Download - A humán genom projekt 2
![Page 1: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/1.jpg)
A humán genom projekt 2. A humán genom projekt 2.
Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária
![Page 2: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/2.jpg)
Kb. 40,000 - 60,000 fehérje kódoló gén (sokkal kevesebb, mint amennyit vártunk)
vagyis a gének a genom kevesebb mint 5%-át foglalják el…..
A “hasznos információ” - hány génünk van?
A “hasznos információ” - hány génünk van?
Hogyan találjuk meg a géneket?
![Page 3: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/3.jpg)
Kiindulási pont: Az agy (és más szövetek) mRNS információtartalma (cDNS)
Gén = az az információ, amely az egyes szövetekben kifejeződik (expresszálódik)
Rövid másolatok (150 -400 bp) PCR reakcióval:
Random primer
Craig Venter
![Page 4: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/4.jpg)
EST = expressed sequence tagEST = expressed sequence tag
Olyan rövid DNS szekvencia részletek, melyek kifejeződnek (az agyban ill. máshol)
EST könyvtár
Az agyban (ill. más szövetekben) kifejeződő gének azonosítására alkalmas
![Page 5: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/5.jpg)
2. Hol van az EST a humán genomban? ‘in silico’ keresés
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool
1. EST -k szekvenálása
2375 agyi EST szekvenálása + BLAST
3. Gének azonosítása, új gének felfedezése
< 400 ismert gén Közel 2000 új gén felfedezése
![Page 6: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/6.jpg)
A gének könyve
Celera, 2001: kb. 30 000 EST kb. 35 000 humán gén
![Page 7: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/7.jpg)
Gének azonosítása ‘in silico’Gének azonosítása ‘in silico’
Mi jellemző a génre:1. Start jel (start kodon)2. Stop jel (stop kodonok) NE LEGYENEK SŰRŰN!3. Exon/intron átmenet: jellemző szekvenciák
Kereső programokpl. ORF (NBCI)
![Page 8: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/8.jpg)
ORF= open reading frame =„Olvasási keret” ORF= open reading frame =„Olvasási keret”
GTGCGTGAGC GTGGCCACCG AGCGCGCCCT GCAGACGCCC
ACCAACTCCT TCATCGTGAG CCTGGCGGCC GCCGACCTCC
TCCTCGCTCT CCTGGTGCTG CCGCTCTTCG TCTACTCCGA
GGTGAGCCGC GTCCGGCCGC ACGAGCATCC TCACCTGCTC
123
654
![Page 9: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/9.jpg)
NCBI ORF finder: „Olvasási keret kereső”
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html
![Page 10: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/10.jpg)
Transzkripciós faktorokTranszkripciós faktorok
1
DNS
kódoló régió5’ nem kódoló régió
promoter
enhancer / silencer szekvenciák
DNS-dep. RNS-pol. II.
Transzkr. F.(FEHÉRJÉK)
TATAGCGT
TATA-box: TATA AAT
AT
GC-box: GGGGCGGGG
GT/CACC-box: GGTGTGGG
TATA
GC
GT
Zn2+
Y
C C F
LH H
...
...
Sp1
![Page 11: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/11.jpg)
DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálat
Gél retardáció Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálat
Gél retardáció Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
![Page 12: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/12.jpg)
EMSA
Szabad DNS darab (jelölt oligo)
*
DNS-fehérje
komplex
*
START
Hagyományoselektroforézis
![Page 13: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/13.jpg)
0 2 4 6 8 perc
Kapilláriselektroforézis
lassabb
EMSA
gyorsabb
Szabad DNS darab (jelölt oligo)
*
DNS-fehérje
komplex
*
![Page 14: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/14.jpg)
Specifikus-e a DNS-fehérje kötődés ?
Kompetíciós (versengési) kísérletek
–CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’
F5’–
„vad típusú próba”
5’–CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’
„specifikus kompetitor”
„nem-specifikus (mutáns) kompetitor”5’–CCCTTGGTGGGTTGGGGGCCTAAGCTGCG–3’3’–GGGAACCACCCAACCCCGGGATTCGACGC–5’
A jelöltoligo
a „próba”
A nem jelöltoligo
a „kompetitor”
![Page 15: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/15.jpg)
1 2 3
EMSA: A specifikus kötődés igazolása
DNS-fehérje
komplex
*
+
Nem spec. komp.
DNS-fehérje
komplex
*
Spec. Komp.
+
DNS-fehérje
komplex
nem látjuk
2
DNS-fehérje
komplex
*
látjuk
3
![Page 16: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/16.jpg)
1 2 3
EMSA: A specifikus kötődés igazolása: supershift
DNS-fehérje
komplex
*
Spec. ellenanyag
+
DNS-fehérje
komplex
*
még lassabb„supershift”
2
DNS-fehérje
komplex
*
+Spec.
ellenanyag + antipeptid
3
DNS-fehérje
komplex
*+
![Page 17: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/17.jpg)
Rekombiáns DNS technológia a gyógyszeriparban
Humán rekombináns fehérjék előállítása gyógyászati célra
Rekombiáns DNS technológia a gyógyszeriparban
Humán rekombináns fehérjék előállítása gyógyászati célra
![Page 18: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/18.jpg)
Rekombináns gyógyszerek Rekombináns gyógyszerek
tPA trombózis
VIII. faktor hemofilia
CSF (colony stimulatong factor) immundeficiencia
eritropoetin anemia
hGF (growth factor) hGF hiány (növekedési rendellenesség)
inzulin diabetes
interleukin immunodeficiencia
VACCINÁK Pl. hepatitis B
FEHÉRJÉK ipari előállítása ?
![Page 19: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/19.jpg)
Humán génexpresszió Prokariótákban Humán génexpresszió Prokariótákban
Expressziós vektorok
A humán gén “háziasítása”
- csak exonok (cDNS)
- bakteriális promoter
- bakteriális riboszóma kötőhely
Az idegen fehérje expressziójának ki/be kapcsolása
ProK DNS lac promoter lac operátor Humán fehérje cDNSRepresszor
fehérje
+IPTGindukció expresszió
![Page 20: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/20.jpg)
Inzulin: Az első engedélyezett rekombináns gyógyszer Inzulin: Az első engedélyezett rekombináns gyógyszer
1. Vektor konstrukció
AmpR
ori
lacZ( gal)
InzulinA vagy B lánc
(inszert)
Mesterséges “ inzulin gén”
Aminósav szekvencia
bázisszekvencia
![Page 21: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/21.jpg)
2. Bakteriális transzformáció, AmpR klónok szelektásása és klónozása
E. coli
Bakteriális kromoszóma
lac represszorAmpR
plazmid
3. Fúziós fehérje termelése IPTG adásra
4. Lízis, fehérje izolálása, tisztítása
6. A és B lánc in vitro egyesítése
gal inzulin
5. CN Br kezelés: Metionin lebomlik, inzulin felszabadul
![Page 22: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/22.jpg)
Met-hiányos hGH bakteriális expressziója Met-hiányos hGH bakteriális expressziója
1. Transzformáció szelekció
növesztés
2. hGH szekréció a periplazmás térbe
3. Bakteriális periplazmás proteáz:levágja a szignál szekvenciát
4. Met-nélküli rec hGH tisztítása
1. Vektor konstrukció
hGHBakteriális
szignál szekvencia(extracelluláris)
AmpR
![Page 23: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/23.jpg)
Riporter rendszerek
Riporter génekRiporter gének
EuKsejt
sejtmag
Virus-vektor-riporter gén konstruktum
Expresszió mérés a riporter fehérje alapján
• luciferáz ATP ADP + Pi + fény • -galaktozidáz Laktóz analóg kék színű termék KÉK SEJTEK• CAT (kloramfenikol acetil transzferáz)
![Page 24: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/24.jpg)
Riporter gének felhasználásapl. Transzkripciós faktorok (TF) tesztelése
riporter12
A vektor B vektor
3
1: enhancer2: promoter3: TF génje
EuKsejt
sejtmagTF
![Page 25: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/25.jpg)
megtermékenyített petesejt
vákum
csipesz
Transzgenikus állatokTranszgenikus állatok
1982: az óriás egér
Növekedési hormon gén injektálása
a hím pronukleuszba
![Page 26: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/26.jpg)
1. Mikroinjektálás (több száz petesejt, mikromanipulátor)2. Beültetés ál-terhes nősténybe3. Az utódok ellenőrzése (PCR a farokból)4. Pároztatás5. Beltenyésztés - Klónozás?
A transzgenikus állatok elkészítése
![Page 27: A humán genom projekt 2](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062222/5681495f550346895db6b2bd/html5/thumbnails/27.jpg)
A t-PA-t tejelő egérA t-PA-t tejelő egér
t-PA + lactalbumin szignál szekvencia szövet specifikus promoter
szekréció a tejbe: 0.1 mg t-PA/ml tej
Jövő: transzgenikus tehén? (JUH, KECSKE)
Molecular Farming
A transzgenikus állatok klónozása
A transzgenikus állatok klónozása