In diesem Dokument wird im Interesse der Lesbarkeit grundsätzlich die männliche Form von Funkti-
onsbezeichnungen verwendet; dies schließt die weibliche Form ein.
1 von 59
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung
für die Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015
Geltungsbereich:
Diese Regel beinhaltet verbindliche Qualitätsmanagementanforderungen für Labore, die die Akkredi-
tierung gemäß DIN EN ISO/IEC 17025 für die Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen anstreben.
Diese Regel der Deutschen Akkreditierungsstelle (DAkkS) übernimmt vollständig und unverändert
den Inhalt des EPPO-Standards PM 7-98. (Quelle: 2010 OEPP/EPPO; Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 40,
5-22).
Datum der Bestätigung durch den Akkreditierungsbeirat: 03.11.2015
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 2 von 59
Inhaltsverzeichnis
Anwendungsbereich ................................................................................................................................ 3
2 Einführung ..................................................................................................................................... 3
3 Akkreditierungsbereich: fester und flexibler Bereich [Scope of accreditation] ............................ 3
4 Termini und Definitionen .............................................................................................................. 4
5 Managementanforderungen (ISO 17025 Punkt 4) ....................................................................... 5
4.1 Verpflichtung der obersten Leitungsebene (ISO 17025 Punkt 4.2.3) 5
4.2 Kontinuierliche Verbesserung und Überprüfung durch die Leitung (ISO 17025 Punkt 4.10) 5
6 Technische Anforderungen (ISO 17025 Punkt 5) .......................................................................... 6
5.1 Allgemeines (ISO 17025 Punkt 5.1) 6
5.2 Personal (ISO 17025 Punkt 5.2) 6
5.3 Räumlichkeiten und Umgebungsbedingungen (ISO 17025 Punkt 5.3) 6
5.4 Diagnostische Methoden (ISO 17025 Punkt 5.4) 6
5.5 Geräte (ISO 17025 Punkt 5.5) 14
5.6 Referenzmaterial (ISO 17025 Punkt 5.6.3.2) 14
5.7 Probenahme (ISO 17025 Punkt 5.7) 14
5.8 Umgang mit der Probe (ISO 17025 Punkt 5.8) 14
5.9 Sicherstellung der Diagnosequalität (ISO 17025 Punkt 5.9) 14
5.10 Ergebnisberichte (ISO 17025 Punkt 5.10.3) 14
7 Quellen ........................................................................................................................................ 14
8 Anhänge ...................................................................................................................................... 16
Anhang 1 - Liste von Tests, die Bestandteil von EPPO-Diagnoseprotokollen sind und häufig
verwendet werden ........................................................................................................... 16
Anhang 2 - Verfahren der Validierung eines Tests (A) durch Vergleich mit einem
validierten Test (B) ............................................................................................................ 26
Anhang 3 – Bericht zur Validierung eines Test .................................................................................... 28
Anhang 4 - Bericht zur Verifizierung eines Tests ................................................................................... 29
Anhang 5 – Tabellen mit detaillierter Anleitung für das Validierungsverfahren je Anwendungs-
bereich (Bakteriologie, Botanik, Entomologie, Mykologie, Nematologie, Virologie und
Phytoplasmologie) ............................................................................................................ 30
Anhang 6 – Validierung morphologischer und morphometrischer Methoden, die z. B. in der
Entomologie, Nematologie, Mykologie und Botanik verwendet werden ........................ 46
Anhang 7 – Beispiele für Laborberichte über kritische Punkte im Diagnoseverfahren und zu
Messunsicherheiten .......................................................................................................... 47
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 3 von 59
Anwendungsbereich
Diese Leitlinie beinhaltet besondere Qualitätsmanagementanforderungen für Laboratorien, die die
Akkreditierung gemäß ISO-Standard 17025 „General requirements for the competence of testing and
calibration laboratories“ [Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlabo-
ratorien] (Verweise auf die entsprechenden Teile des ISO-Standards 17025 sind enthalten) anstre-
ben. Es ist anzumerken, dass in EPPO-Standards das Verb „müssen/sind zu“ den höchsten Grad der
Verbindlichkeit darstellt.
1 Einführung
Die Entwicklung von Qualitätsmanagementsystemen (auch Managementsysteme oder Qualitätssys-
teme genannt) und die Akkreditierung sind für viele Laboratorien im EPPO-Gebiet wichtig geworden.
Der Standard PM 7/84 Basic requirements for quality management in plant pest diagnosis laborato-
ries [Grundlegende Anforderungen für das Qualitätsmanagement in Diagnoselaboratorien für Schad-
organismen von Pflanzen] wurde 2007 verabschiedet. PM 7/84 beschreibt grundlegende Anforde-
rungen, um Laboratorien, die mit der Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen befasst sind, bei
der Gestaltung ihrer Qualitätsmanagementsysteme zu unterstützen. PM 7/98 enthält zusätzliche
Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung anstreben. Er basiert auf dem ISO-Standard
17025 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories [Allgemeine
Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien] (ISO/IEC, 2005) und ist zu-
sammen mit PM 7/84 anzuwenden. Laboratorien beantragen die Akkreditierung in der Regel nur für
wenige Schadorganismen und nicht für alle Schadorganismen, für die sie möglicherweise eine Diag-
nose durchführen werden.
Die Akkreditierung nach ISO-Standard 17025 wird von den nationalen Akkreditierungsstellen durch-
geführt. Es ist wichtig, dass Laboratorien gute Kommunikationswege finden und während des gesam-
ten Vorgangs regelmäßigen Kontakt zu ihrer nationalen Akkreditierungsstelle halten.
Vorliegendes Dokument befasst sich mit der Diagnosequalität und nicht mit Fragen der Gesundheit
und Sicherheit im Besonderen. Die Laborpraxis muss jedoch den nationalen Gesundheits- und
Sicherheitsbestimmungen entsprechen.
2 Akkreditierungsbereich: fester und flexibler Bereich [Scope of accreditation]
Historisch betrachtet, erfolgte die Akkreditierung von Laboratorien in der Regel auf der Grundlage
eines festen Bereichs, der den Testbereich, der durch die Akkreditierung des Laboratoriums abge-
deckt ist, klar und eindeutig festlegt (z. B. Immunofluoreszenztest für den Nachweis von Ralstonia
solanacearum an Kartoffelknollen). Dennoch ist es nicht ohne weiteres möglich, neue oder modifi-
zierte Tests zum Akkreditierungsbereich eines Laboratoriums zuzufügen, auch wenn die Eignung des
Laboratoriums für die Durchführung und Validierung ähnlicher Tests schon von einer Akkreditie-
rungsstelle begutachtet wurde. Obwohl die Erweiterung des Bereichs jederzeit beantragt werden
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 4 von 59
kann, kann die benötigte Zeit de facto eine schnelle Reaktion auf Wünsche des Kunden verhindern.
Deshalb wurde das Konzept des flexiblen Akkreditierungsbereichs entwickelt.
Ein flexibler Akkreditierungsbereich ermöglicht es einem Labor, bestimmte Tests durchzuführen und
die Ergebnisse als akkreditiert auszugeben, auch wenn diese Tests nicht ausdrücklich im Akkreditie-
rungsbereich des Laboratoriums genannt sind („Requirements for the Accreditation of Flexible Scopes
EA-2/15, 2008“ [Anforderungen an die Akkreditierung flexibler Bereiche] EA-2/15, 2008). Der Bedarf
nach einem flexiblen Akkreditierungsbereich kann zum Beispiel in folgenden Situationen entstehen:
Optimierung eines akkreditierten Tests,
Modifizierung eines akkreditierten Tests, um weitere Anwendungen zu ermöglichen (z. B. für
neue Matrizes),
Aufnahme eines Tests, der dem bereits akkreditierten gleichwertig ist.
Das Konzept des flexiblen Bereichs beinhaltet einen Grad an Flexibilität, der normalerweise mit der
Akkreditierungsstelle abgestimmt ist. Dennoch ist anzumerken, dass dieser Grad an Flexibilität auf
nationaler Ebene unterschiedlich ausgelegt wird. Bisherige Erfahrungen mit Laboratorien für Schad-
organismen von Pflanzen zeigen, dass es durch den flexiblen Bereich für ein Laboratorium leichter ist,
vor dem Audit und der Akkreditierung für neue Tests akkreditiert zu werden. Es trägt dabei jedoch
größere Verantwortung nachzuweisen, dass ein Test gültig und dem Anwendungszweck angemessen
ist und mit Kompetenz und Zuverlässigkeit durchgeführt wird. Gibt ein Laboratorium einen Test als
akkreditiert aus und werden bei einem späteren Audit Probleme mit den verwendeten Verfahren
festgestellt, könnte es passieren, dass die Ergebnisse als ungültig gelten und alle ausgestellten Diag-
noseberichte zurückgezogen werden müssen. Es ist also sinnvoll, Erfahrung mit einer Akkreditierung
mit festem Anwendungsbereich zu sammeln, bevor ein Laboratorium einen flexiblen Akkreditie-
rungsbereich beantragt, weil in beiden Fällen alle Anforderungen des ISO-Standards 17025 eingehal-
ten werden müssen. Ein Laboratorium kann jedoch bereits für andere Aktivitäten als die Diagnose
von Schadorganismen von Pflanzen akkreditiert sein. Erfahrungen mit einer festen Akkreditierung auf
anderem Gebiet können für die sofortige Beantragung einer flexiblen Akkreditierung für die Diagnose
von Schadorganismen von Pflanzen ausreichend sein.
3 Termini und Definitionen
Die Definitionen der in vorliegendem Standard verwendeten Termini sind in PM 7/76 Use of EPPO
diagnostic protocols [Verwendung von EPPO-Diagnoseprotokollen] (wird überarbeitet) enthalten.
In vorliegendem Standard bezieht sich „Test“ [test] auf die Anwendung einer Methode auf einen
bestimmten Schadorganismus und eine bestimmte Matrix [matrix]. Alle Testergebnisse von Labora-
torien, die Tests für Quarantäneschadorganismen durchführen, werden qualitativ angegeben (Test
positiv oder negativ oder unklar). Im Ergebnis einiger Tests erhält man quantitative Ergebnisse (z. B.
optische Dichte bei ELISA, Anzahl der Zellen bei IF-TEST, Ct-Werte bei Real-Time-PCR, Messwerte für
morphologische Merkmale). Diese quantitativen Angaben werden jedoch für die Ermittlung eines
qualitativen Werts (positiv/negativ/unklar) verwendet. Folgende Methoden können verwendet wer-
den: Bioassays, biochemische Methoden, Fingerabdruck, Isolierung/Extraktion, molekulare Metho-
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 5 von 59
den, morphologische und morphometrische Methoden, Pathogenitätsbewertung und serologische
Methoden.
4 Managementanforderungen (ISO 17025 Punkt 4)
Das Laboratorium muss ein Qualitätsmanagementsystem entwickeln, umsetzen und pflegen, das alle
Einrichtungen und Aktivitäten im Rahmen der akkreditierten Diagnose von Schadorganismen von
Pflanzen abdeckt.
Das Managementsystem muss die betroffenen Einrichtungen und Aktivitäten (einschließlich Einzel-
heiten zu den Kunden und getesteten Schadorganismen) beschreiben. Das Qualitätssystem muss
dokumentiert und die Qualitätsdokumente müssen archiviert werden (siehe auch unten).
Managementsystem des Laboratoriums: siehe derselbe Abschnitt PM 7/84.
4.1 Verpflichtung der obersten Leitungsebene (ISO 17025 Punkt 4.2.3)
Die oberste Leitungsebene (z. B. der Institutsdirektor) verpflichtet sich, die Ziele des Qualitätsmana-
gements zu erreichen und die Effektivität seines Managementsystems ständig zu erhöhen. Sie er-
bringt einen Nachweis dieser Verpflichtung.
4.2 Kontinuierliche Verbesserung und Überprüfung durch die Leitung (ISO 17025 Punkt 4.10)
Das Managementsystem des Laboratoriums einschließlich der Labortests wird regelmäßig von der
obersten Leitung überprüft, um dessen fortdauernde Eignung und Effektivität sicherzustellen und
notwendige Änderungen und Verbesserungen einzuführen. Das Laboratorium setzt ein Programm für
kontinuierliche Verbesserungen um. Interne Verfahren und externe Begutachtungen können die
notwendigen Informationen liefern. Zu internen Verfahren zählen:
das Festlegen von Qualitätszielen und geeigneten Qualitätsindikatoren (z. B. pünktliche Lieferung
der Ergebnisse oder Verbesserung des Kundenfeedback). Das ist durch die Leitung zu überprüfen.
die Organisation von Mitarbeiterbesprechungen zu folgenden Themen:
o die Planung von vorbeugenden Maßnahmen und die Bewertung der Wirksamkeit von Korrek-turmaßnahmen,
o die gründliche Analyse interner Audits [audit],
o die Prüfung von Beschwerden und entsprechender Korrekturmaßnahmen usw.
o das Feststellen von Schulungsbedarf,
o das Sammeln von Verbesserungsvorschlägen der Mitarbeiter.
Verfahren zum Einholen eines Kundenfeedbacks.
Trendanalysen (technische oder Management).
Bewertungen durch externe Audits, Ergebnisse von Laborvergleichsuntersuchungen [inter-laboratory
comparisons] (Eignungsprüfungen [profiency tests] und/oder die Prüfung der Leistungsfähigkeit eines
Tests [test performance studies]) sind ebenfalls wichtige Elemente der kontinuierlichen Verbesse-
rung.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 6 von 59
5 Technische Anforderungen (ISO 17025 Punkt 5)
5.1 Allgemeines (ISO 17025 Punkt 5.1)
Siehe gleicher Abschnitt PM 7/84
5.2 Personal (ISO 17025 Punkt 5.2)
Siehe gleicher Abschnitt PM 7/84
5.3 Räumlichkeiten und Umgebungsbedingungen (ISO 17025 Punkt 5.3)
Siehe gleicher Abschnitt PM 7/84
5.4 Diagnostische Methoden (ISO 17025 Punkt 5.4)
5.4.1 Allgemeines (ISO 17025 Punkt 5.4.1)
Das Laboratorium verwendet geeignete Methoden und Verfahren für alle Tests im Rahmen seines
Akkreditierungsbereichs. Dazu gehören Handhabung, Transport, Lagerung, Aufbereitung und Testung
von Proben und ggf. die Probenahme selbst. Es wird erwartet, dass Diagnoselaboratorien über
Kenntnisse der Biologie von Organismen verfügen und diese berücksichtigen, wenn sie Teilproben
nehmen und/oder wenn sie Proben für eine Untersuchung aufbereiten, was den Umgang mit Proben
einschließt. Gekaufte Geräte, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien müssen für den Verwendungs-
zweck geeignet sein.
Alle Anweisungen, Standards, technischen Handbücher, Informationen der Hersteller und Referenz-
daten, die für die Arbeit des Laboratoriums benötigt werden, müssen auf dem Laufenden gehalten
werden und dem Personal leicht zugängig sein.
5.4.2 Auswahl der Tests (ISO 17025 Punkt 5.4.2)
Ein Laboratorium verwendet Diagnosetests, die dem Anwendungszweck entsprechen (siehe EPPO-
Standard PM 7/76 Use of EPPO diagnostic protocols [Verwendung von EPPO-Diagnoseprotokollen].
Gesetzlich vorgeschriebene Tests (z. B. durch die Europäischen Union oder die nationale Gesetz-
gebung) sind für die betreffenden Länder bindend. Ist kein Test verbindlich, sollten vorzugsweise
veröffentlichte internationale, regionale oder nationale Standards verwendet werden. Stehen solche
Tests nicht zur Verfügung oder kann die Leistung verbessert werden, können laboreigene oder ange-
passte Tests berücksichtigt werden.
Das Laboratorium stellt sicher, dass es die neueste gültige Fassung eines Tests verwendet, es sei
denn, dies ist unzweckmäßig oder nicht möglich1. Die Testbeschreibung ist gegebenenfalls um weite-
re Einzelheiten zu ergänzen, wenn dadurch die zuverlässige Anwendung im Laboratorium unterstützt
wird.
1 Ein Laboratorium darf die frühere Version eines Tests weiterhin verwenden, wenn diese dem An-
wendungszweck noch angemessen ist.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 7 von 59
Ein Labor, das die Akkreditierung anstrebt, darf nur validierte Tests verwenden. Ist das nicht der Fall,
muss der Test im Laboratorium ein Validierungsverfahren durchlaufen (siehe 5.4.3). Wird ein vali-
dierter Test verwendet, muss das Laboratorium einen objektiven Nachweis dafür erbringen, dass es
den Test entsprechend der festgelegten Leistungskriterien durchführen kann (siehe 5.4.4).
Tests, mit denen Angaben zu allen Leistungskriterien erbracht werden, gelten im Rahmen des vorlie-
genden Dokuments als "vollständig validierte Tests" und entsprechen den "Standardmethoden" im
ISO-Standard 17025.
5.4.3 Validierung von Tests (ISO 17025 Punkt 5.4.5)
Mit der Validierung wird ein objektiver Nachweis dafür erbracht, dass der Test für den Anwendungs-
zweck geeignet ist (siehe EPPO-Standard PM 7/76, in dem unterschiedliche Anwendungszwecke be-
schrieben werden). Untersuchungen der Leistungsfähigkeit eines Tests können ein wertvoller Be-
standteil des Validierungsverfahrens sein.
5.4.3.1 Validierung von Tests, die nicht auf morphologischen und morphometrischen Methoden
beruhen
Allgemeines
Ein Test gilt als vollständig validierter Test, wenn Angaben für die folgenden Leistungskriterien vorlie-
gen: analytische Sensitivität, analytische Spezifität, Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit. Je
nach Anwendungsbereich des Tests muss eventuell die Selektivität bestimmt werden. Je nach lokalen
Bedingungen (z. B. der Wahrscheinlichkeit von Falschreaktionen mit nah verwandten Organismen,
die in den Originaldaten nicht enthalten sind) sind durch das Laboratorium möglicherweise auch wei-
tere Angaben zur analytischen Spezifität beizubringen. Sobald diese Angaben vorliegen, gelten solche
Tests als validiert. Liegen keine Angaben zu den Leistungskriterien vor oder sind diese nicht zugäng-
lich (z. B. veröffentlichte Quellen oder Datenblätter für Validierungen der EPPO—Diagnose-
Datenbank2), muss das Laboratorium die fehlenden Angaben beibringen oder begründen, warum sie
nicht beigebracht werden konnten. Sind Angaben zu Leistungskriterien teilweise verfügbar, ist durch
das Laboratorium zu verifizieren, dass es den Test diesen entsprechend durchführen kann (siehe
5.4.4).
Nicht alle Tests in EPPO-Diagnoseprotokollen sind validiert. Eine Erhebung über die Verwendung von
Tests aus EPPO-Diagnoseprotokollen aus dem Jahr 2008, die 2013 wiederholt wurde, (Petter &
Suffert, 2010) hat ergeben, dass die in Anhang 1 genannten am häufigsten verwendet werden. Damit
gelten sie für das EPPO-Diagnose-Panel als ausreichend vertrauenswürdig in Bezug auf Wiederhol-
barkeit und Reproduzierbarkeit. Ein Labor, das diese Tests anwendet, muss zumindest Validierungs-
daten für die analytische Sensitivität und analytische Spezifität beibringen oder sammeln.
Das regelmäßige Überprüfungsprogramm für EPPO-Diagnoseprotokolle beinhaltet das Ergänzen von
Validierungsdaten.
2 http://dc.eppo.int
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 8 von 59
Validierungsverfahren
Wie in ISO 17025 erwähnt "muss das Laboratorium die erhaltenen Ergebnisse und das für die Validie-
rung verwendete Verfahren aufzeichnen".
Das allgemeine Validierungsverfahren wird nachfolgend beschrieben (siehe auch Abb. 1). Eine detail-
liertere Anleitung findet sich in den Tabellen 4 bis 9 im Anhang 5.
Bestimmung des Anwendungsbereichs des Tests, z. B. Nachweis und/oder Bestimmung eines Or-
ganismus X in einer Matrix Y mit Hilfe der Methode Z unter Berücksichtigung jeglicher besonderer
Anforderungen unter den gegebenen Testbedingungen (Beispiele in PM 7/76).
Festlegung der technischen Anforderungen zur Bestimmung der Leistungskriterien analytische
Spezifität, analytische Sensitivität, Selektivität, Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit anhand
der Anleitung in den Tabellen 4 bis 9. Anschließend Bestimmung der Art und der Zusammenset-
zung der Proben, die für die Validierung benötigt werden. Die Validierung erfolgt mit Referenzma-
terial (siehe Definition in PM 7/84) einschließlich künstlich verseuchte oder gespikte Proben.
Werden Kulturen oder Isolate für biologische Tests verwendet, ist darauf zu achten, dass sie
nachweislich virulent sind.
Planung und Durchführung der Validierung für einzelne Leistungskriterien oder in einen kombi-
nierten Test. Es wird empfohlen, die Schritte gemäß Abbildung 1 durchzuführen.
Darstellung der Ergebnisse in einem Validierungsbericht einschließlich Schlussfolgerung, ob der
validierte Test die Anforderungen gemäß Punkt 1 erfüllt.
Die Verwendung eines Formulars "Bericht zur Validierung eines Tests" könnte nützlich sein, das
Formular kann wie in Anhang 3 gestaltet sein.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 9 von 59
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 10 von 59
Die Validierung eines Tests (A) durch Vergleich mit einem validierten Test (B) ist auch möglich und
kann in bestimmten Situationen (siehe Anhang 2) geeignet sein. Das bedeutet jedoch nur, dass z. B.
Test (A) in Bezug auf bestimmte Leistungskriterien genauso gut ist wie der validierte Test (B).
Die hier beschriebenen Validierungsverfahren (und insbesondere die Erklärungen in den Tabellen 4
bis 9 im Anhang 5) gelten als allgemeine Anleitung für die Validierung von Tests. Die in den Tabellen
genannten Zahlen basieren auf Validierungserfahrungen von Experten der EPPO-Diagnose-Panels.
Der Validierungsumfang ergibt sich aus dem Verhältnis von Kosten, Risiken und technischer Mach-
barkeit. Abweichungen von dieser Anleitung können sich zwangsläufig aus der Kombination von
Schadorganismus und Pflanze ergeben. In diesem Fall ist der Grund für die Abweichung zu dokumen-
tieren. In vorliegendem Dokument kann keine detaillierte Beschreibung für jede Kombination ange-
boten werden.
Validierung nach signifikanter Änderung
Verändert das Laboratorium einen "vollständig validierten Test" signifikant (z. B. durch Untersuchun-
gen außerhalb des ursprünglichen Bereichs), muss dieser "neue" Test validiert werden. Verändert das
Laboratorium einen validierten Test geringfügig, ist zu beurteilen und entsprechend zu dokumentie-
ren, ob der Test aufgrund dieser Änderung validiert oder verifiziert werden muss. Jede Änderung
muss von einer geeigneten Person autorisiert werden, und ggf. ist der Kunde oder die Akkreditie-
rungsstelle zu benachrichtigen.
Zusätzliche Informationen
Gesammelte Daten und Ergebnisse aus laboreigenen Validierungen (insbesondere zur Reproduzier-
barkeit) sowie Ergebnisse aus Laborvergleichsuntersuchungen (Eignungsprüfungen) können auch auf
die Robustheit eines Tests hinweisen, z. B. inwiefern unterschiedliche Reagenzien oder geänderte
Testbedingungen die zu erwartenden Testleistungswerte beeinträchtigen. Daten über die diagnosti-
sche Sensitivität oder Spezifität lassen sich auch durch einen Vergleich mit einem oder mehreren
alternativen Tests gewinnen.
5.4.3.2 Validierung morphologischer und morphometrischer Methoden
Es ist anerkannt, dass die Verfahren morphologischer und morphometrischer Methoden letztendlich
Urteile aufgrund einer Expertenmeinung darstellen. Aus diesem Grund kann die Validierung nicht
denselben Verfahren folgen wie bei den anderen Tests. Eine Anleitung für die Validierung morpholo-
gischer und morphometrischer Methoden ist in Anhang 6 enthalten. Die Anleitung gilt für alle An-
wendungsgebiete (Entomologie, Nematologie, Mykologie, Botanik usw.). Das Laboratorium sollte die
Wahl der morphologischen oder morphometrischen Methoden begründen können, insbesondere
wenn diese nicht in internationalen Standards oder in begutachteten (peer reviewed) Fachzeitschrif-
ten beschrieben sind.
5.4.4 Verifizierung der Fähigkeit eines Laboratoriums, einen bestimmten Test durchzuführen (ISO
Punkt 5.4.2 Absatz 2 letzter Satz)
Verifizierung ist das Verfahren, nach dem der objektive Beweis erbracht werden muss, dass ein Labo-
ratorium in der Lage ist, einen bestimmten vollständig validierten Test dem Anwendungszweck ent-
sprechend durchzuführen.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 11 von 59
5.4.4.1 Verifizierung von Tests, die nicht auf morphologischen und morphometrischen Methoden
beruhen
Allgemeines
Durch die Verifizierung wird der objektive Nachweis dafür erbracht, dass ein Laboratorium in der
Lage ist, einen vollständig validierten Test entsprechend seiner festgelegten Leistungskriterien durch-
zuführen. Die Verifizierung kann auch durch Teilnahme an einer Eignungsprüfung oder einer Unter-
suchung der Leistungsfähigkeit eines Tests erfolgen, sofern die Anforderungen in Tabelle 1 erfüllt
werden können.
Zusätzliche Informationen
Die Wahl der Reagenzien kann entscheidend für die Leistung eines Tests sein. Die Änderung der Rea-
genz (oder Partien/Chargen einer Reagenz) oder des Anbieters kann die Leistung eines Tests beein-
flussen. In diesem Fall muss die Leistung der Reagenz entweder durch Vergleich mit der vorher ver-
wendeten Reagenz oder gemäß Tabelle 1 verifiziert werden.
Tabelle 1. Anleitung für die Verifizierung von Leistungskriterien
Leistungskriterien Verifizierungsmethode
Analytische Sensitivität Mindestens 8 Proben1 an der ermittelten Nach-weisgrenze testen (bei Viren, Viroiden und Phytplasmen sollte dies bei niedriger Kontamina-tion erfolgen).
Kombinierbar mit Wiederholbar-keit/Reproduzierbarkeit
Analytische Spezifität Einige der wichtigsten Zielorganismen (z. B. un-terschiedliche Stämme) und Nicht-Zielorganismen1 auswählen. Die Tests sind bei bei mittlerer Kontamination durch die Organis-men durchzuführen.
Wiederholbarkeit Mindestens 3 Parallelversuche mit demselben Material bei niedriger Kontamination durch Ziel-organismen durchführen.
Reproduzierbarkeit Wie bei Wiederholbarkeit, aber zu unterschiedli-chen Zeiten, wenn möglich durch unterschiedli-che Mitarbeiter und ggf. mit unterschiedlichen Geräten
* künstliche Teilproben einer Probe können verwendet werden
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 12 von 59
Verifizierungsverfahren
Das allgemeine Verifizierungsverfahren wird weiter unten beschrieben (siehe auch Abb. 2).
Durchführung des validierten Tests wie beschrieben oder mit geringen Änderungen, um lokale
Bedingungen zu berücksichtigen (z. B. Anbieter von Reagenzien oder Geräten, sofern dies nicht
ausdrücklich im validierten Test gefordert ist) und um zu bewerten, ob das Laboratorium die Wer-
te für die Leistungskriterien der Validierungsdaten erreicht (siehe Leitlinien Tabelle 1). Die Selekti-
vität braucht nicht verifiziert werden.
Wenn Abweichungen von den im validierten Test beschriebenen Bedingungen die Testergebnisse
beeinträchtigen, sind die Gründe für die Abweichungen zu untersuchen. Der Test ist zu korrigie-
ren, erneut zu verifizieren oder ggf. nach dem im Abschnitt "Validierung von Tests" beschriebe-
nem Verfahren zu validieren. Werden die Leistungswerte nicht erreicht, ist zu untersuchen, ob die
geringfügigen Änderungen des Tests die Ursache dafür sind. Ist das nicht der Fall, ist externer Rat
einzuholen (z. B. Kontakt zum Autor des Tests). Dann sollten Anpassungen vorgenommen und re-
levante Schritte wiederholt werden. Wurden andere Gründe für die Abweichung festgestellt (z. B.
Fehler durch Mitarbeiter), muss eine Korrektur erfolgen und diese dokumentiert werden.
Ergebnisse des Verifizierungstests:
(A) Die Leistungswerte werden erreicht: das Laboratorium kann den Test für Routinezwecke ver-
wenden, und es ist ein Verifizierungsbericht mit dem bescheinigt wird, dass die Anforderungen
eingehalten oder nicht eingehalten wurden, zu erstellen. Möglicherweise ist die Verwendung ei-
nes Formulars "Bericht zur Verifizierung eines Tests" sinnvoll, das Formular kann wie in Anhang 4
gestaltet sein.
(B) Die Leistungswerte werden nicht erreicht: das Laboratorium darf den Test nicht entsprechend
der festgelegten Leistungskriterien anwenden.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 13 von 59
5.4.4.2 Verifizierungsverfahren morphologischer und morphometrischer Methoden
Das Laboratorium muss bestätigen, dass es eine validierte morphologische und/oder
morphometrische Bestimmung sachgerecht durchführen kann. Solch eine Verifizierung kann durch
Teilnahme an einer Eignungsprüfung oder durch die Bestimmung mehrerer Proben im Laboratorium
und anschließende Bestätigung durch einen unabhängigen Fachexperten erfolgen.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 14 von 59
5.4.5 Messunsicherheit (ISO 17025 Punkt 5.4.6)
Die Laboratorien müssen die Faktoren der Testunsicherheit wie z. B. das Personal, Geräte und biolo-
gische Eigenschaften (d. h. Serotypen, Pathotypen) ermitteln. Wiederholbarkeit und Reproduzierbar-
keit geben Auskunft über den Grad der Unsicherheit eines Testergebnisses. Wann immer es möglich
ist, sind geeignete Maßnahmen zur Einschränkung dieser Unsicherheiten zu ergreifen. Werden keine
Maßnahmen ergriffen, sind die Gründe dafür festzuhalten, und der Kunde ist über die Unsicherheiten
rings um den Test umfassend zu informieren.
Obwohl die Tests zur Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen zumeist qualitative Ergebnisse
liefern, können diese qualitativen Ergebnisse auf Messungen beruhen (morphometrische Daten, Zäh-
len von Zellen). Eine solche Messung mag nur einen Teil des Diagnoseverfahrens ausmachen. Ist es
jedoch für die Diagnose entscheidend, ist ihre Unsicherheit zu schätzen. Zwei Beispiele für Laborbe-
richte zur Feststellung kritischer Punkte eines Verfahrens sind in Anhang 7 enthalten.
5.5 Geräte (ISO 17025 Punkt 5.5)
Siehe derselbe Abschnitt PM 7/84
5.6 Referenzmaterial (ISO 17025 Punkt 5.6.3.2)
Siehe derselbe Abschnitt PM 7/84
5.7 Probenahme (ISO 17025 Punkt 5.7)
Siehe derselbe Abschnitt PM 7/84
5.8 Umgang mit der Probe (ISO 17025 Punkt 5.8)
Siehe derselbe Abschnitt PM 7/84
5.9 Sicherstellung der Diagnosequalität (ISO 17025 Punkt 5.9)
Siehe derselbe Abschnitt PM 7/84
5.10 Ergebnisberichte (ISO 17025 Punkt 5.10.3)
Siehe EPPO-Standard PM 7/77 Documentation and reporting on a diagnosis [Dokumentation und
Bericht zu einer Diagnose]
6 Quellen
AFNOR (12995). XP V03-111 Agricultural and food products analysis protocol for the intra-laboratory
evaluation of an alternative method of qualitative analysis against a reference method. Association
Française de Normalisation, La Plaine Saint-Denis, FR.
EA (2008) EA-2/15 Requirements for the Accreditation of Flexible Scopes
http://www.eurolab.org/docs/EA/EA-2_15.pdf [accessed 2009-09-16]. European Association for Ac-
creditation
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 15 von 59
EPPO (2007), Basic requirements for quality management in plant pest diagnosis laboratories. EPPO
Bulletin, 37 580-588
EPPO (2010), PM 7/76 (2): Use of EPPO diagnostic protocols. EPPO Bulletin, 40: 350–352.
EPPO (2006), PM 7/77 (1): Documentation and reporting on a diagnosis. EPPO Bulletin, 36: 459–460.
Hughes K. J. D., Griffin R. L., Tomlinson J. A., Boonham N., Inman A. J. & Lane C. (2006) Development
of a one step real-time PCR assay for diagnosis of Phytophthora ramorum. Phytopathology 96: 975-
981.
ISO/IEC (2005) Standard 17025 General requirements for the competence of testing and calibration
laboratories (verfügbar auf www.iso.org)
Petter F. & Suffert M. (2010) Survey on the use of tests mentioned in EPPO Diagnostic protocols Bul-
letin OEPP/EPPO Bulletin 40, 5-22.
ISO (2003) ISO 16140 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Protocol for the validation of
alternative methods (verfügbar auf www.iso.org)
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 16 von 59
7 Anhänge
Anhang 1 - Liste von Tests, die Bestandteil von EPPO-Diagnoseprotokollen sind und häufig ver-
wendet werden
Aufgrund der Erhebungen der EPPO zur Verwendung der EPPO-Diagnoseprotokolle wurde festgelegt,
dass ein Test als breit angewendet gilt, wenn er in mindestens 2 Laboratorien und für mindestens 8
Proben je Laboratorium verwendet wird. Beachten Sie bitte, dass molekulare Tests die DNS-
Extraktion einschließen.
BAKTERIOLOGIE
PM 7/20 (2) Erwinia amylovora
o asymptomatische Pflanzen – direkte Isolierung (auf CCT, King B und Levanmedium)
o asymptomatische Pflanzen - Enrichment DASI ELISA
o asymptomatische Pflanzen - Anreicherung gefolgt von einer konventionellen PCR
o asymptomatische Pflanzen - Anreicherung gefolgt von einer PCR (Bereswill et al.1992)
o asymptomatische Pflanzen - Anreicherung gefolgt von einer Real-Time-PCR (Gottsberger, 2010)
o asymptomatische Pflanzen - Anreicherung gefolgt von einer Real-Time-PCR (Pirc et al.2009)
o asymptomatische Pflanzen – Anreicherungsisolierung (auf King B oder CCT)
o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem Agglutinationstest
o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von DNS-Sequenzierungen
o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem Hypersensitivitätstests
o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem IF-Test
o asymptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem Pathogenitätstest
o symptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von einem Agglutinationstest
o symptomatische Pflanzen - Isolierung gefolgt von biochemischen Tests
o symptomatische Pflanzen – Direkte Isolierung (auf CCT, King B und Levanmedium)
o symptomatische Pflanzen - DNS-Sequenzierung
o symptomatische Pflanzen - Enrichment DASI ELISA
o symptomatische Pflanzen - Anreicherungsisolierung (auf King B oder CCT)
o symptomatische Pflanzen – Erstellung eines Fettsäureprofils
o symptomatische Pflanzen - Hypersensitivitätstest
o symptomatische Pflanzen – IF-Test
o symptomatische Pflanzen – Streifentest [Lateral flow devices]
o symptomatische Pflanzen – Nested-PCR (Llop et al.2000)
o symptomatische Pflanzen - Pathogenitätstest
o symptomatische Pflanzen - PCR (Bereswill et al.1992)
o symptomatische Pflanzen - PCR (Gottsberger nach Obradovic et al.2007)
o symptomatische Pflanzen - PCR (Stoger et al.2006)
o symptomatische Pflanzen - PCR (Taylor et al.2001)
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 17 von 59
o symptomatische Pflanzen - Real-Time-PCR (Gottsberger, 2010)
o symptomatische Pflanzen - Real-Time-PCR (Pirc et al.2009)
PM 7/21 (1) Ralstonia solanacearum
o nichtselektive Isolierung
o selektive Isolierung
o IF-Test
o Bioassay
o PCR
o biochemische Merkmale
o ELISA
o Pathogenitätstest
o REP-PCR
PM 7/42 (2) Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
o Beprobung und Screening von Tomatensämlingen in Pflanzschulen auf latent Infektion gemäß Anhang 1
o Samenextrakt - Verdünnungsausstrich auf nichtselektive Medien
o Samenextrakt - Verdünnungsausstrich auf halb-selektive Medien
o Samenprobe – konventionelle PCR (nach Pastrik & Rainy, 1999)
o Samenprobe - direkte PCR auf IF-positives Samenextrakt (Pastrik & Rainy, 1999)
o Samenprobe - FAP
o Samenprobe - IF-TEST
o Samenprobe - Pathogenitätstest
o symptomatische Pflanzenproben – biochemische Merkmale
o symptomatische Pflanzenproben – konventionelle PCR (nach Pastrik & Rainy, 1999)
o symptomatische Pflanzenproben - Verdünnungsausstrich auf nichtselektive Medien
o symptomatische Pflanzenproben - Verdünnungsausstrich auf semi-selektive Medien
o symptomatische Pflanzenproben - direkte PCR auf IF-positivem Samenextrakt (Pastrik & Rainy, 1999)
o symptomatische Pflanzenproben - FAP
o symptomatische Pflanzenproben - IF-TEST
o symptomatische Pflanzenproben - Pathogenitätstest
PM 7/59 (1) Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
o IF-TEST
o Fish
o PCR (Pastrik, 2000)
o Verdünnungsausstrich auf MTNA oder RCP 88
o Bioassay
o biochemische Merkmale
o FAP
o Pathogenitätstest
o Real-Time-PCR
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 18 von 59
PM 7/60 (1) Pantoea stewartii subsp. stewartii
o Verdünnungsausstrich
o IF-TEST
o Zellfärbung
o FAP
o Morphologie von Kolonien und biochemische Merkmale
o PCR (Coplin & Marjercak, 2002)
PM 7/65 (1) Xanthomonas fragariae
o DAS ELISA
o IF-TEST
o Isolierungsmethode 1
o PCR (Anhang 2)
o Biochemische und physiologische Bestimmung – konventionelle Tests
o Verdünnungsausstrich nach Detached Leaf Assay
o Erstellung eines Fettsäureprofils
o Isolierungsmethode 2
PM 7/96 (1) Xylophilus ampelinus
o Biochemische Tests
o Direkte Isolierung aus symptomatischem Material auf YPGA und/oder NA
o ELISA
o Extraktion aus symptomatischen Blättern
o Extraktion aus symptomatischen Trieben – erste Methode
o Real-Time-PCR Dreo et al., 2007
PM 7/99 (1) Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus
o Verdünnungsausstrich von Samenextrakten auf King B unter Zusatz von Cycloheximid
o Extraktion aus Samen
o IF-TEST an Reinkulturen
PM 7/102 (1) Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens
o Konventionelle PCR Tegli et al., 2002
o Direkte Isolierung auf NBY und SSM
o Direkte Isolierung auf YPGA und SSM
o Extraktion aus asymptomatischen Samen durch Einweichmethode
o Morphologische und biochemische Merkmale von Reinkulturen
o Pathogenitätstest Methode A
PM 7/110 (1) Xanthomonas spp. (Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas gardneri,
Xanthomonas perforans, Xanthomonas vesicatoria), Erreger der Blattfleckenkrankheit an Tomate
und Paprika
o Biochemische Merkmale
o DNS-Barcoding
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 19 von 59
o Extraktion aus Samen
o Extraktion aus symptomatischen Pflanzen
o Analyse von Fettsäuremethylester
o Hypersensititvätsreaktion
o IF-TEST an Reinkulturen
o Isolierung aus Samen auf CKTM
o Isolierung aus Samen auf NA
o Isolierung aus Samen auf YDC
o Isolierung aus Samen auf YPGA
o Isolierung aus symptomatischen Pflanzen auf Wiebrinks Medium
o Isolierung aus symptomatischen Pflanzen auf YGCA
o Pathogenitätstest
ENTOMOLOGIE
PM 7/3 (2) Thrips palmi (EPPO-Standard ersetzt durch Anhang 1 des ISPM 27)
o morphologische Bestimmung
PM 7/11 (1) Frankliniella occidentalis
o morphologische Bestimmung
PM 7/12 (1) Parasaissetia nigra
o morphologische Bestimmung
PM 7/13 (1) Trogoderma granarium
o morphologische Bestimmung
PM 7/19 (1) Helicoverpa armigera
o morphologische Bestimmung
PM 7/38 (1) Unaspis citri
o morphologische Bestimmung
PM 7/35 (1) Bemisia tabaci
o morphologische Bestimmung
PM 7/36 (1) Diabrotica virgifera
o morphologische Bestimmung
PM 7/51 (1) Aonidiella citrina
o morphologische Bestimmung
PM 7/53 (1) Liriomyza spp.
o morphologische Bestimmung
o PCR RFLP
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 20 von 59
PM 7/55 (1) Rhizoecus hibisci
o morphologische Bestimmung
PM 7/56 (1) Scirtothrips aurantii, Scirtothrips citri & Scirtothrips dorsalis
o morphologische Bestimmung
PM 7/71 (1) Opogona sacchari
o morphologische Bestimmung
PM 7/74 (1) Popillia japonica
o morphologische Bestimmung
PM 7/83 (1) Rhynchophorus ferrugineus und Rhynchophorus palmarum
o morphologische Bestimmung
PM 7/104 (1) Ceratitis capitata
o Morphologische Bestimmung
PM 7/107 (1) Rhagoletis completa
o morphologische Bestimmung
PM 7/109 (1) Epitrix cucumeris, E. similaris und E. tuberis
o morphologische Bestimmung
MYKOLOGIE
PM 7/15 (1) Ciborinia camelliae
o morphologische Bestimmung in vivo
PM 7/17 (2) Guignardia citricarpa
o konventionelle PCR (Bonants et al., 2003)
o Isolierung auf Kirschagar (CDAG)
o Isolierung auf Hafermehlagar
o Isolierung auf Kartoffeldextroseagar
o morphologische Bestimmung
o Real-Time-PCR (van Gent-Pelzer et al., 2007)
o Sequenzierung ITS 1 und 2 – nach konventioneller PCR (Bonants et al., 2003)
PM 7/18 (2) Monilinia fructicola
o konventionelle PCR (Ioos & Frey, 2000)
o Isolierung auf Kartoffeldextroseagar
o morphologische Bestimmung
PM 7/27 (1) Puccinia horiana
o morphologische Bestimmung in vivo
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 21 von 59
PM 7/28 (1) Synchytrium endobioticum
o Nachweis von Sporangien in Erde
o morphologische Bestimmung
o Biossay zur Löschung
o Bestimmung des Pathotyps - Feldversuch
o Bestimmung des Pathotyps - Glynne-Lemmerzahl-Methode
o Bestimmung des Pathotyps – Spieckermann-Methode
PM 7/29 (2) Tilletia indica
o Waschtest für unbehandelten Samen
o Isolierung und Keimung von Teliosporen auf Wasseragar
o morphologische Bestimmung
o Waschtest für behandelten Samen
PM 7/45 (1) Cryphonectria parasitica
o Isolierung
o morphologische Bestimmung
PM 7/66 (1) Phytophthora ramorum
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit Gemüsesaftagar V8
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit P5ARP
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit P5ARP[H]
o Isolierung aus Erde mit P5ARP[H]
o Isolierung aus Wasser mit P5ARP[H]
o konventionelle PCR (Wagner & Werres, 2003)
o konventionelle PCR (Kox et al., 2002)
o konventionelle PCR (Lane et al., 2003)
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit Karottensaftagar (Kröber, 1985)
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit Kirschagar (CDAG)
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit Karottenstückenagar (CPA) (Werres et al., 2001)
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit dunklem Karottenagar
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit PARB [H]
o Isolierung aus Pflanzenmaterial mit SNA
o Rhododendronblatttest für Erd- und Wasserproben (Themann et al., 2002) in Kombination mit Isolierung auf CPA (Werres et al., 2001)
o Real-Time-PCR (Hayden et al., 2004)
o Real-Time-PCR (Hughes et al., 2005)
o Sequenzierung der ITS-Region
PM 7/85 (1) Plasmopara halstedii
o Bioassay
o konventionelle PCR in Samen (Ioos et al.2007)
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 22 von 59
PM 7/86 (1) Diaporthe vaccinii
o morphologische Bestimmung in vitro auf MEA
o morphologische Bestimmung in vitro auf PDA
o morphologische Bestimmung in vivo
PM 7/91 (1) Gibberella circinata
o Bestimmung in Pflanzengewebe außer Samen durch Real-Time-PCR mit doppelt markierter Sonde (Ioos et al., 2009)
o Bestimmung in Reinkulturen durch konventionelle oder SyBr Green Real-Time-PCR (Schweigkofler et al., 2004)
o Bestimmung in Samen durch konventionelle oder SyBr Green Real-Time-PCR (Schweigkofler et al., 2004)
o Bestimmung in Samen durch Real-Time-PCR mit doppelt markierter Sonde (Ioos et al., 2009)
o Isolierung aus Pflanzengewebe außer Samen auf DCPA
o Isolierung aus Pflanzengewebe außer Samen auf PDAS
o Isolierung aus Samen auf DCPA und Übertragung auf PDA und SNA
o Isolierung aus Samen auf Komada Medium und Übertragung auf PDA und SNA
o morphologische Bestimmung in Reinkultur
PM 7/92 (1) Gremmeniella abietina
o morphologische Bestimmung in vitro auf anderen Vollmedien
o morphologische Bestimmung in vivo
PM 7/93 (1) Melampsora medusae
o morphologische Bestimmung
PM 7/111 (1) Fusarium foetens
o Isolierung aus symptomatischen Pflanzen auf SNA unter Zusatz von Antibiotika gefolgt von
Ausplattierung auf semi-selektive Medien
o PM 7/112 (1) Phytophthora kernoviae
o Ködertest Erde
o Ködertest Wasser
o konventionelle PCR (Schlenzig, 2011)
o Isolierung auf CPA
o Isolierung auf semi-selektiven V8-Agar
o morphologische Bestimmung
o Real-Time-PCR für eine Region des ras-verwandten Proteins (Ypt1) (Schena et al., 2006)
o Auslösung der Sporulation (Julius Kühn Institute )
o Test für die ITS-Region (Hugues et al., 2011)
NEMATOLOGIE
PM 7/4 (3) Bursaphelenchus xylophilus
o Extraktion mit Bearmann-Trichter
o ITS RFLP PCR (Burgermeister et al., 2009)
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 23 von 59
o morphologische Bestimmung
PM 7/40 (3) Globodera rostochiensis und Globodera pallida
o Bioassay (Test A Bioassay – Methode angewendet in Deutschland und Österreich)
o Bioassay (Test A Reproduktionstest - Methode angewendet in Norwegen)
o Extraktion durch Flaschen- und Papierstreifenmethode
o Extraktion Fenwick-Kanne
o Extraktion Schuilingzentrifuge
o Extraktion Seinhorst-Abscheider
o Extraktion Wye Spüler
o Schlupftest A (Methode angewendet in Norwegen)
o Schlupftest C (Methoden angewendet in Frankreich)
o morphologische und morphometrische Bestimmung
o Multiplex-PCR-Test (Bulman & Marshall, 1997)
o Testung der Überlebensfähigkeit (visuelle Bestimmung)
PM 7/41 (2) Meloidogyne chitwoodi und Meloidogyne fallax
o Extraktion aus Wurzeln Inkubationsmethode
o Extraktion aus Wurzeln Mazeration/Inkubation/Flotation (Coolen, 1979)
o Extraktion aus Erde Baermann-Trichter
o Extraktion aus Erde für große Mengen angepasst Baermann-Trichter
o Extraktion aus Knollen (enzymatischer Abbau) (Araya & Caswell-Chen, 1993)
o Extraktion aus Knollen (Gewebe im Mixer zerkleinert) Extraktionssiebe oder Flotation (Viaene et al., 2007)
o Morphologie
o PCR RFLP (Zijlstra et al., 1997)
o PCR (Wishart et al., 2002)
o PCR (Zijlstra et al, .2000)
o Real-Time-PCR (TaqMan) (Zijlsta & van Hoof, 2006)
PM 7/87 (1) Ditylenchus destructor und Ditylenchus dipsaci
o Extraktion aus Erde
o Extraktion von D. dipsaci aus Samen
o morphologische und morphometrische Bestimmung
PM 7/88 (1) Radopholus similis
o Extraktion aus Pflanzenmaterial
o Extraktion aus Erde
o morphologische und morphometrische Bestimmung
PM 7/89 (1) Heterodera glycines
o morphologische und morphometrische Bestimmung
PM 7/94 (1) Hirschmanniella spp.
o Extraktion aus Wurzeln
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 24 von 59
o Extraktion aus Erde
o morphologische und morphometrische Bestimmung
PM 7/95 (1) Xiphinema americanum sensu lato
o Extraktion aus Erde
o morphologische und morphometrische Bestimmung
PM 7/103 (1) Meloidogyne enterolobii
o Extraktion aus Wurzeln
o Extraktion aus Erde
o morphologische und morphometrische Bestimmung
PHYTOPLASMOLOGIE
PM 7/62 (1) Candidatus Phytoplasma mali
o Holzindikatoren
o ELISA
o Universal-PCR (Lorenz et al., 1995)
o Universal-PCR (Lee et al., 1998)
o AP- oder 16SrX-gruppenspezifische PCR (Lorenz et al., 1995)
o AP-spezifische PCR (Jaraush et al., 1995)
PM 7/63 (1) Candidatus Phytoplasma pyri
o Universal-PCR (Lorenz et al., 1995)
o Universal-PCR (Lee et al., 1998)
PM 7/79 (1) Grapevine flavescence dorée phytoplasma
o Multiplex-nested-PCR (für den gleichzeitigen Nachweis von Flavescence dorée und Bois noir)
o Direkte generische PCR gefolgt von generischer nested-PCR gefolgt von RLFP
o Direkte generische PCR gefolgt von gruppenspezifischer nested-PCR
VIROLOGIE
PM 7/30 (2) Beet necrotic yellow vein benyvirus
o ELISA
PM 7/31 (1) Citrus tristeza closterovirus
o DAS-ELISA
o Tissue print-ELISA
PM 7/32 (1) Plum pox potyvirus
o biologischer Test (Pfropfinokulation von Indikatorpflanzen)
o DAS-ELISA mit 5B-IVIA oder polyklonalen Antikörpern
o IC-RT-PCR
o Co-PCR
o DASI-ELISA mit 5B-IVIA universellen monoklonalen Antikörpern
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 25 von 59
PM 7/33 (1) Potato spindle tuber pospiviroid
o DIG Sonde
o R-PAGE
o RT-PCR
o TaqMan
PM 7/34 (1) Tomato spotted wilt virus, Impatiens necrotic spot virus und Watermelon silver mottle
virus
o mechanische Inokulation von Indikatorpflanzen
o TAS-ELISA
o RT-PCR
o Nachweis von TSWV in Pflanzen und einzelnen Thripsen unter Verwendung der Real-Time-Fluoreszenz-RT-PCR (TaqMan)
o Streifentest [Lateral Flow Devices](LFD)
PM 7/50 (1) Tomato yellow leaf curl und Tomato mottle begomoviruses
o TAS-ELISA
o PCR-Methode 1 (Accotto et al., 2000)
o DNS-Extraktionsmethode 1 (Accotto et al., 2000)
o PCR/MPCR (Deng et al., 1994)
PM 7/67 (1) American plum line pattern virus (Ilarvirus)
o DAS ELISA (Clark & Adams, 1977)
o Holzindikatoren
PM 7/113 (1) Pepino mosaic virus
o Biossay mechanische Inokulation aus Blatt- oder Fruchtextrakten
o Biossay mechanische Inokulation aus Samenextrakt
o DAS ELISA
o Extraktion aus Samen
o Real-Time-PCR (Ling et al., 2007)
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 26 von 59
Anhang 2 - Verfahren der Validierung eines Tests (A) durch Vergleich mit einem
validierten Test (B)
Der Vergleich eines Tests (A) mit einem validierten Test (B) kann ein geeignetes Validierungsverfah-
ren sein, wenn der Grad der analytischen Sensitivität oder analytischen Spezifität des validierten
Tests (B) als ausreichend gilt und wenn der Test (A) einen Vorteil bietet (z. B. schneller, einfacher).
Bekanntlich kann Test (A) einen höheren Grad an Sensitivität oder Spezifität als der validierte Test (B)
haben, und mit Hilfe des Vergleichs wird nur festgestellt, dass die Sensitivität oder Spezifität des
Tests (A) zumindest genauso hoch wie die des validierten Tests (B) ist.
Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit sind ebenfalls für Test (A) zu bewerten (siehe Anhang 5).
Der Vergleich des Tests (A) mit dem validierten Test (B) ist wie folgt durchzuführen:
3 Wiederholungen mit dem Zielorganismus und 3 mit jedem Nichtzielorganismus wie in Tabelle 2
angegeben durchführen. Die Proben sind den beiden Tests parallel zu unterziehen.
Tabelle 2. Mindestanzahl von Proben für den Vergleich eines Tests (A) mit einem validierten Test (B)
Art des Materials Kontamination mit dem Organismus
Niedrig/Niedrig
(relativ*)
Mittel/Mittel
(relativ*)
Hoch/Hoch
(relativ*)
Reinkulturisolate des Zielorganismus
oder mit dem Zielorganismus gespikte
Proben
101 71 51
Reinkulturisolate des Nichtzielorganis-
mus (der Nichtzielorganismen) oder mit
dem Nichtzielorganismus (Nichtzielor-
ganismen) gespikte Proben
- 22 bis 44 -
Natürlich mit dem Zielorganismus kon-
taminierte Probe
Geeignete Verdünnungsreihen werden mit 15 positiven
Proben, die zuvor mit dem validierten Test (B) bestimmt
wurden, hergestellt, um die Nachweisgrenze des validier-
ten Tests (B) festzustellen.
1 Die Gesamtanzahl der Proben von Zielorganismen ist mindestens zweimal so groß wie die Anzahl
der Proben von Nicht-Zielorganismen.
* Für Virologie und Phytoplasmalogie.
Die Anzahl der in dieser Tabelle angegebenen Proben wurde im Vergleich mit veröffentlichten Stan-
dards, z. B.ISO 16140 Microbiology of food and animal feeding stuffs, Protocol for the validation of
alternative methods [Protokoll für die Validierung alternativer Methoden] (ISO, 2003) und AFNOR XP
V03-111 Agricultural and food products analysis, Protocol for the intra-laboratory evaluation of an
alternative method of qualitative analysis against a reference method [Analyse landwirtschaftlicher
Erzeugnisse und von Nahrungsmittel, Protokoll der internen Laborbewertung einer alternativen Me-
thode des Qualitätstests gegenüber einer Referenzmethode] (AFNOR, 1995), ermittelt.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 27 von 59
Die Korrelation zwischen den Ergebnissen des validierten Tests (B) mit denen des Tests (A) ist in Be-
zug auf die unterschiedliche Schadorganismuskontamination zu bewerten. Die Darstellung der Er-
gebnisse und Berechnung der relativen Leistungskriterien kann wie in Tabelle 3 erfolgen.
Tabelle 3. Beispiel für Ergebnisse einer Korrelation von validiertem Test (B) mit Test (A)
validierter Test (B)
Test (A)
+ - Gesamt
+ 69 3 72
- 6 12 18
Gesamt 75 15 90
Tabelle 3 wurde von Hughes et al., 2006 übernommen. Die Zahlen in dieser Tabelle dienen De-
monstrationszwecken.
PA (positive Übereinstimmung), PD (positive Abweichung), ND (negative Abweichung), NA (negative
Übereinstimmung).
Positive (+) und negative (-) Ergebnisse für 90 Proben, die beiden Tests unterzogen wurden, verdeut-
lichen die diagnostische Sensitivität (PA/(PA+ND)), diagnostische Spezifität (NA/(NA+PD)) und relative
Genauigkeit (PA+NA)/(PA+PD+ND+NA). Diagnostische Sensitivität = 92 %, diagnostische Spezifität =
80 %, relative Genauigkeit = 90 %.
PA PD
ND NA
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 28 von 59
Anhang 3 – Bericht zur Validierung eines Test
Testname:
Anwendungsbereich des Tests:
Zusätzliche Anmerkungen:
Die Unterlagen zur Validität des Tests und den Anforderungen an den Test sind im Laboratorium
verfügbar. Dazu gehören Laborbücher und weitere unten genannte Informationen, die aufzeigen, wie
die Verfahren in dieser Untersuchung validiert wurden.
Leistungskriterien A B C D Aufbewahrungsort für die Unterlagen
Analytische Sensitivität
Analytische Spezifität
Selektivität (wenn relevant)
Wiederholbarkeit
Reproduzierbarkeit
A = Daten aus eigenen Laborversuchen
B = Daten aus Laborvergleichsuntersuchungen
C = Informationen der Hersteller
D = Externe Informationen (Literatur usw.)
Weitere Informationen (wahlweise)
Aufbewahrungsort für die Unterlagen
Diagnostische Sensitivität
Diagnostische Spezifität
Robustheit (siehe 5.4.3)
Auf Grundlage der obigen Feststellung wird der Test als für den Anwendungsbereich geeignet bewer-tet.
Verantwortlicher Mitarbeiter für die Durchführung des Tests
Name in Großbuchstaben:
Unterschrift: Datum:
Autorisierte Person
Name in Großbuchstaben:
Unterschrift: Datum:
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 29 von 59
Anhang 4 - Bericht zur Verifizierung eines Tests
Testname:
Ausgewählter vollständig validierter Test:
Anwendungsbereich des vollständig validierten Tests:
Beschreibung von Änderungen:
Die Unterlagen zur Verifizierung des Tests und den Anforderungen an den Test sind im Laboratorium
verfügbar. Dazu gehören Laborbücher und weitere Informationen, die aufzeigen, wie der Verifizie-
rungstest in dieser Untersuchung durchgeführt wurde.
Leistungskriterien Erhaltene Werte für die Leistungskriterien
Erfüllt die Anforde-rungen des vollstän-dig validierten Tests
(Ja/Nein)
Aufbewahrungsort für die Unterlagen
Analytische Sensitivität
Analytische Spezifität
Wiederholbarkeit
Reproduzierbarkeit
Auf Grundlage des obigen Berichts zur Verifizierung gilt der Test als für den Anwendungsbereich ge-
eignet.
Verantwortlicher Mitarbeiter für die Durchführung des Tests
Name in Großbuchstaben:
Unterschrift: Datum:
Autorisierte Person
Name in Großbuchstaben:
Unterschrift: Datum:
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 30 von 59
Anhang 5 – Tabellen mit detaillierter Anleitung für das Validierungsverfahren je Anwendungs-
bereich (Bakteriologie, Botanik, Entomologie, Mykologie, Nematologie, Virologie und
Phytoplasmologie)
Benutzungshinweise für die Tabellen
Anmerkung zu Zahlen
Die in den Tabellen genannten Zahlen basieren auf Validierungserfahrungen von Experten in den
EPPO-Diagnose-Panels. Abweichungen von dieser Anleitung können sich zwangsläufig aus der Kom-
bination von Schadorganismus und Pflanze ergeben. Die Validierung morphologischer und
morphometrischer Methoden ist für alle Bereiche im Anhang 6 beschrieben.
Allgemeine Anmerkung zur analytischen Sensitivität
Die Nachweisgrenze eines Tests (gemäß Definition in PM 7/76) sollte möglichst immer festgestellt
werden. Dennoch kann diese Grenze nicht immer absolut für den Nachweis von Schadorganismen
von Pflanzen festgestellt werden. Es gibt Organismen, die nicht in Kultur gehalten werden können
(obligate Pathogene), die nicht quantifiziert werden können (Pilze), die nur in der Pflanze vorkom-
men oder von denen keine Reinkultur hergestellt werden kann (z. B. Phytoplasmen). Aus diesem
Grund können für diese Organismen keine oder kaum jemals exakte Konzentrationen ermittelt wer-
den und es müssen folglich Schätzungen benutzt werden. Auch wenn man Reinkulturen herstellen
kann (viele Bakterien und Viren), kann die Konzentration nur geschätzt werden (z. B. cfu oder
mg/mL). Diese Schätzung beruht häufig auf einer indirekten Messung. Sofern möglich, sollten serielle
Verdünnungen hergestellt werden bis ein Endpunkt erreicht ist.
Allgemeine Anmerkung zu Wiederholungen
Die Anzahl der Wiederholungen (angegeben in den nachfolgenden Tabellen) entspricht nicht der
Anzahl der technischen Wiederholungen (z. B. Doppel-/Dreifachreaktionen – die ein Standard bei
ELISA-Tests - oder Real-Time-PCR-Läufen sind).
Methode für die Extraktion von Zielorganismen aus einer Matrix (Isolierung eines Zielorganismus)
Extraktionen sind immer durch einen Test zu validieren.
Analytische Sensiti-
vität
Die Methode muss die Extraktion/Isolierung einer ausreichenden Menge des
Zielorganismus, die weiter kultiviert oder untersucht werden kann, ermögli-
chen. Führen Sie Extraktionen aus mindestens 3 Proben mit ho-
her/mittlerer/niedriger Konzentration des Zielorganismus durch.
Die Proben können aus eindeutig infiziertem Material (Diagnose) bestehen,
oder die Proben können auch durch Zugabe von infiziertem Material mit be-
kannter Zelldichte des Zielorganismus zum Probenmaterial hergestellt wor-
den sein (Nachweis von latenter Infektion oder Kontamination).
Analytische Spezifi-
tät
Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus
einer Probe ist per Definition nicht spezifisch.
Selektivität Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus
einer Probe ist per Definition nicht selektiv.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 31 von 59
Wiederholbarkeit Verwenden Sie mindestens eine Probe mit niedriger Konzentration des Ziel-
organismus und stellen Sie mindestens 3 Teilproben (Extraktionen) her. Be-
werten Sie die Extraktionsleistung durch das entsprechende Testverfahren.
Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu extra-
hieren.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Molekulare Methoden, z. B. PCR, Real-Time-PCR und LAMP
Zu diesem Schritt gehören auch Methoden zur Isolierung von DNS aus der Probe.
Analytische Sensiti-
vität
Untersuchen Sie mindestens 3 Serien gespikter Probenextrakte mit 101 – 106
Zellen des Zielorganismus/mL. Dafür sollten vorzugsweise Dezimalverdün-
nungen von Zellsuspensionen des Zielorganismus in den Probenextrakten
hergestellt werden. Bestimmen Sie die niedrigste Zelldichte mit positivem
Testergebnis.
Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Serien aufzubereiten und zu testen.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Handels-
marke der PCR-Reagenzien (insbesondere DNS-Polymerase) und PCR-
Zyklusbedingungen.
Analytische Spezifi-
tät
Testen Sie (I) Stämme des Zielbakteriums, die genetische Diversität, unter-
schiedliche geographische Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken,
und (II) einen Satz von Nicht-Organismen, insbesondere solchen, die mit dem
Probenmaterial assoziiert sind. Verwenden Sie Zellsuspensionen von Reinkul-
turen mit ungefähr 106 Zellen/mL. Bei Nicht-Zielorganismen sollte die Höhe
der Nukleinsäurekonzentration das Auftreten einer Kreuzreaktion maximal
fördern, jedoch realistisch sein.
Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich von
Sonde/Primer-Sequenzen mit Sequenzen in Genbanken untermauert werden.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Wirte derselben
Familie, unterschiedlicher Sorten der Wirtspflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen gespikter Probenextrakte mit nied-
riger Kontamination. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind wei-
tere Serien aufzubereiten und zu testen.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 32 von 59
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Serologische Methoden: IF-TEST und ELISA
Analytische Sensiti-
vität
Untersuchen Sie mindestens 3 Serien gespikter Probenextrakte mit 102 – 106
Zellen des Zielorganismus/mL. Dafür sollten vorzugsweise Dezimalverdün-
nungen von Zellsuspensionen des Zielorganismus in den Probenextrakten
hergestellt werden. Bestimmen Sie die niedrigste Zelldichte mit positivem
Testergebnis bei Antiserum/Antikörper in der Arbeitsverdünnung.
Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Serien aufzubereiten und zu testen.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Anzahl
der Mikroskopfelder, die im IF-Test ausgewertet werden müssen, und die OD-
Schwelle im ELISA-Test.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität von Antikörpern (I) an Stämmen des Zielbakteri-
ums, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge
und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-
Zielbakterien, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert
sind. Verwenden Sie Zellsuspensionen von Reinkulturen mit ungefähr
106 Zellen/mL und verwenden Sie das Antiserum/die Antikörper in der Ar-
beitsverdünnung.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Wirte derselben
Familie, unterschiedlicher Sorten der Wirtspflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen gespikter Probenextrakte mit nied-
riger Kontamination. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind wei-
tere Serien aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 33 von 59
Plattierung: selektive Isolierung
Analytische Sensiti-
vität
Untersuchen Sie mindestens 3 Serien gespikter Probenextrakten mit 10 – 106
Zellen des Zielorganismus/mL. Dafür sollten vorzugsweise Dezimalverdün-
nungen von Zellsuspensionen des Zielorganismus in den Probenextrakten
hergestellt werden. Bestimmen Sie die niedrigste Zelldichte mit positivem
Testergebnis.
Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Serien aufzubereiten und zu testen.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Handels-
marke der Bestandteile für das Medium (insbesondere Antibiotika und Her-
stellung von Stammlösungen) und Inkubationsbedingungen.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität des Nährmediums (I) an Stämmen des Zielorga-
nismus, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge
und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-
Zielbakterien, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert
sind. Verwenden Sie eine Zellsuspension mit ungefähr 106 Zellen/mL und tes-
ten Sie durch Verdünnungsausstrich.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Wirte derselben
Familie, unterschiedlicher Sorten der Wirtspflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen gespikter Probenextrakte mit nied-
riger Kontamination. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind wei-
tere Serien aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Bioassay: selektive Anreicherung in Wirtspflanzen
Analytische Sensiti-
vität
Untersuchen Sie mindestens 3 Serien gespikter Probenextrakte, die mit 102 –
106 Zellen des Zielorganismus/mL. Dafür sollten vorzugsweise Dezimalver-
dünnungen von Zellsuspensionen des Zielbakteriums in den Probenextrakten
hergestellt werden. Bestimmen Sie die niedrigste Zelldichte mit positivem
Testergebnis. Das erfordert die Isolierung aus Testpflanzen mit
Befallssymptomen oder ohne Befallssymptome.
Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Serien aufzubereiten und zu testen.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 34 von 59
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Wachs-
tumsstadium der Testpflanzen, Inokulationsmethode und Inkubationsbedin-
gungen.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität des Bioassays (I) an Stämmen des Zielbakteri-
ums, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge
und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-
Zielbakterien, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert
sind. Verwenden Sie eine Zellsuspension mit ungefähr 106 Zellen/mL.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten einschließ-
lich der empfindlichsten Sorte(n)).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen gespikter Probenextrakte mit nied-
riger Kontamination und verwenden Sie die Wirtspflanzen, die im Spezifitäts-
test bestimmt wurden. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind
weitere Serien aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Pathogenitätstest
Analytische Sensiti-
vität
Dieser Parameter ist für den Pathogenitätstest, der im Allgemeinen mit Sus-
pensionen von ca. 106 Zellen/mL durchgeführt wird, nicht relevant. Die analy-
tische Sensitivität kann jedoch eine Rolle spielen, wenn unterschiedliche
Wachstumsstadien der Wirtspflanze inokuliert werden.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität des Pathogenitätstests an einem Satz von
Stämmen des Zielbakteriums, die genetische Diversität, unterschiedliche geo-
graphische Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken, und an einem
Satz von Nicht-Zielbakterien, insbesondere solchen, die mit dem Probenmate-
rial assoziiert sind. Verwenden Sie Zellsuspensionen mit ungefähr
106 Zellen/mL.
Ein positives Ergebnis erfordert Symptomausprägung und Reisolierung des
Zielorganismus (Kochsches Postulat).
Selektivität Stellen Sie fest, ob die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirtspflanze
die Testleistung beeinträchtigt.
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen einer Gruppe von Stämmen des
Zielbakteriums, die die Variabilität von Bestimmungstests und der Virulenz
abdecken. Verwenden Sie Zellsuspensionen mit ungefähr 106 Zellen/mL.
Ein positives Ergebnis schließt Symptomausprägung und Reisolierung des
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 35 von 59
Zielorganismus (Kochsches Postulat) ein.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Fingerabdruck: Erstellung eines Proteinprofils, Fettsäureprofils und DNS-Profils
Analytische Sensiti-
vität
Bestimmen Sie die Mindestmenge von Bakterien, die von ausgewählten
Nährmedien entnommen werden müssen, um eine zuverlässige Untersu-
chung durchführen zu können.
Die Testparameter müssen genau definiert und standardisiert werden, z. B.
Nährmedium, Kulturstadium für die Entnahme von Zellen.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität des Fingerabdruckverfahrens (I) an Stämmen des
Zielbakteriums, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische
Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von
Nicht-Zielbakterien, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial asso-
ziiert sind.
Stellen Sie Marker zur Differenzierung von Unterarten oder Pathotypen zur
Verfügung.
Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich mit
Daten in Genbanken untermauert werden.
Selektivität Nicht relevant.
Wiederholbarkeit Testen Sie 3 Wiederholungen des Protein-/Fettsäure-/DNS-Extrakts.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Tabelle 5. Botanik
Siehe auch die Benutzungshinweise für die Tabellen
Methode für die Extraktion eines Zielorganismus aus der Matrix
Die Extraktion ist immer durch einen Test zu validieren.
Analytische Sensiti-
vität
Mit der Methode muss eine ausreichende Menge des Zielorganismus für wei-
tere Untersuchungen extrahiert werden können.
Sie können den prozentualen Anteil von Samen invasiver fremder Pflanzen,
der durch die Extraktion zurückgewonnen wird, anhand von mindestens 3
Proben bestimmen.
Analytische Spezifi- Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 36 von 59
tät einer Probe ist per Definition nicht spezifisch.
Selektivität Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus
einer Probe ist per Definition nicht selektiv.
Wiederholbarkeit Verwenden Sie mindestens eine Probe mit niedriger Konzentration des Ziel-
objekts und stellen Sie mindestens 3 Teilproben (Extraktionen) her. Bewerten
Sie die Extraktionsleistung durch das entsprechende Testverfahren. Werden
keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu extrahieren.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Tabelle 6. Entomologie
Siehe auch die Benutzungshinweise für die Tabellen
Methode für die Extraktion eines Zielorganismus aus der Matrix
Die Extraktion ist immer durch einen Test zu validieren.
Analytische Sensiti-
vität
Mit der Methode muss eine ausreichende Menge des Zielorganismus für wei-
tere Untersuchungen extrahiert werden können. Sie können den prozentua-
len Anteil von Insekten, der durch die Extraktion zurückgewonnen wird, an-
hand von mindestens 3 Proben bestimmen.
DNS-Extraktion: die Validierung ist Bestandteil der Validierung molekularer
Verfahren.
Analytische Spezifi-
tät
Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus
einer Probe ist per Definition nicht spezifisch.
Selektivität Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus
einer Probe ist per Definition nicht selektiv.
Wiederholbarkeit Nicht relevant.
Reproduzierbarkeit Nicht relevant.
Molekulare Methoden, z. B. PCR, Real-Time-PCR und LAMP
Zu diesem Schritt gehören auch Methoden für die Isolierung von DNS aus dem Probenmaterial.
Analytische Sensiti-
vität
Bereiten Sie eine entsprechende Anzahl von Individuen auf. Diese Anzahl
hängt vom Geschlecht, der Art und dem Stadium ab. Bestimmen Sie die Min-
destanzahl von Individuen oder den Teil der Individuen, die/der nachzuwei-
sen sind/ist.
Führen Sie mindestens 3 Versuche durch. Werden nach 3 Serien keine ein-
heitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 37 von 59
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Handels-
marke der PCR-Reagenzien (insbesondere DNS-Polymerase) und PCR-
Zyklusbedingungen.
Analytische Spezifi-
tät
Testen Sie (I) eine Reihe von Zielorganismen, die genetische Diversität, unter-
schiedliche geographische Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken,
und (II) relevante Nicht-Zielorganismen, insbesondere solche, die mit dem
Probenmaterial assoziiert sind. Bei Nicht-Zielorganismen sollte die Höhe der
Nukleinsäurekonzentration das Auftreten einer Kreuzreaktion maximal för-
dern, jedoch realistisch sein.
Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich von
Sonde/Primer-Sequenzen mit Sequenzen in Genbanken untermauert werden.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-
pflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger
Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Wiederholungen aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Tabelle 7. Mykologie
Siehe auch die Benutzungshinweise für die Tabellen
Methode für die Extraktion/Isolierung/Ködern von Zielorganismen aus einer Matrix
Extraktionen sind immer durch einen Test zu validieren.
Analytische Sensiti-
vität
Die Methode muss die Extraktion/Isolierung/das Ködern einer ausreichenden
Menge des Zielorganismus, die weiter kultiviert oder untersucht werden
kann, ermöglichen. Sofern möglich, bestimmen Sie durch Mischen von ge-
sundem und infiziertem Gewebe die Mindestmenge von krankem Gewebe
oder Merkmalen, die ausgestrichen bzw. bestimmt werden müssen, um eine
zuverlässige Untersuchung durchführen zu können.
Extrahieren/Isolieren/Ködern Sie den Zielorganismus aus mindestens 3 Pro-
ben (natürlich infizierten oder künstlich beimpften Proben). Dazu können
auch Waschverfahren oder Membranen zum Ködern von Sporen gehören.
Analytische Spezifi-
tät
Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus
einer Probe ist per Definition nicht spezifisch.
Selektivität Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 38 von 59
einer Probe ist per Definition nicht selektiv.
Wiederholbarkeit Verwenden Sie mindestens eine Probe mit niedriger Konzentration des Ziel-
objekts und stellen Sie mindestens 3 Teilproben (Extraktionen) her. Bewerten
Sie die Extraktionsleistung durch die entsprechende Testmethode. Werden
keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu extrahieren.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Molekulare Methoden, z. B. PCR, Real-Time-PCR und LAMP
Zu diesem Schritt gehört auch die Isolierung von DNS aus dem Probenmaterial.
Analytische Sensiti-
vität
Bestimmen Sie die Mindestmenge des Zielobjekt (z. B. Anzahl der Konidien
oder das Gewicht des infizierten Materials in gesundem Material), aus der
eine nachweisbare Menge der Ziel-DNS gewonnen werden kann. Führen Sie
mindestens 3 Versuche mit seriellen Verdünnungsstufen, vorzugsweise in
Wirtspflanzen-DNS, durch. Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergeb-
nisse erzielt, sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Handels-
marke der PCR-Reagenzien (insbesondere DNS-Polymerase) und PCR-
Zyklusbedingungen.
Analytische Spezifi-
tät
Testen Sie (I) eine Reihe von Zielobjekten, die genetische Diversität, unter-
schiedliche geographische Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken,
und (II) relevante Nicht-Zielorganismen (z. B. phylogenetisch verwandte Pil-
ze), die in der Probe und im Probenextrakt vorkommen können. Bei Nicht-
Zielorganismen sollte die Höhe der Nukleinsäurekonzentration das Auftreten
einer Kreuzreaktion maximal fördern, jedoch realistisch sein.
Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich von
Sonde/Primer-Sequenzen mit Sequenzen in Genbanken untermauert werden.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-
pflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger
Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Proben zu aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 39 von 59
Serologische Methoden: ELISA
Analytische Sensiti-
vität
Bestimmen Sie die Mindestmenge des Zielobjekts (z. B. Anzahl der Konidien
oder das Gewicht des infizierten Materials in gesundem Material), mit positi-
vem Testergebnis mit Antiserum/Antikörper in der Arbeitsverdünnung.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. OD-
Schwelle. Werden nach 3 Versuchen keine einheitlichen Ergebnisse erzielt,
sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität von Antikörpern (I) an Stämmen des Zielorga-
nismus, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge
und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-
Zielorganismen, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert
sind.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-
pflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger
Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Proben zu aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Bioassay: Pathogenitätstest
Analytische Sensiti-
vität
Bestimmen Sie die Matrixmenge oder Matrixextraktmenge (z. B. Gramm Blät-
ter, Erde), die für die Erzeugung von Symptomen erforderlich ist. Führen Sie 3
Versuche mit 5 Verdünnungsserien durch.
Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Serien aufzubereiten und zu testen.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Stadium
der Testpflanzen, Inokulationsmethode und Inkubationsbedingungen.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität des Bioassays (I) an Stämmen des Zielpilzen, die
genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge und unter-
schiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-Zielorganismen,
insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert sind.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 40 von 59
pflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger
Konzentration und verwenden Sie die Wirtspflanzen, die im Spezifitätstest
bestimmt wurden. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weite-
re Proben zu aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Tabelle 8. Nematologie
Siehe auch die Benutzungshinweise für die Tabellen
Methode für die Extraktion von Zielorganismen aus einer Matrix
Extraktionen sind immer durch einen Test zu validieren.
Analytische Sensiti-
vität
Mit der Methode muss eine ausreichende Menge des Zielorganismus für wei-tere Untersuchungen extrahiert werden können. Der prozentuale Anteil von Nematoden, der durch die Extraktion gewonnen wird, ist anhand von mindes-tens 3 Proben zu bestimmen.
Analytische Spezifi-
tät
Dieser Parameter ist nicht relevant. Die Extraktion des Zielorganismus aus einer Probe ist per Definition nicht spezifisch.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-trächtigen (z. B. Bodenart für Zystenextraktoren).
Wiederholbarkeit Verwenden Sie mindestens eine Probe mit niedriger Konzentration des Ziel-organismus und stellen Sie mindestens 3 Teilproben (Extraktionen) her. Be-werten Sie die Extraktionsleistung durch das entsprechende Testverfahren.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-ten.
Molekulare Methoden, z. B. PCR, Real-Time-PCR und LAMP
Zu diesem Schritt gehört auch die Isolierung von DNS aus dem Probenmaterial.
Analytische Sensiti-
vität
Bereiten Sie eine entsprechende Anzahl von Individuen auf. Diese Anzahl hängt vom Geschlecht, der Art und dem Stadium ab. Bestimmen Sie die Min-destanzahl von Individuen oder den Teil der Individuen, die/der nachzuwei-sen sind/ist.
Führen Sie mindestens 3 Versuche durch. Werden nach 3 Serien keine ein-heitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Handels-marke der PCR-Reagenzien (insbesondere DNS-Polymerase) und PCR-
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 41 von 59
Zyklusbedingungen.
Analytische Spezifi-
tät
Testen Sie (I) eine Reihe von Zielorganismen, die genetische Diversität, unter-schiedliche geographische Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) relevante Nicht-Zielorganismen, insbesondere solche, die mit dem Probenmaterial assoziiert sind. Bei Nicht-Zielorganismen sollte die Höhe der Nukleinsäurekonzentration das Auftreten einer Kreuzreaktion maximal för-dern, jedoch realistisch sein.
Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich von Sonde/Primer-Sequenzen mit Sequenzen in Genbanken untermauert werden.
Selektivität Nicht relevant für die Bestimmung von Nematoden, wenn sie vorher aus der Matrix isoliert wurden.
Wird jedoch die PCR für den Nachweis benutzt, ist festzustellen, ob Variatio-nen im Probenmaterial die Testleistung beeinträchtigen (z. B. Erde, Pflanzen).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-ten.
Biochemische Methoden: z. B. Enzymelektrophorese, Erstellung eines Proteinprofils
Zu diesem Schritt gehört auch die Probenaufbereitung
Analytische Sensiti-
vität
Stellen Sie die Mindestanzahl nachzuweisender Individuen fest, die für eine
zuverlässige Untersuchung benötigt werden, und das, sofern möglich, mit
mindestens drei Proben. Die geringste Anzahl von Ziel-Individuen hängt vom
Zustand der Probe (gut bis sehr schlecht), der bekannten innerartlichen Vari-
abilität, der Schwierigkeit, Merkmale zu interpretieren usw. ab.
Die Testparameter müssen genau definiert und standardisiert werden.
Analytische Spezifi-
tät
Testen Sie (I) eine Reihe von Zielorganismen und (II) Nicht-Zielgattungen
und/oder -arten.
Selektivität Nicht relevant.
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger
Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere
Proben aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 42 von 59
Ködern oder Bioassay (einschließlich Pathogenitätstests)
Analytische Sensiti-
vität
Stellen Sie mit mindestens 3 Wiederholungen die Mindestanzahl Individuen
fest, bei der Symptome hervorgerufen werden oder sich der Organismus in
Pflanzenmaterial vermehrt.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Stadium
der Testpflanzen, Inokulationsmethode.
Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu aufzu-
bereiten und zu testen.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität des Bioassays an (I) Stämmen von Zielorganis-
men, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge
und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-
Zielorganismen, insbesondere solche, die mit dem Probenmaterial assoziiert
sind.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-
pflanze).
Wiederholbarkeit Verwenden Sie mindestens 3 Wiederholungen mit der Mindestanzahl von
Individuen, die benötigt wird um eine Population zu bilden, und verwenden
Sie die Wirtspflanzen, die im Spezifitätstest bestimmt wurden. Bei Verwen-
dung als Pathogenitätstest müssen die 3 Wiederholungen so viele Individuen
enthalten, dass Symptome erzeugt werden. Werden keine einheitlichen Er-
gebnisse erzielt, sind weitere Proben zu aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Tabelle 9. Virologie und Phytoplasmologie
Siehe auch die Benutzungshinweise für die Tabellen. Diese Tabelle gilt für Viren, Viroide und
Phytoplasmen.
Molekulare Methoden, z. B. PCR, Real-Time-PCR und LAMP
Zu diesem Schritt gehört auch die Isolierung von RNS/DNS aus dem Probenmaterial.
Analytische Sensiti-
vität (relative Sensi-
tivität)
Da die Konzentration von Viren, Viroiden und Phytoplasmen immer unbe-
kannt ist, bestimmen Sie die maximale Verdünnung nachzuweisender
RNS/DNS. Führen Sie mindestens 3 Versuche mit seriellen Verdünnungsstufen
durch. Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind wei-
tere Serien aufzubereiten und zu testen.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 43 von 59
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Handels-
marke der PCR-Reagenzien (insbesondere DNS-Polymerase) und PCR-
Zyklusbedingungen.
Analytische Spezifi-
tät
Testen Sie (I) eine Auswahl von Zielorganismen und (II) relevante Nicht-
Zielorganismen, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische
Ursprünge und unterschiedliche Wirte abdecken, insbesondere solche, die
ggf. im Probenmaterial vorhanden sein könnten. Bei Nicht-Zielorganismen
sollte die Höhe der Nukleinsäurekonzentration das Auftreten einer Kreuzreak-
tion maximal fördern, jedoch realistisch sein.
Außerdem können die Testergebnisse durch einen "in-silico"-Vergleich von
Sonde/Primer-Sequenzen mit Sequenzen in Genbanken untermauert werden.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-
pflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger
(relativer) Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind
weitere Proben zu aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Serologische Methoden: ELISA und Direct Tissue Blot Immuno Assay, einschließlich Probenaufberei-
tung (gilt nicht für Viroide)
Analytische Sensiti-
vität (relative Sensi-
tivität)
Führen Sie mindestens 3 Versuche mit seriellen Verdünnungen einer infizier-
ten Probe in der ausgewählten gesunden Probe durch. Bestimmen Sie die
maximale Verdünnung nachgewiesener RNS/DNS.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. die OD-
Schwelle im ELISA-Test. Werden nach 3 Serien keine einheitlichen Ergebnisse
erzielt, sind weitere Serien aufzubereiten und zu testen.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität von Antikörpern (I) an Stämmen des Zielorga-
nismus, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge
und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-
Zielorganismen, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert
sind.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-
pflanze).
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 44 von 59
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger
(relativer) Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind
weitere Proben aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Bioassay: Pflanzentest (hauptsächlich zur Verifizierung von Viren und Viroiden, jedoch nicht für
Phytoplasmen) und Pfropfung
Analytische Sensiti-
vität (relative Sensi-
tivität)
Bestimmen Sie die Maximalverdünnung einer infizierten Probe in der gesun-
den Probe, durch die Symptome hervorgerufen werden oder sich der Orga-
nismus in Pflanzen vermehren kann. Es handelt sich hier nur um eine Schät-
zung anzuwendender Verdünnungen. Führen sie 3 Serien mit Verdünnungs-
schritten durch.
Die analytische Sensitivität bezieht sich auf einen bestimmten Satz von Test-
parametern, die genau zu definieren und standardisieren sind, z. B. Stadium
der Testpflanzen, Inokulationsmethode und Inkubationsbedingungen. Wer-
den keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben aufzubereiten
und zu testen.
Nicht relevant für die Pfropfung.
Analytische Spezifi-
tät
Bestimmen Sie die Spezifität des Bioassays (I) an Stämmen des Zielorganis-
mus, die genetische Diversität, unterschiedliche geographische Ursprünge
und unterschiedliche Wirte abdecken, und (II) an einem Satz von Nicht-
Zielorganismen, insbesondere solchen, die mit dem Probenmaterial assoziiert
sind.
Selektivität Stellen Sie fest, ob Variationen im Probenmaterial die Testleistung beein-
trächtigen (z. B. durch die Verwendung unterschiedlicher Sorten der Wirts-
pflanze).
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit geeigne-
ter Verdünnung, die im Sensitivitätstest festgestellt wurde und wählen Sie
Wirtspflanzen anhand der Ergebnisse der obigen Leistungskriterien aus.
Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind weitere Proben zu aufzu-
bereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 45 von 59
Biochemische Methoden: z. B. Elektrophorese, R-PAGE
Analytische Sensiti-
vität (relative Sensi-
tivität)
Führen Sie mindestens 3 Versuche mit seriellen Verdünnungsstufen einer
infizierten Probe in der ausgewählten gesunden Probe durch. Bestimmen sie
die größte noch nachweisbare Verdünnung der Probenextrakte.
Die Testparameter müssen genau definiert und standardisiert werden.
Analytische Spezifi-
tät
Vergleichen Sie mit relevanten Targets/Proteinen/Kontaminanten und führen
Sie auf, wie sie differenziert werden können. Untersuchen Sie auch die inne-
rartliche Variabilität. Definieren Sie die zu bestimmenden Merkmale.
Selektivität Nicht relevant.
Wiederholbarkeit Testen Sie mindestens 3 Wiederholungen von Probenextrakten mit niedriger
(relativer) Konzentration. Werden keine einheitlichen Ergebnisse erzielt, sind
weitere Proben zu aufzubereiten und zu testen.
Reproduzierbarkeit Wie bei der Wiederholbarkeit, aber wenn möglich durch unterschiedliche
Mitarbeiter, an unterschiedlichen Tagen und ggf. mit unterschiedlichen Gerä-
ten.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 46 von 59
Anhang 6 – Validierung morphologischer und morphometrischer Methoden, die z. B. in der Ento-
mologie, Nematologie, Mykologie und Botanik verwendet werden
Die Anleitung basiert auf Validierungserfahrungen von Experten der EPPO-Diagnose-Panels.3
Bei der morphologischen Bestimmung beruht das Expertenurteil i.d.R auf der Verwendung verfügba-
rer Referenzen in Form von Schlüsseln, morphologischen Originalbeschreibungen, Präparaten und
Belegfotos, die von den Experten als Referenz zur Unterstützung der Bestimmung anerkannt sind. Da
diese Referenzen oder Hilfsinformationen von Fachleuten der entsprechenden Gruppe(n) beige-
bracht wurden, gelten sie folglich als validierte Tests im vorstehenden Standard.
Beispiele für Referenzen oder Hilfsinformationen, die im vorstehenden Standard als validierter Test
gelten, sind:
morphologische und morphometrische Methoden in internationalen Standards wie IPPC-
Diagnose-Protokollen und EPPO-Diagnoseprotokollen,
morphologische und morphometrische Methoden, Taxonüberprüfungen, Beschreibungen – vor-
zugsweise Originalartikel - und Schlüssel, die in begutachteten [peer reviewed] Veröffentlichun-
gen – vorzugsweise Originalartikel - veröffentlicht wurden,
Belegpräparate und –typenmaterial (wie Holotypen, Paratypen, Lectotypen und Neotypen) und
Belegfotos (Präparate und Fotos müssen von einem Fachmann bestimmt und bestätigt sein),
morphologische und morphometrische Methoden in allgemeinem Gebrauch, die in nicht-
begutachteten [non-peer reviewed] Zeitschriften einschließlich elektronischen Medien (insbe-
sondere für Schlüssel) veröffentlicht sind.
Wie in 5.4.4.2 erklärt, muss das Laboratorium bestätigen, dass es morphologische und/oder
morphometrische Bestimmungen sachgerecht durchführen kann.
Das Laboratorium sollte auch die Wahl der morphologischen und morphometrischen Methoden
begründen, insbesondere wenn diese nicht in internationalen Standards oder begutachteten (peer-
reviewed) Zeitschriften veröffentlicht sind.
3 Erfahrungen bei der Akkreditierung morphologischer und morphometrischer Bestimmungen in ei-
nem forensischen Laboratorium wurden auch berücksichtigt.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 47 von 59
Anhang 7 – Beispiele für Laborberichte über kritische Punkte im Diagnoseverfahren und zu Mes-
sunsicherheiten
Bericht 1 – Bestimmung kritischer Punkte und Schätzung der Messunsicherheit (mit freundlicher
Genehmigung des National Institute of Biology, Slowenien, 2012).
Anwendungsbereich Bestimmung von Phytoplasma
Methode
(Name, Protokollnummer)
Real-time PCR (02D-Pos43)
Schadorganismus FD und BN
Art der Probe
(Beschreibung, Protokollnummer)
Wein, Vektoren, andere Wirtspflanzen (02D-
Pos10)
Bemerkungen /
Autorisierter Versuchsansteller (Unterschrift,
Datum)
Nataša Mehle, 6.7.2012
Andere Anbieter (Unterschrift, Datum) /
Prüfleiter (Unterschrift, Datum)
Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse
Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit
Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind
Probenahme – Proben-typ
Ungleiche Verteilung des Phytoplasmas in der Pflanzenprobe.
Die Art der Probenahme unterliegt nicht unserer direkten Kontrolle; sie ist jedoch eindeutig festgelegt.
Jahresprogramm besonderer Kon-trollen auf Grapevine yellows (Op. Prev.: Pro-gram posebnega nadzora trsnih rumenic)
Insekten, die mit Gelbta-feln gefangen wurden, eigenen sich nicht für eine Untersuchung.
Bei Eingang der Probe verifizieren wir, ob die Probe für die Untersu-chung geeignet ist.
02D-Pos10
Probenahme - Zeitpunkt Die Phytoplasma-konzentration in den Pro-ben ändert sich mit der Jahreszeit.
Der Zeitpunkt der Pro-benahme ist festgelegt.
Jahresprogramm besonderer Kon-trollen auf Grapevine yellows (Op. Prev.: Pro-gram posebnega nadzora trsnih rumenic)
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 48 von 59
Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse
Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit
Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind
Bei Eingang der Proben verifizieren wir, ob die Probe für die Untersu-chung geeignet ist (ob sie zu einem geeigneten Zeitpunkt/einer geeigne-ten Jahreszeit genom-men wurde).
02D-Pos10
Probenahme – eindeu-tige Etikettierung von Proben
Nicht eindeutige Etiket-tierung der Proben – das Untersuchungsergebnis wurde unter der falschen Probe erfasst.
Die Etikettierung der Proben unterliegt nicht vollständig unserer di-rekten Kontrolle; sie ist jedoch eindeutig festge-legt.
Jahresprogramm besonderer Kon-trollen auf Grapevine yellows (Op. Prev.: Pro-gram posebnega nadzora trsnih rumenic)
Bei Erhalt der Probe verifizieren wie, ob das Etikett des Kunden auf der Probe dem Etikett des Probenahme-berichts entspricht.
02R-Nav05
Transport der Probe zum Labor
Die langfristige Lagerung der Proben bei hohen Temperaturen sowie das Einfrieren und Auftauen der Proben können die Proben schädigen, was die Nachweisbarkeit des Phytoplasmas in solchen Proben verschlechtern kann.
Die Transportmittel zum Laboratorium sind fest-gelegt.
Jahresprogramm besonderer Kon-trollen auf Grapevine yellows (Op. Prev.: Pro-gram posebnega nadzora trsnih rumenic)
Bei Erhalt der Probe verifizieren wir den Zu-stand der Proben.
02D-Pos10
Eingang der Probe Die Probe wurde nicht an die zuständige Person geliefert – die Tests wur-den nicht pünktlich oder überhaupt nicht durchge-führt.
Alle Beschäftigten müs-sen die Anweisungen für den Eingang von Proben kennen.
02R-Nav05; 02R-Sez07
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 49 von 59
Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse
Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit
Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind
Dokumentierung der Probe
Die Information über die gelieferte Probe erreicht nicht die zuständige Per-son - die Tests wurden nicht pünktlich oder überhaupt nicht durchge-führt, oder es wurden falsche Tests durchge-führt.
Genaue Anweisungen für die Erfassung neu eingegangener Proben.
02R-Sez07, 02D-Nav01, 02D-Nav16
Lagerung der Probe Die langfristige Lagerung der Proben bei hohen Temperaturen sowie das Einfrieren und Auftauen der Proben können die Proben schädigen, was die Nachweisbarkeit des Phytoplasmas in solchen Proben verschlechtern kann.
Festgelegter Platz für die Lagerung von Proben.
02R-Nav05
Wahl der Tests Ein ungeeigneter Test wurde durchgeführt.
Genau festgelegte Aus-wahl von Tests und eine gut definierte Abfolge von Verfahren für die Durchführung der Un-tersuchung.
02D-Sez01, 02D-Pos10
Aufbereitung der Probe für die Untersuchung
Kontamination zwischen Proben.
Die Verfahren für die Aufbereitung und Homogenisierung von Proben sind festgelegt einschließlich der Art und Weise der Arbeits-durchführung, um eine Kontamination der Pro-ben untereinander zu verhindern. Nur zustän-dige autorisierte Perso-nen wenden diese Ver-fahren an.
02D-Pos06, 02D-Pos54, 02D-Pos43, 02R-Sez04
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 50 von 59
Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse
Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit
Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind
Wahl eines ungeeigneten Teils der Probe; unzurei-chende Homogenisierung der Probe.
Die Homogenisierung (mit paralleler DNS-Extraktion) wird durch die Verwendung von NIC und interne Positivkon-trolle kontrolliert (die interne Positivkontrolle wird für jede Probe ge-trennt durchgeführt).
Extraktion Wahl einer ungeeigneten Methode für die DNS-Extraktion; ein Fehler während der Extraktion; Kontamination während der Extraktion.
Wahl und Leistung eines Extraktionsverfahrens sind gut beschrieben. Sie erfolgen nur durch zu-ständige autorisierte Personen.
NIC ist in den Extrakti-onsverfahren enthalten. Die Angemessenheit des DNS-Extraktions-verfahrens ist für jede einzelne Probe verifiziert durch Amplifikation einer internen Kontrolle (endogene Nukleinsäu-re, interne Positivkon-trolle w).
02D-Pos06, 02D-Pos54, 02D-Pos43, 02R-Sez04
Durchführung der Me-thode –Bearbeiter
Nicht vertraut mit der Methode – fehlerhafte Durchführung.
Die Methode wird nur von qualifizierten und geschulten Bearbeitern angewendet.
02R-Sez04
Durchführung der Me-thode – Auswirkung von Inhibitoren
Falsch negative Ergebnis-se aufgrund von Inhibito-ren der PCR-Reaktion im DNS-Extrakt.
Untersuchung zusätzli-cher DNS-Verdünnun-gen, wenn eine große Anzahl von Inhibitoren in den DNS-Extrakten vermutet wird.
02D-Pos43
Die DNS-Extraktion wird mit einem anderen vali-dierten Extraktionsver-fahren wiederholt.
02D-Pos06
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 51 von 59
Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse
Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit
Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind
Durchführung der Me-thode – Einfluss der Matrix auf die Spezifi-tät?
Neue und unbekannte Matrix – unspezifische Reaktion bei der Verwen-dung von Oligonukleotidprimern und –sonde.
Für jeden neuen Pro-bentyp und/oder Fund (wie neue Wirte) führen wir zusätzliche Bestäti-gungstests durch.
02D-Pos10, 02D-Pos43
Durchführung der Me-thode – Einfluss der Matrix auf die Sensitivi-tät?
Neue und unbekannte Matrix – verringerte Sen-sitivität der Methode.
Wird eine niedrige Phytoplasmakonzen-tration in den Proben erwartet (aufgrund der KE-Ergebnisse), werden weitere Tests mit höhe-rer DNS-Konzentration durchgeführt.
02D-Pos43
Durchführung der Me-thode – Möglichkeit von Kontaminationen?
Falsch positive Ergebnis-se.
Einbinden der internen Kontrollen: NAC 1, NAC 2.
02D-Pos48
Die Durchführung der Methode ist gut be-schrieben, um mögliche Kontaminationen zu verhindern.
02D-Pos48
Einzelne Schritte des Analyseverfahrens wer-den in getrennten Räu-men durchgeführt.
02D-Pos18
Durchführung der Me-thode – Einfluss der Labormaterialien und -sachen?
Einfluss auf die Fluores-zenzmessung: Staub auf der Testplatte/-folie, Tal-kum an den Handschu-hen, Berühren der Fo-lie/des Bodens der Test-platte.
Größere Kontaminations-möglichkeiten: filterlose Pipettenspitzen.
Einbinden der internen Kontrollen: NAC 1, NAC2.
Verwendung von Labor-handschuhen ohne Tal-kum, Verwendung von Pipettenspitzen mit Fil-ter.
Staubfreie Lagerung von Testplatten und –folie.
02D-Pos48
Durchführung der Me-thode – Einfluss der Laborausstattung?
Ungenaue Pipettierung kleiner Volumina.
Ausschließliche Verwen-dung kalibrierter Pipet-ten.
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 52 von 59
Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse
Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit
Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind
Einbindung von PAC 1 und PAC 2 mit bekann-tem Ct-Wert (Verifizie-rung der Eignung der Ct-Werte).
02D-Obr30, 02D-Pos43
Durchführung der Me-thode – Einfluss des Geräts?
Theoretisch möglich. Verifizierung der Eig-nung des Geräts durch Vergleich mit einer an-deren Vorrichtung/Gerät vor deren Verwendung für die Diagnose.
Beispiel wie bei Bericht über Eig-nungstest D0002/12
Durchführung der Me-thode – Einfluss der Chemikalien?
Alte Chemikalien, unge-eignete Lagerung von Chemikalien, Wahl unge-eigneter Chemikalien, schlechte Qualität einer Chemikaliencharge, kon-taminierte Chemikalien – Beeinträchtigung der Amplifikation, falsch ne-gative/positive Ergebnis-se.
Einbinden der internen Kontrollen: NAC 1, NAC 2. Einbindung von PAC 1 und PAC 2 mit bekann-tem Ct-Wert (Verifizie-rung der Eignung der Ct-Werte).
Aufzeichnung der Ab-laufdaten von Chemika-lien, der Charge-/Inventarnummer oder des Aufbereitungsdatum eines PPS-Gemischs.
02D-Obr30, 02D-Nav24
Durchführung der Me-thode – Einfluss der Umgebung?
Einfluss der Temperatur bei Pipettierung kleiner Volumina.
Verifizierung der Tem-peratur des Raums, in dem PCR-Reaktionsmixe hergestellt werden und des Raums, in dem DNS zugegeben wird.
02D-Obr30, 02D-Pos48
Durchführung der Me-thode – Analyse der Ergebnisse
Falscher Grenzwert – falsch negative Ergebnis-se; Signal, das nicht das Ergebnis der Amplifikati-on ist – falsch positive Ergebnisse.
Verifizierung der Ampli-fikationskurve (z. B. Mehrkomponentenplot).
02D-Pos48, 02D-Pos43
Feststellung und Eintrag der Testergebnisse
Falsche Interpretation der Ergebnisse der Methode.
Klar definierte Interpre-tation der Ergebnisse (z. B. Nachweisgrenze, Pa-ralleltests und Kontrol-len).
02D-Pos43, 02D-Pos48
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 53 von 59
Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse
Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit
Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind
Die zuständige autori-sierte Person für die Überwachung und In-terpretation der Ergeb-nisse verifiziert die Rich-tigkeit der eingegebenen Daten.
02D-Nav01, 02R-Sez07
Endergebnis einer Un-tersuchung – ein Ergeb-nis mit der endgültigen Feststellung vorhan-den/nicht vorhanden
Das Endergebnis hängt von den Teilergebnissen für die verschiedenen einzelnen Amplicons ab – das Fehlen eindeutiger Regeln für die Formulie-rung des Endergebnisses kann zu falschen Schluss-folgerungen führen.
Klar festgelegte Kriterien für den Abschluss der Untersuchungen von Proben. Nur die Perso-nen, die für den ab-schließenden Schritt zuständig und autori-siert sind können die Probenuntersuchung abschließen
02D-Pos10, 02D-Pos43, 02R-Sez07
Falsche Formulierung der Endergebnisse kann den Kunden verwirren.
Die Formulierung der Testergebnisse ist fest-gelegt
02D-Pos18
Benachrichtigung Endergebnisse nicht an alle Seiten weitergeleitet, die lt. Vertrag zum Erhalt des Endergebnisses be-rechtigt sind.
Verzögerung bei der Be-nachrichtigung über die Testergebnisse.
Klar festgelegte Anlei-tungen für die Benach-richtigung über die End-ergebnisse. Der gesamte Schriftwechsel mit dem Kunden wird aufbewahrt (Rückverfolgbarkeit des Schriftwechsels über die einzelnen Proben wird ebenfalls sichergestellt). Das BiaLims-System informiert uns automa-tisch über die fällige Daten/Fristen für die Vorlage von Endergeb-nissen eines Tests.
02D-Nav01, 02D-Nav16
Weitergabe der Testbe-richte
Ergebnisbericht nicht an alle Seiten weitergeleitet, die lt. Vertrag zum Erhalt des Endergebnisses be-rechtigt sind.
Klar festgelegte Anlei-tungen für die Weiterlei-tung und Versendung von Testberichten.
02D-Nav01
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 54 von 59
Verfahrensschritt Mögliche Beeinträchti-gung der Ergebnisse
Maßnahmen zur Ver-ringerung der Messun-sicherheit
Dokument, in dem die Maß-nahmen festlegt sind
Archivierung Beschwerde eines Kun-den, Auftraggebers oder Inhabers über die Durch-führung der Tests.
Organisierte strukturier-te Archive für Testbe-richte für Proben ver-gangener Jahre. Gesi-cherte Nachverfolgbar-keit vom Eingang der Probe bis zu Weitergabe des Testberichts.
Die Proben werden zu-mindest bis zur Überga-be des Testberichts auf-bewahrt. Alle wichtigen DNS-Extrakte werden in einer Sammlung von DNS-Isolaten aufbe-wahrt.
02D-Vzo01, 02D-Pos18, 02D-Nav01, 02R-Nav02, 02R-Nav08
Sonstiges/Anmerkungen /
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 55 von 59
Bericht 2 – Nachweis von Flavescence dorée (FD) und Bois noir (BN) durch Real-Time-PCR
Validierte Methode:
französische Methode MOA006 Teile A und B Version 1b – Nachweis von Phytoplasmen der
16SrV-Gruppe (Flavescence dorée) und 16SrXII-Gruppe (Bois noir)/Matrix: Vitis sp.
Erratum MOA006 Teil A am 7. März 2012
Referenz internes Standardarbeitsverfahren SOP: AMO07S23
Identifizie-
rung der
Faktoren der
Unsicherheit
Art der Unsicherheit Häufigkeit Maßnahmen zur Verringe-
rung/Vermeidung der Unsicherheit
und entsprechende Dokumentation
Beitrag zur
Gesamtunsi-
cherheit
Mitarbeiter
Bestimmung
von Chargen
und Proben
Fehler beim Zuordnen
der Ergebnisse zu ei-
ner Probe
selten Übertragung der vereinfachten Pro-
bennummer auf das Päckchen und
auf die Dokumentregistrierung
APRO6002
zu vernachläs-
sigen
Etikettierung
von Gestel-
len und Be-
häl-
tern/Röhr-
chen (PCR)
Fehler beim Zuordnen
der Ergebnisse zu ei-
ner Probe
selten Verwendung der vereinfachten Pro-
bennummer auf den Behältern wäh-
rend des Untersuchungsverfahrens
(Beutel, Röhrchen, Belegung der PCR-
Platten) APQA
zu vernachläs-
sigen
Schulung der
Mitarbeiter
Menschlicher Fehler
während des Untersu-
chungsverfahrens
selten Schulung und Autorisierung von Mit-
arbeitern APR02003 / APR02004
zu vernachläs-
sigen
Lesen und
Interpretati-
on von PCR-
Ergebnisse
Risiko falsch positiver
und falsch negativer
Ergebnisse
selten Regeln zur Entscheidungsfindung klar
definiert im Qualitätsmanagement-
system AMO07T42
Schulung und Autorisierung von Mit-
arbeitern APR02003 / APR02004
zu vernachläs-
sigen
Berichts-
bearbeitung:
Niederschrei-
ben von In-
formation
Fehler in der Nieder-
schrift
nicht häufig Gesamtprüfung durch den techni-
schen Leiter.
Prüfung der korrekten Übernahme
der Ergebnisse in den Bericht durch
den technischen Leiter und den ad-
ministrativen Leiter. Bericht unter-
zeichnet vom administrativen Leiter:
APR07001
zu vernachläs-
sigen
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 56 von 59
Identifizie-
rung der
Faktoren der
Unsicherheit
Art der Unsicherheit Häufigkeit Maßnahmen zur Verringe-
rung/Vermeidung der Unsicherheit
und entsprechende Dokumentation
Beitrag zur
Gesamtunsi-
cherheit
Untersu-
chung und
Aufbereitung
von Puffern,
Lösung und
Reaktions-
gemischen
Fehler beim Herstel-
lungsverfahren
(Menge,…)
Vollständige und detaillierte Stan-
dardarbeitsverfahren, die eine zuver-
lässige Rückverfolgung gestattet
AMO07P32, AMO05T28 und
AMO07T42
zu vernachläs-
sigen
Material
Verteilung
der
Zielphytoplas
men in Pflan-
zengeweben
Zufällige Verteilung
der Phytoplasmen in
den Pflanzengeweben
häufig Probenahme der notwendigen Men-
ge/Volumen von Blattstielen
und/oder Hauptadern an symptoma-
tischen Weinblättern AMO07T42
nicht zu ver-
nachlässigen
Probe bei
Eingang im
Laboratori-
um zersetzt
Entwicklung von Sap-
rophyten und/oder
Zersetzung von Pflan-
zenmaterial verursa-
chen eine Verringe-
rung des Kontaminati-
onsgrads
selten Probe zurückgewiesen, Benachrichti-
gung des Kunden: AMMQSE06 -
APR06002
zu vernachläs-
sigen
Zersetzung
der Proben
während der
Lagerung
Entwicklung von Sap-
rophyten und/oder
Zersetzung von Pflan-
zenmaterial verursa-
chen eine Verringe-
rung des Kontaminati-
onsgrads
selten Anforderungen an die Lagerungsbe-
dingungen werden festgelegt und
angewendet APQA, APRO6002,
AMO07T42.
zu vernachläs-
sigen
Probe mit
viel Pflan-
zenmaterial
("reiche"
Probe)
Risiko des Vorhanden-
seins von Inhibitoren
gelegentlich Durch das korrekte Ergebnis der
Weinpositivkontrolle kann bestätigt
werden, dass die Amplifikation nicht
gehemmt wird AMO07T42.
zu vernachläs-
sigen
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 57 von 59
Identifizie-
rung der
Faktoren der
Unsicherheit
Art der Unsicherheit Häufigkeit Maßnahmen zur Verringe-
rung/Vermeidung der Unsicherheit
und entsprechende Dokumentation
Beitrag zur
Gesamtunsi-
cherheit
Qualität der
Reagenzien,
Lösungen,
Puffer und
Medien
Nichtbeachtung der
Anforderungen bezüg-
lich Lagerbedingun-
gen, Ablaufdatum,
Kontaminationen
nicht wahr-
scheinlich
Festlegung von Lagerbereichen und –
bedingungen gemäß den Empfehlun-
gen des Lieferanten und der Festle-
gungen des Laboratoriums. Tempera-
turüberwachung von Klimakammern
(z. B. Kühlschrank) für die Lagerung
von Reagenzien: APQM
Lagerbereiche getrennt von den Be-
reichen für die Probenannahme und
die Lagerung positiver Kontrollen:
APQA
Verwendung relevanter Kontrollen
bei jedem Test AMO07T42
Regelmäßiger Austausch des BET-
Färbebades gemäß APQT01
zu vernachläs-
sigen
Aufbereitung
von Lösun-
gen, Puffern
und Medien
Fehler beim Messen
von Gewicht, Volumen
und pH-Wert
nicht wahr-
scheinlich
Metrologische Kontrollen der Waa-
gen, Pipetten, des pH-Meters, um
sicherzustellen, dass die Anforderun-
gen und der festgelegte Maximalfeh-
ler eingehalten werden
APQM
zu vernachläs-
sigen
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 58 von 59
Identifizie-
rung der
Faktoren der
Unsicherheit
Art der Unsicherheit Häufigkeit Maßnahmen zur Verringe-
rung/Vermeidung der Unsicherheit
und entsprechende Dokumentation
Beitrag zur
Gesamtunsi-
cherheit
Geräte / Messungen
Geräte unter
metrologi-
scher Über-
wachung
oder nicht
Nichtbeachtung met-
rologischer und/oder
technischer Anforde-
rungen
nicht wahr-
scheinlich
Festlegung und Durchsetzung eines
metrologischen Qualitätsplans APQM.
Verfahren und Kalibrierungs-
/Verifizierungsprogramme: APQM /
APR03032
Pipette : APR03009 / APR03010
Waage : APR03007 / APR03008
pH-Meter : APR03006
Temperaturen : APR03031
PCR-Maschine Qualifizierung :
APR03036
Festlegung eines Wartungs- und Rei-
nigungsplans APRO3005, APQN.
Technische Bestätigung durch den
Metrologieleiter und den technischen
Leiter vor Inbetriebnahme APRO3001.
zu vernachläs-
sigen
Umgebung
Kreuzkonta-
mination:
allgemein
Risiko falsch positiver
Ergebnisse
selten Desinfektionsplan für Geräte und
Werkbänke.
Beachtung des „Einbahnverkehrs“
während des Untersuchungsverfah-
rens:
APQA
zu vernachläs-
sigen
Kreuzkonta-
mination:
PCR
Risiko falsch positiver
Ergebnisse
selten Getrennte Räume für die Herstellung
von Reaktionsgemischen, die Zugabe
von DNS-Extrakten, die Amplifikation
und die Elektrophorese und die Ver-
wendung geeigneter Kontrollen
APQT01
zu vernachläs-
sigen
Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von
Schadorganismen von Pflanzen anstreben
71 SD 4 029 | Revision: 1.1 | 06. November 2015 59 von 59
Identifizie-
rung der
Faktoren der
Unsicherheit
Art der Unsicherheit Häufigkeit Maßnahmen zur Verringe-
rung/Vermeidung der Unsicherheit
und entsprechende Dokumentation
Beitrag zur
Gesamtunsi-
cherheit
Lagerung der
Proben
Entwicklung von Sap-
rophyten und/oder
Zersetzung von Pflan-
zenmaterial verursa-
chen eine Verringe-
rung des Kontaminati-
onsgrads
selten Die Anforderungen an die Lagerungs-
bedingungen werden festgelegt und
eingehalten.
APQA, APRO6002, AMO07T42.
zu vernachläs-
sigen
Methode / Verfahren
Positive Kon-
trolle für das
gesamte
Verfahren
Kontrolle nicht nach-
gewiesen
gelegentlich Feste Regel:
Wenn die positive Extraktionskontrol-
le nicht die richtige Reaktion zeigt, ist
- entweder eine andere Probe der-
selben Extraktionsserie positiv und
damit der Lauf validiert
- oder keine Probe war positiv im
Lauf (selten) und der Lauf ist nicht
validiert. Der Versuch ist zu wie-
derholen.
Die Verwendung "Wein"-interner
Positivkontrollen für jede Probe er-
laubt die Validierung der Qualität von
jedem Extrakt AMO07T42.
zu vernachläs-
sigen
Sensitivität /
Nachweis-
grenze
Zielorganismus unter
der Nachweisgrenze
möglich
Häufigkeit
nicht fest-
gestellt
Das Risiko hängt von der Methode ab.
Verwenden Sie Kontrollen an der
Nachweisgrenze MO07T42.
Leistungskriterien für den Test wer-
den im internen Validierungsbericht
festgelegt FD BN 2009.
nicht zu ver-
nachlässigen
abhängig von
den Grenzen
der verwende-
ten Methode