Cinétique et stochiométrie
A. Garnier
GCH-2103
A-2010
Cinétique et stochiométrie
Définition Les termes de base Les modes d’opération Les relations de base Détermination théorique Détermination expérimentale
– Taux initiaux– Cuvée– Chemostat– Stop flow
Croissance cellulaire - variables
X S P
Taux de variation
(kg/(m3.s)
dX/dt dS/dt dP/dt
Taux de production /consommation
rx rs rp
Taux spécifique
(kg/(kg.s)
= rx/X qs= -rs/X qp= rP/X
Rendement (kg/kg) Yx/s = rx/rs = /qp
Yp/x, Yp/s
Mode d’opération
Système fermé: cuvée (batch)
•Aucune entrée ou sortie
•Régime transitoire
•dX/dt = rX, dS/dt = rS
•À t = 0, X = X0, S = S0
Cuvée alimentée (Fed-batch)
•Alimentation seulement
•Régime transitoire
•À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0
•F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc
•Si S est constant, le sera aussi, = c
F(t), Sin
V, X, S
Chemostat (continu, CSTR)
F, Sin
V, X, S, P
F, S, X, P
•Une entrée, une sortie
•Mélange idéal: Xout = X, Sout = S, Pout = P
•Après une période initiale d’adaptation, ce système atteindra un régime permanent:
V= cst, X= cst, S= cst, P= cst
Chemostat avec recirculation
F F(1+w)
V, X
Bioréacteur Décanteur
F(1+w)
wF, Xx
Fc, Xc
Fex, Xx
•Permet de concentrer les cellules dans le bioréacteur•Permet de repousser le lavage•Développement pour X seulement
Croissance cellulaire –type de modèles
STRUCTURÉ/
SÉGRÉGÉ
NON-STRUCTURÉ
STRUCTURÉ
NON-SÉGRÉGÉ
+ simple
SÉGRÉGÉ
Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulairesSégrégé: Tient compte d’une distribution de population
Modèles de croissance
Du plus simple au plus compliqué– Exponentiel (ordre 0!!)– Linéaire (logistique)
– Monod– Autres
Phénomènes connexes– Maintenance– Mortalité
Production– Luedeking-Piret combiné aux différents modèles
Modèle enzymatique - Monod
SK
S
S
MAX
Xdt
dX
XYXqsdt
dS
SX
/
-Une variable indépendante, 3 variables dépendantes, trois équations = Une solution!
(1)
(2)
(3)
-Pour un système fermé (cuvée) en supposant YX/S constant:
Modèle de Monod
Équation 3 n’est peut-être pas nécessaire:
dt
dX
Ydt
dX
YX
Ydt
dS
sxsxsx ///
11
Xmax-X = Yx/s * S
Alors:
X
XXY
K
XXY
dt
dX
MAXSX
S
MAXSX
MAX
)(
1
)(1
/
/
X
XXYK
XX
MAXSXS
MAXMAX
)(
)(
/
Modèle de Monod
XXXYK
XX
dt
dX
MAXSXS
MAXMAX
)(
)(
/
t
MAX
X
XMAX
MAXSXS dtdXXXX
XXYK0
/
0 )(
)(
t
MAX
X
XMAX
MAX
MAX
SXS dtdXXXX
XX
XXX
YK0
/
0 )(
)(
)(
Modèle de Monod
t
MAX
X
XMAX
SXS dtdXXXXX
YK0
/
0
1
)(
a
xax
xax
)ln(ln
)(
1
Sachant que:
tXX
XXXYK MAX
X
XMAX
MAXSXS
0
)ln()ln(ln
/
tXX
XX
X
YK
X
X
X
XYKMAX
MAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)(
)(lnln
0
/
0
/
Modèle de Monod
tXX
XX
X
YK
X
X
X
XYKMAX
MAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)(
)(lnln
0
/
0
/
Modèle de Monod
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8
temps (-)
X (
-)
0
4
8
12
16
20
24
S (
-)S = (Xmax-X)/Yx/s
Données
max= 1
Ks= 5
Yx/s= 0,5
So= 20
Xo= 0,1
Détermination théorique
Cinétique…
Rendement: modèles structurés (stochiométriques et autres)
Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire
[C6H12O6]n C6H12O6 G3P
glycerol
purines
pyruvate Acétyl-CoA
lactate
Acides gras
éthanol
Lipides
Ac.aminéspyrimidinesCycle de
Krebs
Acides nucléiques
protéinesNAD+ATPH2O
NADHADPO2
Chaîne respiratoire
Le catabolisme génère de l’ATP et du NADH
Modèle stochiométrique (cliquez ici)
Autres valeurs du coefficient de rendement
(Bailey&Ollis, McGraw-Hill, 1986)
Détermination expérimentale
Coefficient de rendement
Cinétique– Taux initiaux– Stop-flow– Cuvée– Chemostat
Détermination expérimentale du coefficient de rendement - YX/S constant
tXX
XX
X
YK
X
X
X
XYKMAX
MAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)(
)(lnln
0
/
0
/
Modèle de Monod
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8
temps (-)
X (
-)
0
4
8
12
16
20
24
S (
-)S = (Xmax-X)/Yx/s
Données
max= 1
Ks= 5
Yx/s= 0,5
So= 20
Xo= 0,1
Estimation des rendements en cuvée
Modèle de Monod -X vs S
0
2
4
6
8
10
12
0 5 10 15 20
S (-)
X (
-)
Avec des données de t, X, S, on peut calculer, Yx/s par un graphe de X vs S:
Ici, Yx/s = 0,5
Effet de maintenance
S = S(croissance) + S(maintenance)
rS = 1/YG* rX + m * X
qs = 1/YG* + m
1/Yx/s = qs/1/YG + m/
Effet de maintenance
1/Yx/s = qs/1/YG + m/
1/Yx/s vs 1/mu
2
2,05
2,1
2,15
2,2
2,25
0 0,5 1 1,5 2 2,5
1/mu
1/(
Yx
/s)
Effet de mortalité
Le taux de mortalité cellulaire:
rd = - kd*X où kd=cste
Donc en cuvée:
dX/dt = *X – kd*X = (– kd)*X
En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée
Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et le rendement
glutamine
-Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma)
GLUCOSE PYRUVATE
TCA cycle,resp. chain
lactate
glucose pyruvate
GLUTAMINE
GLUTAMATE
OU
NH3
NH3
glutamate
Détermination de la cinétique – Taux initiaux
Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux arrêté (Stopped-flow): Méthode de flux arrêté (Stopped-flow):
Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés.Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés.
Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Moteur
MélangeurMélangeur
LumièreLumièreDétectionDétection
MoteurMoteur
Temps mort :
Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange)
Temps mort :
Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange)
De l’ordre de 1 milliseconde.
Réactif 1Réactif 1 Réactif 2Réactif 2
Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de :Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de :
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Photodiodes
Dichroïsme circulaire
Tube photomultiplicateur
Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)
Photodiodes
Dichroïsme circulaire
Tube photomultiplicateur
Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :
Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires.
Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires.
Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Méthode de flux étanché (Quenched-flow) :
Types d’étanchage :
Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M)
Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.
Types d’étanchage :
Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M)
Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.
Moteur
MélangeurMélangeur
Moteur
MélangeurMélangeur
Récupération des fractions
Récupération des fractions
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes
Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes
Chambre réactionnelle linéaireChambre réactionnelle linéaire
Réactif 1Réactif 1 Réactif 2Réactif 2
Agent étanchant
Agent étanchant
Spectroscopie de masse « en ligne »
Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse
Électrophorèse sur gel,
Comptage à scintillation,
etc…
Spectroscopie de masse « en ligne »
Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse
Électrophorèse sur gel,
Comptage à scintillation,
etc…
Systèmes d’analyse de cinétique rapide
Les fractions recueillies sont analysées par des méthodes non-optiques :
Estimation des paramètres de Monod en cuvée
Puis on peut reformuler l’équation de X pour isoler des termes reliés linéairement:
tXX
XX
X
YK
X
X
X
XYKMAX
MAX
MAX
MAX
SXS
MAX
MAXSXS
)(
)(lnln
0
/
0
/
÷t÷t
t
XX
XXXX
X
YK
t
XX
MAX
MAX
MAX
SXSMAX
00/0
ln)()(
lnln
Y = b + m X
Monod – estimation des paramètres
t
XX
0
ln
t
XX
XXXX
MAX
MAX
00
ln)()(
ln
Modèle de Monod - Estimation des paramètres
y = 0,2475x + 1
0,5
0,55
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
-1,9 -1,7 -1,5 -1,3 -1,1 -0,9 -0,7 -0,5
max = 1
m = 0,2475 = Ks*Yx/s/Xmax
Ks= 0,2475*10,1/0,5
Ks= 5
Utilisation du Chemostat pour la détermination des paramètres cinétiques
Relation cinétique, par exemple Monod:
DSK
S
S
MAX
1D
K
D
KDS
MAX
S
MAX
S
Modèle de Monod -=D vs S
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 5 10 15 20 25
S (-)
=
D(-
)
Modèle de Monod - S vs D
0
5
10
15
20
25
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
D (-)
S
Prochain labo: Cuvée alimentée (Fed-batch)
•Alimentation seulement
•Régime transitoire
•À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0
•F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc
•Si S est constant, le sera aussi, = c
F(t), Sin
V, X, S
Cuvée alimentée (Fed-batch)
3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle de ce système:
F
dt
dV dtFVV
t
00
tV
VdtFdV
00
VX
dt
XVd
VXdt
XdV
dt
VdX
F
…. )()(
)()()()( tVtX
dt
tXdtVtFtX
Cuvée alimentée (Fed-batch)
VXdt
VXd
dt
VX
VXdc
t
c
XV
VXdtVXd
VX 000
1
tVX
VXc
00
ln tceVXVX 00
Cuvée alimentée (Fed-batch)
VX
YSF
dt
VSd
sx
cin
/
VX
YSF
dt
VdS
dt
SdV
sx
cin
/
F0
VXY
SSFsx
ccin
/
cinsx
c
SSY
VXF
/
t
cinsx
c ceSSY
VXF
/
00
Cuvée alimentée (Fed-batch)
tceVXVX 00
t
cinsx
c ceSSY
VXF
/
00
dtFVVt
00 dte
SSY
VXVV
t t
cinsx
c c
0
/
000
11
/
00
t
cinsx
ceSSY
XVV
11/
0
0
t
cinsx
t
c
c
eSSY
X
eXX