diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble...
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Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema
tradicional colombiano.
Andres Felipe Londoño Zapata
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Medellín, Colombia
2016
Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema
tradicional colombiano
Andres Felipe Londoño Zapata.
Tesis de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Directora: Claudia Ximena Moreno Herrera
Ph.D., Ciencias Mención Microbiología.
Codirector: José Uriel Sepúlveda Valencia
Magister en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
Línea de Investigación:
Microbiología de Alimentos
Grupo de Investigación:
MICOBIOP- GICTA-Biociencias
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Medellín, Colombia
2016
A mis padres por sus oraciones y comprensión.
A Verónica por su apoyo incondicional.
A Mónica y a Margarita por todo.
Agradecimientos
A la Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia y a la Universidad Nacional de
Colombia Sede Medellín, por la financiación de este proyecto.
Al laboratorio de Productos Lácteos y al Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la
Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín y al Laboratorio control de calidad
LACMA, por apoyar al desarrollo de todo los análisis que estaban previstos dentro del
proyecto.
A los profesores Claudia Ximena Moreno Herrera y José Uriel Sepúlveda Valencia, por su
apoyo y su acogida en sus grupos de investigación.
A la convocatoria Jóvenes Investigadores 645, con el proyecto: 26676-Diversidad de
bacterias acido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano. Código QUIPU:
201010014813.
Compañeros de laboratorio, por su colaboración y compañerismo.
A todas y cada una de las personas que de una u otra forma contribuyeron para llegar a la
meta.
Resumen y Abstract IX
Resumen
En el presente estudio, los métodos microbiológicos convencionales y
herramientas moleculares, tales como electroforesis en gradiente de temperatura
temporal (TTGE), se utilizaron para evaluar la composición de las comunidades
bacterianas asociadas al queso doble crema de tres empresas en el municipio de
Ubaté-Cundinamarca en Colombia. También se estudió la evaluación de las
características tecnológicas de algunas cepas, como la actividad acidificante, la
producción de diacetilo, actividad proteolítica y lipolítica, actividad antimicrobiana,
el crecimiento a diferentes temperaturas y concentraciones de sal.
El análisis genético de las comunidades bacterianas reveló una baja diversidad, la
cual se estableció por el número de bandas detectadas por TGGE. Las afiliaciones
filogenéticas dominantes se determinaron por secuenciación del gen RNAr 16S y
se agruparon en cuatro géneros Enterococcus sp, Lactobacillus sp, Leuconostoc
sp y Lactococcus sp, secuencias relacionadas con microorganismos importantes
en los procesos de acidificación y en la formación de aromas y sabores en este
tipo de productos. La caracterización e identificación de los aislados de bacterias
ácido lácticas (BAL), mostraron predominio de los géneros Leuconostoc sp y
Weissella sp, los cuales poseen algunas propiedades metabólicas que contribuyen
al desarrollo de características como la textura y la producción de metabolitos
antimicrobianos, reflejando que la microbiota asociada al Queso Doble Crema,
desempeña un rol determinante en la consolidación de sus propiedades
organolépticas
La combinación de diferentes acercamientos permiten inferir sobre la presencia de
la población de BAL diversas e igualmente complejas presentes en el queso doble
crema tradicional colombiano, información que puede ser utilizada para comenzar
X Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
a establecer un sello de calidad, que lleve a establecimiento de un producto
protegido bajo el status de Denominación de Origen (DO).
Palabras clave: Queso Doble Crema, Bacterias Acido Lácticas, Diversidad.
XI
Abstract
In the present study, conventional microbiological methods, molecular tools, such
as temporal temperature gradient electrophoresis (TTGE), were used to assess the
composition of bacterial communities associated with artisan double cream cheese,
from three companies in the municipality of Ubate-Cundinamarca in Colombia.
Further evaluation of the technological characteristics of some strains, such as
acidifying activity, production of diacetyl, proteolytic and lipolytic activity,
antimicrobial activity, growth at different temperatures and salt concentrations were
also studied.
A genetic analysis of these bacterial communities revealed a low level of diversity,
based on the number of bands detected using TGGE. The dominant phylogenetic
affiliations of the bacteria, determined using 16S rRNA gene sequencing, were
grouped into four genera Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc and
Lactococcus, which may have a crucial role in the acidification processes and
desirable flavors to cheese. The identification and characterization of lactic acid
bacteria (LAB) isolates showed predominance of the genera Leuconostoc and
Weissella. These strains have some metabolic properties that can be involved in
texture and production of antimicrobial metabolites development in a double cream
cheese, reflecting that the associated microbiota may imparts diverse sensory
characteristics to cheese.
The combination of different approaches allows to infer, the presence of the diverse
and equally complex lactic acid bacteria population present in the artesian double
cream cheese from Colombian, the information could be used to establish a quality
seal of the product and the achievement of a Protected Designation of Origin (PDO).
Keywords: Double Cream Cheese, lactic acid bacteria, Diversity
Contenido XII
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Lista de figuras.............................................................................................................. XIV
Lista de tablas ................................................................................................................ XV
Lista de símbolos y abreviaturas ................................................................................... XVI
Introducción ...................................................................................................................... 1
1. Capítulo 1: Marco teorico……………………………………………………………...…...4
2. Capítulo 2: Materiales y metodos ............................................................................... 8 2.1 Muestras de queso doble crema. .................................................................... 8 2.2 Análisis fisicoquímico .................................................................................... 10
2.2.1 Acidez titulable y medición de pH………………………………………... 10 2.2.2 Determinación de proteína 10 2.2.3 Cenizas………………………………………………………………………10 2.2.4 Humedad…………………………………………………………………….10 2.2.5 Grasa total…………………………………………………………………...10
2.3 Métodos dependientes de cultivo .................................................................. 11 2.3.1 Aislamiento de cepas de BAL …………………………………………….11 2.3.2 Cuantificación de bacterias totales y de BAL……………………………11 2.3.3 Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA) de los aislados.12 2.3.4 Identificación de los aislados con el gen ribosomal 16S rDNA. 12
2.3.1 Capacidad tecnológica de cepas de bacterias ácido lácticas………….13
Actividad acidificante y producción de diacetilo……………………………13
Actividad proteolítica y lipolítica……………………………………………..13
Crecimiento a diferentes temperaturas y a diferentes concentraciones de sal………………………………………………………………………………14
Actividad antimicrobiana……………………………………………………..14 2.4 Método independiente de cultivos ................................................................. 15
2.4.1 Extracción del DNA total….………………………………………………..15 2.4.2 Análisis PCR-TGGE ……………………………………………………….15 2.4.3 Secuenciación de bandas y análisis filogenético………………………..16 2.4.4 Análisis RISA para fracción cultivable y fracción total………………….16
2.5 Análisis estadísticos………………………………………………………………..16
XIII
3. Capítulo 3. Resultados ............................................................................................. 19 3.1 Análisis fisicoquímico ..................................................................................... 19 3.2 Métodos dependientes de cultivo ................................................................... 19
3.2.1 Aislamiento de cepas de BAL …………………………………………….20 3.2.2 Cuantificación de bacterias totales y de BAL ………………………...…20 3.2.3 Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA) de los aislados..21 3.2.4 Identificación de los aislados con el gen ribosomal 16S rDNA 22
3.2.5 Capacidad tecnológica de cepas de bacterias ácido lácticas………….24
Actividad acidificante y producción de diacetilo…………………….……..24
Actividad proteolítica y lipolítica……………………………………….…….24
Crecimiento a diferentes temperaturas y a diferentes concentraciones de sal………………………………………………………………………………24
Actividad antimicrobiana……………………………………………………..25 3.3 Método Independiente de Cultivos ................................................................. 25
3.3.1 Análisis de comunidades microbiana por PCR-TGGE ………………...25 3.3.2 Afiliación filogenética de las secuencias obtenidas provenientes de las
bandas TGGE…………………………………………………………….…27 3.3.4 Análisis RISA para fracción cultivable y fracción total 30
4. Capítulo 4. Discusion ............................................................................................... 33
5. Capítulo 5. Conclusiones y recomendaciones……………………………..…………...41 5.1 Conclusiones ................................................................................................. 41 5.2 Recomendaciones ......................................................................................... 42
A. Anexo A: Tablas con recuentos totales y de bacterias ácido lácticas ....................... 43
B. Anexo B: Análisis RISA de los aislados .................................................................... 44
C. Anexo C: Tinción gram de los géneros identificados ................................................ 45
D. Anexo D : Fotos de las pruebas de caracterización tecnológicas de cepas BAL .. 46
E. Anexo E: Gel del resultado del TGGE y relacion filogenetica de las bandas ............ 48
F. Anexo F: Presentación en congreso internacional ……………………………………..49
Bibliografía ...................................................................................................................... 52
XIV Caracterización de las comunidades de bacterias acido laticas asociadas a un queso tradicional
colombiano: queso doble crema
Lista de figuras Pag.
Figura 1. Mapa ubicación del lugar de Muestreo………...………………….………………..7
Figura 2. Recuento de bacterias totales y de bacterias ácido lácticas……...………….…18
Figura 3. Análisis clúster de los patrones de bandeo ITS de las bacterias aisladas de los
quesos. …………………………………………………………………………………………..19
Figura 4. Ubicación filogenética de los aislados bacterianos basados en las secuencias
del gen RNAr 16S…………………………………………………………………………….….21
Figura 5. Análisis de las bandas y las relaciones que existen entre los diferentes quesos
producidos…...……………………………………………………………………………….…..25
Figura 6. Dendograma construido mediante el método Neighbor joining para las
secuencias 16S DNAr analizadas por la técnica TTGE………………………………………27
Figura 7. Análisis Cluster elaborado por el coeficiente de similitud Dice (Presencia o
ausencia de bandas) y el método de agrupamiento UPGMA basado en patrones de bandeo
ITS de las muestras de Queso Doble Crema…………………………………………………28
Figura 8. Análisis de cluster elaborado por el coeficiente de similitud Dice (Presencia o
ausencia de bandas) y el método de agrupamiento UPGMA basado en patrones de bandeo
ITS de las muestras de Queso Doble Crema de la fracción de DNA cultivable vs análisis
de la fracción de DNA total…………………………………………………………………..….29
XV
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1. Análisis fisicoquímico de Quesos Doble Crema…………………………..17
Tabla 2. Relación taxonómica de los aislados de los quesos doble crema…...…20
Tabla 3. Caracterización tecnológica de cepas BAL………………………………..23
Tabla 4. Índices de diversidad, obtenidos a partir de los análisis Bandas de TGGE………………………………………………………………………….24
Tabla 5. Índices de diversidad, obtenidos a partir de los análisis RISA…...……..30
Contenido XVI
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviatura Término
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa.
DNAr Ácido Desoxirribonucleico ribosomal.
16S RNAr Secuenciación del gen 16S RNAr.
RISA Análisis del espaciador intergénico ribosomal
BAL Bacterias ácido lácticas.
QDC Queso doble crema.
DO Denominación de origen.
UPGMA Método de agrupamiento de pares con la media aritmética no ponderada.
BLAST Basic Local Alignment Search Tool.
NCBI National Center for Biotechnology Information.
RDP Ribosomal Database Project
T/DGGE Temperature /Denaturing gradient gel electrophoresis.
Introducción
El queso es un producto de la coagulación de la leche entera, semi-descremada o
descremada, constituido principalmente por proteína (caseína), con una cantidad
materia grasa y una fracción variable de minerales (1). En las últimas décadas su
producción a nivel mundial ha aumentado debido a la creciente cultura por el
consumo de los quesos madurados, estimándose en el 2015 una producción anual
de 2,4 millones de toneladas (2). En Colombia el queso es producido de manera
industrial y artesanal, se estima que de la producción anual de leche se destina del
8 al 9% a su elaboración, siendo los quesos frescos (queso campesino, quesillo,
queso momposino, queso doble crema, queso costeño y quesito) los mayor
preferencia comercial (3).
El queso doble crema se elabora de manera artesanal en Colombia, con una
mezcla de leche acidificada y leche fresca. Durante este proceso de acidificación,
aparecen las bacterias acido lácticas (BAL) nativas, estas influyen en las
características organolépticas que definen a cada producto, dándole propiedades
distintivas (4). Estos microrganismo juegan un papel fundamental en la industria
quesera, porque están involucradas en la síntesis de compuestos precursores de
sabores y aromas (5,6)
El estudio e identificaciones de las BAL se ha llevado a cabo en los últimos años
mediante biología molecular, la cual han aportado de manera significativa a la
consolidación de la ecología de estos microrganismos, como una rama importante
en el desarrollo de conocimiento, no solo en la detección de patógenos, sino en la
caracterización de organismos de interés industrial (7,8). La electroforesis en gel
con gradiente de temperatura (TGGE) es una técnica independiente de cultivo, que
2
proporcionan una visión ecológica de las especies predominantes en comunidades
microbianas complejas (9). Además es utilizado como herramienta para la
identificación de microorganismos presentes en alimentos, la valoración del
impacto de bacterias probióticas en la microbiota gastrointestinal nativa humana y
la evaluación de la diversidad microbiana durante la fermentación de alimentos
(10,11)
Los diferentes estudios enfocados en la diversidad microbiana de los quesos
tradicionales han tenido un gran impacto en los productores, proporcionándoles
herramientas para comprender todos los procesos en los que intervienen los
microorganismos, teniendo en cuenta los metabolitos secundarios implicados en la
consolidación de las propiedades organolépticas y los beneficios para la salud de
los consumidores: la prevención de ciertas enfermedades y el alto valor nutricional
por la presencia de ácidos linoleicos conjugados (ALC) y aminoácidos, derivados
de actividades metabólicas durante los quesos (8, 43).
Existe poca información acerca de la composición y diversidad microbiana,
específicamente de BAL en quesos autóctonos producidos en Colombia como el
queso doble crema. La exploración mediante métodos moleculares dependientes
e independientes de cultivos como el TTGE proporcionará información sobre la
presencia de BAL en este alimento. La consolidación de este tipo de estudios podrá
contribuir a la comprensión de los fenómenos involucrados en la consolidación de
propiedades organolépticas y de esta forma, la mejora de los procesos de
tecnificación en la elaboración de estos productos.
3
1. Capítulo 1: Marco teórico
El queso doble crema es un derivado lácteo elaborado de forma artesanal en
Colombia, siguiendo la tecnología desarrollada en los Valles de Ubaté y
Chiquinquirá, en el altiplano cundiboyacense, pertenecientes a la cordillera oriental
de los Andes, en la región andina del país. Se reconoce como uno de los quesos
más comercializados en Colombia y su producción ha presentado crecimiento
sostenido en los últimos años (12). Desde el año 2007 hasta el 2014, el
comportamiento de los precios en planta del queso doble crema ha tenido una
tendencia creciente con un aumento aproximado del 7%, superando al queso
campesino(13).
Para la elaboración de este queso, se requiere una mezcla de leche de vaca fresca
y acidificada (el tiempo aproximado de acidificación son 24h a temperatura
ambiente de la zona donde se elabora. Ubaté), hasta obtener una acidez de 0,40%
de ácido láctico (1). Ha sido categorizado como un queso ácido, no madurado, de
pasta semi-cocida e hilada (14). Durante el proceso de acidificación de la leche
(que se da de manera natural) se establece la microbiota láctica nativa que
contribuye con las características organolépticas, fisicoquímicas y microbiológicas
al producto elaborado (14,15), donde se encuentran las bacterias acido lácticas
(BAL), grupo microbiano responsable del proceso de acidificación, contribuyendo
indirectamente a la sinéresis de la cuajada, la expulsión del suero y la solubilidad
del micelio de calcio, elementos relacionados con la textura del queso, además de
la producción de compuestos como el diacetilo y acetoina precursores de la
formación de aromas y sabores (17). Igualmente, han sido utilizadas como cultivos
iniciadores y algunos de ellas son consideradas como microorganismos probióticos
(Lactobacillus fermentum) y otras han sido catalogadas como bacterias GRAS
(Lactococcus lactis subsp. lactis) (Generally Recognised As Safe) (10,19–21).
La identificación de las BAL en quesos se ha llevado a cabo teniendo en cuenta
dos tipos de aproximaciones. La primera basada en métodos dependientes de
cultivo, que involucran aislamientos en agares selectivos (MRS, M17, Elliker),
4
identificación morfológica, bioquímica, y molecular, seguida de la caracterización
de sus propiedades tecnológicas, dentro de las que se destacan: generación de
metabolitos secundarios a diferentes temperaturas, resistencia a bacteriófagos,
resistencia a concentraciones de sal, autolisis, producción de componentes
antimicrobianos (péptidos) y producción de enzimas (proteasas, peptidasas
lipasas, esterasas, entre otras). La segunda aproximación se enfoca en métodos
independientes de cultivo, en los cuales se extrae el DNA que está presente en el
queso y se analiza mediante técnicas moleculares combinadas con la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), que permiten la identificación de grupos
microbianos que no son detectados por los métodos convencionales(22).
Las técnicas moleculares en microbiología de alimentos han abierto muchas
posibilidades en el estudio de la diversidad y ecología de la microbiota que está
presente y hace parte de las transformaciones bioquímicas en las matrices
alimentarias como: sabores, olores y texturas (23,24). La exploración mediante
técnicas moleculares independientes de cultivo han complementado la información
obtenida mediante los métodos microbiológicos tradicionales, que dan la
posibilidad de identificar diferentes organismos que no son fáciles de obtener con
los procedimientos basados en medios de cultivos (25,26). Entre las técnicas
moleculares utilizadas en la exploración y el conocimiento de la microbiota presente
en quesos están: Polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) (27),
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (T-RFLP) (28,29), Análisis
de restricción de DNA ribosomal amplificado (ARDRA) (10), Electroforesis en gel
con gradiente desnaturalizante/de temperatura. (T/DGGE) (30), Análisis del
espaciador intergénico ribosomal (RISA) (30,31) y Hibridación fluorescente in situ
(FISH) (32,33)
La electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE), es una técnica
independiente de cultivo, la cual genera patrones que proporcionan una visión
ecológica de las especies predominantes en comunidades microbianas complejas.
En este método, se separan los fragmentos de DNA que tengan la misma longitud,
pero provenientes de diferentes secuencias, los cuales se obtienen al amplificar
5
regiones de los genes ribosomales del DNA, llegando a separar fragmentos que
difieren en una sola base (9,29). Los agentes desnaturalizantes (la temperatura y
urea) son los encargados de romper los puentes de hidrogeno entre las cadenas
dobles de DNA, de esta forma, cuando se alcanza una temperatura determinada,
la molécula se desnaturaliza parcialmente, disminuyendo su velocidad de
migración. Esas temperaturas de fusión dependen de variaciones en los
nucleótidos presentes en las secuencias analizadas, principalmente en el
contenido de guanina-citosina, por la tanto, fragmentos de DNA pertenecientes a
varios microorganismos tendrán diferentes posiciones en el gel (10,30). Al obtener
el patrón de migración de las bandas, los resultados pueden analizarse mediante:
a) bases de datos que contengan perfiles de migración con cepas de referencias.
b) Presencia y ausencia de bandas en una posición fija.
c) Interpretación visual de la intensidad de las bandas.
d) Digitalización de los perfiles encontrados; para obtener matrices de distancia y
similitud, con los cuales se puede estudiar y comparar los patrones de bandas
generados, a través de programas informáticos (34).
Adicional a esto, el DNA de las bandas puede ser recuperado desde el gel y se
obtienen las secuencias, para saber que grupos microbianos están relacionados
con esas bandas (10). El TGGE ha sido utilizada para determinar la diversidad de
bacterias en diferentes tipos quesos como Robiola di Roccaverano y Parmigiano
Reggiano (35–37), mozzarella (38,39), Camembert (21) y Armada (40)
Los quesos tradicionales producidos artesanalmente en algunas partes del mundo,
son reconocidos con la distinción Denominación de Origen, por tener
características únicas, desarrolladas en su entorno de elaboración y por la
participación de microbiota nativa presente (35,41,42). La composición de la
población microbiana depende de los continuos cambios en las condiciones
ambientales y de la interacción de los microorganismos durante la fabricación y la
dinámica de la microbiota influencia las características de un queso determinado
(43,44). En Colombia existen productos que hacen parte de una riqueza patrimonial
6
e histórica, entre esos se encuentra el queso doble crema, su proceso tecnológico
fue estandarizado por el Instituto de Ciencia y Tecnología de alimentos (1986), pero
aun no cuentan con Denominación de origen (3,45).
Teniendo en cuenta la limitada información disponible sobre las características
microbiológicas de este queso, el objetivo de este trabajo fue estudiar la diversidad
de las comunidades de bacterias ácido lácticas autóctonas asociadas al queso
doble crema artesanal de la región del Valle de Ubaté en Cundinamarca, Colombia,
usando métodos moleculares y de microbiología convencional que permitan la
identificación y caracterización de los microorganismos presentes en los productos
lácteos, lo que llevara a importantes avances en la comprensión de este
ecosistema y su impacto en la elaboración y calidad del queso en la región.
2. Capítulo 2: Materiales y métodos
2.1 Muestras de queso doble crema
Los muestreos se tomaron en el municipio de Ubaté (Cundinamarca-Colombia)
(Imagen 1). Se escogieron tres empresas representativas del sector (nombrados
para este estudio: Q1-Q21-Q3, las cuales elaboran el queso en forma artesanal, de
cada una se tomaron tres quesos de lotes diferentes que se transportaron según la
Norma Técnica Colombiana (NTC) 5667-3 en refrigeración (4°C) al laboratorio
control de calidad LACMA en Medellín, Colombia, para su respectivo análisis de
microbiología convencional y fisicoquímico y al laboratorio de biología celular y
molecular de la Universidad Nacional de Colombia para la realización del análisis
molecular.
1 Para la empresa Q2 solo se pudo tomar una muestra de queso, porque se hizo un lote de quesos con leche acidificada naturalmente específicamente para este estudio. En esta empresa producen el queso con leche acidificada con ácidos orgánicos.
Figura 1. Mapa ubicación del lugar de Muestreo.
8 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
2.2. Análisis fisicoquímico
Los análisis fueron realizados siguiendo los métodos oficiales de la AOAC. Para
determinar la Acidez titulable se siguió el método oficial 942.15 Ed.18, para la
medición de pH 981.12 Ed.18, proteína 988.05 Ed.18, humedad 926.08, Ed 18,
grasa total 933.05 Ed. 18 y cenizas 923.03 Ed. 18.
2.3. Métodos dependientes de cultivo
Para el análisis de las BAL por métodos dependientes de cultivo se mezclaron los
homogenizados de los lotes provenientes de cada empresa a los cuales se les
realizo:
2.3.1. Aislamiento de cepas de BAL
Para el aislamiento de BAL se utilizaron 10 g de cada queso, los cuales fueron
agregados a 90 ml de agua peptonada 0,1% (Merck® Darmstadt-Alemania) y
homogenizados por tres minutos en Stomacher (AES Laboratories-Francia). Se
realizaron diluciones decimales seriadas en base 10 (10-1 a 10-7) en 9 ml de agua
peptonada 0,1% (Merck® Darmstadt-Alemania). 0.1 ml de cada dilución fue
sembrado en agar MAN ROGOSA y SHARPE (MRS) (Merck® Darmstadt-
Alemania) y en agar M17 según TERZAGHI (Merck® Darmstadt-Alemania), medios
selectivos para el aislamiento de bacilos y cocos de BAL, respectivamente. Las
cajas de Petri se incubaron a 30°C por 48 h en anaerobiosis, utilizando indicador y
Anaerogen (Oxiod). Los ensayos se realizaron por triplicado.
2.3.2. Cuantificación de bacterias totales y de BAL
El recuento total de células bacterianas presentes en las muestras de queso se
realizó por microscopia de epifluorescencia con naranja de acridina (AMRESCO®)
siguiendo la metodología de Bottari et al.(2010), con algunas modificaciones: De la
dilución 10-2 del homogenizado de los quesos, se tomaron 100 ul y se realizó un
extendido para cada muestra, el cual se tiño con solución de naranja de acridina al
0,1% por 1 minuto en oscuridad, las placas se observaron a 100X al microscopio
Capítulo 2 9
de epiflourescencia (Nikon 80i) con el filtro B-2E/C. El recuento para cada muestra
de queso fue realizado por duplicado.
Cuantificación de BAL
Para el recuento de células viables se seleccionaron las diluciones con crecimiento
entre 30 y 300 colonias, se calcularon las unidades formadoras de colonia (UFC),
los resultados se expresaron como log10 de las unidades formadoras de colonias
(ufc) por gramo de muestra. El recuento para cada muestra de queso fue realizado
por triplicado.
De los medios de cultivo MRS (Merck® Darmstadt-Alemania) y M17 (Merck®
Darmstadt-Alemania) se seleccionaron 31 colonias aleatoriamente, para el Q1: 11
(Q1-1…Q1-11), Q2: 11 (Q2-1…Q2-11) y Q3: 9 (Q3-1…Q3-9); a los cuales se les
evaluó su actividad catalasa- oxidasa negativa y la tinción gram. Las muestras
fueron conservadas en glicerol al 20% a una temperatura de -80°C.
2.3.3. Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA) de los
aislados.
Para escoger los aislados que se iban a secuenciar, se hizo un análisis RISA.
Alícuotas de 2 ml de las 31 cepas puras, con crecimiento de 24 horas, se
centrifugaron a 5000 gravedades por 10 minutos. El sobrenadante fue descartado
y el pellet resuspendido en 50ul de buffer TE al 0,1% (EDTA 0,5 m-Tris 1M), se
calentó por 10 minutos en agua hirviendo (100 °C), centrifugando a 10000 rpm por
5 min y el sobrenadante se pasó a un nuevo tubo estéril. Para la reacción de PCR
se utilizaron 2ul del lisado bacteriano y los cebadores L1 (5-
CAAGGCATCCACCGT-3) y G1 (5-GAAGTCGTAACAACG-3), con un tamaño de
producto esperado entre 50 y 1500 pb. La mezcla y el programa de la reacción
usados se describe en (47). El producto de amplificación se verifico por
electroforesis en un gel poliacrilamida al 8% y los geles se tiñeron con nitrato de
plata (AgNO3) (AMRESCO, OH, USA) (48) y analizados con el programa
GelCompar II (Applied Maths TX, USA) (Rademaker y de Bruijin, 2004). Una vez
10 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
alineados los carriles representantes de cada muestra de DNA, se realizó un
análisis de agrupamiento mediante el coeficiente de Dice (49) y el promedio
aritmético no ponderado (UPGMA)(50)
2.3.4. Identificación de los aislados con el gen ribosomal 16S rDNA
A los aislados escogidos para secuenciación, se les realizo una PCR amplificando
los cebadores Eubac 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG), 1492R (GGT TAC
CTT GTT ACG ACT T). Aproximadamente 25 ng del DNA bacteriano se usó como
molde para la reacción. La mezcla y el programa de la reacción como se describe
en Moreno et al, (2002). El producto de amplificación se verifico por electroforesis
en un gel de agarosa al 1% , teñido con EZ-vision (Amresco, OH, USA). Las bandas
de DNA se visualizaron por iluminación con luz ultravioleta y fotografiadas por
Sistem UV Transiluminator (Biometra, Göttingen, Germany). Los amplicones de
aproximadamente 1465 pb se enviaron a secuenciar en Macrogen (Korea) en un
ABI PrimR 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA). Los análisis
posteriores se llevaron de acuerdo a los métodos y procedimientos descritos para
las secuencias de las bandas obtenidas desde los geles de TGGE (Sección 2.4.3).
Las secuencias se depositaron en la base de datos del GenBank con los números
de acceso: KX078319 al KX078333.
2.3.5. Capacidad tecnológica de cepas de bacterias ácido lácticas.
Para la evaluación de la capacidad tecnológica de las BAL, se escogieron 5 cepas
(Q3-3, Q2-5, Q1-9, Q2-11 y Q3-6), las cuales corresponden a las especies
representativas identificadas por secuenciación de los quesos estudiados.
Actividad acidificante y producción de diacetilo.
La actividad acidificante fue medida por determinación del pH en un periodo de 24
h. Aproximadamente 200 µl de las bacterias con crecimiento de 24 h, se inocularon
en tubos que contenían 20 ml de leche descremada reconstituida al 10%. Las
mediciones se realizaron a las 0, 6 y 24 horas de incubación, usando pH-metro
previamente calibrado, WTW (Measurement Systems, Inc modelo 330i-SET) (51).
Capítulo 2 11
La producción cualitativa de diacetilo fue determinada, tomando 3 ml de los cultivos
de las cepas del procedimiento anterior (después de 24 horas de incubación a
30°C), agregándole 0.5 ml de una solución de α-naftol (1% w/v) y KOH (16% w/v),
incubandas a 30°C por 15 minutos La presencia de diacetilo, se indica por la
aparición de una franja roja en el tubo (52).
Actividad proteolítica y lipolítica.
La capacidad proteolítica extracelular, se realizó por siembra en estría de cada
cepa en el medio agar leche (Oxoid) suplementado con leche descremeda al 10%,
incubadas a 30°C por 7 días. La prueba se considera positiva por la presencia de
un halo transparente alrededor de las colonias (52).
La actividad lipolítica se midió de forma cualitativa en el medio de cultivo Agar Nata
(agar leche (Oxoid) suplementado con crema de leche al 1%) (53,54). Se realizó
una siembra por estría de cada suspensión bacteriana en el medio referenciado,
con incubación a 30ºC por 7dias. La prueba se considera positiva por la presencia
de un halo transparente alrededor de las colonias.
Crecimiento a diferentes temperaturas y a diferentes concentraciones
de sal.
El crecimiento a diferentes temperaturas se evaluó en Caldo MRS (Merck®
Darmstadt-Alemania) a 15, 30 y 45 ºC. en un tiempo de incubación de 42 h. (55).
El crecimiento a diferentes concentraciones de sal. se evaluó por crecimiento en
Caldo MRS (Merck® Darmstadt-Alemania) suplementado con concentraciones de
NaCl de 2, 6 y 10 %, incubado a 30°C por 48 h (55).
Actividad antimicrobiana.
Fue evaluada siguiendo la metodología de Wilson, Raftos, Corrigan, & Nair (2010).
Los extractos provenientes de las cepas se obtuvieron después de incubación por
siete días a 30°C y agitación constante (150 rpm) en medio MRS (Merck®
Darmstadt-Alemania) con 1,2 g amberlita XAD-16 (AMRESCO®). Después del
tiempo de incubación, la amberlita se recuperó del medio de cultivo por decantación
y se lavó con agua destilada estéril. Los productos absorbidos se eluyeron en 20
12 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
ml de metanol al 100% en agitación constante por 30 minutos y se concentraron
por evaporación a 40 °C bajo presión reducida en rotoevaporador (Hei-VAP
Advantage HL), hasta obtener un volumen aproximado de 1 ml. Los extractos se
evaluaron mediante difusión en agar contra cepas bacterianas: Escherichia coli
(ATCC® 8739™), Salmonella typhimurium (ATCC® 13311™), Staphylococcus aureus
(ATCC® 29213™), Enterococcus faecalis (aislado clínico) y Listeria monocytogenes
(ATCC® 7646™), las cuales fueron inoculadas uniformemente en agar Mueller-
Hinton (Becton Dickison). Luego, discos de papel filtro (Whatman N° 1) de 6 mm
de diámetro estériles fueron puestos sobre las superficies de los agares inoculados
y en ellos 15 µl del extracto concentrado se dispensaron en cada disco. las cajas
se incubaron a 30°C durante 18h. La presencia de halos transparentes alrededor
del disco, se midió y los resultados se expresaron en milímetros.
2.4. Método Independiente de Cultivos.
Para los análisis moleculares independientes de cultivos, los lotes de las diferentes
empresas productoras, se analizaron por separado.
2.4.1. Extracción del DNA total.
El DNA total de las muestras de queso se extrajo usando el kit comercial Power
Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc., Ca.) siguiendo las instrucciones
del fabricante. La concentración del DNA se determinó usando Nanodrops
(Thermo) y su calidad fue determinada en gel de electroforesis al 1%.
2.4.2. Análisis PCR-TGGE
La PCR-TGGE se realizó en un volumen final de 30 µl usando los primers 341F
con una cola extra G-C (50- CCTACGGGAGGCAGCAG-30) y 907R (50-
CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-30) siguiendo las condiciones reportadas en
Gomez, Yannarell, Sims, Cadavid-Restrepo, & Moreno Herrera (2011). Los
fragmentos obtenidos en la amplificación (aproximadamente 500 pb) se corrieron
en geles de poliacrilamida 7% (P/V) en buffer TAE 1,25X (40 mM Tris base, 20 mM
ácido acético glacial, 1 mM EDTA) con concentración de urea al 8M. El gel se corrió
Capítulo 2 13
a las siguientes condiciones: 55 V por 15 h con una temperatura inicial de 66 °C y
una temperatura final de 68 °C (con un incremento de 0.1 °C h-1 ), usando el sistema
DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, U.S.A), Los geles se tiñeron
con SYBR GREEN al 1X por 30 min y la imagen obtenida se digitalizo. El patrón de
bandas se analizado usando el software Gelcompar II (Applied Maths Biosystems,
Belgium). La PCR-TGGE se realizó por triplicado.
2.4.3. Secuenciación de bandas y análisis filogenético
Las bandas obtenidas del gel de TGGE, se cortaron y eluyeron en agua bidestilada
estéril por 24 h a 4°C. La reacción de PCR se llevó a cabo con 5 ul de la suspensión
y con las mismas condiciones de la PCR-TGGE, con los primer 341F sin la cola
GC y 907R. Los productos se verificaron en gel agarosa al 1%.
Los amplicones se enviaron a Macrogen (Korea) para ser secuenciados en un ABI
PrimR 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA). Las secuencias
obtenidas se editaron usando BioEdit ® (Hall, 1999) y la presencia de secuencias
quimeras se evaluó con DECIPHER (58).
(http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimeras.html). Las secuencias editadas se
compararon con secuencias conocidas en el GenBank usando BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool)(59) y el software Sequence Match del sitio web Ribosomal
Database Project (RDP). Las secuencias editadas se alinearon usando Clustal W
(60). El software MEGA 6.0 (http://megasoftware.net/) se utilizó para construir un
árbol filogenético por el método de neighbor-joining (61) con un bootstrap de 1000
repeticiones. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de Jukes-
Cantor (Jukes y Cantor, 1969).
2.4.4. Análisis RISA para fracción cultivable y fracción total
Para realizar una comparación de las comunidades bacteriana presente en los
quesos, se utilizaron la fracción total y la fracción cultivable, mediante un análisis
RISA. El DNA extraído de las muestras de los quesos (fracción total) y de los
14 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
barridos hechos a los medios de cultivos MRS y M17 (fracción cultivable). La
extracción del DNA se llevó a cabo usando el kit comercial Power Soil DNA Isolation
Kit (MO BIO Laboratories, Inc., Ca.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La
concentración del DNA se determinó usando Nanodrops (Thermo). Para realizar
esta comparación, se hizo una PCR con los cebadores L1 (5-
CAAGGCATCCACCGT-3) y G1 (5-GAAGTCGTAACAACG-3) (47). El producto de
amplificación se verifico por electroforesis en un gel poliacrilamida al 8% y tinción
de plata. Con los resultados se construyeron dendogramas, según el patrón de
bandeo que fue analizado con el programa de Gelcompar II (Applied Maths
Biosystems, Belgium) con el índice DICE-UPGMA. Se generó una matriz de
presencia ausencia para establecer las relaciones existentes; con algunos
indicadores de diversidad, corridos en el programa PAST versión 3 (107).
2.5. Análisis estadísticos
Los resultados para los análisis fisicoquímicos, los conteos, la actividad acidificante
y la actividad antimicrobiana, se analizaron por medio del método estadístico
ANOVA de una sola vía, con un nivel de confianza del 95% (α=0.05). Todos los
análisis estadísticos se llevaron a cabo en el programa SPSS versión18 para
Windows 7.
3. Capítulo 3: Resultados.
3.1 Análisis fisicoquímico.
Los análisis fisicoquímicos realizados a las muestras de los quesos cumplieron con
los requerimientos contemplados en la Norma Técnica Colombiana 750 (NTC 750)
y la resolución 2310 de 1986 para este tipo de productos. En la tabla 1, se muestran
los valores obtenidos para cada uno de los parámetros evaluados. Los resultados
para los análisis fisicoquímicos fueron variables para las muestras analizadas,
mostrando diferencias significativas (p<0,05) para los parámetros proteínas,
humedad, grasa y ácido láctico. Los valores de pH y porcentaje de cenizas no
presentaron diferencias estadísticas significativas con (p>0,05) entre los quesos
analizados.
Tabla 1. Análisis fisicoquímico de Quesos Doble Crema
Parámetros2 Q1 Q2 Q3 Rangos permisibles1
Ácido Láctico (% m/m) 0,11a 0,14b 0,17c 0,20
pH 5,41b 5,59b 5,52b 5,5-6,0
Análisis de cenizas % (m/m) 2,66a 2,79a 2,87a 3,0
Análisis de proteína % (m/m) 26,35a 22,23b 25,04c 25-30
Humedad % (m/m) 44,44a 48,94b 47,06c 60
Grasa % (m/m) 23,69a 20,98b 21,54c 25-45 1Rangos permisibles establecidos por las normativas colombianas. a,b,c Resultados con la misma letra no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p>0,05).
16 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
3.2 Métodos dependientes de cultivo
3 2.1. Aislamiento de cepas de BAL
Las bacterias obtenidas en los medios de cultivos MRS y M17 se caracterizaron
por formar colonias de color blanco, crema y grises; de tonos brillantes y opacas,
algunas con halos transparentes en los extremos de la colonia y los bordes de las
colonias algunos regulares e irregulares. Para cada empresa se aislaron las
colonias según las características descritas y luego se re-aislaron hasta obtener
cepas puras, para posteriores análisis. Al final se obtuvieron 31 cepas de las
muestras de todas las empresas, las cuales eran: gram positivas, catalasa y
oxidasa negativa. El 60% fueron cocos (18 aislados) y el 40% (13 aislados) bacilos
cortos. Para Q1 y Q2 se obtuvieron once aislados y para el Q3 nueve, las cuales
fueron utilizados en los análisis posteriores.
3.2.2. Cuantificación de BAL y de bacterias totales
Los recuentos de células viables de BAL realizados a los quesos se muestran en
la figura 2. El recuento para Q3 fue el más alto de los tres quesos estudiados, con
un valor promedio de 6,8 y 7,0 log UFC/g para M17 y MRS respectivamente.
Seguido por Q1, con valores de 6,8 y 6,7 log UFC/g y por último Q2 con valores de
6,4 y 6,3 log UFC/g. No se encontraron correlaciones entre los recuentos hechos a
los quesos con las diferentes empresas en estudio (p<0.05). Al comparar los
medios usados se denota un mayor crecimiento en el medio M17 para (Q1 y Q2).
En Q3 el crecimiento fue mayor en el medio MRS.
17
Figura 2. Recuento de bacterias totales y de bacterias ácido lácticas.
En el recuento de bacterias totales por epiflourescencia, se presentaron resultados
similares con respecto a los recuentos de células viables (Figura 2), Q3 presento
el conteo más alto 7,1 log Células/g , Q1 7,0 log Células/g y Q2 6,9 log Células/g.
3.2.3. Análisis del espaciador intergénico ribosomal (RISA)
Los patrones en los perfiles RISA encontrados, fueron similares en muchas de los
aislados, con bandas en común entre 700-900 bp, y los 400-600 bp, algunos
presentaron bandas específicas (figura 3). De acuerdo a los agrupamientos que se
formaron mediante los perfiles RISA, 15 aislados cuyos patrones ITS diferían
alrededor de un 20%, según árboles con índices de similitud generados con el
software Gelcompare® (Figura 3) fueron seleccionados para identificación por
secuenciación. Los grupos encontrados no tuvieron una relación directa con la
empresa productora de quesos, evidenciándose una agrupación aleatoria donde
no se distinguen aislados que pertenezcan a un solo queso en específico (Figura
3).
5,6
5,8
6
6,2
6,4
6,6
6,8
7
7,2
7,4
Queso 1 Queso 2 Queso 3
Lg (
UFC
-Cel
ula
s/g-
ul)
Recuento de bacterias totales y de BAL
M17 MRS Epifluorecencia
18 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
Figura 3. Análisis clúster de los patrones de bandeo en RISA de las bacterias aisladas de los quesos. Resultado obtenido por el método: DICE- UPGMA, encerrados en los rectángulos, están los aislados que se escogieron para secuenciar.
19
3.2.4. Identificación de los aislados con el gen ribosomal 16S rDNA
Las características tecnológicas y similitudes filogenéticas de los aislados
seleccionados para secuenciación de acuerdo a diferencias en sus patrones ITS
se muestran en la tabla 2
Aunque los patrones RISA de todos los aislados seleccionados diferían en gran
medida (20%), el análisis de secuencias mostro que el 53% de los individuos
presentaban afiliación filogenética con el género Weissella paramesenteroides (4
Tabla 2. Características tecnológicas y similitudes filogeneticas
Código (Origen- muestra)
Similitudes filogenéticas. (Código de acceso )
Similaridad NCBI # acceso
Capacidad tecnológica.
Q1a-8 Leuconostoc mesenteroides; (AB023245)
97% KX078333 Actividad Acidificante.
Producción de acetoina y diacetilob
Q2-7 Leuconostoc mesenteroides (AB056545)
100% KX078321
Q2-11 Leuconostoc mesenteroides (JK273684)
99% KX078327
Q3-1 Leuconostoc lactis (AB295117)
100% KX078322
Q1-9 Leuconostoc citreum (KC836576)
98% KX078320
Q3-3 Pediococcus acidilactici (EU147309)
100% KX078323 Producción de acetoina y diacetiloc.
Q2-3 Pediococcus acidilactici (KJ083748)
99% KX078325
Q2-6 Weissella paramesenteroides (AB023238)
98% KX078330 Actividad Antimicrobianad.
Q1-3 Weissella paramesenteroides (FJ751790)
100% KX078319
Q3-5 Weissella paramesenteroides (AB068665)
98% KX078328
Q2-8 Weissella paramesenteroides (AB024534)
98% KX078326
Q1-1 Weissella viridescens (KJ580423)
97% KX078332
Q2-5 Weissella viridescens (AB053236)
98% KX078331
Q3-6 Weissella viridescens (AB026736)
97% KX078329
Q3-9 Weissella viridescens (AB026736)
100% KX078324
a Aislados bacterias acidolacticas. b (53), c (41), d (62)
20 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
aislados), Weissella viridescens (4 aislados), seguido por Leuconostoc
mesenteroides (3 aislados) y en menor proporción Pediococcus acidilactici,
Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc lactis y Leuconostoc citreum (1aislado).
La relación filogenética entre los aislados se muestra en el dendograma construido
por el método de neighbor-joining y se observan en la figura 4.
Figura 4. Ubicación filogenéticas de los aislados bacterianos basados en las secuencias del gen RNAr
16S. El dendograma Neighbor-joining fue generado en MEGA usando Kimura-2 y se utilizaron 1000
réplicas en análisis boostrap. la secuencia del gen RNAr 16S de Pyrococcus furiosus fue usada como “out-
group”.
21
3.2.5. Caracterización tecnológica de cepas.
Los resultados para las propiedades tecnológicas realizadas a las cepas de BAL
se muestran en la tabla 3.
Actividad acidificante y producción de diacetilo.
En evaluación de la actividad acidificante, la cepa Q3-3 presento a las 6h, el mayor
descenso de pH y las cepas Q2-5 y Q2-11 a las 24 h.
De las 5 cepas de BAL, solo tres dieron positivo para la prueba de producción de
diacetilo, en Q2-5 y Q3-6 no fue detectado.
Actividad proteolítica y lipolítica.
No se evidencio en ninguna cepa actividad proteolítica y lipolítica extracelular, por
el método cualitativo usado.
Crecimiento a diferentes temperaturas y a diferentes concentraciones
de sal
Se observó que las cepas Q1-9 y Q2-11 no crecieron a 15°C y Q2-5 no creció en
45°C (Tabla 3). Todas las cepas crecieron en concentraciones de 2 y 6% de sal.
En 10% solo una bacteria tuvo crecimiento (Q2-5).
Actividad microbiana.
La actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos del crecimiento de las cepas
evaluadas mostro un efecto inhibitorio sobre: Listeria monocytogenes, Escherichia
coli y Salmonella typhimurium. Los extractos de las cepas BAL que presentaron
valores iguales o por encima de 15 mm en el halo de inhibición fueron Q1-9
(Leuconostoc citreum) y Q2-11(Leuconostoc mesenteroides) y Q3-3 (Pediococcus
acidilactici) siendo las que tuvieron mayor efecto sobre el crecimiento de los
patógenos. El extracto de las BAL tuvo un menor efecto frente Enterococcus
faecalis con halos de inhibición inferiores a 15 mm.
22 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
3.3. Métodos independientes de cultivo.
3.3.1. Análisis de comunidades microbiana por PCR-TGGE
La evaluación de la diversidad de las poblaciones bacterianas de los quesos de
diferentes empresas se llevó a cabo por la técnica PCR-TGGE, amplificando la
región V3-V5 el gen RNAr 16S. Los resultados de la amplificación para cada una
de las muestras fueron reproducibles en los patrones de TGGE, observándose
pocas bandas (Figura 5A). Se notan diferencias en intensidad dentro de cada punto
muestreado pero no entre profundidades. En general, se observó un patrón de
Tabla 3. Caracterización tecnológica de cepas BAL.
Pruebas
Q3-31 Q2-5 Q1-9 Q2-11 Q3-6
Acidificación (pH)2
6h 5,10±0,20 6,10±0,01 5,39±0,03 5,45±0,20 5,95±0,01
24h 4,38±0,01 4,29±0,02 4,36±0,20 4,29±0,10 4,35±0,20
Actividad antimicrobiana
(mm)
Escherichia coli 16 16 15 15 16
Salmonella typhimurium
15 15 20 15 12
Staphylococcus aureus
7 5 15 17 8
Enterococcus faecalis
8 0 12 12 9
Listeria monocytogenes
25 18 20 17 17
Act. Proteolítica
- - - - -
Act. Lipolítica
- - - - -
Concentración de sal (%)
2 + + + + +
6 + + + + +
10 - +/- - - +
Temperaturas (C)
15 + + - - +
45 + - + + +
Producción de diacetilo
+ - + + -
1Nomenclatura de las cepas en estudio Q3-3: Pediococcus acidilactici, Q2-5: Weissella viridescens, Q1-9: :Leuconostoc citreum. Q2-11 Leuconostoc mesenteroides, Q3-6: Weissella paramesenteroides, 2 pH inicial: 6,8.
23
migración de bandas similar a lo largo de cada uno de los carriles donde estaban
representados los quesos y sus respectivos lotes. En gel de TGGE, todos los
carriles tienen en común las bandas número 2, 3, 4 y 7 (figura 5A). Las diferencias
entre cada uno de los patrones se presentaron principalmente en Q2 y Q3, donde
se observó la ausencia y presencia respectivamente, de las bandas 1, 5 y 6(figura
3 A). En algunos carriles se observan manchas provenientes de todas las
muestras.
Las diferencias en los patrones de diversidad entre las tres empresas y los lotes,
se tomaron como parámetros de análisis. Después de analizar los patrones de
bandeo para cada perfil con el software Gelcompar II® (Figura 5A), no se observó
una tendencia definida a la agrupación o formación de clusters por lotes (L1, 2 y 3;
en Q1 y Q2). Sin embargo, se evidencia similaridades entre 90 - 100 % y un 60-
80% para las empresas productoras. Con el análisis de componentes principales
se evaluaron las correlaciones existentes entre los diferentes quesos y sus lotes,
(Figura 3B) observándose que los quesos con sus correspondientes lotes, tuvieron
cercanía, presentándose poca variación entre ellos y teniendo más relación los
quesos de Q1 y Q3. Los índices de diversidad y riqueza (Tabla 4), mostraron
variación entre los lotes y los quesos producidos en las diferentes empresas.
Tabla 4. Índices de diversidad, obtenidos a partir de los análisis Bandas de TGGE. Q1L2
a Q1L3 Q1L1 Q3L1 Q3L2 Q3L3 Q2L1b
Taxa_S 5 5 6 7 7 7 3
Individuals 5 5 6 7 7 7 3
Dominance_D 0,200 0,2000 0,1667 0,1429 0,1429 0,1429 0,3333
Simpson_1-D 0,800 0,8000 0,8333 0,8571 0,8571 0,8571 0,6667
Shannon_H 1,609 1,6090 1,7920 1,9460 1,9460 1,9460 1,0990 a Designación de las muestras analizadas Q1L1 (Queso empresa 1, Lote 1), así para todos los demás. b Para la empresa Q2 solo se pudo obtener una muestra.
24 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
3.3.2. Afiliación filogenética de las secuencias obtenidas
provenientes de las bandas TGGE:
Se destacan bandas asociadas a unidades taxonómicas operacionales específicas
o especies bacterianas que se repitieron a lo largo de todos los puntos de muestreo
Figura 5. Análisis de las bandas y las relaciones que existen entre los diferentes quesos producidos. A) Clúster de los patrones de bandeo de la diversidad de bacterias en quesos doble crema hechos en tres diferentes empresas. (Método: DICE- UPGMA). B) Análisis de PCA.
1 2 3 4 5 6 7
A
B
25
(Figura 5). Treinta bandas de interés en cuanto a ocurrencia en todos los carriles o
exclusivas a ciertos puntos fueron escindidas, re-amplificadas y secuenciadas. Un
total de 5 bandas produjeron secuencias de calidad, pudiendo ser ensambladas,
alineadas e identificadas usando los paquetes Bioedit (Halt,1999), Mega 6.0
(Tamura et al, 2007) y Blast (Altschul et al, 1990). A pesar de que 30 bandas
pudieron ser escindidas y secuenciadas, la mayoría provenientes de los diferentes
quesos analizados, no pudieron ser relacionadas con secuencias en bases de
datos de genes ribosomales debido a la obtención de cromatogramas con ruido
excesivo y secuencias de pobre calidad con múltiples ambigüedades que evitaron
que estas pudieran ser ensambladas y asociadas exitosamente a unidades
taxonómicas operacionales. Adicionalmente, en algunos carriles, la presencia de
manchas, hizo difícil la caracterización y por ende la escisión de bandas
individuales. La identidad de cada una de las bandas que pudieron ser
exitosamente identificadas además de su asociación filogenética a grupos
bacterianos específicos. Todas las bacterias encontradas han sido detectadas en
estudios previos relacionados con muestras provenientes de derivados lácteos,
especialmente con quesos y leches fermentadas. Las identidades de los patrones
de bandeo recurrentes (Figura 5A) se asociaron a las especies Enterococcus sp
con una identidad 99 % (banda 7), Weissella sp una identidad del 100 % (banda 4)
Pediococcus sp una identidad del 100% (banda 1), Lactobacillus fermetum una
identidad del 99% (banda 3), Lactococcus lactis una identidad del 99% (banda 5),
Lactoccoccus lactis subesp lactis una identidad del 99 % (banda 6) y Leuconostoc
mesenteroides una identidad del 100% (banda 2). En general el filum Firmicutes,
representados por los géneros Leuconostoc, Weissella y Lactobacillus, son los
grupos dominantes en todos los quesos muestreados (Figura 6).
26 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
B1
gi|940789697|gb|KT906209.1| Pediococcus sp.
gi|592748636|gb|KF973207.1| Pediococcus sp.
gi|402169848|gb|JX193618.1| Pediococcus sp.
gi|390165382|gb|JQ806707.1| Pediococcus acidilactici.
gi|684782318|gb|KM005147.1| Pediococcus acidilactici.
gi|959479619|gb|KU213668.1| Lactobacillus fermentum.
B3
gi|726968612|gb|KM485580.1| Lactobacillus fermentum.
gi|726968611|gb|KM485579.1| Lactobacillus fermentum.
gi|930156700|gb|KR135402.1| Lactobacillus fermentum.
B7
KU644349.1|_Enterococcus_sp.
KU644404.1|_Enterococcus_sp.
KU324913.1|_Enterococcus_lactis
KT438165.1|_Enterococcus_faecium
gi|937668281|gb|KT887254.1| Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides.
gi|932253262|gb|KT361118.1| Leuconostoc sp.
gi|961055066|gb|KT952378.1| Leuconostoc sp.
B2
gi|961055077|gb|KT952389.1| Leuconostoc sp.
Lactococcus lactis AJ271851
B5
Lactococcus lactis AJ488174
Lactococcus lactis X64887
Lactococcus lactis subsp. cremoris HM218811
B6
gi|937668276|gb|KT887249.1| Lactococcus lactis subsp. lactis
gi|917614574|gb|KT427451.1| Lactococcus lactis subsp. lactis
gi|902883044|gb|KP764114.1| Lactococcus lactis subsp. lactis
gi|902883005|gb|KP764099.1| Lactococcus lactis subsp. lactis
B4
gi|1000811929|dbj|LC127181.1| Weissella paramesenteroides.
gi|884465791|gb|KP789026.1| Weissella sp.
gi|413965743|gb|JX826527.1| Weissella_sp.
gi|407725290|dbj|AB671284.1| Weissella sp.
gi|402169865|gb|JX193635.1| Weissella sp.
gi|2343082|gb|U96622.1| Pyrococcus furiosus
99
98
95
90
98
70
33
63
32
99
0.2
Figura 6. Dendograma construido mediante el método Neighbor joining para las secuencias 16S DNAr
analizadas por la técnica TTGE. El dendograma fue generado en MEGA 6.0 usando Kimura-2 y se
utilización 1000 réplicas en análisis boostrap. la secuencia del gen RNAr 16S de Pyrococcus furiosus
fue usada como “out-group”.
27
3.3.3. Análisis RISA para fracción cultivable y fracción total
Mediante el análisis RISA para la fracción cultivable (Figura 7A) se evidencio la
agrupación entre los diferentes medios de cultivos utilizados. Las diferencias entre
los bandeos en cada medio de cultivo presentaron similaridades aproximadas del
88 % para Q3 y 76% para Q1. Las muestras formaron dos grupos, integrados por
Q3-Q1, Q2 tuvo diferencias marcadas entre los medios evaluados. En la fracción
total también se agruparon los diferentes quesos estudiados según el patrón
obtenido (Figura 7.B), pero en este caso, los quesos con mayor relación fueron: Q1
y Q2. Siendo Q3 el que presento patrones diferentes. Para cada uno de las
fracciones los índices de diversidad no variaron (Tabla 5), presentándose algunas
diferencias en Q2.
Figura 7. Análisis Cluster elaborado por el coeficiente de similitud Dice (Presencia
o ausencia de bandas) y el método de agrupamiento UPGMA basado en patrones
de bandeo ITS de la muestras de Queso Doble Crema. A) análisis de la fracción de
DNA cultivable. B) análisis de la fracción de DNA total.
A
B
28 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
Fracción total vs fracción cultivable.
En el análisis de ITS para la fracción cultivable comparada con la fracción total, se
presentaron algunas diferencias entre los perfiles de bandeos de cada fracción
(Figura 8). No se agruparon las muestras de cada fracción que pertenecen a las
mismas empresas, entre los diferentes medios evaluados y las muestras de DNA
total. Los índices de diversidad muestran que la variación entre cada queso
evaluado fueron similares (Tabla 5). Esto también se observó en lo obtenido por
medio de TGGE (Tabla 4).
Figura 8. Análisis de clúster elaborado por el coeficiente de similitud Dice (Presencia o ausencia de
bandas) y el método de agrupamiento UPGMA basado en patrones de bandeo ITS de las muestras
de Queso Doble Crema de la fracción de DNA cultivable vs análisis de la fracción de DNA total.
29
TABLA 5. Índices de diversidad, obtenidos a partir de los análisis RISA. Q1 Q2 Q3
FCa FTb FC FT FC FT M17 MRS L1
c L2 L3 M17 MRS L1 M17 MRS L1 L2 L3
Taxa_S 9 10 6 5 5 6 10 3 9 9 7 7 7
Individuals 9 10 6 5 5 6 10 3 9 9 7 7 7
Dominance_D 0,11 0,10 0,17 0,20 0,20 0,17 0,10 0,33 0,11 0,11 0,14 0,14 0,14
Simpson_1-D 0,89 0,90 0,83 0,80 0,80 0,83 0,90 0,67 0,89 0,89 0,86 0,86 0,86
Shannon_H 2,20 2,30 1,79 1,61 1,61 1,79 2,30 1,10 2,20 2,20 1,95 1,95 1,95 a FC: fracción cultivable, bFT: fracción total, c L1,L2,L3: Lote 1, 2 y 3.
4. Capítulo 4: Discusión
El estudio de la diversidad de bacterias acido lácticas (BAL) en quesos, ha
permitido conocer la función que tienen este grupo de microorganismos en los
procesos de producción. (63–66). En este trabajo se presenta un acercamiento a
la diversidad bacteriana asociada al queso doble crema tradicional del Valle de
Ubaté, ubicado en Cundinamarca, Colombia. Se utilizaron métodos dependientes
e independientes de cultivo para inferir sobre la presencia de BAL, diversas e
igualmente complejas, presentes en este tipo de queso.
Los parámetros fisicoquímicos evaluados en los quesos, muestran en todas las
empresas un cumplimiento de la normatividad vigente. Sin embargo, se
presentaron variaciones entre las empresas estudiadas, las cuales generalmente
se asocian a diferencias en el nivel de industrialización del proceso de producción
(17). Novoa & Lopez, (2008) y Osorio et al.,(2012) han estudiado el efecto de
algunas características fisicoquímicas en quesos artesanales y como estas
influencian los perfiles organolépticos, mostrando que su variación está ligada a
una acción conjunta de parámetros relacionados con la cantidad de grasa, el pH y
la humedad. Los resultados de este estudio sugieren un rango estrecho en cuanto
a diversidad de especies cultivables en las muestras (Figura 2), ligado a
características complejas fisicoquímicas y por supuesto a los sesgos potenciales
que pueden representar los estudios cultivo-dependientes (67).
Los recuentos obtenidos para cada una de las empresas estudiadas mostraron
variabilidad, presentando valores entre 6,0 - 7,0 Log UFC g-1 , valores menores a
los encontrados en otros quesos frescos y de pasta hilada (Caciocavallo), donde
los conteos alcanzan hasta 8,0-9,0 Log UFC g-1, estos cambios están relacionados
principalmente al origen de la materia prima y a las condiciones de manufactura,
32 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
que presentan diferentes condiciones a los cuales se beneficia el crecimiento de
estas bacterias (68,69). Los recuentos de microorganismos totales por
epifluorescencia, fueron mayores que los realizados en los medios selectivos,
resultados similares se han reportado anteriormente (33,70,71), esto se debe a la
presencia de células no viables y células viables no cultivables en el conteo de
células totales.
En la metodología cultivo dependiente, predomino la presencia de los géneros
Weissella sp y Leuconostoc sp. Algunos de los aislados fueron específicos de
algunas empresas, como es el caso de Leuconostoc lactis (Q3) y Pediococcus
acidilactici (Q2). Esta bacterias han sido reportadas en estudios hechos en
diferentes quesos tradicionales (72,73).
El género Weissella sp aparece como el más dominante entre las BAL aisladas de
las muestras (53%). Esto se corroboró haciendo un análisis de cuales patrones
RISA en los 31 aislados obtenidos coinciden exactamente con 15 aislados
identificados por secuenciación. Por ejemplo, basados solo en el análisis de
patrones RISA, entre todos los aislados, Weissella sp. sigue dominando,
representando el 50% de las secuencias, sin mencionar las coincidencias desde el
punto de vista fenotípico como morfología y tinción de Gram que se presentaron
igualmente con otros aislados, indicando que el porcentaje puede ser mayor. Se
debe tener extremo cuidado en establecer asociaciones taxonómicas y/o
filogenéticas solo desde el punto de vista morfológico, más aún cuando se ejerce
un sesgo tan grande como es el aislamiento en medios selectivos (22,74).
Weissella sp es un género principalmente aislado de alimentos fermentados que
están relacionados con frutas, algunos vegetales y cereales (75,76). En los últimos
años se ha convertido en una bacteria de interés en el ámbito de derivados lácteos,
en especial por su estrecha relación con quesos producidos a partir de leches
ácidas (28,43). También ha sido reportado como un microrganismo con algunas
características que están asociadas a factores benéficos dentro de la producción
de quesos, entre las más importantes encontramos: producción de compuestos
volátiles, exopolisacáridos y algunos péptidos con funciones bioactivas (77).
39
El análisis de patrones ITS muestra que Leuconostoc sp, representó
aproximadamente 30% de todos los aislados obtenidos siendo detectado en todas
las muestras. Esta especie es bien conocida dentro de las BAL por las funciones
que cumple en la consolidación de las propiedades organolépticas de muchos
quesos (7,53,69,78,79). Sus características más importantes van desde la
producción de componentes bioactivos, hasta acondicionar la matriz del queso,
específicamente, mediante cambios fisicoquímicos, lo cual favorece el crecimiento
de otras BAL. (29,72,73,80). En algunos estudios se han destacado las funciones
de este microorganismo y sus variedades de especies en los quesos, atribuyéndole
factores diferenciales al producto como: la reducción del pH, deshidratación ,
incremento de sales y reducción de la actividad del agua (77,81). En este estudio
se encontraron tres especies diferentes relacionadas con este género:
Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc lactis y Leuconostoc citreu, que han
sido reportados en diferentes tipos de quesos de pasta hilada (76,78,82).
Otro de los géneros encontrados fue Pediococcus sp., este coco gram positivo,
homofermentativo, se ha reportado en menor proporción en quesos, asociado
principalmente a microbiota nativa no iniciadora (24,74,83,84). Este género ha sido
asociado a la generación de olores y sabores característicos en derivados lácteos,
su metabolismo, se ha asociado a actividades proteolíticas y lipoliticas (83),
En la evaluación de las características tecnológicas de algunas cepas aisladas, los
valores de pH encontrados muestran que estas bacterias tienen un potencial
acidificante, los valores encontrados a las 24 h estuvieron entre 4,2 y 4,3, los cuales
son similares con otros estudios hechos (40,85,86). La actividad antimicrobiana en
contra de patógenos de interés en alimentos, se evidenció en las bacterias
estudiadas, lo que indica que existen posibles antagonismos relacionados con la
producción de agentes antibacterianos (Tabla 3). Las bacterias ácido lácticas han
sido relacionadas con la producción de agentes antimicrobianos; Cheong et al.,
(2014) evaluaron la acción de algunas BAL sobre el crecimiento de mohos sobre la
superficie de un queso fresco, donde encontraron un control efectivo del
crecimiento del hongo. También, otras investigaciones muestran los posibles
34 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
efectos de consorcios microbianos aislados de quesos, en contra de patógenos
como Listeria sp (87). Las demás características tecnológicas mostraron resultados
muy variables, las cepas resistieron concentraciones de sales del 2 y 6%, esto se
relaciona con la producción de quesos, que incluyen salmueras en sus procesos
de elaboración y es evidencia de su adaptación a estos ambientes. La producción
de diacetilo es uno de los productos del metabolismo del citrato (4,73,85) y es un
compuesto importante en la consolidación de algunos sabores en los quesos, en
este estudio, se encontraron tres cepas BAL (Pediococcus acidilactici, Leuconostoc
citreum, Leuconostoc mesenteroides) que mostraron producción. Las actividades
proteolíticas y lipolítica no estuvieron presentes en las cepas evaluadas, estos dos
propiedades enzimáticas han sido relacionadas principalmente con aislados
obtenidos de quesos madurados, donde se desarrollan gran variedad de
metabolismos que involucran estas dos actividades (51,88–90).
Los análisis independientes de cultivo realizados por PCR- TGGE, de las tres
empresas, evaluando la región V3-V5 del gen rDNA 16S, se realizaron para
completar la información encontrada con los aislados en los medios de cultivos. La
determinación de la diversidad bacteriana en muestras de queso por técnicas de
detección e identificación como TTGE o DGGE, está caracterizada por arrojar
resultados variables, con perfiles de diversidad y mostrando representantes de
diferentes filum (30).
Los resultados obtenidos en este trabajo, muestran bajos niveles de diversidad,
con grupos dominantes pertenecientes al filum Firmicutes y 3 géneros
representando estos grupos: Enterococcus sp, Lactobacillus sp y Lactococcus sp
(figura 5A); los cuales se encontraron asociadas a los quesos estudiados, pero no
crecieron en los medios utilizados. Sin embargo, en algunos carriles se observan
manchas provenientes de todas las muestras y cuyas bandas individuales no
pudieron ser caracterizadas, lo que puede representar a comunidades muy
diversas pueden ser erróneamente interpretadas. Tras el análisis de los patrones
de bandas y la realización de análisis de agrupación, se observó que la comunidad
asociada es constante a través de las diferentes muestras. Este análisis de
39
agrupamiento fue confirmado por tres repeticiones (datos no presentados). Estos
resultados pueden reflejar lo que según algunos autores acontece (42, 91) en
situaciones de presión extrema o perturbación, donde las baterías enzimáticas
bacterianas se ven obligadas a concentrar su acción en mecanismos de
supervivencia en oposición a encaminar su acción a procesos de crecimiento
celular disminuyendo por su puesto el número de aquellos individuos incapaces de
adaptarse evolutivamente (42,56,91). Los otros géneros encontrados por esta
técnica fueron correspondientes a los obtenidos por métodos cultivo. De la misma
manera hay evidencia de la gran influencia que ejercen los cambios fisicoquímicos
en la estructura de la comunidad bacteriana (92,93) donde los índices de diversidad
se ven afectados por cambios en las concentraciones de sal, pH, temperaturas,
concentraciones de oxígeno, entre otros.(37,94)
Sin embargo, es imperativo tener en cuenta las limitaciones que posan en la técnica
TTGE/DGGE. Es claro que los perfiles obtenidos solo representan las comunidades
más representativas o dominantes, es imposible tener una idea de la riqueza total,
lo que puede en algún momento desestimar los perfiles de diversidad y número de
especies, igualmente una sola banda detectada puede representar más de un OTU
o una especie particular puede dar pie a la formación de varias bandas (65,95,96).
Igualmente, es necesario contemplar las limitaciones antes mencionadas con
respecto a los sesgos que representan las técnicas moleculares basadas en PCR,
principalmente, las que se refieren a los sesgos existentes a la hora de obtener
ADN representativo de todas las comunidades presentes (97).
Los géneros de Enterococcus sp, Lactobacillus sp y Lactococcus sp, son aislados
con frecuencia y hacen parte de la microbiota nativa de quesos producidos con
leches acidas y quesos de pasta hilada. Enterococcus sp es un género que ha
tomado mucha relevancia en los últimos años, las especies E. faecuim y E. durans,
se han consolidado como microorganismos con importancia tecnológica en los
procesos de acidificación y maduración (74,98,99). De otro lado los géneros
Lactobacillus sp. y Lactococcus sp, son comunes y han sido encontrados en
36 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
muchos tipo de quesos de diferentes regiones del mundo
(8,21,42,72,76,78,100,101).
Q1 y Q3 fueron las empresas que tuvieron mayor relación, de acuerdo a las bandas
obtenidas por medio de TGGE (figura 5A), es decir, comparten comunidades
bacterianas similares. Las diferencias encontradas frente a Q2, pueden estar
relacionadas con los procesos de producción, utensilio utilizados en la fabricación
y las prácticas de manufactura (41,102), uso de sustancias químicas para la
acidificación, factores que influencia de alguna manera a la diversidad de la
microbiota nativa existente.
La comparación de la diversidad encontradas mediante el análisis RISA, no mostro
una diferenciación entre las empresas. Las variaciones en la comunidades
bacterianas presente en los quesos, se dan generalmente cuando se cambia la
microbiota nativa por cultivos iniciadores o cuando se comparan diferentes sitios
donde se realizan procesos de maduración (96,103).
La microbiota encontrada por el método PCR-TGGE, mostro relación con los
géneros encontrados en los medios selectivos evaluados, contrario a lo que se ha
descrito en este tipo de acercamientos (20,27). Sin embargo, en estudios hechos
en quesos elaborados con leches acidas, han evidenciado que esta
correspondencia puede llegar a darse, por la selectividad que tienen este tipo de
ambientes con las bacterias presentes (29).
Las BAL identificadas dan bases sobre el entendimiento de que bacterias están
presentes en el queso doble crema y abren el curso de otras investigaciones que
conlleven a conocer cuales es la importancia de utilizar cultivos iniciadores con
cepas autóctonas, para así preservar las características organolépticas y
sensoriales del producto original, como lo han logrado muchos de los quesos
artesanales en Europa. En Latinoamérica, existen un gran interés de resaltar el
valor de sus productos autóctonos, tal es el caso de México (77,104), Argentina
(105,106). y Brasil (96) donde se han realizado estudio de caracterización de
algunos de sus quesos autóctonos. Colombia en la actualidad tiene muchos retos
39
para consolidar e identificar sus productos nacionales como sus quesos
tradicionales, que son parte fundamental de su cultura.
Una idea fundamental, se desprende del hecho de encontrar similitudes entre los
análisis moleculares y los cultivos dependientes. Es importante anotar que en
ambas técnicas de tamizaje priman organismos cultivables como dominantes en
las diferentes muestras analizadas. Según lo anterior, surge la pregunta acerca de
quiénes son los miembros más activos y con mayor importancia en el ecosistema;
la fracción cultivable, o ese 95-99 % que aún no ha podido ser aislado, asunto que
sin duda requiere atención e investigación adicional (28,74). El enfoque
bidireccional seguido en este trabajo, demuestra que particularmente en esta
muestra, las dos técnicas efectivamente exponen los componentes dominantes de
la comunidad. En este orden de ideas, tal parece ser que el reto en futuros estudios
de ecología y diversidad bacteriana, es de vital importancia desarrollar nuevas
tecnologías de cultivo de organismos no antes cultivados e integrar las técnicas
moleculares, cultivo dependientes y de función de las comunidades en un enfoque
totalmente polifásico, lo que sería de gran utilidad para llevar importantes avances
en la comprensión de este ecosistema y su impacto en la elaboración y calidad del
queso en la región.
38 Diversidad de bacterias ácido lácticas en queso doble crema tradicional colombiano.
5. Capítulo 5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
La diversidad de BAL aisladas e identificadas en los quesos doble crema, que se
evaluaron en este estudio correspondieron a: Pediococcus acidilactici, Weissella
paramesenteroides Weissella viridescens, Leuconostoc citreum, Leuconostoc
mesenteroides y Leuconostoc lactis. Por otro lado especies y géneros
pertenecientes a Enterococcus sp, Weissella sp, Pediococcus sp, Lactobacillus
fermetun, Lactococcus lactis, Lactoccoccus lactis subesp lactis y Leuconostoc
mesenteroides, se detectaron por TGGE.
Las bacterias que se encontraron relacionadas con el queso doble crema por medio
de métodos dependientes e independientes de cultivos han sido reportadas en
muchos tipos de quesos y ellas están relacionadas con actividades metabólicas de
importancia, que contribuyen al desarrollo de propiedades organolépticas
Las relaciones existentes entre las diferentes empresas productoras de queso
doble crema analizados en este estudio, mostraron que existen algunas
poblaciones de bacterias acido lácticas que están presentes en las muestras y los
lotes analizados para cada uno de los quesos. La diversidad de bacterias tampoco
fue muy diferente, solo Q2 presento algunos cambios, que sugieren esta
involucrados con la forma de producción.
39
Características relacionadas con el potencial tecnológico, se evaluaron para
algunos aislados representativos de especies de bacterias acido lácticas
encontrados en los quesos, donde la actividad acidificante, la producción de
diacetilo y crecimiento a concentraciones de sal (2 y 6%) fueron las importantes.
La producción de compuestos antibacterianos, evidencio la existencia de actividad
contra: Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus,
Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes.
Los cambios en las comunidades bacterianas relacionados con el queso doble
crema, presentes en este estudio, contribuyen al fortalecimiento del conocimiento
en este tipo de productos autóctonos, que dan pie a proponer nuevas alternativas
para promover su conservación mediante distinciones como protección de
Denominación de Origen (DO).
5.2. Recomendaciones.
En Colombia existen pocos acercamientos al conocimiento de la composición
microbiana en sus productos autóctonos; establecer y entender como están
actuando en determinado alimento es fundamental para ayudar entender su aporte
en la producción. Para esto se debe profundizar en estudios donde se apliquen
métodos moleculares más gruesos, relacionados con genómica y transcriptomica,
donde se puedan obtener con mayor información sobre la composición de este
queso y sus metabolismos relacionados
41
A. Anexo A: Tablas con recuentos totales y de bacterias ácido lácticas.
Anexo 1. Recuento1 de bacterias acido lácticas. Q1 SD3 Q2 SD Q3 SD
M172 6,8 6,2 6,4 6,2 6,8 6,4
MRS2 6,7 6,2 6,3 5,3 7,0 6,5
Epifluorecencia3 7,0 6,3 6,9 6,4 7,1 6,1 1Log10 de los valores obtenidos en los recuentos UFC- Celulas/g. 2Medios de cultivos evaluados. 3 Recuento de bacterias totales. 3SD: desviación estándar.
I Anexo 1. Bacterias en tinción con naranja de acridina,
en microscopia de epiflouerecencia, 100X .
43
B. Anexo B: Análisis RISA de los aislados.
Anexo B. Análisis clúster de los patrones de bandeo ITS de las bacterias aisladas de los
quesos. Resultado obtenido por el método: PEARSO- LINKAGE,
45
C. Anexo C: Tinción gram de los géneros identificados.
Leuconostoc sp.
Pediococcus sp.
Weissella sp.
46
D. Anexo D: foto de las pruebas de caracterización tecnológicas de cepas BAL.
Q3-3
Q2-5 Q1-9 Q2-11 Q3-6
Q3-3
Q2-5 Q1-9 Q2-11 Q3-6
Control +: Act. Proteolítica Act. Lipolítica.
Act. Lipolítica Act. Proteolítica
Q3-3 Q2-5 Q1-9 Q3-6 Q2-11 C+ C-
Control +: Act. Proteolítica Act. Lipolítica. Control +: Act. Proteolítica Act. Lipolítica.
Producción de diacetilo.
Salmonella typhimurium
Q3-3
Q2-5
Q1-9
Q2-11
Q3-6 C+
C-
Staphylococcus aureus
Q3-3
Q2-5
Q1-9
Q2-11 Q3-6
C+
C-
Escherichia coli
Q3-3
Q2-5
Q1-9
Q2-11 Q3-6
C+ C-
Actividad antimicrobiana.
47
Q3-3
Q2-5 Q1-9
C+ Q2-11
Q3-6
C-
Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis
Q3-3
Q2-5 Q1-9
C+ Q2-11
Q3-6
C-
48
E. Anexo E: Gel resultado del TGGE y relación taxonómica de las bandas.
Anexo E. Taxonomía de las identificaciones de las bandas de TGGE.
Reino: Bacteria Bacteria Bacteria Bacteria Bacteria Bacteria
División: Firmicutes Firmicutes Firmicutes Firmicutes Firmicutes Firmicutes
Clase: Bacilli Bacilli Bacilli Bacilli Bacilli Bacilli
Orden: Lactobacillales Lactobacillales Lactobacillales Lactobacillale
s Lactobacillal
es
Lactobacillales
Familia: Leuconostoca
ceae Lactobacillace
ae Leuconostocaceae
Streptococcaceae
Lactobacillaceae
Enterococcaceae
Género Leuconostoc Pediococcus.
( Banda 1) Weissella. (Banda 4)
Lactococcus Lactobacillus Enterococcus (Banda 7)
Q1 L1 Q1 L2 Q1L3 Q2 Q3L1 M Q3L2 Q3L3
2
4
3
5
7
1
6
Anexo E. Patrones de bandas para tres diferentes quesos mediante la electroforesis en gel con
gradiente de temporal de temperatura.
49
Especie Leuconostoc
mesenteroides (Banda 2)
. Lactoccoccus lactis subesp lactis (Banda
6) Lactococcus lactis.(Banda
5)
Lactobacillus fermetun (Banda 3)
Códigos de acceso en GenBank: Banda1: KX097974 , banda 2: KX097975 , Banda 3: KX097976 , banda 4: KX097977, banda 5: KX097978 , banda 6: KX097979, banda 7: KX097980
51
Bibliografía.
1. Mejía LG, De Arango MJ, Sepúlveda JU. Quesos frescos y de pasta hilada. (Medellín) -Universidad Nacional de Colombia, editor. Colombia; 1995. 190 p.
2. Trade and Market Division of FAO. Food Outlook, Biannual report on global food markets. 2015;(November):1–133.
3. Arango J. La industria del queso en Colombia cultura láctea. Despertar lechero. Colombia; 2004. p. 117–37.
4. Papagianni M. Metabolic Engineering of Lactic Acid Bacteria for the Production of Industrially Important Compounds. Comput Struct Biotechnol J [Internet]. Research Network of Computational and Structural Biotechnology; 2012;3(4):1–8. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2001037014600593
5. Pedersen TB, Ristagno D, McSweeney PLH, Vogensen FK, Ardö Y. Potential impact on cheese flavour of heterofermentative bacteria from starter cultures. Int Dairy J [Internet]. Elsevier Ltd; 2013;33(2):112–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2013.03.003
6. Yvon M, Rijnen L. Cheese flavour formation by amino acid catabolism. Int Dairy J [Internet]. 2001;11(4–7):185–201. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694601000498
7. Alegría Á, Szczesny P, Mayo B, Bardowski J, Kowalczyk M. Biodiversity in Oscypek, a traditional Polish Cheese, determined by culture-dependent and -independent approaches. Appl Environ Microbiol. 2012;78(6):1890–8.
8. Casalta E, Sorba JM, Aigle M, Ogier JC. Diversity and dynamics of the microbial community during the manufacture of Calenzana, an artisanal Corsican cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2009;133(3):243–51. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.05.022
9. Ahrne S, Pettersson B, Molin G, Va a. Temporal temperature gradient gel electrophoresis ( TTGE ) as a tool for identi ® cation of Lactobacillus casei , Lactobacillus paracasei , Lactobacillus zeae and Lactobacillus rhamnosus. Lett Appl Microbiol. 2001;215–9.
10. Monnet C, Bogovic Matijasic B. Application of PCR-based methods to dairy products and to non-dairy probiotic products. Polymerase Chain Reaction. 2012. 11-51 p.
11. Walter J. Ecological Role of Lactobacilli in the Gastrointestinal Tract: Implications for Fundamental and Biomedical Research. Appl Environ Microbiol [Internet]. 2008 Aug 15;74(16):4985–96. Available from: http://aem.asm.org/content/74/16/4985.short
12. Novoa CF, Lopez NC. Evaluación de la vida útil sensorial del queso doble crema con dos niveles de grasa. Rev Med Vet y Zootec 55. 2008;(1):91–9.
13. Palacios Villarraga IA. Análisis de la demanda de lácteos en Colombia (2007-2013) [Internet]. 2014. Available from: http://repositorio.escuelaing.edu.co/handle/001/176
14. Osorio DP, Novoa CF, Gutierrez LF. Determinación e la viabilidad de la nariz electrónica en la predicción de la vida útil del queso doble crema. Rev Aliment Hoy 21. 2012;26(45):26–42.
15. Ramírez-Navas JS. Propiedades funcionales de los quesos. Tecnol Láctea Latinoam. 2010;64(1):40–7.
16. Beresford TP, Fitzsimons NA, Brennan NL, Cogan TM. Recent advances in cheese microbiology. Int Dairy J. 2001;11(4–7):259–74.
17. Fox PF, McSweeney PLH, Cogan TM, Guinee TP. Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology: Major Cheese Groups [Internet]. Elsevier Science; 2004. Available
52
from: https://books.google.com.co/books?id=7juYW_Rz9y4C 18. Paul L.H. McSweeney MJS. Biochemical pathways for the production of flavour
compounds in cheeses during ripening: A review. Lait. 2000;80(3):293–324. 19. Lara-Villoslada F, Olivares M, Xaus J. Chapter 4 - Safety of Probiotic Bacteria. In:
Preedy RRWR, editor. Bioactive Foods in Promoting Health [Internet]. Boston: Academic Press; 2010. p. 47–58. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123749383000049
20. Papagianni M, Leroy F, De Vuyst L, Monnet C, Bogovic Matijasic B, Lara-Villoslada F, et al. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Preedy RRWR, editor. Trends Food Sci Technol. Boston: Academic Press; 2004;15(2):67–78.
21. Mei J, Guo Q, Wu Y, Li Y. Microbial diversity of a camembert-type cheese using freeze-dried Tibetan kefir coculture as starter culture by culture-dependent and culture-independent methods. Al-Ahmad A, editor. PLoS One [Internet]. San Francisco, USA: Public Library of Science; 2014 Oct 31;9(10):e111648. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4216126/
22. Aponte M, Fusco V, Andolfi R, Coppola S. Lactic acid bacteria occurring during manufacture and ripening of Provolone del Monaco cheese: Detection by different analytical approaches. Int Dairy J. 2008;18(4):403–13.
23. Botina SG, Tsygankov YD, Sukhodolets V V. Identification of industrial strains of lactic acid bacteria by methods of molecular genetic typing. Russ J Genet [Internet]. 2006;42(12):1367–79. Available from: http://dx.doi.org/10.1134/S1022795406120039
24. Bonomo MG, Ricciardi A, Zotta T, Parente E, Salzano G. Molecular and technological characterization of lactic acid bacteria from traditional fermented sausages of Basilicata region (Southern Italy). Meat Sci. 2008;80(4):1238–48.
25. Flórez AB, Hernández-Barranco AM, Marcos I, Mayo B. Biochemical and microbiological characterization of artisan kid rennet extracts used for Cabrales cheese manufacture. LWT - Food Sci Technol [Internet]. 2006 Aug [cited 2016 Mar 23];39(6):605–12. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643805000873
26. Wessels S, Axelsson L, Bech Hansen E, De Vuyst L, Laulund S, Lähteenmäki L, et al. The lactic acid bacteria, the food chain, and their regulation. Trends Food Sci Technol [Internet]. 2004 Oct [cited 2016 Mar 23];15(10):498–505. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924224404000950
27. Quigley L, O’Sullivan O, Beresford TP, Ross RP, Fitzgerald GF, Cotter PD. Molecular approaches to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2011;150(2–3):81–94. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.08.001
28. Fuka MM, Wallisch S, Engel M, Welzl G, Havranek J, Schloter M. Dynamics of Bacterial Communities during the Ripening Process of Different Croatian Cheese Types Derived from Raw Ewe’s Milk Cheeses. PLoS One [Internet]. Public Library of Science; 2013;8(11):e80734. Available from: http://dx.doi.org/10.1371%2Fjournal.pone.0080734
29. Cocolin L, Alessandria V, Dolci P, Gorra R, Rantsiou K. Culture independent methods to assess the diversity and dynamics of microbiota during food fermentation. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2013;167(1):29–43. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.05.008
30. Dolci P, Alessandria V, Rantsiou K, Cocolin L. Advanced methods for the
53
identification, enumeration, and characterization of microorganisms in fermented foods [Internet]. Advances in Fermented Foods and Beverages: Improving Quality, Technologies and Health Benefits. Elsevier Ltd; 2014. 157-176 p. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/B978-1-78242-015-6.00007-4
31. Pogačić T, Mancini A, Santarelli M, Bottari B, Lazzi C, Neviani E, et al. Diversity and dynamic of lactic acid bacteria strains during aging of along ripened hard cheese produced from raw milk and undefined natural starter. Food Microbiol. 2013;36(2):207–15.
32. Ercolini D, Hill PJ, Dodd CER. Bacterial community structure and location in Stilton cheese. Appl Environ Microbiol. 2003;69(6):3540–8.
33. Bottari B, Santarelli M, Neviani E, Gatti M. Natural whey starter for Parmigiano Reggiano: Culture-independent approach. J Appl Microbiol. 2010;108(5):1676–84.
34. Fernández R, Le S. DGGE : electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante. 2009;149–74. Available from: www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/dgge.pdf
35. Bonetta SS, Bonetta SS, Carraro E, Rantsiou K, Cocolin L. Microbiological characterisation of Robiola di Roccaverano cheese using PCR-DGGE. Food Microbiol [Internet]. 2008 Sep [cited 2016 Mar 22];25(6):786–92. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002008000828
36. Gala E, Landi S, Solieri L, Nocetti M, Pulvirenti A, Giudici P. Diversity of lactic acid bacteria population in ripened Parmigiano Reggiano cheese. Int J Food Microbiol. Netherlands; 2008 Jul;125(3):347–51.
37. Neviani E, Bottari B, Lazzi C, Gatti M. New developments in the study of the microbiota of raw-milk, long-ripened cheeses by molecular methods: the case of Grana Padano and Parmigiano Reggiano. Front Microbiol [Internet]. Frontiers Media S.A.; 2013 Feb 28;4:36. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3584316/
38. Guidone A, Ricciardi A, Romaniello A, Bonomo MG, Morone G, Zotta T, et al. Microbial changes of natural milk cultures for mozzarella cheese during repeated propagation cycles. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2016;65:572–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2015.08.031
39. Guidone A, Zotta T, Matera A, Ricciardi A, De Filippis F, Ercolini D, et al. The microbiota of high-moisture mozzarella cheese produced with different acidification methods. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2016;216:9–17. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.09.002
40. Herreros MA, Fresno JM, González Prieto MJ, Tornadijo ME. Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a Spanish goats’ milk cheese). Int Dairy J [Internet]. 2003;13(6):469–79. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694603000542
41. Scatassa ML, Gaglio R, Macaluso G, Francesca N, Randazzo W, Cardamone C, et al. Transfer, composition and technological characterization of the lactic acid bacterial populations of the wooden vats used to produce traditional stretched cheeses. Food Microbiol [Internet]. Elsevier Ltd; 2015;52(2074):31–41. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002015001197
42. Gobbetti M, De Angelis M, Di Cagno R, Mancini L, Fox PF. Pros and cons for using non-starter lactic acid bacteria (NSLAB) as secondary/adjunct starters for cheese ripening. Trends Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2015;45(2):167–78. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.tifs.2015.07.016
43. Quigley L, O’Sullivan O, Stanton C, Beresford TP, Ross RP, Fitzgerald GF, et al.
54
The complex microbiota of raw milk. FEMS Microbiol Rev. 2013;37(5):664–98. 44. Peláez C, Requena T. Exploiting the potential of bacteria in the cheese ecosystem.
Int Dairy J [Internet]. 2005;15(6–9):831–44. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694604003206
45. Instituto de Ciencia y Tecnología de alimentos. Guía para producción de quesos Colombianos, Inventario y desarrollo de la Tecnología de Productos lácteos Campesinos Colombia. 1986.
46. Bottari B, Santarelli M, Neviani E, Gatti M. Natural whey starter for Parmigiano Reggiano: Culture-independent approach. J Appl Microbiol. 2010;108(5):1676–84.
47. Moreno C, Romero J, Espejo RT. Polymorphism in repeated 16S PRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio. Microbiology. 2002;148(4):1233–9.
48. Sanguinetti CJ, Dias Neto E, Simpson AJ. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Vol. 17, BioTechniques. UNITED STATES; 1994 Nov.
49. Nei M, Li WH. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci U S A. UNITED STATES; 1979 Oct;76(10):5269–73.
50. Mohammadi SA, Prasanna BM. Analysis of Genetic Diversity in Crop Plants—Salient Statistical Tools and Considerations. Crop Sci [Internet]. Madison, WI: Crop Science Society of America; 2003;43. Available from: http://dx.doi.org/10.2135/cropsci2003.1235
51. Piraino P, Zotta T, Ricciardi A, McSweeney PLH, Parente E. Acid production, proteolysis, autolytic and inhibitory properties of lactic acid bacteria isolated from pasta filata cheeses: A multivariate screening study. Int Dairy J [Internet]. 2008;18(1):81–92. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694607001203
52. Franciosi E, Settanni L, Cavazza A, Poznanski E. Biodiversity and technological potential of wild lactic acid bacteria from raw cows’ milk. Int Dairy J [Internet]. 2009;19(1):3–11. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694608001428
53. Nieto-Arribas P, Sesena S, Poveda JM, Palop L, Cabezas L. Genotypic and technological characterization of Leuconostoc isolates to be used as adjunct starters in Manchego cheese manufacture. Food Microbiol. 2009/11/17. 2010;27(1):85–93.
54. Latorre I, Navarro CER. Caracterización bioquímica y tecnológica de cepas ácido lácticas aisladas de leche cruda de oveja en el proceso de elaboración de queso artesano de Teruel [Thesis]. Vol. Especializ, Departamento de Química Analítica, Área de Química Analítica . [España.]: Universidad de Zaragoza; 2011.
55. Kostinek M, Specht I, Edward VA, Schillinger U, Hertel C, Holzapfel WH, et al. Diversity and technological properties of predominant lactic acid bacteria from fermented cassava used for the preparation of Gari, a traditional African food. Syst Appl Microbiol. 2005;28(6):527–40.
56. Wilson GS, Raftos DA, Corrigan SL, Nair S V. Diversity and antimicrobial activities of surface-attached marine bacteria from Sydney Harbour, Australia. Microbiol Res [Internet]. Elsevier; 2010;165(4):300–11. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.micres.2009.05.007
57. Gomez AM, Yannarell AC, Sims GK, Cadavid-Restrepo G, Moreno Herrera CX. Characterization of bacterial diversity at different depths in the Moravia Hill landfill site at Medellín, Colombia. Soil Biol Biochem [Internet]. 2011 Jun [cited 2016 Mar
55
24];43(6):1275–84. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807171100109X
58. Wright ES, Yilmaz LS, Noguera DR. DECIPHER, a Search-Based Approach to Chimera Identification for 16S rRNA Sequences. Appl Environ Microbiol [Internet]. 2012 Feb 1;78(3):717–25. Available from: http://aem.asm.org/content/78/3/717.abstract
59. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. ENGLAND; 1997 Sep;25(17):3389–402.
60. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. ENGLAND; 1994 Nov;22(22):4673–80.
61. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. UNITED STATES; 1987 Jul;4(4):406–25.
62. Cock LS, Hernández LJ V, Gaona RC. Cinética de fermentación y acción antimicrobiana de Weissella confusa contra Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae. Rev Fac Ing. 2010;1(55):55–65.
63. Duval P, Chatelard-Chauvin C, Gayard C, Rifa E, Bouchard P, Hulin S, et al. Microbial dynamics in industrial Blue veined cheeses in different packaging. Int Dairy J [Internet]. 2016 Feb [cited 2016 Feb 15];56:198–207. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694616300073
64. Georgescu M, Dobrea M, Georgescu D. Microbial Population Dynamics in Presence of Lactococcal Bacteriophage During Ripening of Traditional Raw Milk Romanian Cheese. Agric Agric Sci Procedia [Internet]. 2015 [cited 2016 Mar 25];6:324–31. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2210784315002193
65. Ryssel M, Johansen P, Al-Soud WA, Sørensen S, Arneborg N, Jespersen L. Microbial diversity and dynamics throughout manufacturing and ripening of surface ripened semi-hard Danish Danbo cheeses investigated by culture-independent techniques. Int J Food Microbiol [Internet]. 2015 Dec 23 [cited 2016 Mar 19];215:124–30. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515301252
66. Pangallo D, Saková N, Koreňová J, Puškárová A, Kraková L, Valík L, et al. Microbial diversity and dynamics during the production of May bryndza cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. 2014 Jan 17 [cited 2016 Mar 25];170:38–43. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016816051300487X
67. Aldrete-Tapia A, Escobar-Ramirez MC, Tamplin ML, Hernandez-Iturriaga M. High-throughput sequencing of microbial communities in Poro cheese, an artisanal Mexican cheese. Food Microbiol. 2014;44:136–41.
68. Kafili T, Razavi SH, Djomeh ZE, Naghavi MR, ??lvarez-Mart??n P, Mayo B. Microbial characterization of Iranian traditional Lighvan cheese over manufacturing and ripening via culturing and PCR-DGGE analysis: Identification and typing of dominant lactobacilli. Eur Food Res Technol. 2009;229(1):83–92.
69. Golic N, Cadez N, Terzic-Vidojevic A, Suranska H, Beganovic J, Lozo J, et al. Evaluation of lactic acid bacteria and yeast diversity in traditional white pickled and fresh soft cheeses from the mountain regions of Serbia and lowland regions of Croatia. Int J Food Microbiol. 2013/08/27. 2013;166(2):294–300.
70. De Dea Lindner J, Bernini V, De Lorentiis A, Pecorari A, Neviani E, Gatti M.
56
Parmigiano Reggiano cheese: evolution of cultivable and total lactic microflora and peptidase activities during manufacture and ripening. Dairy Sci Technol. 2008;88:511–23.
71. Gatti M, Bernini V, Lazzi C, Neviani E. Fluorescence microscopy for studying the viability of micro-organisms in natural whey starters. Lett Appl Microbiol. 2006;42(4):338–43.
72. Picon A, Garde S, Ávila M, Nuñez M. Microbiota dynamics and lactic acid bacteria biodiversity in raw goat milk cheeses. Int Dairy J. 2015;
73. Garabal JI, Rodríguez-Alonso P, Centeno JA. Characterization of lactic acid bacteria isolated from raw cows’ milk cheeses currently produced in Galicia (NW Spain). LWT - Food Sci Technol [Internet]. 2008;41(8):1452–8. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643807003052
74. Carraro L, Maifreni M, Bartolomeoli I, Martino ME, Novelli E, Frigo F, et al. Comparison of culture-dependent and -independent methods for bacterial community monitoring during Montasio cheese manufacturing. Res Microbiol [Internet]. Elsevier Masson SAS; 2011;162(3):231–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.resmic.2011.01.002
75. Patel A, Falck P, Shah N, Immerzeel P, Adlercreutz P, Stålbrand H, et al. Evidence for xylooligosaccharide utilization in Weissella strains isolated from Indian fermented foods and vegetables. FEMS Microbiol Lett. 2013;346(1):20–8.
76. Di Cagno R, Buchin S, de Candia S, De Angelis M, Fox PF, Gobbetti M. Characterization of Italian Cheeses Ripened Under Nonconventional Conditions. J Dairy Sci [Internet]. Elsevier; 2007;90(6):2689–704. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030207700796
77. Chombo-Morales P, Kirchmayr M, Gschaedler A, Lugo-Cervantes E, Villanueva-Rodríguez S. Effects of controlling ripening conditions on the dynamics of the native microbial population of Mexican artisanal Cotija cheese assessed by PCR-DGGE. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2016;65:1153–61. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2015.09.044
78. Terzic-Vidojevic A, Mihajlovic S, Uzelac G, Veljovic K, Tolinacki M, Nikolic M, et al. Characterization of lactic acid bacteria isolated from artisanal Travnik young cheeses, sweet creams and sweet kajmaks over four seasons. Food Microbiol. 2014/01/07. 2014;39:27–38.
79. Nikolic M, Terzic-Vidojevic A, Jovcic B, Begovic J, Golic N, Topisirovic L. Characterization of lactic acid bacteria isolated from Bukuljac, a homemade goat’s milk cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. 2008;122(1–2):162–70. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160507006654
80. Badis A, Guetarni D, Moussa Boudjema B, Henni DE, Kihal M. Identification and technological properties of lactic acid bacteria isolated from raw goat milk of four Algerian races. Food Microbiol [Internet]. 2004;21(5):579–88. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002003001199
81. Pogačić T, Chuat V, Madec MN, Samaržija D, Lortal S, Valence F. Phenotypic traits of genetically closely related Leuconostoc spp. Int Dairy J. 2014;39(1):96–101.
82. Cheong EYL, Sandhu A, Jayabalan J, Kieu Le TT, Nhiep NT, My Ho HT, et al. Isolation of lactic acid bacteria with antifungal activity against the common cheese spoilage mould Penicillium commune and their potential as biopreservatives in cheese. Food Control [Internet]. Elsevier Ltd; 2014;46:91–7. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.05.011
83. Montoya D, Boylston TD, Mendonca A. Preliminary screening of Bifidobacteria spp.
57
and Pediococcus acidilactici in a Swiss cheese curd slurry model system: Impact on microbial viability and flavor characteristics. Int Dairy J [Internet]. Elsevier Ltd; 2009;19(10):605–11. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.04.005
84. Dolci P, Alessandria V, Zeppa G, Rantsiou K, Cocolin L. Microbiological characterization of artisanal Raschera PDO cheese: analysis of its indigenous lactic acid bacteria. Food Microbiol. 2008/01/22. 2008;25(2):392–9.
85. Nieto-Arribas P, Seseña S, Poveda JM, Palop L, Cabezas L. Genotypic and technological characterization of Leuconostoc isolates to be used as adjunct starters in Manchego cheese manufacture. Food Microbiol. 2010;27(1):85–93.
86. Asteri IA, Robertson N, Kagkli DM, Andrewes P, Nychas G, Coolbear T, et al. Technological and flavour potential of cultures isolated from traditional Greek cheeses - A pool of novel species and starters. Int Dairy J [Internet]. Elsevier Ltd; 2009;19(10):595–604. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.04.006
87. Callon C, Retureau E, Didienne R, Montel MC. Microbial biodiversity in cheese consortia and comparative Listeria growth on surfaces of uncooked pressed cheeses. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;174:98–109. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.01.003
88. Bozoudi D, Kotzamanidis C, Hatzikamari M, Tzanetakis N, Menexes G, Litopoulou-Tzanetaki E. A comparison for acid production, proteolysis, autolysis and inhibitory properties of lactic acid bacteria from fresh and mature Feta PDO Greek cheese, made at three different mountainous areas. Int J Food Microbiol [Internet]. 2015;200:87–96. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000781
89. Di Cagno R, Quinto M, Corsetti A, Minervini F, Gobbetti M. Assessing the proteolytic and lipolytic activities of single strains of mesophilic lactobacilli as adjunct cultures using a Caciotta cheese model system. Int Dairy J [Internet]. 2006;16(2):119–30. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095869460500035X
90. Delgado FJ, González-Crespo J, Cava R, Ramírez R. Changes in microbiology, proteolysis, texture and sensory characteristics of raw goat milk cheeses treated by high-pressure at different stages of maturation. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2012;48(2):268–75. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2012.03.025
91. Cretenet M, Laroute V, Ulve V, Jeanson S, Nouaille S, Even S, et al. Dynamic analysis of the Lactococcus lactis transcriptome in cheeses made from milk concentrated by ultrafiltration reveals multiple strategies of adaptation to stresses. Appl Environ Microbiol. United States; 2011 Jan;77(1):247–57.
92. Montel MC, Buchin S, Mallet A, Delbes-Paus C, Vuitton DA, Desmasures N, et al. Traditional cheeses: Rich and diverse microbiota with associated benefits. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;177:136–54. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.02.019
93. Aljewicz M, Cichosz G, Nalepa B, Bielecka M. The effect of milk fat substitution with palm fat on lactic acid bacteria counts in cheese-like products. LWT - Food Sci Technol [Internet]. 2016;66:348–54. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0023643815302607
94. Fox PF, Cogan TM. Factors that Affect the Quality of Cheese BT - Starter cultures: General aspects. Start Cult Gen Asp [Internet]. 2004;Volume 1:583–608. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874558X04800848\n(null)
95. Singh S, Goswami P, Singh R, Heller KJ. Application of molecular identification tools
58
for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: A review. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2009;42(2):448–57. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2008.05.019
96. Arcuri EF, El Sheikha AF, Rychlik T, Piro-Métayer I, Montet D. Determination of cheese origin by using 16S rDNA fingerprinting of bacteria communities by PCR-DGGE: Preliminary application to traditional Minas cheese. Food Control [Internet]. Elsevier Ltd; 2013;30(1):1–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2012.07.007
97. Alessandria V, Dolci P, Rantsiou K, Pattono D, Dalmasso A, Civera T, et al. Microbiota of the Planalto de Bolona: An artisanal cheese produced in uncommon environmental conditions in the Cape Verde Islands. World J Microbiol Biotechnol. 2010;26(12):2211–21.
98. Tormo H, Ali Haimoud Lekhal D, Roques C. Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from raw goat milk and effect of farming practices on the dominant species of lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol. 2015/06/18. 2015;210:9–15.
99. Tormo H, Ali Haimoud Lekhal D, Roques C. Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria isolated from raw goat milk and effect of farming practices on the dominant species of lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol [Internet]. 2015/06/18. Elsevier B.V.; 2015;210:9–15. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000720
100. Perin LM, Dal Bello B, Belviso S, Zeppa G, de Carvalho AF, Cocolin L, et al. Microbiota of Minas cheese as influenced by the nisin producer Lactococcus lactis subsp. lactis GLc05. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2015;214:159–67. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2015.08.006
101. Vannini L, Patrignani F, Iucci L, Ndagijimana M, Vallicelli M, Lanciotti R, et al. Effect of a pre-treatment of milk with high pressure homogenization on yield as well as on microbiological, lipolytic and proteolytic patterns of “Pecorino” cheese. Int J Food Microbiol [Internet]. 2008;128(2):329–35. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160508004959
102. Lortal S, Di Blasi A, Madec MN, Pediliggieri C, Tuminello L, Tanguy G, et al. Tina wooden vat biofilm: A safe and highly efficient lactic acid bacteria delivering system in PDO Ragusano cheese making. Int J Food Microbiol [Internet]. Elsevier B.V.; 2009;132(1):1–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.02.026
103. Randazzo CL, Vaughan EE, Caggia C. Artisanal and experimental Pecorino Siciliano cheese: Microbial dynamics during manufacture assessed by culturing and PCR-DGGE analyses. Int J Food Microbiol. 2006;109(1–2):1–8.
104. Morales-Celaya MF, Lobato-Calleros C, Alvarez-Ramirez J, Vernon-Carter EJ. Effect of milk pasteurization and acidification method on the chemical composition and microstructure of a Mexican pasta filata cheese. LWT - Food Sci Technol [Internet]. Elsevier Ltd; 2012;45(2):132–41. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lwt.2011.08.015
105. Wolf IV, Perotti MC, Bernal SM, Zalazar CA. Study of the chemical composition, proteolysis, lipolysis and volatile compounds profile of commercial Reggianito Argentino cheese: Characterization of Reggianito Argentino cheese. Food Res Int [Internet]. 2010 May [cited 2016 Mar 27];43(4):1204–11. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996910000785
106. Candioti MC, Hynes E, Quiberoni A, Palma SB, Sabbag N, Zalazar CA. Reggianito Argentino cheese: influence of Lactobacillus helveticus strains isolated from natural