BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein,
Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk
menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino
perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut.
Banyak metode yang dapat dilakukan dalam pemisahan dan identifikasi
asam amino, seperti metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi
dan elektroforesis. Salah satu meteode yang paling banyak digunakan dalam
pemisahan asam-asam amino adalah metode romatografi.
Metode kromatografi merupakan metode pemisahan dua atau lebih
senyawa atau ion berdasarkan pada perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau
ion-ion tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Metode kromatografi bermacam-
macam, dapat digolongkan berdasarkan mekanisme pemisahannya serta alat yang
digunakan. Salah satu jenis kromatograi adalah kromatografi lapis tipis (KLT).
kromatografi jenis ini murah dan mudah dilakukan serta rutin digunakan di
berbagai laboratorium.
Dalam percobaan ini kita akan menentukan nilai Rf asam amino serta
mengidentifikasi asam amino dalam suatu larutan sampel berdasarkan nilai Rf
menggunakan kromatografi lapis tipis, sehingga kita akan lebih memahami
pemisahan dan identifikasi asam amino dengan metode ini. Hal inilah yang
melatarbelakangi sehingga percobaan ini dilakukan.
1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan
1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dilakukannya percobaan ini adalah untuk mengetahui dan
memahami cara pemisahan dan identifikasi asam amino melalui metode
kromatografi lapis tipis.
1.2.1 Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah untuk:
1. Menghitung nilai Rf dari beberapa jenis asam amino dan larutan sampel.
2. Mengidentifikasi asam amino dalam larutan sampel berdasarkan nilai Rf nya.
1.3 Prinsip Percobaan
Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan
menggunakan metode kromatrografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari
campuran n-butanol, asam asetat dan air, dan fase diamnya berupa lapisan tipis
silika gel.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik
menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran
bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun
kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-
asam amino tersebut (Poedjiadi, 2005).
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri,
kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. salah satu metode
yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-
macam kromatografi ialah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan
kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 2005).
Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan fisik, dimana
komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salah
satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas,
yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut sepanjang landasan stasioner
(Day dan Underwood, 2002).
Fase stasioner dapat berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase
bergerak dapat berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zat-
zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, dan tentu saja laju
pemisahan terlatak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang
berbeda (Day dan Underwood, 2002).
Zat terlarut di dalam suatu fasa gerak mengalir pada suatu fasa diam. Zat
terlarut yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak yang lebih besar akan tertahan
lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa
gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan demikian
senyawa-senyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat perbedaan
migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam (Anonim, 2008).
Penggolongan kromatografi dapat didasarkan atas mekanisme
pemisahannya serta alat yang digunakan. Berdasarkan mekanisme pemisahannya,
kromatografi digolongkan atas kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi,
kromatografi pasangan ion, kromatografi penukar ion, dan kromatografi eksklusi
ukuran. Sedangkan berdasarkan alat yang digunakan, kromatografi dibedakan atas
kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi cairan kinerja
tinggi (HPLC), serta kromatografi gas (Aisyah, 2008).
Kromatografi kertas adalah salah satu jenis kromatografi partisi, aitu
pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang
tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini
cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis
diteteskan sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung
kertas dilarutkan ke dalam pelarut tertentu.
Penggantungkertas
titiktempatasamamino
Pelarut
Pelarut ini akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa
senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam
pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh
daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir,
kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya di
udara. Dengan proses ini, asam-asam amino akan terpisah satu dengan yang lain,
dan dengan menyemprotkan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut
akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang
terpisah itu (Poedjiadi, 2005).
Kromatografi lapis tipis menggunakan aluminium oksida, serbuk selulosa
atau silica gel sebagai absorben yang berupa lapis tipis yang diletakan di ata
selembar kaca. Seperti halnya pada kromatografi kertas, larutan yang mengandung
asam amino diteteskan di atas absorben dan dibiarkan bergerak. Pemisahan asam
amino didasarkan perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada
pH tertentu (Poedjiadi, 2005).
Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan
dua fase pelarut, misalnya pasangan fenol – air, n-butanol – air atau dengan tiga
fase pelarut, misalnya n-butanol – asam asetat – air, dimana setiap jenis asam
amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Pada
Kertas kromatografi
kromatografi partisi, kertas digunakan sebagai pendukung air (fase stasioner).
Campuran komponen-komponen yang akan dipisahkan ditempatkan pada fase
stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fasa mobile (zat cair), maka
fasa mobile akan melalui fasa stasioner, sambil membawa komponen-komponen
tersebut, dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan
kecepatan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk mengidentifikasi
komponen-komponen yang dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini disingkat
dengan Rf (Rate of front) (Tim Dosen Biokimia, 2008).
Kromatografi penukar ion juga merupakan metoda yang paling banyak
digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan menghitung jumlah tiap-tiap
asam amino dalam suatu campuran. Metode ini juga memanfaatkan perbedaan
dalam tingkah laku asam basa dari asam amino, tetapi terdapat faktor tambahan
yang menyebabkan prosedur ini efektif (Lehninger, 1995).
Kromatografi kertas, merupakan salah satu jenis kromatografi partisi,
yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaaan kelarutan dalam dua pelarut
yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini
cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis
diteteskan sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung
kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu (Khopkar, 1990).
Kromatografi lapis tipis (KLT), teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh
Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak
sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam
dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom
terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan
pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang
terpisahkan (Khopkar, 1990).
Harga Rf yaitu b/a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut
tertentu. Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui
macamnya pada kromatografi kertas seperti yang dilakukan di atas maka dapat
diketahui macam asam amino yang diperiksa. Penentuan macam asam amino
dapat pula dilakukan dengan menghitung harga Rf masing-masing asam amino,
dan dibandingkan dengan harga Rf asam amino yang telah ada (Poedjiadi dan
Supriyanti, 2005).
Protein adalah molekul terbesar sebagai penyusun tubuh kita setelah air.
Hal ini mengindikasikan pentingnya protein dalam menopang seluruh proses
kehidupan dalam tubuh kita dalam kenyataannya, memang kode genetik yang
tersimpan dalam untaian DNA digunakan untuk membuat protein. Protein
berfungsi sebagai penyimpan dan pengantar seperti hemoglobin yang memberikan
warna merah pada sel darah merah kita masih banyak lagi fungsi protein sepert
hormon, antibodi dalam pertahanan tubuh.(Witarto, 2009).
BAB III
METODE PERCOBAAN
3.1 Bahan Percobaan
Larutan sampel, larutan glisin, larutan histidin, larutan alanin, eluen (n-
butanol : asam asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v), larutan penyemprot ninhidrin 2 %,
plat KLT, aseton, akuades, selotip dan tissue roll, sabun cair
3.2 Alat Percobaan
Chamber, pipet volum 1 mL, pipa kapiler 0,5 L, gelas ukur 10 mL, botol
semprot, pipet tetes, gunting, pensil, penggaris, gegep dan oven, bulb filter,
mistar, lap halus, dan sikat tabung.
3.3 Prosedur Percobaan
Dibuat larutan eluen dengan menggunakan larutan n-butanol, asam asetat,
dan air dengan perbandingan 2,5 : 6 : 2,6 v/v. Kemudian dimasukkan eluen ke
dalam chamber, dikocok sebentar, kemudian ditutup dan ditunggu sampai jenuh.
Pada plat KLT yang sebelumya telah digunting sesuai ukuran chamber, dibuat
base line, kemudian membuat titik-titik pada base line yang merupakan tempat
penotolan larutan asam amino alanin, glisin, histidin serta asam amino sampel X
serta membuat garis pada ujung atas absorben sebagai batas tanda elusi. Plat KLT
selanjutnya diaktifasi degan jalan dipanaskna dalam oven pada suhu sekitar 100
oC. Setelah plat KLT diaktifasi, semua larutan asam amino dan larutan asam
amino sampel X ditotolkan pada titik yang telah dibuat pada plat KLT dengan
menggunakan pipa kapiler yang sebelumya telah dicuci dengan aseton kemudian
dikeringkan. Jika eluen telah jenuh, plat KLT dielusi ke dalam chamber dengan
hati-hati agar base line tidak tercelup ke dalam eluen. Elusi dihentikan jika eluen
menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya. Dikeluarkan absorben dari
chamber dan dikeringkan. Selanjutnya kromatogram disemprot dengan larutan
ninhidrin, kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu kurang lebih 60°C
selama setengah jam. Setelah kering diberi tanda pada noda yang timbul pada
kromatogram dengan pensil. Ditentukan nilai Rf dari masing-masing noda pada
kromatogram.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Tabel hasil pengamatan :
No Asam amino Jarak eluen (cm) Jarak noda (cm) Rf (cm)
1 Glisin 6 3,9 0,65
2 Serin 6 4,1 0,68
3 Alanin 6 4,1 0,68
4 sampel X 6 4 0,67
4.2 Reaksi
- Reaksi asam amino glisin dengan ninhidrin.
Reaksi asam amino serin dengan ninhidrin
Reaksi Serin dengan ninhidrin
Ninhidrin Serin
3 H2O + +3 H2O
Diketohidrindilen diketohidrindaminSenyawa berwarna biru ungu
+
serin
Ninhidrin
Hidrindantin
+ CH2OH – CH + NH3 + CO2
O
Ninhidrin Hidrindantin
C
C
C
O
O
OH
OH
C
C
C
O
O
OH
OH
+ NH3 +
- Reaksi asam amino alanin dengan ninhidrin
C
C
C
O
O
OH
OH
+ H3C CH COOH
NH2
ninhidrin alanin
C
C
C
O
O
OH
OH
ninhidrin
+ NH3
C
C
C
O
H
HO
O
hidridantin
+
C
C
C
O
H
HO
O
+ H3C CH
O
+ NH3 + CO2
hidridantin
C
C
C
O
OH
C
C
O
O
N C + 3H2O
diketodihidrindilendiketodihidrindaminwarna biru ungu
- Reaksi asam amino sampel X
Senyawa berwarna biru ungu
4.3 Pembahasan
Kromatografi adalah suatu prosedur yang memungkinkan pemisahan
campuran zat terlarut bergantung pada derajat pada mana berbagai zat terlarut
diadsorpsi dibagi atau ditukar antara larutan asal (“fase bergerak”) dan suatu fase
padat atau fase cair kedua, yang dikenal sebagai “fase diam”. Pada percobaan
pemisahan dan identifikasi asam amino ini digunakan kromatografi lapis tipis
(KLT)
Pada percobaan ini dilakukan identifikasi asam amino pada suatu sampel
dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT), dimana dilakukan perhitungan
nilai Rf beberapa asam amino yang digunakan dan asam amino sampel yang akan
diidentifikasi.
Pada percobaan ini kita menggunakan kertas kromatografi yang berukuran
sekitar 7 cm x 3 cm, dan setelah digunting dibuat garis base line sekitar 2 cm
sebagai tempat menotol asam amino glisin, alanin, histidin serta larutan sampel x.
Base line pada tepi atas plat KLT berfungsi sebagai batas berhentinya proses
elusi. Kertas kromatografi ini adalah fase diam dalam percobaan ini. Plat KLT
yang digunakan harus sudah dikeringkan dalam oven agar kadar air dalam plat
KLT habis (menguap semua).
Selanjutnya kertas kromatografi digunting sesuai ukuran chamber yang
digunakan. Sebelum dilakukan penotolan larutan asam amino, plat KLT terlebih
dahulu diaktifasi melalui pemanasan pada suhu sekitar 100 oC. Tujuan
pengaktifan ini adalah untuk menghilangkan uap air pada plat KLT, sehingga
dalam proses elusi nantinya plat KLT dapat menyerap eluen dengan baik. Setelah
dilakukan aktifasi plat KLT, selanjutnya larutan asam amino ditotolkan pada plat
KLT menggunakan pipa kapiler. Setiap penotolan asam amino dilakukan tegak
lurus dengan bidang tempat menotol, serta hanya dilakukan satu kali. Tujuannya
adalah untuk menghindari terjadinya komet (noda berekor) pada plat.
Larutan eluen dibuat dari campuran n-butanol, asam asetat, dan air dengan
perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Pemilihan ketiga pelarut ini didasarkan pada
perbedaan kepolaran dari ketiga pelarut tersebut, dengan urutan kepolaran air > n-
butanol > asam asetat. Setiap asam amino memiliki koefisien partisi tertentu untuk
pasangan pelarut tertentu. Asam amino yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak
(pelarut) yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat
terlarut yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama
pada fasa diam. Dengan demikian asam amino dapat dipisahkan akibat perbedaan
migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diamnya. Prinsip percobaan KLT ini
didasarkan pada sifat fisik dan kimia asam amino. Sifat fisik ditunjukkan oleh
kecepatan bergerak pada fase diam dari kertas kromatografi dan sifat kimianya
berdasarkan pada warna ynag timbul ketika disemprot dengan larutan ninhidrin
Sebelum dimasukkan plat KLT, chamber terlebih dahulu dijenuhkan
dengan eluen dengan cara menutup rapat chamber yang berisi eluen. Tujuan
penjenuhan ini adalah agar proses elusi dapat berjalan dengan cepat serta untuk
mencegah penguapan eluen. Setelah eluen dijenuhkan dan plat KLT telah
ditotolkan larutan asam amino dan sampel, plat KLT dimasukkan dalam chamber
dan dilakukan proses elusi sampai bayang-bayang eluen mencapai end line (batas
akhir elusi). Setelah plat KLT diangkat dari eluen, kemudian dikeringkan pada
suhu kamar dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin, yang bertujuan untuk
memberikan warna pada noda asam amino dan Ninhidrin berfungsi sebagai
pereaksi spesifik terhadap asam amino dengan membentuk warna ungu
(lembayung) bagi asam amino glisin, serin, dan alanin dan larutan sampel. Untuk
memperjelas noda asam amino, plat KLT dimasukkan dalam oven pada suhu
sekitar 90 oC selama sepuluh menit. Proses elusi dibiarkan beberapa saat agar
eluen mencapai jarak tertentu yang telah diberi tanda dan setelah sampai pada
garis tanda, plat KLT dikeringkan dengan oven agar pelarut menguap sempurna
sehingga noda yang terbentuk tidak melebar. Selanjutnya dilakukan pengukuran
jarak eluen dan jarak noda dari base line (tempat penotolan).
Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, diperoleh nilai Rf untuk
asam amino glisin adalah 0,65, asam amino serin 0,68, dan asam amino alanin
adalah 0,68 Untuk asam amino sampel X didapatkan nilai Rf nya sama dengan
nilai Rf asama amino alanin, yaitu 0,67. Hasil nilai Rf dari larutan sampel ini
tidak ada yang sesuai dengan asam amino tersebut namun, nilainya mendekati
dengan nilai asam amino serin atau alanin, tetapi sesuai dengan teori nilai Rf
sampel itu adalah phenylalanine.
Adanya kesalahan dari hasil percobaan yang dilakukan, yaitu perbedaan
nilai Rf asam amino yang diperoleh dengan nilai Rf asam amino berdasarkan
tabel, mungkin disebabkan karena saat melakukan proses elusi, chamber yang
digunakan tidak terlalu rapat, atau dapat pula karena pembuatan eluaen yang tidak
terlau tepat perbandingannya atau ini juga bisa terjadi karena adanya beberapa
faktor yaitu pada saat penotolannya dilakukan berkali-kali pada tempat penotolan
yang sama sehingga hasil penotolannya melebar, faktor yang lain pada saat proses
elusi plat KLT mengenai larutan eluen sehingga asam aminonya menjadi larut
dalam eluen. Chamber yang tidak ditutup rapat dengan menggunakan isolasi bisa
membuat hasil kromatografi tidak memuaskan.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan:
1. Nilai Rf asam amino glisin adalah 0,65, asam amino serin 0,68, asam amino
alanin 0,68, serta sampel X adalah 0,67.
2. Berdasarkan nilai Rf, larutan sampel X adalah mendekati larutan asam amino
alanin.dan serin.
5.2 Saran
Untuk laboratorium agar kebersihannya agar tetap terjaga dan kalau bisa
asam amino yang disediakan asam amino yang beragam.
Untuk asiten kinerjanya sudah sangat baik dalam menjelaskan kepada
kami praktiknnya tentang prosedur percobaan yang akan dilakukan, saya harap
dapat dipertahankan
DAFTAR PUSTAKA
Aisyah, 2008, Kromatografi, (online), (http://rgmaisyah.wordpress.com/kromatografi, diakses tanggal 16 Maret 2010, pukul 16.00 WITA.)
Anonim, 2008, Kromatografi Adalah, (online), (http://137maestro. blogspot.com/2009/03/kromatografi-adalah.html, diakses tanggal 16 Maret 2010, pukul16.30 WITA.)
Day, R.A dan Underwood, A.L., 2001, Analisis Kimia Kuantitatif edisi keenam,diterjemahkan oleh : Iis Sopyan, Erlangga, Jakarta.
Lehninger, A. L., 1995, Dasar-Dasar Biokimia jiid 1, diterjemahkan oleh MaggyThenawidjaja, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta
Poedjiadi, A., 2005, Dasar-Dasar Biokimia edisi revisi, UI-Press, jakarta.
Tim Dosen Biokimia, 2009, Penuntun dan Laporan praktikum Biokimia,Laboratorium Biokimia fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Hasanuddin, Makassar.
Witarto, A.B., 2009, Journal of Biochemistry, Tokyo University of Agricultureand Technology, 105(5), (http ://www.jstage.jst.go.jp, diakses tanggal 16Maret 2010, pukul 19.44 WITA)
LEMBAR PENGESAHAN
Makassar, 17 OKTOBER 2010
ASISTEN PRAKTIKAN
( INDRIYANI ) ( AHMAD FADEL)
Lampiran 1
Perhitungan nilai Rf
3,9 cm- Rf Glisin = = 0,65 cm
6 cm
4,1 cm- Rf Serin = = 0,68 cm
6 cm
4,1 cm- Rf Alanin = = 0,68 cm
6 cm
Lampiran 2
Daftar nilai Rf 20 asam amino
Amino acid Rf value
alanine 0.38
arginine 0.20
asparagine 0.5
aspartic acid 0.24
cysteine 0.4
glutamine 0.13
glutamic acid 0.30
glycine 0.26
histidine 0.11
isoleucine 0.72
leucine 0.73
lysine 0.14
methionine 0.55
phenylalanine 0.68
prolinenot a true amino acid - shows up as yellow
0.43
serine 0.27
threonine 0.35
tryptophan 0.66
tyrosine 0.45
valine 0.61
Lampiran 3
Bagan kerja
- Digunting dan diberi tanda
- Dikeringkan dalam oven untuk mengaktifkan lapisan tipis
- Ditotolkan larutan contoh dan sampel
- Dikeringkan
- Dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen (n-butanol : asam
asetat : air = 2,5 ml : 0,6 ml : 2,6 ml) yang telah jenuh.
- Dielusi sampai tanda batas yang telah ditentukan
- Dikeluarkan dari chember dan dikeringkan
- Disemprot dengan larutan ninhydrin 0,1 %
- Dikeringkan dalam oven selama beberapa menit pada suhu 60 oC.
- Ditandai dengan diberi lingkaran dengan menggunakan pensil
- Diukur jarak noda dari tempat penotolan
- Diukur jarak tempuh eluen
- Dihitung nilai Rf-nya
-
Plat KLT
Noda
Data
Lampiran 4
Gambar hasil Kromatografi Lapis Tipis