![Page 1: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/1.jpg)
Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per
studio di fenomeni velociRelazione di dottorato A.A.:2012 Ciclo XXVII
Dottorando: Paolo PozziTutore: Giuseppe Chirico
Laboratory of Advanced Biological Spectroscopy
Università degli studi di Milano – BicoccaDipartimento di fisica G.Occhialini
![Page 2: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/2.jpg)
Summary
• Fluorescence
• “Standard” Microscopy
• Structured Illumination
• Neural Network Analysis
• Calcium Imaging
![Page 3: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/3.jpg)
Fluorescence
fluorophore
Linear phenomenon
S1
S2
![Page 4: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/4.jpg)
CCD
ObjectiveEx
cita
tion
filte
r
Emission filterDichroic mirror
Sample
Microscope Field of View
Lamp
Epifluorescence Microscope
![Page 5: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/5.jpg)
Two Photon Fluorescence
fluorophore
Non - Linear phenomenon
S1
S2
![Page 6: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/6.jpg)
Phototube
Objective
Emission filterDichroic mirror
Sample
Microscope Field of View
Two Photon Microscope
Laser Source
Galvanometric mirrors
![Page 7: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/7.jpg)
Scanning Imaging
Very slow!!!
10-15 fps max
I
t
![Page 8: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/8.jpg)
Phase Shaping
𝐸=𝐴 (𝑥 , 𝑦 )𝑒𝑖 𝜑 (𝑥 , 𝑦 )𝑡
FFT
FFT
Standard microscope:
Structured Illumination:
![Page 9: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/9.jpg)
Objective
Emission filterDichroic mirror
Sample
Microscope Field of View
Structured IlluminationMicroscope
Laser Source
CCD
SLM
![Page 10: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/10.jpg)
What do we Watch?Millisecond scale fluorescence variations in multiple locations:
Blood flow cross-correlationNeural network monitoring
![Page 11: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/11.jpg)
Neurons
𝐾 +¿ ¿
𝐶𝑙−𝑁𝑎+¿ ¿
𝐾 +¿ ¿
𝐶𝑙−𝑁𝑎+¿ ¿
𝐴−
Ionic ChannelsDendrites
Axon
![Page 12: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/12.jpg)
Action PotentialPo
tenti
al
−70𝑚𝑉
0𝑚𝑉
−60𝑚𝑉
+30𝑚𝑉
Resting potential
Sodium Channels Open
Potassium Channels Open
Times
![Page 13: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/13.jpg)
Voltage Sensitive Dyes• Membrane Marker• Extremely sensible to Stark Effect• Two photon fluorescence change
S2
S1
![Page 14: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/14.jpg)
The experiment
Mossy Fiber (Input)
Purkinje Cell (Output)
Granule Cells (Elaboration)
![Page 15: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/15.jpg)
Imaging
![Page 16: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/16.jpg)
Data Acquisition
WIP
5
![Page 17: Applicazioni di microscopia ad illuminazione strutturata per studio di fenomeni veloci](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062813/56816464550346895dd648dc/html5/thumbnails/17.jpg)
Calcium Imaging
5