Disciplina: Genética II
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
O que são as hemoglobinopatias ?
Distúrbios das hemoglobinas humanas
Mutações nos genes das globinas
Doença monogênica mais comum
Anemia Hereditária
Caso Clínico 1
• Menino de raça negra, com 4 meses de idade;
• Terceiro filho de pais jovens, naturais de Luanda;
• O primeiro filho do casal faleceu aos 5 meses;
• Aparentemente saudável até 15 dias antes do internamento, com febre e tosse; desde então ficou prostrado e progressivamente mais pálido.
Foram realizados diversos exames complementares
de diagnóstico, como hemograma com os seguintes resultados:
Hemoglobina – 4,6g/dL (13 a 16g/dL)
N.º Glóbulos vermelhos – 1.400.000/mm3 (4,5 a 6 milhões)
N.º Glóbulos brancos – 8.000/uL (4.000 – 11.000)
N.º Plaquetas – 156.000/uL (150.000-450.000)
Qual o diagnóstico provável?
Qual tipo de anemia? Ferropriva ou hereditária?
Solicitar esfregaço de sangue e eletroforese de hemoglobinas
Esfregaço normalTeste de falcização positivo
Estrutura e funçãoFUNÇÃO:FUNÇÃO: transportador de oxigênio em hemácias de vertebrados.
ESTRUTURA: tetrâmero 2 cadeias tipo alfa ()
2 cadeias tipo beta ()
Cada subunidade :
-cadeia polipeptídica globina
-grupo prostético (cofator):
grupo Heme
-
Formação da estrutura
quaternária da hemoglobina.
4 cadeias são dobradas tetrâmero globular, com peso molecular de 64.500 D
CARACTERÍSTICAS DA ESTRUTURA DAS
GLOBINAS
- estrutura bem conservada ao longo da evolução
Estrutura terciária: quase todas as globinas possuem as 8 regiões
helicoidais A - H
2 aminoácidos histidina (resíduo F8) conservados fenilalanina (resíduo CD1)
sítios internos: resíduos apolares invólucro hidrofóbico.
superfície da molécula: resíduos polares (hidrofílicos)
Mutações conformação/
substituição aa. conservados/alteração
do invólucro hidrofóbico
Hemoglobinopatias
CARACTERIZAÇÃO DAS CADEIAS DE GLOBINA
Cadeias e : tamanhos semelhantes
cadeia 141aa cadeia 146 aa
-genes da cadeia : cromossomo 16 ; 2; 1
- genes da cadeia : cromossomo 11 ; G; A; ; e diferem em 10 aa
Genes das globinas, distribuídos em dois cromossomos.
Cluster Beta – LCR (REGIÃO CONTROLADORA DO LOCUS)
-responsável pela expressão em alto nível do gene da -globina nos tecidos
apropriados e durante o desenvolvimento:
- controla expressão dos genes da família beta globina: atividade de estimulação,
inibição interação de fatores de transcrição com o DNA e maquinaria da
RNA polimerase Atua como um SUPERACENTUADOR de transcrição
- LCR localizado ~20 kb do gene épsilon possui 5 sítios hipersensíveis (HS)
-deleções da LCR não expressam os genes do grupo da -globina- alvo para terapia gênica.
LCR
G A
LCR
G A
LCR
G A
Embrionário DNA
Fetal DNA
Adulto DNA
Strachan and Reald HMG2 1999
Ativação dos Genes Beta
http://www.med.yale.edu/obgyn/reproimmuno/courses/class3/sld007.htm
Como ocorre a ativação e silenciamento dos genes da globina durante o desenvolvimento?
ONTOGÊNIA – Tipos de globinas durante as fases do desenvolvimento
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=dbio&part=A736
Hb Gower 1
Hb Gower 2
HbF
HbA2
HbA
Expressão dos genes da globina durante o desenvolvimentoExpressão dos genes da globina durante o desenvolvimento
Mudanças temporais da síntese de globina alterações
no local da eritropoiese.
SÍNTESE DE GLOBINA EMBRIONÁRIA:
- 3a à 8a semanas de gestação: eritropoiese no saco vitelínico
Hb embrionárias globinas e (combinação com as
demais)
3 Hb embrionárias Hb Gower 1 (2 2 )
Hb Gower 2 (2 2 )
Hb Portland (2 2 )
SÍNTESE DA HEMOGLOBINA FETAL
5a semana gestação:
hematopoiese muda para o fígado fetal mudança na síntese
de para e de para Hb fetal 2 2 (Hb F).
-predominante (vida fetal)
-70% da Hb total ao nascimento, mas na idade adulta
1%.Cadeias :- detectáveis no início da gestação síntese significativa próximo ao nascimento.Cadeia : -síntese inicia no final da vida fetal, continuando após nascimento, não atinge + de 2% da Hb adulta.
Hb F
SÍNTESE DA HEMOGLOBINA ADULTA
-hematopoiese: medula óssea
-Recém-nascido: HbF (2 2 ): 70-90%
HbA (2 2): 0-10%
-Após 6 meses de vida: hemoglobinas do adulto
HbA (2 2): 95%
HbA2 (2 2): 2-3%
HbF (2 2 ): até 1%
DOSAGEM GÊNICA E DOENÇAS CLÍNICAS
-globina : 4 genes
-globina : 2 genes
-uma única mutação no gene -globina 25% das cadeias .
-mutações da -globina doença severa na vida fetal e pós-
natal.
- uma única mutação no gene -globina afeta 50% das cadeias
.
- mutações da -globina não trazem consequências pré-natais
(globina e a Hb F).
diplóide
DISTÚRBIOS GENÉTICOS DA HEMOGLOBINA
A. Variantes estruturais: alteram a globina (mudanças na
sequência de aminoácidos), sem afetar a taxa de síntese
B. Talassemias: alteração na síntese desequilíbrio nas
quantidades das cadeias do tipo alfa e beta
1. Variantes estruturais: maioria provém de mutações de
ponto.
- > 900 variantes descritas
- anemia hemolítica
- transporte de O2 alterado
- Brasil: mais comuns Hb S, Hb C e Hb D
HEMOGLOBINAS VARIANTES
Hemoglobina S: Hb S (primeira Hb anormal detectada)
alteração: 1 aa. dos 146 da -globina
6 Glu Val (A T)
Mutação em homozigose Anemia falciforme.
PATOLOGIA MOLECULAR DA HB S
•Pauling et al. (1949): Hb A e Hb S por eletroforese
•Ingram (1956): substituição de 1 dos 146 aa. na cadeia da -
globina.
Ac. Glutâmico: carga negativa
Valina: neutro → mobilidade eletroforética mais lenta da HbS
Eletroforese alcalina de hemoglobinas em gel de agarose. Diferenciação da mobilidade eletroforética dos genótipos SC, SF e AS.
Eletroforese ácida de hemoglobinas em gel de agarose. (1) Hb ASF em sangue de recém-nascido; (2) Hb AS; (3) Hb AA. Devido ao processo físico-químico de eletroendosmose a Hb Fetal migra com maior rapidez que a Hb A.
DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
- África equatorial: 1/50 nascimentos
- Região do Mediterrâneo
- Índia e países onde essas pessoas migraram.
- incidência: 1/400 a 1/600 afro-americanos.
- hemácias: forma afoiçada ( tensão de O2)
http://cienciahoje.uol.com.br/114271
AFOIÇAMENTO E SUAS CONSEQUÊNCIAS
Hb com subunidades mutantes
-condições de tensão de O2 Hb S agregam-se em
polímeros que distorcem o eritrócito (insolubilidade)
- são menos flexíveis, não se comprimem nos capilares,
obstruindo o fluxo sanguíneo hipóxia local.
Como explicar a alta frequência do alelo
mutante (2S) em algumas regiões da África?
Duas explicações possíveis para a seleção contra
homozigotos mutantes:
1. Alta taxa mutação ou
2. Heterozigotos portadores mais adaptados
-certas situações ambientais: heterozigotos portadores (traço
falcêmico - HbAS) maior vantagem seletiva que os homozigotos
normais (HbAA).
(HbAS)
gene falcêmico : alta frequência em certas regiões da África heterozigotos são mais resistentes ao Plasmodium vivax (parte do ciclo evolutivo nas hemácias do hospedeiro)
http://www.assis.unesp.br/~egalhard/errmetab.htm
MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
•destruição prematura dos eritrócitos afoiçados
•anemia nos dois primeiros anos, •atraso crescimento e atraso da puberdade,• esplenomegalia, •infecções repetidas (hipofunção esplênica), •infartos nos tecidos (ulceração)•problemas osteoarticulares e
renais
http://www.ufv.br/dbg/BIO240/DG112.htm
HEMOGLOBINA C - HbC
•substituição na 6a posição da cadeia (GAG AAG): 6 Glu Lys
- menos solúvel que a Hb A cristaliza-se nas hemácias distúrbio hemolítico leve.- anemia sob estresse ou durante a gravidez -gene C frequente na África ocidental e em descendentes dessa região.
-Hb SC: indivíduos possuem alelo S no outro locus da -globina.-distúrbio hemolítico mais leve que a anemia falciforme
HEMOGLOBINA INSTÁVEL
HB HAMMERSMITH
mutação de ponto substituição na cadeia 42 Phe Ser
fenilalanina resíduo CD1 - aa conservados (alojar o
Heme)
-resíduo de serina é menor Heme
sai do lugar
- instabilidade ( hemoglobina
precipita formando inclusões)
- afinidade por O2 cianose.
http://www.ciencianews.com.br/hemoglobinopatias/hemoglobinopatias-index.htm
HEMOGLOBINAS COM ALTERAÇÕES FUNCIONAIS
TRANSPORTE DE O2 ALTERADO
-mutações que alteram a capacidade da Hb transportar O2
Metemoglobinas – Hb M•Oxihemoglobina: forma normal da Hb em que o ferro está
no estado reduzido (ferroso)•Metemoglobina: o ferro encontra-se na forma férrica
(oxidada) incapaz de transportar O2 cianose;
assintomática nos heterozigotos.
- Ex.: Hb Hyde Park - 92 His Tyr
- histidina: aa conservado (resíduo F8)http://www.hemoglobinopatias.com.br/hemoglobinopatias/listagem.htm
Hb Lepore
- alguns pacientes com fenótipo de -talassemia: - cadeias globínicas híbridas : metade N-terminal de uma cadeia fundida com a metade C-terminal de uma cadeia normal - Fusão da porção 5’ do gene com 3’ do gene
pareamento desigual na MEIOSE
crossing-over homólogo
(genes homólogos)
Pareamento normal
Pareamento anormal
Crossing-over desigual
Anti-Lepore
Lepore
Hb Lepore: cadeias fusionadas.
- mutação provoca redução ou ausência na síntese de
uma das cadeias ou , sem alterar a sequência de
aminoácidos
- cadeia produzida na taxa normal: excesso relativo
precipitação na célula lesando a membrana
destruição prematura da hemácia.
2 grupos talassemias
talassemias
TALASSEMIAS
Distribuição geográfica ao redor do Velho mundo: Mediterrâneo, Oriente Médio e partes da África, Índia e Ásia. Thalassa: mar
ALFA-TALASSEMIAS-distúrbios genéticos na produção da -globina afetam a formação das Hb fetal (HbF 2 2 ) e adulta (HbA 2 2)-Ausência de cadeia : talassemia 0
-Redução de cadeia : talassemia +
- ausência de cadeias de -globina: cadeias de -globina formam um tetrâmero. -maioria das -talassemias deleções
Recombinação homóloga desigual
Formas de Talassemia Alfa
•Deleção 4 genes alfa: formação de 4 Hb Barts forma major
hidropisia fetal
•Deleção de 3 genes alfa: tetrâmero 4 Doença da Hb H
precipitam na hemácia destruição e anemia hemolítica
•Deleção de 2 genes alfa: anemia leve (traço talassêmico)
•Deleção de 1 gene alfa:
portador silencioso
- -talassemia por deleção homozigota (ausência de cadeias )
restrita ao SE asiático.
- estado heterozigoto (2 genes normais e 2 mutantes).
2 genótipos —/ —
— —/
progênie — —/— —
Hidropisia fetal
Pais
Hidropisia Fetal
Pais
Traço -talassêmico: deleção de 2
genes (_ _/ ) :
- anemia leve.
- comum em orientais e SE asiático
Hemoglobina H
Doença da Hb H (4): deleção de 3 genes (_ _/ _ ) moderadamente grave.alteracões ósseas, esplenomegaliaafeta orientais e brancos
DOENÇA DA HB H
Precipitados da HbH
Traço -talassêmico
(_/_ )
SO Ásia, negros
americanos e
brasileiros
Pais
descendentes
TRAÇO ALFA-TALASSÊMICO
http://www.ciencianews.com.br/doencaeritro/Altera%E7%F5es%20Eritr.%20Nas%20Talassemias%20-%207/genfisioa.htm
DESEQUILÍBRIOS DAS GOBINAS ALFA
(4)
(4)
BETA-TALASSEMIAS-produção reduzida ou ausente de -globina anemia
microcítica hipocrômica.-Ausência de cadeia : talassemia 0
-Redução de cadeia : talassemia +
-desequilíbrio da síntese de -globinas precipitação das cadeias
danos na hemácia.
- cadeia é importante no período pós-natal síntese após o
nascimento (-globina substituiria a e a síntese de Hb A é ).
- maioria das -talassemias são decorrentes de mutações pontuais
síntese de RNA
- síntese de Hb F reduz a gravidade da doença.-indivíduos homozigotos para -talassemia talassemia major -indivíduos heterozigotos para -talassemia talassemia minor
http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm
1. Mutação nos promotores (TATA box)2. Mutação no splicing do mRNA3. Mutação da cobertura (cap) do mRNA4. Mutações sem sentido e de matriz de leitura
Normal Hipocrômica e microcítica
http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm
DESEQUILÍBRIOS DAS GOBINAS BETA
http://www.hemoglobinopatias.com.br/talassemias/tal-beta.htm
TIPOS DE TALASSEMIA BETA
Sinais Clínicos -anemia intensa antes dos 2
anos (Hb F pós-natal), -atraso do crescimento, -icterícia, -hepatoesplenomegalia, -alterações esqueléticas (expansão da medula óssea).
Tratamento- transfusão sanguínea- administração de agentes quelantes do ferro-transplante de medula óssea-Terapia gênica
TALASSEMIA MAJOR – ANEMIA DE COOLEY
TALASSEMIA MAJOR – ANEMIA DE COOLEY
Eletroforese de hemoglobinas em gel de agarose alcalina: (1) Hb AF de talassemia beta maior; (2) Hb S/beta talassemia ou SF, onde m indica o fracionamento da metaemoglobina S e a a globina alfa livre; (3) Hb AA2 e Fetal em tal. beta menor; (4) Hb AS (traço falciforme); (5) Hb AA (normal).
Cadeias normais em excesso precipitam-se formando
os corpúsculos de Heinz na hemácia em forma de
lágrima.
TALASSEMIA MINOR -
TRAÇO TALASSÊMICO
-portadores de um alelo
mutante (heterozigoto)
-Geralmente assintomáticos
- anemia leve
-diagnóstico: eletroforese
( Hb A2).
Risco para casamentos entre portadores de talassemia beta
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL•Eletroforese em acetato de celulose (pH alcalino ou ácido): rápida e baixo custo, mas sensibilidade limitada Hbs co-migram na mesma posição.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL•Eletroforese de Focalização isoelétrica: técnica de alta precisão identifica Hbs com co-migração
•A Hb migra no gel e se precipita ao encontrar seu ponto isoelétrico (conforme o pH no gradiente do gel)
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
•HPLC (Cromatografia líquida de alta pressão): diagnóstico diferencial das hemoglobinopatias (dados quantitativos e qualitativos)
•Técnicas moleculares: identificação da mutação (PCR, sequenciamento)
5- Considerando que a amostra número 1 é o perfil adulto normal (HbAA) responda quais são os perfis das amostras 2 e 3 nas eletroforeses A e B.
Eletroforese A
-
+
AF
S e similares
A2; C e similares
1 2 3
-
+
AF
S e similares
A2; C e similares
1 2 3
Eletroforese B