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第五节 基因工程菌生长代谢的特点
菌体的生长通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。
控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。
菌体的生长通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。
控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。
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一、菌体的生长与能量的关系一、菌体的生长与能量的关系
碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量,当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时,菌体会产生乙酸,导致培养基的 pH 值下降,从而影响菌体的生长。适当提高 pH ,可减少乙酸的抑制作用
碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量,当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时,菌体会产生乙酸,导致培养基的 pH 值下降,从而影响菌体的生长。适当提高 pH ,可减少乙酸的抑制作用
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分批培养中选择不同的碳源,连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长,从而控制乙酸的产生,减少它的抑制作用。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。
分批培养中选择不同的碳源,连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长,从而控制乙酸的产生,减少它的抑制作用。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。
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大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞,阻止乙酸产生,可提高产量。
大肠杆菌中克隆携带氧能力的 VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿组主细胞,阻止乙酸产生,可提高产量。
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二、菌体生长与前体供应的关系
在基础培养基中加入氨基酸(小分子前体)能使菌体比生长率提高,蛋白合成增加。
基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构,致工程菌生长速率降低。
在基础培养基中加入氨基酸(小分子前体)能使菌体比生长率提高,蛋白合成增加。
基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构,致工程菌生长速率降低。
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质粒存在对菌体代谢的影响:中等拷贝质粒( 56 拷贝)的工程菌中与前体合成有关的酶增加,这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。
高拷贝质粒的工程菌( 240 拷贝)中,生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足,从而产生“严紧反应”有关。
质粒存在对菌体代谢的影响:中等拷贝质粒( 56 拷贝)的工程菌中与前体合成有关的酶增加,这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。
高拷贝质粒的工程菌( 240 拷贝)中,生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足,从而产生“严紧反应”有关。
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“严紧反应”是当氨酰 tRNA 不足时 ,核糖体在密码子上停留 ,并合成被称为魔点的 ppGpp 的结果。
ppGpp 是一个重要的调控分子。它通过影响 RNA 链的延深过程减少转录。
“严紧反应”是当氨酰 tRNA 不足时 ,核糖体在密码子上停留 ,并合成被称为魔点的 ppGpp 的结果。
ppGpp 是一个重要的调控分子。它通过影响 RNA 链的延深过程减少转录。
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它的浓度增加会导致在合成 mRNA 和 rRNA 时 RNA 聚合酶在模板上的移动产生停顿, RNA 链延长速度减慢,使游离的 RNA 聚合酶浓度降低,严紧控制的启动子如 rrnA 等的转录减少。
也可能 ppGpp 是通过干扰 RNA 聚合酶与PL 启动子专一识别反应。
它的浓度增加会导致在合成 mRNA 和 rRNA 时 RNA 聚合酶在模板上的移动产生停顿, RNA 链延长速度减慢,使游离的 RNA 聚合酶浓度降低,严紧控制的启动子如 rrnA 等的转录减少。
也可能 ppGpp 是通过干扰 RNA 聚合酶与PL 启动子专一识别反应。
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第六节 基因工程菌的不稳定性第六节 基因工程菌的不稳定性
基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为: 分裂不稳定 结构不稳定
基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为: 分裂不稳定 结构不稳定
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分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一 定 比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变
分裂不稳定:指工程菌分裂时出现一 定 比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变
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一、质粒不稳定产生的原因
常见分裂不稳定的两个因素:
⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率;
⑵这两种菌比数率差异的大小。
一、质粒不稳定产生的原因
常见分裂不稳定的两个因素:
⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率;
⑵这两种菌比数率差异的大小。
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对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数:
低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性;
高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。
对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数:
低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性;
高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。
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质粒稳定性的分析方法质粒稳定性的分析方法
样品样品 不含抗性标记抗生素
平 板 培 养基
不含抗性标记抗生素
平 板 培 养基10-12h10-12h
100 个菌落100 个菌落
含抗性标记抗生素
平 板 培 养 基
含抗性标记抗生素
平 板 培 养 基
10-12h 10-12h 统计生长菌落数
重复三次 ,计算比值
(稳定性 stability)
重复三次 ,计算比值
(稳定性 stability)
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二、提高质粒稳定性的方法二、提高质粒稳定性的方法
为了提高质粒稳定性,工程菌培养采用两阶段培养法:
⑴先使菌体生长至一定密度;
⑵再诱导外源基因的表达
为了提高质粒稳定性,工程菌培养采用两阶段培养法:
⑴先使菌体生长至一定密度;
⑵再诱导外源基因的表达
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由于第一阶段外源基因未表达,减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别,增加了质粒稳定性。
在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长,提高质粒稳定性。
调控环境参数如温度、 pH 、培养基组分和溶解氧浓度
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有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢,间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率,可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率,都可以提高质粒稳定性。
有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢,间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率,可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率,都可以提高质粒稳定性。
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大肠杆菌的蛋白 /菌体量的比值是基本恒定的,因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。
培养条件的改变,都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应,影响生物大分子的和成和菌体的生长。
大肠杆菌的蛋白 /菌体量的比值是基本恒定的,因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。
培养条件的改变,都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应,影响生物大分子的和成和菌体的生长。
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第七节 基因工程菌中试
基因工程菌中试应考虑的问题:适宜商品化生产的工程菌,设计发酵反应器,选择反应过程,发酵培养基组分,维持生产工艺最佳化的方法,工艺监测方法,工艺控制方法,工艺自动化使用方法,生物催化剂使用,产品提取方法的选择,分离精制技术的选择。
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一 工程菌选择 用于中试的工程菌需具备的条件试能用一般基因重组技术获得,有高产潜力,能有工业原料薇培养基,生产工期能采用一般工业生产经验,能产生和分泌蛋白质,不致病,无毒性,能安全生产,符合国家卫生部门有关规定,产品有特异性,发酵液粘度小。
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二 反应器设计三 发酵培养基组成培养基组成及作用:① 提供化学元素② 提供特殊营养源③ 提供能源④ 控制代谢
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四 工艺最佳化与参数监测控制1.工艺最佳化 是指最快周期,最高产量,最好质量,最低消耗,最大安全性,最周全的服务处理效果,最佳化速度与最低失败率等的综合指标
2. 参数监测控制 需监测与控制的 4种参数: A,主要参数: pH,温度,溶氧。 B,生物量:浑浊度,细胞组分,总氮量及菌丝干重。 C,碳源:糖,有机酸,淀粉。 D,产品。
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五 计算机的应用
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第八节 重组工程菌的培养 基因工程菌的培养过程包括 : ⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件 ,
如温度、 pH 、培养基各种组分、碳氧比,分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响 ;
⑵通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。
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菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养
原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制
微生物工业发酵过程简图
菌种 一级种子摇瓶 二级种子罐培养 扩大培养
原料 发酵培养 灭菌 发酵生产 代谢产物分离 基配制
微生物工业发酵过程简图
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一 基因工程菌的培养方式1. 分批培养2. 补料分批培养3. 连续培养4. 透析培养5. 固定化培养
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2.补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养 ,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的方法。
2.补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养 ,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基,使菌体进一步生长的方法。
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二、基因工程菌的培养工艺二、基因工程菌的培养工艺
基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同 ,基因工程菌带外源基因 ,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。
基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同 ,基因工程菌带外源基因 ,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。
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工艺要求:外源基因既高效表达,又有利于产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有:
1. 培养基的影响2. 接种量的影响3. 温度的影响4. 溶氧量的影响5. 诱导时机的影响6. 诱导表达程序的影响7. pH 的影响
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⒈培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率,又要保持工程菌的稳定性,使外源基因高效表达。常用的碳源有:葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有:酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。
⒈培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率,又要保持工程菌的稳定性,使外源基因高效表达。常用的碳源有:葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有:酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。
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不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大,而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对 lac启动子有阻遏作用。乳糖对 lac启动子有利。
不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大,而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对 lac启动子有阻遏作用。乳糖对 lac启动子有利。
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在氮源中,酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对 trp 启动子控制的基因有影响。
无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子,磷浓度不同,影响菌体生长。
在氮源中,酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对 trp 启动子控制的基因有影响。
无机磷在许多代谢反应中是一个效应因子,磷浓度不同,影响菌体生长。
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⒉接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。
接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小,菌体延迟期较长,使菌龄老化,不利于外源基因表达。
⒉接种量的影响 接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例。
接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。 接种量小,菌体延迟期较长,使菌龄老化,不利于外源基因表达。
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接种量大,可缩短生长延迟期,菌体迅速繁衍,很快进入对数生长期,适于表达外源基因。
接种量过高,使菌体生长过快,代谢物积累过多,反而会抑制后期菌体的生长。
接种量大,可缩短生长延迟期,菌体迅速繁衍,很快进入对数生长期,适于表达外源基因。
接种量过高,使菌体生长过快,代谢物积累过多,反而会抑制后期菌体的生长。
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⒊ 温度的影响⒊ 温度的影响
温毒对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。
温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度,改变菌体代谢产物的反应方向,影响代谢调控机制。
温毒对基因表达的调控作用发生在复制转录翻译和小分子调节分子的合成等水平上。
温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各种酶的反应速度,改变菌体代谢产物的反应方向,影响代谢调控机制。
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适宜的发酵温度是既适合菌体的生长,又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常,影响终产物的形成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
适宜的发酵温度是既适合菌体的生长,又适合代谢产物合成的温度。高温或低温都会使发酵异常,影响终产物的形成并导致减产。
温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。
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⒋ 溶解氧的影响⒋ 溶解氧的影响 对于好氧发酵 ,溶解氧浓度是重要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用率,则能提高发酵产率。
对于好氧发酵 ,溶解氧浓度是重要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用率,则能提高发酵产率。
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发酵时,随 DO2浓度的下降,细胞生长减慢, ST值下降,发酵后期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量的能量,促进细胞的呼吸作用,提高对氧的需求。
维持较高的 DO2值,才能提高工程菌的生长,利于外源蛋白产物的形成。
采用调节搅拌转速的方法 ,可改变培养过程中的氧供给,提高活菌产量。
发酵时,随 DO2浓度的下降,细胞生长减慢, ST值下降,发酵后期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量的能量,促进细胞的呼吸作用,提高对氧的需求。
维持较高的 DO2值,才能提高工程菌的生长,利于外源蛋白产物的形成。
采用调节搅拌转速的方法 ,可改变培养过程中的氧供给,提高活菌产量。
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⒌ 诱导时机的影响⒌ 诱导时机的影响
对于 λP 启动子型的工程菌,使用 cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株( clts857),在 28 ~ 30 0C下培养时,该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏 PL 启动子的转录;
当温度升高 42 0C时,该阻遏蛋白失活,使启动子启动转录,提高目的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。
对于 λP 启动子型的工程菌,使用 cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株( clts857),在 28 ~ 30 0C下培养时,该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏 PL 启动子的转录;
当温度升高 42 0C时,该阻遏蛋白失活,使启动子启动转录,提高目的基因的表达效率。一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。
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在对数生长期,细胞快速繁殖,直到细胞密度达到 109/个为止,这时菌体数目倍增,对营养和氧需求量急增,营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。
在对数生长期,细胞快速繁殖,直到细胞密度达到 109/个为止,这时菌体数目倍增,对营养和氧需求量急增,营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制因素。
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7 pH 的影响7 pH 的影响
pH 对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响,所以应根据工程菌的生长和代谢情况,对pH进行适当的调节。
pH 对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响,所以应根据工程菌的生长和代谢情况,对pH进行适当的调节。
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如采取两段培养工艺,培养前期重点是优化工程菌的生长条件,其最佳 pH 在 6.8 ~ 7.4左右 ;培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件 ,其最佳 pH 为 6.0~ 6.5 。
如采取两段培养工艺,培养前期重点是优化工程菌的生长条件,其最佳 pH 在 6.8 ~ 7.4左右 ;培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件 ,其最佳 pH 为 6.0~ 6.5 。
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总之 ,最佳化的工艺是获得 : 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。
总之 ,最佳化的工艺是获得 : 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。
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三、基因工程菌的培养设备三、基因工程菌的培养设备
应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵,微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物,细胞生长并非主要目标,而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。
应用发酵罐大规模培养基因工程菌。它不同于微生物发酵,微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物,细胞生长并非主要目标,而基因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物。
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发酵罐的组成有: 发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。
发酵罐的组成有: 发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。
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对发酵罐要求: 提供菌体生长最适生长条件, 培养过程不得污染, 保证纯菌培养, 培养及消毒过程不得游离异物,不能干扰细菌代谢活动等。
对发酵罐要求: 提供菌体生长最适生长条件, 培养过程不得污染, 保证纯菌培养, 培养及消毒过程不得游离异物,不能干扰细菌代谢活动等。
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第九节 高密度发酵 利用大肠杆菌表达重组基因产物与传统发酵培养不同,重组菌培养有自身的特点,即目的基因克隆自啊质粒上,存在分裂不稳定性和结构不稳定性;随着培养环境的改变,质粒拷贝数会有增有减,基因剂量也会相应变化;大多数克隆基因的表达是已知启动子控制的,因而易通过改变环境条件来调节。
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高密度发酵是一个相对概念,一般指培养基中工程菌的菌体浓度在 50gDCW/L 以上,理论上的最高值可达 200gDCW/L
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一 影响高密度发酵的因素 1. 培养基 2. 溶氧浓度 3.pH 4. 温度 5. 代谢副产物
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二 实现高密度发酵的方法 1. 发酵条件的改进( 1)培养基的选择( 2)建立流加式培养的方式( 3)提高供氧能力 2.构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌( 1)阻断乙酸产生的主要途径( 2)对碳代谢流进行分流( 3)限制进入糖酵解途径的碳代谢流( 4)引入血红蛋白基因 3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌
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第十节 基因工程药物的分离纯化第十节 基因工程药物的分离纯化
基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质 。它的制得具有以下特点:①表达产物在初始料中含量较低;
基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质 。它的制得具有以下特点:①表达产物在初始料中含量较低;
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②含有大量细胞及代谢产物;③表达产物稳定性差,易失活变性;④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异;⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。
②含有大量细胞及代谢产物;③表达产物稳定性差,易失活变性;④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异;⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。
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一、建立分离纯化工艺的根据一、建立分离纯化工艺的根据
⒈含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括:
①菌种的类型及其代谢特性。 ②原材料培养基的来源及其质量。 ③生产工艺及条件。
⒈含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括:
①菌种的类型及其代谢特性。 ②原材料培养基的来源及其质量。 ③生产工艺及条件。
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⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求
⒉物料中杂质的种类和性质。 ⒊目的产物特性。 ⒋产品质量的要求
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二 、分离纯化的基本过程二 、分离纯化的基本过程 发酵液
细胞分离胞内产物 胞外产物
细胞破碎
固液分离 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
包含体 细胞碎片分离
变性
复性
发酵液
细胞分离胞内产物 胞外产物
细胞破碎
固液分离 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
包含体 细胞碎片分离
变性
复性
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三、分离纯化的技术三、分离纯化的技术分离纯化的技术要求:①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好,能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离,达到较高的纯化倍数。
分离纯化的技术要求:①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好,能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离,达到较高的纯化倍数。
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③收率要高。④两个技数间能直接衔接, 不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快,满足高 生产率的要求。
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⒈细胞破碎与固液分离 ⑴细胞收集: 离心法、膜分离法。 ⑵细胞破碎:机械破碎法、非机械破碎法。
⑶固液分离
⒈细胞破碎与固液分离 ⑴细胞收集: 离心法、膜分离法。 ⑵细胞破碎:机械破碎法、非机械破碎法。
⑶固液分离
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⒉目的产物的分离纯化⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和
生物学特性来决定。
目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和
生物学特性来决定。
产 物 特 性 作 用产 物 特 性 作 用
等电点 决定离子交换种类及条件
相对分子量 选择不同孔径的介质
疏水性 与疏水、反相介质结合的程度
生物特异性 决定亲和配基
溶解性 决定分离体系及蛋白浓度
稳定性 决定工艺采用温度及流程时间
等电点 决定离子交换种类及条件
相对分子量 选择不同孔径的介质
疏水性 与疏水、反相介质结合的程度
生物特异性 决定亲和配基
溶解性 决定分离体系及蛋白浓度
稳定性 决定工艺采用温度及流程时间
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⒉目的产物的分离纯化⒉目的产物的分离纯化
目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。
蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。
目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。
蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。
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产 物 特 性 作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 相对分子量 选择不同孔径的介质 疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 生物特异性 决定亲和配基 溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 稳定性 决定工艺采用温度及流程时间
产 物 特 性 作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 相对分子量 选择不同孔径的介质 疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 生物特异性 决定亲和配基 溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 稳定性 决定工艺采用温度及流程时间
产物的特性在分离纯化中的作用 产物的特性在分离纯化中的作用
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分离纯化的方法依赖色谱分离方法分离纯化的方法依赖色谱分离方法 ⑴离子交换层析( ion exchange chromatography IEC)
离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换,从而达到分离的目的。
它具有分辨率高容量大操作容易,该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。
⑴离子交换层析( ion exchange chromatography IEC)
离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换,从而达到分离的目的。
它具有分辨率高容量大操作容易,该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。
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⑵反相色谱( reversed phase chromatography, RPC)和 疏水色谱( hydrophobic interaction chromatography, HIC)
反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。
反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。
反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。
反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。
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常用固定相为硅胶烷基键合相。 流动相为低离子强度的酸性水溶液,加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。
由于固定相骨架疏水性强,吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。
常用固定相为硅胶烷基键合相。 流动相为低离子强度的酸性水溶液,加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。
由于固定相骨架疏水性强,吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。
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疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似,主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用,无机盐的存在能使相互作用力增强。
固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。
流动相为 pH6~ 8盐水溶液。
疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似,主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用,无机盐的存在能使相互作用力增强。
固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。
流动相为 pH6~ 8盐水溶液。
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在高盐浓度时,蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附;盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱,目的蛋白质被逐步洗脱下来,蛋白质疏水性越强,洗脱时间越长。
与反相色谱相比,疏水色谱回收率较高,蛋白质变性可能性小。
在高盐浓度时,蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附;盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱,目的蛋白质被逐步洗脱下来,蛋白质疏水性越强,洗脱时间越长。
与反相色谱相比,疏水色谱回收率较高,蛋白质变性可能性小。
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⑶亲和层析( affinity chromatography, AC)
⑶亲和层析( affinity chromatography, AC)
亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附,如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。
亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附,如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。
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配基:在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。
载体:与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步: ①配基固定化 ②吸附目的物 ③样品解吸
配基:在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。
载体:与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步: ①配基固定化 ②吸附目的物 ③样品解吸
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⑷凝胶过滤⑷凝胶过滤
凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质,小分子能进入孔内,在柱中缓慢移动,而大分子不能进入孔内,快速移动,利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。
凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质,小分子能进入孔内,在柱中缓慢移动,而大分子不能进入孔内,快速移动,利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。
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根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异,可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。
主要应用两个方面: ①脱盐和更换缓冲液 ②蛋白质分子的分级分离。 在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。
根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异,可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。
主要应用两个方面: ①脱盐和更换缓冲液 ②蛋白质分子的分级分离。 在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。
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⒊非蛋白质杂质的去除
DNA 、热原质和病毒的纯化方法:⑴ DNA 的去除 DNA 在 pH4.0以上呈阴离子,蛋白质的 pI在 6.
0以上 ,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性,可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上,而 DNA 不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。
⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素(脂多糖)去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透,脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去,脂多糖是疏水性可用疏水层析法。
⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
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⒊非蛋白质杂质的去除⒊非蛋白质杂质的去除
DNA 、热原质和病毒的纯化方法: ⑴ DNA 的去除 DNA 在 pH4.0以上呈阴离子,蛋白质的 pI在 6.0以上 ,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性,可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上,而 DNA 不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。
DNA 、热原质和病毒的纯化方法: ⑴ DNA 的去除 DNA 在 pH4.0以上呈阴离子,蛋白质的 pI在 6.0以上 ,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性,可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上,而 DNA 不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。
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⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素(脂多糖)去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透,脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去,脂多糖是疏水性可用疏水层析法。⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
⑵热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素(脂多糖)去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透,脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去,脂多糖是疏水性可用疏水层析法。⑶病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。
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四、选择分离纯化方法的依据
⒈根据产物表达形式来选择 分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。
⒈根据产物表达形式来选择 分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。
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产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式 ,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质 ,在一定程度上有利于分离纯化 . 为了获得周质蛋白
经低浓度溶菌酶处理后 , 可采用渗透压休克的方法来获得。
产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式 ,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质 ,在一定程度上有利于分离纯化 . 为了获得周质蛋白
经低浓度溶菌酶处理后 , 可采用渗透压休克的方法来获得。
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可溶性表达产物破菌后的细胞上清,首选亲和分离方法,或离子交换层析。
可溶性表达产物破菌后的细胞上清,首选亲和分离方法,或离子交换层析。
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⒉根据分离单元之间的衔接选择⒉根据分离单元之间的衔接选择 应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺,尽早采用高效的分离手段。
先将最多的杂质去除,将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段,即通常先运用非特异、低分辨的操作单元(如沉淀超滤和吸附等),以尽快缩小样品体积,提高产物浓度,去除最主要杂质(包括非蛋白类杂质)。
应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺,尽早采用高效的分离手段。
先将最多的杂质去除,将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段,即通常先运用非特异、低分辨的操作单元(如沉淀超滤和吸附等),以尽快缩小样品体积,提高产物浓度,去除最主要杂质(包括非蛋白类杂质)。
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随后采用高分辨率的操作单元(离子交换层析和亲和层析)凝胶过滤放在最后,这样可以提高分离效果。
层析分离次序的选择同样重要,合理的组合能提高分辨效率,并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。
随后采用高分辨率的操作单元(离子交换层析和亲和层析)凝胶过滤放在最后,这样可以提高分离效果。
层析分离次序的选择同样重要,合理的组合能提高分辨效率,并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。
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⒊根据分离纯化工艺的要求来选择⒊根据分离纯化工艺的要求来选择
分离纯化工艺应遵循以下原则: ⑴具有良好的稳定性和重复性 ⑵尽可能减少组成工艺的步骤 ⑶各技术步骤间要相互适应和协调
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⑷工艺过程中尽可能少用试剂 ⑸工艺所用时间要短 ⑹工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低
⑺具有较高的安全性
⑷工艺过程中尽可能少用试剂 ⑸工艺所用时间要短 ⑹工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低
⑺具有较高的安全性
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第十一节 变性蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成,虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点,但包涵体蛋白质的复性率一般都很低 。
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一 . 包涵体的特性与形成 1. 包涵体的定义、组成与特性: 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。 一般含有 50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、 RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、 ompF和 ompA 等,环状或缺口的质粒 DNA ,以及脂体、脂多糖等,大小为 0.5-1um ,具有很高的密度(约 1.3mg/ml),无定形,呈非水溶性,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 NMR 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构,他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
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2包涵体的形成: 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子,或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。
2.1、基因工程菌的表达产率过高,超过了细菌正常的代谢水平,由于细菌的 δ因子的蛋白水解能力达到饱和,使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。
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2.2 、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
2.3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内 pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
2.4 、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子,如折叠酶和分子伴侣等,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。
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2.5 、蛋白质在合成之后,于中性 pH 或接近中性 pH 的环境下,其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键,即是说,有的表达产率很高,如 Aspartase和 Cyanase,表达产率达菌体蛋白的 30%, 也不形成包涵体,而以可溶形式出现。
2.6 、在细菌分泌的某个阶段,蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
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二 . 包涵体的分离和溶解 1基因工程菌发酵液,经离心浓缩后,可用:机械破碎、超声破碎:单纯超声破碎,在小规模下且菌量较少的情况下效果较好,由于能量传递和局部产热等原因,很难用于大体积细胞悬液的破碎,这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起,给后期纯化带来困难。因此,在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜,再结合超声破碎方法,可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解 ,然后以 5000-20000g 15min 离心,可使大多数包涵体沉淀,与可溶性蛋白分离。
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2洗涤:为了除去包涵体上粘附的杂质,如膜蛋白或核酸,应用洗涤液洗涤包涵体,通常用低浓度的变性剂 , 过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解,如 2M 尿素在 50mM Tris pH7.0-8.5左右 ,1mM EDTA 中洗涤。此外可以用温和去垢剂 TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
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3 溶解:一般用强的变性剂如尿素( 6-8M)、盐酸胍( GdnHCl 6M),通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,一般来讲,盐酸胍优于尿素,因为盐酸胍是较尿素强的变性剂,它能使尿素不能溶解的包涵体溶解,而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化,特别是在碱性 pH 值下长期保温时。或用去垢剂,如 SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、 Sarkosyl等,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。 Kandula Suntha等人用 TritonX-100 来溶解 Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。
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另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇( DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM 2-BME或 DTT,也有文献使用 5mM浓度。在较粗放的条件下,可以使用 5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关,而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响,如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶,有时还原剂的使用也是必要的,可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
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三 .包含体蛋白复性方法1 包涵体蛋白复性方法 1.1 稀释复性和透析复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。
透析复性:好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成无活性蛋白质聚体,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模。
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1.2 含二硫键的蛋白的复性
1.3封闭蛋白的疏水蔟促进复性
1.4凝胶过滤层析复性
1.5 小分子添加剂促进的复性
1.6 分子伴侣或折叠酶促进的复性
1.7人工分子伴侣的复性
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2包涵体蛋白复性效率 复性是一个非常复杂的过程,除与蛋白质复性的过程控制相关外,还很大程度上与蛋白质本身的性质有关,有些蛋白非常容易复性,如牛胰 RNA酶有 12 对二硫键,在较宽松的条件下复性效率可以达到 95%以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如 IL-11,很多蛋白的复性效率只有百分之零点几,如在纯化 IL-2 时以十二烷基硫酸钠溶液中加入铜离子( 0.05%SDS, 7.5-30u mol/l CuCl2 )的方法, 25-37°C下反应 3小时,再 EDTA至 1m mol/l终止反应,复性后的二聚体低于 1%。一般说来,蛋白质的复性效率在20% 左右。
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2.1影响复性效率的因素: 2.1.1蛋白质的复性浓度:正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用,蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素,因而,一般浓度控制在 0.1-1mg/ml ;如果变性蛋白加入复性液中过快,容易形成絮状沉淀,可能是蛋白重新凝聚的缘故。所以我们采用再水浴和磁力搅拌下,逐滴加入变性蛋白,使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。
2.1.2pH 和温度:复性缓冲液的 pH值必须在 7.0以上,这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成,过高或过低会降低复性效率,最适宜的复性 pH值一般是 8.0-9.0 。 [12]
此外,影响复性效率的因素还有,变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
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2.3 复性效果的检测: 根据具体的蛋白性质和需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
2.3.1、凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质,或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2.3.2 、光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱( CD)等,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测,但一般只用于复性研究中的过程检测。
2.3.3、色谱方法:如 IEX、 RP-HPLC、 CE等,由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
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2.3.4 、生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好的反映了复性蛋白的活性,值得注意的是,不同的测活方法测得的结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。
2.3.5 、黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶性很差,大多形成可见的沉淀析出。
2.3.6 、免疫学方法:如 ELISA 、 WESTERN等,特别是对结构决定簇的抗体检验,比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
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第十二节 基因工程药物的质量控制
第十二节 基因工程药物的质量控制
是利用活细胞作为表达系统,产物的分子量较大,并有复杂的结构,还参与生理功能的调节,用量极微,任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。
是利用活细胞作为表达系统,产物的分子量较大,并有复杂的结构,还参与生理功能的调节,用量极微,任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。
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宿主细胞中表达的外源基因,在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化,故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。
宿主细胞中表达的外源基因,在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化,故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。
![Page 98: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/98.jpg)
一、 医药生物技术产品质量保证的一般性要点
1.产品安全性评价
2.产品本身的结构
3.严格控制条件
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二、 生物材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码药品的 DNA序列的正确性,重组微生物来自单一克隆,所用质粒纯而稳定,以保证产品质量的安全性和一致性。
二、 生物材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码药品的 DNA序列的正确性,重组微生物来自单一克隆,所用质粒纯而稳定,以保证产品质量的安全性和一致性。
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根据质量控制要求应了解以下 特性: ⒈明确目的基因的来源、克隆经过,并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证;
根据质量控制要求应了解以下 特性: ⒈明确目的基因的来源、克隆经过,并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证;
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⒉应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分(如复制子、启动子)的来源与功能,构建中所用位点的酶切图谱,抗生素抗性标记物;
⒊ 应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性;
⒉应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分(如复制子、启动子)的来源与功能,构建中所用位点的酶切图谱,抗生素抗性标记物;
⒊ 应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性;
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三、培养过程的质量控制 在工程菌的贮存中,要求种子克隆纯而稳定;
在培养过程中,要求工程菌所含的质粒稳定,始终无突变;
在重复生产发酵中,工程菌表达稳定;
始终能排除外源微生物污染。
在工程菌的贮存中,要求种子克隆纯而稳定;
在培养过程中,要求工程菌所含的质粒稳定,始终无突变;
在重复生产发酵中,工程菌表达稳定;
始终能排除外源微生物污染。
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生产基因工程产品应有种子批系统,并证明种子批不含有致癌因子,无细菌、病毒、真菌和支原体等污染,并由原始种子批建立生产用工作细胞库。
生产基因工程产品应有种子批系统,并证明种子批不含有致癌因子,无细菌、病毒、真菌和支原体等污染,并由原始种子批建立生产用工作细胞库。
![Page 104: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/104.jpg)
原始种子批须确证克隆基因DNA序列,详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期,保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。
原始种子批须确证克隆基因DNA序列,详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期,保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。
![Page 105: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/105.jpg)
对生产种子,应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料,并控制微生物污染;提供培养生产浓度与产量恒定性数据,依据宿主细胞 -载体系统稳定性,确定最高允许传种代数;
对生产种子,应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料,并控制微生物污染;提供培养生产浓度与产量恒定性数据,依据宿主细胞 -载体系统稳定性,确定最高允许传种代数;
![Page 106: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/106.jpg)
在培养过程中,应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征;依宿主细胞 -载体稳定性与产品恒定性,规定持续培养时间,并定期评价细胞系统和产品。
在培养过程中,应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征;依宿主细胞 -载体稳定性与产品恒定性,规定持续培养时间,并定期评价细胞系统和产品。
![Page 107: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/107.jpg)
培养周期结束时,应监测宿主细胞 -载体系统的特性,如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度,含插入基因载体的酶切图谱等。
培养周期结束时,应监测宿主细胞 -载体系统的特性,如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度,含插入基因载体的酶切图谱等。
![Page 108: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/108.jpg)
四、纯化过程的质量控制四、纯化过程的质量控制
产品要有足够的生理和生物学试验数据,确证提纯物分子批间保持一致性;外源蛋白质、DNA 与热源质控制在规定限度以下。
产品要有足够的生理和生物学试验数据,确证提纯物分子批间保持一致性;外源蛋白质、DNA 与热源质控制在规定限度以下。
![Page 109: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/109.jpg)
在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质,并有检测方法。
在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质,并有检测方法。
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四、目标产品的质量控制四、目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求 :产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。
基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求 :产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。
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五、目标产品的质量控制
基因工程药物质量控制主要包括:产
品的鉴别,纯度,活性,安全性,稳
定性和一致性
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1.生物活性测定 需通过动物体内试验和通过细胞培养 进行体外效价测定。
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2. 理化性质鉴定1)非特异性鉴别2)特异性鉴别3)相对分子质量测定 凝胶过滤法、 SD-SPAGE法
2. 理化性质鉴定1)非特异性鉴别2)特异性鉴别3)相对分子质量测定 凝胶过滤法、 SD-SPAGE法
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4 )等电点测定5)肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质 ,对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法,该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用 HPLC、毛细管电泳。
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6 )氨基酸组成分析 50 个氨基酸较理想7)部分氨基酸序列分析 N端 15 个氨基酸可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。
8)蛋白质二硫键分析测定方法有 : 对氯汞苯甲酸法等 5 , 5’-二硫基双 -2-硝基苯甲酸法
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3. 重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定
蛋白质浓度测定方法有 :福林 -酚法、双缩脲法
3. 重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定
蛋白质浓度测定方法有 :福林 -酚法、双缩脲法
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4. 纯度分析蛋白质含量测定 SDS-PAGE、等电聚焦、各种 HPLC、 毛细管电泳
5.杂质检测 ①蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法
②非蛋白类杂质
4. 纯度分析蛋白质含量测定 SDS-PAGE、等电聚焦、各种 HPLC、 毛细管电泳
5.杂质检测 ①蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法
②非蛋白类杂质
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②非蛋白类杂质非蛋白类杂质主要有 :病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及 DNA 。
②非蛋白类杂质非蛋白类杂质主要有 :病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及 DNA 。
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常用检测方法:
杂质和污染物 检 测 方 法
内毒素 鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白 免疫分析、 SDS-PAGE、 CE其它蛋白杂质 免疫分析、 SDS-PAGE、 HPLC、 CE残余 DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异 肽谱、 HPLC、 IEF、 CE甲酰蛋氨酸 肽谱、 HPLC、 IEF、 CE蛋氨酸氧化 肽谱、 HPLC、 质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGE、 IEF、 HPLC、 CE、质谱、
凝胶过滤
常用检测方法:
杂质和污染物 检 测 方 法
内毒素 鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白 免疫分析、 SDS-PAGE、 CE其它蛋白杂质 免疫分析、 SDS-PAGE、 HPLC、 CE残余 DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异 肽谱、 HPLC、 IEF、 CE甲酰蛋氨酸 肽谱、 HPLC、 IEF、 CE蛋氨酸氧化 肽谱、 HPLC、 质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGE、 IEF、 HPLC、 CE、质谱、
凝胶过滤
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杂质和污染物 检 测 方 法
单克隆抗体 SDS-PAGE、免疫分析氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质 谱、 CE微生物 微生物学检查支原体 微生物学检查病毒 微生物学检查
杂质和污染物 检 测 方 法
单克隆抗体 SDS-PAGE、免疫分析氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质 谱、 CE微生物 微生物学检查支原体 微生物学检查病毒 微生物学检查
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6.稳定性考查 是药品有效性安全性的重要指标,是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。
7.产品一致性的保证
6.稳定性考查 是药品有效性安全性的重要指标,是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。
7.产品一致性的保证
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六、产品的保存⒈液态保存⑴低温保存⑵在稳定的下保存⑶高浓度保存⑷加保护剂保存⒉固态保存
六、产品的保存⒈液态保存⑴低温保存⑵在稳定的下保存⑶高浓度保存⑷加保护剂保存⒉固态保存
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第十三节 基因工程药物制造实例第十三节 基因工程药物制造实例
干扰素( interferon , IFN )是人体细胞分泌的一种活性蛋白质,具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性,是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为 α、 β、 γ、ω等 4个类型。 α型干扰素在分为 α1b α2a α2b等亚型。
干扰素( interferon , IFN )是人体细胞分泌的一种活性蛋白质,具有广泛的抗病毒抗肿瘤和免疫调节活性,是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为 α、 β、 γ、ω等 4个类型。 α型干扰素在分为 α1b α2a α2b等亚型。
![Page 124: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/124.jpg)
一、基因工程菌的组建
诱生的白细胞 提取全 RNA 通过寡 dT-纤维素柱 蔗糖密度梯度 获得寡 A 的 mRNA 离心提取 12s 的 mRNA 逆转录成 cDNA 双链 cDNA接上 dT或 dG尾
pBR322 质粒 pBR322 质粒加上 dA 或 dC
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退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 扩增杂交质粒
筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌克隆 含干扰素 cDNA克隆
将干扰素 cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达
退火获的杂交质粒 转化大肠杆菌 扩增杂交质粒
筛选抗青霉素但对氨苄 用杂交翻译法挑选 青霉素敏感细菌克隆 含干扰素 cDNA克隆
将干扰素 cDNA克隆入表达载体 在大肠杆菌 中进行高效表达
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二、基因工程干扰素的制备二、基因工程干扰素的制备
启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提
精提 半成品制备 半成品检定 分装
冻干 成品检定 成品包装
启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提
精提 半成品制备 半成品检定 分装
冻干 成品检定 成品包装
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α2b干扰素生产过程1. 发酵 工程菌: SW-IFNα-2b/E.coli DH5α,质粒用启动子,含氨苄青霉素抗性基因。培养基含 1%蛋白冻 0.5%酵母提取物 0.5%NACl。摇床培养 30 C, 10h,发酵种子。 15L发酵罐培养, 30 C,8h。然后 42 C, 3h。离心去上清。
α2b干扰素生产过程1. 发酵 工程菌: SW-IFNα-2b/E.coli DH5α,质粒用启动子,含氨苄青霉素抗性基因。培养基含 1%蛋白冻 0.5%酵母提取物 0.5%NACl。摇床培养 30 C, 10h,发酵种子。 15L发酵罐培养, 30 C,8h。然后 42 C, 3h。离心去上清。
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2.产品的提取与纯化 湿菌超声破碎,离心,上清超滤浓 缩, Sephadex G50 分离。
经 SDS-PAGE检查。 在经 DE-52柱纯化。
2.产品的提取与纯化 湿菌超声破碎,离心,上清超滤浓 缩, Sephadex G50 分离。
经 SDS-PAGE检查。 在经 DE-52柱纯化。
![Page 129: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/129.jpg)
三、质量控制标和要求三、质量控制标和要求⒈半成品检定⑴干扰素效价测定⑵蛋白质含量测定⑶比活性⑷纯度测定⑸相对分子量测定
⒈半成品检定⑴干扰素效价测定⑵蛋白质含量测定⑶比活性⑷纯度测定⑸相对分子量测定
![Page 130: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/130.jpg)
⑹残余外源性 DNA 含量测定⑺残余血清 igG 含量测定⑻残余抗生素活性测定⑼紫外光谱扫描⑽肽图测定⑾等电点测定⑿除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。
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⒉成品检定⒉成品检定⑴物理性状⑵鉴别试验⑶水分测定⑷无菌试验⑸热原试验⑹干扰素效价测定⑺安全试验
![Page 132: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/132.jpg)
二 .人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
![Page 133: 第五节 基因工程菌生长代谢的特点](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061407/568145b8550346895db2c205/html5/thumbnails/133.jpg)
三 .人白细胞介素 -2