Download - ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA
![Page 1: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/1.jpg)
ELEKTRONSKI MIKROSKOP U ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJA
![Page 2: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/2.jpg)
Matthias Jakob Schleiden Theodor Schwann Rudolf Virchow
ćelijska teorija1838-39.
Početak biologije ćelija
Matthias Jakob Schleiden (1804-1881)
botaničar
Theodor Schwann (1810-1882)
fiziolog, citolog i histolog
Rudolf Virchow (1821-1902)
lekar
1. Svi organizmi se sastoje od jedne ili više ćelija.
2. Ćelije su osnovne strukturne jedinice svih organizama.
3. Ćelija može nastati samo od prethodno postojeće (omnis cellula e cellula) (1858)
- Sva živa bića izgrađena su od ćelija- Ćelija je strukturna i funkcionalna jedinica svih živih bića- Ćelija može nastati samo od prethodno postojeće, deobom. Spontana generacija nije moguća- Ćelije sadrže nasledne informacije koje se prenose sa ćelije na ćeliju tokomdeobe- Sve ćelije u osnovi imaju isti hemijski sastav- Svi metabolički i biohemijski procesi značajni za održavanje života odvijaju se u ćelijama
![Page 3: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/3.jpg)
![Page 4: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/4.jpg)
Razvoj elektronske mikroskopijeu svetu
![Page 5: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/5.jpg)
1929. Ruska publikuje prvi naučni rad koji se bavi uticajem magnetnog polja na kretanje elektrona
1931. Ruska i Knoll konstruišu prvi elektronski mikroskop kojije uveličavao samo 17 x.
1933. Prvi put se pomoću elektronskog mikroskopa dobija boljadefinicija objekata nego pomoću svetlosnog mikroskopa, uz uveličanje od 12 000 x (E. Ruska, doktorska teza)
Ernst Ruska(1906-1988)
Max Knoll(1897–1969)
Helmut Ruska(1908-1973)
![Page 6: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/6.jpg)
Ernst RuskaThe development of the electron microscope and of electron microscopyNobel lecture, December 1986.Nobel lecture, December 1986.
![Page 7: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/7.jpg)
1939. Isporučen prvi serijski proizvedeni mikroskop Siemens Super Microscope, uveličavao do 30 000 x.
![Page 8: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/8.jpg)
Porter, Claude and Fullam: A study of tissue culture cells by electron microscopy. Journal of Experimental Medicine, March 1945.
Fibroblast embriona pileta gajen u kulturi, fiksiran u OsO4, ispran i osušen; uveličanje 1600 x.
![Page 9: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/9.jpg)
1948. Pease i Baker razvijaju metod pravljenja preseka biološkog materijala debljine 0.1-0.2 µm
1952. Palade, Porter i Sjöstrand usavršavaju postupak fiksiranja i sečenja biološkog materijala
1956. Glauert i saradnici uvode Araldite kao medijum za kalupljenje
1963. Sabatini, Bensch i Barrnett uvode glutar-aldehid, praćen 1963. Sabatini, Bensch i Barrnett uvode glutar-aldehid, praćen OsO4, kao metod fiksacije
kasnije se uvode i usavršavaju tehnike za trodimenzionalnu rekonstrukciju objekata viđenih elektronskim mikroskopom ifiksiranje materijala zamrzavanjem
![Page 10: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/10.jpg)
30
![Page 11: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/11.jpg)
Srčana muskulatura - miš Interkalarni disk
Kontraktilni filamenti
![Page 12: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/12.jpg)
Dobitnici Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu 1974. godine
George Emil Palade(1912-2008)
Albert Claude(1899-1983)
Christian de Duve(1917-2013)
![Page 13: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/13.jpg)
Razvoj elektronske mikroskopijekod nas
![Page 14: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/14.jpg)
1954. Prvi jugoslovenski model elektronskog mikroskopa –diplomski rad Nedeljka Košute iz Zagreba
“Iskra” iz Kranja je kratko vreme bila važan domaći proizvođač elektronskih mikroskopa
1956-58. U Beogradu počinje sa radom Univerzitetska laboratorija za elektronsku mikroskopiju, u prostorijama Medicinskog fakulteta
Prvi EM proizveden u našoj zemlji –LEM “Iskra” Kranj
![Page 15: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/15.jpg)
1962. Na kongresu u Pragu predstavljena prva elektronska mikrografija maligne ćelije
1979. Osnovano Društvo za elektronsku mikroskopiju Srbije
Srbija ima oko 20 laboratorija za elektronsku mikroskopiju i preko 20 elektronskih mikroskopa. Centri: Beograd, Novi Sad, Niš
Prvi EM u Srbiji – ELMI – D2, Carl Zeiss, Jena
![Page 16: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/16.jpg)
Elektronski mikroskop –dizajn i primena
Philips CM 12
![Page 17: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/17.jpg)
Transmisioni elektronski mikroskop
Skening elektronski mikroskop
Tipovi elektronskog mikroskopa
Skening elektronski mikroskop
Visokovoltažni elektronski mikroskop
![Page 18: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/18.jpg)
Ljudsko oko 0.2 mmSM 0.2 �mSEM 2.5 nmSM 0.2 �mSEM 2.5 nmTEM – teor. 0.05 nmTEM - prakt. 1 nmAFM 50 pm
![Page 19: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/19.jpg)
Mogućnosti elektronskog mikroskopa u poređenju sa svetlosnim
Biljna ćelija (tkivo korena luka) posmatrana pomoću svetlosnog i elektronskog mikroskopa; uveličanje 1000 x.
![Page 20: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/20.jpg)
Transmission Electron Microscope TEM demo sessionhttps://www.youtube.com/watch?v=zkr3JmhjKbg&list=PLhn3D8Mrx2LIqoO1Z2HzO9qGdhcowwu7Y
![Page 21: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/21.jpg)
Priprema uzoraka za posmatranje pod elektronskim mikroskopom
- fiksacija- fiksacija- ispiranje, dehidratacija i kalupljenje- sečenje- kontrastiranje
![Page 22: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/22.jpg)
� glavni ograničavajući faktor za dobijanje detaljnijih i pouzdanijih informacija je preparacija uzorka
� elektronska mikrografija je slika uzorka izmenjenog preparativnom procedurom
![Page 23: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/23.jpg)
Fiksacija
Cilj fiksacije
Očuvati strukturu ćelije uz minimalne izmene zapremine, morfologije i prostornih odnosaorganela i makromolekulaorganela i makromolekula
Minimalizovati gubitak konstituenata
Maksimalno zaštiti uzorak od budućih postupaka
Jednako očuvati sve konstituente ćelije
![Page 24: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/24.jpg)
Koagulantni i nekoagulantni fiksativi
Koagulantni (neaditivni) fiksativi ETANOLgranularni/retikularni čvrst materijal suspendovan u tečnosti
Nekoagulantni (aditivni) fiksativi GA, FA, OsO4transparentni gel – stabilizacija proteina, lipida
Uticaj na transparentnost citoplazme
Uticaj na zapreminu tkiva –parenhim, stroma, lumeni
![Page 25: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/25.jpg)
Faktori koji utiču na kvalitet fiksacije
fiziološko stanje ćelije u trenutku fiksacije
veličina uzorka
toničnost, jonski sastav i pH rastvora fiksativa(pufer)
koncentracija fiksativa, temperatura i dužina fiksacije
![Page 26: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/26.jpg)
Fiziološko stanje ćelije u trenutku fiksacije
Primer
- GA u STH-ćelijama miša u ponoć i u podne(mali, jasno definisan/hipertrofisan)(mali, jasno definisan/hipertrofisan)
- struktura membrana EPR u jetri tokom 24h; regionalne razlike u zastupljenosti gl- i gr-ER
- mitohondrije – nabubrele vs. kondenzovane(nestimulisani vs. stimulisani nervni završeci)
![Page 27: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/27.jpg)
Veličina uzorka tkiva
~ 60 µm od površine
dublji sloj tkiva
![Page 28: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/28.jpg)
Izbor pufera i recept za pravljenje Sörensen-ovog fosfatnog pufera
• fosfatni pufer• kakodilatni pufer (arsen)• veronal-acetatni pufer (pH 4,2-5,2)
0.2 M stok rastvori:
Rastvor A:
Na2HPO4 x 2H2O 35.61 g
ili Na2HPO4 x 7H2O 53.65 g
ili Na2HPO4 x 12H2O 71.64 g
Rastvor B:
NaH2PO4 x H2O 27.6 g
ili NaH2PO4 x 2H2O 31.21 g
Destilovane vode do 1000 ml Destilovane vode do 1000 ml
![Page 29: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/29.jpg)
0.1 M fosfatni pufer : pomeša se x ml rastvora A sa y ml rastvora B
pH (na 250C) x ml A y ml B
5.8 4.0 46.0
6.0 6.15 43.85
6.2 9.25 40.75
6.4 13.25 36.756.4 13.25 36.75
6.6 18.75 31.25
6.8 24.5 25.5
7.0 30.5 19.5
7.2 36.0 14.0
7.4 40.5 9.5
7.6 43.5 6.5
7.8 45.75 4.25
8.0 47.35 2.65
Dodati dH2O do 100 ml
![Page 30: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/30.jpg)
Osobine GA kao fiksativa za EM
- komercijalno se proizvodi kao 25% rastvor- lako se rastvara u vodi- blago do umereno toksičan- fiksira brzo, efikasno i ireverzibilno- fiksira brzo, efikasno i ireverzibilno- minimalno menja strukturu tkiva- preporučuje se fiksacija 2 h na 4°C, 1.5-4%
2.5% GA u fosfatnom puferu:0.2 M fosfatni pufer 50 ml25% GA u H2O 10 mldH2O dopuniti do 100 ml
![Page 31: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/31.jpg)
Reakcije GA
• Sa proteinimareakcija sa NH2-grupama, naročito lizina
• Sa lipidimareakcija sa fosfolipidima koji imaju NH -grupereakcija sa fosfolipidima koji imaju NH2-grupeznačaj postfiksacije OsO4-om
• Sa nukleinskim kiselinamareakcije nisu do kraja poznate
• Sa ugljenim hidratimazadržava 40-65% glikogena
![Page 32: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/32.jpg)
Ograničenja fiksacije GA-om
- ne kontrastira tkivo- menja morfologiju nekih struktura u ćeliji- ne čuva većinu lipida, može da dovede do formiranja
mijelinskih figuramijelinskih figura- inhibira aktivnost enzima, blokira antigene- ne sprečava sasvim ekstrakciju tkivnih konstituenata
- preporučuje se dvostruka fiksacija (OsO4)
![Page 33: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/33.jpg)
hemijska fiksacija
fiksacijazamrzavanjem
![Page 34: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/34.jpg)
Ispiranje, dehidratacija, kalupljenje
- Ispiranje u puferu
- Dehidratacija u alkoholu i propilen-oksiduNeželjeni efekti dehidratacije:Neželjeni efekti dehidratacije:- smanjenje uzorka- promena konformacije proteina- gubitak lipida
- Infiltracija i kalupljenje – smoleSmole su toksične i mogu da izazovu alergiju
Neželjeni efekti- smanjenje uzorka tokom polimerizacije
![Page 35: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/35.jpg)
![Page 36: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/36.jpg)
Reprezentativni protokol fiksacije i kalupljenja za EM
1. GA u puferu 2-4 h, 4°C2. Ispiranje u puferu 3x20'3. Postfiksacija u OsO4 1-4 h4. 50% etanol 15'5. 70% etanol 15'5. 70% etanol 15'6. 96% etanol 15'7. 100% etanol 15'8. 100% etanol:propilen-oksid 1:1 15'9. propilen-oksid 15'10. propilen-oksid:smola 2:1 20'11. propilen-oksid:smola 1:1 45'12. propilen-oksid:smola 1:2 60'13. smola 3x45', 45°C14. stavljanje u modle 72h, 56- 60°C
![Page 37: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/37.jpg)
Sečenje
vrsta nožadebljina presekabrzina sečenjamrežice
![Page 38: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/38.jpg)
30 nm30 nm
70 nm
100 nm
150 nm200 nm300 nm
Problemi pri sečenju
- kompresija- tragovi noža
http://sydney.edu.au/video/play.php?video=/ict/videos/introduction-to-microtomy.mp4&poster=/ict/images/videos/introduction-to-ultramicrotomy.jpg&widescreen=true&download=false
![Page 39: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/39.jpg)
Kontrastiranje preseka
osmijumkontrastira lipide i proteine
uranil-acetatkontrastira nukleinske kiseline, proteine,kontrastira nukleinske kiseline, proteine,fosfolipide membrana
olovo-citratkontrastira ugljene hidrate, vezuje se zastrukture kontrastirane uranil-acetatom
![Page 40: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/40.jpg)
Postupak
![Page 41: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/41.jpg)
Nastanak slike na fluorescentnom ekranu
![Page 42: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/42.jpg)
Rad u EM-laboratoriji -rizici, mere opreza i bezbednost pri
rukovanju reagensima
- toksičnost (kontakt, inhalacija)- toksičnost (kontakt, inhalacija)- zapaljivost- odlaganje otpada
![Page 43: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/43.jpg)
Perspektive razvoja elektronske mikroskopije
kombinovanje sa metodima detekcije molekula
usavršavanje metoda fiksacije
udruživanje različitih metoda
![Page 44: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/44.jpg)
Immunolabelling
![Page 45: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/45.jpg)
SM
EM
Korelacija SM i EM
![Page 46: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/46.jpg)
Correlative LM-airSEM microscopy
Scientific Reports 4: 5987, 2014
![Page 47: ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJA](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022012016/615b337ef92f561a2c16963a/html5/thumbnails/47.jpg)
• 3D tomografija
Multi-lysosomal body (A.J. Koster and W.J.C. Geerts, Utrecht University)