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- Enzimas oxidativas envolvidas na degradação
de lignina: estrutura, função, como determinar
e aplicações no branqueamento de polpas
- Lacase usada na funcionalização de fibras
(seminário)
André Ferraz
Departamento de Biotecnologia
Escola de Engenharia de Lorena
Universidade de São Paulo
Lorena, SP
Enzimas em conversão de biomassa
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Outline - LiP, MnP e VP (peroxidases) - Lacases - Determinação experimental - Aplicações em branqueamento de polpas - Aplicação de lacases na funcionalização de fibras (artigo para discussão no terço final da aula)
Ref. básicas:
1. T Teerii and G Henriksson. 2009 Enzymes degrading wood components. In:
In: Pulp and Paper Chemistry and Technology Volume 1, Wood Chemistry
and Wood Biotechnology
Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar Henriksson
cap. 11, pp. 245-270
2. Kenneth E Hammel and Dan Cullen, 2008. Role of fungal peroxidases in
biological ligninolysis. Current Opinion in Plant Biology 11:349–355
3. seminário: Jordi Garcia-Ubasart, Josep F. Colom, Carlos Vila, Nuria
Gómez Hernández, M. Blanca Roncero, Teresa Vidal . 2012. A new procedure
for the hydrophobization of cellulose fibre using laccase and a hydrophobic
phenolic compound. Bioresource Technology 112: 341–344.
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Revisando sobre o modo de ação dos organismos degradadores de lignina
A hifa do fungo habita o lúmen da célula; a degradação ocorre no interior da parede celular
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Enzimas
envolvidas na
degradação de
lignina
princípio do
modo de ação
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Lógica de
fragmentação,
independente
da ação
enzimática,
dos radicais
inicialmente
gerados por
envolvidas
oxidativas
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Lacase (Cu2+)
Lacase red. (Cu1+)
O2
H2O PhOH
PhO•
Enzimas oxidativas (lacases) (EC 1.10.3.2) (AA1_1)
Quem são as enzimas envolvidas na degradação de
lignina??
grupo 1: Lacases
Cupro-proteínas que recebem elétrons dos fenóis a partir da redução do Cu2+ a Cu1+. A Lac-Cu1+ é então oxidada por O2 que é reduzido à água
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Lacases de Trametes versicolor 52J listada no CAZy
(white-rot fungi)
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Visão geral dos 4 íons Cobre. Os
íons denominados T1 realizam a
oxidação do substrato; T2/T3
reduzem o O2
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A estequeometria da reação envolve mais de 1 molécula fenólica
por O2 reduzido, pois há 4 cobres na molécula de lacase
Cada O-H fenólico perde 1 e-, gerando um radical fenoxila que se decompõe, por várias vias, conforme mostrado anteriormente
A enzima atua somente sobre compostos com hidroxilas fenólicas
(de fato, também pode atuar sobre aminas aromáticas), pois a
capacidade oxidativa é baixa
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Potencial redox do Cu2+ (T1) varia de acordo com o tipo de lacase O. V. Morozova, G. P. Shumakovich, M. A. Gorbacheva, S. V. Shleev, and A. I. Yaropolov (2007) Blue” Laccases. Biochemistry (Moscow) 72:1136-1150.
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11
A capacidade oxidativa pode ser aumentada se a ação é
inicialmente realizada sobre mediadores sintéticos (ABTS ou
HBT). Nestes casos a oxidação pode ocorrer mesmo em
substratos não fenólicos de lignina
Fonte: Reproduzido de Bourbonnais et al. (1999).
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Oxidação de ABTS em dois estágios, que podem ser iniciados por lacase
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Mediadores naturais já descritos para lacases
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Quem são as enzimas envolvidas na degradação de
lignina??
a) Fenoloxidases
b) Enzimas que produzem peróxido de hidrogênio
C0 CI
CII
S
S+•
S
S+•
H2O2
H2O H 2 O
C 0 C I
C II
H 2 O 2
Mn3+
Mn2+
PhOH PhO
.
Mn3+
Mn2+
ou
LiP (EC 1.11.14) (AA 2) MnP (EC 1.11.1.13) (AA2)
Enzimas oxidativas (peroxidases) - visão simplista
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Lip e MnP de Phanerochaete chrysosporium (white-rot fungi). Estruturas similares em todas as peroxidases (grupo heme é o sítio ativo).
No caso da MnP, há um sítio de ligação de Mn2+ que funciona como um co-fator para a ação da enzima
http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Wood4.html
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Ciclo de oxi-redução no sítio catalítico das peroxidases
Forma nativa da enzima Forma oxidada da enzima
oxidação do substrato
oxidação do substrato. Se for uma MnP: Mn2+>>Mn3+
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Mn3+ ou .OH
.
Mn2+ ou H2O
COOH
O2
COOH.
COOH
OO.
Abstração de H de um doador
COOH
O OH
COOH
COOH
COOH.(etapa de propagação)
(etapa de iniciação)
B
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
ROO.
ROOH
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
.O2
OCH3
OOCH3
OH
HO
OC2H5
.OO
HOO.
OC2H5
OH
OCH3O
OCH3
O
OCH3O.
+
OC2H5
HO
OH
OCH3
OCH3
OH
OC2H5
O
AB
Figura 5. (A) Reação de peroxidação de ácido linoleico iniciada por íons Mn3+
ou radicais
hidroxila. (B) Degradação de um composto modelo de lignina (não fenólico) iniciada por radical
organoperoxila (ROO) gerado in situ pelo sistema MnP, ácido linoleico e H2O2. O modelo
proposto explicaria a via de oxidação C-alfa (A) e a clivagem beta-O-4 (B). Ambas reações
seriam iniciadas pela abstração do um hidrogênio benzílico do composto modelo através da ação
de um radical peroxila gerado pelo sistema MnP/ácido linoleico/H2O2
Fonte: Reproduzido com modificações de Kapich et al. (1999).
Ação de MnP, mediada por ácidos graxos
insaturados, sobre modelos não fenólicos de lignina
Peroxidação de ácido graxo iniciada por Mn3+
Degradação de modelo não fenólico por ROO gerado por MnP
Fonte: Reproduzido com modificações de Kapich et al. (1999).
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Degradação in vitro de
lignina contida em um
material lignocelulósico
pelo sistema MnP/ácido
linoleico
G.G.S. Cunha et al. / Enzyme and
Microbial Technology 46 (2010) 262–
267
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Enzimas oxidativas (Peroxidase versátil - VP)
(EC 1.11.1.16) (AA2)
Híbrido estrutural de LiP e MnP. Combina as propriedades catalíticas das 2 enzimas, oxidando substratos de LiP e MnP.
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Versátil Peroxidase de Pleurotus eryngii
VPL has the three acidic amino acid residues required for Mn2+ binding, and a catalytic efficiency (kcat/Km) for Mn2+ oxidation in the general range exhibited by typical MnPs. In addition, VPL has a tryptophan residue, trp164, analogous to the LiPA trp171 that participates in electron transfer from aromatic donors and consequently enables the enzyme to oxidize nonphenolic lignin-related structures The catalytic efficiency of P. eryngii VPL on veratryl alcohol is relatively low the same reaction catalyzed by P. chrysosporium LiP
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Celobiose desidrogenase (EC 1.1.99.18) (AA3) Oxida polissacarídeos, reduzindo Fe3+, O2 ou mesmo coopera com o ciclo catalítico das LPMOs (AA9)
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glicose oxidase
(EC 1.1.3.4) (AA3)
(intracelular)
glioxal oxidase
(AA5_1)
(extracelular)
aril-álcool oxidase
(EC 1.1.3.7) (AA3)
(extracelular)
Enzimas que produzem peróxido
(são acessórias às peroxidases)
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Enzimas que produzem peróxido
Também MnP pode gerar H2O2 a partir da oxidação de
ácidos orgânicos como o malônico e oxálico.
O=O
H-O-O. + CO2
Doador de H
HO-(C=O)-(C=O)-OH
Mn3+ Mn2+
O=C=O + H+ + HO-C.=O
H2O2
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24
Biobranqueamento com o sistema Lacase/mediador
Exemplo do efeito da ação do sistema lacase/HBT sobre polpa kraft não branqueada
Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997)
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25
Figura 8. Linha de branqueamento piloto composta das etapas L-E-Q-P Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997).
Figura 9. Número kappa e alvura das polpas tratadas em planta piloto após os tratamentos com
lacase/mediador (L) e lacase/mediador seguido de extração alcalina (L-E). Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997).
Lacase/HBT em linha piloto de biobranqueamento
Incluindo a etapa final de branqueamento (QP), polpa atingiu 76.5% ISO de alvura.
Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997)
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26
Figura 13. Estrutura de mediadores alternativos testados no sistema lacase/mediador. O
mediador de referência foi o HBT, mostrado na figura “L”. Fonte: reproduzido de Camarero et al. (2007).
Mediadores alternativos ao HBT
HBT
Fonte: Reproduzido de Camarero et al. (2007)
AS
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Mediadores alternativos ao HBT
Fonte: Reproduzido de Camarero et al. (2007)
HBT
AS
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Eficiência da MnP em função do tipo de ácido graxo insaturado presente no meio reacional Kappa inicial = 8,5
Fonte: Reproduzido de Bermeck et al. (2002)
Alvura inicial = 39,3%
Biobranqueamento com o sistema MnP/mediador
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Lacase usada na funcionalização de fibras (seminário)
Garcia-Ubasart et al., 2012. A new procedure for the hydrophobization of cellulose fibre using laccase and a hydrophobic phenolic compound. Bioresource Technology 112: 341-344