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Strutture cellulari, loro funzioni e confronto fra organismi procarioti ed eucarioti
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Colture di cellule e di tessuti animali
• Gli esperimenti biologici si possono condurre sia su organismi interi che su organi e tessuti animali isolati. Lavorando su tessuti e organi gli esperimenti in genere sono a breve termine, poichè è necessario mantenere il tessuto il più possibile in uno stato simile a quello fisiologico.
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Perfusione
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• Le colture cellulari durano più a lungo e permettono una varietà di studi che con i tessuti non è possibile. In ogni caso sia i tessuti che le colture si possono utilizzare per diversi scopi che riguardano:
• -lo studio del differenziamento cellulare (ciclo cellulare)
• -studi patologici;• -modelli sperimentali in biochimica,
farmacologia, fisiologia;• -manipolazione genetica;• -applicazioni biotecnologiche
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Colture primarie e secondarie
• Per colture primarie si intendono quelle colture ottenute da cellule provenienti direttamente dal tessuto, da embrioni, da cellule adulte in sospensione o da tumori. In genere contengono una miscela relativamente eterogenea di cellule in differenti stati fisiologici. Vi sono cellule che possono crescere in sospensione o adese ad un matrice artificiale tipo la plastica ma anche al collagene.
• Le colture secondarie sono subcoltivazioni di colture primarie che si rendono necessarie quando le cellule giungono a confluenza ovvero coprono completamente la matrice a cui sono adese.
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Curva di crescita• -la fase lag• - la fase log• = 3.3(log Nx - log No) / (tx - to)
– No numero cellule iniziali al tempo to– Nx numero cellule al tempo tx ; è espresso in ore h-1
• E’ noto che i procarioti crescono con scissione binaria, mentre gli eucarioti per divisione mitotica. In entrambi i casi la cellula si divide per dare origine ad altre due cellule. Pertanto, il tempo di raddoppiamento o di generazione sarà dato da:
• g = 0.301 (tx – to) / log Nx – log No
• -la fase stazionaria• -la fase di declino
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lag
log
stazionaria
declino
tempo
Log numero di cellule vive
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Conservazione delle cellule: la crioconservazione
• Il congelamento in azoto liquido è il metodo preferito per la maggior parte delle cellule eucariotiche, in queste condizioni a -196°C
• la vitalità cellulare sia mantenuta per il periodo durante il quale il campione è conservato in azoto liquido.
• La velocità con cui il campione viene congelato è molto importante
• lenta diminuzione della temperatura • Uso di agenti crioprotettivi (DMSO, PEG)
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Conta delle cellule al microscopio
• aspirare il terreno liquido• lavagio con 5 ml di 1x PBS sterile (Phosphate Buffer Saline :
KH2PO4 0.017M, Na2HPO4 0.05M, NaCl 1.5M);• trattare le cellule con tripsina (precedentemente riscaldata a 37°C);• aggiungere 4-5 ml di terreno• trasferire la sospensione cellulare in un tubo batteriologico;• 10l di cellule di questa sospensione con 10 l di soluzione Trypan
Blue (diluizione 1/2). (Il colorante entra nelle cellule morte che risulteranno colorate di blu e quindi potranno essere riconosciute ed escluse dal conteggio)
• 10l di miscela ed un vetrino reticolato al microscopio ottico (quadrato grande = 0.1 l)
• contare le cellule vive (non colorata il blue) presenti in un quadrato. Per avere una misura statisticamente attendibile è necessario fare una media tra più quadrati;
• aliquotare le cellule in base al numero di cellule che servono
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Cellula morta
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• 100 cellule media di più quadrati
• 100 x 10 = 1.000
• 1.000 x 2 =2.000 (diluizione)
• 2.000 x 1000 = 2.000.000 cellule
• 2.000.000 x ml totale delle cellule