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HISTÓRICO DA CLONAGEM: 1986- IL4, IL5 E IL6
Revisiting the 1986 molecular cloning of interleukin 6
Toshio Hirano*
Osaka University, Suita, Osaka, Japan
*Correspondence: [email protected]
Edited by:
Kendall A. Smith,Weill Medical College of Cornell University, USA
Artigo original na NATURE-1986
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CONCEITOS TEÓRICOS
• Clonagem molecular: Construção de uma molécula de DNA recombinante e sua propagação em hospedeiro apropriado que possibilite a seleção deste DNA. Introdução de um gene dentro de um vetor, através das enzimas de restrição ( enzimas modificadoras do DNA- reconhecem determinados pares de base e clivam) e o propaga dentro de um organismo (célula) hospedeiro (a) para estudá-lo.
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CONCEITOS TEÓRICOS
• Inserto: Fragmento de DNA que se tem interesse em estudar ( expressar ou reproduzir). A união de um inserto e um vetor dará origem a uma molécula chamada QUIMÉRICA (DNA recombinante).
• DNA Recombinante será trasnfectado para dentro de uma célula onde se reproduzirá independente ou não da reprodução do próprio material genético. Essa célula será dita CÉLULA TRANSFORMADA.
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CLONAGEM
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CLONAGEM
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ARTIGO
DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA SEMI-QUANTITATIVA UTILIZANDO PLASMÍDIO CLONADO COM PARTE DO GENE Gb DE CITOMEGALOVÍRUS
Descrição de métodos, técnicas e instrumentais
Medicina, Ribeirão Preto-2002
Lauro J Marin, Aldo A Cunha, Victor H Aquino e Luiz TM Figueredo.
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INTRODUÇÃO
Importância do diagnóstico do CMV- Grande incidência – 100%
• Grande variedade de Síndromes Clínicas- Doenças agudas, transmissões verticais e sangue, imunodeficiência. Pneumonias e pneumonites,retinites,meningoencefalites,mielites, polirradiculopatia, úlceras gastrointestinais etc...
• Atualmente: RN/Transplantados e HIV/AIDS
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CITOMEGALOVIRUS
Genoma: 240kb,envelope de bicamada proteica- 8 proteínas –glicoproteínas gB e gH- Sítios antigênicos para Ac neutralizantes.
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LACUNAS
1. Prevalência alta- Presença do vírus ocasionando a doença?
2. Latente- PMN OU replicação viral ativa?
3.Detecção de doença: PCR-Tempo Real- Oneroso.
4. Assintomatologia ou baixa clínica- 90% dos casos!!!!!!!!!!!!
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MATERIAIS E MÉTODOS
• Explicação do método Semi-quantitativo-PCR: É uma medida indireta por comparação pareada da medida dos plasmídeos clonados com os teores virais da amostra obtida dos pacientes.
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CLONAGEM PLASMIDIAL
1. Plasmídio bacteriano pCRII (Invitrogen-USA)
Gene gB com 296 pb- 81874-82176, cepa 169
Dois primers- gB 1 e gB2
PCR convencional: 35 ciclos (Tecne-England)
Eletroforese em gel de Agarose 2%, azul de bromofenol 0,25% em sacarose 40%. Brometo de etídio
Bandas com tamanho de 100pb de peso molecular
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CLONAGEM
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MATERIAIS E MÉTODOS
• Sequenciamento- Comparando o genoma do CMV ao plasmidio-inserto - PCR de sequenciamneto –Thermo sequenase (Amersham Pharmacia- USA). Armazenada em computador utilizando o programa SEQ 4x4 Basecaller (Amersham Pharmacia-Canadá) e WinDNAsis (Hitachi-Japan)- gene gB CMV 169.
• Quantificação dos plasmídios- Espectofotômetro-absorbância de 290nm.
Diluições decimais variadas.
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RESULTADOS
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RESULTADOS-
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SEQUENCIAMENTO
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CÁLCULO DO NÚMERO DE PLASMÍDIOS
• Após purificado o plasmídio: 200 mcl-176 mcg DNA/ml
• Verificação do número de plasmídios no lote: PM médio de um par de bases nitrogenadas 660 e multiplicou-se esse valor por n. de pares de bases do mesmo: 1400190.
• PM do plasmídio: 1400190 g- 6,02 x 10 23 mol plasmidiais ( N. de Avogadro)
• Número de plasmídio da amostra de DNA 176 mcg/ml-3,83 x 1018.
• Amostras aliquotadas em 50mcl.
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SENSIBILIDADE DA PCR DAS ALÍQUOTAS
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CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS
• Cálculo para determinar a CV das amostras feito a partir das densidades das bandas das soluções decimais.
Ex. Material clínico com banda de 50991 que fica entre 30307 (8670) – 61177 (86700): 30870
• Intervalo entre banda amostral (50991) e banda plasmidial mais diluída (30307): 20684
• Regra de 3: Intervalo da banda amostral 3870-100% e 20640 x: 67%
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CÁLCULO DA CARGA VIRAL NAS AMOSTRAS CLÍNICAS
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DISCUSSÃO
1. Plasmídio clonado mostrou alta homologia com a cepa de CMV (98%).
2. Leitura das bandas ponto-chave e manter as concentrações das soluções.
3. Sequenciamneto e diluições lógicas.
Diliução até 867 plasmídios por mcg de DNA mostrou-se adequada aos graus de infecções agudas..
Baixo custo e rápida.
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OBRIGADA!