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DNA 손상에 의한 ATM 활성화와
H2AX 작용기구 해석
강종석․이 재
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머 리 말
21세기는 지식과 정보가 그 국가의 경쟁력을 좌우하는 지식
기반 산업사회로 나아가고 있으며, 최고가 아니면 살아남을
수 없는 무한경쟁시 가 되어가고 있습니다. 이러한 변화 속
에서 각 국가에서는 미래 유망기술(Emerging Technology)을
선정하여 국가 역량을 집 함으로써 차세 국가경쟁력을 확
보하려는 여러 가지 노력을 기울이고 있습니다.
최근 우리나라에서도 미래 유망기술에 한 심이 어느 때
보다도 증 되고 있는 가운데, 한국과학기술정보연구원에서는
과학계량학 인 방법으로 미래 국가 유망기술을 측하기
한 일련의 연구를 수행하고 있습니다.
본 보고서는 과학기술정보데이터베이스(SCIE)에서 최근 6
년간 분야별 피인용도가 높은 핵심논문들을 가지고 정보계량
학 인 분석을 행하여 선정된 핵심 유망 연구 역에 해
련 국내 문가들의 자문을 토 로 작성된 R&D 동향보고서입
니다. 본 보고서가 련 과학기술정보를 국내에 확산시키고,
미래 국가유망기술의 략 육성을 한 연구개발 활동에 작
으나마 도움이 되었으면 합니다.
마지막으로 본 보고서를 집필한 자들의 노고에 감사드리
며, 본고의 내용은 한국과학기술정보연구원의 공식의견이 아
님을 밝 둡니다.
2005년 12월
한국과학기술정보연구원
원 장
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ⅰ
목 차
제1장 서 론 ······················································································1
1. 연구의 배경 ·····························································································1
2. 연구의 방법 ·····························································································2
제2장 기술의 개요 ·············································································3
제3장 H2AX의 역할 ·········································································7
1. double-strand break 치로의 γ-H2AX와 repair factor의
colocalization ···························································································7
2. IR이후 repair factor의 순차 결합 ······················································8
3. DNA damage 후 foci로의 Brca1 recruitment ······································9
4. wortmannin은 radiation-induced foci 형성을 해한다. ····················11
5. repair-deficient cell에서의 γ-H2AX foci 형성 ····································12
제4장 분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한 ATM 활성화 ····15
1. IR에 의한 ATM의 자동인산화 ····························································15
2. active monomer로의 ATM의 분리 ·····················································18
3. ATM 활성화에 련된 세포내 신호 ···················································19
제5장 DNA strand break에 의한 ATR 활성화 ·························23
제6장 결론 제언 ·········································································25
참고 문헌 ··························································································29
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ⅲ
그림 목차
<그림 1> DSB에 의해 유발되는 ATM고 ATR의 활성화 ·························24
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1
제1장
서 론
1. 연구의 배경
○ 21세기 지식기반사회에서 과학기술경쟁력은 국가경쟁력
의 원천이며, 이에 세계 각국들은 미래의 경쟁에 살아남
기 해 핵심기술과제를 선정하여 연구개발에 박차를
가하고 있음.
○ 우리나라 과학기술부도 2005년 6월 ‘미래국가유망기술
원회’를 구성하여 ‘과학기술 측조사(2005-2030)’ 결과
(2005년 5월, 국가과학기술 원회 보고)에서 도출된 기
술후보군을 바탕으로 『미래 국가유망기술 21』을 선정
하여 발표한 바 있음.
○ 한 한국과학기술정보연구원(KISTI)에서는 2005년 SCIE
논문데이터베이스를 이용한 정보계량학 분석을 통해
『미래 유망연구 역 선정연구』를 시도하 으며, 본 보고
서는 그 결과에 기 하여 최근 2~3년간 논문의 인용도가
속히 높아지고 있는 유망 연구 역을 심으로 기술논
평 형식으로 풀이한 심층 Expert Review임.
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2 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
2. 연구의 방법
○ 한국과학기술정보연구원에서는 SCIE 데이터베이스에 등
록된 논문(1999~2005년 상반기까지 발표된 논문) 에
서, 각 연도 각 분야별( 분류 22분야)로 피인용수
가 상 1%인 고인용 논문(HCP; Highly cited papers)
을 추출하고 공인용분석(Co-citation analysis) 동시단
어분석(Co-word analysis) 등의 과학계량학 방법들과
문가 평가(Expert evaluation)를 통해 ‘미래 유망연구
역’을 도출하 음.
○ 상기 도출된 미래 유망연구 역 에서 통계학 방법으
로 최근 논문의 인용도가 격히 상승하는 연구 역을
과학기술 분야별로 추출하여 본 테크이슈 보고서의 주제
로 삼았음.
○ 본 보고서는 DNA damage에 의한 ATM 활성화와
H2AX 작용기구 해석에 있어서 최근 많이 발표되고 있
는 논문들을 종합하여 련 분야 연구에 한 기 지
식과 함께 세계 인 연구동향을 개 으로 살펴보고,
미래 핵심기술로 자리잡기 한 연구개발 략을 제시
하 음.
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3
제2장
기술의 개요
○ 진핵세포에서 double-strand break이 발생하게 되면 다
양한 반응이 일어나는데 즉 cell cycle arrest, DNA
repair factor의 재배치 혹은 apoptosis등이 일어난다. 세
포내 기능을 arrest하지 않는다면 게놈의 불완 성이 크
게 증가하며 발암에도 계된다. DNA repair나 damage
존재에 한 신호 달에 계하는 것으로 알려진 여러
factor가 double-strand break 이후 커다란 nuclear
domain(foci)에 축 되게 된다(1-6).
○ 를 들어 Mre11-Rad50-Nbs1(MRN) complex가 ionizing
radiation(IR)에 노출된 후에 형성되며(1) 이들 foci는
damage를 받은 DNA가 포함되는 부분에 치하게 된다(7).
Saccharomyces cerevisiae에서도 Mre11-Rad50-Xrs2
complex가 non-homologous end joining(11,12), meiotic
recombination(9,10,13)
, telomere 유지(14-16)
뿐만 아니라 IR
노출에서도 기능하며(8-10)
homologous recombination에서
도 기능한다(17,18). MRN complex는 exo-와 endonuclease
활성을 가지고 있는데 이를 통해 double-strand break의 repair
과정에서 DNA end processing을 담당하게 된다(19-21)
.
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4 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
○ 진핵생물의 RecA homolog인 Rad51은 DNA damage 후
single-stranded DNA에 foci를 형성하고 MRN과 달리 S
phase동안 비처리된 세포에서도 foci를 형성한다(22)
. 흥
미롭게도 Rad50 foci와 Rad51 foci는 damage후에 동일
한 세포에서는 거의 발견되지 않는데(1,23) 이는 상호 배
타 인 repair과정이 존재함을 의미한다. Brca1 tumor
suppressor gene 생성물은 Rad50 혹은 Rad51과는 별도
로 모이게 되는데 이를 통해 DNA double-strand break
repair에 Brca1이 기능한다는 것을 상할 수 있다(4,23)
.
○ double-strand break가 일어나게 되면 제일 처음 세포내
에서 일어나는 반응 하나는 진핵세포의 세 종류의
H2A 분자의 하나인 H2AX의 인산화이다(24)
. H2AX의
독특한 C-terminal tail에 존재하는 Ser 139이 damage
후 1-3분 안에 인산화 되며 인산화 된 H2AX 분자의 수
는 damage가 심할수록 그에 비례하여 증가한다.
double-strand break를 도입할 경우에는 이러한 반응이
일어나나 다른 종류의 damage 즉 UV 조사에 의해서는
일어나지 않는다. 인산화 된 형태의 H2AX(γ-H2AX)에
특이 인 항체가 최근 생산되어 이를 이용하여 γ-H2AX
는 DNA damage가 일어난 치의 chromatin domain에
치함을 알게 되었다(25)
.
○ double-strand break가 일어난 후 H2AX의 특이 인 변형
은 매우 빠르게 일어나는데 이 게 인산화 된 분자의 foci
가 시간 으로는 훨씬 뒤에 찰되는 repair factor의 foci와
련이 있는지 여부를 연구하 다. 그 결과 핵에서 형성되
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제2장 기술의 개요 5
는 γ-H2AX 분자의 기 패턴이 후의 recovery과정에서 발
견되는 damage-induced foci의 Rad50과 Rad51의 패턴과
일치하 다. Brca1 역시 recruit되는데 그 시기는 두 종
보다 선행하 다. kinase inhibitor wortmannin을 사용해
H2AX 인산화를 방해하거나 kinase가 결핍된 cell line을 사
용하여 인산화 된 H2AX가 DNA damage 후 repair factor
에 의한 foci 형성 개시에 기능한다는 것과 H2AX 활성화에
phosphoinosite(PI)-3 kinase가 계한다는 것을 밝 냈다.
○ 인간 질병 ataxia-telangiectasia(AT)에서 돌연변이 되어
있는 유 자인 ATM은 DNA에 double-strand break를
일으키는 방사선이나 기타 약제에 노출된 후에 나타나는
포유류 세포의 신호 달과정 개시에 요하다(26,27)
. AT
환자의 세포에는 개 ATM 단백질이 결핍되어 있으며
telomere morphology상의 비정상이 보이고 IR에 비정상
인 반응을 보여 세포사 증가, chromosome break 증가,
cell-cycle checkpoint 결함이 나타난다(28). 더욱이 AT
환자는 진 인 소뇌 기능장애, 면역결핍, 생식능력 감
퇴, 방사선 민감성, 조로, 암 험 증가를 겪게 된다.
○ ATM 유 자는 지질보다는 단백질을 주로 인산화 시키
는 phosphoinositide 3-kinase(PI(3)K) superfamily(29,30,31)
에 속하는 370kDa크기의 단백질을 encoding한다. 이 거
단백질 C-terminal에 치한 350개의 아미노산으
로 된 kinase domain이 ATM의 주된 기능을 담당한다.
세포가 IR에 노출되면 ATM kinase 활성이 나타나며 이
기능이 cell cycle에서 G1, S, G2 phase의 arrest를 해
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6 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
필요하다(27)
. ATM kinase의 수 개의 기질이 이러한 IR
에 의한 cell cycle arrest과정에 여한다. 여기에는 G1
checkpoint에서 p53, Mdm2, Chk2(30-34)
, S phase arrest
에서 Nbs1, Brca1, FancD2, SMC1(35-41)
, G2/M
checkpoint에서 Brca1, hRad17이 포함된다(42,43).
○ 진핵세포가 DNA strand break를 인식하는 자세한 기작
에 해서는 아직 더 연구되어야 할 것이나 IR후에 나
타나는 빠른 ATM kinase 활성은 ATM kinase가 포유
류 세포에서 신호 달의 기 단계에 작용함을 시사한다(29,30). transfected ATM은 phosphoprotein으로서 ATM
kinase 활성이 번역 후 모사에 의해 조 될 확률을 높여
다. ATM에서 IR에 의해 유발된 인산화가 일어나는
치가 확인되었다. 이는 분자간 자동인산화과정을 통해
일어나며 이러한 인산화 과정의 기능상 요성도 탐구되
었다. 인산화 과정 자체가 직 으로 kinase의 활성을
조 하지는 않으나 신 ATM oligomer를 붕괴시켜
ATM kinase domain에 기질이 근가능 하도록 한다.
반응의 신속성과 화학량론을 고려하면 ATM은 직
으로 DNA strnad break에 결합하여 활성화되지는 않으
며 이보다는 DNA damage로 인해 chromatin 구조상의
격한 변화가 일어나 ATM 활성을 개시하는 모델을
상정할 수 있다.
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7
제3장
H2AX의 역할
repair factor의 nuclear foci로의 recruitment
1. double-strand break 위치로의 γ-H2AX와 repair
factor의 colocalization
○ breast tumor line MCF7을 laser scissor 기법(25)
으로 조
사하고 30분간 recover 시간을 후 고정하고 항체를
이용해 면역 염색하 다. γ-H2AX과 Rad50에 한 항체
를 이용한 결과 두 분자들은 세포 핵에서 laser를 쏘아
경로를 따라 특이 으로 치하 다. 즉 MRN
complex는 double-strand break이 치하는 곳에서
H2AX 인산화가 일어나는 지 에 치한다.
○ 면역형 연구에 의하면 Brca1는 DNA damage후에 Rad51
과 함께 foci에 모이게 된다(4). Brca1과 γ-H2AX간의 계
를 알기 해 laser scissor를 이용해 double-strand break를
도입하고 각 단백질에 특이 인 항체를 이용하 다. 그 결
과 Brca1은 DNA break line과 γ-H2AX에 정확하게 일치
하여 치하 다. 이러한 패턴은 γ-H2AX 패턴을 가진 세
포의 체는 아니지만 부분에서 나타났다. Brca1이
MRN complex와 같이 치한다고 보고되었기 때문에(23)
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8 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
Brca1과 Nbs1 항체를 조합하여 시도하 고 두 factor가 자
주 DNA break line에 함께 치한다는 사실을 발견하 다.
그러나 몇 개의 세포에서는 Nbs1 염색패턴은 나타내나
Brca1 염색패턴은 나타내지 않았다. laser scissor를 이용한
연구결과에 의하면 MRN complex와 Brca1은 실제로 γ
-H2AX와 DNA double-strand break 치에 치하나
Brca1과 MRN의 결합은 일부에서만 발견되었다.
2. IR이후 repair factor의 순차적 결합
○ 조사량이 을 경우와 laser scissor에 내성이 덜한 cell
line에 해 연구하기 해 표 인 137Cs source를 사용
하여 double-strand break를 유발하 다. 보통의
fibroblast line IMR90에 12 Gy 조사 후 시간에 따른
foci 형성 과정을 항체를 이용해 조사하지 않은 세포와
비교하 다. 조사하지 않은 IMR90 세포에서는 γ-H2AX
에 해 분명히 구별되는 2개의 집단을 찰할 수 있었
다. 90-95%의 세포에서 γ-H2AX 염색이 상당히 약하고
퍼져있었으며 반면에 5-10%의 세포에서 하나 는 수
개의 밝은 γ-H2AX foci를 찰하 다. 이 소수의 세포
군집에서 Rad50 foci와 같이 치한 γ-H2AX foci는 거
의 없었는데 이는 MRN complex가 방사선 조사가 없는
상태에서 일어난 double-strand break에 recruit되었다는
것을 의미한다.
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제3장 H2AX의 역할 9
○ IMR90 세포를 12 Gy IR에 노출시킨 후 γ-H2AX foci는
100%의 세포군집에서 나타났다. 반면에 Rad50 foci는
더 늦게 수 시간에 걸쳐 나타났다. 를 들어 2시간에서
γ-H2AX foci는 존재하나 Rad50 foci는 존재하지 않았다.
그러나 Rad50 foci가 조사 6-8시간 후에 나타났을 때 그
치는 이미 존재하던 γ-H2AX foci와 상당히 일치하
다. 후반에는 감소하기는 하 으나 최소 24시간에 걸쳐
Rad50은 γ-H2AX와 같이 치하게 되었다. NIH Image
로그램을 이용하여 정량 분석을 한 결과 γ
-H2AX-Rad50 colocalizing foci의 수는 차 증가하여
조사 후 6-8시간에서 최 치에 이르며 이때 략 70%의
γ-H2AX foci가 Rad50 foci와 일치하게 된다.
3. DNA damage 후 foci로의 Brca1 recruitment
○ IMR90 세포에서 Brca1 foci 형성의 시간경과에 따른 과
정을 조사한 결과 Rad50 colocalization 과정과는 상당히
다름을 발견하 다. 조사 10-15%의 세포군집이
Brca1 foci를 보 으며 이들 세포 약 50-70%가 γ-
H2AX foci와 같이 치하는 최소한 하나의 Brca1 foci
를 가지고 있었다. 12 Gy 조사와 45분의 recovery후
S-phase Brca1 foci가 사라졌다. 2시간의 recovery후
10-15%의 세포에서 Brca1 foci가 나타났고 이들 세포에
서 부분의 Brca1 foci는 γ-H2AX foci와 겹쳐졌다. 시
각분석과 정량분석 결과 Brca1/γ-H2AX colocalized foci
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10 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
의 도는 조사 2시간 후 최 에 이르며 이는 Rad50/γ-
H2AX foci보다 상당히 빠른 것이다. Brca1 foci가 이 시
간 에 가장 밝게 나타난 것은 아니지만 최소한 60%의
Brca1 foci가 핵 내에서 조사 2시간 후의 γ-H2AX foci
와 일치하 다. Brca1이 γ-H2AX와 함께 치하게 되는
상은 6시간에 걸쳐 계속되었다. 따라서 찰된 foci 형
성의 순서는 γ-H2AX이 가장 먼 고 그 후에 Brca1,
MRN이 따르게 된다.
○ IR후 Rad51 foci의 출 에 해 검사한 결과 이들 foci는
IMR90 세포의 소수에만 존재하고 이들 소수 세포들은
Brca1 foci를 나타낸 것들과 겹친다는 사실을 발견하
다. 조사하지 않은 세포를 Rad51 항체로 염색한 결과 S
phase Rad51 foci는 γ-H2AX foci와 거의 겹치지 않았
다. 12 Gy 조사와 2 시간의 recovery 후 Rad51과 Brca1
foci는 10-15%의 세포에서 분명하게 나타났으나 Rad51
foci와 γ-H2AX foci간에는 겹치지 않았다. 그러나 6시간
후 Rad51 foci가 20-25%의 세포에 존재하 으며 Rad51
과 γ-H2AX간에 분명한 일치를 찰하 다. 다른 시간
에서 Rad51과 Brca1의 결합을 탐구한 결과 이들의
colocalization은 차 으로 증가하여 6시간의 recovery
후 최소한 55%에서 같이 치하 다. 일반 으로 Rad50
과 Rad51은 같은 세포 핵에서는 발견되지 않았다. 즉
Rad51-γ-H2AX colocalization은 비록 다른 세포 군집에
서 일어나기는 하 으나 Rad50-γ-H2AX의 경우와 유사
하며 Brca1이 γ-H2AX와 colocalization한 후의 recovery
과정에서 일어났다.
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제3장 H2AX의 역할 11
○ SV40-transformed human fibroblast line인 SVG p12 세
포를 이용한 경우에도 비록 나타나는 시간과 Rad51과
Rad50 foci의 비율은 달랐으나 foci 형성 순서는 동일하
다. 즉 γ-H2AX이 먼 일어나고 다음으로 Brca1-γ-
H2AX, 그 다음으로 Rad50-γ-H2AX 혹은 Rad51-γ-
H2AX colocalization이 각기 다른 세포에서 일어났다.
4. wortmannin은 radiation-induced foci 형성을 저
해한다.
○ 비처리된 MCF7 세포와 비교하여 30분동안 wortmannin
과 incubation하고 12 Gy 조사한 세포는 γ-H2AX foci가
히 고 그 밝기도 떨어졌다. 이 세포들을 Brca1과
Rad51에 특이 인 항체로 염색한 결과 wortmannin을
preincubation하면 이들 단백질들에 의한 foci 형성도 완
히 제거됨을 알게 되었다. 반면에 wortmannin을 조사
후 5분 안(γ-H2AX foci는 나타나나 Brca1-Rad51 foci는
나타나기 )에 첨가하면 모든 foci가 정상 으로 나타
났다. 그러므로 foci 형성에서 wortmannin에 민감한 단
계는 조사에 한 반응에서 기에 해당하며 γ-H2AX
인산화 과정일 것이다. wortmannin에 의해 γ-H2AX
foci 형성을 제거하면 다른 factor에 의한 foci도 형성되
지 않는데 이는 γ-H2AX 인산화가 이 과정에서 필수
이라는 것을 의미한다.
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12 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
5. repair-deficient cell에서의 γ-H2AX foci 형성
○ DNA dependent protein kinase(DNA-PK)가 완 히 결
핍되어 있고(48) ATM 단백질은 극히 소량만을 가진 것
으로 알려진(45-47)
M059J 세포에 IR을 조사하여 그 반응
을 찰하 다. 놀랍게도 M059J 세포는 정상 인 성장
조건에서도 높은 수 의 γ-H2AX foci를 나타났다. 이
세포들을 IR에 노출시켜도 세포당 foci수가 증가하지는
않았다.
○ 더욱 정확한 찰을 해 더 강한 IR을 조사하고 2
dimensional electrophoresis를 통해 인산화와 비인산화 γ
-H2AX 수 을 비교한 결과 DNA-PK-positive 세포에
서는 recovery 시간에 인산화된 형태의 histone이 격
히 증가하여 최 약 70%의 세포내 H2AX가 인산화
되었다. M059J 세포에서는 γ-H2AX의 양이 조 증가
하 으나 정상 인 cell line에 비교하 을 때 수배 감소
된 수치 다. 이러한 결과에서 DNA-PK와 ATM이 없
을 경우 γ-H2AX 응이 히 감소하나 완 히 제거
되지는 않음을 알 수 있다. 이는 다른 종류의 kinase에
의한 것이다.
○ Nijmegen breakage syndrome(NSB) 유 자가 돌연변이
되어 있는 NBS cell line의 경우 IR에 노출 후 높은 수
의 chromosone aberration이 나타났으며(48) MRN foci
를 보이지 않았다. M059J cell line과 같이 조사하지 않
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제3장 H2AX의 역할 13
은 culture에서 높은 수 의 γ-H2AX foci가 찰되었다.
어도 50-70%의 조사하지 않은 세포가 γ-H2AX foci를
나타내었으며 정상 인 fibroblast의 경우에는 5-10%이
다. NBS 세포는 chromosome의 불안정성이 높기 때문에
γ-H2AX foci가 많다는 것은 이러한 세포에서
double-strand break가 많이 일어난다는 것을 시각 으
로 보여주는 것이다. 그러나 M059J 세포와는 달리 NBS
세포는 2 Gy에 노출된 후에는 γ-H2AX foci수가 5-10배
증가하 다. 더욱이 이들 세포에서 Brca1과 Rad51이 정
상 으로 γ-H2AX와 colocalization되었다. 즉 이러한 반
응에 MRN foci 형성이 필수 이지는 않다.
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15
제4장
분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한
ATM 활성화
1. IR에 의한 ATM의 자동인산화
○ 세포가 IR에 노출되게 되면 transfected ATM과
endogenous ATM 모두에서 도입되는 32P-orthophosphate
의 양이 증가하게 된다. kinase가 불활성화된 ATM의 경우
에는 IR후에도 증가하지 않는다. 방사성 phosphate의 도입
은 in vitro ATM kinase 활성 실험에서도 나타난다(30,49)
.
이러한 in vitro ATM 인산화는 kinase가 불활성화된
ATM 단백질에서는 나타나지 않으며 30nM wortmannin
에 의해 해되고 마그네슘 첨가에 의존 이며 exogenous
DNA 첨가에는 의존 이지 않다. ATM의 기질 인산화 역
시 동일한 성질을 보인다(30,49,50). 이러한 찰 모두가 ATM
이 자신을 인산화 시킨다는 모델에 잘 들어맞는다. 인산화
되는 아미노산의 종류를 확인하기 해 trypsin 처리한 조
각들을 2D 기 동 등을 통해 조사한 결과 Ser이었다.
○ 인산화 되는 Ser의 정확한 치를 알기 해 Edman
degradation 등 다양한 실험을 통한 결과 그 서열은
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16 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
1974-SLAFEEGSPQSTTISSLSEK-1992 이었으며 1981
Ser이 인산화되는 것으로 측되었다. Ser 1981은
mouse와 Xenopus ATM에서는 보존되었으나 덜 복잡한
metazoan의 homologue에서는 발견되지 않았다. Ser
1981은 FAT domain의 N-terminal에 치하 으며 이
지역은 략 500 아미노산으로 이루어지며 Frap, ATM,
Trapp을 포함하는 PI(3) kinase family에서 보존되는
부분이다(51). Ser이 'SQ' site에 있기 때문에 자동인산화
나 ATM family member에 의한 인산화가 상된다(49)
.
○ Ser 1981의 인산화된 형태와 비인산화된 형태를 인식하
는 각각의 polyclonal 항체(anti-1981S-P, anti-1981S)를
생산하 다. 10 Gy 조사후 30분내에 anti-1981S를 이용
해 검출한 야생형 ATM은 수배 감소하 으나 kinase 불
활성 ATM은 변화가 없었다. 반 로 IR후 anti-1981S-P
결합은 수배 증가하 으나 kinase 불활성 ATM은 향
이 없었다. anti-1981S 결합이 감소한다는 것은 세포내
총 ATM의 많은 양이 IR후 Ser1981에서 변형이 일어난
다는 것이다. 인산화에 특이 인 항체를 이용하여 검출
된 ATM은 cell-cycle상의 변화에 의한 것은 아니다. 왜
냐하면 IR 조사 후 한시간 내에는 cell-cycle상에 큰 변
화가 없었고 IR이나 UV를 조사한 후 G0에 고정되어 있
는 fibroblast에서도 이러한 인산화가 발견되었기 때문이
다.
○ ATM 자동인산화는 다음과 같은 증거에 의해 제시되었
다. 첫째 IR후 in vivo, in vitro에서 phosphate의 도입은
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제4장 분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한 ATM 활성화 17
ATM kinase 활성에 의존 이며 둘째 wortmannin에 민
감하다는 것, 셋째 target Ser이 ‘SQ' site라는 이다.
1981 치에 Ser residue를 가지고 있는 polypeptide는 in
vitro에서 ATM kinase의 훌륭한 기질이 되는데 이는
ATM이 이 치를 인산화 할 수 있다는 것이다. 더욱이
20μM 혹은 그 이상의 wortmannin은 human diploid
fibroblast의 IR후 Ser1981 인산화를 해한다. 이 농도의
wortmannin은 in vivo에서 ATM과 DNA-PK 모두를
해하지만 ATR(ataxia-telangiectasia와 Rad3에 련된)
은 해하지 못한다(50)
. IR에 의해 유발되는 Ser1981 인
산화의 kinetics와 수 은 DNA-PK 활성이 있는 cell
line에서도 그리고 없는 cell line에서도 각각 응하는
경우에 일치하 는데 이는 DNA-PK는 제외됨을 의미한
다.
○ ATM의 kinase가 불활성화된 돌연변이조차도 세포내에
서 어느 정도까지는 인산화될 수 있기 때문에 Ser1981
의 인산화에서 ATM kinase 활성의 요성을 더욱 확실
히 하기 해 ATM kinase 활성의 근원이 transgene에
서만 나타나도록 실험하 다. 그 결과 kinase 불활성화
된 ATM의 인산화가 transfection 후 어느 정도 찰되
었지만(이 경우 endogenous ATM 활성은 가지고 있다)
ATM kinase 활성이 없는 cell line으로 transfection한
경우 Ser1981에 인산화를 검출할 수 없었다. 즉 Ser1981
의 인산화는 ATM kinase 자체의 활성에 의존하며
transfection된 kinase 불활성 ATM의 인산화는 다른
kinase에 의한 것이다.
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18 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
2. active monomer로의 ATM의 분리
○ Ser1981의 기능을 세분화하여 알아보기 한 연구가 진행되
었다. 야생형 ATM을 도입하면 AT 세포에 IR 유발 p53 인
산화가 복구되나 kinase가 불활성된 경우나 S1981A- ATM
의 경우에는 그 지 않았다. 반면에 S1981A-ATM의 in
vitro kinase 활성은 야생형 ATM과 다름이 없었다. HeLa
cell에 S1981A-ATM을 transfection한 경우 IR 유발 G2
checkpoint와 S-phase 복제 arrest를 kinase 불활성 ATM
construct와 구별할 수 없을 정도로 유사한 식으로 해한
다. IR 유발 cell-cycle checkpoint를 막는 것과 같이
S1981A를 transfection한 돌연변이도 endogenous ATM 단
백질의 Ser1981에의 IR 유발 인산화를 해하 다. 따라서
Ser1981의 돌연변이가 in vitro에서 ATM kinase 활성을 없
애지는 못했지만 S9181A-ATM의 발 은 AT 세포를 보완
하지 못하 고 endogenous ATM의 세포내 활성을
dominant-inhibitory하게 해하 다.
○ ATM의 세포내 활성에 해 Ser1981 돌연변이의 in
vitro에서의 효과의 차이에 한 원인을 탐구하기 해
ATM domain과 단백질-단백질 결합에 해 생화학
으로 연구하 다. 이에 의하면 kinase domain과 인산화
domain은 서로 안정 으로 결합하며 Ser1981 의 서열
이 이 결합에 요하다. Ser1981을 인산화 된 Ser과 유
사한 하를 띤 side chain을 가지고 있는 Asp나 Glu로
돌연변이 시키면 이 결합이 일어나지 않는데 이는
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제4장 분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한 ATM 활성화 19
Ser1981의 인산화가 이 domain이 kinase domain과 결합
하는 것을 막아 다는 의미이다.
○ ATM의 Ser1981 domain이 ATM의 kinase domain과 결
합할 때 cis 혹은 trans로 결합하는지 단백질 complex를
이루고 있는지를 조사하기 해 formaldehyde등으로 고
정하고 면역침 시키는 등의 방법으로 실험하 다. 그
결과 보통의 세포에서 ATM은 dimer 혹은 더 높은 차
원의 multimer로 존재하며 DNA damage 후 complex
분리에는 분자간 ATM Ser1981 인산화가 필요하다는 것
을 확인하 다.
3. ATM 활성화에 관련된 세포내 신호
○ IR 후의 ATM 자동 인산화의 kinetics, 반응성, 화학량론
을 연구한 결과 DNA strand break이 일어날 경우에 상
당히 민감하게 ATM 인산화가 일어남을 확인하 다(52,53). 한 제한효소에 의해 몇 개의 DNA break을 도
입한 경우에는 ATM 인산화가 찰되었다(54)
.
○ DNA damage 후 인산화 되는 세포내 ATM 단백질의
비율을 확인한 결과 기하 수 으로 성장하는 primary
human fibroblast culture의 경우 0.5 Gy IR에 노출된
후(18 DNA break 추정) 15분간 50% 이상의 세포내
ATM이 자동 인산화 되었다.
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20 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
○ 비교 소수의 DNA strand의 존재 하에 상당한 비율의
세포내 ATM이 빠르게 인산화 된 으로 미루어 활성
화와 자동 인산화를 해 ATM oligomer가 직 DNA
strand break에 결합하지는 않을 것이다. 이러한 찰은
DNA strand break이 일어날 경우 break이 일어난 지
자체로부터는 거리가 떨어진 곳에서 ATM을 활성화시
킬 수 있는 핵내 변화가 일어나리라는 것을 시사해 다.
IR에 노출되어 DNA strand break이 일어날 경우 DNA
상의 topological constraint가 격히 변화하기 때문에(55-57) chromatin 구조상의 변화에 의해 핵 내에서 이와
는 떨어져 있는 지 에서 격한 변경을 가져올 수도 있
을 것이다. chromatin과 chromosome 구조는 DNA
break이 없더라도 hypotonic 조건에 의해 변경될 수 있
는데(58,59)
이를테면 chloroquine에 노출되거나(60-62)
histone deacetylase inhibitor를 처리하는 경우에 가능하
다(63-65). 세포를 mild한 hypotonic buffer에 노출시키거나
혹은 이 두 chromatin-modifying 약제에 노출시키면
ATM 단백질에 격하고도 리 퍼진 인산화가 일어남
을 면역형 법 등에 의해 확인하 다.
○ 이러한 처리에서 histone H2AX의 인산화나 인산화 된
ATM이나 γ-H2AX의 foci가 찰되지 않았기 때문에
이들 처리가 DNA break를 일으킨다는 증거는 없다(66)
.
흥미롭게도 이들 chromatin-modifying 처리는 p53을 인
산화하게 되는데 ATM에 의한 p53의 인산화는 DNA
break 치에서는 일어나지 않는다. 반면에 IR 조사를
![Page 25: DNA 손상에 의한 ATM H2AX 작용기구 해석gift.kisti.re.kr/data/IAC/files/KISTI-200512-KJS-DNA_ATM_H2AX.pdf · ATM kinase domain에 기질이 접근가능 하도록 한다](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022011811/5e141e9b82e5e27825187b0a/html5/thumbnails/25.jpg)
제4장 분자간 자동인산화와 dimer 분리를 통한 ATM 활성화 21
단독으로 처리하 건 다른 처리와 함께 처리하 건
ATM과 H2AX의 인산화는 분명하다. 더욱이 이들 세
처리는 최 치이하의 IR(0.2Gy)에 세포를 노출시킨 후
보이는 ATM 인산화의 양을 증가시킬 수 있었다. 인산
화된 ATM의 면역형 염색 패턴에 의해서도 정보를 얻
을 수 있는데 IR 처리 후 가장 이른 시간에는 염색은
핵에 걸쳐 리 퍼져 있었다. 그러나 수분 후에는 일부
foci가 리 퍼진 핵내 염색에 더하여 찰되었다. 다른
chromatin-modifying 약제를 처리한 경우 리 퍼진 염
색은 찰되었으나 foci는 찰되지 않았다. 즉 ATM이
리 퍼져 활성화되고 일부의 ATM 단백질이 IR에 의
해 발생한 DNA break 치로 이동되어 아마도 break
치에서 기질을 인산화 할 것으로 보인다.
![Page 26: DNA 손상에 의한 ATM H2AX 작용기구 해석gift.kisti.re.kr/data/IAC/files/KISTI-200512-KJS-DNA_ATM_H2AX.pdf · ATM kinase domain에 기질이 접근가능 하도록 한다](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022011811/5e141e9b82e5e27825187b0a/html5/thumbnails/26.jpg)
![Page 27: DNA 손상에 의한 ATM H2AX 작용기구 해석gift.kisti.re.kr/data/IAC/files/KISTI-200512-KJS-DNA_ATM_H2AX.pdf · ATM kinase domain에 기질이 접근가능 하도록 한다](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022011811/5e141e9b82e5e27825187b0a/html5/thumbnails/27.jpg)
23
제5장
DNA strand break에 의한 ATR 활성화
○ 최근 delayed DSB(DNA double-strand break)-induced
intra-S-phase 신호경로에 여하는 것으로 알려진
ATR kinase의 기작을 설명하는 모델이 제안되었다(67)
.
ATR은 IR에 의해 DSB 치에 생기는 핵내 foci도 형
성하며 효소 활성면에서 불활성화 된 ATR의 과발 은
IR에 의해 유발되는 S-phase checkpoint를 손상시킨다.
DSB-ATR의 연계의 주된 특징은 DSB recession(즉
DNA 말단의 효소 단)이 필요하며 이로 인해
single-stranded DNA(ssDNA)가 생성된다는 것이다. 이
는 ATM의 경우와는 구별되는 특징이다. 뒤이어
ssDNA를 RPA가 감싸게 되면 ATR interacting
protein(ATRIP)-ATR complex가 모이게 된다. 여기에
다른 factor들도 모여 ATR 기질의 인산화를 도와
checkpoint 신호가 개시되도록 한다.
![Page 28: DNA 손상에 의한 ATM H2AX 작용기구 해석gift.kisti.re.kr/data/IAC/files/KISTI-200512-KJS-DNA_ATM_H2AX.pdf · ATM kinase domain에 기질이 접근가능 하도록 한다](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022011811/5e141e9b82e5e27825187b0a/html5/thumbnails/28.jpg)
24 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
<그림 1> DSB에 의해 유발되는 ATM고 ATR의 활성화
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25
제6장
결론 및 제언
○ 최근 몇 년간 S-phase checkpoint를 비롯해 DNA damage
에 한 세포내 반응에 해 상당한 이해가 이루어졌다.
이러한 checkpoint의 생물학 요성은 이러한 과정에
결함이 있는 세포나 생명체의 표 형을 살펴보면 확연하
다. 그러한 연구를 통해 효모에서 인간에 이르기까지 진핵
생물에서 S-phase checkpoint의 심 한 역할을 발견하게
되었다. 를 들어 intra-S-phase DNA-damage
checkpoint에 결함이 있어 나타나는 Ataxia telangiectasia,
Nijmegen breakage syndrome과 같은 질병뿐만 아니라 심
각한 신경퇴화, 면역결핍 그리고 몇 종류의 암에 쉽게 걸
리는 상이 나타난다. 환자나 종양의 checkpoint 상태도
방사선과 화학요법과 같은 DNA에 피해를 주는 치료법의
결과에 향을 주기 때문에 치료효과를 측하거나 그러
한 치료를 최 화하고 checkpoint 결함을 가진 암을 선택
으로 제거하는 새롭고 정교한 치료 략을 수립하기
해 한 노력이 checkpoint 결함을 이용하는 연구에 투
자되어왔다(68).
○ checkpoint 개념에 해서는 복제, 재조합, repair등 다양
한 DNA 처리에 여하는 checkpoint sensor, mediator,
단백질간의 흥미로운 연결 계가 나오고 있다. 이들 연
![Page 30: DNA 손상에 의한 ATM H2AX 작용기구 해석gift.kisti.re.kr/data/IAC/files/KISTI-200512-KJS-DNA_ATM_H2AX.pdf · ATM kinase domain에 기질이 접근가능 하도록 한다](https://reader030.vdocuments.site/reader030/viewer/2022011811/5e141e9b82e5e27825187b0a/html5/thumbnails/30.jpg)
26 DNA damage에 의한 ATM 활성화와 H2AX 작용기구 해석
결 계와 상호 신호 달 과정, checkpoint 신호과정에서
phosphatase의 역할, checkpoint로부터의 회복 등에 한
더 정확한 이해는 앞으로의 도 과제가 될 것이다. 한
ATR 활성화가 DSB에 반응하여 시간 으로 지연이 있
다는 사실을 탐구하는 것도 요할 것이다. Seckel
syndrome을 가진 환자의 ATR 발 에 향을 주는
splicing mutation이 밝 진 것(69)
이 이 문제에 큰 도움
이 될 것이다. 다른 요한 문제는 checkpoint가 어떻
게 chromatin remodelling과 사에 향을 미치며 어떤
기작에 의해 결과 으로 세포가 다시 증식할 것인지 아
니면 cell-cycle상에서 정지하거나 사멸할 것인지가 결정
되는가라고 할 수 있다. checkpoint에 의해 유발되는
chromatin 조 과정의 하나로 악되는 것이 순간 인
ATM/ATR-CHK1에 의존한 인간 TLK1고 TLK2의
해를 들 수 있다. TLK1, TLK2는 서로 련된 S-phase
kinase로서 chromatin assembly factor ASF1을 조 한
다(70,71).
○ intra-S-phase checkpoint 과정에서 해결해야 할 특정 문
제 에서 요한 것으로 DNA-damage sensor의 확인,
checkpoint mediator의 역할에 한 더 정확한 이해 등을
들 수 있다. 이외에도 ssDNA gap에 응하여 Xenopus
laevis CDC7-DBF4 kinase(발생계통학 으로 보존된
S-phase kinase)의 ATR과 RPA 의존 해(72,73)
도 명확
히 해야 할 것이다.
○ 살아있는 세포를 직 시각 으로 찰할 수 있는 live-
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제6장 결론 및 제언 27
cell imaging 기술의 발 도 의심할 여지없이 이루어져
야 할 것이며 이를 통해 단백질-단백질 결합의 동 분
석이 용이해질 수 있을 것이며 더 나아가 실시간으로
인산화 과정을 직 으로 악할 수도 있을 것이다.
지난 수년간은 이 분야에서 단히 생산 인 기간이었
으며 앞으로도 더 많은 흥미로운 발견들과 연구를 통해
더욱 확실한 정보를 얻게 된다면 생물 의학 측면에서
의 그 가치는 따로 언 할 필요가 없을 것이다.
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참고문헌
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저자소개 자문위원
강 종 석
․공학박사
․ , 한국과학기술정보연구원 선임연구원
․ 서: BT분야 국가연구개발 심층분석,
리튬이차 지 등
이 재
․이학박사
․ , 한국과학기술기획평가원 선임연구원
․ , 한국과학기술정보연구원 선임연구원
․ 서: BT분야 국가연구개발 심층분석
평가 등
신 석
․이학박사
․ , 고려 생명공학원 선임연구원
BB091 강종석․이 재
DNA 손상에 의한 ATM 활성화와
H2AX 작용기구 해석
2005년 12월 19일 인쇄
2005년 12월 23일 발행
발행처
서울특별시 동 문구 청량리동 206-9
ꂕ 130-742
화 : 3299-6114
등록: 1991년 2월 12일 제5-258호
발행인
조 화
인쇄처
신기획