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Caroline De Paula Lopes
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CDTec
GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA MICROBIANA I
CONTROLE DO CRESCIMENTO
MICROBIANO – MÉTODOS FÍSICOS
E QUÍMICOS
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O controle dos microrganismos iniciou-se há cerca de 100 anos:
◦ Estudo de Pasteur;
◦ Joseph Lister:
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Industrial
Laboratorial
Hospitalar....
A escolha do método depende do objetivo, do tipo de material e do nível de controle que se deseja obter.
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Controle de microrganismos
= Redução da carga microbiana
Microbiologia – MORTE – Perda da capacidade reprodutiva
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Parede Celular
Membrana Citoplasmática
Enzimas e Proteínas
DNA e RNA
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Você sabe o que é....
Desinfecção?
Esterilização?
Sanitização?Assepsia?
Limpeza?
Bacteriostase?
Germicida?
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ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a
destruição total de todas as formas de
vida de um material ou ambiente,
através de métodos físicos ou químicos.
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DESINFECÇÃO: eliminação parcial dos microrganismos, mata as formas vegetativas, mas não necessariamente as esporuladas de microorganismos patogênicos presentes num material inanimado.
Métodos: substâncias químicas (desinfetantes), radiação UV, água fervente ou vapor.
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◦ SANITIZAÇÃO: Utiliza um agente, normalmentequímico, em utensílios e equipamentos, quereduz a população microbiana até níveiscompatíveis com às exigências da saúde pública
◦ ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar oretorno da contaminação a um objeto, superfícieou local.
◦ ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos,como pele e mucosas.
◦ LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos
de desinfecção ou esterilização.
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◦ BACTERIOSTASE: inibição do crescimento, pelainibição da síntese protéica, entretanto a bactérianão está morta.
◦ BACTERICIDA: MORTE CELULAR
◦ BACTERIOLÍTICO: morte celular por lise
Inibição da síntese de parede celular
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Tamanho da população; Intensidade ou concentração do
agente microbiocida; Tempo de exposição ao agente; Temperatura; Natureza do material contendo
os microrganismos; Características dos
microrganismos; Condições ambientais (pH,
concentração de carboidratos,presença de matéria orgânica).
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PARA OBTER MAIOR EFICIÊNCIA DO CONTROLE MICROBIANO, DEVE-SE LEVAR EM
CONSIDERAÇÃO ALGUNS PRINCÍPIOS BÁSICOS, OS MESMOS DEVEM SER APLICÁVEIS
A TODOS OS MÉTODOS.
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1- Avaliar susceptibilidade das espécies paraesse agente
2- O contato do agente com o microrganismodeve ser facilitado
3- O tempo de exposição adequado, entre oagente escolhido e o microrganismo parapermitir a ação necessária.
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Tempo de redução decimal =VALOR D
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1 Físicos:- Calor (úmido, seco, pasteurização)- Filtração;- Baixas temperaturas;- Alta pressão;- Dessecação- Pressão osmótica- Radiação
2 Químicos:
Desinfetantes e/ou anti-sépticos:
- halogênios (cloro, iodo)
- álcoois (etanol 70%, isopropanol)
- fenóis e bifenóis (o-fenilfenol, tricosan)
- biguanidas (clorexidina)
- agentes tensoativos (sabões e detergentes)
- Quaternários de amônio
- Metais (Ag, Hg, Cu)
- Conservantes de alimentos
- Antibióticos (nisina)
- Esterilizantes gasosos (oxirano)
- Aldeídos (glutaraldeído)
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CONTROLE FÍSICO
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Calor (úmido, seco, pasteurização)
- Mecanismos de ação: desnaturação das proteínas (enzimas)
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- Fervura: destrói formas vegetativas de bactérias patogênicas, fungos e grandes partes de vírus em 10 minutos( vírus hepatite e endosporos resistem por mais tempo)
- Autoclave: maior temperatura devido a pressão (esterilização efetiva)
Métodos físicos de controle Microbiano
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Métodos físicos de controle Microbiano
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Pasteurização:
- Objetivo: eliminar microrganismos patogênicos, prolongar a qualidade, utilizado em alimentos perecíveis (leite, iogurte, sorvete, cerveja)
- Tempo de pasteurização difere: viscosidade, teor de gorduras ....
Métodos físicos de controle Microbiano
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Pasteurização:
Métodos físicos de controle Microbiano
Saída dos tubos Entrada da câmara
Saída da câmara
Entrada dos tubos
septos
Lenta (62-65ºC – 30 minutos)
Rápida (72-75ºC/15 a 20
segundos)
UHT (135-145ºC/2 a 5 segundos)
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Métodos físicos de controle Microbiano
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Aplicado principalmente a instrumentos e materiais sólidos (por exemplo vidraria)
Requer uma temperatura e um tempo maior (170-180°C/algumas horas)
Obtido em fornos de esterilização (Forno de Pasteur)
Métodos físicos de controle Microbiano
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Testes utilizados para monitorar e validarprocessos, garantindo a segurança do métodos,podem ser;
Químicos – fitas termossensíveis
Biológicos-consiste numa populaçãopadronizada de microrganismos viáveis(usualmente esporulados) conhecidos comoresistentes ao modo de esterilização a sermonitorizado.
Métodos físicos de controle Microbiano
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Recipiente de plástico flexível
Ampola quebrável (de vidro)
com meio de cultura estéril
Papel de filtro com esporos
Controle do
processo de
esterilização em
autoclave
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•Cor inalterada
•pH inalterado
•Esporos mortos
•Não há germinação
•Cor alterada
•pH alterado
•Esporos vivos
•Há germinação
Funcionamento da
autoclave normal
Funcionamento da
autoclave comprometido
Métodos físicos de controle Microbiano
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Mecanismo de ação: remoção mecânica
Soluções sensíveis ao calor, ar;
Filtros de membrana: ésteres de celulose, polímeros plásticos◦ 0,22μm e 0,45μm para bactérias.
Bactéria retida num filtro tipo Isopore
Métodos físicos de controle Microbiano
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Métodos físicos de controle Microbiano
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Capelas de fluxo laminar
Filtros de ar de alta
eficiencia (90%)
Membranas de acetato
de celulose
Métodos físicos de controle Microbiano
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Mecanismo de ação: interrupção do metabolismo bacteriano.
◦ Liofilização: água sublimada do interior da célula. Os MO permanecem viáveis, porem latentes com a ausência de água.
Métodos físicos de controle Microbiano
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Refrigeração comum: bacteriostático 0-7ºC; (exceção bactérias psicrotróficas)
Congelamento -20ºC; ◦ Lento: bactérias em estado latente
◦ Rápido: mais letal, ciclos de congelamento e descongelamento são utilizados
Nitrogênio líquido -179ºC.
Métodos físicos de controle Microbiano
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Comprimento de onda
Intensidade
Distância da fonte
Duração
Métodos físicos de controle Microbiano
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Ionizantes: Raios gama, raios X e feixes de elétrons de alta energia.
◦ Mecanismo de ação: os raios ionizam a água, formando radicais hidroxila altamente reativos.
Métodos físicos de controle Microbiano
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Não-ionizantes: radiação não muito penetrante: UV (260nm)
Mecanismo de ação: alteram o DNA pela formação de dímeros.
C A T C A
Métodos físicos de controle Microbiano
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Fortes e curtos pulsos elétricos;
Ação sobre bactérias: ruptura da membrana celular, formação de poros na membrana.
Métodos físicos de controle Microbiano
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Aumento da concentração de sais ouaçúcares;
Mecanismo de ação: provoca a saída de águacondensando o citoplasma e retraindo amembrana.
Ex???????
Métodos físicos de controle Microbiano
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CONTROLE QUÍMICO
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Capacidade de penetração na matéria orgânica sem perder sua ação germicida e ausência de ação corrosiva.
Desinfetantes:
Não ser irritante, não interferir no processo de
cicatrização e não ser absorvido pela pele
Anti-sépticos:
Métodos químicos de controle Microbiano
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1- Possuir alta eficiência germicida,
2- Ser de efeito rápido, ter amplo espectroantimicrobiano e ação prolongada.
3- Apresentar estabilidade química, devendoser solúvel em água e nos líquidos orgânicos;
4- Ser inodoro ou ter odor agradável;
5- Incolor;
6- Não produzir manchas.
Métodos químicos de controle Microbiano
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Alvo/Efeito de alguns agentes químicos
•Parede celular
•Membrana plasmática
•Ligação cruzada entre macromoléculas
•Intercalação de DNA
•Interação com grupos tióis (sulfidrilas)
•Oxidação
SH
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Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas e dissolução de lipídios de membranas.
Bactericida;
Não age sobre endósporos e vírus não envelopados.
Álcool etílico: 70%
Álcool isopropílico: puro é superior ao etílico.
Métodos químicos de controle Microbiano
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Mecanismo de ação: liberação de O nascente; oxida os sistemas enzimáticos
Exemplos:
Peróxidos: H2O2 3% age sobre organismos anaeróbios;
Ácido peracético: efetivo contra bactérias, fungos, endosporos e vírus.
Ozônio: empregado na desinfecção de água.
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Mecanismo de ação: alquilação dos grupos funcionais das proteínas (aminas, carboxilas, hidroxilas), inativando-as.
Aldeído fórmico : solução em água de 3 a 8 %
Aldeído glutárico: soluções alcalinas a 2%
Formalina: solução aquosa de formol, associada a um sabão ou detergente 40%
OBS: Alquilação é a transferência de um grupo alquila de uma molécula para outra.
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Mecanismo de ação antimicrobiana do glutaraldeído
Alvo Ação
Esporos bacterianos •Inibe germinação (concentrações);
É esporocida (concentrações)
Micobactérias •Provavelmente a parede celular
Outras bactérias que
não formam esporos
•Associação forte com camadas mais
externas da parede celular; Ligação
ente aminoácidos de proteínas;
Inibição de transporte na célula
Fungo •Parede celular
Vírus •Ligação proteína-DNA e
mudanças no capsídio
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Mecanismo de ação: desnaturam proteínas e rompem membranas plasmáticas lipídicas.
Exemplos:
fenol;
cresol
hexaclorofeno;
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Fenol: desinfetante fraco, atividade bactericida em [0,2 a 1%]
Cresóis: creolina superfícies;
Triclosano (bifenol): uso em superfícies;
Hexaclorofeno (bifenol): em desuso por causar alterações neurológicas.
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anti-sepsia da pele e bucal
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IODO
◦ Solução alcoólica a 2%, bactericida, fungicida, virucida,
[ ] esporocida
◦ Mecanismo de ação: presume-se que há a combinação irreversível a proteínas, interação com os aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, inibindo suas funções.
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CLORO
cloro + água = ácido hipocloroso
◦ Cl2 + H2O H+ + Cl- + HOCl
◦ Mecanismo de ação do 2HOCl: oxida grupos SH e NH2 de enzimas bacterianas, inibindo-as.
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CLORO◦ Hipoclorito de sódio;
◦ Dióxido de cloro;
◦ Cloraminas (cloro + amônia);
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Mecanismo de ação: alteram a permeabilidade da membrana, inibem enzimas, desnaturação de proteínas;
◦ Ativas contra G+ e pouco menos ativas contra G-
◦ EXEMPLOS:
Cloreto de benzalcônio
Cloreto de cetilpiridínio Cepacol
Agentes de superfície
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Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas combinam-se com proteínas, geralmente nos grupos SH (sulfidrilas);
ação bacteriostática;
Mercurocromo e mertiolate
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Mecanismo de ação: alquilação direta dos grupos carboxilas, hidroxilas e sulfidrilas, inativando certas enzimas;
Óxido de etileno: atua pela interação com proteínas, alta capacidade de penetração, é explosivo;
Betapropiolactona: baixa capacidade de penetração, carcinogênico.
OBS: Alquilação é a transferência de um grupo alquila de uma molécula para outra.
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Agente Químico Concentração (%) Aplicações Nível de
Atividade
Compostos Fenólicos 0.5-3.0 Desinfecção de objeto inanimado Intermediário
Álcoois 70-90 Anti-sepsia da pele, desinfecção de
instrumentos cirúrgicos
Intermediário
Iodo 1 Anti-sepsia da pele, pequenos
cortes, desinfecção da água
Intermediário
Compostos Clorados 0.5-5.0 Desinfecção da água, superfícies
não metálicas, equipamentos de
laticínios, materiais domésticos
Baixo
Mercúrio 1 Anti-sepsia da pele, desinfecção de
instrumentos
Baixo
Alta – Mata todas as formas de vida microbiana
Intermediário – Mata o bacilo da Tuberculose, Fungos e vírus, mas não os esporos
Baixo – Não mata o bacilo da tuberculose, nem os esporos e vírus em um tempo
aceitável
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Fatores importantes associados
ao uso de agentes químicos
•Potência
•Espectro de ação
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1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
Fenol Substância a ser testada
2 Banho maria (20°C/5 min)
Determinação do Coeficiente fenólico
1
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FenolSubstância a
ser testada
3 Acrescentar 0,5 ml de cultura
padrão
4 Depois de 5, 10 e 15 minutos, semear em
placas estéreis 1 amostra de cada diluição
Salmonella typhi
Staphylococcus aureus
Determinação do Coeficiente fenólico
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5 Após 48h, observar as culturas e identificar a
maior diluição onde não se observa
crescimento (turbidez), após 10 min.
Diluição da substância, em que há crescimento
Diluição do fenol em que há crescimento•Coeficiente fenólico =
Determinação do Coeficiente fenólico
1/64
1/8= 8
Exemplo:
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Agente Staphylococcus aureus Salmonella typhi
Fenol
Cloramina
Cresols
Etanol
Formalina
Água oxigenada
Lisol
Cloreto de mercúrio
Tintura de iodo
1,0
133,0
2,3
6,3
0,3
-------
5,0
100,0
6,3
1,0
100,0
2,3
6,3
0,7
0,01
3,2
143,0
5,8
Coeficiente fenólico de alguns agentes
químicos
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Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Determinando o espectro de ação de um
desinfetante
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1
3
24
1
3
24
1
3
24
= Disco impregnado com desinfetante
Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Incubar
Determinando o espectro de ação de um
desinfetante
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Determinando o espectro de ação de um
desinfetante
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Ácidos orgânicos: acético, láctico, sórbico...
pH ácido inibe o crescimento microbiano
Nitritos e Nitratos
Formam ác. nitroso e óxido nítrico que são substâncias oxidantes
Gás Sulfeto, metabissulfito e SO2
Redução das pontes dissulfeto em proteínas
Adição de sal e açúcar
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VERMELHO, A.L., PEREIRA, A.F., COELHO, R.R.R., SOUTO-PADRÓN, T. Práticas de Microbiologia,Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2006.
FRANCO, B.G.M.F; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu, São Paulo, 2005.
TORTORA, G. J.;FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia, Artmed, Porto Alegre, 2005.