Download - Aim of Study - Method Finished
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
1/41
2. TUJUAN PENELITIAN
2.1.1 Untuk Menyelidiki Apakah Ada Perbedaan Tingkatapoptosis pada Tikus Rawan Aborsi dibandingkan dengan
Hewan yang Hamil Normal
Berdasarkan bukti bahwa aborsi murine ditandai dengan produksi sitokin tipe-
!ang ber"ebihan #$egmann dkk% &&'(. )aghupath!% &&*+ dan berkurangn!a
tingkat sitokin Th2 #. ,haouat dkk% &&+% dan dengan mempertimbangkan
bahwa TN-/ ada"ah sebuah induktor apoptosis penting #0upta% 2112+% tuuanpene"itian kami ada"ah untuk men!e"idiki apakah aborsi didahu"ui o"eh
peningkatan "au apoptosis. Untuk me"akukan pene"itian ini% kami mengana"isis
akti3itas en4im kun5i dari kematian se" terprogram% !aitu 5aspase-'% !ang
akti3asin!a mewaki" poin no return da"am induksi apoptosis. 6ami uga
mempe"aari 5iri-5iri penting !ang "ain dari kematian se" terprogram seperti
7ragmentasi 8NA. 9e"ain itu% beberapa mo"eku" anti dan pro-apoptosis !ang
ter"ibat da"am a"ur se" kematian ter"ihat pada antarmuka 7eto-materna" dan
dihitung untuk mempe"aari partisipasi se" tersebut berkaitan dengan kegaga"an
suatu kehami"an.
8engan demikian% pada tikus rawan aborsi !ang dibandingkan dengan kontro"
!ang hami" norma" kami mengana"isa:
. !emampuan "el !ekebalan yang #iisolasi dari desidua
untuk Menghasilkan "itokin Th1 atau Th2 setelah PMA$
onomy%in
Perubahan "oka" pada keseimbangan sitokin tipe Th;Th2 teradi se"ama
kehami"an da"am rahim ibu dan pada unit 7eto-p"asenta. Perubahan proamasi #TN-/ !aitu% IN-?%
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
2/41
IL-@+ !ang ber"ebihan sangat berkore"asi dengan awa" timbu"n!a aborsi
#$egmann dkk% &&'(.. ,"ark dkk% &&&( ,haouat dkk% 211'.% en5"ussen dkk.%
211'a+. 9e"ain itu% sitokin Th2 di"aporkan bersi7at protekti7 #Lin dkk% &&'(.
)aghupath!% &&*% &&&%. 8ea"tr! dkk% 2111+ Akibatn!a%: rasio Th:Th2 berperan
penting da"am menentukan hasi" kehami"an. 6ami mengukur sekresi sitokin Th
dan Th2 #misa"n!a TN- / dan IL-1+ o"eh se"-se" imun desidua dari tikus rawan
aborsi !ang hami" dan tikus !ang hami" norma" dengan menggunakan sitometri.
a" ini di"akukan untuk mengkon
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
3/41
Proses apoptosis berperan penting da"am perkembangan sistem kekeba"an tubuh
#Cp7erman dan 6orsme!er% 211'( 0reen% 211'+. Deskipun apoptosis berperan
da"am perkembangan garis keturunan se"% ke"ainan pada se" imun uga bisa
merugikan% karena bisa berimp"ikasi bagi timbu"n!a suatu kondisi seperti
de
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
4/41
terprogram ditandai dengan perubahan tertentu pada permukaan se" dan
mor7o"ogi nuk"ir #engartner% 2111+. Perubahan mor7o"ogi Nuk"ir merubah
karakteristik apoptosis !ang mun5u" di da"am se" bersama-sama dengan
teradin!a peristiwa biokimia !ang khas: pembe"ahan 8NA nuk"ir !ang dimediasi
o"eh endonuk"ease% sehingga membentuk 7ragmen 8NA da"am ukuran
o"igonu5"eosoma" #=1-211 bp+. 8NA !ang sudah ter7ragmentasi dapat dideteksi
dengan prosedur TUNEL (terminal deoxynuclotidyltransferase-mediated UTP end
Laelling). 6ami mengana"isis 7ragmentasi 8NA pada aringan p"asenta dari tikus
aborsi dan tikus !ang hami" norma" dengan menggunakan metode ini sebagai
indikator apoptosis tambahan.
-. Molekul Pro dan anti'apoptosis di dalam aringan
Plasenta dan #esidua
8a"am pene"itian ini kami memutuskan untuk men!e"idiki peran mo"eku" anti dan
pro-apoptosis% dan da"am ana"isis kami tidak ada keadian apoptosis !ang
signi
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
5/41
I I.2. Untuk Menyelidiki Apakah Sifat Anti-Apoptosis
HO-1 Ikut Berperan di dalam Efek rotektifnya Selama
!ehamilan
9P-'2% uga dikena" sebagai heme oF!genase- #C-+ menginduksi permu"aan
pada beberapa rangsangan stres berikut% antara "ain seperti "ipopo"isakarida
#,amhi dkk.% &&+% radiasi u"tra3io"et #6e!se dkk.% &=&+% hidrogen peroksida%
"ogam berat dan bahan kimia organik #6e!se dkk.% &=&+. 8iketahui uga bahwa
ekspresi ber"ebihan C- ter"ibat da"am ke"angsungan hidup antung Fenogra7t
#9oares dkk% &&=(.. Arauo dkk% 211'+. C- dan C-2 di-down-regulate di
antarmuka 7eto-materna" pada tikus rawan aborsi% bi"a dibandingkan dengan
tikus !ang hami" norma" #en5"ussen dkk.% 211a+% ha" ini uga teradi pada
pasien !ang menderita aborsi spontan se"ama trimester pertama ika
dibandingkan dengan wanita hami" norma" !ang usian!a sesuai #en5"ussen
dkk.% 211'b+. 9e"ain itu% ekspresi C- !ang ber"ebihan o"eh ineksi koba"t-
protopor
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
6/41
'. BAAN PENELITIAN
.1. 3ahan !imia4 Media4 and Perlengkapan.
AE,% '-amino-&-eth!"5arba4o" 8A6C ,!tomation% 0"ostrup% 8enmark
Amp"i-TaH 8NA po"!merase Eurogente5% Ber"in% Jerman
AnneFin IT, 5onugated 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman
aHua ad inie5tabi"ia Braun% De"sungen% Jerman
Bo3ine serum a"bumin #B9A+ 9igma ,hemie 0mb% 9teinheim%
Jerman
,aspase-' 5o"orimetri5 assa! 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
7/41
,h"oro7orm 9igma% 9teinheim% Jerman
8iamino ben4idine #8AB+ e5tor Laboratories% Peterborough%
Inggris
8NAse 9tratagene% Amsterdam% Be"anda
dNTPs% desoF!nu5"eotidtriphosphate Amersham Bios5ien5es% reiburg%
Jerman
8TT% %-8ithio-8L-threito" LU6A Bio5hemika% 9igma% 9ee"4e%
Jerman
Ethano" abso"ute "uka% 9igma% 9ee"4e% Jerman
Eth!"enediaminetetraa5eti5 a5id #E8TA+ 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman
B9% 7eta" bo3ine serum Bio5hrom A0% Ber"in% Jerman
L!mpho"!te-D Linaris% Bettingen am Dain% Jerman
ankKs Ba"an5e 9a"t 9o"ution #B99+ 0ib5o% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman
ematoFi"in )oth% 6ar"sruhe% Jerman
isto-6it )oth% 6ar"sruhe% Jerman
2C2 '1 Der5k% 8armstadt% Jerman
)P orseradish peroFidase 8A6C% 0"ostrup% 8enemark
!n "itu ,e"" 8eath 8ete5tion 6it% PC8 )o5he% Dannheim% Jerman
Ionom!5in 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman
L-0"utamine 0ib5o% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman
Dethano" Baker% 8e3enter% o""and
2-Der5aptoethano" 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman
Donensin 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman
Na," Der5k% 8armstadt% Jerman
C"igo dth!midine-nu5"eotide #odT+ Amersham Bios5ien5es% reiburg%
Jerman
Para7orma"deh!de #PA+ Der5k% 8armstadt% Jerman
Peni5i""in;9treptom!5in 0ib5o% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman
Phorbo"-2%'-m!stirate #PDA+ 9igma% 9teinheim% Jerman
)ainbow marker New Eng"ands% BioLabs% rank7urt am
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
8/41
Dain% Jerman
)e3erse Trans5riptase Amersham Bios5ien5es% reiburg%
Jerman
)NAse-Inhibitor ProtegM% Dannheim% Jerman
)PDI @1 w L-0"ue 0ibson% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman
9aponin )iede"-de aen% 9ee"4e% Jerman
9odium a4ide #NaN'+ Der5k% 8armstadt% Jerman
9odium h!drogen 5arbonate #Na,C'+ Der5k% 8armstadt% Jerman
9odium p!ru3ate 9igma% Tau7enkir5hen% Jerman
Triphosphate buered sa"ine #TB9+ 8ULBE,,CK9% PAA Laboratories 0mb
Tri4o" In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman
Tr!psin;E8TAGB99 0ib5o% In3itrogen% 6ar"sruhe% Jerman
O!"o" Da""in5krodt Baker% 8e3enter% Be"anda
.2. Antibodi )Abs*
• Sitometri Arus
"semua anti#odi A#s anti-tikus monoklonal$
,8-IT, #L'T+ 5"one: 2&.& B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman
,8=a-,! #L!-2+ 5"one: '-@* B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman
TN-a-PE 5"one: DP@-OT22 B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman
IL-1-PE 5"one: JE9-@E' B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman
• Imunohistokimia dan Blot Barat
Antibodi PRMR
• Anti#odi !elin%i Anti-&ikus
Bag- #,-@+ 9anta ,ru4 Biote5hno"og!%
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
9/41
eide"berg% Jerman
B5"-2 #N-&+ 9anta ,ru4 Biote5hno"og!%eide"berg%
Jerman
B5"-F9 #L-&+ B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman
• Anti#odi !am#in' Anti-&Ikus
,aspase-' p #6-&+ B8 Pharmingen% eide"berg% erman
Antibodi pada b5"-F9 #L-&+ dan 5aspase-' p #6-&+ untuk pewarnaan pada
be"ahan para
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
10/41
mg;m" B9A
,itrate buer #1 mD+ 8ari 1. D ,@=C* F 2C% 1.D,@C*Na' F 2
Larutan "taining ,oomassie 1 a5eti5 a5id% 21 ethano"%)21,oomassie in d2C
Larutan de-"taining ,oomassie 1 a5eti5 a5id% 21 ethano" in d2C
Larutan 8AB m" d2C% 2 tetes "arutan u#er % tetes"arutan 8AB dan 2 tetes "arutan 2C2
Ana"isis 9istem E,L )eagen # m"+% reagen 2 # m"+
Ethano" & % * with d2C
Buer sitometri arus B9A% 1. NaN' da"am PB9
B9)PDI medium B9 1 di )PDI @1 #B9 tidak akti7 sebe"um digunakan pada suhu @, dibak mandi se"ama '1 menit+.
air peroFid 2C2 ' pada methano"
Larutan )P #kotak+ m" TB9 #p *%@+ G tetes )eag. Adan tetes)eag. B se5ara bersamaan
Buer "isis #akti
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
11/41
989-running buer #$B+ 1.12 D Tris p =.'% 1.&2 D g"!5erine(1. 989 d2C to L
TB9% "arutan Tris 3u5er saline )H0* p *.% 11 mD Tris base%1.& Na,"
TB9 #$B+ 11 mD T)I9 p *.% 1.& Na,"% d2Cup to
L
F Trans7er buer #$B+ . g Tris p =.'% *2 g g"!5ine% d2Cup to L
FTrans7er buer #$B+ 211 m" F Trans7er buer 21 methano" #211 m"+ d2C up toL
Larutan Pen5u5i #$B+ 1% Tween% susu bubuk di PB9
(.). eralatan la#oratorium* Bahan dan pro'ram +
eralatan la#oratorium
ABI Prism**11 9eHuen5e 8ete5tion9!stem
Perkin E"mer App"! Bios!stems
Ba"an5e L, @211 8 9artorius% 0oettingen% 0erman!
Bath T!p 9$ 21 Ju"abo 0mb% 9ee"ba5h% erman
,entri7uge )otiFa;)P etti5h% Tutt"ingen% Jerman
,r!ostate D 11 CD% Di5ron 0mb% $a""dor7% Jerman
A,9-,a"ibur Be5ton 8i5kinson% 9an Jose% A9
9arung tangan bebas bubuk 6imber"!-,"ark ,oorporation%
a3entem% Be"gia
omogenisator U"tra TurraF T= I6A Laborte5hnik% 9tau7en% erman
inkubator eraeus% anau% Jerman
Laminar >ow% steri" eraeus% anau% Jerman
Dikroskop ,aha!a eiss AFiophot% Jena% Jerman
Daster5!5"er persona" Eppendor7% amburg% Jerman
DiomaF D) Imaging
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
12/41
$estern b"ot 5hambers Bio)ad% Duni5h% Jerman
3AHAN 6 3AHAN
tabung Eppendor7 % m" Eppendor7% amburg% erman
tabung a"5on ;1 m" a"5on% Be5ton 8i5kinson Labware%rank"in Lakes% A9
pipet Trans7er '% m" 9arstedt% NQrmbre5ht% Jerman
termos T* dan T2 B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman
11 Rm net B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman
Pipet 111;211;1 R" B8 Pharmingen% eide"berg% Jerman
s"ides;5o3er s"ides Den4e" 0"asbearbeitungswerk 0mb%
Brauns5hweig% erman
PR78RAM P0
Program 9e" Suest Be5ton 8i5kinson% 9an Jose% A9ImageSuantTL Amersham
Paket statistik untuk I"mu 9osia" - 9P99 -% ersi .
(.,. eraatan Hean.
Pene"itian ini disahkan o"eh kementerian Jerman dan di"aksanakan sesuai dengan
pedoman institusiona" #La0et9i% Ber"in% Jerman )eg.11*1;1'+ serta Panduan
untuk Perawatan dan Penggunaan ewan Pertanian da"am Pene"itian Pertanian
dan Pengaaran% Amerika 9erikat. Tikus antan 8BA;2J dan tikus betina ,BA ; J
dibe"i dari ,har"es )i3er% Jerman% sementara tikus antan BALB;5 dipero"eh dari
Bg% Jerman. ewan-hewan !ang dipe"ihara di 7asi"itas arrier hewan dari Pusat
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
13/41
Pene"itian Biomedis dari ,harite% 6ampus ir5how 6"inikum% Dedi5a" Uni3ersit! o7
Ber"in% dengan sik"us terang; ge"ap se"ama 2 am% air dan makanan ad liitum&
. Detode Pene"itian
9.1 Perkawinan Murine 03A$ : #3A$2 dan #esain
ksperimental
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
14/41
9eperti !ang dikemukakan o"eh ,"ark #&=1+% kombinasi ,BA;J F BALB;5 mewaki"i
ke"ompok kehami"an norma" #1 aborsi% kontro"+% sedangkan kombinasi ,BA;J F
8BA;2J memper"ihatkan keguguran spontan% dengan tingkat aborsi antara dan
'1 #,"ark &=1( ,haouat &==( en5"ussen 2112a% b% 211'a% 211+. Tikus
betina ,BA;J berumur 2 bu"an dipasangkan dengan tikus BALB ; 5 atau 8BA;2J
antan berumur '- bu"an. 8i setiap kandang% dua sampai tiga betina
ditempatkan dengan satu peantan.
Beberapa pene"itian mengemukakan adan!a peningkatan "e3e" sitokin Th pada
tikus rawan aborsi dibandingkan dengan kombinasi kontro" ,BA;J F BALB;5 #Lin
dkk% &&'(... 6rishnan dkk% &&@a% en5"ussen dkk% 211'a+. 8a"am kar!a i"miah
ini% tuuan kami ada"ah untuk mengana"isis apakah mungkin apoptosis
menentukan teradin!a keguguran% o"eh karena itu hewan-hewan dibagi da"am
ke"ompok berikut:
. 6e"ompok kehami"an norma" ,BA;J F BALB;5 #kontro"% n +
2. 6e"ompok kombinasi rawan aborsi ,BA J F 8BA;2J #n +
Pen!e"idikan baru-baru ini mengungkapkan bahwa up-regulation en4im C-
o"eh ap"ikasi 5oba"tumprotoporph!rin #,o-PP% )osenberg% &&'+ #en5"ussen dkk%
211(.. 9o""wede" dkk% 211+ atau dengan trans7er gen adeno3ira" #en5"ussen et
a" 211@. + bisa men5egah 7eti dari peno"akan% sehingga meningkatkan hasi"
kehami"an pada tikus aborsi rawan. 8a"am kar!a i"miah ini% kami men!e"idiki
apakah e7ek per"indungan C- da"am men5egah peno"akan anin dapat
dikaitkan dengan si7at-si7at anti-apoptosisn!a. Untuk mengui hipotesis kami% C-
di-up-regulate dan di-down-regulate dengan men!untikkan tikus rawan aborsi
se5ara intraperitonea" #ip+ masing-masing dengan ,o-PP dosis tungga" atau seng-
protopor
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
15/41
. 6e"ompok ,BA ; J F 8BA;2J G 1 mg ; kg n-PP i.p. #n +
Tikus betina diperiksa dua ka"i #puku" = pagi dan puku" = ma"am+ untuk
pemeriksaan pen!umbatan 3agina. Pada hari di mana terdeteksi pen!umbatan
3agina% maka dianggap sebagai 1 hari kehami"an. 6emudian% betina dipisahkan
dari peantan. Pada hari ke- kehami"an% tikus betina dikorbankan dengan
menggunakan 5ara dis"okasi "eher. 6ami te"ah memi"ih titik waktu ini karena
p"asenta sudah benar-benar terbentuk saat anin masih akan terus berkembang.
Uteri tersebut sudah di"en!apkan dan tempat imp"antasi uga didokumentasikan.
Tingkat aborsi dihitung sebagai um"ah aborsi per um"ah imp"antasi untuk setiap
hewan. Jum"ah imp"antasi harus se"a"u sebanding antar ke"ompok. Pada gambar
berikut uteri dari non-hami" #0br. = A+% kehami"an hami" #0br. = B+ dan 8BA;2J
rawan aborsi dikawinkan dengan ,BA ; J betina #0br. = ,+. Lebih deti"n!a%
0ambar. = 8 menggambarkan perkembangan !ang berbeda antara anin dari
tikus sete"ah hari kehami"an dan anin !ang menga"ami resorpsi dari titik
waktu !ang sama% !ang ditandai o"eh penampi"an nekrotik dan ukurann!a !ang
ke5i".
A
U&EUS /O/-HAMI0
B
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
16/41
!ehamilan normal 03A$ : 3A+3$%
0
Aborsi 03A$ : #3A$2
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
17/41
0ambar. = gambar I"ustrasi !ang menunukkan uteri dari betina non hami" ,BA;J #A+% daribetina ,BA;J !ang menga"ami kehami"an sukses #B+ dan dari 8BA;2J !ang kawin denganbetina ,BA;J% #,+ menunukkan resorpsi. 8i 8% anin berumur hari #besertap"asentan!a+ dibandingkan dengan resorpsi% di mana anin dan p"asenta tidak dapatdibedakan. )esorpsi aringan ditandai dengan penampi"an nekrotik dan perdarahan.Pandangan umum #E+ aringan desidua ibu #a+% resorpsi #b+% dan anin sehat denganp"asentan!a #5+.
9ampe" resorpsi sudah tidak dipakai da"am pene"itian ini% karena protein dan
iso"asi )NA seringka"i tidak berhasi" karena adan!a tingkat kerusakan aringan.
9e"ain itu% sebagaimana !ang ter"ihat pada gambar. & B% da"am sampe" histo"ogi
beberapa enis se" p"asenta #!aitu spongiotro7ob"ast dan se" "ab!rinthi5+
menghi"ang.
0ambar. & 0ambaran umum p"asenta sehat #A+ atau resorpsi aringan #B+
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
18/41
9.2. Pengambilan "ampel
Pada hari kehami"an ke-% betina ,BA;J !ang sebe"umn!a dikawinkan dengan
antan BALB;, atau 8BA;2J% dikorbankan dengan 5ara dis"okasi "eher%
p"asentan!a diekstrak dan di5u5i da"am PB9. 9ampe" untuk )NA atau iso"asi
protein diepit dan dibekukan da"am nitrogen 5air dan disimpan pada -=1,
sampai saatn!a digunakan% sedangkan sampe" !ang akan diana"isis sitometri
arusn!a ditempatkan di da"am di tabung !ang berisi m" medium )PDI dan
di"etakkan di atas es. P"asenta untuk I, atau TUNEL assa! akan tetap disimpan
di da"am a"koho" &@ se"ama 2 am pada suhu ,. 6eesokan harin!a sampe"
didehidrasi da"am etano" dingin 11 se"ama sampai 2 am pada suhu ,dengan tota" perubahan% kemudian dimasukkan ke da"am F!"o" dingin se"ama
-2 am pada suhu , dengan tota" 2 perubahan. Untuk "angkah terakhir%
sampe" di5e"upkan di F!"o" dan kiri di )T se"ama -2 am dengan tota"
perubahan #9aint Darie% &@2+. P"asenta kemudian ditempe"kan da"am para
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
19/41
9ete"ah kuanti
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
20/41
9.=. isolasi E-io limfosit dari 3arin'an limpa
9e" "impa diiso"asi da"am +-well plate !ang mengandung m" )PDI dengan
menghan5urkan organ pada 11 Rm net. Jum"ah tota" se" !ang teriso"asi #@ m"+
dikumpu"kan da"am a"5on 1 m"% kemudian buer "isis O ditambahkan hingga
1 m" dan diinkubasi se"ama 1 menit pada )T untuk agar teradi "isis eritrosit.
9e"-se" tersebut disentri7ugasi pada 11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit%
kemudian pe"et di-resuspend da"am m" )PDI !ang mengandung 1 B9 dan
disentri7ugasi "agi pada 11 rpm dengan suhu , se"ama 1 menit. Terakhir%
sp"eno5!tes di-resuspend da"am m" )PDI G 1 B9 dan di"etakkan diatas es
sampai saat digunakan.
9.>. "itometri Arus
9.>.1. Prinsip "itometri Arus
Desin .ytometers /low (/.) atau uorescence-activated cell sorting (/.")
#A,9+ !ang dikembangkan pada tahun &@1 #an 8i""a dkk.% &@&+ sebagai
instrumen ana"itis !ang menawarkan tekno"ogi 5anggih untuk karakterisasi !ang
5epat atau memisahkan se" berdasarkan
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
21/41
menggambarkan popu"asi se" darah !ang terdeteksi #0br. 1 A+ dan% seka"i
di"oka"isasi% maka akan teraga keamanann!a. an!a se" "im7osit"ah !ang
dipertimbangkan untuk diana"isis.
1amar& 23 "inyal T0e "". (side scatter) dan /". (forward scatter) yang di0asil%an darisel-sel dara0 (/"."".-otplot)& "". diseut seagai granularity selular4 misalnya seldara0 granulosit dengan inti penyimpangan yang memili%i "". yang 5au0 lei0 intensdaripada limfosit atau eritrosit yang lei0 tida% teratur& /". er%aitan dengan u%uranatau sinyal volume sel& ,al ini 5uga ditentu%an ole0 fa%tor-fa%tor lain seperti inde%s iasdari parti%el4 ole0 %arena itu4 parti%el yang esar a%an mene%u% lei0 ringan dari yang%ecil& i $ pemagian populasi selular di%ait%an dengan persentase& (imodi6%asi dari
tesis 7 "tefan /est itu)&
,!tometers di"engkapi dengan sirkuit e"ektronik% !aitu aringan kompensasi !ang
mengukur intensitas sin!a" dari sin!a" photodetektor "ainn!a. 9eperti
digambarkan da"am gamabr #A dan B+% kompensasi memungkinkan
pengkoreksian tumpang tindih antara spektrum >uoresensi dari >uoro5hromes
!ang berbeda. 8a"am pene"itian kami% kompensasi tersebut se"a"u di"akukan
sebe"um dimu"ain!a pengukuran.
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
22/41
0ambar. 6ompensasi #kanan+ memungkinkan koreksi pen!eberangan spektrum
>uoresensi dari >uoro5hromes !ang berbeda #kiri+.
9.>.2. Analisis #ata
8ata , diana"isis dengan menggunakan Program Suest !our untuk tiga
parameter% seperti ,!-% PE-dan antibodi IT, !ang terkonugasi terhadap satu
sama "ain. 9ete"ah pengukuran kontro" negati7% ende"a !ang "ebih rendah #gate+
di sisi kiri di5iptakan setidakn!a dengan &&%& dari se"uruh popu"asi se" !ang
tidak diwarnai. 6ontro" negati7 atau pewarnaan kontro" isotipe merupakan
perwaki"an dari pewarnaan !ang benar% karena tidak adan!a auto->uoresensi
atau pengikatan !ang tidak spesi.. "timulasi Produksi sitokin dan Pemblokiran 8olgi
Limpa !ang teriso"asi atau "im7osit desidua di"etakkan di atas es% masing-masing
da"am m" )PDI G 1 B9% dan kemudian di-resuspend kemba"i% dipindahkan
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
23/41
ke +-well plate #% F 1@ se" ; m"+ dan dirangsang menggunakan m" medium
)PDI dan 1 B9 dengan 1 ng;m" PDA dan Rg;m" ionom!5in da"am
inkubator !ang di"embabkan pada suhu '*, dengan ,C2 . 9ete"ah satu am
pertama% 2 RD monensin ditambahkan di tiap sumur hingga tingkat medium
guna memb"okir 0o"gi agar menghentikan transportasi intrase"u"er% dan inkubasi
di"anutkan se"ama ' am "agi.
9.>.9. Pewarnaan dengan Antibodi kstraseluler
9ete"ah inkubasi% re-suspensi se" 2 m" dibagi ke tabung-tabung A,9 dan di5u5i
dengan menambahkan buer ,. 6emudian% se"-se" disentri7ugasi pada 11
rpm se"ama 1 menit pada suhu ,% supernatan dibuang dan pe"et diresuspend
da"am 11 Y" buer , !ang mengandung antibodi ekstrase"u"er !ang sudah
dien5erkan (282334 .9-/!T.-dan .:-cy-;-laelled)& 9e"-se" kemudian diinkubasi
se"ama 1 menit pada suhu , tanpa pen5aha!aan.
9.>.;. &iksasi
9ete"ah inkubasi% se"-se" di5u5i dengan menambahkan buer ,% kemudian
disentri7ugasi pada 11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit% supernatan
dibuang dan pe"et tersebut di-resuspend da"am PA 11 Y" . 9e"-se" tersebut
diinkubasi CN pada suhu ,% untuk memungkinkan teradin!a .=. Permeabil i/ation dan Pewarnaan ntraseluler
6eesokan harin!a% se" di5u5i dengan buer ,% kemudian disentri7ugasi pada
11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit% dan supernatan kemudian
dihi"angkan. Pe"et di-resuspend da"am 11 m" "arutan !ang mengandung antibodi
intrase"u"er #anti-TN- / ber"abe" PE or anti-IL-1-PE+% keduan!a dien5erkan
:211 di da"am saponin 1%. 9e"-se" kemudian diinkubasi se"ama 21 menit pada
suhu , tanpa pen5aha!aan. 9ete"ah inkubasi% se"-se" di5u5i dengan saponin
1%% disentri7ugasi pada 11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit. 9upernatan
dibuang dan pe"et tersebut di-resuspend da"am 11 Y" da"am buer , untuk
diba5a da"am sebuah /."-caliur . 6ontro" negati7 masing-masing dirawat
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
24/41
dengan menggunakan kontro" isotipe dan se" !ang tidak berwarna. Tabe" 2
merangkum skema pewarnaan tersebut.
&a#un' 4A+S 1 2 (
5enis Sampel !ontrol anti anti
4I&+ 6 +7) +7)
E 6 &/48 I0-19
+y, 6 +7: +7:
Tabe" 2 9kema pipetting untuk pewarnaan "im7osit desidua. 9atu tabung se" dapatdiwarnai se5ara bersamaan dengan tiga antibodi >uoro5hrome. Untuk setiap sampe"% se"-se" !ang tidak diwarnai !ang mewaki"i kontro" negati7 diukur di setiap kasus.
9.?.1. Prinsip
9ebuah keadian !ang menandai awa" kematian se" terprogram ada"ah hi"angn!a
asimetris 7os7o"ipid membran% dengan trans"okasi phosphatid!"serine #P9+ dari
"ea>et inti dari "apisan ganda 7os7o"ipid ke permukaan se" #engarter% 2111+.
Pen5aha!aan P9 memberikan 5ara sederhana untuk mendeteksi se" !ang
menga"ami apoptosis. AnneFin- #' 68a+% anggota ke"uarga AnneFin ka"sium
dari 7os7o"ipid pengikat protein !ang tergantung pada ka"sium% memi"iki a
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
25/41
0ambar. 2 9kema representasi dari ssay < nnexin. 0ambar di atas menampi"kanin3ersi phosphatid!"serine #P9+ sete"ah induksi apoptosis% dan se"anutn!a mengikatAnneFin--IT, ke permukaan se" di dengan konsentrasi ka"sium !ang dideuores5ein #-AnneFin-IT,+
bersama dengan Propidium !odide #PI+. 9eperti !ang sudah die"askan di atas%
pada tahap awa" kematian se" terprogram% P9 diarahkan pada membran se"% dan
AnneFin- mengikatn!a% tergantung kas"ium !ang diberikan. PI dapat mudah
bergerak me"intasi membran p"asma !ang mengikat 8NA% sehingga mewarnai
se" apoptosis akhir% !ang se" membrann!a sudah permeabe" atau mati. C"eh
karena itu% penguian ini memungkinkan pendeteksian apoptosis serta
di7erensiasi antara se"-se" apoptosis awa" #AnneFin- G+ dan se" apoptosis akhir
#AnneFin- G ; PI G+ dari se" !ang dapat hidup #AnneFin- G ; PI G+ ataupun
nekrotik #PI G+ se" #0br. '+.
http://www.bdbiosciences.com/http://www.bdbiosciences.com/
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
26/41
0ambar. ' Perwaki"an p"ot dot IT,-anneFin-;PI sitometri arus dua parameter. 8i da"amgambar% sangat mungkin untuk mendeteksi dan membedakan se" apoptosis awa"#AnneFin- G+ dan se" apoptosis akhir #AnneFin- G ; PI G+ dari se" 3iab"e #anneFin--;P-+atau se" nekrotik #PI G+ se".
9.? . Prosedur ksperimental
Tingkat Ex-vivo apoptosis awa" dan akhir da"am "im7osit desidua dan "impa dari
tikus norma" atau rawan aborsi diana"isis dengan mendeteksi se" AnneFin--IT,
!ang terkonugasi dan se" positi7 PI dengan menggunakan sitometri. 9ete"ah
iso"asi% "impa dan se" desidua dikumpu"kan dan ditempatkan ke da"am tabung%
kemudian di5u5i dengan menambahkan m" PB9 dingin. 9e"-se" tersebut
kemudian disentri7ugasi pada 11 rpm pada suhu , se"ama 1 menit%supernatan dibuang dan pe"et di re-suspend da"am 11 Y" O u#er inding
!ang mengandung 2 Y" ;sampe" AnneFin--IT, serta 2 Y" ; sampe" PI. 6emudian
diinkubasi se"ama menit tanpa 5aha!a pada )T. 9ete"ah inkubasi% se"-se"
di5u5i dengan PB9 m" dingin% kemudian disentri7ugasi 11 rpm pada suhu ,
se"ama 1 menit dan supernatan dibuang. Pe"et itu di-resuspend da"am 11 Y"
;tabung buer binding O dan se" diana"isis dengan sitometri arus da"am waktu
am. 6ontro" negati7 untuk setiap sampe" dirawat dengan menghi"angkan
AnneFin--IT, !ang terkonugasi atau PI.
9.?.9. Analisis #ata
Ana"isis data di"akukan dengan menggunakan Program 0ell uest untuk
parameter IT,-AnneFin !ang terkonugasi dan propidium iodida. 9ete"ah
pengukuran kontro" negati7% ende"a !ang "ebih rendah #gerbang+ di sisi kiri
dibuat dengan setidakn!a && dari popu"asi se"uruh se" !ang tidak diwarnai.
Popu"asi se" dide
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
27/41
9.B. Apoptosis pada PlasentaC Pengukuran AktiDtas 0aspase'
9.B.1. Prinsip dan Pengu@ian
Protein e7ektor% 5aspase-'% ada"ah 5aspase !ang pa"ing ban!ak dite"iti dari
semua 5aspases mama"ia !ang ada. En4im ini dapat memproses 5aspases 2% @% *dan & dan se5ara khusus membe"ah ban!ak protein kun5i% sehingga
men!ebabkan induksi apoptosis. 9e"ain itu% 5aspase-' memainkan peran sentra"
da"am memediasi apoptosis nuk"ir% termasuk kondensasi kromatin dan
7ragmentasi 8NA serta b"ebb"ing #engartner% 2111+. Ui 5aspase-' ko"orimetri
didasarkan pada hidro"isis substrat peptida asetil-sp-sp-
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
28/41
Homo'ena
t lasenta
+aspase-(
,m'6m
assay
#u=er 1
inhi#itor
+aspase-(
A%7EM
+aspase-(
su#strate
A%7EM
ea'ent
#lank
- - ?9 >l - 19 >l
Homo'ena
t lasenta
, >l - :, >l - 19 >l
Homo'ena
t lasenta@ Inhi#itor
, >l - , >l 19 >l 19 >l
!ontrol
ositif
+aspase-(
- , >l :, >l - 19 >l
!ontrol
ositif
+aspase-(
@ Inhi#itor
- , >l , >l 19 >l 19 >l
&a#le (. eaksi skema pipettin' untuk ? ell plate
9.B.2.2. +angka'langkah Per%obaan
9ebe"um memu"ai per5obaan% serangkaian so"usi p-nitroani"in pada kisaran
konsentrasi 1 sampai 211 YD #Tabe" + sudah disiapkan. 9etiap pengen5eran
11 Y" ditambahkan ke sumur *+-well plate. $u#er ssay #11 Y"+ dimasukkan
sebagai kosong. Absorbansi diba5a pada 1 nm menggunakan
spektro7otometer. 9ebuah kur3a ka"ibrasi absorbansi di"akukan dengan memp"ot
ni"ai C81 3ersus konsentrasi p-nitroani"ine per sumur% di mmo"% seperti !ang
ditunukkan pada Tabe"
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
29/41
Tabe" . 9kema konsentrasi standar p-nitroani"ine% dibuat dengan mengen5erkan "arutan
stok p-nitroani"ine pada u#er assay F.
9ete"ah iso"asi% 1 mg homogenat p"asenta # m"+ atau kontro" positi7 5aspase-'
# m"+ dimasukkan ke da"am sumur spesi
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
30/41
dimodiuores5ein%. 0ambar +. 9e"ama teradi reaksi% en4im
terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) mengkata"isis po"imerisasi
nuk"eotida !ang ber"abe" >uores5ein untuk membebaskan uung 8NA beruntai
ganda '[-C% dan merusak kebebasan temp"ate. "uores5ein !ang men!atu
kemudian terkonugasi dengan antibodi anti->uoresein !ang terkonugasi dengan
0orse-radis0-peroxidase (P=+. 9ete"ah reaksi% se" !ang berwarna dapat
diana"isis dengan menggunakan mikroskop 5aha!a.
9.1E.2. +angkah'langkah per%obaan
Pendeteksian kematian se" apoptosis pada tingkat se" tungga" di"akukan dengan
menggunakan !n"itu .ell eat0 etection >it4 P=. Bagian tersebut diobati
dengan 1 mD p@ buer sitrat se"ama menit pada @11 $ di da"am mi5rowa3e
untuk membuka kemungkinan pengikatan !ang tidak spesi
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
31/41
9.1E.. Analisis #ata
Jum"ah TUNEL G se" ; mm \ dari aringan p"asenta die3a"uasi dengan
menggunakan mikroskop 5aha!a dengan scaled-eye piece% pra-ka"ibrasi dengan
mikrometer s"ide menggunakan perbesaran 211 O #21 O ob!ekti7 dan 1 O
oku"er+. Penghitungan tersebut di"akukan tanpa mengetahui hasi" sampe".
9.11. +okalisasi "elular Molekul Pro'dan Anti'apoptosis
pada Antarmuka anin ' bu
9.11.1. Prinsip
Isti"ah imunohistokimia #abbr. I,+ menga5u pada teknik !ang ber"aku
terhadap 5aha!a% serta mikroskopi >uoresensi% !ang menggunakan antibodi
#Abs+ khusus untuk mengidenti
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
32/41
tanpa antibodi primer dengan han!a menambahkan B9A atau serum% ini
merupakan tes penting untuk kenonspesi
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
33/41
dan kemudian di5u5i dengan air keran sampai didapatkan "arutan !ang ernih .
6emudian% be"ahan-be"ahan di5u5i berurutan dengan 5epat dengan a"koho" *%
&% 11 dan dibiarkan 2 F menit di xylol. 9"ide penutup dipasang
menggunakan a"at 'oti ,isto. 9ampe" !ang diobati dengan AE,Gsubstrate-
5hromogen # tetes ; be"ahan% bukan 8AB+% di5u5i seban!ak dua ka"i da"am TB9%
di-counterstain dengan ema"aun% di5u5i dengan air keran dan segera dipasang
dengan media pemasangan AHuateF. 6ontro" negati7 diganti antibodi primern!a
dengan B9A di TB9 atau dengan 5ara menginkubasi antibodi sebe"umn!a
dengan peptida pengha"ang komersia" se"ama dua am.
I .Antibodi
8i"usi
6e"in5i anti tikus
-B5"-2
-B5"-F9
-Bag-
Po"ik"ona"
:11
6ambing Anti Tikus
-5aspase-'
Po"ik"ona"
:11
II. Antibodi
Terbiotini"asi
8i"usi
6ambing Anti Tikus
:211
6e"in5i Anti kambing
:211
&a#el , 8a7tar antibodi primer dan sekunder !ang digunakan da"am pengen5eran.
9.11.. Analisis Mikroskop 0ahaya.
Po"a dan intensitas pewarnaan pada enis se" p"asenta dan sampe" desidua !ang
berbeda die3a"uasi o"eh dua pengamat independen menggunakan mikroskop
5aha!a dengan perbesaran 211 F #21 F ob!ekti7 dan 1 F oku"er+. Tingkat
pewarnaan di setiap enis se" p"asenta% serta di desidua% dianggap "u"us semi-
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
34/41
kuantitati : negati7 #-+% "emah #G+% sedang #G G+% tinggi #G G G+ atau intens #G G
G G+% dan tanda-tanda !ang kemudian diubah menadi ni"ai numerik #1% % 2% '
dan %+ untuk ana"isis semi-kuantitati7 seperti !ang te"ah die"askan sebe"umn!a
#en5"ussen et a".% 211'+.
9.12. "#" Page dan Festern 3lot ) F3*
9.12.1 . Prinsip
Ui B"ot Barat mendeteksi um"ah protein di da"am se" serta pada ekstrak
aringan. Pertama% protein dipisahkan o"eh ukuran mereka dengan menggunakan
989-po"!a5r!"amide ge" e"e5trophoresis #dikena" uga sebagai e"ektro7oresis989-PA0E+. sodium duode5!"su"phate su"7ate #989+% reagen reduktor% meng-
denature protein se5ara kese"uruhan dengan meme5ahkan pengikatan
ko3a"enn!a !ang bertanggung awab atas struktur tersier atau kuaterner. 6etika
protein dipisahkan pada ge"% protein dapat ditrans7er da"am membran
nitrose"u"osa dan kemudian diberi "abe" dengan 5ara menginkubasi dengan
antibodi ber"abe" atau dengan menggunakan antibodi primer dan diikuti o"eh
antibodi sekunder !ang terkonugasi dengan en4im. 6umpu"an dari protein
tersebut bisa di3isua"isasikan% misa"n!a pada
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
35/41
ka"i dengan Tween 1% dan susu di TB9% antibodi sekunder terbiotini"asi
!ang terkonugasi )P dien5erkan :111 da"am susu;TB9 ditambahkan ke
sistem se"ama am pada )T. $and ditemukan o"eh 5hemi"umines5en5e dengan
menggunakan pera"atan komersia" DiomaF D) Imaging
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
36/41
9.1.2. Prinsip Real Time RT'P0R
P,) )ea" Time ada"ah tes !ang sangat sensiti7 dan akurat% dan ini merupakan
teknik baru untuk mengukur akumu"asi produk se5ara Creal timeC se"ama 7ase
eksponensia" dari reaksi P,) !ang menggunakan probe >uorogeni5 dua"-"abe".
Probe ini merupakan o"igonuk"eotida% diberi "abe" dua" !ang pertama ada"ahpewarna 'eporter #misa"n!a AD% @-5arboF!>uores5ein+ !ang me"ekat se5ara
ko3a"en pada uung [ dan !ang kedua ada"ah pewarna Duenc0er #misa"n!a
Tamra% @-5arboF!tetrameth!"rhodamine+ !ang me"ekat se5ara ko3a"en uung '[.
Pewarna Suen5her !ang ter"etak se5ara proksima" men!erap emisi dari pewarna
reporter % se"ama probe masih utuh. 9e"ama 7ase perpanangan reaksi P,)% probe
terhibridisasi dihidro"isis o"eh akti3itas [-nuk"ease dari po"imerase TaH-% !ang
memisahkan uenc0er dari reporter . a" ini men!ebabkan peningkatan emisi
>uoresensi dari pewarna reporter% !ang sebanding dengan um"ah awa" temp"ate
#C3erberg dkk. &&&+. )ea" time )T-P,) mendeteksi produk amp"i
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
37/41
0ambar. = 9kema i"ustrasi prinsip rea" time-P,) #A dan B+ dan ana"isis grauoresensi ini meningkat karena akumu"asi progresi7 daneksponensia" dari >uoro5hromes !ang bebas dari reporter. 9ik"us di mana >uoresensimen5apai ni"ai ambang batas ini disebut ambang sik"us #threshold %y%le 4 ,T 3a"ue+!ang berbanding terba"ik dengan um"ah awa" dari 8NA target. P,) )ea"-time memonitor>uoresensi !ang dipan5arkan se"ama reaksi saat indikator produksi amp"ikon pada setiapsik"us P,)% se5ara rea" time #ni"ai ambang ada"ah tingkat deteksi atau titik di mana reaksimen5apai intensitas neon di atas ba5kground+
9.1.. "intesis %#NA
Untuk sintesis 58NA% sampe" !ang mengandung 2 mg )NA tota" ditempatkan
se"ama 2 menit di atas es dan dNTP 2%mD% 2 U;m" 8NAse I dan 1 U;m"
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
38/41
inhibitor )NA-se di5ampur dan ditambahkan da"am buer reaksi. 9ete"ah
inkubasi se"ama '1 menit pada suhu '*,% 5ampuran tersebut dipanaskan
hingga suhu *, se"ama menit. 211 U;m" reverse transcriptase dan inhibitor
)NA-se sudah disiapkan di da"am air !ang bebeas )NA-se dan diinkubasi pada
suhu 2, se"ama @1 menit % kemudian di"anutkan dengan inkubasi pada suhu
& , se"ama menit. 9ampe" dibiarkan da"am suhu -21 , sampai saat
digunakan.
9.1.9. Prosedur ksperimental
)eaksi Amp"i
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
39/41
pro#e "4AM la#elled$ AA+;;A;;+&;;;A&;++&& ;&;
Ba'-1
forard primer
reerse primer
pro#e "4AM la#elled$
;+&AA+ +A+ +&; +AA;AA&&; AA&
;&&&;+A;A;A; ++& ++; +
&&+&;A+A&++A;+A;;;&&&&+&;;+
B%l-0
forard primer
reerse primer
pro#e "4AM la#elled$
;;&;A;&+;;A&&;+AA;&&;
;&A;A;A&++A+AAAA;&;&+++A;
++&;AA&;A++A++&A;A;++&&;;A&++
Ba
forard primer
reerse primer
pro#e "4AM la#elled$
;+;&;;&&;+++&+&&+&A+&&
A;+A;++;+&+A+;;A;
+AAA+&;;&;+&+AA;;+++&;&;+
&/4-8
forard primer
reerse primer
pro#e "4AM la#elled$
&+;A;&;A+AA;+++;&A;+
+&+A;++A+&++A;+&;+&+
+;&+;&A;+AAA++AA;+;;A
CDa%tin ";enhousekeepin'$
forard primer
reerse primer
pro#e "4AM la#elled$
;+&&+&&&;+A;+&++&&+;&&
;&&;&+;A+;A++A;+;+
+A;++&&++&&+&&;;;&A&;;AA&++
&
9.1.;. Analisa
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
40/41
asi" !ang dipero"eh dari )T-P,) rea" time ada"ah data 5omputer exportale.
Untuk setiap probe p"ot amp"irus%al Gallis
. Pada semua kasus p f1%1( p f1%1( p f1%11 dianggap signi
-
8/19/2019 Aim of Study - Method Finished
41/41
0ambar. & )epresentasi khas gra