Download - はじめよう siRNA 実験 オフオオフフオフ ターゲット効果ををを ... · 2020-02-07 · RISC RISC mRNA の異異異異なるななるるなる位置 位置にににに設定設定された
はじめようはじめようはじめようはじめようsiRNA実験実験実験実験
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2014年11月14日(金)
ライフテクノロジーズジャパン株式会社
サーモフィッシャーサイエンティフィック グループ
本日の内容�siRNAの基礎
siRNAのワークフロー
RNAiの原理
オフターゲット効果
�siRNA実験の成功の秘訣
siRNAを低濃度で使う
化学修飾siRNAを使う
3
化学修飾siRNAを使う
高効率なトランスフェクションを行う
複数のsiRNAを個別に使う
Single siRNAs vs. siRNA Pools
� Silencer Select siRNA
Silencer Select siRNAの特徴
Silencer Select siRNA Library
� まとめ
RNAi実験のワークフロー
siRNAのののの設計設計設計設計・・・・合成合成合成合成 siRNAのののの導入導入導入導入 ノックダウンのノックダウンのノックダウンのノックダウンの評価評価評価評価・・・・解析解析解析解析
•設計済みsiRNAを検索・合成または•アクセッション番号等をもとに設計
•最適な導入方法を検討•Negative control•Positive control(GAPDH等)•蛍光修飾siRNA•目的のsiRNA
•導入後の培養時間•mRNAレベル:24~48時間•タンパク質レベル:24~72時間
•mRNAの解析(qPCR等)•タンパク質解析(ウエスタンブロット等)•表現系解析(顕微鏡解析等)
4
•
18s neg1
surv
Protein Knockdown
GAPDH
Survivin
mRNA Knockdown
トランスフェクション試薬siRNA
細胞専用Webサイトにて検索
RNAiのメカニズムのメカニズムのメカニズムのメカニズム
細胞内細胞内細胞内細胞内ではではではでは内在性内在性内在性内在性ののののmiRNAとととと同様同様同様同様のののの経路経路経路経路でででで作用作用作用作用するするするする
siRNA::::mRNAと100%の相同性を持ち、mRNAを分解することで
標的遺伝子をノックダウンする。
RNA interference :::: RNA干渉干渉干渉干渉
2本鎖RNA分子(dsRNA)を細胞や生体に導入し、導入したdsRNAとホモロジーを持つmRNAを特異的に分解することで発現が抑制される現象
dsRNA
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標的遺伝子をノックダウンする。
miRNA :一般にmRNA配列と一部ミスマッチがあり、mRNAの分
解ではなく翻訳を抑制することで遺伝子をノックダウンする。
siRNA miRNA
siRNAとshRNAの違い
siRNAs• 合成オリゴ
• デザインの自由度が高くノックダウン効率が高い
• 標的以外のノックダウンを最小限にする化学修飾が可能
shRNA(short hairpin
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shRNA(short hairpin RNA)
• ウイルスまたはプラスミドから作られる
• デザインの自由度が低い
• 長期間のノックダウン
• 発現量を制御できず標的以外のノックダウンが多い
siRNA の一般的な構造
・二本鎖の核酸
・19 塩基の RNA + TT (DNA) = 21 塩基
・2 塩基 (TT) だけ末端が突出
・アンチセンス鎖は標的 mRNA と完全に相補的
TT GCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGG
CGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCTT
←センス鎖
←アンチセンス鎖
siRNA
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-------UGCGUA GCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGCUGAUU-------標的 mRNA
TT GCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGGGCUAUUAUCUAAUCUAGGG ←センス鎖
CGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCCCGAUAAUAGAUUAGAUCCC TT ←アンチセンス鎖
RISC
標的mRNAの分解
siRNA
オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果とはとはとはとは
標的遺伝子以外の遺伝子に対して非特異的にRNAi効果を示してしまう現象
オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果
目的目的目的目的ののののRNAi
アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖
目的遺伝子のノックダウン
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siRNA導入導入導入導入によるによるによるによる非特異的非特異的非特異的非特異的なななな免疫応答免疫応答免疫応答免疫応答やややや細胞毒性細胞毒性細胞毒性細胞毒性
センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖によるによるによるによる非特異的非特異的非特異的非特異的なななな抑制抑制抑制抑制アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖とととと相補性相補性相補性相補性をををを有有有有するするするする遺伝子遺伝子遺伝子遺伝子をををを非特異的非特異的非特異的非特異的にににに抑制抑制抑制抑制
センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖
アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖
目的遺伝子のノックダウン
siRNA実験の成功の秘訣
siRNA をををを低濃度低濃度低濃度低濃度でででで使使使使うううう
化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾siRNAをををを使使使使うううう
標的遺伝子標的遺伝子標的遺伝子標的遺伝子のノックダウンをのノックダウンをのノックダウンをのノックダウンを最大化最大化最大化最大化しししし、、、、オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果をををを最小化最小化最小化最小化すべしすべしすべしすべし
そのための実験のポイント
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化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾siRNAをををを使使使使うううう
高効率高効率高効率高効率なトランスフェクションをなトランスフェクションをなトランスフェクションをなトランスフェクションを行行行行うううう
二種以上二種以上二種以上二種以上のののの siRNA でででで個別個別個別個別にににに実験実験実験実験をををを行行行行うううう
ポイント① siRNA を低濃度で使用する
siRNAをををを低濃度低濃度低濃度低濃度でででで用用用用いることでいることでいることでいることで、、、、オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果をををを抑制抑制抑制抑制
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CLTC(クラスリン重鎖)に対するsiRNA
センス鎖
アンチセンス鎖
RISC
化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾
ポイント② 化学修飾siRNAを使用する
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アンチセンス鎖
標的miRNAをノックダウン
RISCセンス鎖
標的以外のmiRNAをノックダウンオフターゲットの主要因となる
RISC
センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖をををを化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾によりによりによりにより非活性化非活性化非活性化非活性化することですることですることですることで、、、、センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖ががががRISCにににに取取取取りりりり込込込込まれるのをまれるのをまれるのをまれるのを防防防防ぐことがぐことがぐことがぐことが可能可能可能可能
80% reduction
ポイント② 化学修飾siRNAを使用する
化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾によりによりによりにより、、、、オフターゲットはオフターゲットはオフターゲットはオフターゲットは大大大大きくきくきくきく減少減少減少減少するするするする。。。。
BaseO
OO
O
LNA®
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2-fold changesp<0.001
化学修飾なし化学修飾あり(LNA)
LNA修飾したsiRNA(Silencer ® Select)とLNA修飾なしのsiRNAのオフターゲットの比較。siRNA導入後に増加もしくは減少したmRNAの数をマイクロアレイ(Affymetrix U133 2.0 Plus genechip)で解析した。
ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う
接着系細胞株幹細胞初代細胞
浮遊系細胞
エレクトロポレーションNeon® Transfection System
細胞に合わせた最適なトランスフェクション手法を選択する
•試薬での導入が困難だった細胞に使用•浮遊系細胞に適している
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siRNA専用トランスフェクション試薬Lipofectamine ® RNAiMAX
プラスミド、siRNA共通トランスフェクション試薬Lipofectamine ® 3000
•siRNA導入の第一選択肢としておすすめ•簡便かつ低コスト
•siRNAとプラスミドのコトランスフェクションが可能
正確正確正確正確なななな導入効率導入効率導入効率導入効率のののの確認方法確認方法確認方法確認方法
Positive control siRNA(例:GAPDH)を導入し、mRNAレベルでの抑制効果を確認する→高精度なTaqManがおすすめ
70%以上のノックダウン
蛍光標識したsiRNAを導入して、導入された細胞をカウントする
ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う
= 80%以上の導入効率
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Alexa555蛍光修飾siRNAの導入BLOCK-iT™ Alexa Fluor® RedFluorescentControl
生存率生存率生存率生存率のののの確認方法確認方法確認方法確認方法
• 未処理細胞
• Negative control siRNA 導入細胞
• 導入試薬のみ
生存率生存率生存率生存率がががが最低最低最低最低でもでもでもでも70707070%%%%以上以上以上以上であるかをチェックであるかをチェックであるかをチェックであるかをチェック
ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う
トリパンブルー染色により生存率のチェック
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生存率生存率生存率生存率がががが最低最低最低最低でもでもでもでも70707070%%%%以上以上以上以上であるかをチェックであるかをチェックであるかをチェックであるかをチェック
トリパンブルー
ポイント④ 複数の siRNA で実験する
AAAAAAAAAAAAAターゲットmRNA
siRNA #1 siRNA #2
RISC RISC
mRNA の異異異異なるなるなるなる位置位置位置位置にににに設定設定設定設定されたされたされたされた siRNA を用いて個別個別個別個別ににににノックダウン実験を行い、
複数の siRNA で同じ結果が得られることを確認する
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論文では同一遺伝子に対する複数の siRNA での確認を要求されることがある。
→二つ以上の siRNA でオフターゲット効果のフェノタイプが一致する可能性は非常に
低いため、複数の siRNA で同一のフェノタイプが得られた場合はターゲットの
ノックダウンによる効果と考えられる。
Single siRNAs vs. siRNA Pools
検証方法 mRNAレベルでの抑制結果
siRNAは1種類ずつ単独で導入(Single法) すべきか、複数のsiRNAをミックスした状態で導入(Pool法)すべきか
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アポトーシスアッセイ
Pool法は標的mRNAのノックダウンに効果的だが、大きな問題がある
Positive phenotype:
Single siRNAs vs. siRNA Pools
アポトーシス関連の遺伝子をスクリーニングした例
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Negative control siRNAを導入した場合より - 2SD以下の値を示したもの
Phenotype 変化変化変化変化のののの確認確認確認確認::::
3種類の異なるsiRNAのうち2種類のsiRNAによって同様なphenotypeの変化が誘導された場合、siRNAの導入によって誘導されたphenotypeとする
Pool法はFalse PositiveやFalse Negativeとなる場合がある
Single siRNAs vs. siRNA Pools
アポトーシスアッセイ
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• 同一ターゲットのsiRNAであっても異なるphenotypeの変化を誘導する場合がある• mRNAレベルでの抑制が得られても目的とするphenotypeの変化を誘導できない場合がある• Pool法を用いると正しいphenotype誘導が行われないケースが多い
オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果による影響
False positiveのリスクを最小限にするために、同一ターゲットの複数のsiRNAを単独で使用し、同じphenotypeとなることを確認する必要がある
Single siRNAs vs. siRNA Pools
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Echeverri et al. Nature Methods Oct. 2006
•より確実なノックダウン•より高いノックダウン効率•より高い特異性•低毒性
Phenotype from
siRNA 3
Phenotype from
Phenotypefrom
Silencer® Select siRNA製品コンセプト
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Silencer® Select siRNAs複数のsiRNAを使用した実験により
裏付けられた高い信頼性
デザインアルゴリズム
バイオインフォマティックフィルター
化学修飾(LNA)
from siRNA 1
fromsiRNA 2
Silencer® Select siRNA低濃度で効率的なノックダウン
•デザインアルゴリズムにより低濃度でノックダウン可能な配列をデザイン
•他のsiRNAに対し、同濃度で最大100倍のノックダウン効率
•わずか3 nMの濃度で80%以上のノックダウン効率を実現
siRNA濃度とノックダウン効率の関係
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10 mRNA targets, 3-4 siRNAs per target
Silencer® Select siRNAデザインアルゴリズム改良によるノックダウン効率の向上
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デザインアルゴリズム改良によるノックダウン効率の向上40の標的遺伝子に対して155のsiRNAをSilencer Selectデザインアルゴリズムでデザインし、従来のデザイン(Silencer siRNA)と比較した。5 nMのsiRNAをHeLa細胞に導入し、48時間後のmRNA量をTaqMan Gene Expresssion Assayにより解析。
Mismatch Filter
Silencer® Select Toxicity Classifier
Natural miRNA
Silencer® Select siRNA特異性を高めるためのフィルタリング
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Natural miRNA Seed Region Filter
Antiviral Response Motif Filter
siRNA Seed Region Ranking
Selection of hyperfunctional siRNA with improved potency and specificity.Wang, X, et al., NAR, Oct. 21, 2009
Multiple rounds of selection,
40+ formats evaluated
Hundreds of siRNA tested
Silencer® Select siRNA最適な化学修飾パターンの探索
New ChemistryPattern
Modification
Potency testingMicroarray
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Silencer® Select siRNA
B
O
OO
O
LNA®
Potency testingStrand biasCell assay
MicroarrayPhenotypic
assaysToxicity
Silencer® Select Library
Protease
Kinases(710)
Phosphotase(298)
Nuclear Hormones (47)
Ion Channels
通常のチューブ製品以外に、スクリーニングにはsiRNAを96 wellまたは384 wellプレートにスポットしたプレートタイプが便利です。下の既製品以外に任意のsiRNAを選べるカスタムライブラリも可能です。
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Human Genome Collection (21,585)
Extended Druggable Genome (10,415)Extended Druggable Genome (10,415)
Druggable Genome (9,032)Druggable Genome (9,032)
GPCR (380)Protease (494)
Ion Channels (338)
Silencer Select siRNA Pre-made Libraryシリーズと対象遺伝子数
まとめ
siRNAのののの設計設計設計設計・・・・合成合成合成合成 siRNAのののの導入導入導入導入 ノックダウンのノックダウンのノックダウンのノックダウンの評価評価評価評価・・・・解析解析解析解析
•導入後の培養時間•mRNAレベル:24~48時間•タンパク質レベル:24~72時間
•mRNAの解析(qPCR等)•タンパク質解析(ウエスタンブロット等)•表現系解析(顕微鏡解析等)
•最適な導入方法を検討•Negative control•Positive control(GAPDH等)•蛍光修飾siRNA•目的のsiRNA
•Single法で複数のsiRNAを使用
•設計済みsiRNAを検索・合成または•アクセッション番号等をもとに設計•同一遺伝子に対し複数設計
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•
•優れたデザインアルゴリズムの化学修飾siRNASilencer ® Select siRNA
•Single法で複数のsiRNAを使用
•第一選択肢:siRNA専用トランスフェクション試薬Lipofectamine ® RNAiMAX
•第二選択肢:エレクトロポレーションNeon® Transfection System
•正確なmRNA定量TaqMan Gene Expression Assay