![Page 1: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/1.jpg)
Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа
микробного загрязнения
Федеральное государственное автономное образовательное учреждениевысшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»Институт фундаментальной биологии и биотехнологии
Кафедра биофизики
Кириллова Мария Александровна
Руководитель: к.б.н. Есимбекова Е. Н.
Красноярск 2012
![Page 2: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/2.jpg)
Микробная загрязненность - показатель санитарного качества продуктов питания, воды,
чистоты поверхностей
Методы определения микробного загрязнения:
1. Микробиологические2. Биолюминесцентный метод,
основанный на измерении АТP3. Биолюминесцентный метод,
основанный на измерении FMN
2
http://biotest-by.com/
![Page 3: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/3.jpg)
Цель
• Разработать метод анализа микробного загрязнения с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий, основанный на определении количества FMN в образце.
3
![Page 4: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/4.jpg)
Материалы и методыРеакционная смесь
• 0,05 М фосфатный буфер• комплекс ферментов
люцифераза - оксидоредуктаза• 0,0025% тетрадеканаль• 5*10-5 ÷10-3 М NADH• 5*10-8÷10-6 М FMN
Исследуемый объект
• Escherichia Coli (BL21 codon Plus (DE3) RIPL), выращенные в лаборатории Фотобиологии ИБФ СО РАН на среде LB без антибиотиков в течение 18 часов при 30ºС.
• Образцы бактерий исследовали в стационарной фазе роста.
• Оптическая плотность при λ=590 нм D=6,4; 1 ед.опт.пл.=5*108 клеток/мл
4Люминометр Lumat LB9507
h
NADH:FMN-oxidoreductase (R)
NAD(P)H + H+ + FMN NAD(P)+ + FMNH2
Luciferase (L)
FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2О + h
Колонии E. coli
![Page 5: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/5.jpg)
Калибровочная кривая для определения FMN
Максимальная чувствительность биферментной системы 1,2*10-9 М FMN 5
![Page 6: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/6.jpg)
Анализируемые образцы Escherichia Coli (штамм BL21)
Образец №1. Интактные клеткиОбразец №2. Клетки, разрушенные
ультразвуковым дезинтегратором при частоте 44 кГц
Образец №3. Надосадочная жидкость после
центрифугирования разрушенных клеток (5000 об/сек, 12 мин)
6
![Page 7: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/7.jpg)
Зависимость интенсивности свечения от количества бактериальных клеток (образец 2)
Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы составляет 3,9 млн. бактериальных клеток
7
![Page 8: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/8.jpg)
Зависимость интенсивности свечения от количества бактериальных клеток (образец 3)
Максимальная чувствительность биолюминесцентной системы составляет 5 млн. бактериальных клеток
8
![Page 9: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/9.jpg)
Сравнение с АТР-системой
Система светлячков
• Предел обнаружения АТР – 10 -14 М.
• Предел обнаружения бактериальных клеток – 1000 кл / мл
Бактериальная система
• Предел обнаружения ФМН -1,2 ·10 -9 М
• Предел обнаружения бактериальных клеток – 3,9 млн. кл /мл
9
![Page 10: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/10.jpg)
Санитарные правила и нормыГруппа продуктов Количество бактерий, КОЕ/г не
болееВода минеральная 100
Молоко 3*105
Мясо 103
Рыба свежая 5*104
Овощи 104– 5*105
Пиво 500
Мороженное 105
Масло сливочное 103 - 105
10
![Page 11: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/11.jpg)
Выводы
• Для анализа бактериальной загрязненности образец достаточно подвергнуть разрушению ультразвуковым дезинтегратором
• Предел обнаружения бактериальных клеток –3,9 млн. кл /мл
• Чувствительность метода ниже чувствительности АТР-системы на 3 порядка
11
![Page 12: Применение ферментативной системы светящихся бактерий для анализа микробного загрязнения](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070502/56813645550346895d9dbf10/html5/thumbnails/12.jpg)
Перспективы • Возможна разработка биолюминесцентного метода
анализа бактериальной загрязненности, основанного на измерении NADH
• Предварительно полученные результаты указывают на высокую чувствительность биолюминесцентного метода к NADH (до 1·10-13 М), что сравнимо с чувствительностью люциферазы светляков к АТФ
• В дальнейшем планируется для упрощения процедуры проведения анализа разработка иммобилизованного ферментного препарата
12