Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 0
ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI
POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN
VITRO DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor
circinelloides UCP 050: UMA ABORDAGEM PARA USO
EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS
RECIFE 2008
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN
VITRO DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor
circinelloides UCP 050: UMA ABORDAGEM PARA USO
EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS
ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI
RECIFE
2008
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 2
ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI
POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN VITRO
DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor circinelloides UCP
050: UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE
CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Nutrição, Departamento de Nutrição do
Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal
de Pernambuco em cumprimento aos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Nutrição - Área de
Concentração: Ciências dos Alimentos.
Orientador (a): Profª. Drª. Tânia Lúcia Montenegro Stamford
Co - orientador (a): Profª. Drª. Thayza Christina Montenegro Stamford
RECIFE 2008
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 3
Fai, Ana Elizabeth Cavalcante
Potencial do efeito antimicrobiano in vitro de quitosana extraída de Mucor circinelloides UCP 050: uma abordagem para uso em sistemas deconservação de alimentos / Ana Elizabeth CavalcanteFai. – Recife : O Autor, 2008.
94 folhas + 16 anexos: il., fig., tab., graf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Nutrição. 2008.
Inclui bibliografia e anexos. 1. Quitosana. 2. Patógeno alimentar. 3.
Propriedade antibacteriana. 4. Conservantes de alimentos. I. Título.
612.39 CDU (2. ed.) UFPE 664.024 CDD (22. ed.) CCS03-2008
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ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI
POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE
QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor circinelloides UCP 050:
UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE
CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS
Aprovada em 07 de fevereiro de 2008
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 5
Dedico Essa dissertação aos meus pais, Maria das Graças Cavalcante Fai e Andres Bartolome Fai (in memoriam) e aos meus irmãos Maria Julieta Fai Serpa e Rafael José Serpa Cavalcante Fai. Obrigada por confiar em mim e acreditar em meu potencial. Longe ou perto, mas sempre morando em meu coração. Amo vocês!
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“Pouca ciência afasta de Deus, muita a Ele reconduz”.
Louis Pasteur
“Nenhuma mente que se abre para uma nova idéia voltará a ter o tamanho original”.
Albert Einstein
“Um cientista em seu laboratório não é somente um técnico, é também uma criança colocada diante de fenômenos naturais que a impressionam como um conto de fadas”.
Marie Curie
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AGRADECIMENTOS
A Deus por sempre me proteger e guiar meus passos. A Profª. Drª. Tânia Lúcia Montenegro Stamford pela orientação e dedicação sem as quais não seria possível realizar este sonho. Agradeço por ter me ensinado o verdadeiro objetivo da pesquisa científica e por ter me ajudado a crescer como pesquisadora e como ser humano. Minha estima especial a Drª. Thayza Christina Montenegro Stamford pela total dedicação. Agradeço a Deus pela sua co-orientação, valiosos ensinamentos e pelo exemplo de pesquisadora que é. Obrigada pela paciência, delicadeza e confiança, imprescindíveis para a realização deste trabalho. As palavras se tornam pequenas para tamanho agradecimento. A Profª. Drª. Galba Maria de Campos-Takaki pelo prestimoso estímulo, ensinamentos e por disponibilizar gentilmente o laboratório do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco, possibilitando a realização deste trabalho. Agradeço por me ensinar o verdadeiro significado da palavra colaboração em pesquisa. Ao meu namorado Pedro Henrique P. Buarque de Gusmão pelo carinho, compreensão e incentivo constante. Obrigada por você existir e fazer parte da minha vida. A amiga e ex-professora Drª. Evânia Altina Teixeira de Figueiredo pela constante preocupação e incentivo desde a época da graduação até os dias atuais. Agradeço por todo o conhecimento de microbiologia que me foi transmitido e por acreditar sempre no meu potencial. A Universidade Federal de Pernambuco, em especial ao Departamento de Nutrição pela oportunidade de realizar meu curso de Mestrado nesta renomada instituição. Aos professores Dr. José Almiro da Paixão, Drª. Janete Magali de Araújo e Drª. Erilane C. L. Machado pela disponibilidade e colaborações proporcionadas. Ao Departamento de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco por todo auxílio e atenção prestados, durante a fase experimental desta pesquisa, em especial aos professores doutores Petrus Santa Cruz e André Galembeck e suas equipes. Ao Magnífico Reitor da Universidade Católica de Pernambuco, Pe. Pedro Rubens Ferreira Oliveira, S.J., pelo acesso aos laboratórios do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais para realização deste trabalho. A minha turma de mestrado, Amanda, Daniela, Emmanuela e Teresa pela amizade, apoio e saudável convivência durante o curso.
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A Aline, Amanda, Claudinha, Deborah, Gustavo, Janaína, Jay, Lely, Paulo Henrique, Rafael, Suelen, Tatty, Victor e Vladimir pelo convívio e amizade. Sinceramente, muito obrigada! Aos colegas do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco pela troca de experiências e convívio agradável durante a fase experimental deste trabalho, e em especial a Marta Cristina Freitas da Silva pela amizade, apoio e auxílio na produção de quitosana microbiana. Aos técnicos Salatiel José de Santana e Severino Humberto de Almeida pela amizade e colaboração durante a fase experimental dessa pesquisa. A Neci Nascimento, secretária da Pós-Graduação em Nutrição, pelo auxílio, presteza e amizade durante o curso de Mestrado e a Girleide Lopes pela disponibilidade e assistência. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, pela bolsa de Mestrado concedida. A todos que de alguma maneira, direta ou indireta, contribuíram para a realização deste trabalho, os meus mais sinceros agradecimentos.
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RESUMO
Recentemente, a quitosana vem despertando bastante interesse em relação às suas aplicações em produtos alimentícios e farmacêuticos. Entre outras, a atividade antimicrobiana deste biopolímero tem sido apontada como uma das suas mais interessantes propriedades. O objetivo deste estudo foi extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides (UCP 050) e avaliar a efetividade desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos. Quitosana proveniente de caranguejo foi utilizada para comparação. A fim de determinar as concentrações mínimas bacteriostáticas e bactericidas das quitosanas foi realizado o teste de Heilman. Foi utilizada fermentação submersa para produção de quitosana por Mucor circinelloides (UCP 050) utilizando como substrato meio de cultura alternativo a partir de Jacatupé (Pachyrhizus erosus, (L) URBAN). Avaliou-se, ainda, o crescimento de M. circinelloiodes em diferentes tempos (24, 48, 72 e 96 horas), incubado a 28ºC e 150 rpm. Quitina e quitosana foram extraídas por tratamento álcali-ácido e a quitosana caracterizada por espectroscopia ao raio de Infravermelho, viscosidade, análise térmica e difração de raio X. M. circinelloides crescido em meio de cultura jacatupé apresentou rendimento de biomassa máximo (20.7 g.L-1) em 96 horas, enquanto a maior produção de quitosana (64 mg.g-1) e quitina (500 mg.g-1) foram observadas em 48 e 72 horas de crescimento, respectivamente. A quitosana caracterizada apresentou grau de deacetilação de 83% e massa molecular de 2,6 x 104 g/mol. A difração de raio X apresentou um pico de maior intensidade próximo ao angulo de 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å) e a análise termogravimétrica demonstrou um processo de desidratação, seguido da decomposição do polímero, com geração de material carbonizado. As curvas de calorimetria apresentaram um pico largo endotérmico e um segundo pico endotérmico. A quitosana microbiológica e de crustáceo demonstraram concentração mínima inibitória idênticas para todas as bactérias ensaiadas, de 1,50 mg.mL-1 para Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli e Yersinia enterocolitica e 0,625 mg.mL-1 para Pseudomonas aeruginosa. Nenhuma concentração de ambas quitosanas demonstrou ação bactericida para a cepa de S. entérica. A quitosana microbiológica apresentou menor concentração mínima bactericida frente P. aeruginosa quando comparada com a quitosana de crustáceo, sendo de 2,5mg.mL-1 -1 e 5,0 mg.mL , respectivamente. Os resultados obtidos destacam a quitosana como um promissor agente de conservação de alimentos de origem natural. Palavras-chave: quitosana; patógeno alimentar; propriedade antibacteriana; conservante de alimentos.
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ABSTRACT
Chitosan has recently gained more interest due to its applications in food and pharmaceutics. Among others, the antimicrobial activity of chitosan has been pointed out as one of its most interesting properties of chitosan. The purpose of this study was to extract and characterize chitosan from Mucor circinelloides (UCP 050) and evaluate the in vitro antibacterial activity of chitosan against food pathogenic and spoilage bacteria. Chitosan from crabs was used to comparison. The antibacterial activity was carried determining the minimum inhibitory and bactericidal concentration by Heilman test. Submerged fermentation was carried for chitosan productions by M. circinelloides (UCP 050) in an economic culture medium, Yam Bean (Pachyrhizus erosus L. Urban). The assay also evaluate the growth of M. circinelloiodes in different times of growth (24, 48, 72 and 96 hours), incubated at 28ºC in an orbital shaker at 150 rpm. Chitin and chitosan were extracted by alkali-acid treatment. Fungi chitosan was characterized by infrared spectroscopy, viscosity, thermal analysis and X-ray diffractometry. M. circinelloides grown in the yam bean medium produced higher yields of biomass (20.7 g.L-1) in 96 hours. The high level of chitosan (64 mg.g-1), and chitin (500mg.g-1) were produced at 48 and 72 hours of growth, respectively. Chitosan showed degree of deacetilation and viscosimetric molecular weight as: 83% and 2.70 104
x g/mol, respectively. X-ray diffraction showed strong Bragg refractions at an angle 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å) and thermal analyses demonstrated a process of dehydration, followed of the polymer decomposition, with generation of carbonized material. DSC curves showed two thermal events; the first was a wide endothermic peak, and the second event was an endothermic peak. Both chitosan had identical minimum inhibitory concentration for all bacteria assayed, which was 1,50 mg.mL-1 for Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli and Yersinia enterocolitica and 0,625 mg.mL-1 for Pseudomonas aeruginosa. Neither concentration of both chitosan showed bactericide effect against S. enterica strain. Microbiological chitosan showed lower minimum bactericide concentration against P. aeruginosa than crustacean chitosan, which was 2,5 mg.mL-1 and mg.mL-1, respectively. The results obtained in this study demonstrate the potential of chitosan as a novel food preservative of natural origin. Keywords: chitosan; foodborne pathogen; antibacterial property; food preservative.
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Sumário
1.0 INTRODUÇÃO 15 2.0 REVISÃO DE LITERATURA 17 2.1 Quitina e Quitosana 17 2.1.1 Considerações gerais 17 2.1.2 Produção de quitina e quitosana 19 2.1.3 Biossíntese de quitina e quitosana 21 2.1.4 Ciclo biológico de quitina e quitosana 22 2.1.5 Aplicações quitina e quitosana 23 2.2 Quitosana: promissor agente conservante de alimentos 26 2.2 .1 Atividade antimicrobiana 28 2.2.2 Atividade antioxidante 34 2.2.3 Biofilmes 36 3.0 OBJETIVOS 39 4.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40
Primeiro artigo Título - Chitosan from Mucor circinelloides: growth, production
and physico-chemical characterization Abstract 53 1. Introduction 54 2. Materials and methods 55 2.1 Microorganisms 55 2.2 Culture medium 56 2.3 Growth profile 56 2.4 Glucose and nitrogen consumption and pH determination 57 2.5 Chitin and Chitosan Extraction 57 2.6 Chitin and chitosan characterization 57 2.6.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%) 57 2.6.2 Molecular weight 58 2.6.3 Thermal analysis 58 2.6.4 X-ray diffraction 59 2.7 Statistic analysis 59 3. Results and discussion 59 4. Conclusion 65 5. Acknowledgements 66 6. References 66
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Figures 69
Segundo artigo Título - Microbiological chitosan potentiates the antibacterial
activity against food and spoilage bacteria Abstract 75 1. Introduction 76 2. Materials and Methods 79 2.1 Bacterial strains and culture conditions 79 2.2 Chitosan preparation 79 2.3 Chitosan from M. circinelloides extraction 80 2.4 Chitin and chitosan characterization 80 2.4.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%) 80 2.4.2 Molecular weight 81 2.5 Antimicrobial activit 81 3. Results and discussion 82 4. Conclusion 86 5. Acknowledgements 86 6. References 86 Figures 91 Tables 92 CONCLUSÕES 93 ANEXOS 94
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Lista de figuras
Revisão de literatura Figura 1- Estrutura química (a) quitina, (b) quitosana 17 Figura 2- Arranjo das cadeias de α e ß quitina, antiparalelo (a) e paralelo (b)
19
Figura 3- Esquema da síntese de quitina e quitosana nos crustáceos e nos fungos da Ordem Mucorales
21
Figura 4- Ciclo biológico de quitina 23 Figura 5- Esquema das aplicações da quitosana na indústria de alimentos
25
Primeiro artigo
Título: Chitosan from Mucor circinelloides: growth, production and physico-chemical characterization
Figure 1- Profile of growth of M. circinelloides UCP 050 in yam bean medium at 28ºC, 150rpm, during 96h of cultivation 69
Figure 2- Chitin and chitosan yields (mg/mL) from M. circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium, at 28ªC, 150rpm during 96 h of cultivation
70
Figure 3- Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050
71
Figure 4- X-ray diffraction of chitosan from Mucor circinelloides (UCP 050)
72
Figure 5- DSC and TGA termograms of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050, under continuous flow of dry nitrogen gas (50mL.min-1), at a heating rate of (10°C min-1)
73
Segundo artigo Título - Microbiological chitosan potentiates the antibacterial
activity against food and spoilage bacteria Figure 1- Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050. 91
Figure 2- Infrared spectra of chitosan from crabs (Sigma®). 91
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Tabelas
Segundo artigo Título: Microbiological chitosan potentiates the antibacterial
activity against food and spoilage bacteria Table 1-Minimum inhibitory concentration (mg.mL-1) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria 92
Table 2-Minimum bactericidal concentration (mg.mL-1) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria
92
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1.0 Introdução
A exigência por alimentos seguros, com uma vida útil prolongada e de alta
qualidade nutritiva e sensorial é crescente (CHI et al., 2006). Os consumidores e os
próprios órgãos de saúde pública estão especialmente preocupados com os efeitos
decorrentes do uso de vários aditivos químicos em produtos alimentícios e sua
relação com a saúde (RHOADES & ROLLER, 2000; BARRETEAU et al., 2006).
Este cenário tem incentivado a pesquisa de novos agentes naturais que
possam ser empregados de forma a complementar os métodos de preservação de
alimentos que se dispõe atualmente (SOUZA et al. 2005; DEVLIEGHERE et al.,
2004a; KANATT, 2008a).
Destaca-se, entre estes, a quitosana, heteropolimero composto por unidades
repetidas de β-1,4 N-acetilglucosamina e β (1-4)-D-glicosamina, encontrada na
parede celular de fungos sendo a Classe Zygomycetes, e em particular a Ordem
Mucorales, a que apresenta maior quantidade de quitina e quitosana (CAMPOS-
TAKAKI, 2005; FRANCO et al., 2005; STAMFORD et al., 2007). A quitosana
também pode ser obtida através da deacetilação da quitina, podendo o grupo N-
acetil sofrer vários graus de deacetilação, gerando assim diversos derivados
(OKAWA et al., 2003; SANTOS et al., 2003).
A literatura atual é vasta em material sobre quitina e quitosana, podendo-se
encontrar várias revisões que abordam diferentes aspectos destes polímeros
(TSIGOS et al., 2000; KIM & RAJAPAKSE, 2005; RINALDO, 2006; NO et al.,
2007).
A quitosana apresenta um amplo espectro de possíveis aplicações em
biomedicina (MARTINO et al., 2005), produtos farmacêuticos, biotecnologia
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 16
(COSTA SILVA et al., 2006), nanotecnologia (MURUGADOSS &
CHATTOPADHYAY, 2008) e ciência de alimentos (SHAHIDI et al., 1999; LIU et
al., 2008).
As características físico-químicas deste biopolímero, derivadas de sua
capacidade de formação de complexos polieletrolíticos e propriedades de
biodegradabilidade, biocompatibilidade aos tecidos e bioatividade, justificam a
razão pela qual o modo de obtenção e produção deste polissacarídeo tem sido
extensivamente estudado na atualidade (HARISH PRASHANTH &
THARANATHAN, 2006; YEN & MAU, 2007).
Na indústria alimentícia, a quitosana também oferece um amplo espectro de
possíveis aplicações, como seja, formação de filmes biodegradáveis (MENG et al.,
2008) recuperação de sub-produtos, imobilização de enzimas (KUMAR,2000),
purificação de água (ZENG et al., 2008), clarificação de sucos de frutas
(CHATTERJEE et al., 2005), agente antioxidante (SHAHIDI et al., 2002;
KANATT et al., 2004), destacando-se sua eficácia quanto à preservação da
qualidade microbiológica do alimento (QUIN et al., 2006; NO et al., 2007;
KANATT et al., 2008b).
Neste sentido, frente ao reconhecido potencial antimicrobiano da quitosana e
considerando a obtenção deste polímero a partir de fungos como uma alternativa
rentável e promissora, esta pesquisa teve como objetivo extrair e caracterizar a
quitosana da biomassa de Mucor circinelloides e avaliar a eficácia desta na inibição
do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse
em alimentos.
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2.0 Revisão de Literatura
2.1 Quitina e Quitosana
2.1.1 Considerações gerais
A quitina é um polímero natural, álcali-ácido insolúvel, linear que apresenta
unidades repetidas de β-1,4 N-acetilglucosamina e β (1-4)-D-glicosamina (figura
1a) e com exceção da celulose é o polissacarídeo mais abundante e largamente
distribuído na natureza (CANELLA & GARCIA, 2001; MUZZARELLI, 2001). A
quitina é encontrada no exoesqueleto dos crustáceos, insetos e, em especial, na
parede celular de fungos. A quitosana (figura 1b) é um heteropolimero natural,
amino catiônico, composto por unidades β-1,4 D-glucosamina ligadas a resíduos de
N-acetilglucosamina, sendo encontrada na parede celular de fungos. A quitosana
também pode ser obtida através da deacetilação da quitina, podendo o grupo N-
acetil sofrer vários graus de deacetilação, gerando assim diversos derivados (KHAN
et al., 2002; ANDRADE et al., 2003; OKAWA et al., 2003).
(a) (b)
Figura 1- Estrutura química (a) quitina, (b) quitosana Fonte: Craveiro et al., 1999.
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A quitina foi isolada pela primeira vez em 1881 por Braconnot, quando
trabalhava com Agaricus volvaccus e outros fungos, recebendo a denominação
inicial de fungina (CAMPANA-FILHO et al., 2007). Odier em 1823 isolou um
resíduo insolúvel de insetos, chamando-o de quitina, nome derivado da palavra
grega Chiton, que significa carapaça ou caixa protetora. Contudo, Odier relatou que
havia isolado a quitina mediante vários tratamentos de soluções de hidróxido de
potássio concentrado. Isto, o levou a um equívoco, pois na realidade ele isolou a
quitosana. A quitosana, por sua vez, foi descoberta em 1859 por Rouget e seu nome
foi proposto em 1894 por Hoope-Seyler devido ao fato desta substância possuir a
mesma quantidade de nitrogênio que a quitina original (CRAVEIRO et al., 1999;
CAMPOS-TAKAKI, 2005).
Polissacarídeos conhecidos por apresentarem polimorfismo, quitina e
quitosana podem assumir três diferentes arranjos de suas cadeias nas regiões
cristalinas as quais são dependentes da polaridade adquirida pelas cadeias de açúcar.
As formas são denominadas α, ß e γ (Figura 2) e podem ser evidenciadas através do
estudo de difração de raios-x. A conformação polimérica α apresenta uma
disposição alternada de cadeias paralelas e antiparalelas que é dominante sobre as
demais, além de ser mais estável e resistente. Esta forma é encontrada em
crustáceos, cutícula de artrópodes, parede celular de fungos e insetos, estando
geralmente associada a proteínas e materiais inorgânicos. As conformações ß e γ
estão relacionadas à flexibilidade e dureza, ressaltando-se que estas podem ser
convertidas à forma α através de tratamentos químicos adequados. A ocorrência de
forma ß é evidenciada em organismos marinhos como lulas e algas microscópicas e
possui um arranjo de cadeias dispostas em paralelo. A forma γ todavia não foi
completamente caracterizada, embora haja sugestões de que tenha duas cadeias
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 19
paralelas e uma antiparalela (CAMPOS-TAKAKI, 2005; RINALDO, 2006; YEN &
MAU, 2007).
Figura 2 - Arranjo das cadeias de α e ß quitina, antiparalelo (a) e paralelo (b) Fonte: Tharanathan & Kittur, 2003
2.1.2 Produção de quitina e quitosana
Exoesqueletos de crustáceos constituem a fonte tradicional para obtenção de
quitina e quitosana. O conteúdo de quitina nos crustáceos varia de acordo com a
espécie estando o rendimento entre 2 a 12% da massa corpórea total, e de 13 a 42%
na casca. A quitosana é obtida pela deacetilação da quitina utilizando NaOH 50% e
temperatura em torno de 110ºC (SYNOWIECHI & AL-KHATEEB, 2003).
Existem várias limitações em relação à viabilidade do processo de obtenção da
quitina e quitosana proveniente de crustáceos, tais como: adaptação ao clima,
sazonalidade, locais de confinamento e o processamento em larga escala associado
com a conversão química de quitina em quitosana pela quitina deacetilase
(POCHANAVANICH & SUNTORNSUUK, 2002; AMORIM et al., 2005;
FRANCO et al., 2005; SILVA et al., 2006a).
Utilização de massa micelial de fungos como fonte alternativa de quitina e
quitosana tem demonstrado grandes vantagens, tais como: extração simultânea de
quitina e quitosana, independência dos fatores de sazonalidade, produção em larga
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 20
escala (AMORIM et al., 2001; AMORIM, et al., 2006; STAMFORD, et al., 2007).
A quantidade destes polissacarídeos extraídos da biomassa varia de acordo com a
espécie de fungo e condições nutricionais, principalmente, a fonte de carbono
utilizada.
Fungos da Divisão Zygomycotina apresentam quitina e quitosana
simultaneamente em sua parede celular (TSIGOS et al., 1999; FRANCO et al.,
2005; AMORIM, et al., 2006).
Várias pesquisas utilizando fungos como fonte alternativa de quitina e
quitosana relatam rendimentos iguais ou superiores, destes polímeros, aos obtidos
quando utilizadas fontes tradicionais (ANDRADE et al., 2003; AMORIM et al.,
2005).
Estudos utilizando biomassa de Mucor rouxii e M. javanicus obtiveram
rendimento de quitosana em torno de 8% e de quitina entre 8,9% e 23,9%
(SYNOWIECK & AL-KHATEEB, 1997; ANDRADE et al., 2003). Em recentes
estudos, tem se estabelecido métodos de otimização para processos de produção de
quitina e quitosana a partir de massa micelial de Cunninghamella elegans, assim
como a utilização de meios de cultura alternativos e de baixo custo econômico,
sendo relatados rendimentos de quitosana entre 5% e 8%, e de quitina em torno de
23% a 40% (ANDRADE et al., 2000, AMORIM et al., 2001; FRANCO et al.,
2005, STAMFORD et al., 2007).
Nwe et al. (2001) avaliando a produção de quitosana por vários
Zygomycetes, utilizando batata doce como meio de cultura básico, obtiveram os
melhores resultados com Gongronella butleri apresentando rendimento de
quitosana entre 7,9 a 11,6% e 8,2 a 12,7% em fermentação submersa e sólida,
respectivamente.
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2.1.3 Biossíntese de quitina e quitosana
A biossíntese de quitina difere significativamente em fungos e crustáceos,
contudo, etapas da via de produção e maquinaria enzimática para regulação
catalítica são similares, como observado na figura 3.
Figura 3 - Esquema da síntese de quitina e quitosana nos crustáceos e nos fungos da Ordem Mucorales Fonte: Stamford, 2006
Nos crustáceos a síntese inicia-se pela conversão de glicose-6-fosfato em N-
acetilglicosamina- 1-fosfato, envolvendo uma série de etapas que requerem várias
reações enzimáticas. A N-acetilglicosamina-1-fosfato reage com a UTP formando a
UDP-NAcetilglicosamina, que finalmente, transfere a N acetilglicosamina para a
polimerização de cadeias de quitina em um processo mediado pela enzima quitina-
sintetase e íons Mg+2 , como catalisador, resultando na formação de uma longa
cadeia de sub-unidades monossacarídicas unidas por ligações β-1→4 (CABIBI,
1987). A quitosana é obtida pela deacetilação da quitina mediante tratamento
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químico com NaOH em alta temperatura (DAVIS & BARTINICK, 1984;
BARTNICKI-GARCIA, 1989).
Nos fungos a síntese de quitina e de quitosana ocorrem simultaneamente. A
síntese de quitina é altamente compartimentalizada. A enzima quitina sintetase
ocorre na forma de zimógeno, sendo distribuída em regiões específicas da superfície
celular, em vesículas especializadas chamadas quitossomas (BARTNICKI-
GARCIA, 1989). A montagem macromolecular inicia-se fora do citoplasma, onde a
enzima protease atua na superfície celular ativando o zimogêno. Desta forma a
UDP-N acetilglicosamina é produzida a partir da glicose, e a quitina sintetase
catalisa a transferência do N-acetilglicosamina para polimerização da cadeia
formando quitina. A quitosana presente na parede celular de alguns fungos da
Ordem Mucorales, é formada a partir da deacetilação da cadeia de quitina nascente,
pela ação da quitina deacetilase, durante a biossíntese de quitina. As sínteses de
quitina e de quitosana são realizadas pela organização espacial da síntese de quitina
na superfície celular (DAVIS & BARTNICKI-GARCIA, 1984; STAMFORD,
2006).
2.1.4 Ciclo biológico de quitina e quitosana
De acordo com Craveiro et al. (1999), quitina e quitosana são
biologicamente sintetizadas em um total de, aproximadamente, um bilhão de
toneladas anualmente, sendo biodegradadas sem acúmulo excessivo na natureza,
através do “ciclo da quitina” (figura 4). As enzimas hidrolíticas envolvidas nesse
processo (lisoenzima, quitinase, quitina desacetilase e quitosanase) estão largamente
distribuídas nos tecidos e fluídos corporais dos animais e plantas, bem como no solo
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impedindo naturalmente o excesso destes polímeros, contribuindo para a
preservação do ambiente.
QUITINA QUITOSANA
Quitina oligossacarídeos
Quitosana oligossacarídeos
N-acetil-D-glicosamina D-glicosamina
Quitina desacetilase
Quitinase Lisozima
Quitosanase
N-acetil-ß-D-glicosaminidase
QUITINA QUITOSANA
Quitina oligossacarídeos
Quitosana oligossacarídeos
N-acetil-D-glicosamina D-glicosamina
Quitina desacetilase
Quitinase Lisozima
Quitosanase
N-acetil-ß-D-glicosaminidase
Figura 4 - Ciclo biológico de quitina Fonte: Craveiro et al, 1999
2.1.5 Aplicações quitina e quitosana
O interesse comercial nas aplicações de quitosana e derivados aumentou
vertiginosamente nas últimas três décadas, o que pode ser constatado pelo depósito
de patentes no Japão, Europa, China, Coréia e, principalmente, nos EUA. Assim,
conforme o “United States Patent and Trademark Office”, foram registradas 5946
patentes patentes relacionadas à quitosana no período 1976-2006 apenas nos EUA
(CAMPANA-FILHO et al., 2007).
A literatura apresenta uma grande diversidade de fontes para produção de
quitina e quitosana, as quais influenciam as diferentes propriedades destes
polímeros e derivados, possibilitando o aumento do potencial biotecnológico e
aplicações comerciais (HARISH PRASHANTH & THARANATHAN, 2006;
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 24
MAIA et al., 2006; YEN & MAU, 2007). As principais propriedades deste
polissacarídeo são: bioatividade, biodegradabilidade, biocompatibilidade,
reatividade do grupo amino deacetilado, permeabilidade seletiva, ação
polieletrolítica, habilidade em formar gel e filme, habilidade de quelação e
capacidade adsortiva (SYNOWIECKI & AL-KHATEEB, 2003; THARANATHAN
& KITTUR, 2003).
A quitosana vem sendo extensivamente estudada devido às suas
propriedades peculiares que lhe conferem um aproveitamento bastante versátil, tais
como: carreador de fármacos de liberação controlada e DNA (MITRA et al., 2001;
KATO et al., 2004; KIM et al., 2004; SUNIL et al., 2004), regeneração de tecidos
epiteliais (KARIMAN, 2007; LI et al., 2007a; NIEKRASZEWICZ et al., 2007),
confecção de membranas artificiais (DUREJA et al., 2001; COSTA et al., 2006),
promotor de osteogênese (MUZZARELLI & MUZZARELLI, 2002; MURUGAN
& RAMAKRISHNA, 2004; MARTINO et al., 2005; PARK et al., 2005;
HAMILTON et al., 2007), antibacteriano (MUZZARELLI et al., 1990; CHUNG et
al., 2004; YADAV & BHISE, 2004; JING et al., 2007), coadjuvante da higiene oral
(ENEL et al., 2000; SANO et al., 2002; SANO et al., 2003; HAYASHI et al.,
2007), absorção de gordura e redução do colesterol sérico (KIM et al., 2005;
RODRÍGUEZ & ALBERTENGO, 2005; FEOFILOVA, 2007; LIU et al, 2008),
componente de cosméticos (MASATO, 2002; KOHEI & MAKI, 2006), remoção e
recuperação de diferentes resíduos (VIVEK & TORRES, 2000; LIMA et al., 2006),
biotransformação e detecção de pesticidas (DU et al., 2007; YOSHIZUKA et al.,
2007), recobrimento de sementes na agricultura (VELÁSQUEZ, 2003), remoção de
corantes, aminoácidos e proteínas (CRAVEIRO et al., 1999; BORDERÍAS et al.,
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 25
2005), como agente de floculação no tratamento de efluentes aquosos (DÍAZ et al.,
2007; ZENG et al., 2008).
As possibilidades de aplicações são ainda enriquecidas pelo fato da
quitosana poder ser preparada em diferentes formas, tais como soluções de
viscosidade controlada, géis, filmes e membranas, microesferas e nanopartículas
(CAMPANA-FILHO et al., 2007; MURUGADOSS & CHATTOPADHYAY,
2008).
Na indústria alimentícia, a quitosana oferece um amplo espectro de
aplicações (SHAHIDI et al., 1999; KUMAR, 2000; JIANG & LI, 2001; AGULLÓ
et al., 2003; THARANATHAN & KITTUR, 2003; BORDERÍAS et al., 2005;
BAUTISTA-BAÑOS et al., 2006; BORGOGNI et al., 2006; Li et al., 2007b),
conforme esquematizado na figura 5.
Quitosana
FUNÇÃO DE ADITIVO OUTRAS FUNÇÕESEMBALAGENS ATIVAS
Emulsificante
Antioxidante
Conservante
Estabilizante
Controle da oxidação lipídica
Prevenção do escurecimento
enzimático
Formação de biofilmes
Antibacteriano e antifúngico
Barreira à perda de umidade
Redução da produção de
etileno e poligalacturonase
em frutos
Manutenção da cor por mais
tempo
Redução da taxa respiratória em
frutos
Recuperação de subprodutos
Encapsulação de aromas
Clarificação de sucos de frutas
Purificação de água
Quitosana
FUNÇÃO DE ADITIVO OUTRAS FUNÇÕESEMBALAGENS ATIVAS
Emulsificante
Antioxidante
Conservante
Estabilizante
Controle da oxidação lipídica
Prevenção do escurecimento
enzimático
Formação de biofilmes
Antibacteriano e antifúngico
Barreira à perda de umidade
Redução da produção de
etileno e poligalacturonase
em frutos
Manutenção da cor por mais
tempo
Redução da taxa respiratória em
frutos
Recuperação de subprodutos
Encapsulação de aromas
Clarificação de sucos de frutas
Purificação de água
Figura 5 - Esquema das aplicações da quitosana na indústria de alimentos
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 26
2.2 Quitosana: promissor agente conservante de alimentos
Atualmente, a qualidade é um componente fundamental dos alimentos,
como a segurança alimentar (inocuidade) é componente indispensável da qualidade
(SILVA et al., 2006b). No entanto, a manutenção da qualidade de diversos produtos
alimentícios durante sua vida útil só é possível graças à atuação dos conservantes
químicos, tornando a produção de alimentos um tanto complexa, uma vez que, os
consumidores exigem alimentos seguros para o consumo, com mínimo de aditivos
químicos e que apresentem a conveniência de possuir uma extensa vida de
prateleira, estabelecendo-se, assim, um paradoxo.
No Brasil, o uso de aditivos alimentares é norteado pelo Ministério da Saúde
e regulamentado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),
considerando aditivo alimentar qualquer ingrediente adicionado intencionalmente
aos alimentos, sem propósito de nutrir, com o objetivo de modificar as
características físicas, químicas, biológicas ou sensoriais, durante a fabricação,
processamento, preparação, tratamento, embalagem, acondicionamento,
armazenagem, transporte ou manipulação de um alimento, de acordo com as
diretrizes preconizadas pela Portaria nº 540 (BRASIL, 1997). De acordo com esta
mesma Portaria os aditivos são classificados quanto à função, sendo classificados
como agentes conservantes as substâncias que têm a finalidade de impossibilitar ou
retardar a deterioração microbiana ou enzimática dos alimentos. A quitosana
apresenta-se perfeitamente compatível com esta definição, considerando suas
propriedades físico-químicas e o reconhecido potencial antimicrobiano e
antioxidante.
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 27
O uso de aditivos químicos é, no entanto, uma das práticas mais discutidas e
polêmicas. Se por um lado seu uso é imprescindível, por outro a debilidade e
incertezas de ambos os estudos negativos e positivos relacionados à toxicidade dos
aditivos químicos gera controvérsias. Dessa forma, justifica-se a atual tendência
adotada pela indústria de alimentos de uma política decrescente do uso de aditivos
químicos.
A toxicidade da quitosana é menor do que a glicose ou sacarose. A dose letal
de glicose em mamíferos é da ordem de 8 a 12 gramas enquanto que 18 gramas de
quitosana por quilograma de massa corporal em mamíferos não apresenta qualquer
sinal de toxicidade ou mortalidade (CRAVEIRO et al. 1999, YADAV & BHISE,
2004). Estudos indicam que a quitosana é benéfica e segura para o consumo
humano. Entretanto, como qualquer outra substância, se utilizada de forma
inadequada ou em excesso pode ser nociva ao organismo.
Os problemas referidos, decorrentes de doses excessivas da quitosana, foram
causados por desidratação gástrica e pelo impacto em decorrência do aumento do
volume da mesma uma vez que esta consiste em uma fibra natural que em meio
ácido se expande para formar um gel no estômago (COSTA SILVA et al., 2006).
A quitosana vem sendo utilizada na indústria de alimentos nos Estados
Unidos, Alemanha e Japão, sendo reportado neste último, como agente conservante
em: macarrão, molho de soja, sardinha, entre outros; contudo, dados quanto às
condições de processamento/formulação, todavia são escassas (ROLLER &
COVILL, 1999; RODRÍGUEZ et al., 2002).
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 28
2.2 .1 Atividade antimicrobiana
Com o intuito de evitar ou retardar a deterioração microbiana de alimentos a
quitosana e seus derivados têm sido amplamente pesquisados como agentes
antimicrobianos, e nos últimos anos têm recebido uma atenção especial, graças aos
resultados promissores neste âmbito de aplicação (TIKHONOV et al., 2006;
QIUPING & WENSHUI, 2007).
Pesquisas têm demonstrado que a quitosana apresenta ser eficiente como
antimicrobiano contra vários microrganismos como Staphylococcus aureus,
Escherichia coli (ZHENG & ZHU, 2003; LI et al., 2007b), Salmonella.
typhimurium, Streptococcus faecalis (CHUNG et al., 2004), Salmonella entérica, S.
paratyphi, Pseudomonas aeruginosa (YADAV & BHISE, 2004), Listeria
monocytogenes (COMA et al., 2002), Bacillus. cereus, Shigella dysenteriae,
Aeromonas hydrophila, Fusarium, Alternaria, Helminthosporium (COSTA SILVA
et al., 2006), Sacharomyces cerevisiae, S. ludwigii, Zygosaccharomyces baillii,
Cryptococcus albidus, Candida sp., Rhodotorula sp. (WANG, 1992; RHOADES &
ROLLER, 2000; SAGOO et al., 2002).
O mecanismo de ação da quitosana sobre os microrganismos não está
completamente elucidado, mas várias propostas são sugeridas (NO et al., 2007).
Estudos mais recentes revelam que o mecanismo da atividade
antimicrobiana da quitosana está intimamente relacionado às propriedades físico-
químicas da solução de quitosana (grau de deacetilação e massa molar),
concentração utilizada e tempo de exposição, além das características inerentes à
membrana do microrganismo (COSTA SILVA et al., 2006; KANATT et al.,
2008b).
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 29
Alguns pesquisadores correlacionam a atividade antimicrobiana da
quitosana à formação de complexos polieletrolíticos, uma vez que seus grupos
amínicos protonados provavelmente se ligam seletivamente à superfície celular
carregada negativamente dos microrganismos, alterando a atividade celular e a
permeabilidade da membrana, resultando na perda de componentes intracelulares e
conseqüente inibição microbiana (AVADI et al., 2004; TSAI & HWANG, 2004;
YADAV & BHISE, 2004; CHEN et al., 2006).
Pesquisas demonstram que o efeito antimicrobiano da quitosana é distinto
em bactérias Gram-positivas e negativas (LIU et al., 2004). A atividade
antimicrobiana da quitosana em bactérias Gram-negativas tem sido associada à
natureza catiônica da quitosana que permite a interação e formação de complexos
polieletrólitos com os polímeros aniônicos presentes na superfície do
microrganismo pertubando a integridade da membrana. Em bactérias Gram-
positivas a hipótese é de que a quitosana forma filmes ao redor da célula, inibindo a
absorção de nutrientes (HELANDER et al., 2001; DEVLIEGHERE et al., 2004b;
HARISH PRASHANTH & THARANATHAN, 2006; KANATT et al., 2008a).
Estudos recentes relatam que a quitosana induz à desorganização molecular
e mudanças morfológicas em fungos fitopatógenos como: Fusarium oxysporum,
Sclerotio sclerotiorum, Rhizopus stolonifer, Penicillium digitatum, Colletotrichum
gloesporioides (BAUTISTA-BAÑOS et al., 2004), Aspeegillus niger
(PLASCENCIA-JATOMEA et al., 2003), entre outros.
A quitosana também apresenta a função de agente quelante de íons
metálicos. Dessa forma é sugerido ainda que este polissacarídeo poderia interferir
na produção de toxinas no crescimento microbiano (BORDERÍAS et al., 2005).
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 30
Altieri et al. (2005) estudando a eficiência antibacteriana da quitosana em
queijo muzarela mantido sob temperatura de refrigeração, constataram que a
quitosana inibiu o crescimento de microrganismos do grupo Coliforme e de
Pseudomonas spp. Inferiram ainda, que a presença deste polissacarídeo não afetou a
viabilidade e crescimento das bactérias ácido láticas, ao contrário, observou-se um
sutil estímulo com relação à sua multiplicação, de forma a não comprometer a
funcionalidade tecnológica que esta classe de microrganismos exerce sobre este
produto, demonstrando assim, que o uso de quitosana seria uma opção vantajosa
para estender a vida de prateleira deste alimento em termos tecnológicos e
econômicos.
Lee et al. (2002) e Barreteau et al. (2006) sugerem que oligossacarídeos de
quitosana e a própria quitosana de baixa massa molecular exerceriam um efeito
benéfico seletivo sobre o crescimento e atividade biológica de bactérias probióticas
tais como Bifidobacteria e Lactobacillus.
Martinez-Castellanos et al. (2007) reportaram que Lactobacillus
acidophillus, L. plantarum e Lactobacillus spp. podem ser impregnados em
películas de quitosana conservando sua viabilidade mesmo em concentrações
elevadas deste polissacarídeo (20g/L). Dentro do conceito de tecnologia de barreiras
de proteção o uso de biofilmes de quitosana associado a bactérias láticas é de
grande potencialidade, visto que lactobacilos produzem ácido lático, bacteriocinas e
outros compostos que inibem o desenvolvimento de patógenos e deteriorantes de
alimentos, além de serem importantes probióticos (SAAD, 2006).
Tsai & Hwang (2004) examinando a atividade antibacteriana in vitro frente
a algumas bactérias patógenas e probióticas relataram que para a quitosana com
grau de deacetilação entre 70 e 95%, a concentração mínima letal para Escherichia
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 31
coli, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, V. parahemoliticus, Listeria
monocytogenes e Shigella dysenteriae foi de 50 a 200 p.p.m., enquanto para
Clostridium perfrigens e bactérias probióticas dos gêneros Lactobacillus e
Bifidobacterium foi de 250, 500 e 1000 p.p.m., respectivamente. Fica evidente que a
resistência destas espécies probióticas testadas é mais elevada, quando comparada
às patógenas alimentares e intestinais, o que leva a crer que superfície celular destes
microrganismos é distinta, fazendo-se necessárias mais pesquisas acerca das
mesmas para se alcançar uma explicação conclusiva.
Outra constatação interessante destes mesmos autores refere-se à baixa
eficiência antibacteriana da quitosana frente C. perfrigens testada in vivo após a
ingestão na forma de pó em animais de laboratório, atribuindo-se este fato
fundamentalmente às diferenças de pH (nas condições do intestino o pH é maior
que 7,0, estando acima do pKa da quitosana), havendo portanto menos grupos
amínicos protonados desfavorecendo a interação com a superfície celular, e à
própria conformação da molécula que quando in vitro (pH<7) poderia estar mais
disponível devido ao desdobramento da cadeia por conta de uma maior repulsão
eletrostática dos grupos positivamente carregados.
Juneja et al. (2006) demonstraram que a adição de quitosana (concentração
3% p/p) em carne bovina e de peru cozidos foi eficiente para reduzir
significativamente o risco potencial de germinação de esporos de Clostridium
perfrigens durante a etapa de resfriamento de 54,4 ºC a 7,2ºC por até 18h.
É valido ressaltar que não obstante a quitosana apresente potencial para ser
utilizada como agente antimicrobiano natural é imprescindível que sejam estimadas
as características da matriz alimentar em questão, considerando-se os efeitos dos
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 32
próprios constituintes, o pH do produto, a combinação de procedimentos a que este
é submetido, as propriedades reológicas e demais aspectos físicos-químicos.
Devlieghere et al. (2004b) estudaram a ação antimicrobiana da quitosana in
vitro frente a alguns constituintes alimentares, constatando que há interferência do
NaCl devido à interação eletrostática derivada da dissociação desta molécula, sendo
que no caso das proteínas esta ação seria mais dependente do pH do meio às
próprias cargas aminoacídicas, visto que se estas estiverem abaixo do ponto
isoelétrico não haverá perda de atividade antimicrobiana, enquanto a gordura não
apresentou nenhum efeito adverso quanto a esta propriedade da quitosana.
Rodriguez et al. (2003) demonstrou que o uso de quitosana como biofilme
para revestir pizzas pré-cozidas (0,079g/100g pizza) foi eficiente para estender a
vida de prateleira durante o armazenamento devido sua ação antifúngica, reduzindo
o crescimento de Alternaria sp, Penicillium sp e Cladosporium sp. No entanto, após
o processamento térmico parte desta atividade antimicrobiana foi perdida
justificando-se tal fato, em razão da reação de Maillard visto que o grupamento
amínico comprometido com o açúcar redutor nesta reação, em temperatura elevada,
não é mais disponível para a formação de complexos polieletrolíticos,
desprendendo-se, portanto, que o uso de quitosana incorporado como agente
antimicrobiano em massas alimentícias fermentadas perde parte de sua propriedade
funcional se submetido a tratamento térmico (RODRÍGUEZ et al., 2002).
Vale ressaltar que alguns estudos revelam que os produtos resultantes da
reação de Maillard (PRM) apresentam ação antibacteriana (EINARSSON et al.,
1983; NAKAMURA et al., 1991; CHUYEN, 1998; CHEVALIER et al., 2001;
USUI et al., 2004; CHUNG et al, 2006), sendo inclusive sugerida, sua aplicação
como um aditivo conservante de alimentos (GOULD, 1995; LEISTNER, 2000).
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 33
Contudo, a literatura ainda é restrita em relação aos efeitos deletérios dos
PRM sobre microrganismos patógenos alimentares.
Neste sentido, Huang et al. (2007) estudaram a eficácia antibacteriana de
uma solução de quitosana antes, durante e depois da reação de Maillard induzida
pela adição de xilose e aquecimento a 95º/60horas. Examinaram, ainda, o efeito da
adição de quitosana e dos PRM sobre a vida de prateleira de macarrão de massa
fresca armazenado a 4ºC. Os autores verificaram que a atividade antibaceriana da
quitosana aumentou na fase inicial da reação de Maillard, observando que, a
atividade mínima inibitória para Bacillus subtilis decaiu de 250mg/mL para
50mg/mL. Constataram também que bactérias Gram-positivas são mais sensíveis
aos PRM que Gram-negativas. Por fim, concluíram que a adição de 0,05mL/100mL
de solução de quitosana e de PRM na formulação de macarrão de massa fresca
resultou em extensão de vida de prateleira de 6 e 14 dias, respectivamente.
Chi et al. (2006) relataram efeito sinérgico sobre a propriedade bactericida
de filmes de quitosana enriquecidos com extrato puro de óleo de orégano,
incorporadas em fatias de mortadela armazenada a 10ºC/5 dias, observando-se uma
redução do número de células de Listeria monocytogenes e Escherichia coli
O157:H7 de aproximadamente 4 logs decimais, comparada com 1 a 3 logs quando
aplicado somente o filme de quitosana, constatando ainda que este tipo de processo
é aceito em termos sensoriais.
Greco et al. (2007) reportaram que baixa concentração de quitosana (0,015%
p/v) com grau de deacetilação de 90% e PM de 300KDa é eficiente para inibir o
crescimento de Candida krusei em suco de maçã. Agregar a quitosana em uma
etapa prévia à pasteurização dos sucos, diminuiria a carga microbiana inicial,
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 34
permitindo tratamentos térmicos menos enérgicos, fazendo-se necessários mais
estudos a este respeito.
Não obstante sua comprovada eficiência antimicrobiana vale ressaltar que a
quitosana aplicada como um aditivo natural, complementar aos processos de
conservação tradicionais, não deve ser vista como um incentivo para o descuido das
boas práticas higiênico-sanitárias durante a fabricação de alimentos, uma vez que
esta ação configura na verdade, em mais uma etapa neste processo, ou seja,
aumentam-se os pontos críticos de controle. Neste sentido, um passo adicional,
como a incorporação de quitosana, requer um estrito cumprimento das “Boas
Práticas de Fabricação” para que os produtos cheguem às etapas finais com o maior
nível de qualidade possível.
2.2.2 Atividade antioxidante
Os processos de preservação de alimentos são determinados primeiramente
pelo controle do desenvolvimento microbiano. Contudo, outros fatores devem ser
controlados tais como a ocorrência de reações químicas e enzimáticas que
comprometem a qualidade sensorial do produto.
Diversos estudos têm reportado a habilidade antioxidante da quitosana,
tendo sido avaliado seu uso em carnes e derivados e frutos do mar que contém
quantidades significativas de ácidos graxos insaturados, particularmente
susceptíveis à oxidação lipídica durante seu processamento e armazenamento
(KANATT et al., 2004). Shahidi et al. (2002) verificaram que a adição de quitosana
mostrou-se eficiente como agente de controle da oxidação lipídica em bacalhau
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 35
(Gadus morhua), enquanto Darmadji & Izumimoto (1994) verificaram o efeito
antioxidante da quitosana em carne picada.
Kanatt et al. (2004), por sua vez, estudaram o efeito da adição de quitosana
em carne de cordeiro submetida a processo de irradiação, constatando que este
polissacarídeo minimizou os efeitos deste processo sobre a peroxidação lipídica,
uma vez que esta reação é justamente o fator limitante ao uso da irradiação em
carnes.
O mecanismo de ação antioxidante da quitosana nestes produtos é atribuído
à sua capacidade de quelar íons metálicos, tais como o ferro, ligado às moléculas de
hemoglobina e mioglobina, o qual age como catalisador desta reação (KAMIL et
al., 2002; BARRETEAU et al., 2006).
Em função da habilidade de se complexar a íons metálicos a quitosana é
também um promissor agente de controle do escurecimento enzimático em vegetais,
visto que a polifenoloxidase, enzima responsável por este fenômeno, possui cobre
no seu centro ativo e funciona como oxidase de função mista, atuando na
hidroxilação de monofenóis para diidroxifenóis e em seguida oxidando estes
últimos para o-quinonas. No caso dos vegetais, poder-se-ia sugerir, assim, o uso
da quitosana como biofilme de revestimento, visto que esta agiria como fator de
duplo impacto haja vista sua habilidade de bloquear dois componentes essenciais à
reação: o oxigênio (atmosfera modificada) e a própria enzima. Ressalta-se que neste
caso este método de preservação seria eficaz somente no início do processo uma
vez que a formação da quinona é dependente do oxigênio e da polifenoloxidase,
porém, uma vez formadas, as reações subseqüentes ocorrem espontaneamente sem a
dependência destes elementos para formação de melanina (ARAÚJO, 1999; ASSIS
& LEONI, 2003).
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 36
2.2.3 Biofilmes
Usar revestimentos e coberturas em frutas e vegetais com o objetivo de
aumentar seu período de preservação não consiste em prática recente. No entanto,
as coberturas denominadas “comestíveis” como hoje conhecemos datam das
décadas finais do século passado. Este renovado interesse deve-se à demanda dos
consumidores por alimentos de alta qualidade, preocupações ambientais em relação
ao acúmulo de embalagens não biodegradáveis e a oportunidade de se criar
alternativas de mercado para a produção de filmes de fontes renováveis
(FRANCHETTI & MARCONATO, 2006; BOTREL et al., 2007; MENG et al,
2008).
A quitosana destaca-se por sua capacidade de atuar como uma barreira à
perda de umidade, controlar a respiração do fruto e apresentar alto potencial
antimicrobiano, além de prevenir o escurecimento enzimático, ressaltando-se que
esta é biodegradável o que a torna “ambientalmente correta” (ASSIS & LEONI,
2003; BORDERÍAS et al., 2005; GALLETI et al., 2006; CHIEN et al., 2007a).
Neste âmbito de aplicação pode-se considerar, na realidade, os biofilmes a
base de quitosana como embalagens ativas, pois além de atuarem como uma
barreira a agentes externos, apresentam uma série de funções desejáveis à
manutenção da qualidade do vegetal ou fruto revestido. Apresenta como uma das
vantagens, sobre a embalagem convencional, o fato da quitosana apresentar
propriedades como agente antimicrobiano e antioxidante atendendo a atual
demanda por alimentos minimamente processados e livres da incorporação de
conservantes químicos (COMA et al., 2002; OLIVEIRA & OLIVEIRA, 2004).
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 37
Botrel et al. (2007) desenvolveram um revestimento antimicrobiano para
alho minimamente processado constituído de amido de mandioca adicionado de
quitosana, constatando que este foi viável para reduzir significativamente a
microbiota presente durante 20 dias de estocagem.
Qiuping & Wenshui (2007) pesquisando novas técnicas de preservação e
manutenção da qualidade de cerejas da Índia (Ziziphus mauritina, cv. Cuimi), à
temperatura ambiente, constataram que o uso de biofilme combinando quitosana e
1-metilciclopropeno foi eficaz para incrementar a vida útil deste fruto em oito dias.
Observaram diminuição da sua taxa respiratória e de produção de etileno e
poligalacturonase, pelas cerejas, observando também redução da perda de peso,
maior conservação da coloração verde e níveis mais altos de ácido ascórbico e
sólidos solúveis totais.
Chien et al. (2007b) reportaram a eficiência do biofilme de quitosana para
retardar o escurecimento, a deterioração e a perda de água em pitayas vermelhas
(Hylocereus undatus) fatiadas, mantendo o conteúdo de sólidos solúveis totais,
acidez titulável e ácido ascórbico. Verificaram, ainda, que este revestimento não
influenciou na qualidade sensorial de pitayas vermelhas, sugerindo assim, o uso de
coberturas de quitosana para preservar frutos minimamente processados de forma
geral.
Têm sido conduzidas, ainda, análises detalhadas dos filmes de quitosana por
microscopia eletrônica de varredura e de força atômica indicando estrutura
descontínua, que caracteriza certa porosidade residual no filme formado,
apresentando, de forma geral, espessura extremamente fina, não superior a 1,5 mm.
Essas características são desejáveis para coberturas de frutos, visto que, apesar de se
almejar baixar a taxa respiratória com vistas a retardar o amadurecimento, é
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 38
necessário que haja nos revestimentos a manutenção de uma respiração mínima,
evitando a ocorrência de processo fermentativo (ASSIS et al. 2002).
Contudo, observa-se, todavia, grande distância entre pesquisa e realidade
comercial, evidenciando-se que um dos aspectos que têm dificultado o uso da
quitosana na indústria alimentícia é a falta de padronização da mesma. As
quitosanas disponíveis, principalmente no Brasil, são de procedências diversas e
apresentam diferentes graus de pureza e densidade molar, além de não seguirem
industrialmente um procedimento comum de deacetilação, tornando os materiais
comerciais consideravelmente diferentes entre si, dificultando, dessa maneira, o
estabelecimento de um processamento padrão de géis e a obtenção de filmes e
revestimentos com características reprodutíveis (ASSIS & LEONI, 2003). Ressalta-
se a primazia da quitosana extraída de fungos quanto à aplicação deste biopolímero
no segmento alimentício, visto que a derivada de crustáceos é considerada
relativamente inconsistente quanto às suas propriedades físico-químicas devido à
variação da própria matéria-prima, contaminação por proteínas, carbonato de cálcio
e efeitos cáusticos dos produtos químicos necessários à síntese em altas
temperaturas resultando em hidrólise da cadeia (NADARAJAH et al., 2001).
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 39
3.0 Objetivos
3.1. Geral
Extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides (UCP
050) e avaliar a efetividade desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de
bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos.
3.2. Específicos
Investigar a eficiência do meio de cultura produzido a partir de Jacatupé
(Pachyrhizus erosus L. Urban) para o crescimento de Mucor circinelloides e
produção de quitina e quitosana;
Extrair e caracterizar quitosana da biomassa de Mucor circinelloides;
Verificar a sensibilidade de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de
interesse em alimentos frente à ação da quitosana;
Verificar a concentração inibitória mínima e máxima da quitosana sobre as
cepas ensaiadas.
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Primeiro artigo
CHITOSAN FROM Mucor circinelloides: GROWTH, PRODUCTION
AND PHYSICO-CHEMICAL CHARACTERIZATION
Trabalho submetido para publicação ao periódico indexado
CARBOHYDRATE POLYMERS
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CHITOSAN FROM Mucor circinelloides: GROWTH, PRODUCTION AND
PHYSICO-CHEMICAL CHARACTERIZATION
Ana Elizabeth Cavalcante Fai
Nutrition Pos-Graduatin coursin, Federal University of Pernambuco
Av. Professor Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, 50 670-901 Recife, PE, Brazil
E-mail: [email protected]
Thayza Christina Montenegro Stamford
Nucleous of Health Research, Integrated College of Patos-PB Av. s/n, Belo Horizonte, 58 700-300Patos, PB, Brazil
Nucleous of Research in Environmental Sciences, Catholic University of Pernambuco
Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 50 050-590 Recife, PE, Brazil E-mail: [email protected]
Petrus D´Amorim Santa-Cruz Oliveira
Department of Chemistry, Federal University of Pernambuco Av. Professor Moraes Rego s/n,
Cidade Universitária, 50 670-901 Recife, PE, Brazil E-mail: [email protected]
Galba Maria de Campos-Takaki
Universidade Católica de Pernambuco, Department of Chemistry and Nucleous of Research in Environmental Sciences,
Catholic University of Pernambuco Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 50 050-590 Recife, PE, Brazil.
E-mail: [email protected]
Tânia Lucia Montenegro Stamford
Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco Av. Professor Moraes Rego s/n,
Cidade Universitária, 50 670-901 Recife, PE, Brazil E-mail: [email protected]
Tel.: +55-81-21268471 Fax: +55-81-21268474.
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Chitosan from Mucor circinelloides: growth, production and physico-chemical
characterization
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a1Ana Elizabeth Cavalcante Fai , Thayza Christina Montenegro Stamfordb,d,
Petrus D´Amorim Santa-Cruz Oliveirac d,e, Galba Maria de Campos-Takaki ,
Tânia Lúcia Montenegro Stamfordf
a Pos-graduate student in the Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil;
b Nucleus of Health Research, Integrated College of Patos, Patos, Brazil;
c Department of Chemistry, Federal University of Pernambuco
d Nucleus of Research in Environmental Science, University Catholic of Pernambuco, Recife, Brazil;
e Department of Biology, University Catholic of Pernambuco, Recife-PE, Brazil
f Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife, Brazil.
Abstract
Microbiological processes were used for chitin and chitosan productions by Mucor
circinelloides (UCP 050) grown in Yam Bean (Pachyrhizus erosus L. Urban). The
polysaccharides were extracted by alkali-acid treatment and chitosan characterized
by infrared spectroscopy, viscosity, thermal analysis and X-ray Diffractometry.
Highest yield of biomass (20.7mg/mL) was found in 96 hours. The high level of
chitosan (64mg/g), and chitin (500mg/g) were produced at 48 and 72 hours of
growth, respectively. It was demonstrated that Yam Bean showed a great potential
as an economic medium and can reach a good yield of chitosan with chemical
properties that enable it to be used in biotechnological applications.
1 Corresponding author E-mail address: [email protected] (FAI, A.E.C.)
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Key words: Biopolymers, Zygomycetes, Crystallographic properties;
Deacetylation; Thermal analysis
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1. Introduction
Chitosan is a cationic, biodegradable, biocompatible and bioactivity, amino
polysaccharide, essentially composed of β-1,4 D-glucosamine (GlcNAc) linked to
N-acetyl-D-glucosamine residues. This polymer hold a great economic value as due
to their versatile biological activities and chemical applications (Andrade et al.,
2000; Synowiecki & Al-Khatteb, 2003; Amorim et al., 2005; Campos-Takaki,
2005).
Chitosan is a common constituent of fungal cell walls, particularly the class
of Zygomycetes, it is produced by the chemical or spontaneous deacetylation of
chitin, an insoluble linear β-1,4-N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc). Commercially,
chitosan is obtained by chemically deacetylating crustacean chitin with strong alkali
(Santos et al., 2003; Chatterjee et al., 2005; Silva et al., 2006; Silva et al., 2007).
The crustacean chitosan is inconsistent in its physico-chemical properties due to the
variability in raw materials, the harshness of the isolation and conversion processes,
caustic effects of the chemicals used in the isolation process, variability in the levels
of deacetylation and protein contamination (Nadarajah, et al., 2001; Tharanathan &
Kittur, 2003; New et al., 2002).
In order to obtain chitosan of a more consistent quality, filamentous fungi
have been considered an attractive source for industrial applications because their
specific products can be manufactured under standardized conditions (Tan, et al.,
1996; Synowiecki & Al-Khatteb, 1997; Pochanavanich & Suntornsuk, 2002;
Nemtsev et al., 2004; Amorim et al., 2006). This is achieved by careful
manipulation of the growth parameters such as pH and composition during the
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fermentation process. These manipulations result in chitosan of a varying molecular
weight and degree of deacetilation, which influence various properties, application
and biological response of the polymer (Kittur et al., 2002; Jaworska et al., 2003).
The use of biomass from fungi has demonstrated great advantages, such as:
independence of seasonal factor, wide scale production, simultaneous extraction of
chitin and chitosan, extraction process is simple and cheap resulting in reduction in
time and cost required for production, and also absence of proteins contamination,
mainly the proteins that could cause allergy reactions in individuals with shellfish
allergies (Andrade et al., 2000; Amorim et al., 2001; Andrade et al., 2003; Franco et
al., 2005; Stamford et al., 2007). However, to optimize the production of chitin and
chitosan from fungi, it's usually used complex or synthetics cultures media, which
are expensive. It’s becomes necessary to obtain economic culture media that
promote the growth of fungi and stimulate the production of the polymers
(Stamford et al., 2007).
The present paper aims to investigate chitin and chitosan production using
the Mucoralen fungi Mucor circinelloides (UCP 050), grown by submerse
fermentation in economic culture medium, yam bean (Pachyrhizus erosus L.
Urban), as substrate, and describe the physico-chemical properties of chitosan.
2. Materials and methods
2.1 Microorganisms
Mucor circinelloides UCP 050 (Culture Collection of Catholic University of
Pernambuco, Recife, Brazil) isolated from mangrove sediment from Rio Formoso,
PE, Brazil. The strain was maintained at 4°C on Potato Dextrose Agar (PDA)
slants.
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2.2 Culture medium 74
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M. circinelloides was grown, for chitin and chitosan production, in Yam
Bean Medium (Pachyrhizus erosus L. Urban)- basic chemical composition [total
protein (8.72g), starch (40.9g) and glucose (11.14g) per liter of distilled water, pH
7.0]. Tuberous roots of yam bean were provided by the Department of Agronomy
at Federal Rural University of Pernambuco (Northeast Brazil). The tuberous roots
surface were washed with water and soap, for withdrawal of impurities. The Yam
Bean Medium was prepared from tuberous roots peeled, rounded sliced (±1,5cm)
and boiled in distilled water in the ratio of 1:2 (w/v) for 45 minutes (after initiate the
boil). The broth was cooled, filtered in filter of paper and autoclaved at 121,5°C, 15
minutes (Stamford et al., 2007).
2.3 Growth profile
The spores of M. circinelloides were harvested from cultures grown for
seven days at 28ºC on Petri dishes containing PDA medium. A suspension was
prepared and adjusted to 108 spores /mL, using a hematocytometer for counting. For
fungal submerse cultivation, 10mL spores suspension (108 spores/mL) was
inoculated in Erlenmeyers flasks of 1000mL containg 290mL of culture medium,
and the flasks were incubated at 28ºC in an orbital shaker at 150 rpm, during 96
hours. The mycelia was harvested, washed twice in destilled and deionoized water
by filtration, utilizing a silkscreen nylon membrane (120 F), and were submitted to
lyophilization process. After lyophilization the biomass was mantained in a vacuum
dissecator until constant weight. During M. circinelloides submerse cultivation in
yam bean medium, aliquots were collected every 24 hours for biomass, pH, glucose
and total nitrogen determination (Stamford et al., 2007).
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2.4 Glucose and nitrogen consumption and pH determination 99
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The glucose consumption was determined by the enzymatic colorimetric
method (Labtest® Kit - Glucose oxidase). A standard curve was made by using a
range of glucose solutions (0.5 to 10.0 g/L). Colorimetric method Labtest® Kit for
protein was utilized for the nitrogen consumption determination, using a
spectrophotometer Spectronic Genesys 2. Changes in pH were measured using a
potentiometer (Digital Pontentiometer Quimis Mod. 400 A). All assays were
performed twice.
2.5 Chitin and Chitosan Extraction
The process of extraction involved deproteination with 2% w/v sodium
hydroxide solution (30:1 v/w, 90ºC, 2 h), separation of alkali-insoluble fraction
(AIF) by centrifugation (4000 rpm, 15 min.), extraction of chitosan from AIF under
reflux (10% v/v acetic acid 40:1 v/w, 60ºC, 6 h), separation of crude chitin by
centrifugation (4000 xg, 15 min.) and precipitation of chitosan from the extract at
pH 9.0, adjusted with a 4 M NaOH solution. Crude chitin and chitosan were washed
on a coarse sintered-glass funnel with distilled water, ethanol and acetone and air-
dried at 20ºC (Franco et al., 2004).
2.6 Chitin and chitosan characterization
2.6.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%)
The degree of deacetylation for microbial chitin and chitosan were
determined using the infrared spectroscopy according to Baxter et al. (1992), using
the absorbance ratio A1655/A3450. Two milligrams sample of fungal chitin and
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chitosan, which had been dried overnight at 60°C under reduced pressure were
thoroughly blended with 100mg of KBr, to produce 0.5mm thick disks. The disks
were dried for 24h at 110°C under reduced pressure. Infrared spectrometer was
recorded with a Bruker 66 Spectrometer, using a 100mg KBr disks for reference.
The intensity of maximum absorption bands were determined by the baseline
method.
2.6.2 Molecular weight
The molecular weights of chitin and chitosan were determined by viscosity,
using the procedure described by Santos et al. (2003). The viscosity of chitosan was
determined using an AVS-350 viscometer (Schott-Geräte), type/capillary: Cannon-
Fenske dinside= 1.01mm, at 25C. After getting the intrinsic viscosity from tables K
and a, were obtained for HAc/NaAc. K = 0.076, a = 0.76. The flow time was
determined in seconds. Using Mark-Houwinks equation the average viscosimetric
molecular weight expressed in g/mol.
2.6.3 Thermal analysis
The Thermogravimetric Analysis (TGA) and the Differential Scanning
Calorimetry (DSC) were carried out using the thermal analysis instrumentation
Shimadzu, model 50WS, and Shimadzu, model DSC-50WS, respectively.
Accurately weighed (10mg) chitosan sample was placed into aluminum cup and
sealed. The experiment consisted of a heating the samples from 0 to 400°C up to a
under continuous flow of dry nitrogen gas (50mL.min-1), at a heating rate of (10°C
min-1).
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2.6.4 X-ray diffraction 149
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The X-ray diffraction patterns were determined using a wide-angle X-ray
SIEMENS D5000 diffractometer and the Ka, Cu radiation, with λ = 1.5406 Aº. The
voltage was 40kV and the intensity 40mA. The 2θ angle was scanned between 3°
and 80°, and the counting time was 1s at each angle (0.02°) (Chatterjee et al., 2005).
2.7 Statistic analysis
The data were analyzed for significance using the Student´s t-test and chi-
square test using STATISTICA program version 6.0 of Statsolt Inc., USA. All
experiments were carried out in triplicate and the results are expressed as mean ±
S.D.
3. Results and discussion
The profile of growth of M. circinellooides (UCP 050) and chitin /chitosan
production using yam bean medium is showed in figure 1 and 2. Biomass
production increase rapidly within 48 h of growth, and reached a higher production
of biomass, statistically significant (p=0.003), in 72 hours of cultivation, with
average dry weight corresponding to 20.7g/L (Figure 1). This result is in agreement
with Stamford et al., (2007) using C. elegans growth in Yam Bean medium, which
reported best yield of biomass (24.3g/L), with 48 hours of cultivation time. Silva et
al. (2006) investigated the effect of NaCl, glucose and sucrose concentration on
C.elegans growth in mucorales medium, reported best yield of 24.4g/L biomass
with 4% of glucose, after 96 hours of growth. The results obtained in the present
study are superior to the reported by Amorim et al. (2006) and Pochanavanich &
Suntornsuk (2002) described highest biomass production, respectively by
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Cuninghalemlla bertholletiae and Aspergillus niger of 9g/L. Synowiecki & Al-
Khatteb (1997) reported maximum yield of biomass by Mucor rouxii grown in yeast
extract and glucose 2% medium, for 48 hours, to the 4g, per liter of medium. On
the other hand, New & Stevens (2004) described best yield of biomass from
Gongronella butleri grown on sweet potato supplied with urea, after 7 days of
cultivation of 40g/Kg. M. circinelloides growth curve for biomass, pH, nitrogen
content and glucose consumption was analyzed in figure 1, demonstrating the
residual glucose and nitrogen were 3.16g/L and 0.01g/L respectively. Similar
results were reported by Andrade et al. (2000) and Franco et al. (2004). Amorim et
al. (2001) suggested that the remaining glucose and nitrogen as due to nitrogenous
compounds like secondary metabolites present at the end of growth of the fungi
metabolism and excess of carbon source in the medium.
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The pH of yam bean medium oscillates between 7 and 4, during the culture
time (Figure 1). The values of pH decreased during the exponential phase, probably,
by pyruvic acid formation, as due to the high glucose and starch concentration in
yam bean medium. Amorim et al. (2006) and Stamford et al. (2007) described
constant values of pH during the “lag” phase and pH decreased during the
exponential phase. That information of higher amount of the yam bean glucose and
starch was previously mentioned by Sarangbin & Watanapokasin (1999), during the
citric acid production. Amorim et al. (2001), Amorim et al. (2006) reported that
during growth of C. elegans and Cunninghamella bertholletiae, respectively, the pH
of the media drops in the first 24h and remained low (between 5 and 3) during the
first 96 h of cultivation, probably because of the interaction between the medium
substrate and the release of ions from the cell.
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Figure 2 shows chitin and chitosan yield extracted, to each 24 hours, from
M.circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium during 96 hours of
cultivation. The best yields of the polysaccharides (mg per gram of dry mycelia
biomass) are obtained with 48 hours of culture for chitosan (64mg/g or 6.4%) and
with 72 hours for chitin (500mg/g or 50%). These results are in agreement with
Stamford et al. (2007), that investigated the production of chitin and chitosan from
C. elegans growth in Yam Bean medium, obtained best yield chitin (440mg/g) and
chitosan (66mg/g) with 72 and 48 hours of cultivation time, respectively. Similar
results were reported by Tan et al. (1996), which studied different Zygomycetes
strains and observed that Cunninghamella echinulata was the best chitosan
producing strain, with a yield of approximately 7.0% of chitosan per mycelia dry
weight. According to Chatterjee et al. (2005) production of chitosan from fungi was
influenced by composition of the growth medium, and obtained highest amount of
chitosan from Mucor rouxii 7%.
Chitosan production stabilize after 48 hours of culture, although, chitin
production increase up to 72 hours of culture, and decrease at 96 hours. The higher
chitosan yields in 48 hours of growth suggest that during initial growth chitin is less
crystalline and thus more susceptible to chitin deacetylase, and the chitosan formed
by this enzime prevails in acid pH (Figure 2). According to Amorim et al. (2005)
optimum pH for chitin deacetylase activity from Zygomycetes is pH 4.5. During M.
circinelloides growth the pH of the yam bean medium drops to 5-4 in the first 48h,
and stabilize around 4 (Figure 1), stowing high metabolic interchange between the
medium substrate uptake and the release of ions from the cells. Amorim et al.
(2001) reported higher yields of chitosan were found within 24 hours of cultivation
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of M. racemosus and C. elegans at pH 3.5, which seems to be also a stimulating
agent for production of this biopolymer.
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The data in the present work are in agreement with Nadarajah et al. (2001),
Pochanavanich & Suntornsuk (2002), Amorim et al. (2006) and Stamford et al.
(2007) that chitosan production by the microorganisms is strongly dependent of the
culture conditions, including cultivation time. Chung et al. (2004) demonstrated that
chitin and chitosan content in the cellular wall of fungi change according to the
species and these polymers usually show higher values in Zygomycetes.
The decline in the amount of extractable chitosan seen in the time-culture
curve may be due to physiological changes in the cell wall of the fungi. Chitosan is
produced in the fungal cell wall by deacetylating its precursor, nascent chitin.
During the exponential phase, the ratio of free chitosan molecules is relatively high,
due to the active growth. Once the culture enters the stationary growth phase, more
of the chitosan is anchored to the cell wall of the Zygomycetes binding to chitin and
other polysaccharides and extraction becomes more difficult (Tan et al., 1996;
Nadarajah et al., 2001; Nwe et al., 2002).
The characterization of chitin and chitosan obtained from M. circinelloides
in yam bean medium by infrared spectra (Figure 3) are similar to those reported in
the literature (Amorim et al., 2001; Andrade et al., 2000; Franco et al., 2005). The
most significant parts of chitin and chitosan spectra are those showing the amide
bands at approximately 1665, 1555 e 1313 cm-1, which could be assigned to the
C=O stretching, the N– H deformation in the CONH plane and the CN bond
stretching plus CH2 wagging. In a similar way, chitin from C. elegans shows bands
in the amide II region, which were 1153, 1378 and 1558 cm-1. The results are in
agreement with Shigemasa et al. (1996). Andrade et al. (2003) and Franco et al.
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(2005) which reported that chitin structure containing two types of amide group and
both form C=O….N-H intermolecular bonds, but one is also an acceptor for the
CH OH group. 2
According to Santos et al. (2003) the deacetylation and the regeneration
process, cause disturbance in the initial crystalline reticulum of chitin, inducing a
reordering of the hydrogen linking of chitosan. This can be observed in the central
band at approximately 3483 cm-1 e 3305 cm-1, in the region of the axial deformation
of OH, which appears overlapping the band of axial deformation of NH indicating
the intermolecular hydrogen linking formation, and at the displacement of the
higher frequency band indicating an increase in the structural order. The data are in
accordance with the reported in literature when comparing both chitin and chitosan
infrared spectra obtained by microbiological methods (Amorim et al., 2001;
Andrade et al., 2000; Pochanavanich & Suntornsuk, 2002; Santos et al., 2003;
Franco et al., 2005).
Deacetylation degree (%DD) is an important parameter associated with the
physical-chemical properties of chitosan, because it’s linked directly to the chitosan
cationic properties (Pochanavanich & Suntornsuk, 2002). In the present study
chitosan from M. circinelloides grown in yam bean medium presents 83% DD.
Amorim et al. (2001), Pochanavanich & Suntornsuk (2002); Chatterjee et al. (2005)
and Franco et al. (2005), reported deacetylation degree of chitosan from fungi
between 80 to 90% DD.
The average viscosimetric molecular weight (MV) of chitosan from M.
circinelloides obtained in the present research is 2.70 104x g/mol, which is
considered relatively low (Pochanavanich & Suntornsuk, 2002). The result is in
agreement with the literature, which reports molar weights ranged between 1,0 x
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to 9,0 x 10 g/mol (Nadarajah et al., 2001; Santos et al., 2003; Chatterjee et al.,
2005). Chitosan with a low molecular weight was reported to reduce the tensile
strength and elongation of the chitosan membrane but to increase its permeability.
Thus, fungal chitosan could have potential medical and agricultural applications
(Pochanavanich & Suntornsuk, 2002).
X-ray diffraction is commonly used to determine the polymorphic forms of a
compound having different crystalline structures for which distinct powered X-ray
diffraction patterns are obtained. These patterns are indicative of different spacing
of the crystal planes, which provide strong evidence for polymorphic differences. In
addition, it provides accurate measurements of crystallinic contents, which greatly
affects physical and biological properties of the polymer (Liu et al., 2004;
Chatterjee et al., 2005; Rinaudo, 2006). Figure 4 shows the powder diffraction
pattern of chitosan from M. circinelloides grown in yam bean medium. Strong
Bragg refractions was observed at an angle 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å). From the above
result it can be concluded that fungi chitosan shows organized reticular structure.
This is consistent with previous results from Chatterjee et al. (2005). In addition,
Francis Suh (2000) reports that chitosan crystallinity is a function of the degree of
deacetylation.
Polymers usually have a strong affinity for water and in the solid state these
macromolecules may have disordered structure which can be easily hydrated (Qin
et al., 2004). As is known the hydration properties of chitosan depend on the
primary and supramolecular structure (Kittur et al., 2002). Figure 5 shows TGA
and DSC curve of microbiological chitosan under N2 atmosphere between 25 -
400ºC. From TGA curve it is observed that chitosan degraded in three stages. The
first degradation stage was explained as the loss of water. The second stage, which
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initiate at 170ºC, was due to the decomposition temperature of this polymer, with
carbonized residue formation, and the third weight loss point was at 335ºC
correspond to the initial of carbonized material consumption. These results are in
agreement with Liu et al. (2004).
From DSC curve it is observed two peaks (figure 5). The first registered
thermal event was a wide endothermic peak between 26 and 182ºC. According to
Kittur et al. (2002), the endotherm peak related to the evaporation of water is
expected to reflect physical and molecular changes during N-deacetilation and
carboxymethylation. The second thermal event registered, related to the polymer
decomposition was an endothermic peak. Similar results were obtained by Santos et
al. 2003. According to Kittur et al. (2002) endothermic effect of fungi chitosan is
associated to the elevated enthalpy, due to the presence of weak intramolecular
hydrogen bond. This event is coherent with the observed in TGA curve and agrees
with Kittur (2002) and Santos et al. (2003) studies. This last author suggest that
there is an inverse relationship between thermal stability and deacetilation degree,
however, no evidences of molecular weight influence in thermal stability were
found.
4. Conclusion
Based on these results, we concluded that mycelium of Mucor circinelloides
is a good source of chitosan production production. Yam bean (Pachyrhizus erosus
L. Urban) showed a great potential as an economic medium and can reach a good
yield of chitosan within two days of submerse culture with chemical properties that
enable it to be used in biotechnological applications. Microbiological chitosan
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extraction and processing can be optimized to improve yield in large-scale
production.
5. Acknowledgements
The work was financed by Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
and Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP).
6. References
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Biomass
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Figure 1. Profile of growth of M. circinelloides UCP 050 in yam bean medium at 28ºC, 150rpm, during 96h of cultivation.
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Chitin Chitosan
Mean±SD
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Time (hour)
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Yie
ld (m
g)
Figure 2. Chitin and chitosan yields (mg/mL) from M. circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium, at 28ªC, 150rpm during 96 h of cultivation.
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 71
Figure 3. Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050. Degree of
acetylation (DD) was determined according to Baxter et al. (1992)
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 72
Figure 4. X-ray Diffraction of chitosan from Mucor circinelloides (UCP 050)
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0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000-4000
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TGA
(ºC)
(mW
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Figure 5.Differential Scanning Calorimetry (DSC) and Thermogravimetric Analysis (TGA) termograms of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050, under continuous flow of dry nitrogen gas (50mL.min-1), at a heating rate of (10°C min-1)
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 74
Segundo artigo
MICROBIOLOGICAL CHITOSAN POTENTIATES THE
ANTIBACTERIAL ACTIVITY AGAINST FOOD AND SPOILAGE
BACTERIA
Trabalho submetido para publicação ao periódico indexado
FOOD CONTROL
Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________ 75
Microbiological chitosan potentiates the antibacterial activity against food and
spoilage bacteria
Ana Elizabeth Cavalcante Faia2, Thayza Christina Montenegro Stamfordb,c, ,
Marta Cristina de Freitas da Silvac,d, Galba Maria de Campos-Takakic,e Tânia
Lúcia Montenegro Stamfordf
a Pos-graduate student in the Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil;
b Nucleus of Health Research, Integrated College of Patos, Patos, Brazil;
c Nucleus of Research in Environmental Science, University Catholic of Pernambuco, Recife, Brazil;
d Pos-graduate student in the Department of Fungi Biology, Federal University of Pernambuco, Recife-PE, Brazil
e Department of Biology, University Catholic of Pernambuco, Recife-PE, Brazil
f Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Recife, Brazil.
Abstract
Chitosan was extracted from M. circinelloides biomass by alkali-acid treatment and
was compared with chitosan from crabs (Sigma®). The chemical characterization was
done by infrared spectroscopy (Deacetilation degree) and viscosity (Molecular
weight). Effectiveness of chitosan isolated from Mucor circinelloides UCP 050 in
inhibiting the growth of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Escherichia coli and Yersinia
enterocolitica was evaluated. Chitosan from crabs was used to comparison. The
antibacterial activity was carried determining the minimum inhibitory and bactericidal
concentration by Heilman test. The polysaccharides showed degree of deacetilation
and viscosimetric molecular weight respectively of 83% and 2.70 104 g/mol for x 2 Corresponding author E-mail adress: bethfai@yahoo. (A.E.C. FAI)
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microbiological chitosan, and 80% and 7.59 104x g/mol for chitosan from crabs. Both
chitosan had identical minimum inhibitory concentration for all bacteria assayed.
Neither concentration of both chitosan showed bactericide effect against Salmonella
enterica strain. Microbiological chitosan showed lower minimum bactericide
concentration against Pseudomonas aeruginosa than crustacean chitosan, which was
2,5mg/mL and 5,0mg/mL, respectively.
Keywords: chitosan; foodborne pathogen; antibacterial property; food preservative.
1. Introduction
Among the desirable qualities that should be associated with foods is freedom
from spoiling and pathogenic microorganisms. However, foodborne disease continues
to be a common and serious threat to public health all over the world (Samuel et al.,
2007).
Recently, the ban of chemical additives by some consumers has driven
researches for food preservatives of natural origin since chemical additives are still
indispensable, considering food preservation techniques disposable nowadays
(Devlieghere, Vermeiren & Debevere, 2004a; Devlieghere, Vermeiren & Debevere,
2004b).
In this context, considerable attention has been paid to chitosan, a cationic
amino polysaccharide, essentially composed of β-1,4 D-glucosamine (GlcNAc) linked
to N-acetyl-D-glucosamine residues (Amorim, Ledingham, Fukushima & Campos-
Takaki, 2005; Andrade, Neto, Fukushima & Campos-Takaki, 2003). This
polysaccharide is naturally present in the cell wall of certain fungi, and can also be
obtained by chitin deacetylation from exoskeleton of crustacean, insects and
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arthropods (Amorim, Pedrosa, Kazutaka, Martínez, Ledingham & Campos-Takaki
2006; Campos- Takaki, 2005; Silva, Stamford, Franco & Campos-Takaki 2006)
The use of biomass from fungi has demonstrated great advantages, such as:
independence of seasonal factor, wide scale production, simultaneous extraction of
chitin and chitosan, extraction process is simple and cheap resulting in reduction in
time and cost required for production, and also absence of proteins contamination,
mainly the proteins that could cause allergy reactions in individuals with shellfish
allergies (Silva, Barros Neto, Stamford & Campos-Takaki, 2007; Stamford, Stamford,
Stamford, Neto & Campos-Takaki, 2007).
Due to the unique polycation nature and biodegradable characteristic, chitosan
and its derivates have been proposed for various applications in biomedicine (Martino,
Sittinger & Risbud, 2005), pharmaceutics, biotechnology (Costa Silva, Santos &
Ferreira, 2006) nanotechnology (Murugadoss & Chattopadhyay, 2008) and food
science (Liu, Zhang & Xia, 2008; Shahidi, Arachchi & Jeon, 1999). Chitosan hold a
great economic value as due to its peculiar properties, such as: biodegradability,
biocompatibility, bioactivity, selective permeability, polieletrolic action, chelation, ion
exchange properties, antitumor and antimicrobial activity and adsorption capacity
(Chung et al., 2004; Santos, Soares, Dockal, Campana Filho & Cavalheiro, 2003;
Yadav & Bhise, 2004).
In food technology chitosan is readily seen due to its several functional
properties and can be used as biodegradable films (Meng, Li, Liu & Tian, 2008),
recovery of waste material from industrial processing discards, enzymes
immobilization (Kumar,2000), antioxidant (Kamil, Jeon & Shahidi, 2002; Kanatt,
Chander & Sharma 2004; Shahidi, Kamil, Jeon & Kim, 2002), emulsifying (Li et al.,
2007), fruit juice clarification compounds (Chatterjee, Adhya & Guah, 2005),
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antibacterial and antifungal agent (Quin, Li, Xiao, Liu, Zhu & Du, 2006; No, Meyers,
Prinyawiwatkul & Xu, 2007).
Chitosan from crustacean has been shown antimicrobial activity against
Staphylococcus aureus, Escherichia coli (Li et al., 2007; Zheng & Zhu, 2003),
Salmonella typhimurium, S. faecalis (Chung et al., 2004), S. entérica, S. paratyphi,
Pseudomonas aeruginosa (Yadav & Bhise, 2004), Listeria monocytogenes (Coma,
Martial-Gros, Garreau, Copinet, Salin & Deschamps, 2002), Bacillus. cereus, Shigella
dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Fusarium, Alternaria, Helminthosporium (Costa
Silva et al, 2006), Sacharomyces cerevisiae, S. ludwigii, Zygosaccharomyces baillii,
Cryptococcus albidus, Candida sp., Rhodotorula sp. (Rhoades & Roller, 2000; Sagoo,
Board & Roller, 2002).
The broad spectrum of antimicrobial activity and low toxicity towards
mammalian cells make chitosan a potential source of food preservative of natural
origin (Helander, Nurmiaho-Lassila, Ahvenainen, Rhoades & Roller, 2001; Li et al.,
2007; Shahidi et al, 1999; Rhoades & Roller, 2000; Roller & Covill, 1999).
Chitosan is not yet accepted as a food additive in South America, but it is
employed in food manufacture in countries such as Japan, the United States, and
Germany (Rodríguez, Centurión & Agulló, 2002; Rodríguez & Agulló, 2003; Roller &
Covill, 1999). It has been approved as a food additive in Korea and Japan since 1995
and 1983, respectively (No et al, 2007).
In the United States, upon receiving the US FDeA approval for GRAS status,
chitosan as a food additive and its applications in food systems will certainly be in
more demand in the near future (Sagoo et al, 2002).
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The aim of this study was to investigate the antimicrobial activity, in vitro, of
chitosan from Mucor circinelloides UCP 050 against six foodborne pathogens and
spoilage bacteria and compare with commercial chitosan from crab (Sigma®).
2. Materials and Methods
2.1 Bacterial strains and culture conditions
Listeria monocytogenes ATCC 7664, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,
Salmonella entérica ATCC 6017 and Yersinia enterocolítica ATCC 9610 for
antimicrobial assay were provided by FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil.
Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Escherichia coli ATCC 8739 were donated
by Antibiotics Institute, UFPE (Recife, Brazil). Stock cultures were kept on Muller
Hinton agar slants added of blood (5% v/v) at 4 ºC. Inocula used in the experimental
assays were obtained from overnight cultures grown (18 h) in Brain Heat Infusion
broth (DIFCO Laboratories, Detroit, MI, USA) at 37 °C. After incubation the bacteria
cells were separated from the growth medium by centrifugation at 10.000 xg for 15
minutes at 4°C, washed three times in buffer KCl (0.05M KCl, 1mM KH PO2 4, 1Mm
CaCl , 0.1mMMgCl2 2, pH 6.0), and resuspended in buffer KCl. Suspensions were
adjusted so that the optical density (OD) at 660nm was 1.5 which provided a bacterial
inoculum of approximately 5 x 108 Colony Forming Unity/mL (CFU/mL).
2.2 Chitosan preparation
Chitosan obtained from biomass of Mucor circinelloides UCP 050 grown in
yam bean medium according to procedure described by Stamford et al (2007) was used
in this study. Chitosan solutions at concentration ranging from 10.0 to 0.025 mg/mL
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prepared in acetic acid 1% (v/v), according to Shigemasa & Minami (1996), were
assayed in pH 5.8, which were adjusted using HCl and NaOH.
2.3 Chitosan from M. circinelloides Extraction
The process of extraction involved deproteination with 2% w/v sodium
hydroxide solution (30:1 v/w, 90ºC, 2 h), separation of alkali-insoluble fraction (AIF)
by centrifugation (4000 rpm, 15 min.), extraction of chitosan from AIF under reflux
(10% v/v acetic acid 40:1 v/w, 60ºC, 6 h), separation of crude chitin by centrifugation
(4000 xg, 15 min.) and precipitation of chitosan from the extract at pH 9.0, adjusted
with a 4 M NaOH solution. Crude chitin and chitosan were washed on a coarse
sintered-glass funnel with distilled water, ethanol and acetone and air-dried at 20ºC
(Stamford et al, 2007)
2.4 Chitin and chitosan characterization
2.4.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%)
The degree of deacetylation for microbial chitin and chitosan were determined
using the infrared spectroscopy according to Roberts (1992), using the absorbance
ratio A1655/A3450 and calculated according to the following equation:
A (%) = (A1655/A3450) x 100 / 1.33
Two milligrams sample of fungal chitin and chitosan, which had been dried
overnight at 60°C under reduced pressure were thoroughly blended with 100mg of
KBr, to produce 0.5mm thick disks. The disks were dried for 24h at 110°C under
reduced pressure. Infrared spectrometer was recorded with a Bruker 66 Spectrometer,
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using a 100mg KBr disks for reference. The intensity of maximum absorption bands
were determined by the baseline method.
2.4.2 Molecular weight
The molecular weights of chitin and chitosan were determined by viscosity,
using the procedure described by Santos et al (2003). The viscosity of chitosan was
determined using an AVS-350 viscometer (Schott-Geräte), type/capillary: Cannon-
Fenske dinside= 1.01mm, at 25C. After getting the intrinsic viscosity from tables K and
a, were obtained for HAc/NaAc. K = 0.076, a = 0.76. The flow time was determined in
seconds. Using Mark-Houwinks equation the average viscosimetric molecular weight
expressed in g/mol.
2.5 Antimicrobial activity
Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal
concentration (MBC) of chitosan on the assayed bacteria was carried out using broth
macrodilution method (Heilman test) as described by Chambrevil & Marmonier
(1987). For this a 0.1 mL aliquot of bacterial inoculum was inoculated to screw-capped
13 x 130 mm sterile tubes containing 0.9 mL of BHI broth containing the wished
chitosan concentration (10 to 0.3125 mg/mL) followed for shaking using Vortex for
30s. The system was incubated at 37 ° C for 24 hours and the MIC was defined as the
lowest chitosan concentration providing no visible growth (turbidity) and the MBC
was the lowest chitosan concentration able to cause a 99.9 % killing rate of the initial
inoculum. MBC was found by inoculating a 25 µL aliquot of the chitosan treated assay
in sterile Muller Hinton agar Petri dishes added of blood (5% v/v) and followed by
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incubation at 37 oC for 48 h. For positive control chitosan was replaced by sterile
distilled water and acetic acid 1 %. The assays were made in triplicate and the results
expressed as average values. Also, the viability of the bacterial strains was assessed by
verifying their capacity to grow in Muller-Hinton agar without adding chitosan.
3. Results and discussion
In this study was reported for the first time the antibacterial activity of chitosan
from Mucor circinelloides UCP 050 towards foodborne pathogens and spoilage
bacteria and compared with commercial chitosan from crabs (Sigma®).
In the present research, chitosan was produced and extracted from biomass of
Mucor circinelloides, and was characterized to determinate the degree of deacetilation
(DD) and molecular weight; for comparison chitosan from crabs was used. Infrared
spectra of fungi and crustacean chitosan are shown in figures 1 and 2, respectively.
Chitosan from M. circinelloides and crabs (Sigma®) present 83% DD and 80% DD,
respectively. Papers report deacetylation degree of chitosan from fungi between 80 to
90% DD (Amorim et al, 2005; Silva et al, 2006; Silva et al, 2007; Stamford, Stamford,
Stamford, Neto & Campos-Takaki, 2007). Deacetylation degree (%DD) is an
important parameter associated with the physical-chemical properties of chitosan,
because it’s linked directly to the chitosan cationic properties (Pochanavanich &
Suntornsuk, 2002).
The average viscosimetric molecular weight (MW) of chitosan obtained in the
present research are 2.70x104 and 7.59x104g/mol, for chitosan from M. circinelloides
and crabs, respectively. The results are in agreement with the literature which reports
molar weights between 1.0 x 104 to 9.0 x 105 g/mol (Nadarajah, Kader, Mohd & Paul,
2001; Pochanavanich & Suntornsuk, 2002; Santos et al, 2003; Stamford et al, 2007).
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The effectiveness of chitosan from M. circinelloides and crabs to inhibit the
growth of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella enterica, Escherichia coli and Yersinia enterocolitica by determining the
minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration, was
showed in table 1 and 2.
As demonstrated in table 1 and 2, fungi and crustacean chitosan showed
identical minimum inhibitory concentration for all bacteria assayed, and identical
minimum bactericidal concentration for Listeria monocytogenes,Staphylococcus
aureus, and Yersinia enterocolitica. These results are in agreement with those reported
by Avadi et al. (2004) and Kanatt, Chander and Sharma (2008 a, b). The antimicrobial
activity of chitosan is well documented against a number of food spoilage and
pathogenic microorganisms with MIC varying from 0.01% to 1% (Kanatt et al, 2008 b;
Sagoo et al, 2002). However, it is important to stand out that comparing MIC values of
different chitosan studies is difficult, because of possible differences in chemical and
structural properties of the chitosan used in these studies, experimental circumstances,
chitosan solvent, MIC definition, genera, species, strains and even the same strains
under different environmental conditions. (Devlieghere, Vermeiren & Debevere, 2004;
Tikhonov et al., 2006).
Regarding to the minimum bactericidal concentration, towards Pseudomonas
aeruginosa, microbiological chitosan showed lower MBC value than crustacean
chitosan, which was 2,5mg/mL and 5,0mg/mL, respectively. Neither concentrations, of
both chitosan, showed bactericide effect against Salmonella enterica.
The antibacterial activity of chitosan in vitro depends on the
physicochemical characteristics of chitosan and the specie, or even the strain of
bacteria tested (Tsai & Hwang, 2004). In addition, Chung et al., 2004 demonstrated
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that although cell wall hydrophilicity is similar among Gram-negative bacteria, the
distribution of negative charge on their cell surfaces can be quite different. More
negatively charged cell surfaces have a greater interaction with chitosan. This could
explain why the susceptibility of Salmonella enterica to chitosan in this study, was
different from the others Gram-negative bacteria tested.
Chitosan exhibited antibacterial activity only in an acidic medium, which was
usually attributed to the poor solubility of chitosan above pH 6.5 and more positively
charged polycation with stronger affinity for cells (Quin et al, 2006). Hence, for the
antimicrobial activity chitosan was dispersed in a solution of acetic acid 1%. Since
acetic acid itself has antibacterial activity, a positive control, where chitosan was
replaced by sterile distilled water and acetic acid 1 %, was used for each
microorganism to assure that the antimicrobial activity evidenced is attributed to
chitosan. Microbial growth was observed in all positive control. Also, the viability of
the bacterial strains was confirmed by verifying their growth in Muller-Hinton agar
without adding chitosan.
The exact mechanism of the antimicrobial action of chitosan is still unknown,
but different mechanisms have been proposed, considering its chemical and structural
properties (No et al, 2007).
As a polymeric macromolecule, chitosan cannot directly access to the
intracellular parts of the cells. A key feature of chitosan antimicrobial activity is its
positive charge of the amino group at C-2 below its pKa (pH 6.3). This creates a
polycationic structure which can be expected to interact with anionic components of
cell surface (Liu, Du, Yang & Zhu, 2004). The inhibitory activity of chitosan towards
Gram-negative bacteria has been reported to be due to the interaction of its
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polycationic molecules with the predominant anionic components of the Gram-
negative surface, resulting in changes in its permeability (Kanatt et al, 2008a).
Interaction of diffused hydrolysis products with microbial DNA, which leads to
the inhibition of the mRNA and protein synthesis and the chelation of metals and spore
elements have also been suggested for the antimicrobial action of chitosan (Chen, Wu,
Long & Liu, 2006). In addition, chitosan can bind on the cell surface to form a film
around the cells, so the transport of nutrient into cells is disturbed. This mechanism has
been postulated to be the main antibacterial action of chitosan on Gram-positive
bacteria (Helander et al, 2001).
According to Muzzarelli (1999) autolysing enzymes, which normally control
bacteria division, become lethal substances when cationic compounds are present; thus
it is possible that a similar mechanism is promoted by the strongly cationic chitosan.
On the other hand, it has been reported that the hydrolytic susceptibility of chitosan to
a wide range of enzymes derived from various bacterial, fungal and plant sources is
significant. So there is a possibility that when the concentration of chitosan is
insufficiently high to inhibit growth of bacteria, chitosan could be being hydrolyzed by
some enzymes in the bacteria and used as a kind of energy (Li et al, 2007; Steinbüchel
& Rhee, 2005).
The antimicrobial activity of chitosan has been pointed out as one of its most
interesting properties of chitosan to food industry, since food preservation is a
continuous fight against microorganisms spoiling the food or making it unsafe
(Devlieghere et al, 2004). The successful application of any novel antimicrobial agent
in food preservation depends on a number of factors. The antagonistic action of
chitosan is often directed against a select group of organisms and can vary
considerably between species and strains. As with traditional preservatives, target
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organisms may develop resistance or tolerance to the new antimicrobial agent upon
prolonged exposure. Adequate control of microbial growth in foods using chitosan
would require extensive additional knowledge of the factors that determine chitosan
performance (Roller & Covill, 1999).
Hence, more research on the surface charges and residues of foodborne bacteria
and how they interact to chitosan in vitro and in food matrices are essential to
subsidize the potential of chitosan in the creation of better quality foods.
4. Conclusion
The results obtained in this study demonstrate the antibacterial potential of
chitosan, from fungi and crab shell, against foodborne pathogens and spoilage bacteria.
More research is required to evaluate chitosan’s antimicrobial effectiveness in
combination with other interfering substances in food materials. Evaluations on
sensory quality and economic feasibility also should be carried out. This in turn can
provide a focus for effective use of chitosan as a novel food preservative.
5. Acknowledgements
The work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico (CNPq), Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) and
Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP).
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4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
Tran
smita
nc (%
)
Wavenumber cm-1
Figure 1- Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP050.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,45
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
Tran
smita
nc (%
)
Wavenumber (cm-1)
Figure 2- Infrared spectra of chitosan from crabs (Sigma®).
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Table 1- Minimum inhibitory concentration (mg.mL-1) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria
-1Minimum inhibitory concentration (mg.mL ) Bacteria Chitosan
Fungi Crustacean Listeria monocytogenes 1.250 1.250 Staphylococcus aureus 1.250 1.250 Pseudomonas aeruginosa 0.625 0.625 Escherichia coli 1.250 1.250 Salmonella enterica 1.250 1.250 Yersinia enterocolitica 1.250 1.250
-1Table 2- Minimum bactericidal concentration (mg.mL ) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria
Minimum bactericidal concentration (mg.mL-1) Bacteria Chitosan
Fungi Crustacean Listeria monocytogenes 2.500 2.500 Staphylococcus aureus 5.000 5.000 Pseudomonas aeruginosa 2.500 5.000 Escherichia coli 5.000 5.000
a aSalmonella enterica NBE NBEYersinia enterocolitica 5.000 5.000 a NBE: no bactericide effect
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Conclusões PRIMEIRO ARTIGO
A massa micelial de Mucor circinelloides UCP 050 pode ser considerada uma fonte alternativa para obtenção de quitina e quitosana;
O meio de jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban) demonstrou grande
potencial como um meio de cultura econômico para a produção de quitina e quitosana;
As propiedades físico-químicas da quitosana produzida por M. circinelloides
em meio jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban) as tornam adequada para diversas aplicações biotecnológicas;
A produção e extração de quitina e quitosana microbiana podem ser otimizadas
para obtenção destes biopolímeros em larga escala. SEGUNDO ARTIGO
Os resultados obtidos demonstram a eficácia antibacteriana da quitosana microbiana e de caranguejo, frente a bactérias patógenas/deteriorantes em alimentos;
A atividade antimicrobiana da quitosana sugere sua potencialidade como um
agente conservante de alimentos de origem natural, visando a redução de aditivos químicos;
Mais estudos são necessários para avaliar a efetiva ação antimicrobiana de
diferentes tipos de quitosana in vitro e em sistema alimentícios reais;
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Anexos
QUITOSANA: UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS
Ana Elizabeth Cavalcante Fai1*; Thayza Christina Montenegro Stamford2; Tânia Lúcia Montenegro Stamford1.
1 Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco Av. Professor Moraes Rego 1235 – Cidade Universitária – 50670901. Recife, PE.
2 Coordenação de Pesquisa e Extensão, Faculdades Integradas de Patos Rua Horácio Nóbrega, s/n- Belo Horizonte-58704-000 Patos, PB
*Correo electrónico: [email protected]
RESUMEN
La exigencia por alimentos seguros, con una vida útil prolongada y de alta cualidad nutritiva y sensorial es creciente. Los consumidores y los propios órganos de salud pública están especialmente preocupados con los efectos decurrentes del uso de varios adictivos químicos en productos alimenticios y su relación con la salud. Ese escenario tiene incentivado las pesquisas de nuevos agentes naturales que puedan ser empleados de forma a complementar los métodos de preservación de alimentos que se disponen actualmente. Destaca-se entre estos el quitosano, polisacárido compuesto por unidades repetitivas de β (1-4)-D-glicosamina, encontrada en la naturaleza en la pared celular de algunos hongos, y que todavía puede ser obtenida por la deacetilación de la quitina presente en lo exoesqueleto de crustáceos, insectos y artrópodos. El quitosano presenta características peculiares derivadas de su capacidad de formación de complexos polielectrolíticos, con propiedades de biodegradación, biocompatibilidad y bioactividad. En la industria alimenticia este polímero ofrece un amplio espectro de posibles aplicaciones, destacando-se como agente antimicrobiano, antioxidante y como embalaje activamente funcional. El presente trabajo aborda aspectos que caracterizan el quitosano por su potencial como conservante natural y perfil atóxico como una prominente opción para obtener alimentos con bajos niveles de adictivos químicos.
Palabras claves: adictivos químicos, quitosana, preservación de alimentos.
Introdução
As mudanças nos padrões nutricionais e os benefícios creditados a uma alimentação
saudável dinamizaram intensamente todos os setores responsáveis pela produção de alimentos
levando à busca por alternativas de transformação, conservação e alteração química destes
produtos.
Redação: Rua das Gardênias, 36 (Mirandópolis) - 04047-010 - São Paulo,SP Fone (11) 5589-5732 - Fax (11) 5583-1016 - E-mail: [email protected]
DECLARAÇÃO Declaro, para os fins e efeitos de direito, que o trabalho intitulado ASPECTOS LEGAIS DO USO DE ADITIVOS QUÍMICOS EM ALIMENTOS, de autoria de Ana Elizabeth Cavalcante Fai, Amanda de Morais Oliveira, Emmanuela Prado de Paiva, Daniela de Souza Soares, Teresa Cristina Caheté Mitchell e Tânia Lúcia Montenegro Stamford foi aprovado para publicação na Revista Higiene Alimentar.
São Paulo, 19 de julho de 2007
Sílvia Panetta Nascimento Coordenadora Científica
ASPECTOS LEGAIS DO USO DE ADITIVOS QUÍMICOS EM ALIMENTOS
Ana Elizabeth Cavalcante Fai Amanda de Morais Oliveira Emmanuela Prado de Paiva
Daniela de Souza Soares Teresa Cristina Caheté Mitchell
Tânia Lúcia Montenegro Stamford _______________________________________________________________
Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco, Recife. [email protected]
Resumo Os produtos industrializados ocupam uma parcela cada vez maior do mercado de alimentos haja vista, principalmente, a mudança dos hábitos alimentares nos últimos anos. Sem o uso de aditivos químicos, a variedade destes alimentos disponíveis e seu tempo de vida em manter-se em condições de consumo seriam muito reduzidos. Contudo, o uso de aditivos é um tema controverso, com alegações de que estes são tóxicos e que podem desencadear reações adversas nos consumidores. Entretanto, todos os aditivos permitidos no Brasil são considerados seguros, de acordo com as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária se utilizados nas quantidades estabelecidas pela mesma. Não obstante ao cumprimento das recomendações da legislação, ressalta-se que a indústria de alimentos deve estar sempre atenta às constantes investigações e descobertas nesta área, de forma a fornecer ao mercado alimentos sempre seguros. Este trabalho teve o intuito de abordar os aspectos legais vigentes no Brasil quanto à regulamentação do uso de aditivos químicos em alimentos. Palavras chave: aditivos alimentares, legislação, classificação. Summary Day by day, industrialized products occupy a larger portion in the food market, especially due to the alimentary habits change in the last years. Without the use of chemical addictive, foods variety and shelf-life would be much reduced. On the other hand, the use of addictive is a controversial subject, with allegations that they are toxic and might cause adverse reactions in consumers. However, all the addictive allowed in Brazil are considered safe, according to the National Agency of Sanitary Surveillance norms if they are used in the established amounts. In spite of following legislation recommendations food industry should be attempts to the constants investigations and discoveries in this area, in order to always provide safe foods. This work has as objective approaching the effective legal regulation aspects of food chemical addictive in Brazil. Keywords: food addictive, legislation, classification. Introdução
II-02-C
GROWTH AND PRODUCTION OF CHITIN AND CHITOSAN BY Mucor circinelloides UCP 050
USING YAM BEAN MEDIUM A.E.C. FAI1; A.S. ASSIS1; T.C.M.STAMFORD2,3; G.M.CAMPOS-TAKAKI3 ; T.L.M.STAMFORD4
1 Univ. Fed. Pernambuco, Recife-PE,Brasil 2 Faculdade Integrada de Patos-PB 58700-300 Brasil E-mail: [email protected] NPCAMB, Univ. Católica 50050-590, Recife-PE, Brasil. E-mail: [email protected] Univ. Fed. Rural PE, 50050-590,Brasil E-mail: [email protected] Chitin is an linear β1,4- linked homopolymer of N-acetyl-D-glucosamine, and chitosan is essentially composed of β-1,4 D-glucosamine (GlcNAc) residues [1]. Commercially, chitin and chitosan were obtained from exoskeletons of crustaceans, but chitosan is a product derived from de-N-acetylating of chitin [2,3]. Recent advances in fermentation technologies suggest that the cultivation of selected fungi can provide an alternative source of chitin and chitosan [1,4,5]. The present paper aims to investigate the chitin and chitosan production by Mucor circinelloides (UCP 050), grown on submerse fermentation using yam bean (Pachyrhizus erosus L. Urban) medium. A suspension of 108 spores/mL of M. circinelloides was inoculated in Erlenmeyers flasks containing 50 mL of yam bean medium, incubated at 28ºC, 150 rpm, during 96 hours[2]. Aliquots were collected each 24 hours, and biomass, pH, glucose and total nitrogen were determined. The mycelia was harvested, washed in deionizer water, and submitted to lyophilization process. The glucose and the nitrogen consumption were evaluated by spectrophometer method, and the changes of pH were measured [2]. The process of extraction of chitin and chitosan involved deproteinization with sodium hydroxide solution, and extraction of chitosan by acetic acid [4]. The degree of deacetilation for chitin and chitosan were determined by infrared spectroscopy, and the molecular weights were determined by viscosity [3]. The data were analyzed by the Students t-test and chi-square test, using the Statistic program, version 6.0 of Stat soft Inc., USA. All experiments were carried out in triplicate and the results are expressed as mean ± S.D. M. circinelloides growth curve for biomass, pH, nitrogen content and glucose consumption was analyzed (Fig.1). Biomass production increase rapidly within 48 h of growth, and reached the maximum dry weight (20.7g/L) at 96 h. The pH of the culture medium was 7 to 4, during the time of cultivation. These results are in agreement with the literature [3,4].
02468
1012141618
0 24 48 72 96
Time (h)
Biom
ass
(g/L
) Glu
cose
(g
/L)
012345678910
Nitr
ogen
(g/L
) pH
biomass glucose nitrogen pH
Fig. 1- Profile of growth of M. circinelloides UCP 050 in yam bean medium at 280C, 150rpm,
during 96h of cultivation. M. circinelloides grown in yam beam showed the best yields of chitosan (64mg/g), and chitin (500mg/g) with 48 and 72 hours, respectively (Fig.2), and similar results are obtained by Stamford et al. [2] using C. elegans.
Chitin Chitosan
Mean±SD 10 20 30 40 50 60 70 80 90 A 110
Time (hour)
0
100
200
300
400
500
600
Yie
ld (m
g)
Fig.2. Chitin and chitosan yields (mg/mL) from M.
circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium, at 28ªC, 150rpm during 96 h of
cultivation. In the present study chitin and chitosan from M. circinelloides grown in yam bean medium present 22% DD and 83% DD, and molecular weight (MV) of 3.09 x 104g/mol and 2.7 x 104g/mol, respectively. ACKNOWLEDGEMENT The authors are thankful to CNPq, CAPES, and UNICAP. REFERENCES 1. Campos-Takaki GM. In: Chitin and chitosan opportunities
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2. Stamford TCM, Stamford TLM, Stamford NP, Neto BB, Campos-Takaki GM. Elect. J. Biotechn., 10(1), (2007) on-line: http://www.ejbiotechnology.info/..
3. Santos JE, Soares JP, Dockal ER, Filho SC, Cavalheiro ETG. Polím.: Ciência e Tecnologia, 13(4), (2003), 242
4. Franco LO., Stamford TCM, Stamford NP, Campos-Takaki GM. Rev. Analyt., 3(10), (2005), 40.
5. Freitas Silva MC, Stamford TCM, Franco LO, Campos-Takaki GM. Asian Chitin J. 2 (2006), 29
IV SIAQ (NATAL, BRASIL 2007)__________________________________________