CROMATOGRAFÍALÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
(HPLC)
La fase móvil es líquida
Partición o reparto
Adsorción
Intercambio iónico
Exclusión molecular
Cromatografía líquida de alta eficiencia
Características y ventajas
Trabaja con partículas muy pequeñas (< 10 m)
Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch
= libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)
Rápida
Picos angostos (alta eficiencia)
Separa compuestos no-volátiles o térmicamente
inestables
Cromatografía líquida de alta eficiencia
BOMBA
INYECTOR
CÁMARA DE MEZCLA
PRE-COLUMNA
DETECTOR
COLUMNA
Esquema del equipo de HPLC
Elución con gradienteElución
isocrática
Elución isocrática vs elución con gradiente
Elución isocrática: solvente de composición constante.Elución con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se varía la composición de la FM en forma continua o escalonada.
Solventes utilizados como FM
Solventes orgánicos, agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras
Alta pureza
Desgasificados
Tratamiento con He
Sistema de desgasificación al vacío
Filtración
Sistemas de bombeo
Requerimientos
Generación de altas presiones (1000 - 6000 psi)
Flujo libre de pulsaciones
Caudales 0.1 – 10 mL/min
Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable, teflón)
Bomba recíproca o de movimiento alternado
etapa de aspiración
pistón
fase móvil
etapa de descargahacia la columna
Ventajas: pequeño volumen interno, resiste presiones > a 10.000 psi, permite elución con gradiente, caudales constantes e independientes de la contrapresión de la columna y la viscosidad del solvente
Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)
Sistemas de inyección de muestra
eluyente
Llenado del bucle Inyección de muestra en columna
columna
eluyente
columna
muestra
Sistemas de inyección de muestra
Sistemas de inyección de muestra
Composición similar a la columna cromatográfica
Elimina materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE
Se usa para mejorar la vida de la columna. Se
reemplaza cuando se contamina.
Precolumna
Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente
Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i.
Tamaño partículas de relleno: 5–10 m
Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma
Columna
Columna
Rellenos
Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polímero no porosas de 30 – 40 m de diámetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de sílica, alúmina, polímero.
Relleno de partículas. Micropartículas porosas de sílica, alúmina o polímero de 3 – 10 m de diámetro. Se recubren con películas orgánicas que unen químicamente o físicamente a la superficie.
Columna
Basados en la medida de una propiedad del eluyente (índice de refracción, constante dieléctrica, densidad)
Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente límite)
Requisitos
Sensibilidad adecuada
Respuesta lineal amplia
Respuesta rápida y reproducible
Manejo sencillo
Detectores
Celda del detector UV-visible en HPLC
De la columna
DetectorFuente UV
Al desecho
Ventanas de cuarzo
Ensanchamientoextracolumna
Eficiencia de la columna
Tamañopartículas
de empaque
Tamaño de
muestra
10 m
5 m
3 m
H
(cm/min)
H vs para partículas de diferentes diámetros
Tamaño de muestra
adsorción
L-L (k = 2.3)
fase ligada (k = 4.3)
fase ligada (k = 1.2)
H
g muestra/ g empaque
De acuerdo al tipo de FE el efecto es más o menos pronunciado
Ensanchamiento extracolumna
r224 DM
Hex =
Se origina en los tubos que conectan los componentes del sistema cromatográfico (puerto de inyección y columna, columna y detector, etc.)
coeficiente de difusión del soluto en fase móvil [cm2/s]
radio del tubo [cm]velocidad lineal de FM [cm/s]
CROMATOGRAFÍA GASEOSA
G-L y G-FL
G-S adsorción
partición G-LGaseosa
líquida
sólida
FM FE MÉTODO INTERACCIÓN
Cromatografía gaseosa
Ventajas:
Alta resolución
Alta velocidad
Alta sensibilidad
Separación de compuestos con PE ~
Limitaciones:
Muestras volátiles o fácilmente vaporizables
Deficiente para compuestos iónicos o de PM > 600
Deficiente como técnica cualitativa y preparativa
Cromatografía gaseosa
Cromatógrafo de gases
Esquema de un cromatógrafo de gases
gas portador
puerto de inyección
columna
registro
medidor flujo
sitio de referencia
Detector
cromatografía de elución
Puerto de inyección
vidrio
entrada gas portador
columna
cámara de vaporización
salida de excedenteBloque de metal
calentado
salida de purga del septo
septo de goma
Columnas tubulares abiertas (capilares)
Columnas rellenas
Columnas
flujoDiámetro interno(100 a 700 m)
Sílice fundidapoliimida
Soporte recubierto con FE líquida
SCOTWCOT FSOT
Columnas tubulares abiertas (capilares)
Columnas
Columnas
FSOT WCOT SCOT Rellena
Fases estacionarias Nombre comercial
Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30
Poli(fenilmetildimetil)siloxano [10% fenil] OV-3, SE-52
Poli(fenilmetil)siloxano [50% fenil] OV-17
Poli(trifluoropropildimetil)siloxano OV-210
Polietilenglicol Carbowax 20M
Poli(dicianoalildimetil)siloxano OV-275
Ejemplos de algunas fases estacionarias usadas en cromatografía de gases
FE no-polar poli(dimetilsiloxano)
CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad
Los compuestos aparecen casi en orden creciente de sus puntos de ebullición. El determinante principal de la retención en esta columna es la volatilidad de los compuestos
6911710298138126
hexanobutanol3-pentanonaheptanopentanoloctano
5678910
80metil etil cetona497propanol336pentano256acetona1PE (°C)Compuesto
La FE muy polar retiene los solutos polares. Los primeros que se eluyen son los 4 alcanos, le siguen las 3 cetonas y por último los 3 alcoholes. La fuerza determinante de la retención es el enlace de hidrógeno con la FE.
propanol butanol pentanol
CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad
FE polar poli(etilenglicol)
6911710298138126
hexanobutanol3-pentanonaheptanopentanoloctano
5678910
80metil etil cetona4
97propanol3
36pentano2
56acetona1
PE (°C)Compuestoalcanos
cetonas
Efecto de la temperatura en el cromatograma
Isotérmica a 45 °C
Isotérmica a 145 °C
Programada
Detector de conductividad térmica
Detector de ionización de llama (FID)
terminal de la columna
gas portador
H2
aire
llama
electrodo colector
Detector de captura electrónica
(Ni63, Sr90)
aislante
de la columnaal desecho
emisor radiactivo
+electrodo
-electrodo
CONDUCTIVIDAD TÉRMICA
IONIZACIÓN DE LLAMA
CAPTURA ELECTRÓNICA
COMPUESTOS Orgánicos e inorgánicos. Algunos dañan los filamentos (HCl, Cl2, haluros de
alquilo)
Orgánicos. No responde a CO, CO2,
SO2, H2O
Con átomos electronegat.(haluros de alquilo, organometálicos, organofosforados)
GAS PORTADOR H2, He N2, He N2, Ar
SENSIBILIDAD Moderada Muy buena Muy buena
LINEALIDAD Buena Amplia Limitada
TEMPERATURA LÍMITE
400 °C 400 °C 225 °C (Tr)350 °C (63Ni)
OTROS No destructivo. Afectado por variaciones de temperatura y caudal
Destructivo,requiere 3 gases y electrómetro
No destructivo, requiere licencia, muestras secas y electrómetro
Análisis cuantitativo en CL y CG
Área S
[S] [S]/[P]
Área SÁrea P
Uso de patrones externo e interno
S PS
Uso de patrón externo
Área Sx
Sx
Área SxÁrea P
SxP
CROMATOGRAFÍA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Un espectrómetro de masas acoplado a un cromatógrafo líquido o a un cromatógrafo de gases es un potente detector para análisis cualitativo y cuantitativo
La espectrometría de masas es una técnica basada en ionizar moléculas gaseosas, acelerarlas en un campo eléctrico y separarlas de acuerdo a sus masas
Un espectro de masas es un gráfico que muestra la abundancia relativa de cada fragmento que llega al detector de un espectrómetro de masas