改変型dnaメチル化酵素および それを用いたdnaメチル化解 …...bs-seq...
TRANSCRIPT
1
改変型DNAメチル化酵素およびそれを用いたDNAメチル化解析法
神奈川工科大学応用バイオ科学部
応用バイオ科学科
教授 飯田 泰広
2019年8月27日
クロマチンへの後天的な修飾により遺伝子発現が制御されることに起因する遺伝学的あるいは分子生物学的事象
Gene
expression
gene
silencing
5’ CG 3’
3’ GC 5’
5’ CG 3’
3’ GC 5’
5’ CG 3’
3’ GC 5’
5’ CG 3’
3’ GC 5’
5’ CG 3’
3’ GC 5’
Dnmt1
エピジェネティクスとは
DNAメチル化の維持と遺伝子発現
◎がん関連DNAのメチル化異常： 大腸がん、肝がん、前立腺がん、急性骨髄性白
血病、 乳がん、肺がん、膀胱がん などヒストン修飾異常： 前立腺がん、乳がん、膀胱がん、胃がん、
肺がん、肝がん、 腎がん、ろ胞性リンパ腫、神経芽細胞腫 など
◎その他： 糖尿病、高血圧、アレルギー性疾患、神経変性疾患、精神疾患、脂肪細胞機能の変化 など
メチル化解析
・正確な診断ができる・基礎研究・薬剤開発・再生医療
エピジェネティクスと病気
ATGGTTCACGTAGTACCC
m
ATGGTTCACGTAGTACCC
m
ATGGTTCACG TAGTACCC
m
ATGGTTCACGTAGTACCC
m
ATGGTTCACGTAGTACCC
m
ATGGTTCACGTAGTACCC ATGGTTCAUGTAGTACCC
切断（メチル化感受性制限酵素）
変換（バイサルファイト処理）
濃縮（メチル化CpGに特異的に結合するタンパク質）
エピジェネティクスの解析法１
エピジェネティクスの解析法2
Hpa II 消化
アダプター付加
Msp I 消化(Hpa II のアイソシゾマー)
PCR
MIAMI法 メチル化DNA免疫沈降法(MeDIP法)
6
エピジェネティクスの解析法3
メチル化の位置を特定できるのはバイサルファイトシークエンスのみ
ACGTTAmCGGTmCGA
AUGTTA CGGT CGA
ATGTTA CGGT CGA
Sequence
Sodium
bisulfite
Unmethylated region Methylated region
C is converted to U mC isn’t converted
U is readed as T mC is readed as C
Bisulfite sequencing (BS-seq)
非メチル化領域 メチル化領域
シトシン→ウラシル シトシンのまま
チミンとして検出 シトシンとして検出
○●●
バイサルファイトシークエンスの原理
7～9割 3～1割
① DNAの断片化
②ヒドロキシメチル化についてもメチル化と同様に変換される
バイサルファイト処理の問題点
: unmethylated (C)
: methylated (mC)
: hydroxymethylated (hmC)
BS-seq
● ● ○
・鋳型量が必要 → シングルセルでは困難
・ヒドロキシメチルは生物的には非メチルと同義 → 誤った解析結果
単一細胞
新規メチル化解析法
メチル化解析
メチル化DNAの種類
Takeshita K., et al,PNAS, 108(22),
9055-9059 (2011)
Dnmt1
polymerase
PCR(DNA増幅)
Dnmt１
DNAメチル化
新規メチル化ＤＮＡ解析法の提案
755－1616BAH1―MTase
BAH1 BAH2 Catalytic domain
163－1616PCNA binding
domain―MTase
BAH1CXXCRFTS BAH2 Catalytic domain
384－1616RFTS―MTase
BAH1CXXCRFTS BAH2 Catalytic domain
646－1616CXXC-MTase
BAH1CXXC BAH2 Catalytic domain
1－1616Full-length
16161139 Catalytic domain
ⅠⅣⅥ Ⅶ ⅨⅩ
TRDKG repeat
1
PCNA binding domain
BAH2BAH1CXXCRFTS
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000*
***
*
RLU
: p<0.05, : p<0.01***646-1616 of hDnmt1
was able to reduce de novo activity
CG / CG CG / mCG CG / hmCG
Ｄｎｍｔ１のサブクローニングと活性評価
hemi-mCG
DNA
hemi-mCG
DNA
Unmethylated
CG DNA
Zhang ZM., et al, J Mol Biol., 427(15):2520-31(2015)
BAH1,2
Active site
TRD
RFTS
CXXC
・DNA CG
BAH1,2
Active site
TRD
・RFTS
CXXC
BAH1,2
Active site
TRD
CG
・DNA
RFTS
CXXC
+
hDnmt1
646-1616
1 20
N=1
N=6
N=2
N=3
N=4
N=5
1 20
N=1
N=6
N=2
N=3
N=4
N=5
1 20
N=1
N=6
N=2
N=3
N=4
N=5
: 0 %
: 0 %
: 100 %
+
hDnmt1
646-1616
+hDnmt1
646-1616
+hDnmt1
646-1616
MLH1 CpG island, CG 20 / 384 bp
1 20HeLa
gDNAPCR
Construction
of plasmid
M.SssI(CpG Methyltransferase)
0
組換えＤｎｍｔ１の機能評価
① Denaturation &
primer annealing
② Extension
③ ExonucleaseⅠtreatment
④ hDnmt1
(646-1616)
treatment
⑤ Bisulfite
conversion
⑥ PCR &
sequencing
T C T
ヒドロキシメチル化部位を特定可能
Mix
White cells Black cells
100
cells
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
*
*White
Black
Rel
. to
whi
te
Gen
e ex
pres
sion
leve
ls
: p<0.05*
Novel methodⅠ+ BS-seq
n=1
n=2
n=3
n=4
n=5
n=6
BS-seq
n=1
n=2
n=3
n=4
n=5
n=6
mRNA → Real-time PCR
gDNA → BS-seq
MITF-M promoter Black (100 cells)
White (100 cells)
1 8
41
Black (100 cells)
White (100 cells)
Tyrosinase promoter
(CG 4 / 547 bp)
(CG 8 / 316 bp)
BlackExpression
WhiteSuppression
組換えＤｎｍｔ１の新規メチル化評価法への適用
メラノーマ細胞での発現量 メチル化の評価
従来法では正しく評価できていない可能性
14
実用化に向けた課題
• ヒドロキシメチル化を排除してメチル化を解析することは可能となっている。
• しかし、メチル化の維持とPCRは別ステップで行っている。
15
変性
アニーリング
伸長
メチル化の維持
今後の展開マイクロ流路と組み合わせた新規メチル化評価法
(株)ASICONのHPより
課題・流路への
DNAポリメラーゼ と組換えDnmt1の固定化
16
想定される用途
• ヒドロキシメチル化の影響を受けないDNAのメチル化解析。
• 鋳型量の少ないサンプルのDNAメチル化解析（神経細胞などの難組織培養細胞含む）
• エピジェネティック創薬
17
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 ：メチル化酵素及びそれを用いた
メチル化解析方法
• 出願番号 ：特願2019-027858
• 出願人 ：神奈川工科大学
• 発明者 ：飯田泰広、前田翔大
18
産学連携の経歴
• 2007年-2008年 産業技術総合研究所の受託研究
• 2009年-2011年 ジュジュ化粧品(株)と共同研究実施
• 2017年-2019年 磐田化学工業(株)と共同研究実施
