein Phenol
k Benzylamin Phenol pH 76
k Benzylamin Phenol pH 23
Retentionskapazitaumlt
Hydrophobizitaumlt
Sterische Selektivitaumlt
Silanolwechselwirkungen
(Wasserstoff bruumlckenbindungen)
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 76
(Restsilanol pH 76) Anzahl der freien
Silanolgruppen auf der Saumlule
Ionenaustauschkapazitaumlt pH 23
(Restsilanol pH 23) Anzahl der sauren
Silanolgruppen auf der Saumlule
Menge Dichte der Alkylketten bzw
Kohlenstoffgehalt Oberflaumlche
Oberflaumlchenbedeckung Je kleiner der
Wert desto weniger Hydrophobizitaumlt
Endcapping wenn das Endcapping
nicht gut ist viele freie Silanolgruppen
oder polare Gruppen vorhanden sind
ist der Wert hoch
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt
bei pH 76 wider
Ein hoher Wert spiegelt eine
hohe Ionenaustauschkapazitaumlt bei
pH 23 wider
Tanaka Parameter Saumlulen Charakteristik Erklaumlrung
Tabelle 1 Auflistung und Erklaumlrung der einzelnen Tanaka-Parameter
Shim-Pack LC-Saumlulen von Shimadzu
N =L
H= 555
tR
Wh
2( )
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
Windows ist Warenzeichen der MicrosoftCorporation copy2018 Apple Inc Alle Rechtevorbehalten Apple das Apple Logo Macund Mac OS sind Warenzeichen von Apple
AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
23SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
schiede zwischen den verschiede-nen C18-Saumlulen im Shim-pack Sor -ti ment Als Beispiele werden inAbbildung 2 (Seite 21) die amstaumlrksten von einander abweichen-den Werte verglichen (siehe auchTabel le 1)
Der k PB Wert zeigt die Reten -tionskapazitaumlt der Saumlule fuumlr unpo-lare Substanzen Saumlulen die gerin-ge Retentionszeiten fuumlr Amyl ben -zene liefern haben kleine WerteFuumlr schnelle Analysen bietet sichin dem Fall die GISS-Saumlule anbenoumltigt man eine Saumlule mit hoherRetention ist die XR-ODS IIIeine gute Wahl
Der CH2 Parameter macht eineAussage uumlber die Hydrophobi zi taumltund Selektivitaumlt fuumlr Substanzeneiner homologen Reihe die sichwie die Testsubstanzen nur durchAnzahl an C-Kettengliedern un -terscheiden Auch hier zeigt diehydrophobe XR-ODS III Phaseeinen hohen Wert Die RP-Shieldhingegen mit der eingebettetenpolaren Gruppe weist deutlichweniger Retention und Selektivitaumltfuumlr die unpolaren Testsubstanzenauf der erhaltene Wert fuumlr CH2ist deutlich geringer
Der naumlchste Parameter TOverdeutlicht die Faumlhigkeit derSaumlule planare und nicht-planareMolekuumlle voneinander zu trennen(sterische Selektivitaumlt) Die C18-P-Saumlule ist also sehr gut um struk-turaumlhnliche Analyten zu trennendie sich nur in ihrer raumlumlichenAnordnung unterscheiden
Silanolwechselwirkungen also dieFaumlhigkeit der Saumlule Wasserstoff -bruumlckenbindungen einzugehen
werden durch den CP Wertbeschrieben Es laumlsst sich dadurchauch eine Aussage uumlber die Quali -taumlt des Endcapping treffen DieserWert ist mit Vorsicht zu genieszligenda hier die RP-Shield einen sehrgeringen Wert zeigt obwohl sieeine polare Gruppe enthaumllt Dieseeingebettete Funktionalitaumlt besitztjedoch die entgegengesetzte Pola -ritaumlt der Silanolgruppen ndash daherder reduzierte CP Wert
Die letzten beiden Parameter spie-geln die Ionenaustauschkapazitaumltder Saumlule bei pH 76 bzw pH 23wider also in einer mobilen Phasemit pH uumlber und unter dem pKader Silanolgrup pen bei dem Ioni -sierung zu O- einmal gefoumlrdert(pH 76) und einmal unterdruumlckt(pH 23) wird Hier zeigt dieMAqC-ODS die mit enthaltenem
Metall deutlich saure Gruppenenthaumllt auch bei pH 76 Kationen -austauscheffekte
Fazit
Die Auswahl einer passenden C18-LC-Saumlule ist eine anspruchsvolleAufgabe Es gibt sehr viele ver-schiedene C18-Typen und dieseunterscheiden sich teilweise starkin ihren Trenneigenschaften DieKlas sifizierung nach den Parame -tern des Tanaka-Testprotokollskann eine Hilfe sein die richtigeWahl zu treffen
Literatur[1] K Kimata K Iwaguchi S Onishi
K Jinno R Eksteen K Hosoya
M Araki N Tanaka J Chromatogr Sci
27 (1989) 721
[2] H Engelhardt H Low W Gotzinger
J Chromatogr A 544 (1991) 371
[3] D V McCalley J Chromatogr A 636
(1993) 213
[4] httpwwwacdlabscomresourcesfree
warecolsel
Tabelle 2 Auflistung wichtiger Saumlulenspezifikationen mit deren Auswirkung auf die Trennung und einem Saumlulenbeispiel aus dem
Shim-pack Sortiment
Kohlenstoffbeladung
Kohlenstoffbeladung
Oberflaumlche
Oberflaumlche
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Porengroumlszlige
Reines Kieselsaumluregel
Hohe Werte
Kleine Werte
Hohe Werte
Kleine Werte
Bis ca 10 nm
Bis ca 20 nm
30 nm und mehr
Alle modernen neuen
Viele alte
Hohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenHohe Retention fuumlr unpolare AnalytenGeringe Retention fuumlr unpolare AnalytenBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu ca 5000 DaBenutzbar fuumlr Molekuumlle bis zu 20000 DaGute Peakform fuumlrMakromolekuumlle (Peptide und Proteine)Bessere Peakform fuumlr basische AnalytenSchlechte Peakform fuumlr basische Analyten durch viele Wechselwirkungen
XR-ODS III
GISS
XR-ODS III
GISS
Alle Shim-pack Saumlulen (auszliger GISS)GISS
Nicht im Shim-pack Sortiment vorhanden
Beispiel Saumlule
IMPRESSUMShimadzu NEWS Kundenzeitschrift der Shimadzu Europa GmbH Duisburg
HerausgeberShimadzu Europa GmbHAlbert-Hahn-Str 6 -10 middot D-47269 DuisburgTelefon +49 (0)203 76 87-0Telefax +49 (0)203 76 66 25shimadzushimadzueuwwwshimadzueu
RedaktionUta SteegerTelefon +49 (0)203 76 87-410 Ralf Weber Maximilian Schulze
Gestaltung und Produktionme brand communication GmbH GWADuumlsseldorf
Auflage Deutsch 5650 middot Englisch 4340
copyCopyrightShimadzu Europa GmbH Duisburg Juli 2018 Nachdruck auch auszugs weisenur mit Geneh migung der Redaktion gestattet
Windows ist Warenzeichen der MicrosoftCorporation copy2018 Apple Inc Alle Rechtevorbehalten Apple das Apple Logo Macund Mac OS sind Warenzeichen von Apple
AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
AKTUELLES
24 SHIMADZU NEWS 22018
Die Zukunft der Massen-spek tro metrie fuumlr das toxikologischeScreeningDas European Innovation Center ndash Interview mit Prof Saint-MarcouxUniversitaumltsklinik Limoges Frankreich
D er Toxikologe Prof FranckSaint-Marcoux (Dr derPharmazie) vertritt die
Position eines Universitaumltsprofes -sors fuumlr Toxikologie und leitet denFachbereich Klinische und Foren -sische Toxikologie des Institutsfuumlr Pharmakologie und Toxikolo -gie an der UniversitaumltsklinikLimoges (Frankreich) Er hateinen Masterabschluss in analyti-scher Chemie einen Masterab -schluss in weiterfuumlhrenden Stu -dien der Pharmazie und hat 2004promoviert auf dem Gebiet derpharmakokinetischen Modellie -rung Er ist Autor oder Co-Autorvon mehr als 70 Veroumlffentli chun -gen in internationalen Referenz -magazinen (peer-reviewed jour-nals) und war bisher an etwa 50Tagungen und internationalenVer anstaltungen beteiligt
Seit April 2017 arbeitet er als Ex -perte fuumlr klinische Anwendungenmit dem European InnovationCenter von Shimadzu um Metho -den und Tools zu entwickeln dieTandem-LC-MS in der Toxikolo -gie umzusetzen
Prof Saint-Marcoux wuumlrden Siekurz Ihre Forschung skizzierenWas ist der derzeitige Stand derTechnik
Wir arbeiten im Labor an Fragenzur klinischen und forensischenToxikologie Das umfasst zB ver-sehentliche Belastun gen durchPharmaka oder toxische Verbin -dungen Selbst-Vergiftun gen Ver -dacht auf Uumlberdosierung Uumlber-wachung von Suchtkranken Fah -ren unter Drogeneinfluss (DUID)oder Dopingkontrollen In jederSituation ist es die Aufga be des
mit Hilfe eines LCMS-8060Triple-Quadrupol-Massenspek tro -meters
In einem ersten Ansatz wurdeeine Spektraldatenbank fuumlr dieLC-MSMS-Plattformen vonShimadzu entwickelt Sie enthaumlltuumlber 8000 MRM-Uumlbergaumlnge fuumlr1280 zertifizierte Referenzstan -dards (einschlieszliglich 37 deuterier-te interne Standardverbindungen)mit 6084 registrierten Spektrenim positiven und negativen Mo -dus Diese Bibliothek nutzt dieProdukt-Ionen-Spektren die sichfuumlr die Routinesuche und denNachweis von chemischen Ver bin -dungen mit Treffern in der Refe -renzbibliothek nutzen lassen
Neu an dem Ansatz ist die Erfas -sungsmethode von Spektren diedie bdquoRekonstruktionldquo eines Spek -trums erlaubt das alle spezifi-schen Uumlbergaumlnge eines Molekuumllsenthaumllt Es handelt sich um einensogenannten bdquoMRM-Spektrum-Modusldquo Im Gegensatz zu anderenbisher publizierten Ansaumltzenwobei methodisch alle Molekuumllezwei oder drei Kollisionsenergienmit Hilfe des Produkt-Ionen-Scan nings ausgesetzt werdenhaben wir die Kollisionsenergiefuumlr bis zu 15 Uumlbergaumlnge in einemMole kuumll optimiert Dieser Ansatzmacht es moumlglich aumluszligerst spezifi-sche und reiche Spektralinforma -tionen zu erhalten
Zur Zeit verfolgen wir ein For -schungsprojekt zur Bewertung derquantitativen Leistungsfaumlhigkeitendes auf dieser Bibliothek beruhen-den Screening-Verfahrens Etwaspraumlziser Wir entwickeln eine Me -thode fuumlr die am haumlufigsten uumlber-
neue illegale Drogen zu untersu-chen Dies erklaumlrt warum wir lau-fend Forschungsarbeiten durch-fuumlhren um relevante modernepraktische und effiziente Analyse -verfahren zu entwickeln haupt-saumlchlich unter Einsatz von LC-MSoder GC-MS
Koumlnnen Sie die Forschungbeschreiben die Sie mit demEuropean Innovation Center von Shimadzu betreiben
Ganz allgemein entwickeln wir inder Kooperation neuartige Analy -semethoden fuumlr die ToxikologieSeit Beginn unserer Zusammen -arbeit fokussieren wir die Ent -wick lung von Screening-Ablaumlufen
Toxikologen Fremdstoffe bzwXenobiotika eindeutig zu identifi-zieren (auch wenn Hinwei se dazufehlen) toxikologisch hohe Kon -zentrationen zu messen oder sehrniedrige Nachweisgren zen zu er -zielen und quantitative Ergebnis -se zu liefern Meist muss dies rundum die Uhr mit einer schnellenProbenanalyse moumlglich sein
Jedoch verschieben sich die Zielestaumlndig Es gibt immer neue Arz -neimittel fuumlr die eine therapeuti-sche Medikamentenuumlberwachungnotwendig ist Dies bedeutet dasseine individuelle Dosiseinstellungbasierend auf der Medikamenten -spiegelbestimmung im Blut erfol-gen kann Es gibt auch staumlndig
Prof Saint-Marcoux Universitatsklinik Limoges Frankreich
AKTUELLES
25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
0
00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
0
[]
2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
[]
mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
00
100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
00
0
100
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
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25SHIMADZU NEWS 22018
wachten Wirkstoffe eingeschlos-sen Antidepressiva Anxio lytikaDrogen Analgetika sowie Anti -psychotika und testen ihre Leis -tungsfaumlhigkeiten fuumlr infrathera-peutische therapeutische undtoxische Konzentrationen in ei -nem quantitativen Ansatz ErsteErgebnisse sind vielversprechendund wir stellen bald ein erstesVerfahren vor
Unterdessen entwickeln wir voll-automatische Extraktionsmetho -den die vom programmierbarenProbenvorbereitungssystemCLAM-2000 direkt an einLCMS-8060-System angekoppeltdurchgefuumlhrt werden Das ersteVerfahren wurde fuumlr die Bestim -mung von 42 Amphetaminen Ko -kain und Opiate entwickelt DieseArbeiten sind kuumlrzlich zur Veroumlf -fentlichung eingereicht worden
Warum sind Sie an diesemForschungsthema interessiertWorin besteht das Ziel Warumist es wichtig
Das Screening ist der erste Schrittim Analyseablauf wenn die Artoder die Gegenwart eines Wirk -stoffs vollstaumlndig unbekannt istwas in der klinischen und forensi-schen Toxikologie oft der Fall istGewoumlhnlich geht das Screeningeiner spezifischen Analyse vorausdie eine Quantifizierung der detek -tierten Verbindung erlaubt Erwar -tet werden Verfahren die Detek -tion sowie Quantifizierung ermoumlg -lichen
Zusaumltzlich eliminieren automati-sierte Prozessschritte eventuelletechnische Fehler in der Vorbe rei -tung Zudem sparen sie Laborzeitweil die Mitarbeiter andere Taumltig -keiten durchfuumlhren koumlnnen waumlh-rend das System automatisch laumluft
Auf welche Weise helfen dieGeraumlte von Shimadzu bei IhrerForschung
Das LCMS-8060 ist ein leistungs-faumlhiges Laborsystem WelcheAnwen dung wir auch bisher ent-wickelt haben Verglichen mitkonventionellen 2 MRM pro Ver -bindung haben wir keinen Verlustder Empfindlichkeit durch dieDatenerfassung im MRM-Spek -trum-Modus festgestellt Beispiels -weise bei der Methode zur Bestim -
mung illegaler Drogen betrug dieVerweilzeit und die Pausenzeit fuumlrdie Datenerfassung typischerweise3 ms und 1 ms was bedeutet dassdie maximale Zeit einer Proben -schleife weniger als 1 Sekunde be -traumlgt sogar im intensivsten Bereichder uumlberlappenden Substanz-Elution Zum jetzigen Zeitpunktlassen sich 220 MRM gleichzeitigmessen wobei im Durchschnittimmer noch 20 Datenpunkte uumlbereinen Peak gemessen werden
Ein CLAM-2000 ist das ersteSystem das Verfahren ohnemenschlichen Eingriff ermoumlglichtsobald das Primaumlrroumlhrchen einge-fuumlhrt wird Die Probenaufberei -tung wird mit dem LC-MSMS-System synchronisiert wobei keinZeitverlust eintritt waumlhrend dieFaumlhigkeit der Online-Probenauf -bereitung und der direkten Injek -tion sofort nach der Probenauf -bereitung erhalten bleibt
Worin sehen Sie die Staumlrken von Shimadzu verglichen mitanderen Anbietern und zwarnicht auf die Geraumlte beschraumlnkt
Mit dem European InnovationCenter war Shimadzu das ersteUnternehmen das uns eine direk-te und effektive Zusammenarbeitvorgeschlagen hat Dies ist einespannende und eine bdquoWin-Winldquo-Partnerschaft
Alle Arbeiten werden betreut vomInstitut fuumlr Pharmakologie undToxikologie des Universitaumlts kli -nikums Limoges sowie vonShimadzu namentlich SteacutephaneMoreau vom Standort DuisburgDeutschland und Alban Huteauaus dem franzoumlsischen Marne-la-Valleacutee Der uumlberseeische Ge -schaumlftsbereich Massenspektro -metrie der Shimadzu Corporation
mit Neil Loftus und Alan Barnesist ebenfalls mit groszligem Enga ge -ment an diesen Entwicklungenbeteiligt Ein wichtiger Punktbesteht darin dass wir mit Tipha -ine Robin eine Promotions studen -tin haben die sich diesem Projektvollstaumlndig widmet
Haben Sie Wuumlnsche oder Anfor -derungen an Shimadzu hinsicht-lich Unterstuumltzung oder Tech -no logie die helfen wuumlrden IhreVerfahren oder Forschung zuverbessern auch wenn dieseWuumlnsche zur Zeit schwer zuerfuumlllen waumlren
Wir haben verschiedene Projekteim Sinn etwa die Entwicklungvon analytischen Methoden ineinem anstehenden Q-TOF-System oder die Entwicklung vonanalytischen Methoden basierendauf Microsampling Wing DevicesBedauerlicherweise benoumltigen wirmehr Personal Eine potenzielleLoumlsung wuumlrde darin besteheneinen zweiten Promotionsstuden -ten mit Shimadzu zu teilen
Wagen wir einen Blick in dieZukunft Was wird auf den klini-schen und forensischen Gebie -ten passieren und wie wird dasdie Analysegeraumlte in 10 Jahrenbeeinflussen etwa die KlinischeMS und klinische Verfahren
In naher Zukunft werden wir aufzahlreiche Herausforderungen beiden pre-analytischen analytischenund post-analytischen Schrittenstoszligen
Erstens Instrumente die wenigerinvasiv als die uumlblichen Blutpro -ben sind oder die es Patientenerlauben selbst Proben zu neh-men werden mehr und mehr inden Vordergrund ruumlcken Diesbeinhaltet dass wir mehr undmehr neuen Probenarten begeg-nen Trockenblutproben Speichel -
proben oder Mikrovolumina anBlut Derzeit bestehen Blutprobengewoumlhnlich aus nicht weniger als50 bis 100 microl Wenn wir erwartendass moderne Beprobungsstrate -gien gezielt zu Proben von weni-ger als 5 microl fuumlhren werden koumln-nen Sie sich die Empfindlichkeits -zunahme vorstellen die wir benouml-tigen
Zweitens mehr und mehr Medi -kamente werden der bdquopersonali-siertenrdquo oder bdquozielgerichtetenrdquoMedizin angehoumlren Dies wirdeine Entwicklung von verfeinertenAnalyseverfahren nach sich zie-hen wie die bdquoNano-Surface andMolecular Orientation Limitedldquo(nSMOL) Methode die Shimadzufuumlr die Messung von Therapeutikaauf Basis monoklonaler Antikoumlr -per entwickelt hat
Wir muumlssen auch an hocheffizien-te Labore denken die hinsichtlichProbenaufbereitung noch nutzer-freundlicher werden und den Ar -beitsaufwand minimieren Dabeiwird ein CLAM-2000 sehr hilf-reich sein Ein System muss auchflexibel genug sein viele Proben -arten zu bearbeiten Ich moumlchtedies mit Trockenblut proben oderMikroroumlhrchen um setzen undwuumlnsche mir andersartige Extrak -tionsverfahren
Sehr oft wird die Zeit die derBearbeitung und Pruumlfung vonDaten gewidmet wird nichtberuumlcksichtigt obwohl es einKernpunkt ist Man kann nichtirgendein Labor mit hohemDurchsatz in ein Effizienz-Labortransformieren wenn Sie keineSoftware haben die Ihnen hilftschnell Ergebnisse zu liefern Inmeinem Labor sehe ich dass wirdie meiste Zeit feinjustierte Me -thoden mit automatischen Extra -ktionsverfahren und extrem kur-zen Analyselaumlufen anwenden aberdennoch Stunde um Stunde auf-wenden um die Daten zu pruumlfenSind die Eichkurven ok Sind dieBereiche der internen Standardsok Sind alle Peaks gut integriertSind die internen Qualitaumltskon -trollen ok Wir benoumltigen defini-tiv Hilfsmittel die automatischdiese Fragen beantworten und unssicher die Analysen fahren lassengenauso wie neue Automobile unssicher auf der Autobahn fahrenlassenCLAM-2000
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
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00
30
100
00 01 02 03 04 05 06 07
3080 3100 3120 3140 3160 3180 3200mz
08 09
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Inte
n (x10
0)
Zeit [min]
Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
320
2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
0
100
00 50 100 150 200 250 300 350 400
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
[
]
Zeit [min]
Stationaumlre Phase C18A ndash 01 HCOOH w H2OB ndash 01 HCOOH w ACNO ndash 80 B w A
1 TIC(+) CE -450
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
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2+
7433
1+
3081
1+
30911+
3131
1+
3121
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mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
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]
mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
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tens
itaumlt
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Inte
nsit
aumlt
A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
daute Proteine Die derivatisiertenPeptide erzeugen protonierte 246-Triphenylpyridinium-Ionen inausreichender Menge im Ver laufder CID-Fragmentierung (collisi-on induced dissociation) die sichdurch die Verwendung eines selek -tiven Modus als nuumltzlich erwiesenhat wie zB MRM oder einPrecursor-Ionenscan
Das Forschungsteam schlug aucheine neue Methode zur Gewin -nung isobarer Peptide vor durchKombination von 18O-Enzym -markierung und Modifizierungvon Peptiden durch 12C- und 13C-Isotopologen der 246-Triphenyl -pyryliumsalzen Diese Kombina -tion fuumlhrt zur Bildung von isoba-ren Duplexen Das nachfolgendeFragmentierungsexperiment fuumlhrtzur Bildung von Referenzionendie sich um 4 Da unterscheidenIhr Vergleich dient der quantitati-ven Bewertung der Peptide in Ver -gleichsproben
Derzeit wird dieser Ansatz anechten Urinproben getestet DasUntersuchungsziel besteht in derEntwicklung einer Methode dieeinen fruumlhen Nachweis einesPraumlclampsiezustands (PE) basie-rend auf tryptischen Podocin-Fragmenten erlaubt die als PE-Biomarker anerkannt sind Bei PEhandelt es sich um eine multipleFunktionsstoumlrung die noch im -mer als eine Hauptursache vonMuumltter- und Neugeborenen sterb -lichkeits und -erkrankungsrate gilt
LC-MS-Analyse
Die LC-MS von derivatisiertemtryptisch abgebauten Rinder -serum albumin (BSA) wurde miteinem LCMS-8050 Triple-Qua -dru pol-Massenspektrometer vonShimadzu durchgefuumlhrt Fuumlr dasExperiment im Precursor-Ionen -modus waumlhlten die Forscher dasIonenfragment mit mz 3082 beieiner Kollisionsenergie von 45 eVdas ein protoniertes 246-Triphe -nylpyridinium-Kation darstelltDasselbe LC-MS-Massenspektro -meter wurde fuumlr die Analyse derisobarischen Peptidmodelle (Du -plex) im MRM-Modus als auchbeim Q1Q3-Scan eingesetzt
APPLIKATION
P rotein- und Peptiduntersu-chungen sind unerlaumlsslichfuumlr das Verstaumlndnis vieler
biologischer Ablaumlufe auf dermolekularen Ebene Die Tandem-Massenspektrometrie (MSMS) istdie bevorzugte Methode fuumlr quali-tative und quantitative Protein-und Peptidanalysen geworden ndashaufgrund ihrer hohen Empfind -lich keit Genauigkeit und Eignungzur Analyse komplexer Mischun -gen Allerdings kann die Analysevon Peptiden in geringen Konzen -trationen problematisch werdenwegen nicht ausreichender Ionisa -tionseffizienz einiger PeptideEiner der Wege dieses Problemzu umgehen ist das Einbringeneines Ionisationsverstaumlrkers insAnalysemolekuumll Eine Arbeits -grup pe an der polnischen Univer -sitaumlt Breslau entwickelte einenneuen auf einem 246-Triphenyl -pyridinium-Rest basierendenIonisationsmarker wodurch eineLC-MS-Analyse von Peptiden aufAttomol-Niveau mit Hilfe desMRM-Modus (multiple reactionmonitoring) ermoumlglicht wird
haben den Einsatz von 246-Tri -phenylpyryliumsalzen fuumlr diePeptid-Derivatisierung vorge-schlagen [2]
Pyryliumsalze reagieren leicht mitsterisch ungehinderten primaumlrenAminen zu geladenen Pyridinium -salzen Diese Reaktion erweist sichinsbesondere selektiv gegenuumlberder -Aminogruppe des LysinsDaher wurden die 246-Triphe nyl -pyryliumsalze fuumlr die Derivatisie -rung synthetischer Peptide ebensoeingesetzt wie fuumlr tryptisch ver-
basischste Aminosaumlure Argininenthalten die staumlrksten Signale auf[1]
Eine Methode die Ionisationsef fi -zienz eines Peptides ohne Argininzu steigern ist das Einbringen ei -ner festen Ladungsgruppe in daszu analysierende Molekuumll DieForscher der Universitaumlt Breslau
Einfuumlhrung
Aufgrund einer nicht-ausreichen-den Ionisationseffizienz sichertdie Massenspektrometrie nichtimmer eine erfolgreiche Analysevon niedrig abundanten Peptidenworaus eine begrenzte Analyse -empfindlichkeit resultiert
Die Protonenaffinitaumlt des Peptid -mole kuumlls die Ionisationseffizienzist der die Ionisationsausbeutebeeinflussende SchluumlsselparameterDaher weisen Peptide welche die
26 SHIMADZU NEWS 22018
Derivatisierung mitPyryliumsalzenHoumlhere Empfindlichkeit bei Peptidanalysen mit LC-MSMS
Abbildung 1 Reaktion von 246-trisubstituierten Pyryliumsalzen mit Peptiden
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Bestimmungsgrenze ndash 1 Attomol (1 x 10-18)
Injektion ndash 1 microl
TPP+-Gly-Leu-OH (+) CE -41
308
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2 MRM transitions 47920 gt 30820 i 47920 gt 320
Abbildung 2 MS-Spektrum das fuumlr ein Attomol des derivatisierten Dipeptids
TPP+-Gly-Leu-OH mit dem LCMS-8050 von Shimadzu erhalten wurde
Abbildung 3 LC-MS-Analyse von tryptisch verdautem derivatisiertem BSA die mit
dem Precursor-Ionen-Scanmodus durchgefuumlhrt wurde
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APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
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2+
7433
1+
3081
1+
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3131
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mz
MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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100
100
3075
00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 min
3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Rel
ativ
e In
tens
itaumlt
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mz
mz
Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
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Inte
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A
B
Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
APPLIKATION
28
IMSC
Florenz Italien26 - 31082018wwwimsc2018it
TIAFT
Gent Belgien26 - 30082018wwwtiaft2018org
Dioxin
Krakau Polen26 - 31082018wwwdioxin2018org
MSACL
Salzburg Oumlsterreich09 - 13092018wwwmsaclorg
ISC
Cannes - MandelieuFrankreich23 - 27092018wwwisc2018fr
SFC
Straszligburg Frankreich17 - 19102018wwwgreenchemistrygrouporg
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-Amino grup pe des Lysins Da -ruuml ber hinaus benoumltigt die Pyryli -um-Salz reaktion keine aktivenGruppen mit geringer Sta bilitaumlt inwaumlssrigen Loumlsungen Eine geeig-nete Kombination im 16O 18O-Aus tausch und eine Derivati sie -rung mit 246-Triphe nylpyryli -um salzen oder seinen 13C4 Isoto -po lo gen ermoumlglicht die Erzeu -gung isobarischer Pep tide DerIntensi taumlts vergleich des Sig nalsder aus den isobarischen Pep tiden
Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
ShimadzuEurope
27SHIMADZU NEWS 22018
APPLIKATION
zwei schweren Sauerstoffatomenin die Carboxylgruppe des Lysinszur Folge hat Mit diesem Ansatzsind einige Unwaumlgbarkeiten ver-bunden zB ein Back-Exchange-Effekt oder eine Uumlberlagerungisotopischer Peaks Das For -schungs team schlug eine Modifi -ka tion dieses Ansatzes durchzusaumltzliche Nutzung von 246-Triphenylpyryliumsalzen vor
Eine Probe wird in H218O undunmarkiertem 246-Triphenyl py -ryliumsalz verdaut eine andereProbe dagegen in unmarkiertemH2O und markiertem 246-Tri -phe nylpyryliumsalz (Abbildung4) Danach werden die Probenzusammengefuumlhrt und zusammenanalysiert Durch Fragmentierungder Ionen die den isobarischenPeptiden entsprechen entstehenReferenzionen mit einem Mas sen -unterschied von 4 Da (markiertesund unmarkiertes 246-Triphe -nylpyridinium) Ihr Intensitaumlts -ver gleich erlaubt die Bestimmungder relativen Peptidkonzentrationin den zwei Proben Daher bestehtkein Risiko der Uumlberlagerung iso-topischer Peaks Daruumlber hinauswurde kein Back-Exchange-Effektbeobachtet da das Pyridinium-modifizierte Lysin nicht vomEnzym erkannt wird
Die Analyse von Peptiden imMultiple-Reaction-Monitoring(MRM)-Modus ermoumlglicht einenPeptidnachweis mit hoher Emp -findlichkeit Dies resultiert ausdem verbesserten Signal-Rausch-Verhaumlltnis Daher wurde die
Die Trennung wurde durchgefuumlhrtauf einer RP-Aeris Peptide (50 x21 mm 35 microm)-Saumlule mit einerGradientenelution von 5 - 60 Bin A (A 01 HCOOH inWasser B 01 HCOOH inMeCN) bei Raumtemperatur uumlbereine Dauer von 45 min fuumlr verdau -tes BSA (Flussrate 01 ml min-1)und 15 min fuumlr die isobarischenPeptidmodelle (Flussrate 02 mlmin-1) Die Proben wurden in 400 microl einer Wasser-Acetonitril-Mischung geloumlst
Derivatisierungsverfahren
Eine Probe wurde in Dimethyl -for mamid (DMF) geloumlst und an -schlieszligend der dreifache Uumlber-schuss an 246-Tripheylpyrylium -salz und der gleiche Uumlberschussvon Triethylamin (TEA) zugege-ben Die resultierende Mischungwurde gevortext und bei 70 degC fuumlr20 min inkubiert Zuletzt wurdedas Loumlsungsmittel im Stickstoff -strom verdampft und lyophilisiert
Ergebnisse
Nachweisgrenze
Das derivatisierte Dipeptid H-Gly-Leu-OH diente zur Uumlberpruuml-fung der analytischen Nachweis -grenze Der selektive MRM-Moduswurde fuumlr diesen Zweck angewen-det und fuumlr das untersuchte Dipep -tid konnte eine Nachweisgrenzevon 1 Attomol gezeigt werden(Abbildung 2)
Analyse von tryptisch verdautem BSA
Zur Analyse von derivatisiertemBSA-Precursor wurde der Ionen -scanmodus genutzt Das proto-nierte 246-Triphenylpyridinium-Kation von 308 mz bei 45 eVKollisionsenergie wurde als Test-Ion gewaumlhlt Dadurch wurdenausschlieszliglich solche Peptidebeobachtet die Ionisationsmarkerenthielten (Abbildung 3)
246-Triphenylpyridiniumsalz-basierte isobarische Peptide(Duplex)
Ein 16O18O-Austausch wird inder vergleichenden Proteomikhaumlufig eingesetzt Der tryptischeProteinverdau wurde in H218Odurchgefuumlhrt was den Einbau von
Analyse der isobarischen Peptid -modelle (Ac-Leu-Val-Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH66-75 BSA-Fragment) mit Hilfedes MRM-Modus durchgefuumlhrtDas Forschungsteam nutzte diediagnostischen Referenzionen(mz 308 und 312) fuumlr die MRM-Uumlbergaumlnge Die Analyseergebnissesind in Abbildung 5 dargestellt
Ein Full-Scan-Spektrum der iso-barischen Peptidmodelle wird imoberen Teil der Abbildung ge -zeigt Der deutliche Peak bei mz743 entspricht dem Duplex In
diesem Experiment wurden zweiaumlquimolare Mengen analysiert undsomit zwei diagnostische Peaksmit vergleichbarer Intensitaumlt be -obachtet Das Vorhandensein von246-Triphenylpyridinium-Antei -len in Peptiden steigert die Ionen -effizienz Die Analyse modifizier-ter isobarischer Peptide im MRM-Modus koumlnnte daher eine betraumlcht -lich verbesserte Nachweisgrenzezum Ergebnis haben
Echte ProbenanalyseDie synthetisierten isotopischmarkierten und unmarkierten246-Triphenylpyryliumsalzewurden zur Analyse eines trypti-schen Podocin-Abbaus verwendetwelches aus dem Urin vonSchwangeren stammt Der analy-sierte Urin stammt aus unter-schiedlichen PE-Stadien Eineschematische Darstellung findetsich in Abbildung 6 (Seite 28) DerEinsatz von Pyryliumsalzen er -moumlg licht sowohl eine Steigerungder Ana lyseempfindlichkeit alsauch das Einbringen von stabilenPeptid-Isotopen welche imGegenzug eine LC-MRM-MS-Analytik mit Hilfe der multiplenIsotopenver duumlnnungstechnikermoumlglichen
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MS MSMS
Abbildung 4 Schematische Darstellung des Verfahrens das zur Erzeugung isobarischer
Peptide (Duplex) von zwei Proben fuumlhrt
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3080 3085 3090 3095 3100 3105 3110 3115 3120 3125 3130
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
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Multiple reaction monitoring (MRM)
743 gt 308 mz 35 eV743 gt 312 mz 35 eV
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Abbildung 5 A) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die durch Derivatisierung von Ac-Leu-Val-
Asn-Glu-Val-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys-OH gebildeten isobarischen Peptidmodellen erhalten
wurde B) ESI-MS-Spektrum das fuumlr die isobarischen Peptidmodelle (Duplex) im
MRM-Modus anhand der 743 gt 308 und 743 gt 312 mz-Uumlbergaumlngen erhalten wurde
Der Einschub zeigt ein LC-MS-Chromatogramm das im MRM-Modus erhalten wurde
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Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
Hilfe des Isotopenverduumlnnungsansatzes analysiert
Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
Stefanowicz DSc Zbigniew Szewczuk Prof
Chem Fakultaumlt Universitaumlt Breslau Polen
Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
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APPLIKATION
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Fazit
Ein neuer Ionisationsverstaumlrkerba sie rend auf einem 246-Triphe -nyl py ri dinium-Rest wurde kon-zipiert welche eine hochemp-findliche Peptidanalyse aufAttomol-Niveau mit Hilfe derLC-MS erlaubt Ein groszliger Vor -teil dieses Ionisationsverstaumlrkersbe steht in dem komfortablenDeri vatisie rungs pro zess und derho hen Selek tivitaumlt gegenuumlber der
Abbildung 6 Schematische Darstellung der empfindlichen bdquoShotgunldquo-Proteomics-
Analyse von Urinproteinen die von derselben Patientin bei verschiedenen PE-
Stadien stammen Die aus den Proben isolierten und zu unterschiedlicher Zeit
gesammelten tryptischen Peptide werden mit Hilfe von Ionisationsverstaumlrkern
derivatisiert die mit einer unterschiedlichen Zahl stabiler Isotope markiert sind
Die derivatisierten Proben werden kombiniert und die Aumlnderungen der relativen
Podocin-Konzentrationen und anderer Biomarker werden mit einem LC-MS mit
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Forschungsteam von links nach rechts Piotr Stefanowicz Remigiusz Bąchor
Zbigniew Szewczuk Monika Kijewska Mateusz Waliczek
stammenden Referenz ionenerlaubt eine Quantifizie rung derPeptide Kuumlrz lich wurden Pyridi -niumsalze fuumlr eine LC-MRM-MS-Analyse von Podocin als Biomar -ker des PE-Stadiums zurAnwen -dung gebracht
AutorenMateusz Waliczek Ph D Monika Kijewska
PhD Remigiusz Bąchor PhD Piotr
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Literatur[1] DR Zook H Forsmo-Bruce S Briem
Chromatographi 52 (2000) 60-64
[2] M Waliczek M Kijewska
M Rudowska B Setner P Stefano -
wicz Z Szewczuk Sci Rep 6 (2016)
37720
[3] X Yao C Afonso CJ Fenselau
Proteome Res 2 (2003) 147-152
[4] KCS Rao RT Carruth MJ Miyagi
Proteome Res 4 (2005) 507-514
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