synthese von dl-mevalonsäure-5-pyrophosphat

I964 H. MACHLEIDT, E. COHNEN und R. TSCHESCHE 215

SYNTHESE VON DL-MEVALONSb;URE-5-PYROPHOSPHAT

von HANS MACHLEIDT, ERICH COHNEN und RUDOLF TSCHESCHE

Aus dem Organisch-Chemischen Institut der Universitit Bonn

Eingegangen am 28. Juni 1963

Aus 3-Hydroxy-3-methyl-A~-hexenyl-(l)-phosphat (11) wird iiber das Phosphor- amid 111 bzw. -morpholid 1V mit HSPOd/Pyridin in 42-proz. Ausbeute 3-Hydro- xy-3-methyl-A~-hexenyl-(l)-pyrophosphat (VII) dargestellt. Daneben entsteht durch intramolekulare Phosphorylierung einer tert.-Hydroxygruppe ein 1.3- Cyclophosphat (XI). Das ungesattigte 1 -Pyrophosphat liefert bei der Oxydation mit J O 4 e in Gegenwart katalytischer Mengen MnOJe ~~-Mevalonsaure-5-

pyrophosphat (IX). Die Kristallisation gelingt als Dibrucin-Salz.

Die Phosphorylierung von Mevalonsaure-5-phosphat (I) durch 5-Phospho-mevalonat-kinase ist der zweite Reaktionsschritt in der biologischen Umwandlung von Mevalonsaure in Squalen 1-4). Das gebildete Mevalonsaure-5-pyrophosphat wird durch 5-Pyrophospho-mevalonat-decarboxylase unter Dehydratisierung und Decarboxy- lierung in das Isopentenyl-pyrophosphat umgewandelt, das als ,,aktives Isopren" die Bildung der Polyisoprenoide einleitet 5,2,6). Die Charakterisierung von enzymatisch synthetisiertem I erfolgte bisher papierchromatographisch oder elektrophoretisch sowie durch das schwerlosliche Bariumsalz. Eine Synthese des Mevalonsaure-5-pyrophosphats stand bisher aus.

Die Darstellung von ~~-Mevalonsaure-5-phosphat (I) durch Oxydation von 3- Hydroxy-3-methyl-A5-hexenyl-( 1)-phosphat (11) mit JO40 in Gegenwart katalytischer Mengen Mn040 ist kurzlich gelungen7). Es war daher naheliegend, dieses Synthese- verfahren zur Darstellung von ~~-Mevalonsaure-5-pyrophosphat (IX) heranzuziehen.

Versuche, aus I durch Reaktion mit p-Cyan-ithylphosphat 8) in Gegenwart von Dicyclo- hexylcarbodiimid oder Trichloracetonitril als Kondensationsmittel und anschlieRende OHo- katalysierte Hydrolyse ~~-Mevalonsaure-5-pyrophosphat (IX) direkt darzuste Ilen, schlugen

1) U. HENNING, E. M. MOSLEIN und F. LYNEN, Arch. Biochem. Biophysics 83, 259 (1959). 2 ) K. BLOCH, S. CHAYKIN, A. H. PHILLIPS und A. DE WAARD, J . biol. Chemistry 234, 2595

3 ) H. R. LEVY und G . POPJAK, Biochem. J. 75, 417 (1960). 4) H. HELLIG und G. POPJAK, J. Lipid Res. 2, 235 (1961) [C. A. 55, 24850 (1961)l. 5 ) F. LYNEN, B. W. AGRANOFF, H. EGGERER, U. HENNINC und E. M. MOSLEIN, Angew. Chem.

6 ) F. LYNEN, H. EGGERER, U. HENNINC und I. KESSEL, Angew. Chem. 70, 738 (1958). 7) H. MACHLEIDT, E. COHNEN und R. TSCHESCHE, Liebigs Ann. Chem. 655, 70 (1962). 8) G . M. TENER, J. Amer. chem. SOC. 83, 159 (1961).

(1 959).

71, 657 (1959).

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fehl. Unter den zahlreichen Reaktionsprodukten wurde ~~-Mevalonsaure-3.5-cyclophosphat als Hauptprodukt identifiziert. Ebenfalls erbrachte die Reaktion des Silber- ode1 Tri-N- butyl-ammoniumsalzes von I mit Dibenzylphosphorsaurechlorid kein brauchbares Ergebnis.

Die Synthese des als Zwischenprodukt benotigten Pyrophosphats VIZ wurde nach dem Verfahren von CHAMBERS und KHORANA9) versucht und I1 in Form des Diammo- niumsalzes mit Ammoniak in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) umgesetzt. Die elektrophoretische und papierchromatographische Kontrolle der Reaktion zeigte die quantitative Umsetzung zu einem amorphen Phosphoramid 111 an. Die Umsetzung von I11 mit 10 Aquivv. Phosphorsaure in Dioxan oder Tetrahydrofuran brachte jedoch einen zunachst unerwarteten Verlauf. Als Hauptprodukt der in 30 Min. abgelaufenen Reaktion entstand das 1.3-Cyclophosphat XI. Das gesuchtePyrophosphat VII konnte nach Chromatographie an Kieselgel (Losungsmittelsystem Isopropyl- alkohol/Ammoniak/Wasser = 6 : 2 : 1) in nur 15-proz. Ausbeute als kristallines Tris- cyclohexylammoniumsalz isoliert werden.

VII verhalt sich bei der pH-Titration wie eine dreibasische Saure (Abb. 1); die pK-Werte*) [pKl = (0.96) *), pK2 = 2.1, pK3 = 6.41 entsprechen den pK-Werten der Pyrophosphorsaure [pK, = -(0.96), pK2 = 2.7, (1.50), pK3 = 6.8 (6.6), pK4 = 9.4 (9.611.

Abbildung I Titrationskurven von 3-Hydroxy-3-methyl-

As-hexenyl-( 1)-pyrophosphat (VII) und ~~-Mevalonsaure-5-pyrophosphat (IX)

I 0 2 4 ccm

0.1 n NaOH

Die Urnwandlung von III in das Cyclophosphat XI erfolgte ebenfalls in wagriger Losung durch Behandlung mit Dowex 50 (HQ-Form) oder bei Gegenwart katalytischer

* ) Die hier angegebenen pK-Werte wurden durch vergleichende Titration von Pyrophosphor-

9 ) R. W. CHAMBERS und H. G . KHORANA, J. Amer. chem. SOC. 80, 3749 (1958). saure ermittelt; in den Klammern sind die Literaturwerte angegeben.

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Mengen Saure in 58-proz. Ausbeute; daneben bildete sich das lineare Phosphat 11. Der Reaktionsweg 111 + XI, der unter Phosphorylierung einer tertiaren Hydroxy- gruppe ablauft, erscheint bemerkenswert, da Phosphorylierungen von Alkoholen durch Phosphoramidate normalerweise nicht stattfinden 10). Erst in Gegenwart von 1 Mol.

CH3 J & z - C 0 2 H c- s&- c H = c H 2 - &)%-;'I

H zc,o - h -" 4 'RI

H2C-o -P (0H)Z 4 4

0 0 0

H2Cb-P(OH)z

I I1 111: R' = H, R" = CH=CH2

,CHz-CHq IV: R',R' = , ,O,R" = CH=CH2

CH2-CH2 CH2- C H\z

CH2-CH2 v: R~,R ' = < ,o,R" = H

CHI

c (;SIOHCH~-RII QH + P- 0 -P( OH) 2 $ $ $ 4 0 0 0 0 0

H2CxO- P-0-P( 0H)z

IX VII: R" = CH=CH2 VI VIII: R" = H

X: R" = H XIII: R" = H XI: R" = CH=CHz XIV: R" = CH=CH2 XV: R" = CH=CHz XII: R" = €1

Pyridin-hydrochlorid als Protonendonator, konnte ein Phosphorsauremonoester- morpholid mit 50 Moll. Methanol zum Phosphorsaure-diester umgesetzt werden 11).

10) Lord TODD, Proc. chem. SOC. [London] 1962, 199. 11) J. G. MOFFATT und H. G. KHORANA, J. Amer. chem. SOC. 83, 649 (1961).

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Die giinstige sterische Anordnung der tertiaren Hydroxygruppe in I11 und die groBe Stabilitat des Cyclophosphats 7) XI erleichtern offenbar den nucleophilen Angriff der OH-Gruppe auf die protonierte P-N-Bindung in VI unter Bildung von XI.

Gleichfalls zeigte das in Gegenwart von DCC aus I1 und Morpholin in quantitativer Ausbeute hergestellte Morpholid IV, mit 10 Moll. Phosphorsaurell) in Tetrahydro- furan umgesetzt, Cyclisierung zu XI. Das gesuchte Pyrophosphat VII wurde in nur 25-proz. Ausbeute isoliert. Anwendung von Pyridin als Losungsmittel verlangsamte erwartungsgemafi die Protonen-katalysierte Reaktion, steigerte jedoch bei Reaktion mit 3 Moll. Phosphorsaure die Ausbeute an VII auf 29% und bei Reaktion mit 15 Moll. Phosphorsaure auf 42% d. Th.

Die intrarnolekulare Phosphorylierung uber ein Phosphoramidat der Struktur 111 bzw. IV ist eine allgemeine Reaktion. So entzog sich V zu 78% dem nucleophilen Angriff eines Phosphatanions unter Bildung des Cyclophosphats XII. Das Pyro- phosphat VIII wurde nur zu 22% d. Th. gebildet.

Das damit praparativ zugangliche Pyrophosphat VII konnte nun quantitativ rnit J04Q in Gegenwart katalytischer Mengen MnO4012) zum ~~-Mevalonsuure-5-pyrophosphat (IX) oxydiert werden. Nach Entfernen aller Kationen durch Dowex 50 (H@-Form) sowie des Jodats und Perjodats durch Silberoxyd gelang die Isolierung von IX als kristallisierendes Dibrucin-Salz in 76-proz. Ausbeute.

Die Titrationskurve von ZX (Abb. 1, S. 216) entspricht einer vierbasischen Saure rnit folgenden pK-Werten: pK1 = -*), pK2 = 2.5, pK3 = 4.5, pK4 = 6.6; pK3 entspricht dem Wert der Mevalonsaure (pK = 4.3). ZX bildet ein schwerlosliches Bariumsalz. Durch In H2S04 tritt bei 100" in

10 Minuten vollstandige Hydrolyse in Mevalonsaure-5-phosphat (I) und anorganisches Phosphat ein. Die papierchromatographischen und elektrophoretischen Eigenschaften von IX stimmen mit den in der Literatur l-4) angegebenen befriedigend iiberein.

Versuche, XIV direkt mit Morpholinophosphorsauredichlorid zii IV umzusetzen 13),

gelangen nicht. Unter den Reaktionsbedingungen entstand das Cyclophosphatmorpholid XV. Morpholide dieser Struktur sind im Gegensatz zu linearen Diesterphosphatmorpholiden gegen He-katalysierte Hydrolyse sehr bestandig. Kurze Behandlung mit 1 n H2S04 bei 100" lant XV unverandert, erst nach 2 Stunden bei 100" tritt Ringoffnung zum linearen Phosphat I1 ein.

*) Unter den Titrationsbedingungen nicht menbar. 12) R. U. LEMIEUX und E. VON RUDLOFF, Canad. J. Chem. 33, 1701 (1955)[ C. A. 50, 7717

13) W. MEISE, Dissertation Univ. Bonn 1963. (1 956)].

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B E S C H R E I B U N G D E R V E R S U C H E

Papierchromarographie: Alle Reaktionsschritte der Phosphorylierungen wurden papierchromatographisch mit den Losungsmittelgemischen A = Isopropylalkohol/konz. Ammo- niak/Wasser (6 : 1 : 3) bzw. B = Isopropylalkohol/konz. Ammoniak/Wasser (7 : 1 : 2) unter Zusatz von 5 % CC14 und C = tert.-Butylalkohol/Ameisensaure/Wasser (4 : 1 : 1.6) durch absteigende Chromatographie auf dem Papier 2043 b (SCHLEICHER & SCHULL) untersucht. Die Entwicklung der Chromatogramme erfolgte wie beschrieben7) ; RF-Werte in Tab. 1.

Hochspannungselektrophorese: Sie wurde mit dern Pherographen nach WIELAND und PFLEI- DERER 14) ausgefuhrt. Zur Trennung dienten 11 cm breite Papierstreifen 2043 b (SCHLEICHER & SCHULL) und 1.5 rn Pyridin/Acetat-Puffer (pH 6.2) sowie .5 m Glycin/Natronlauge-Puffer (pH 11.5). Die Laufzeit betrug 140 Min. bei 45-50 V/cm bzw. 100 Min. bei 38-40 V/cm.

Tabelle 1. RF- und Rp-Werte -

__

_ _ __._

Verbindung

H3P04

Methylphosphat P-Cyan-athylphosphat Mevalonsaure-5-phosphat (I) Mevalonsaure-1.3-cyclophosphat 3-Methyl-As-hexendiy1-(1.3)-

3-Methyl-butandiyl-( 1.3)-cyclo-

3-Hydroxy-3-methyl-A5-hexenyl-

3-Hydroxy-3-methyl-butyl-( 1)-

3-Hydroxy-3-methyl-A5-hexenyl-

3-Hydroxy-3-methyLA5-hexenyl-

Mevalonsaure-5-pyrophosphat (IX) 3-Hydroxy-3-methyl-butyl-( 1)-

3-Hydroxy-3-methyl-butyl-( 1)-

3-Hydroxy-3-methyl-A5-hexenyl-( 1)

H4P207

cyclophosphat (XI)

phosphat (XII)

(I)-phosphat (11)

phosphat

(1)-phosphatamid (111)

(1)-pyrophosphat (VII)

phosphatmorpholid (V)

pyrophosphat (VIII)

phosphatmorpholid (IV)

RF RF Syst. A Syst. B

RF RP RP Syst. C pH 6.2 pH 11.5

0.17 -

0.38 0.06 0.37 0.06 0.33 0.03 0.51 0.14 0.73 0.68

- -

0.70 0.56

0.52 0.31

0.46 0.18

- 0.50

0.46 0.20

0.22 - 0.79 0.65

0.37 0.08

- 0.76

0.47-0.54 - - -

- -

- -

0.64 1.10 - 1.20 - 0.80

- 0.90

- 0.69

- 0.77

0.64

- 0.90

0.30 1.17 - -

- 0.58

-

0.92 ~

-

1.06

0.62

0.66

0.74

0.78

-

-

0.70

0.80 0.44

-

0.48

14) TH. WIELAND und G. PFLEIDERER, Angew. Chem. 67, 257 (1955).


Amid von 3-Hydroxy-3-methyl-A~-hexenyl-(I)-phosphat (111). - Eine waBrige Losung von 3.06 g (7.5 mMol) Bis-cyclohexylamnioniumsalz von 117' wurde iiber Dowex 50 (Ha-Form) filtriert, mit Ammoniak neutralisiert und i. Vak. eingedampft. Der Ruckstand wurde in 15 ccm 2n NH3 aufgenommen, mit einer Losung von 7.72 g (37.5 mMol) Dicyclohexylcarbo- diimid in 75 ccm tert.-Butanol versetzt und im geschlossenen GefaB auf 85" erwarmt. Nach 20stdg. Reaktion, Erkalten, Abfiltrieren des abgeschiedenen Dicyclohexylharnstoffes und Abdampfen des Losungsmittels i. Vak. blieb amorphes 111 zuruck, das zum Entfernen von Wasser 3 ma1 mit je 50 ccm absol. Benzol eingedampft und schlieBlich in 50 ccm absol. Tetra- hydrofuran aufgenommen wurde. Das so dargestellte Amid war papierchromatographisch und elektrophoretisch einheitlich.

Morpholid von 3-Hydroxy-3-methyl-A~-hexen~~I-(I)-phosphnt (IV). - 5.71 g (14 mMol) Bis- cyclohexylammonium-Salz von 117) wurden rnit Dowex 50 (He-Form) in die Saure und nach Zugabe eines Uberschusses Morpholin sowie Eindampfen der Losung i. Vak. in das Morpho- linium-Salz von 11 iibergefuhrt. Die L.osung des Riickstandes in 250 ccm tert.-Butanol wurde sodann mit 6.09 g (70 mMol) Morpholin und 14.4 g (70 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 3 Stdn. bei 90" gehalten. Das Papierchromatogramrn und das Elektropherogramm zeigten die vollstandige Umsetzung von TI in IV an. Nach Abdestillieren des Losungsmittels i. Vak., Versetzen des Ruckstandes rnit Wasser, Abfiltrieren des abgeschiedenen Dicyclo- hexylharnstoffes und Eindampfen des Filtrates blieb ein Sirup zuriick, dessen Kristallisation als Morpholiniurn-, Cyclohexylammonium- oder Ammoniumsalz nicht gelang. Zur weiteren Umsetzung wurde wie voranstehend beschrieben in 50 ccm absol. Pyridin aufgenommen.

3-Hydroxy-3-methyl-A5-hexenyl- (I)-pyrophosphat (VII). - a) Die voranstehend erhaltene Losung von I l l in Tetrahydrofuran wu,de zu einer Losung von 7.35 g (75 mMol) krist. Phosphorsuure in 25 ccm absol. Tetrahydrofuran getropft. Nach 2-3 stdg. Reaktion zeigte die papierchromatographische Kontrolle einer Probe nach Neutralisation rnit Ammoniak vollstandigen Umsatz von I11 an. Nach dem Abdestillieren des Losungsmittels i. Vak., Aus- fallen des anorganischen Phosphats mit 50 ccni Isopropylalkohol/konz. Ammoniak/Wasser (6 : 2 : I ) , Ausziehen des unloslichen Ammoniumphosphats mit dem gleichen I. osungsmittel- gemisch und Eindampfen der vereinigten Filtrate blieben 6.05 g Sirup (aus VII und XI beste- hend) zuriick. Er wurde in 15 ccm des obigen Losungsmittelgemischs gelost und an 100 g Kieselgel (0.2 mm, ungesiebt) mit dem gleichen Losungsmittel chromatographiert (Saulen- groBe 28 x 390 mm, FraktionsgroBe 15 ccn ) : Die Fraktionen 6 - 1 0 enthielten 4.75 g Ammo- niumsalz des Cyclophosphats X I neben Spuren I 1 und 111. Die Frakrionen 11-30 ergaben 465 mg wasserunloslichen Dicyclohexylharnstoff sowie nach Eindampfen des wlBrigen Aus- zuges und Versetzen mit einem UberschuB gesattigter Ba(OH)z-Losung 460 mg (14%) schwerlosliches Bariumsalz von VII. Nach Behandlurig rnit einer waBrigen Aufschllmmung von Dowex 50 (He-Form) enthielt das Filtrat eine papierchromatographisch und elektrophoretisch rnit VII (nach b) identische Suhstanz.

b) 4.20 g (42 rnMo1) krist. fhosphorsuure wurden in 50 ccm absol. Pyridin nach Zusatz von 7.77 g (42 mMol) Tri-n-burylamin unter Riihren gelost und sodann mit einer Losung von 14 mMol I V in 50 ccm absol. Pyridin versetzt. Nach dreitagiger Reaktion war die Umsetzung von IV beendet. Abdestillieren des Losungsmittels i. Vak., Extraktion des Riickstandes mit 20 ccm Isopropylalkohol/Ammoniak/Wasser (6 : 2 : I ) , Abtrennen des ungelosten anorganischen Phosphats und Chromatographie an 120 g Kieselgel (SaulengroBe 27 x 600 mm,

I964 Synthese von ~~-Mevalonsaure-5-pyrophosphat 221

FraktionsgroBe 10 ccm) ergab aus den Fraktiorren 17-27 nach dem Abdestillieren des Lo- sungsmittels 6.5 g Ammoniumsnlz X I neben Spuren 11 und IV. Nach Behandlung rnit Dowex 50 (Ha-Form) wurden durch Titration rnit 1 n NaOH 10.6 mMol (763:) X I ermittelt. Der Ruckstand der Fruktionen 30- 150, papierchromatographisch und elektrophoretisch VII enthaltend, wurde in wenig Wasser gelost, uber Dowex 50 (Ha-Form) filtriert und nach dem Waschen mit Wasser mit 0.1 n Cyclohexylumi/z-Losung titriert (Verbrauch 3.8 mMol, 27 "/). Nach dem Abdampfen des Losungsmittels i. Vak. ergab die Umkristallisation des Ruck- standes aus Wasser unter Zusatz von Aceton und einigen Tropfen Cyclohexylamin 2.18 g (24 %) Tris-cyclohexylammoniumsulz-trihydrat von VZI (aus der Mutterlauge kristallisierten weitere 150 mg, 2%); Schmp. 110--115".

C7H1608P~.(C6H13N)3.3 H20 (641.7) Ber. C 46.80 H 9.58 N 6.55 P 9.65 Gef. 46.54 8.89 6.65 9.56

c) Eine Losung von 2 mMol I V in 10 ccm absol. Pyridin wurde mit 2.94 g (30 mMol) krist. Phosphorsiiure und 5 . 5 5 g (30 mMol) Tri-n-butylumin in 60 ccm absol. Pyridin 6 Tage bei 20" stehengelassen. Die Trennung der Reaktionsprodukte erfolgte, wie voranstehend beschrieben, durch Chromatographie an 45 g Kieselgel. Die Fruktionen 7- -13 enthielten XZ neben geringen Mengen 11, die Fruktionen 23-60 nach Behandlung mit Dowex 50 (Ha-Form) und Titration rnit 0.1 n Cyclohexylamin 42% d. Th. an VII. Nach dem Umkristallisieren aus Aceton/Wasser wurden 450 mg (35 %) Tris-cyclohexylammonium-Salz von VIZ isoliert; Schmp. 110- 114".

~~-Mevalonsiiure-5-pyrophosphat (IX). - 641 mg ( I mMol) Trih-cyclohexylammoniumsalz- trihvdrut von VIZ, 1.71 g (8 mMol) Natriunrperjodat und 22 mg KMnO4 wurden in 300 ccm dest. Wasser unter Zusatz von 2n NaOH gelost, so daB der pH-Wert 7.7 betrug. Nach l0stdg. Reaktion zeigte die papierchromatographische Kontrolle vollstandige Oxydation von VII an. Die rotviolette Losung wurde i. Vak. auf 100 ccm eingeengt, durch Filtration uber Dowex 50 (Ha-Form) von Na@-Ionen befreit und zum Entfernen von Jodat und Perjodat mit 3.2g frisch gefalltem Silberoxyd geschiittelt. Nach Abfiltrieren des Niederschlages und Waschen mit Wasser, bis sich IX im Waschwasser nicht mehr nachweisen lieB, wurde das saure Filtrat nochmals uber Dowex 50 (Ha-Form) filtriert, rnit 860 mg (2 mMol) Brucin.2 H20 versetzt und i. Vak. eingedampft. Der Ruckstand ergab nach dem Losen in wenig Wasser und Versetzen niit Aceton bis zur Triibung 552 mg kristallisiertes Dibrucin-Salz.6 H20 von I X ; Schmp. 173-175". Aus den Mutterlaugen wurden weitere 363 mg (Gesamtausbeute 76%) isoliert. Zur Analyse wurde i. Hochvak. bei 40" getrocknet. Gewichtsverlust fur 6 H20 gef. 9.10, ber. 8.96%.

C6H14010P2.[C21H?"02N2(OCH3)2]2 (1097.0) Ber. C 56.93 H 6.06 N 5.11 P 5.65 Gef. 56.72 6.40 5.07 4.80

3-Hydroxy-3-methyl-butyl- (1)-phosphat. - 520 mg (5 m Mol) 1.3-Dihydrox)~-3-methyI-butan (X), 10 ccm /3-Cyan-athylphosphut-Los~ing7) und 3.60 g (25 mMol) Trichloracetonitril wurden in 10 ccm absol. Pyridin gelost und unter Ruhren 4 Stdn. auf 75" erwarmt. Nach Abdestil- lieren des Losungsmittels i. Vak. blieb ein braunes 0 1 zuruck, aus dem nach Zusatz von Wasser Trichloracetamid kristallisierte. Nach dem Filtrieren und Waschen niit Wasser wurde das Filtrat mit 120 ccm 0.2n Ba(OH)2 5 Min. zum Sieden erhitzt und nach dem Erkalten zur Abtrennung von ausgeschiedenem Bariumphosphat erneut filtriert. Nach dem Einengen des Filtrates i. Vak. wurde mit 2n H2SO4 angesauert und zum Entfernen geringer Mengen


CP-Ionen rnit ca. 150 mg frisch gefalltem Silberoxyd geschuttelt. Das Filtrat ergab nach Ent- fernen restlicher Ag-Ionen durch Dowex 50 (Ha-Form) und Eindampfen rnit uberschussigem Cyclohexylarnin i. Vak. einen krist. Ruckstand. Aus Wdsser/Aceton kristallisierten 870 mg (46 %) ; die Mutterlauge ergah weitere 380 mg (20 %) Bis-cyclohexylammonium-Salz vom Schmp. 170-175".

C ~ H I ~ O ~ P . ( C ~ H ~ ~ N ) Z (382.5) Ber. C 53.39 H 10.28 N 7.32 P 8.10 Gef. 54.06 10.53 7.33 8.29

3-Hydroxy-3-methyl-butyl-(I)-pyrophosphat (VIII). - Eine wal3rige Losung von 293 mg (0.7 mMol) Bis-cyclohexylammoniuni-Salz von 3-Hydroxy-3-methyl-butyl- ( I ) -phosphat wurde uber Dowex 50 (H@-Form) filtriert und nach Zusatz von Morpholin i. Vak. eingedampft. Der Ruckstand, in 50 ccm tert.-Butanol geltist, wurde 4 Stdn. bei 95" rnit 304 mg (3.5 mMol) Morpholin und 722 mg (3.5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Er ergab, wie voranstehend beschrieben, ein papierchromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Morpholid, das in 5 ccrn absol. Pyridin rnit 206 mg (2.1 mMol) Phosphorsiiure in 5 ccm absol. Pyridin unter Zusatz von 388 mg (2.1 mMol) Tri-n-butylamin 72 Stdn. bei 20" behandelt wurde. Die Aufarbeitung erfolgte wie bei VII (S. 220) beschrieben. Sie erbrachte nach der Chromatographie an 45 g Kieselgel aus den Fraktionen 10-12 bei Behandlung rnit Dowex 50 (Ha-Form) und Titration rnit 0.1 n Cyclohexylamin papierchromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Cyclohexylphosphat X117) in 78-proz. Ausbeute. Die Aufarbeitung der Fraktionen 50- 75 ergab nach der Titration rnit 0.1 n Cyclohexylamin 22 % d. Th. Pyrophosphat. Aus Wasser/Aceton wurden 1 10 mg kristallisiertes Tris-cyclohexylammonium- Salz von VIlI vom Schmp. 137-140" erhalten.

C5H,408P2.(C6H13N)3.3 H20 (615.7) Ber. C 44.86 H 9.63 N 6.82 Gef. 44.61 9.51 6.87

Morpholid von 3-Methyl-butandiyl- (1.3)-cyclophosphat (XIII). - 2.08 g (20 mMol) 1.3-Di- hydroxy-3-methyl-butan (X) in 10 ccm absol. Pyridin wurden bei 0" langsam rnit 4.08 g (20 mMol) Morpholino-phosphorsiiuredichloridl5) in 10 ccm absol. Pyridin versetzt. Nach 20stdg. Stehenlassen bei 20", Zusatz von AtherlBenzol und Abfiltrieren von Pyridin-hydrochlorid ergab das i. Vak. eingedampfte Filtrat 4.7 g oligen Ruckstand. Zur Reinigung wurde i. Hochvak. (Bad 140') destilliert. Das ubergehende hellgelbe 0 1 kristallisierte in der KLlte.

C ~ H I ~ N O ~ P (235.2) Ber. C 45.96 H 7.71 N 5.95 Gef. C 45.70 H 7.79 N 6.40

Morpholid von 3-Methyl-A5-hexendiyl-(1.3)-cyclophosphat (XV). - Wie bei XI11 beschrieben, wurden 1.3 g (10 mMol) X1V7) in 10 ccm absol. Pyridin bei 0" rnit 2.04 g (10 mMol) Mor- pholino-phosphorsauredichlorid in 10 ccm Pyridin umgesetzt. Die Aufarbeitung erbrachte 2.6 g gelbes 01, das i. Hochvak. (Bad 190") in einer Kurzwegapparatur destilliert wurde; Sirup, der nicht kristallisierte.

CllHzoN04P (261.3) Ber. C 50.57 H 7.72 N 5.36 Gef. C 50.60 H 7.73 N 5.13

15) P. MALATESTA und B. TARANTINO, 11 Farmaco [Pavia] Ed. sci. 10, 15 (1955) [C. A. 50, 1827 (1956)l.

synthese von dl-mevalonsäure-5-pyrophosphat

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