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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE-UFRN
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA - PPGEQ
Dissertação de Mestrado
Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em
resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi.
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino Dos Santos
Coorientador: Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior
NATAL/RN
FEVEREIRO/2017
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão
Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina
Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi.
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Engenharia Química,
sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo
Silvino dos Santos e coorientação do Dr.
Francisco Canindé de Sousa Junior.
NATAL/RN
FEVEREIRO/2017
Catalogação de Publicação na Fonte.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN / Sistema de Bibliotecas - SISBI
Biblioteca Setorial Especializada em Engenharia Química - CT
Leitão, Ana Laura Oliveira de Sá.
Avaliação de métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados
em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i.
chagasi / Ana Laura Oliveira de Sá Leitão. - Natal, 2017.
96f.: il.
Orientador: Everaldo Silvino dos Santos.
Coorientador: Francisco Canindé de Sousa Junior.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro
de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação
em Engenharia Química.
1. Leishmaniose - Dissertação. 2. Adsorção - Dissertação. 3. Lipopolissacarídeos
- Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Sousa Junior, Francisco Canindé de.
III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSEQ CDU 616.993.161(043.3)
LEITÃO, Ana Laura Oliveira de Sá – Avaliação de métodos de rompimento celular e de
diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno
503 de Leishmania i. chagasi. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de
Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos químicos, catalíticos e
biotecnológicos, 2017, Natal/RN, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Coorientador: Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior
RESUMO
Com o desenvolvimento da indústria biotecnológica, é crescente o interesse por antígenos
recombinantes purificados para obtenção de vacinas. Porém, para essa aplicação esses
antígenos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso é de grande relevância o
desenvolvimento de técnicas que permitam a redução do número de operações unitárias
necessárias ao processo de purificação, permitindo ainda uma elevada recuperação e
proporcionando uma maior economia na obtenção dos bioprodutos. A Adsorção em Leito
Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa propícia para o downstream
processing, pois é uma técnica cromatográfica de modo simples e de baixo custo, que integra
as etapas de clarificação, concentração, purificação em uma única operação. Neste contexto, o
presente trabalho tem como objetivo avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes
metais imobilizados em resina Streamline chelating para purificação do antígeno 503 de
Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacarídeos (LPS) liberados
durante a etapa de rompimento celular. Primeiramente, foi avaliado qual o melhor método de
rompimento celular para obtenção da proteína intracelular. As estratégias estudadas utilizando
lisozima, pérolas de vidro, ureia e EDTA foram avaliadas através de quatro planejamentos
experimentais. Em seguida, foram realizados testes de adsorção em batelada, utilizando-se
cinco íons metálicos (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) nas concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L
acoplados na resina Streamline chelating, escolhendo-se o metal que apresentou melhor
adsorção do antígeno para os ensaios usando ALE. Posteriormente, foi estimada a quantidade
mínima de tensoativo Triton X-114 necessária na etapa de lavagem da ALE para remoção do
LPS, a fim de obter-se o antígeno 503 livre desse contaminante. E por fim, foram realizados
ensaios de ALE visando recuperar e purificar a proteína de interesse. Para os ensaios usando
ALE utilizou-se uma coluna de 2,6 cm de diâmetro por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba
peristáltica. Com os planejamentos experimentais realizados para avaliação do rompimento
celular, observou-se que maiores quantidades de proteínas totais e do antígeno 503 liberadas
foram obtidas para o método da ureia e que o único fator significativo para esse planejamento
foi a concentração, correspondente a 8,0 M. Como resultado para a triagem do íon metálico, o
cobre (Cu2+) foi o metal que apresentou maior capacidade de adsorção do antígeno 503,
apresentando valores de capacidade de adsorção de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente
para as concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L, respectivamente. Tem-se ainda que para as três
condições analisadas (0,01, 0,05 e 0,1 % de Triton X-114) na etapa de lavagem da ALE o
percentual de remoção de LPS foi elevado e que a concentração mínima utilizada (0,01 %) já
foi suficiente para a remoção de 99,70 % deste contaminante. Para o teste de ALE utilizando
eluição isocrática (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recuperação (3,0
%) do antígeno 503. Avaliou-se então a eluição em degrau, inicialmente em dois passos,
aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Porém, esta estratégia ainda não
foi eficiente para recuperar a proteína de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total
de três passos de eluição, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse último teste mostrou uma recuperação
de 15,0 % da proteína de interesse e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0.
Portanto, a técnica cromatográfica de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC)
mostrou ser uma alternativa eficiente na recuperação e purificação do antígeno 503 a partir do
homogeneizado de E. coli não clarificado.
Palavras-chave: Adsorção em Leito Expandido, purificação, íon metálico, antígeno 503,
remoção de LPS.
LEITÃO, Ana Laura Oliveira de Sá – Avaliação de métodos de rompimento celular e de
diferentes metais imobilizados em resina Streamline Chelating para purificação do antígeno
503 de Leishmania i. chagasi. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de
Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos químicos, catalíticos e
biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos
Coorientador: Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior
ABSTRACT
Due to the development of biotechnology industry, there is a growing interest in purified
recombinant antigens to obtain vaccines. However, for this application these antigens require a
high degree of purity, thus, it is of great relevance the development of techniques that allow the
reduction in the number of unitary operations required for the purification process, this would
also allow a high recovery and a greater saving in obtaining bioproducts. The Expanded Bed
Adsorption (EBA) has shown as a suitable alternative for downstream processing, once it is a
simple and low cost chromatographic technique that integrates clarification, concentration and
purification in a single operation. This study aims at evaluating the methods of cell disruption
and the different metals immobilized in Streamline Chelating resin for purification of
Leishmania i. chagasi 503 antigen by EBA as well as removing the lipopolysaccharides
(endotoxin) released during the stage of cell disruption. Firstly, the best method of cell
disruption to obtain intracellular protein was evaluated. The strategies studied using lysozyme,
glass beads, urea and EDTA were evaluated through four experimental designs. Then, batch
adsorption tests were carried out using five metal ions (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ and Fe3+) at
concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M coupled in the Streamline chelating resin, selecting the
metal that showed the best adsorption of the antigen for the assays using EBA. Then, the
minimum amount of Triton X-114 tensioactive required in the EBA wash stage for LPS removal
was estimated in order to obtain the 503 antigen free of this contaminant. Finally, EBA assays
were performed in order to recover and purify the protein of interest. EBA experiments were
carried out using a column of 2.6 cm in diameter (30 cm height), coupled to a peristaltic pump.
The experimental plannings carried out to evaluate cell disruption, showed that higher amounts
of total proteins and 503 antigen released were obtained for the urea method and that the only
significant factor for this planning was the concentration corresponding to 8.0 M. As a result of
the metal ion screening, copper (Cu2+) was the metal with the highest adsorption capacity of
503 antigen, presenting adsorption capacity values of 0.102, 0.128 and 0.111 mg / mL of
adsorbent at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M, respectively. For the three analyzed
conditions (0.01, 0.05 and 0.1% Triton X-114) in the EBA washing stage, the percentage of
LPS removal was high and the minimum concentration used (0.01%) was enough to remove
99.70% of this contaminant. For the EBA test using isocratic elution (0.6 M imidazole) the
results obtained showed a low recovery (3.0 %) of the 503 antigen. The step elution was then
evaluated, initially in two steps, applying 0.6 M and then 1.0 M imidazole. However, this
strategy has not yet been effective in recovering the protein of interest. A new assay was
performed, with a total of three elution steps, using 0.3 and 0.6 M. This test showed that a
recovery of 15.0% of the protein of interest and a purification factor of 3.0. Therefore, the
immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) technique has been shown to be an
efficient alternative in the recovery and purification of the 503 antigen from the homogenized
E. coli unclarified.
Keywords: Expanded Bed Adsorption, purification, metallic ion, 503 antigen, LPS removal.
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela vida, força, fé e coragem.
Aos meus pais, Gerardo e Lucinha, e ao meu irmão Bruno, pelo amor, afeto, dedicação e
confiança sempre depositada.
À minha vovó Laura (in memoriam), por sua infinita bondade, pelo carinho e cuidado de mãe
e pelas orações a mim ofertadas.
Ao meu orientador Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos, pela orientação, disponibilidade,
comprometimento e atenção oferecidos durante este trabalho.
Ao meu coorientador Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior, pela forma que me acolheu no
LEB e por ter sido tão solícito durante todo esse tempo de desenvolvimento da pesquisa.
Ao meu namorado Mauro André, pela compreensão, carinho e companheirismo demonstrados
no decorrer desta jornada.
À minha prima Naylla e minhas amigas Jéssyca, Cleitiane, Patrícia e Jhéssica, pela amizade,
apoio e incentivo, vocês foram essenciais em todo esse tempo.
As bolsistas de iniciação científica, Fernanda, Laura e Cecília, por toda ajuda e
comprometimento para a realização deste trabalho.
Aos meus colegas do LEB, Carlos, Sérgio, Millena, Emy e Naldo e aos demais integrantes
desse laboratório, pela receptividade, companhia, conversas, risadas e disponibilidade em
ajudar.
Aos servidores do PPGEQ pela disponibilidade e atenção.
SUMÁRIO
1. Introdução ............................................................................................................................. 16
2. Objetivos ............................................................................................................................... 19
2.1 Objetivos Gerais ............................................................................................................. 20
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 19
3. Revisão Bibliográfica ........................................................................................................... 22
3.2 Leishmaniose .................................................................................................................. 22
3.2.1 Leishmaniose Visceral ............................................................................................. 23
3.2.1.1 Situação epidemiológica .................................................................................... 23
3.2.1.2 Agente etiológico e transmissão ........................................................................ 24
3.2.1.3 Quadro Clínico .................................................................................................. 24
4.2.1.4 Diagnóstico e tratamento ................................................................................... 25
3.3 Antígenos Recombinantes .............................................................................................. 26
3.3.1 Antígeno 503 ............................................................................................................ 26
3.4 Rompimento Celular ....................................................................................................... 27
3.4.1 Lise enzimática ......................................................................................................... 28
3.4.2 Pérolas de vidro ........................................................................................................ 29
3.4.3 EDTA - Mg2+ ........................................................................................................... 29
3.4.4 Ureia ......................................................................................................................... 29
3.5 Purificação de Proteínas .................................................................................................. 30
3.6 Cromatografia ................................................................................................................. 32
3.6.1 Adsorção em Leito Expandido ................................................................................. 32
3.6.1.1 Caracterização do leito expandido ..................................................................... 35
3.6.2 Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC) .................. 36
3.7 Endotoxinas .................................................................................................................... 38
4. Metodologia .......................................................................................................................... 42
4.1 Material ........................................................................................................................... 42
4.1.1 Adsorvente ............................................................................................................... 42
4.1.2 Coluna ...................................................................................................................... 42
4.1.3 Material Biológico.................................................................................................... 43
4.1.4 Reagentes e Padrões ................................................................................................. 44
4.2 Métodos .......................................................................................................................... 44
4.2.1 Preparo do inóculo ................................................................................................... 44
4.2.2 Cultivo e indução ..................................................................................................... 45
4.2.3 Escolha do método para o rompimento celular ........................................................ 45
4.2.3.1 Método de lise enzimática ................................................................................. 46
4.2.3.2 Método de pérolas de vidro ............................................................................... 46
4.2.3.3 Método de rompimento celular usando ureia .................................................... 47
4.2.3.4 Método de rompimento celular usando EDTA - Mg2+ ...................................... 47
4.2.4 Triagem do íon metálico .......................................................................................... 48
4.2.5 Isoterma de adsorção ................................................................................................ 49
4.2.6 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE ............................. 49
4.2.7 Determinação da concentração de proteínas totais .................................................. 50
4.2.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida ...................................................................... 51
4.2.9 Derterminação da concentração de antígeno 503 ..................................................... 51
4.2.10 Determinação de LPS ............................................................................................. 52
4.2.11 Cálculos .................................................................................................................. 52
5. Resultados e Discussões ....................................................................................................... 55
5.1 Escolha do método para o rompimento celular .............................................................. 55
5.2 Triagem do íon metálico ................................................................................................. 63
5.3 Isoterma de adsorção ...................................................................................................... 66
5.4 Remoção de LPS ............................................................................................................. 67
5.5 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE ................................... 69
6. Conclusões ............................................................................................................................ 78
7. Referências Bibliográficas .................................................................................................... 80
Apêndice 1 ................................................................................................................................ 94
Anexo 1 .................................................................................................................................... 96
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o mundo no ano de 2013 (World
Health Organization, 2014). ..................................................................................................... 23
Figura 2 - Etapas de um processo genérico de purificação de biomoléculas. Fonte: Pessoa-Jr &
Kilikian, 2005. .......................................................................................................................... 31
Figura 3 - Princípio de funcionamento de um processo de adsorção em leito fixo e expandido.
Fonte: adaptado de Crase & Draeger, 1992. ............................................................................. 33
Figura 4 - Figura 4: Etapas do processo de adsorção em leito expandido. Fonte: Amersham
Pharmacia Biotech, 1997. ......................................................................................................... 35
Figura 5 - Estrutura química dos LPS de E. coli O11:B4 de acordo com Ohmo & Morrison
(1989). Abreviações - Hep: L-glicerol-D-mano-heptose; Gal: galactose; Glc: glicose; KDO:
ácido 2-ceto-3-deoxioctônico; NGa: N-acetil-galactosamina e NGc: N-acetil-glic ................. 39
Figura 6 - Aparato experimental utilizado para os ensaios de ALE. ....................................... 43
Figura 7 - Biorreator de bancada Biostat B. ............................................................................. 45
Figura 8 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de lisozima (X1) e do tempo (X2) na
concentração de proteína total obtida. ...................................................................................... 58
Figura 9 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de lisozima (X1) e do tempo (X2) na
concentração de antígeno 503 obtida........................................................................................ 58
Figura 10 -(a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da razão g de pérolas de vidro/mL de suspensão (X1) e do
tempo (X2) na concentração de proteína total obtida. .............................................................. 59
Figura 11 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da razão g de pérolas de vidro/mL de suspensão (X1) e do
tempo (X2) na concentração de antígeno 503 obtida. .............................................................. 59
Figura 12 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de EDTA (X1) e do tempo (X2) na
concentração de proteína total obtida. ...................................................................................... 60
Figura 13 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno e (b) superfície de resposta
que apresenta os efeitos da concentração de EDTA (X1) e do tempo (X2) na concentração de
antígeno 503 obtida. ................................................................................................................. 60
Figura 14 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2) na
concentração de proteína total obtida. ...................................................................................... 61
Figura 15 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2) na
concentração de antígeno 503 obtida........................................................................................ 61
Figura 16 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) mostrando o perfil protéico apresentado para cada
ensaio do planejamento. Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Ensaio 1 (2,0 M e 15
min); Coluna 3: Ensaio 2 (8,0 M e 15 min); Coluna 4: Ensaio 3 (2,0 M e 60 min). ................ 63
Figura 17 - Capacidade de adsorção do antígeno 503 para os íons estudados. ........................ 64
Figura 18 - Isoterma de adsorção para o antígeno 503 na resina Streamline Chelating. .......... 66
Figura 19 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado
de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem e a eluição
isocrática. .................................................................................................................................. 69
Figura 20: Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do
homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Linha
1: Padrão de peso molecular; Linha 2: Homogeneizado de E. coli; Linha 3: Carga; Linha 4:
Lavagem: Linha 5: Eluição ...................................................................................................... 71
Figura 21 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado
de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem e a eluição
em degrau com 0,6 e 1,0 M. ..................................................................................................... 72
Figura 22 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do
homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Coluna
1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga; Coluna
4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,6 M; Coluna 6: Eluição 1 M. .............................................. 74
Figura 23 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado
de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem e a eluição
em degrau com 0,3 e 0,6 M. ..................................................................................................... 74
Figura 24 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do
homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Coluna
1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga; Coluna
4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,3 M; Coluna 6: Eluição 0,6 M. ........................................... 76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Principais características da resina Streamline chelating. ....................................... 42
Tabela 2 - Composição do meio de cultivo 2xTY (pH 7,0) ..................................................... 44
Tabela 3 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando
lisozima. .................................................................................................................................... 46
Tabela 4 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando
pérolas de vidro. ....................................................................................................................... 47
Tabela 5 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando a
ureia. ......................................................................................................................................... 47
Tabela 6 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando o
EDTA - Mg2+. ......................................................................................................................... 48
Tabela 7- Condições de eluição para purificação do antígeno 503. ......................................... 50
Tabela 8 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de lise
enzimática (lisozima). ............................................................................................................... 55
Tabela 9 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método pérolas
de vidro. .................................................................................................................................... 55
Tabela 10 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método da ureia.
.................................................................................................................................................. 55
Tabela 11 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de
EDTA - Mg2+. ......................................................................................................................... 56
Tabela 12 - Percentagem de remoção de LPS nos ensaios de ALE. ........................................ 68
Tabela 13 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não
clarificado para o ensaio com a eluição isocrática. .................................................................. 69
Tabela 14 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não
clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos. ...................................... 73
Tabela 15 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não
clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com três passos. ...................................... 74
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 - Sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L. infantum. .............. 27
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
ALE: Adsorção em Leito Expandido
ANOVA: Análise de variância
APT: Área de proteína total
API: Área de proteína de interesse
BSA: Albumina de Soro Bovino
cm: Centímetro
C: Concentração da proteína no equilíbrio na fase líquida
C0: Concentração inicial da proteína alvo na fase líquida
CPT: Concentração de proteína total
Ca503: Concentração do antígeno 503
cDNA: DNA complementar
DAT: Teste de Aglutinação Direta
DEAE: Dietil aminoetil
DEQ: Departamento de Engenharia Química
dp: Diâmetro da partícula
E. coli: Escherichia coli
EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético
EF-1: Fator de alongamento 1
ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay
FP: Fator de Purificação
Fcal: Pontos de percentual calculados da distribuição F
Ftab: : Pontos de percentual tabelados da distribuição F
g: Aceleração da gravidade
Gal: Galactose
GE: Grau de expansão do leito
Glc: Glicose
GTP: guanosina trifosfato
H: Altura do leito expandido
H0: Altura do leito fixo
Hep: L-glicerol-D-mano-heptose
IDA: Ácido iminodiacético
IMAC: Cromatografia de Afinidade por Íon Metálico Imobilizado
INF-γ: Interferon gama
Kd: Constante de dissociação no equilíbrio
kDa: Kilodalton
KDO: Ácido 2-ceto-3-deoxioctônico
L: Litro
LAL: Limulus Amebocyte Lysate
LC: Leishmaniose Cutânea
LCM: Leishmaniose Cutâneo-Mucosa
LV: Leishmaniose Visceral
LPS: Lipopolissacarídeos
m: Metro
mg: Miligrama
min: Minuto
mL: Mililitro
mM: Milimolar
n: Índice de Richardson-Zaki
NGa: N-acetil-galactosamina
NGc: N-acetil-glicosamina
OMS: Organização Mundial da Saúde
q: Capacidade de adsorção
qmáx: Capacidade máxima de adsorção
R2: Coeficiente de regressão
RIFI: Reação de Imunofluorecência Indireta
ReP: Reynolds da partícula
rpm: Rotações por minuto
SABs: sistemas aquosos bifásicos
SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes
SP: Sulfapropil
tRNA: Aminoacil-RNA transportador
U: Velocidade da partícula
UE: Unidade de endotoxina
UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Ut: Velocidade terminal da partícula
V: Volume de extrato bruto
Vads: Volume de adsorvente utilizado
%: Percentagem
º C: Graus celsius
ε0: Porosidade inicial do leito
ε: Porosidade do leito
μ: Viscosidade do fluido
μL: Microlitro
ρp: Densidade da partícula
ρL: Densidade do fluido
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
16
1. Introdução
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
1. Introdução
Em muitos países, o aumento dos fatores de risco para a Leishmaniose tem despertando
uma crescente preocupação nos órgãos de saúde pública. Esta é uma doença causada por
protozoários do gênero Leishmania e classifica-se em três formas: Leishmaniose Visceral (LV),
Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Cutâneo-Mucosa (LCM) (World Health
Organization, 2014). Estima-se que cerca de 88 países são afetados e a população em risco é de
aproximadamente 350 milhões de pessoas (Desjeux, 2004).
A Leishmaniose Visceral (LV), umas das manifestações clínicas da Leishmaniose, é
uma doença crônica e potencialmente fatal para o homem se não tratada (Gontijo & Melo,
2004). A LV apresenta uma incidência anual de 200.000 a 400.000 novos casos (World Health
Organization, 2014) e exibe uma extensa distribuição ocorrendo na Ásia, na África, nas
Américas, na Europa e no Oriente Médio. Na América Latina, 90% dos casos ocorrem no
Brasil, principalmente na região Nordeste (Ministério da Saúde, 2014).
Até o presente não existe nenhuma vacina eficaz no tratamento da Leishmaniose em
humanos. As drogas que vem sendo empregadas, por mais de sessenta anos, para o tratamento
da doença são os antimoniais pentavalentes. No entanto, essas drogas apresentam custos
elevados, nem sempre são efetivas e apresentam elevada toxicidade. Diante desses aspectos,
avanços expressivos dos estudos de biologia molecular vêm contribuindo para a produção de
antígenos recombinantes purificados que poderão ser utilizados para obtenção de vacinas
(Gontijo & Melo, 2004).
Adicionalmente, com o desenvolvimento da indústria biotecnológica, o interesse pelas
proteínas é cada vez maior, devido a suas atividades enzimáticas e ações terapêuticas. Porém,
para a maioria de suas aplicações elas precisam apresentar um elevado grau de pureza (Chase,
1994). As técnicas utilizadas para separação e purificação de proteínas são conhecidas como
downstream processing (Santos, 2001). Esse processo envolve diferentes operações unitárias
como, por exemplo, centrifugação, filtração, precipitação, cromatografia e cristalização
(Padilha, 2013).
Por outro lado, a Escherichia coli encontra-se como um dos hospedeiros mais utilizados
na obtenção de proteínas recombinantes, principalmente por apresentar vantagens como
facilidade de manipulação e grande disponibilidade de informação genética, crescimento
rápido, alto nível de expressão em meios de baixo custo e facilidade na ampliação de escala
17
1. Introdução
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
(Huang et al., 2012). Nesses casos em que a proteína recombinante é expressa em E. coli, o
procedimento de ruptura celular ocasiona a liberação de grandes quantidades de
lipopolissacarídeos (LPS), uma vez que estes derivam da membrana celular externa de bactérias
Gram-negativas (Lopes et al., 2010). Esses LPSs apresentam elevada toxicidade sobre os seres
humanos, por isso é fundamental a sua remoção de produtos biológicos e farmacêuticos e, para
isso, diversos métodos vêm sendo testados. Uma alternativa que vem mostrando resultados
promissores na remoção de LPS integrado à purificação da proteína de interesse, é a aplicação
do Triton-X 114 durante a etapa de lavagem do processo cromatográfico (Sousa Junior, 2015).
Ainda segundo Sousa Junior (2015), devido ao elevado número de operações unitárias
necessárias, que é dependente do grau de purificação desejado, a etapa de purificação apresenta
um alto custo. Portanto, é de grande interesse o desenvolvimento de técnicas econômicas e que
permitam a redução dessas etapas para a purificação de proteínas.
Assim, vem sendo amplamente estudado o desenvolvimento das operações
integradas, as quais reduzem o número de operações unitárias necessárias ao processo de
purificação, permitindo uma elevada recuperação e, também, proporcionando uma maior
economia na obtenção dos produtos (Cavalcanti, 2010). Dessa forma, a Adsorção em Leito
Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa promissora na área de recuperação
e purificação de biomoléculas, pois é uma técnica cromatográfica que integra as etapas de
clarificação, concentração e purificação em uma única etapa (Anspach et al., 1999). Além disso,
a mesma permite explorar diferentes técnicas cromatográficas, tais como: troca iônica,
interação hidrofóbica e afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC) (Zhao et al., 2009).
Dentre essas técnicas cromatográficas, a IMAC é uma cromatografia de afinidade em que a
biomolécula se liga reversivelmente ao metal imobilizado na resina e vem sendo bastante
utilizada na purificação de proteínas recombinantes que possuem caudas de histidina (Iwashita,
2012).
Estudos realizados por Campubrí et al. (2006), Dalal et al. (2008), Yap et al. (2010) e
Sousa Júnior et al. (2015) confirmam que a utilização da técnica cromatográfica IMAC
operando em leito expandido vem se mostrando eficiente para processos de purificação.
Nesse contexto, esse processo que integra a clarificação, recuperação e purificação da
proteína e remoção de LPS em uma única operação vem sendo estudado pelo grupo de pesquisa
em Engenharia de Bioprocessos do Departamento de Engenharia Química (DEQ) da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e trata-se de um processo simples e de
baixo custo quando comparado com outros procedimentos alternativos.
18
1. Introdução
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
O presente trabalho está dividido em sete capítulos. O Capítulo 1 consiste na introdução
aos assuntos discutidos no decorrer do trabalho, em seguida, tem-se o Capítulo 2, onde estão
expostos os objetivos propostos. O Capítulo 3, apresenta uma revisão da literatura com relação
à Leishmaniose, antígenos recombinantes, rompimento celular, purificação de biomoléculas,
cromatografia, adsorção em leito expandido, técnica de Cromatografia de Afinidade por Íons
Metálicos Imobilizados (IMAC) e endotoxinas. O Capítulo 4 irá abordar a metodologia
utilizada, seguido do Capítulo 5, que irá apresentar os resultados e discussões e no Capítulo 6
são apresentas as considerações finais. Por fim, o Capítulo 7 relata as referências estudadas para
a elaboração deste trabalho e em seguida tem-se o apêndice e o anexo.
CAPÍTULO II
OBJETIVOS
20
2. Objetivos
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
2. Objetivos
Os objetivos deste trabalho podem ser divididos em objetivos gerais e específicos.
2.1 Objetivos Gerais
• Avaliar os métodos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em
resina Streamline Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i.
chagasi.
• Remover os lipopolissacarídeos liberados durante a etapa de rompimento celular.
2.2 Objetivos Específicos
• Avaliar quatro métodos de rompimento celular, utilizando lisozima, pérolas de
vidro, ureia e EDTA-Mg2+, para obtenção da proteína intracelular;
• Analisar a influência dos íons metálicos Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+ imobilizados
na resina Streamline chelating na adsorção do antígeno 503 usando o
homogeneizado celular em sistema de batelada;
• Determinar a quantidade mínima de tensoativo Triton X-114 necessária na etapa de
lavagem da ALE para remoção do LPS, a fim de obter-se o antígeno 503 livre desse
contaminante;
• Recuperar e purificar o antígeno 503 diretamente do homogeneizado bacteriano não
clarificado por adsorção em leito expandido, utilizando a resina Streamline
chelating com o metal imobilizado que apresentar melhor capacidade de adsorção.
CAPÍTULO III
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
22
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
3. Revisão Bibliográfica
Neste capítulo é elaborada uma revisão da literatura baseada na temática deste trabalho,
abordando assuntos com relação à purificação de biomoléculas, incluindo processos de
rompimento celular, a técnica de adsorção em leito expandido e a IMAC. Além disso, um
contexto geral sobre a leishmaniose, antígenos recombinantes e endotoxinas também foram
estudados.
3.2 Leishmaniose
A leishmaniose constitui um complexo de doenças com uma importante diversidade
clínica e epidemiológica. A doença é causada por um parasita protozoário da família
Trypanosomatidae, que pertence ao gênero Leishmania. Cerca de 30 espécies foram
comprovadas, sendo 20 dessas espécies patogênicas para os seres humanos (Desjeux, 2004).
As manifestações clínicas da doença dependem da espécie de Leishmania e apresenta três
principais formas: visceral (LV), cutânea (LC) e mucocutânea (LMC) (World Health
Organization, 2014).
A doença é considerada endêmica em 88 países, dos quais 72 são países em
desenvolvimento e 13 estão entre os menos desenvolvidos. A maioria dos casos de leishmaniose
ocorre em populações rurais pobres e áreas suburbanas de alguns países, como: Índia, Sudão,
Bangladesh, Nepal, Brasil, Peru, Irã, Afeganistão, Argélia, Síria e Arábia Saudita (Desjeux,
1996). A Figura 1 apresenta o estado de endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o
mundo no ano de 2013.
23
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
3.2.1 Leishmaniose Visceral
3.2.1.1 Situação epidemiológica
A Leishmaniose Visceral (LV), também conhecida como calazar, é a forma clínica mais
grave, pois é geralmente fatal se não tratada (Boelaert et al., 2000). É uma doença sistêmica
que atinge as células do sistema monocular fagocitário do homem sendo os órgãos mais
afetados o baço, fígado, linfonodos, medula óssea e pele (Melo, 2004).
No Brasil, inicialmente a LV foi caracterizada como uma doença rural, ocorrendo
especialmente na região Nordeste. Com o aumento da urbanização houve uma expansão na
distribuição geográfica da LV e a doença se espalhou para todas as regiões do país, envolvendo
as regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste (Martins-Melo et al., 2014). Essas
modificações, do ponto de vista epidemiológico, resultam da alta densidade demográfica,
alterações climáticas e migração rural para áreas urbanas periféricas (Miranda, 2008).
Figura 1 - Endemicidade da Leishmaniose Visceral em todo o mundo no ano de 2013 (World Health
Organization, 2014).
24
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Em 1998, fora da região Nordeste foram notificados 15% dos casos e, em 2005, essa
proporção aumentou para 44% (Harhay et al., 2011). Atualmente, a doença está distribuída em
21 estados brasileiros, com cerca de 3.500 casos anuais (Alvar et al., 2012). Aproximadamente
41,9% dos casos humanos do país correspondem a crianças com até nove anos de idade
(Marcondes & Rossi, 2013).
Os dados epidemiológicos dos últimos anos relatam a periurbanização e a urbanização
da LV, destacando-se a ocorrência de surtos nas seguintes cidades: Rio de Janeiro (RJ),
Araçatuba (SP), Santarém (PA), Belo Horizonte (MG), Corumbá (MS), Teresina (PI), São Luís
(MA), Natal (RN), Fortaleza (CE), Camaçari (BA), Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e
Palmas (TO) (Ministério da Saúde, 2014).
3.2.1.2 Agente etiológico e transmissão
A LV é causada por espécies pertencentes ao complexo Leishmania donovani. No
Brasil, o agente etiológico é a L. chagasi, espécie semelhante à L. infantum encontrada em
alguns países do Mediterrâneo e da Ásia. Com a realização de estudos envolvendo técnicas
bioquímicas e moleculares, a L. chagasi e a L.infantum foram consideradas a mesma espécie, e
por isso este parasita é mencionado como L. infantum chagasi ou L. i. chagasi (Sousa Junior,
2015). Para que ocorra a transmissão da doença é necessária a presença do vetor susceptível,
bem como de um hospedeiro e um reservatório também susceptíveis (Gontijo & Melo, 2004).
No ambiente urbano o cão doméstico é o principal reservatório e fonte de infecção para os
vetores (Courtenay et al., 2002).
A principal forma de transmissão do parasita é através da picada de flebotomíneos do
sexo feminino. Outras formas de transmissão já foram registradas, como: congênita, seringas
contaminadas e transfusão de sangue (Quinnell & Courtenay, 2009). No Brasil, duas espécies
de vetores estão relacionadas com a transmissão da doença, Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia
cruzi, sendo a primeira considerada o principal vetor da LV (Gontijo & Melo, 2004).
3.2.1.3 Quadro Clínico
As manifestações clínicas da LV apresentam as seguintes formas: assintomática,
oligossintomática e clássica (Sousa Junior, 2015).
25
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
A forma clássica da doença é caracterizada pela presença de febre, anemia,
hepatoesplenomegalia, manifestações hemorrágicas, linfadenomegalia, perda de peso,
taquicardia, além de tosse seca e diarréia, sendo estas duas últimas menos frequentes (Pastorino
et al., 2002). Apenas uma pequena parcela de indivíduos infectados desenvolve sinais e
sintomas da doença, a maioria desenvolve infecção assintomática ou oligossintomática (Lima
et al., 2012). De acordo com Ready (2014), aproximadamente 25% dos indivíduos infectados
evoluem para a forma clássica da doença.
4.2.1.4 Diagnóstico e tratamento
O diagnóstico da LV é baseado em parâmetros epidemiológicos, clínicos e laboratoriais
(Pastorino et al., 2002). Um dos problemas associado a esse diagnóstico é a semelhança no
quadro clínico que a LV apresenta com outras doenças presentes nas áreas onde ela ocorre,
como, por exemplo, Doença de Chagas, Esquistossomose, Malária, Tuberculose e Febre
Tifóide (Gontijo & Melo, 2004). Diante dos sinais e sintomas que são comuns a outras
patologias devem-se utilizar os métodos clínicos adjuntos aos métodos parasitológico,
sorológico e imunológico para construir o diagnóstico da LV (Souza et al., 2012).
O diagnóstico feito através do método clínico baseia-se em diversas indicações, como:
febre prolongada, anemia, esplenomegalia, hepatomegalia e leucopenia. O método
parasitológico, por sua vez, fundamenta-se na visualização direta em cultivo do parasito obtido
de baço, fígado, medula óssea ou linfonodos. Por outro lado, os métodos sorológicos e
imunológicos utilizam testes, tais como: a Reação de Imunofluorecência Indireta (RIFI), a
Reação Imunoenzimática Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) e o Teste de
Aglutinação Direta (DAT) (Assis et al., 2008).
O tratamento da LV vem sendo realizado com cinco medicamentos derivados de
moléculas naturais e sintéticas: antimônio pentavalente, anfotericina B (AmpB), miltefosine,
paromomicina e pentamidine. Atualmente, dois compostos antimoniais pentavalentes são
comercialmente disponíveis: Glucantime® (antimoniato de metilglucamina) e Pentostan®
(estibogluconato de sódio) (Hwan, 2016).
No Brasil, esses medicamentos à base de antimônio, são as drogas de primeira escolha
para o tratamento da doença e o único composto disponível é o antimoniato N-metil glucamina,
sendo a última adquirida previamente por meio da aminação redutora da glicose em presença
de metilamina (Rath et al., 2003). Devido a toxicidade do antimônio, a Organização Mundial
26
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
da Saúde (OMS) sugere que a dosagem dessa droga não ultrapasse 20 mg/kg/dia, com uma dose
máxima diária de 850 mg (Balaña-Fouce et al., 1998). Distúrbios cardiovasculares são os
principais efeitos colaterais do glucantime (Gontijo & Melo, 2004).
A anfotericina B é uma droga de segunda linha utilizada como tratamento alternativo,
em caso de resistência aos antimoniais. É um antibiótico antifúngico proveniente de uma cepa
de Streptomyces nodosus (Rath et al., 2003). O uso desse medicamento é restringido pela sua
elevada toxicidade, com isso a anfotericina B pode ser incorporada em lipossomas, reduzindo
a toxidade e elevando os níveis de cura (Freitas-Junior et al., 2012).
3.3 Antígenos Recombinantes
Com o surgimento da tecnologia do DNA recombinante, tornou-se possível expressar
proteínas recombinantes, tornando-se essa técnica uma ferramenta importante nos estudos da
estrutura, função e identificação de novas proteínas, principalmente com finalidades
terapêuticas (Vaz, 2008).
As proteínas recombinantes podem ser obtidas em diversos hospedeiros, tais como:
bactérias, leveduras, fungos filamentosos e células de mamíferos. A bactéria Gram-negativa,
Escherichia coli, é um dos hospedeiros mais bem estudados e utilizados para reprodução destas
proteínas, principalmente por ser bem caracterizada em termos de genética molecular, fisiologia
e sistema de expressão, permitindo assim que várias técnicas de manipulação genética fossem
desenvolvidas e aprimoradas (Makrides, 1996; Choi & Lee, 2004; Lima, 2004).
Proteínas de Leishmania, como por exemplo antígenos de Leishmania chagasi, têm sido
clonados e produzidos em bactérias para o desenvolvimento de vacinas e kits de diagnóstico
(Silva, 2013).
3.3.1 Antígeno 503
De acordo com o estudo realizado por Martins et al. (2006), observou-se que uma vacina
que produz proteção contra a LV deveria possuir mecanismo de ação que consistiria no estímulo
da produção de interferon gama (INF-γ). Para esse estudo foi gerada uma biblioteca de cDNA
(DNA complementar) da forma amastigota de Leishmania i. chagasi e os antígenos foram
27
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
identificados através da dupla varredura da biblioteca. O antígeno 503 apresentou 100% de
identidade com o fator de alongamento 1-γ de L. infantum, sendo observada uma massa de 56 kDa
e confirmando ainda, o potencial desta proteína como candidata à vacina ou teste para diagnóstico
específico da LV.
O fator de alongamento 1-γ é uma subunidade do fator de alongamento 1 (EF-1). O EF-
1 além de ser o principal fator traducional, é também uma das mais importantes proteínas
multifuncionais, uma proteína G que desempenha um papel importante na tradução de proteínas
em células eucarióticas. O EF-1 é composto por quatro subunidades principais: alfa, beta, gama
e delta (EF-1α, EF-1β, EF-1δ e EF-1γ). A subunidade EF-1α liga o aminoacil-RNA
transportador (tRNA) ao ribossomos 80s através da hidrólise do guanosina trifosfato (GTP),
enquanto as outras subunidades (EF-1β, EF-1δ e EF-1γ) apresentam como função a troca do
nucleotídeo EF-1α-guanosina difosfato (GDP) por EF-1α-GTP (Cañavate et al., 2002; Ejiri,
2002).
O Quadro 1 mostra a sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L.
infantum
3.4 Rompimento Celular
Existem dois tipos básicos de produtos produzidos por microrganismos: intracelular,
que são retidos no interior da célula do citoplasma e extracelular que são excretados para um
meio de crescimento (Geciova et al., 2002). Comparado aos produtos extracelulares, os
intracelulares dificultam o processo de purificação de biomoléculas, uma vez que exigem o
rompimento celular (Pessoa-Jr & Kilikian, 2005).
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Quadro 1 - Sequência de aminoácidos do fator de alongamento 1-γ de L. infantum.
Fonte: GenBank número CAC35543.1
28
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
De acordo com Pessoa-Jr (2005), o rompimento celular ocorre após a etapa de separação
e lavagem das células obtidas ao final do cultivo. Alguns fatores como: tamanho da célula,
necessidade de controle de temperatura, tempo de operação, tolerância a tensões de
cisalhamento, rendimento do processo, custo e capital de energia, devem ser considerados para
escolha da técnica de rompimento mais adequada.
Portanto, a ruptura celular consiste da primeira etapa no processo de recuperação de
produtos intracelulares e constitui um passo essencial do downstream processing, pois algum
dano ocasionado ao produto de interesse a ser recuperado, pode influenciar nas etapas seguintes
(Neves, 2003).
Os métodos para ruptura celular são classificados como: mecânicos e não-mecânicos.
Os métodos mecânicos incluem técnicas baseadas em forças de cisalhamento (moinho de bolas,
ultrassom) ou por pressão (homogeneizador a alta pressão). Os métodos não-mecânicos podem
ser: físicos (choque osmótico, termólise, congelamento e descongelamento), químicos
(detergentes, solventes, EDTA) e enzimáticos (lise enzimática) (Harrison, 1991; Ho et al.,
2006).
3.4.1 Lise enzimática
A lise enzimática é um método de rompimento celular atraente em termos da sua
especificidade, condições suaves de operação, baixo investimento de capital, além de ser
adequado para a recuperação de biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento (Harrison,
1991).
Esse método de ruptura baseia-se na remoção da parede celular, com a ação das enzimas,
acompanhado do rompimento da membrana citoplasmática devido à pressão osmótica interna.
As enzimas atuam no rompimento, visto que a parede seja seu substrato (Pessoa-Jr, 2005).
Diferente das bactérias gram-positivas, as gram-negativas possuem uma estrutura mais
complexa. Estas são constituídas por uma parede de duas camadas: a interior, composta por
peptidoglicano e a membrana externa formada por fosfolipídios, proteínas, lipoproteínas e
lipopolissacarídeos. Logo, é necessário um pré-tratamento para remover a membrana externa e
expor o peptidoglicano ao ataque enzimático, esse pré-tratamento pode ser feito, por exemplo,
com o detergente Triton X-100 (Andrews & Asenjo, 1987).
29
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
3.4.2 Pérolas de vidro
Devido à sua simplicidade, esse método parece ser o mais simples para ruptura celular
quando equipamento especializado não estiver disponível (Benov & Al-Ibraheem, 2002).
O rompimento por pérolas de vidro é um método mecânico e ocorre devido à força de
cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células. Esse método é
bastante indicado para escala laboratorial, uma vez que não necessita de grande aparato
operacional. O procedimento desse método consiste, basicamente, da adição das pérolas de
vidros em um tubo, contendo um determinado volume de suspensão celular, agitado-se o tubo
vigorosamente por um determinado tempo (Neves, 2003).
3.4.3 EDTA - Mg2+
O EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) é um agente quelante que causa
desestabilização ou remoção da membrana externa (Harrison, 1991). No caso da E. coli o
EDTA é necessário para romper a camada de peptidoglicano na membrana externa e Mg2+é
adicionado para estabilizar os esferoplastos (Xiang et al., 2002).
3.4.4 Ureia
A expressão de proteínas em E. coli frequentemente leva à produção de proteínas
agregadas e insolúveis expressas em corpos de inclusão no citoplasma bacteriano. Os agentes
mais usualmente utilizados para a solubilização de proteínas agregadas são guanidina e ureia.
Estes levam a formação de estruturas protéicas flexíveis e desordenadas e quando altos níveis
de concentração destes agentes desnaturantes são utilizados a solubilização pode ser completa
através da ruptura de interações intramoleculares (Clark, 2001; Singh & Panda, 2005)
Desse modo, a ureia é um agente caotrópico que age interrompendo as interações fracas
entre moléculas, como as interações hidrofóbicas entre as proteínas. Agentes caotrópicos são
eficazes na desnaturação de proteínas e por esse motivo são adicionados nos tampões de lise
(Geciova et al., 2002; Burden, 2012).
30
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
3.5 Purificação de Proteínas
O interesse por processos de purificação é crescente devido ao desenvolvimento da
biotecnologia e à demanda das indústrias farmacêutica e química por produtos com elevado
grau de pureza (Zuñiga et al., 2003). Destacam-se, dentre esses produtos, as proteínas,
interferons, insulinas, hormônios de crescimento, vacinas, cujas técnicas de separação e
purificação podem ser agrupadas no downstream processing. Essas operações unitárias são
bastante dispendiosas, podendo comprometer em até 80% do custo total (Santos, 2001). Dessa
forma, tem-se grande interesse no estudo e desenvolvimento de técnicas mais simples, ou seja,
que permita a redução das etapas desse processo, e que ofereça um menor custo para a
purificação de biomoléculas.
Diversas técnicas podem ser utilizadas na purificação de produtos biotecnológicos e a
seleção do processo mais adequado a ser utilizado vai depender da aplicação final da molécula-
alvo requerendo maior ou menor grau de pureza, das características físico-químicas e também
das impurezas. Biofármacos (diagnósticos e terapêuticos) são os que demandam maior grau de
pureza e, assim, acabam elevando a complexidade e os custos do processo de purificação
(Pessoa-Jr & Kilikian, 2005).
Na indústria biotecnológica, as técnicas cromatográficas são os métodos mais
empregados para recuperação e purificação de proteínas, principalmente quando alta
concentração e alta pureza são necessárias, e a adsorção em leito fixo, especificamente,
encontra-se com uma das técnicas de mais amplo estudo. Porém, uma das maiores limitações
desta técnica se dá após os processos fermentativos, onde são necessárias algumas operações
unitárias prévias, devido à presença de diversos contaminantes e materiais indesejados, como
subprodutos e resíduos celulares, os quais podem causar obstrução da coluna e, deste modo,
prejudicar o rendimento do processo de purificação (Azzoni, 2002; Zhao et al., 2009; Lima,
2014).
O objetivo de um processo de purificação de proteínas é atingir rendimento máximo
com alta seletividade, considerando os custos das operações empregadas. Sendo assim, é
necessário ter uma sequência adequada das etapas envolvidas no processo e um número
otimizado de operações unitárias envolvidas, reduzindo o tempo de processamento (Silva,
2000).
Em geral, o processo de recuperação e purificação envolve uma estratégia que inclui
quatro passos sequenciais: clarificação (remoção de compostos insolúveis), concentração
31
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
(isolamento do produto), purificação e polimento. Essa abordagem é uma das melhores
estratégias para a purificação de biomoléculas (Cussler & Ding, 1995; Zuñiga et al., 2003).
Nesse caso, como comentado anteriormente, técnicas que permitam integrar as etapas de
clarificação, concentração/purificação são de extrema importância. Dentre essas destacam-se
os sistemas aquosos bifásicos (SABs) e a adsorção em leito expandido (ALE), sendo essa última
usada no presente trabalho. A Figura 1 esquematiza as etapas de um processo de purificação de
biomoléculas.
Figura 2 - Etapas de um processo genérico de purificação de biomoléculas. Fonte: Pessoa-Jr
& Kilikian, 2005.
Meio de cultivo com células ou
microrganismos em suspensão
Clarificação
(separação células/meio)
Células ou microrganismos
(produtos intracelulares)
Sobrenadante
(produtos extracelulares)
eextracelularesexintracel
ulares) Rompimento de células
ou microrganismos
Remoção de fragmentos de
células ou microrganismos
Fração sólida
Sobrenadante
e
Separação/Concentração de
moléculas
Purificação
Tratamentos finais
32
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
3.6 Cromatografia
A introdução da cromatografia como técnica analítica ocorreu em 1906, por um
pesquisador russo, Mikhael Semenovich Tswett, ao descrever sua experiência de separar a
clorofila de uma mistura de pigmentos de planta (Moraes, 2009). Nas últimas décadas, a
cromatografia vem se destacando como uma das técnicas mais importantes para separação e
purificação de biomoléculas, devido ao seu alto desempenho e eficiência (Zhao et al., 2009).
Essa técnica baseia-se nas características físico-químicas dos componentes de interesse
e consiste da separação dos componentes entre uma fase móvel, que contém a mistura de
componentes a serem separados, e outra estacionária, esta normalmente é sólida e formada por
matriz de partículas empacotadas em uma coluna de forma tubular (Azzoni, 2002; Zuñiga et
al., 2003). Durante a passagem da fase móvel por meio da fase estacionária, os constituintes da
amostra são difundidos entre as duas fases, de tal forma que, cada um deles é seletivamente
retido pela fase estacionária, resultando em uma migração diferencial que promove a separação
(Collins et al., 2006).
As técnicas cromatográficas mais utilizadas para purificação de produtos
biotecnológicos são: cromatografia por exclusão molecular, troca iônica, interação hidrofóbica,
afinidade e imunoafinidade. Na cromatografia por exclusão molecular a separação ocorre em
função dos tamanhos das moléculas, enquanto que nos demais processos, as diferentes
moléculas adsorvem na matriz, e em seguida, ocorre dessorção seletiva, proporcionando a
separação dos componentes (Pessoa-Jr & Kilikian, 2005).
3.6.1 Adsorção em Leito Expandido
A Adsorção em Leito Expandido (ALE) tende a simplificar de forma significativa o
downstream processing, pois nessa técnica o caldo bruto proveniente da fermentação pode ser
utilizado sem que haja uma clarificação prévia, com o material particulado passando através do
leito sem ser retido. Esta técnica cromatográfica elimina as etapas de filtração, centrifugação e
concentração, integrando em uma única operação as etapas de clarificação, concentração e
purificação (Chase & Draeger, 1992; Hjorth, 1997). Essa característica de integrar essas etapas
em uma única operação unitária é a principal vantagem da utilização da adsorção em leito
expandido, sobre a técnica cromatográfica convencional em leito fixo.
33
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
A Figura 3 ilustra a comparação entre o funcionamento de um processo de adsorção em
leito fixo (3a) e expandido (3b), podendo-se observar que no leito fixo o material particulado
bloqueia a coluna. No entanto, ao ser operada de forma expandida a alimentação contendo o
material particulado passa pela coluna sem a obstrução do leito (Figura 3b) (Santos, 2001).
Figura 3 - Princípio de funcionamento de um processo de adsorção em leito fixo e expandido.
Fonte: adaptado de Crase & Draeger, 1992.
A ALE baseia-se na fluidização do leito de adsorventes cromatográficos (Padilha,
2013). Esse processo de fluidização do leito promove uma maior interação entre as matrizes
adsorventes e as moléculas alvo (Curvelo-Santana et al., 2008).
As propriedades das partículas adsorventes são de fundamental importância para formar
uma fluidização perfeita, nesse caso, faz-se necessário o uso de partículas com alta massa
específica, que permite o estabelecimento de elevadas velocidades de fluxo de líquido através
do leito expandido. Quando a fase móvel é bombeada em sentido ascendente através da coluna,
as partículas com tamanhos e densidades diferentes distribuem-se de forma não uniforme ao
longo da altura do leito (Lin et al, 2013). As partículas adsorventes maiores ou mais densas
Fluido com partículas
Partículas adsorventes
Material particulado que passa pelo leito
Torta de Células
(a) (b)
34
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
localizam-se na parte inferior do leito expandido e as menores ou menos densas na parte
superior, como pode ser visto na Figura 2b ilustrada acima (Hjorth, 1997).
O fluxo ascendente através do adsorvente fornece uma maior fração de vazios no interior
do leito, o que permite a utilização de material particulado, que passa através da fase sólida
enquanto a biomolécula alvo é adsorvida (Tong & Sun, 2002).
As matrizes adsorventes mais utilizadas para purificação de proteínas são as de celulose,
agarose, dextrana e poliacrilamida (Sousa Junior, 2015). Os ligantes clássicos (SP – sulfapropil,
DEAE – dietil aminoetil e IDA – ácido iminodiacético) são acoplados ao suporte das partículas
adsorventes (agarose-quartzo ou agarose-metal) elevando sua densidade e viabilizando a
expansão do leito. Estes adsorventes são identificados comercialmente como Streamline,
comercializados pela GE Healthcare e são compostos de 6% de agarose contendo um núcleo
de quartzo cristalino, que atua aumentando a densidade do adsorvente, com um tamanho de
partícula que varia de 100-300 µm, com tamanho médio de 200 µm e densidade em torno de
1,2 g/mL (Amersham Pharmacia Biotech, 1997; Kilikian & Santos, 2005).
O processo de cromatografia em leito expandido corresponde a uma sequência de
operações, que inclui o equilíbrio da resina, aplicação da amostra, a lavagem das proteínas não
adsorvidas, a eluição do composto e a regeneração da resina (Moraes, 2009). A ilustração dessa
sequência é representada na Figura 4. Primeiramente, o adsorvente do leito expandido é
equilibrado com o tampão de equilíbrio, aplicado em fluxo ascendente, causando a expansão
do leito em 2 ou 3 vezes, dependendo da velocidade. Após essa etapa, a amostra contendo as
células e partículas em suspensão é alimentada, no sentido ascendente, no leito estabilizado.
Dessa forma, a biomolécula alvo adsorve na resina, enquanto as células, restos celulares e
contaminantes saem pela parte superior da coluna. Nessa etapa, é importante manter o mesmo
grau de expansão do leito estabelecido e para isso deve-se controlar a velocidade. Em seguida,
efetua-se a lavagem de modo ascendente usando-se o tampão, para remoção de partículas e
proteínas fracamente adsorvidas. Depois da lavagem, a eluição da biomolécula de interesse é
conduzida após sedimentação do leito, ou seja, com o leito empacotado, podendo-se utilizar o
fluxo na forma ascendente ou descendente. Finalmente, a resina é limpa e regenerada para ser
novamente utilizada (Amersham Pharmacia Biotech, 1997).
35
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Figura 4 - Etapas do processo de adsorção em leito expandido. Fonte: Amersham Pharmacia
Biotech, 1997.
3.6.1.1 Caracterização do leito expandido
Para as operações usando a ALE é de fundamental importância conhecer o
comportamento do leito em função das propriedades físicas das partículas e do fluido (Moraes,
2009). Uma das formas de conhecer esse comportamento é por meio da correlação de
Richardson & Zaki (1954), eles estudaram a sedimentação e fluidização de vidro, divinil
benzeno e balas de chumbo usando soluções como cloreto de sódio, M-cresol, bromofórmio e
glicerol e obtiveram uma expressão que relaciona a velocidade do fluido e a velocidade terminal
da partícula, com a porosidade do leito, conforme a Equação (1) (Santos, 2001):
U
Ut=εn (1)
Em que U é a velocidade do fluido, 𝑈𝑡 é a velocidade terminal da partícula, 𝜀 a
porosidade do leito e n é o índice de expansão (ou índice de Richardson-Zaki), sendo este uma
função do número de Reynolds terminal (Ret).
Ret=dPρ
LUt
μ (2)
Leito sedimentado
Equilíbrio
(expansão do leito)
Aplicação da amostra
Lavagem Eluição da proteína
Regeneração
36
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
No regime de Stokes, em que o 𝑅𝑒𝑝 < 0,1, a velocidade terminal de uma partícula isolada
𝑈𝑡 é dada por:
Ut=gdP
2(ρ
p-ρ
L)
18μ (3)
Sendo g a aceleração da gravidade, dp é o diâmetro da partícula, μ é a viscosidade do
fluido, e ρp e ρL são as densidades da partícula e do fluído, respectivamente.
Outro parâmetro importante na caracterização do leito expandido é o grau de expansão
(GE), que é um número adimensional e representa a razão entre a altura do leito expandido (H)
e a altura do leito fixo do adsorvente (𝐻0), para uma dada velocidade aplicada, como segue na
Equação (4). Para sistemas operando em leito expandido, os valores de GE giram em torno de
2,0 a 3,0 (Kilikian & Santos, 2005).
GE=H
H0 (4)
A Equação (5) representa a relação entre a porosidade do leito e o grau de expansão:
H
H0=
(1-ε0)
(1-ε) (5)
Em que ε é a porosidade do leito e 𝜀0 a porosidade inicial do leito (assumindo valor de
0,4) (Cavalcanti, 2010).
3.6.2 Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC)
A IMAC foi introduzida por Porath e colaboradores em 1975 e, desde então, íons
metálicos imobilizado vem sendo empregados como ligantes gerais em cromatografia de
afinidade para a purificação de várias biomoléculas (Vançan, 1999).
Assim como as demais técnicas de cromatografia de afinidade, a IMAC é usada nos
casos em que se deseja uma purificação rápida e uma elevada pureza do produto. Apresenta
vantagens quando comparada a essas outras técnicas, como a estabilidade entre IMAC – ligante,
37
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
condições suaves de eluição, regeneração simples e de baixo custo, além da sua aplicabilidade
em condições desnaturantes, o que muitas vezes faz-se necessário quando as proteínas
recombinantes são expressas em E. coli na forma de corpos de inclusão, permitindo que as
proteínas marcadas com histidina possam ser separadas eficientemente na presença de
concentrações de desnaturantes, como ureia ou guanidina-HCl (Gaberc-Porekar & Menart,
2001).
Nessa técnica, a adsorção das proteínas é baseada na interação entre o íon metálico
imobilizado na matriz do adsorvente e um grupamento doador de elétrons localizados na
superfície das proteínas (Sousa Junior, 2015). Os íons metálicos mais usualmente empregados
são, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Al3+ e Ca2+. Sendo que para purificação de proteínas que
possuam resíduos de histidina, triptofano e cisteína, os mais utilizados são, Cu2+, Ni2+, Co2+,
Zn2+, onde esses íons interagem com o nitrogênio aromático dos grupamentos imidazol, indol
e com o enxofre do grupamento tiol, respectivamente, de cada aminoácido (Bresolin et al.,
2009).
Bresolin et al. (2009) reportam ainda uma predição de afinidade da proteína com o
ligante IDA baseado em resíduos de histidina acessíveis na superfície de proteínas. Para a
ocorrência de apenas um resíduo de histidina o Cu2+ é o íon mais indicado para adsorção de
proteína, quando houver mais de um resíduo de histidina os íons metálicos que devem ser
utilizados para retenção de proteínas são Cu2+ e Ni2+ e no caso de ocorrer um cluster de histidina
os íons apropriados para adsorção de proteína são Cu2+, Ni2+, Zn2+ e Co2+.
Segundo Sulkowski (1989), o par de elétrons presente no nitrogênio aromático do anel
imidazol da histidina é o principal colaborador na interação entre a proteína e íons metálicos de
transição (quando quelatados ao ácido iminodiacético, IDA) e que a presença de múltiplas
histidinas expostas na superfície da proteína a ser separada aumenta o grau desta interação.
Poucas são as proteínas que naturalmente contêm resíduos de histidina localizados na
superfície, porém com o advento da engenharia genética, proteínas que na sua forma original
não possuíam caudas de histidinas disponíveis para ligação com íons metálicos imobilizados,
são geneticamente modificadas para receberem uma cauda de histidina, o que facilita a
purificação da proteína alvo por IMAC (Serpa, 2002).
Nessa técnica cromatográfica, o processo de purificação depende de diversos fatores,
como a escolha dos íons metálicos, dos agentes quelantes, das matrizes cromatográficas usadas
para imobilização dos agentes quelantes e as condições de adsorção e dessorção, buscando
38
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
favorecer a interação entre a proteína e o metal para que alta recuperação e seletividade sejam
alcançadas (Bresolin et al., 2009).
3.7 Endotoxinas
As endotoxinas são lipopolissacarídeos (LPS) de alta massa molecular, derivados da
membrana celular de bactérias gram-negativas e são responsáveis pela sua organização e
estabilidade (Lopes, 2010; Lopes, 2014). A liberação de LPS ocorre durante a morte ou
multiplicação celular dessas bactérias (Cardoso, 2014). Em indústrias farmacêuticas, é possível
encontrar endotoxinas durante os processos de produção ou no produto final. Entretanto, a
presença do LPS mesmo em concentrações muito baixas (<1,0 UE/mL) é indesejável, devido à
potente reação inflamatória desencadeada por esta molécula, causando graves efeitos
fisiopatológicos sobre o hospedeiro como choque endotóxico, injúria tecidual e até morte
(Schädlich et al., 2009).
O lipopolissacarídeo é formado pelo núcleo polissacarídico, ao qual se liga a cadeia O-
antigênica e a unidade lipídica A (Lopes, 2014), como mostra a Figura 5.
39
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Figura 5 - Estrutura química dos LPS de E. coli O11:B4 de acordo com Ohmo & Morrison
(1989). Abreviações - Hep: L-glicerol-D-mano-heptose; Gal: galactose; Glc: glicose; KDO:
ácido 2-ceto-3-deoxioctônico; NGa: N-acetil-galactosamina e NGc: N-acetil-glic.
O lipídeo A é considerado a porção ativa da membrana da bactéria Gram-negativa,
constituído por um dissacarídeo de glicosamina, sendo altamente substituído por ácidos graxos
de cadeia longa ligados por ligações do tipo éster ou amida (Fukumori, 2008). Essa região é
responsável pela maior parte das atividades biológicas da endotoxina, isto é, a sua toxicidade
(Magalhães et al., 2007).
A região oligossacarídica possui sua estrutura formada por uma região com o ácido 2-
ceto-3-deoxioctônico (KDO) ligado a heptoses, geralmente L-glicerol-D-mano-heptose (Hep)
e outra região ligada a hexoses, frequentemente glicose (Glc), galactose (Gal), N-acetil-
galactosamina e N-acetil-glicosamina (NGc) (Erridge et al., 2002).
A porção O-antígeno geralmente é formada por uma sequência de oligossacarídeos
idênticos, com unidades repetidas de três a oito monossacarídeos, os quais são específicos para
40
3. Revisão Bibliográfica
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
cada espécie de bactéria e determinam a sua identidade sorológica, o que permite a classificação
de mais de 100 sorotipos de E. coli e mais de 1000 de Salmonella (Petsch & Anspach, 2000).
As endotoxinas apresentam efeitos biológicos muito fortes ao entrar na corrente
sanguínea de humanos, que vão desde febre e calafrios até hipotensão, síndrome da angústia
respiratória do adulto, coagulação intravascular disseminada e choque (Gorbet & Sefton, 2005).
Os antibióticos usados para tratar doenças causadas por bactérias Gram-negativas podem
quebrar as células bacterianas e isso ocasiona a liberação de LPS, podendo levar a uma piora
imediata dos sintomas (Magalhães et al., 2007).
Devido ao potencial tóxico dos LPS, é de extrema importância sua remoção de
preparações injetáveis e de outros produtos biológicos e farmacêuticos (Lopes et al., 2010).
Porém, essas moléculas apresentam característica termoestável, ou seja, não é destruída de
forma eficaz pelos processos de esterilização amplamente utilizados como, por exemplo, o calor
úmido a 121°C por 30 minutos (Magalhães et al., 2007). Deste modo, diferentes processos têm
sido desenvolvidos para remover LPS de proteínas, entre eles estão, adsorção por afinidade,
ultrafiltração, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e extração
por duas fases aquosas. A aplicabilidade desses métodos depende das propriedades da
biomolécula de interesse (Lin et al., 2005).
De acordo com estudos realizados por Reichelt et al. (2006), Zimmerman et al. (2006)
e Sousa Junior (2015), a adição de um detergente não iônico, como o Triton X-114, durante a
etapa de lavagem dos processos cromatográficos, é uma alternativa eficiente para remoção de
LPS.
O tensoativo não-iônico, Triton X-114, auxilia na dissociação da endotoxina de
proteínas recominantes, proporcionando uma capacidade de separação das fases para a remoção
da endotoxina dissociada (Aida & Pabst, 1990).
CAPÍTULO IV
METODOLOGIA
42
4. Metodologia
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
4. Metodologia
Neste item serão apresentados os materiais e as metodologias empregadas para avaliar
os métodos de rompimento celular e de diferentes metais imobilizados em resina Streamline
Chelating para purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi, bem como a remoção
de LPS.
4.1 Material
4.1.1 Adsorvente
A resina Streamline chelating foi utilizada durante os ensaios com IMAC e adquirida
da GE Healthcare (Uppsala, Suécia). As características desse adsorvente são apresentadas na
Tabela 1.
Tabela 1 - Principais características da resina Streamline chelating.
Característica Descrição
Ligante Ácido iminodiacético (IDA)
Tamanho médio da partícula 200,0 μm
Variação no tamanho da partícula 100,0 – 300,0 μm
Densidade média da partícula 1,2 g/mL
Matriz Ligação cruzada de agarose 6,0 %
contendo núcleo de quartzo
pH de trabalho 3,0 – 13,0
pH de limpeza 3,0 – 14,0
Grau de expansão a 300 cm/h 2,0 – 3,0
Condições de estocagem Etanol 20,0 %
Fonte: adaptado de Amersham Pharmacia Biotech (1997).
4.1.2 Coluna
Uma coluna de vidro especialmente construída para operar em leito expandido, com
diâmetro igual a 2,6 cm e uma altura de 30,0 cm e equipada com um êmbolo ajustável para
43
4. Metodologia
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
minimizar o espaço de topo sobre o leito fluidizado, foi utilizada nos experimentos de ALE. A
coluna possuía uma régua (escala) na parede externa para registrar a altura do leito. A porção
inferior da coluna foi preenchida por esferas de vidros para distribuir o fluxo de entrada,
formando um leito com altura de 4,0 cm. Uma bomba peristáltica, modelo Perimax 12, da
Spetec, foi utilizada para bombear o líquido para a coluna, conforme ilustra a Figura 6.
Figura 6 - Aparato experimental utilizado para os ensaios de ALE.
4.1.3 Material Biológico
O microrganismo utilizado foi uma cepa de Escherichia coli M15, abrigando o
plasmídeo pQE-30 capaz de expressar o antígeno 503 com cauda de histidina, cedida pela Dra.
Mary Wilson da Universidade de Iowa (Iowa, EUA) (Martins et al., 2006)
A cepa de E. coli expressando o antígeno 503 é armazenada a -80°C em microtubos com
glicerol a 50% no Laboratório de Imunogenética do Departamento de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
44
4. Metodologia
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
4.1.4 Reagentes e Padrões
O Triton X-114, lisozima, albumina do soro bovino (BSA), e os antibióticos ampicilina
e canamicina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA), o kit cromogênico cinético
de Limulus Amebocyte Lysate (LAL kinetic-QCL®) foi obtido da empresa Lonza (Walkersville,
EUA) e o padrão peso molecular para eletroforese de proteínas adquirido da GE Healthcare
(Uppsala, Suécia). Todos os outros reagentes utilizados foram de grau analítico. A água
deionizada utilizada nos experimentos foi proveniente do sistema de ultrapurificação modelo
EASYpure da Barnstead (Dubuque, USA).
4.2 Métodos
4.2.1 Preparo do inóculo
Para ativação do microrganismo, 200,0 µL da solução de glicerol contendo a cepa
armazenada a -80°C foram transferidos assepticamente para 50,0 mL do meio de cultivo 2xTY,
conforme a Tabela 2. O meio foi previamente esterilizado em autoclave a 120°C, durante 20
minutos, e depois suplementado com 50,0 µL de ampicilina (0,1g/L) e 50,0 µL de canamicina
(0,025g/L) em frascos de Erlenmeyers de 250,0 mL. Esse cultivo inicial foi realizado em
incubador rotativo a 37°C e 200 rpm, por 12 horas e chamado de pré-inóculo. Para preparo do
inóculo, foram adicionados 5,0 mL do pré-inóculo a 45,0 mL do meio de cultivo 2xTY, contidos
em Erlenmeyers de 250,0 mL, e incubados a 200 rpm e 37°C por 6 horas. Esta suspensão
constitui o inóculo dos ensaios (Vaz, 2011).
Tabela 2 - Composição do meio de cultivo 2xTY (pH 7,0)
Nutriente Composição (g/L)
Triptona 16,0
Extrato de Levedura 10,0
NaCl 5,0
45
4. Metodologia
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
4.2.2 Cultivo e indução
O clone foi cultivado em biorreator de bancada Biostat B (B. Braun Biotech
International) com um volume de trabalho de 1,5 L, a 37ºC, 400 rpm e uma vazão de aeração
de 1,0 - 1,5 L/min, durante 3 horas. Nesse método, 1350,0 mL do meio de cultivo 2xTY, foram
suplementados com 1,5 mL de ampicilina (0,1 g/L) e 1,5 mL de canamicina (0,025 g/L) e
inoculados com 150,0 mL de inóculo na fase exponencial do crescimento. No cultivo, o pH do
meio foi mantido em 7,0 com a adição automática de uma solução de NH4OH (25,0 %) ou HCl
(1,0 N). Após uma hora do início do cultivo, o mesmo foi induzido pela adição de 150,0 mL de
lactose para concentração final de 10,0 g/L (Vaz, 2011). A Figura 6 ilustra o biorreator de
bancada onde foram realizados os cultivos.
Figura 7 - Biorreator de bancada Biostat B.
Decorrido as 3 horas, as células foram separadas por centrifugação a 2800 rpm, durante
30 min, segundo Vaz (2011). As células sedimentadas foram ressuspensas em tampão de lise
apropriado conforme método de rompimento, para obter uma suspensão com concentração
celular de 5,0 % (p/v).
4.2.3 Escolha do método para o rompimento celular
Com o objetivo de avaliar a melhor técnica para a lise celular, foi elaborado um
planejamento fatorial completo 22 para cada método analisado (lisozima, pérolas de vidro, ureia
46
4. Metodologia
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
e EDTA - Mg2+). Os planejamentos analisaram dois fatores, com dois níveis e duplicata no
ponto central, totalizando 6 experimentos.
A resposta do planejamento foi avaliada em termos da concentração de proteínas totais
e da quantidade de antígeno 503 liberada. A análise dos efeitos das variáveis sobre a resposta
foi feita usando o software Statistica 7.0 (StatSoft), com uma significância estatística de 95,0
%.
4.2.3.1 Método de lise enzimática
Nesse método a enzima utilizada para o rompimento celular foi a lisozima.
Primeiramente, as células foram ressuspensas no tampão de lise (30,0 mM Tris-HCl, 30,0 mM
NaCl, pH 8,0) e, em seguida, rompidas com 0,1 – 0,5 mg/mL de lisozima na presença de 20,0
mM de MgCl2. Para tal, um volume de 5,0 mL da suspensão foi agitada em shaker, a 100 rpm
e 25 °C, durante um de tempo de 30 a 60 minutos (Ho et al., 2006; Haddad et al., 2015),
conforme mostra a Tabela 3. As células foram centrifugadas a 2800 rpm, por 30 minutos e o
sobrenadante recolhido para análise de proteínas totais e antígeno 503. Os fatores e os níveis
analisados para esse método estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando
lisozima.
Fatores Variáveis codificadas Níveis
-1 0 1
Concentração lisozima (mg/mL) X1 0,1 0,3 0,5
Tempo (min) X2 30,0 45,0 60,0
4.2.3.2 Método de pérolas de vidro
As células foram ressuspensas no tampão de lise (30,0 mM Tris-HCl, 30,0 mM NaCl
30,0, pH 8,0), homogeneizadas no vórtex, e logo após, 5,0 mL da suspensão foi agitada com
0,1 – 1,0 g de pérola de vidros/mL de suspensão em um tempo variando de 5,0 a 10,0 minutos,
conforme a Tabela 4. Em seguida, as células foram centrifugadas a 2800 rpm, por 30 minutos
e o sobrenadante recolhido para análise de proteínas totais e antígeno 503.
47
4. Metodologia
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Tabela 4 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando
pérolas de vidro.
Fatores Variáveis codificadas Níveis
-1 0 1
Razão (g pérolas/mL de
suspensão) X1 0,1 0,55 1,0
Tempo (min) X2 5,0 7,5 10,0
4.2.3.3 Método de rompimento celular usando ureia
Para esse rompimento celular as células foram ressuspensas em um tampão de lise a
base de ureia (100,0 mM NaH2PO4, 10,0 mM Tris-HCl, 2,0 – 8,0 mol/L ureia, pH 8,0) e 5,0
mL da suspensão foi homogeneizada no vórtex, durante 15 a 60 minutos (Vaz, 2011), como
apresentado na Tabela 5. Para remover os resíduos celulares realizou-se centrifugação a 2800
rpm por 30 minutos e o sobrenadante foi recolhido para análise de proteínas totais e antígeno
503. As variáveis analisadas, concentração de ureia e tempo, e os seus respectivos níveis são
mostrados na Tabela 5.
Tabela 5 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando a
ureia.
Fatores Variáveis codificadas Níveis
-1 0 1
Concentração de ureia (mol/L) X1 2,0 5,0 8,0
Tempo (min) X2 15,0 37,5 60,0
4.2.3.4 Método de rompimento celular usando EDTA - Mg2+
Nesse procedimento as células foram ressuspensas no tampão de lise (200,0 mM ácido
bórico, 150,0 mM NaCl, 1,0 – 5,0 mM EDTA, 5,0 mM MgSO4, pH 8,0) e 5,0 mL das
suspensões foram agitadas no shaker, a 4 °C e 70 rpm, por um tempo de 6,0 a 12,0 horas (Xiang
et al., 2002), de acordo com a Tabela 6. Em seguida, como descrito nos métodos anteriores,
cada suspensão foi centrifugada a 2800 rpm por 30 minutos e o sobrenadante foi recolhido para
análise de proteínas totais e antígeno 503.
48
4. Metodologia
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Tabela 6 - Fatores, variáveis codificadas e níveis para o planejamento experimental usando o
EDTA - Mg2+.
Fatores Variáveis codificadas Níveis
-1 0 1
Concentração de EDTA (mM) X1 1,0 3,0 5,0
Tempo (horas) X2 6,0 9,0 12,0
4.2.4 Triagem do íon metálico
Essa etapa teve como objetivo avaliar o íon metálico que apresenta maior capacidade de
adsorção do antígeno, para isso cinco metais foram estudados: Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+,
em diferentes concentrações da solução de sulfato do metal analisado. A resina foi carregada
com os íons com auxílio de um sistema de filtração à vácuo. Primeiramente, 3,0 mL do
adsorvente foi lavado com 30,0 mL de água destilada e, em seguida, carregado com 15,0 mL
da solução de sulfato de íon analisado nas concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L . Para garantir
a adsorção do metal na resina aguardou-se um tempo de 15 minutos. Para remover os íons
fracamente ligados, a resina foi lavada com 30,0 mL de tampão (100,0 mM acetato de sódio,
0,5 M cloreto de sódio, pH 4,0). Por último, a resina foi lavada com 15,0 mL de água destilada
(Clemmitt & Chase, 2000).
Após a etapa acima, a resina foi previamente equilibrada com tampão de equilíbrio (20,0
mM NaH2PO4, 2,4 M NaCl e 10,0 mM imidazol, pH 8,0) e, em seguida, 0,75 mL dessa resina
e 0,75 mL do lisado celular a 5% de biomassa, foram transferidos para microtubos. A mistura
foi incubada em shaker, durante duas horas, a 25 °C e 100 rpm. Em seguida, o sobrenadante foi
retirado e a quantidade de proteína total não ligada foi determinada pelo método de Lowry. Para
o antígeno 503 realizou-se a eletroforese para posterior quantificação utilizando o software
Image J. A quantidade de antígeno adsorvido na fase sólida foi determinada de acordo com a
Equação (6). Esse procedimento foi realizado em triplicata para cada íon analisado.
q=V(C0-C)
Vads (6)
Em que, q corresponde a quantidade de antígeno adsorvido na resina (mg/mL) , V o
volume de extrato bruto (mL), C0 o valor de concentração de antígeno inicial (mg/mL), c indica
a concentração da proteína de interesse no equilíbrio (mg/mL) e Vads o volume de adsorvente
utilizado (mL).
49
4. Metodologia
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4.2.5 Isoterma de adsorção
De início foram realizadas diferentes diluições do extrato bruto contendo o antígeno 503
em um tampão de lise (100,0 Mm NaH2PO4, 10,0 mM Tris-HCl, 8,0 M ureia, pH 8,0),
determinado através da seção 4.2.3.3.
Em Erlenmeyers de 50,0 mL foi adicionado 5,0 mL de cada diluição, juntamente com
0,1 g do adsorvente ligado ao íon metálico selecionado no item 4.2.4, essa mistura foi mantida
em shaker, a 25 °C e 100 rpm, durante duas horas, para assegurar o equilíbrio entre as fases
sólida e líquida. Em seguida, a fase líquida foi recolhida, para a quantificação de proteínas, e a
concentração de antígeno 503 adsorvida foi quantificada por um balanço de massa. O
comportamento de equilíbrio de adsorção foi avaliado pelo modelo de isoterma de Langmuir,
de acordo com a Equação (7). A regressão não linear dos dados foi realizada utilizando o
software Statistica 7.0 (StatSoft) (Sousa Junior et al., 2015).
q=q
máxc
kd+c (7)
Sendo q a quantidade de proteína alvo adsorvida na resina, c representa a concentração
de equilíbrio da proteína alvo não adsorvida, 𝑞𝑚á𝑥 indica a capacidade de ligação máxima, e
𝑘𝑑 é a constante de dissociação, que pode ser derivada a partir da regressão linear do gráfico de
Langmuir.
4.2.6 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE
Para purificação do antígeno 503 e simultânea remoção do LPS utilizando ALE,
aproximadamente 27,0 mL da resina Streamline Chelating carregada com o íon metálico
selecionado foi vertida na coluna de ALE para dar uma altura de leito sedimentado igual a 5,0
cm, conforme descrito por Sousa Junior et al. (2015). Primeiramente, o adsorvente foi
equilibrado com o tampão de equilíbrio (20,0 mM NaH2PO4, 2,4 M NaCl e 10,0 mM imidazol,
pH 8,0) a uma velocidade linear de 150 cm/h, obtendo um grau de expansão de
aproximadamente 2,0. Em seguida, 100,0 mL do homogeneizado de E. coli M15 foi bombeado
para a coluna com uma velocidade linear do fluido de 150 cm/h, no sentido ascendente.
Posteriormente, a resina foi lavada com 50,0 mL de um tampão mantido em um banho
refrigerado a 4 °C, composto por: 20,0 mM NaH2PO4, 10,0 mM imidazol, 2,4 M NaCl, 10,0%
glicerol e Triton X-114. Destaca-se que foram analisadas três concentrações de Triton X-114:
50
4. Metodologia
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
0,01%, 0,05% e 0,1%, durante essa etapa de lavagem visando a remoção do LPS. Ainda nessa
etapa de lavagem, foram adicionados 100,0 mL do tampão de lavagem, cuja composição é: 20,0
mM NaH2PO4, 10,0 mM imidazol, 1,625 M NaCl e 10,0% glicerol, pH 8,0. A seguir, a etapa
de eluição foi realizada de forma isocrática conforme otimizado por Sousa Junior et al. (2015)
e em degrau, com o leito sedimentado e uma velocidade de 50 cm/h. Os tampões utilizados
apresentam a seguinte composição: 20,0 mM NaH2PO4, 1,0 M NaCl, pH 7,0, variando a
concentração de imidazol, conforme segue na Tabela 7. Em cada etapa foram recolhidas
amostras de 10,0 mL, para uma posterior análise de concentração de proteína total e do antígeno
503. Por fim, a resina Streamline Chelating utilizada foi regenerada de acordo com Amersham
Pharmacia Biotech (1997), utilizando NaOH 1,0 M, durante um tempo de contato de 1 hora,
seguido pela aplicação de 250,0 mL de uma solução contendo EDTA (20,0 mM NaH2PO4, 0,5
M NaCl, 50,0 mM EDTA, pH 7,4) para remoção do íon metálico e por último a resina foi lavada
com 250,0 mL de água destilada.
Tabela 7- Condições de eluição para purificação do antígeno 503.
Ensaios Eluição Concentração de imidazol (mol/L)
1 Isocrática 0,6
2 Degrau 0,6 – 1 mol/L
3 Degrau 0,3 – 0,6 mol/L
4.2.7 Determinação da concentração de proteínas totais
A quantificação das proteínas totais nas amostras foi realizada pelo método de Lowry
(Lowry et al., 1951). O princípio desse método baseia-se numa mistura do reagente Folin-
Ciocalteau, que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador
cobre (II), resultando em uma coloração azul esverdeada intensa e esse composto apresenta
absorção máxima em 750 nm (Zaia et al., 1998). A proteína albumina de soro bovino (BSA)
foi usada como padrão na concentração de 0,01 a 0,1 (mg/mL).
51
4. Metodologia
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
4.2.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida
Todas as amostras foram avaliadas quanto à presença do antígeno 503 por eletroforese
em gel de poliacrilamida a 12% conforme metodologia descrita por Laemmli (1970).
As amostras foram inicialmente dialisadas em membranas com poro de 12,0 kDa contra
4 L de água deionizada, a 4 °C por 18 horas. Para cada ponto foi utilizada a concentração de 40
µg/µL, concentrados no aparelho Centrivap Concentrator (Labconco, EUA). Imediatamente
antes de aplicadas no gel, as alíquotas foram ressuspensas em tampão de amostra (0,06 mM
Tris-HCl, 10,0 % glicerol, 2,0 % SDS, 5,0 % 2-mercaptoetanol e 0,4 % azul de bromofenol,
pH=6,8) e desnaturadas por aquecimento a 90 ºC por 5 minutos em banho Maria. Preparou-se
um gel de poliacrilamida a 12% e a separação eletroforética foi realizada utilizando uma cuba
vertical MiniVE (GE Healthcare, Suécia) contendo tampão de corrida (25,0 mM Tris-HCl,
192,0 mM Glicina, 0,1 % SDS, pH= 8,3) a uma voltagem de 150 V. Após o término da corrida,
o gel obtido foi revelado pela coloração com nitrato de prata. Em todos os géis utilizou-se o
marcador de baixa massa molecular (GE Healthcare, Suécia) contendo a mistura de seis
proteínas: α-lactalbumina (14,4 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa), anidrase carbônica (30,0
kDa), ovalbumina (45,0 kDa), albumina (66,0 kDa) e fosforilase b (97,0 kDa).
4.2.9 Determinação da concentração de antígeno 503
A concentração do antígeno 503 foi determinada por densitometria das bandas de
proteínas separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (Seção 4.2.8) utilizando-se o
software Image J, no qual a imagem digitalizada do gel foi processada gerando curvas, cujos
picos são proporcionais a largura e a intensidade de coloração das bandas presentes. O programa
utilizou integrações simples para transformar as áreas sob as curvas em valores numéricos.
Somando-se as áreas de todos os picos obtidos foi possível obter o valor numérico
correspondente à concentração de proteínas totais observadas no gel (APT). Quantificando
apenas a área sob a curva correspondente à proteína recombinante de interesse (API) obteve-se
o valor numérico representativo do antígeno 503 e a partir destes dois valores calculou-se a
fração relativa da proteína recombinante.
A concentração do antígeno 503(Ca503
)é dada pela Equação 8:
Ca503=API
APT*CPT (8)
52
4. Metodologia
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Onde, 𝐶𝑃𝑇 é a concentração de proteínas totais (mg/mL), estimada pelo método de
Lowry.
4.2.10 Determinação de LPS
A concentração de LPS em amostras de proteína foi medida por um método
cromogênico cinético usando o Kit de LAL cinético-QCL®, conforme manual do fabricante
Lonza (2011) e Sousa Junior (2015).
Para preparo da curva de calibração, a endoxina padrão liofilizada foi reconstituída com
1,0 mL água apirogênica, tendo uma concentração final de 50,0 EU/mL. Após a reconstituição,
agitou-se vigorosamente por 15 minutos em vórtex. A partir da endotoxina padrão reconstituída,
preparou-se diluições seriadas, a fim de se obter as concentrações de endotoxina com 25,0
EU/mL, 5,0 EU/mL, 0,5 EU/mL, 0,05 EU/mL e 0,005 EU/mL.
O reagente LAL foi reconstituído com 2,6 mL de água apirogênica, imediatamente antes
de seu uso e agitado suavemente para evitar a formação de bolhas. Para realização do teste,
após a diluição, 100,0 µL de cada amostra, padrões, controle negativo (água apirogênica) e
controle positivo (endotoxina 25,0 EU/mL) foram aplicados em duplicata em microplaca de 96
orifícios. Em seguida, com auxílio de uma pipeta de 8 canais, adicionou-se 100,0 µL do
reagente LAL e a microplaca foi incubada e monitorada em intervalos de 2,0 minutos até o
aumento da DO (λ = 405 nm) em 0,2 em relação ao valor inicial. Uma concentração padrão de
LPS 25,0 EU/mL foi usada como controle positivo e os resultados dos testes foram
considerados válidos quando o valor de concentração de LPS foi recuperado entre 50 e 200%.
A água e as ponteiras utilizadas nas diluições dos padrões e das amostras foram apirogênicas e
a toda a vidraria utilizada nas diluições foi previamente despirogeneizada a 250 ºC por duas
horas.
4.2.11 Cálculos
A pureza do antígeno 503, o rendimento (%) e o fator de purificação (FP) foram
determinados de acordo com as equações (9), (10) e (11), respectivamente.
Pureza do antígeno 503=Quantidade de antígeno 503 recuperado
Quantidade de proteína total (9)
53
4. Metodologia
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Rendimento (%)=Quantidade de antígeno 503 recuperado
Quantidade de antígeno 503 no extrato bruto*100% (10)
Fator de purificação = Pureza do antígeno 503
Pureza do antígeno 503 no extrato bruto (11)
CAPÍTULO V
RESULTADOS E DISCUSSÕES
55
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
5. Resultados e Discussões
Neste capítulo são exibidos e discutidos os resultados para a melhor técnica de lise celular,
avalia-se o íon que proporciona maior capacidade de adsorção do antígeno 503 através da
triagem realizada, apresentando também a isoterma de adsorção, bem como os resultados
obtidos ao realizar os ensaios de ALE.
5.1 Escolha do método para o rompimento celular
De acordo com o que foi apresentado na seção 4.2.3, os planejamentos fatoriais
completos 22 foram realizados para avaliar quatro métodos de rompimento celular de E. coli,
buscando-se determinar qual estratégia possibilita a maior liberação de proteínas intracelulares,
como o antígeno 503 recombinante. Os resultados adquiridos para cada planejamento são
apresentados nas Tabelas 8, 9, 10 e 11. As maiores respostas de concentração de proteínas totais
(CPT) e de antígeno 503 (Ca503) obtidas para cada método de rompimento encontram-se em
destaque nas tabelas abaixo.
Tabela 8 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de lise
enzimática (lisozima).
Ensaios X1 X2 CPT (mg/mL) Ca503 (mg/mL)
1 -1 -1 0,423 ± 0,011 0,018 ± 0,001
2 +1 -1 0,822 ± 0,004 0,063 ± 0,003
3 -1 +1 0,467 ± 0,009 0,023 ± 0,001
4 +1 +1 0,883 ± 0,009 0,068 ± 0,001
5* 0 0 0,861 ± 0,004 0,065 ± 0,001
6* 0 0 0,770 ± 0,013 0,060 ± 0,002
* Ponto Central.
Tabela 9 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método pérolas
de vidro.
Ensaios X1 X2 CPT (mg/mL) Ca503 (mg/mL)
1 -1 -1 0,376 ± 0,007 0,013 ± 0,002
2 +1 -1 0,458 ± 0,002 0,018 ± 0,001
3 -1 +1 0,506 ± 0,004 0,026 ± 0,002
4 +1 +1 0,475 ± 0,004 0,021 ± 0,002
5* 0 0 0,480 ± 0,002 0,023 ± 0,001
6* 0 0 0,506 ± 0,004 0,027 ± 0,002 * Ponto Central.
56
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Tabela 10 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método da
ureia.
Ensaios X1 X2 CPT (mg/mL) Ca503 (mg/mL)
1 -1 -1 0,683 ± 0,005 0,030 ± 0,003
2 +1 -1 1,575 ± 0,006 0,140 ± 0,001 3 -1 +1 0,675 ± 0,002 0,029 ± 0,002
4 +1 +1 1,566 ± 0,007 0,130 ± 0,002
5* 0 0 1,090 ± 0,003 0,071 ± 0,002
6* 0 0 0,987 ± 0,007 0,074 ± 0,005
* Ponto Central.
Tabela 11 - Resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 para o método de
EDTA - Mg2+.
Ensaios X1 X2 CPT (mg/mL) Ca503 (mg/mL)
1 -1 -1 0,532 ± 0,004 0,027 ± 0,002
2 +1 +1 0,510 ± 0,002 0,025 ± 0,002
3 -1 -1 0,545 ± 0.002 0,029 ± 0,003
4 +1 +1 0,558 ± 0,002 0,029 ± 0,001 5* 0 0 0,506 ± 0,002 0,022 ± 0,002
6* 0 0 0,493 ± 0,002 0,019 ± 0,002
* Ponto Central.
Ao comparar os resultados obtidos nos quatro planejamentos experimentais, observou-
se que o método para rompimento celular de E. coli utilizando a ureia foi o mais eficiente, uma
vez que forneceu as maiores concentrações de proteína total e do antígeno 503 no sobrenadante.
De acordo com Burden (2012), a ureia é um agente caotrópico que age interrompendo
as interações fracas entre as moléculas, como as ligações de hidrogênio e interações
hidrofóbicas entre as proteínas. Altas concentrações desse agente caotrópico solubilizam os
corpos de inclusão e, por outro lado, baixa concentração de ureia não desnatura completamente
as moléculas de proteínas solubilizadas (SINGH et al., 2015).
Nesse caso, como destacado na Tabela 10, os maiores valores obtidos corresponderam
aos ensaios 2 e 4, sendo os do segundo ensaio de 1,575 mg/mL e 0,140 mg/mL para
concentração de proteína total e concentração de antígeno 503, respectivamente, e para o ensaio
4 de 1,566 mg/mL para concentração de proteína total e 0,130 mg/mL para concentração de
antígeno, estes valores foram obtidos ao se utilizar a maior concentração de ureia (8,0 mol/L).
Observa-se ainda que o segundo melhor método de rompimento, que favoreceu a liberação do
antígeno 503, foi o método enzimático utilizando lisozima.
57
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
E. coli é uma bactéria Gram-negativa e, deste modo, menos sensível a lisozima. Logo,
observou-se que a lisozima por si só não é um método eficiente para o rompimento dessa
bactéria. Estudos mostram que para obter melhores resultados com esse método de lise
enzimática, este é normalmente combinado com um dos métodos mecânicos de ruptura de
células (Peternel & Komel, 2010; Haddad et al., 2015).
Destaca-se também que os métodos de rompimento com pérolas de vidro e EDTA -
Mg2+ apresentaram resultados semelhantes para concentração de proteína total e do antígeno
503. E em ambos, a liberação do antígeno de interesse pareceu pouco influenciado pelos fatores
avaliados neste trabalho (concentração/razão e tempo).
Para o método que utilizou pérolas de vidro, as maiores respostas foram alcançadas na
condição do ponto central, utilizando 0,55 g pérolas/mL de suspensão e um tempo de agitação
em vórtex de 7,5 minutos. Numanoglu & Sungurl (2004) estudaram a extração de β-
galactosidase de Kluyveromyces lactis ATCC8583 utilizando esse mesmo método e observaram
que acima de 0,60 g pérolas de vidro/mL de suspensão celular, para extrair a enzima, não houve
aumento na atividade enzimática. Isso também foi verificado no presente trabalho, em que o
maior nível avaliado no planejamento (1,0 g pérolas/mL de suspensão) não produziu aumento
nas concentrações de proteína total e antígeno 503.
Os resultados de concentração de proteína total e antígeno 503 mostrados nas Tabelas
8, 9, 10 e 11 foram analisados através dos diagramas de Pareto e gráficos de superfície de
resposta, com auxílio do software Statistica 7.0 (StatSoft).
As Figuras 8 e 9 ilustram o diagrama de Pareto e as superfícies de resposta para o
planejamento utilizando o método de lise enzimática. Através dos diagramas de Pareto (Figuras
8a e 9a), para um nível de significância (ou confiança) de 95%, percebe-se que os fatores
concentração de lisozima (X1), tempo (X2) e a interações entre esses dois fatores (X1X2) não
apresentaram efeito significativo para nenhuma das respostas (Cpt e Ca503). E as superfícies de
resposta para ambas as respostas apresentaram comportamento semelhante, os valores máximos
são alcançados à medida que ocorre o aumento na concentração de lisozima. Além disso,
alterações na variável tempo não resultaram em diferenças consideráveis nas respostas, como
pode ser observado nas Figuras 8b e 9b.
58
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
a) b)
Figura 8 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de lisozima (X1) e do tempo (X2) na
concentração de proteína total obtida.
a) b)
Figura 9 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de lisozima (X1) e do tempo (X2) na
concentração de antígeno 503 obtida.
A análise estatística dos métodos que utilizaram pérolas de vidro e EDTA - Mg2+ para
o rompimento celular mostrou comportamento semelhante ao de lise enzimática. Em que os
fatores analisados em cada método e as suas interações, para o mesmo nível de confiança (95%),
não apresentaram efeito significativo sobre as respostas proteína total e antígeno 503, como
pode ser visto nos diagramas de Pareto representados pelas Figuras 10a e 11a, para o método
de pérolas de vidro, e as Figuras 12a e 13a para a lise utilizando o EDTA - Mg2+. Analisando
as superfícies de respostas do planejamento com pérolas de vidro (Figuras 10b e 11b) observa-
se que a concentração de proteína total é maior à medida que o tempo aumenta e que a variável
razão de g pérolas/mL de suspensão não apresenta diferenças significativas. Para a resposta em
59
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
termos de concentração de antígeno 503 maiores valores são alcançados com a diminuição da
razão de g pérolas/mL de suspensão e aumento da variável tempo. As Figuras 12b e 13b ilustram
as superfícies de respostas para o método de ruptura utilizando EDTA - Mg2+ e tem-se que a
concentração de proteína total e do antígeno 503 aumentam com o acréscimo do tempo,
enquanto que a variação na concentração de EDTA não influenciam de maneira significativa
nas respostas.
Como os três métodos citados anteriormente não apresentaram efeito significativo nas
suas respostas não serão apresentadas as equações do modelo para estes planejamentos.
a) b)
Figura 10 -(a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da razão g de pérolas de vidro/mL de suspensão (X1) e do
tempo (X2) na concentração de proteína total obtida.
a) b)
Figura 11 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da razão g de pérolas de vidro/mL de suspensão (X1) e do
tempo (X2) na concentração de antígeno 503 obtida.
60
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
a) b)
Figura 12 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de EDTA (X1) e do tempo (X2) na
concentração de proteína total obtida.
a) b)
Figura 13 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de EDTA (X1) e do tempo (X2) na
concentração de antígeno 503 obtida.
As Figuras 14 e 15 mostram o diagrama de Pareto e a superfície de resposta para o
planejamento que utilizou a ureia, tendo como resposta a concentração de proteínas totais e do
antígeno 503, respectivamente. Analisando os diagramas de Pareto (Figuras 14a e 15a) observa-
se que, para um nível de confiança de 95%, apenas a concentração de ureia influencia a resposta,
ou seja, apenas a concentração de ureia apresenta efeito significativo sobre as variáveis
resposta, com efeito positivo, o que implica dizer que maiores concentrações de proteína total
e do antígeno de interesse são obtidas na maior concentração de ureia. O tempo e a interação
61
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
entre as variáveis não apresentaram efeito significativo. As superfícies de resposta para ambos
os modelos apresentaram comportamento semelhante, em que maiores respostas são alcançadas
à medida que ocorre o aumento na concentração de ureia e a variação nos níveis da variável
tempo não resulta em diferenças consideráveis. Conforme pode ser visto nas Figuras 14b e 15b.
a) b)
Figura 14 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de proteína total e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2) na
concentração de proteína total obtida.
a) b)
Figura 15 - (a) Diagrama de Pareto para a concentração de antígeno 503 e (b) superfície de
resposta que apresenta os efeitos da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2) na
concentração de antígeno 503 obtida.
Os resultados mostram que a concentração de ureia utilizada para a lise celular deve ser
de 8 M. Estudos realizados por Vaz et al. (2011) e Sousa Junior et al. (2015), relatam o
62
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
rompimento celular da E. coli utilizando tampão de lise com essa mesma concentração (8 M)
de ureia para liberação do antígeno 503. Falconer et al. (1996), em seu estudo analisaram a lise
celular da E. coli, utilizando no tampão uma combinação do agente quelante EDTA com a ureia,
variando a concentração de ureia em 0, 2, 4, e 6 M, e perceberam que as maiores concentrações
de ureia, no caso estudado 6 M, é eficaz para a liberação de proteínas intracelulares.
Vaz et al. (2011) ao utilizarem a E. coli M15 expressando o mesmo antígeno relatam
que as células foram homogeneizadas juntamente com o tampão de lise no vórtex por um tempo
de 15 a 60 minutos. Dessa forma, conforme apresentado no diagrama de Pareto pode-se
observar que a variável tempo não apresenta influência significativa sobre as respostas
estudadas, o que significa dizer que o tempo correspondente a 15 minutos é o suficiente para
romper a célula da E. coli fornecendo valores elevados de proteína total e antígeno 503. Assim,
passou-se a utilizar a estratégia de rompimento celular com ureia 8 M sob agitação em vórtex
por 15 minutos em todas etapas seguintes deste trabalho.
Baseado no planejamento fatorial completo 22 para o método utilizando a ureia obteve-
se as Equações (12) e (13) do modelo de primeira ordem para ambas as respostas, as quais
expressam a concentração de proteína total (mg/mL) e a concentração do antígeno 503 (mg/mL)
em função da concentração de ureia (X1) e do tempo (X2).
Cpt=1,0960+0,4458X1-0,0043X2-0,0002X1X2 (12)
Ca503=0,0790+0,0527X1-0,0027X2-0,0022X1X2 (13)
Através da análise de variância (ANOVA), percebe-se que os modelos estatísticos para
concentração de proteína total e concentração de antígeno 503, a um nível de significância de
95 %, apresentaram coeficiente de regresssão (R2) de 98,12 % e 98,84 %, respectivamente.
Com base no teste F, os modelo apresentado através da Equação 12 é estatisticamente
significativo, pois a razão entre o Fcal (34,82) e o Ftab (19,16), para variação de regressão e
resíduos, foi maior do que 1, e é preditivo, uma vez que, considerando o erro puro e a falta de
ajuste, a razão entre o Fcal (1,87) e o Ftab (161,40) foi menor do que 1. Da mesma forma, o
modelo representado pela Equação 13 também é significativo e preditivo. Com estes dados
obtidos pela ANOVA pode-se concluir que os modelos descrevem bem os dados experimentais
estabelecidos.
A Figura 16 ilustra a eletroforese com gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12,0 %
contendo as amostras de proteínas obtidas com o rompimento utilizando ureia, a coloração foi
63
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
obtida com o nitrato de prata. Cada coluna correspondente a um ensaio do planejamento fatorial
realizado. Vale ressaltar que o antígeno 503 apresenta uma massa molecular de 56 kDa (Martins
et al., 2006; Vaz et al., 2011; Sousa Junior et al., 2015). As colunas 2 e 4, referem-se aos ensaios
que resultaram em menores concentrações de proteínas totais e de antígeno 503,
correspondendo aos ensaios 1 e 3 do rompimento celular, em que a menor concentração de
ureia (2,0 M) foi aplicada.
Figura 16 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) mostrando o perfil protéico apresentado para
cada ensaio do planejamento. Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Ensaio 1 (2,0
M e 15 min); Coluna 3: Ensaio 2 (8,0 M e 15 min); Coluna 4: Ensaio 3 (2,0 M e 60 min);
Coluna 5: Ensaio 4 (8,0 M e 60 min); Coluna 6 e 7: Ensaios 5 e 6 (5,0 M e 37,5 min).
5.2 Triagem do íon metálico
Conforme descrito na seção 4.2.4, avaliou-se o íon imobilizado na resina que apresentou
maior capacidade de adsorção (q) do antígeno 503 com a resina Streamline chelating. Dentre
os cinco íons analisados, o cobre foi o que apresentou valores mais elevados de adsorção, sendo
de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente, para as concentrações de 0,1, 0,5 e 0,8 M,
respectivamente. Para determinar a concentração do íon a ser usada para carregar a resina nos
ensaios de coluna operando em leito expandido, os resultados obtidos foram analisados no
software Statistica 7.0 (StatSoft), por meio do Teste de Tukey, o qual corresponde a um teste
de comparação de média. De acordo com este teste observou-se que os valores de adsorção do
antígeno para o íon Cu2+ não apresenta diferença significativa para as três concentrações
kDa
97.0
66.0
45.0
30.0
20.1
1 2 3 4 5 6 7
64
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
analisadas, então a de 0,1 M foi utilizada nos próximos ensaios. A Figura 17 apresenta os
valores de adsorção para cada íon estudado.
Figura 17 - Capacidade de adsorção do antígeno 503 para os íons estudados.
Através desse gráfico é possível estabelecer uma ordem da capacidade de adsorção:
Cu2+ > Ni2+ > Fe3+ > Zn2+ > Co2+.
Essa ordem pode ser correlacionada ao potencial de redução dos íons metálicos
analisados. Sabe-se que o potencial de redução é a tendência que uma espécie química tem de
ganhar elétrons, e dessa maneira ser reduzida no processo.
De acordo com a tabela do potencial de redução que tem como referência o eletrodo
padrão de hidrogênio (Anexo I), percebe-se que os íons metálicos estudados apresentam a
seguinte ordem de potencial de redução: Fe3+ > Cu2+ > Ni2+ > Co2+ > Zn2+. Logo, percebe-se
que a ordem da capacidade de adsorção dos íons avaliados, apresentou uma similaridade à
ordem do potencial de redução, com exceção dos íons Fe3+ e Co2+. Vale a pena ressaltar que
além do potencial de redução, outros fatores como a eletronegatividade, tipos de ligações
(iônica ou covalente), polarizabilidade das espécies envolvidas, disponibilidade do doador de
elétrons, pH, força iônica e tipo de sal utilizado podem ter influência nessas interações (Bresolin
et al., 2009).
Em IMAC a adsorção de proteínas é baseada na coordenação entre um ión metálico
imobilizado e grupos doadores de eletróns a partir da superfície da proteína, os quais agem
65
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
como base de Lewis. Os íons mais comumente utilizados são os ións de metais de transição
Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+ e estes atuam como ácidos de Lewis, ou seja, aceptores de pares
de elétrons (Gaberc-Porekar & Menart, 2001).
Segundo Chaga (2001), espera-se que cerca de 50% das proteínas provenientes de
amostras biológicas podem ser retidas em Cu2+ imobilizado, sendo que esse número cai
significativamente se Ni2+, Co2+e Zn2+ são utilizados, pois estes últimos apresentam requisitos
mais rigorosos para os locais de ligação.
Gaberc-Porekar & Menart (2001) citam que quando se trata de resina com o ligante
Ácido Iminodiacético (IDA), como é o caso da Streamline chelating utilizada nesse estudo, a
afinidade de muitas proteínas retidas apresenta a seguinte ordem: Cu2+ > Ni2+ > Zn2+ ≥ Co2+.
Portanto, quando se analisa os quatro íons citados anteriormente observa-se que o antígeno 503
apresenta essa mesma ordem de afinidade.
Dalal et al. (2008) realizaram um estudo para purificar uma proteína recombinante
com cauda de histidina expressa em E. coli e analisaram o carregamento da resina Streamline
chelating, com 0,1 M da solução de sulfato de três metais diferentes: Cu2+, Ni2+ e Zn2+. De
maneira semelhante ao obtido neste trabalho, o cobre foi o íon que apresentou maior capacidade
de adsorção para a proteína e a capacidade de adsorção assumiu a seguinte ordem: Cu2+ > Ni2+>
Zn2+.
Em outro estudo, Clemmitt & Chase (2000) avaliaram a seletividade e a capacidade de
adsorção de 0,05 M dos íons metálicos Cu2+, Ni2+ e Zn2+ na resina Streamline chelating, para a
purificação de uma enzima intracelular, β-galactosidase, recombinante expressa em E. coli.
Eles observaram que o Cu2+ apresentou maior capacidade de adsorção, porém um grande
número de proteínas contaminantes também se ligaram a resina reduzindo assim a purificação.
O Ni2+, por sua vez, também adsorveu a enzima de interesse, mas por outro lado proporcionou
uma menor quantidade de adsorção de proteínas totais, tornando possível uma purificação mais
elevada. O Zn2+ foi o que apresentou uma menor quantidade de adsorção da proteína de
interesse. Então, nesse caso o Ni2+ mostrou-se mais seletivo e foi escolhido para ser carregado
na Streamline chelating.
66
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
5.3 Isoterma de adsorção
A isoterma foi realizada conforme a metodologia descrita no item 4.2.5 e representa
graficamente a quantidade de antígeno 503 adsorvido por unidade de massa de adsorvente como
uma função da concentração de equilíbrio do antígeno 503 no tampão de lise, como ilustrado
na Figura 18.
Figura 18 - Isoterma de adsorção para o antígeno 503 na resina Streamline Chelating.
Observando a Figura 18 percebe-se que o modelo de Langmuir se ajustou bem aos
dados experimentais, com R2 = 0,9885. A capacidade máxima de adsorção (qmáx
) do antígeno
503 à resina Streamline chelating foi de 3,07 mg de proteína/g de adsorvente, e a constante de
dissociação (kd) foi de 0,13 mg/mL.
Estudos realizados por Sousa Junior et al. (2015), mostram que os dados também se
ajustaram relativamente bem ao modelo de Langmuir e apresentam, para a adsorção do mesmo
antígeno de interesse (503) usando o íon metálico Ni2+ acoplado à mesma resina (Streamline
chelating), a capacidade máxima de adsorção foi de 1,95 mg de proteína/g de adsorvente. Dessa
forma, comparando-se esse valor com o de 3,07 mg de proteína/g de adsorvente obtido neste
trabalho ratifica que o Cu2+ permite uma maior capacidade de ligação máxima para a proteína
de interesse. Outros estudos, como o realizado por Dalal et al. (2008) também mostram que, de
maneira semelhante ao obtido neste trabaho, a isoterma de adsorção da proteína de interesse na
resina Streamline – Cu2+ pode ser representado pelo modelo de Langmuir.
67
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
O modelo de Langmuir tem sido utilizado com frequencia para avaliar o
comportamento de adsorção de proteínas quando utiliza-se cromatografia por afinidade (Jiang
& Hearn, 1996).
5.4 Remoção de LPS
Na indústria biotecnológica o principal problema relacionado com a produção de
proteínas recombinantes em Escherichia coli é a presença de lipopolissacarídeos (LPS), já que
o LPS é derivado da membrana celular de bactérias Gram-negativas. Devido ao efeito tóxico
sobre seres humanos, é essencial remover LPS de preparações de produtos biológicos e
farmacêuticos (Magalhães et al., 2007).
Estudos realizados por Pestch & Anspach (2000), Wilson et al. (2001), Reichelt et al.
(2006), Cheng et al. (2008) e Sousa Junior (2015) demonstraram que Triton X-114 pode ser
aplicado para remoção de concentrações elevadas de LPS. Nesse contexto, foi avaliado a
quantidade mínima de tensoativo, Triton X-114 necessária para remoção do LPS e o tensoativo
foi aplicado durante a etapa de lavagem do ensaio de ALE, conforme o item 4.2.6. A
determinação de LPS foi realizada segundo o procedimento descrito na seção 4.2.10.
A temperatura e o volume do tampão de lavagem contendo o Triton-X 114, de 4,0 ºC e
50,0 mL, respectivamente, foram determinados de acordo com estudo realizado por Sousa
Junior (2015), no qual observou que para a remoção de LPS essas variáveis foram
estatisticamente significativas, influenciando de forma negativa no processo. Mostrando que
50,0 mL de tampão com Triton X-114 seguido por lavagem com 100 mL de tampão sem
tensoativo foi ligeiramente mais eficaz na remoção de endotoxinas e que executando o
procedimemento a 4,0 °C obteve-se uma boa eliminação de LPS.
Segundo Pestch & Anspach (2000) e Reichelt et al. (2006), o ponto de turvação desse
tensoativo é 22 °C e abaixo dessa temperatura o Triton X-114 dissocia de maneira eficiente
endotoxinas de proteínas.
As concentrações de Triton X-114 avalidas foram estimadas de acordo com estudos
relatados na literuratura. Reichelt et al. (2006), Zimmerman et al. (2006) e Sousa Junior (2015),
mostraram que a aplicação de apenas 0,1% de Triton X-114 na etapa de lavagem foi bem
sucedida para redução de endotoxina, removendo mais de 99 % do LPS inicial. Dessa forma,
concentrações de 0,01 %, 0,05% e 0,1 % de Triton X-114 foram aplicadas no tampão de
68
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
lavagem visando avaliar a quantidade mínima necessária para remoção de LPS e para isso foram
realizados três ensaios operando em coluna de leito expandido. Os valores obtidos para cada
ensaio estão apresentados na Tabela 12.
Tabela 12 - Percentagem de remoção de LPS nos ensaios de ALE.
Carga (UE/mL) Eluição (UE/mL) % Remoção LPS
Ensaio 1 (0,01 %) 5,48 x 105 1628,55 99,70
Ensaio 2 (0,05 %) 8,84 x 104 389,39 99,56
Ensaio 3 (0,1 %) 7,02 x 105 1628,55 99,77
De acordo com a Tabela 12, observa-se que para as três condições analisadas o
percentual de remoção de LPS foi elevado e que para a concentração mínima utilizada (0,01 %)
já foi obtida uma remoção de 99,70 %. Esses resultados confirmam o que já foi obtido em outros
estudos citados anteriormente, que a adição de baixas concentrações de Triton X-114 durante a
etapa de lavagem de processos cromatográficos é eficiente para remover mais de 99,0 % de
LPS. Portanto, o uso do tensoativo utilizado é eficaz na dissociação de endotoxinas fortemente
ligadas a proteínas recombinantes.
No entanto, mesmo após uma remoção de 98,0 a 99,0 % do LPS, a concentração residual
deste contaminante ainda pode ser elevada. O limite estabelecido para as quantidades de
endotoxinas permitidas em produtos farmacológicos injetáveis para humanos é de 5,0 UE por
kg de peso corporal por hora (Lopes et al., 2010). Nesse estudo, o terceiro ensaio, por exemplo,
apresentou uma maior remoção de endotoxinas (99,77 %), no qual o homogeneizado de E. coli
(carga) possuía inicialmente 7,02 x 105 EU/mL, e mesmo após 99,0 % de remoção a eluição
ainda apresentou uma concentração de LPS de 1628,55 UE/mL, o que pode representar uma
quantidade significativa, uma vez que tem-se como objetivo obter um produto para uso
intravenoso, tornando necessária uma etapa adicional para remoção do LPS residual. De
qualquer forma, uma estratégia que integra em apenas uma etapa os processos de clarificação,
recuperação, purificação e redução significativa de LPS a partir de um extrato não clarificado,
como a utilizada neste trabalho, parece ser muito vantajosa.
69
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
5.5 Purificação do antígeno 503 e remoção de LPS utilizando ALE
Para a purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não clarificado
utilizando uma coluna operando em leito expandido foi realizado o procedimento descrito na
seção 4.2.6. No primeiro ensaio a etapa de eluição foi realizada de forma isocrática, com a
concentração de imidazol de 0,6 M, conforme otimizado por Sousa Junior et al. (2015)
Realizou-se o ensaio com a concentração de Triton X-114 de 0,01 % no tampão de
lavagem, de acordo com o que foi apresentado anteriormente. A Figura 19 ilustra o
cromatograma obtido para esse ensaio de purificação e a Tabela 13 apresenta o balanço de
massa.
Figura 19 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do
homogeneizado de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de
lavagem e a eluição isocrática.
Tabela 13 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não
clarificado para o ensaio com a eluição isocrática.
Etapas Volume
(mL)
Proteína
total (mg)
Antígeno 503
(mg)
Pureza do
antígeno 503
Rendimento
(%)
Fator de
Purificação
Homogeneizado
Celular 100 180,0 14,0 0,080 100,0 1,0
Passante 100 95,14 6,14 - - -
Lavagem 150 67,37 2,89 - - -
Eluição 100 19,65 0,42 0,021 3,0 0,26
70
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Analisando a Tabela 13, observa-se que na etapa de carga foi perdido 95,14 mg de
proteína total e 6,14 mg de antígeno 503, isso implica dizer que, em relação ao que foi aplicado
teve-se uma perda de 52,85% e 43,85%, referente a massa de proteína total e antígeno 503,
respectivamente. Com os dados obtidos nessa tabela foi possível calcular a capacidade de
adsorção dinâmica do Cu2+ e foram obtidos valores de 4,37 mg proteína total/g de adsorvente e
0,82 mg antígeno 503/g de adsorvente. Comparando a capacidade de adsorção dinâmica obtida
nesse estudo com a obtida por Sousa Junior et al. (2015), que foram de 7,66 mg/g de adsorvente
e 1,14 mg/g de adsorvente, para proteína total e antígeno 503, respectivamente, usando o Ni2+,
conclui-se que o Cu2+ é um pouco mais seletivo que o Ni2+, mas a capacidade dinâmica desse
último confere ao mesmo melhor vantagem. Estudos realizados por Camprubí et al. (2006),
avaliaram também a purificação de uma proteína recombinante em E. coli, nesse caso a
estreptolisina O (SLO), utilizando para os ensaios de ALE uma coluna preenchida com a resina
Streamline chelating – Ni2+. Foi possível analisar que a perda de proteína total foi
correspondente a 77,86%, mostrando que grande parte dos contaminantes não foram adsorvidos
na resina, e que apenas 26,05% foi equivalente à perda da proteína de interesse, podendo-se
concluir que para essa proteína o Ni2+ mostrou-se seletivo.
Durante a etapa de lavagem, espera-se que ocorra a remoção de partículas, células,
detritos celulares e proteínas que ficaram fracamente adsorvidas no adsorvente (Anspach et al.
1999). De acordo com a Figura 19, é notório que a concentração de proteína total e,
consequentemente, a de antígeno 503 vai decrescendo à medida que aumenta o volume do
tampão de lavagem, até que estas concentrações se tornam constantes. Esse perfil na etapa de
lavagem confirma a remoção das proteínas que apresentaram uma interação fraca com a resina
em estudo.
Seguida da etapa de lavagem tem-se a eluição, assim como descrito na metodologia,
essa etapa foi realizada com o leito empacotado. Segundo Chase (1994), essa forma é mais
eficiente, uma vez que, reduz-se o volume de eluente utilizado e resulta em uma concentração
mais elevada do produto eluído. A eluição pode ser alcançada pela introdução de um agente
competidor que age deslocando a proteína, no presente estudo foi utilizado o imidazol. De
acordo com a Tabela 11, observa-se que a eluição com o tampão contendo 0,6 mol/L de
imidazol recuperou apenas 3,0% do antígeno 503, com um fator de purificação de 0,26, e esses
resultados obtidos não foram satisfatórios quando comparados, por exemplo, aos resultados
obtidos por Sousa Junior et al. (2015) para a eluição do mesmo antígeno 503 para mesma resina
71
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
com o metal Ni2+. Esses autores obtiveram uma recuperação e um fator de purificação de 59,2%
e 6,0, respectivamente.
A Figura 20 mostra o comportamento do antígeno 503 no ensaio de ALE analisado em
SDS-PAGE 12%. Dessa forma, é possível observar que nas condições usadas no ensaio de ALE
o protocolo de purificação não apresentou bons resultados, como pode ser observado pelo perfil
eletroforético de proteínas.
Figura 20 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do
homogeneizado de E. Coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE.
Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga;
Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição.
Destaca-se que, como se trata de outro metal pode existir interações secundárias
adicionais envolvendo forças iônicas ou hidrofóbicas, sendo necessárias novas estratégias de
eluição para obtenção de uma pureza aumentada, como variações no pH e na concentração de
imidazol. Tampões de pH baixos (< 6) na maioria das vezes são suficiente para eluir a proteína
alvo, embora isso possa levar a desnaturação da mesma (Clemmitt & Chase, 2000). No caso de
proteínas sensíveis a pH mais baixo, um pH neutro é mais favorável. Em estudos realizados por
Yap et al. (2010), o pH variou de 6,0 a 8,0 e a concentração de imidazol de 50,0 a 500,0 mM,
observando que a quantidade eluída da proteína de interesse aumentou gradativamente com o
aumento na concentração de imidazol e radicalmente com o aumento do pH. A fim de melhorar
os resultados aqui obtidos, outra alternativa seria utilizar mais de um passo de eluição, em uma
estratégia conhecida como eluição em degrau, na qual utiliza-se primeiramente um tampão com
uma concentração mais baixa de imidazol a fim de eluir as proteínas contaminantes fracamente
ligadas ao adsorvente, e em seguida, emprega-se um tampão contendo uma concentração mais
kDa 97.0 66.0
45.0
30.0
20.1
1
2
3
4
5
72
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
alta do agente competitivo, com a finalidade de eluir o antígeno 503. Esta estratégia foi estudada
por Campubrí et al. (2006), que utilizou 50,0 e 500,0 mM de imidazol, Clemmitt & Chase
(2000), onde as etapas de eluição foram realizadas utilizando concentrações de imidazol de 6,0
mM e 60,0 mM, e ainda por Tan et al. (2006) que aplicaram a eluição em duas etapas, usando
50,0 e 350,0 mM do imidazol. Observa-se que para todos esses estudos a estratégia foi eficiente
e foram obtidos resultados satisfatórios na eluição da proteína de interesse.
Deste modo, com o objetivo de melhorar a recuperação do antígeno 503, a estratégia de
eluição em degrau foi empregada, uma vez que trabalhos encontrados na literatura sugerem que
a utilização de uma baixa concentração de imidazol pode ser utilizada para eluir algumas
proteínas contaminantes.
Primeiramente, baseado na concentração de imidazol aplicada na eluição isocrática (0,6
mol/L), foram utilizados dois passos de eluição com 0,6 e 1,0 mol/L de imidazol, com a
finalidade que a proteína de interesse seja eluída no segundo passo (1,0 mol/L). O
cromatograma adquirido para esse ensaio de purificação está ilustrado na Figura 21 e a Tabela
14 apresenta o balanço de massa.
Figura 21 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do
homogeneizado de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de
lavagem e a eluição em degrau com 0,6 e 1,0 mol/L.
73
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Tabela 14 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não
clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos.
Etapas Volume
(mL)
Proteína total
(mg)
Antígeno
503 (mg)
Pureza
do antígeno 503
Rendimento
(%)
Fator de
Purificação
Homogeneizado
Celular 100 168,0 7,30 0,043 100,0 1,0
Passante 100 61,39 3,13 - - -
Lavagem 150 54,36 1,28 - - -
Eluição 1 50 13,23 0,37 0,028 5,07 0,65
Eluição 2 50 8,34 0,04 0,005 0,55 0,12
Através da Figura 21 perecebe-se que a etapa de eluição, mesmo com dois passos,
apresentou perfil semelhante a etapa de eluição do cromatograma realizado com eluição
isocrática (Figura 20), podendo-se concluir que essa estratégia não foi eficiente para eluir o
antígeno 503.
Por meio da Tabela 14 pode-se observar que o segundo passo de eluição (Eluição 2)
utilizando 1,0 mol/L de imidazol resultou em uma recuperação e fator de purificação da proteína
de de interesse de apenas 0,55 e 0,12, respectivamente. Quando comparado ao teste anterior
realizado com eluição isocrática, observa-se que houve uma diminuição na recuperação e fator
de purificação. Logo, esses passos de eluição não foram satisfatórios para eluição do antígeno
503, o que pode ser confirmado através da Figura 22, a qual ilustra o perfil eletroforético das
proteínas. Essa Figura mostra que a biomolécula de interesse foi eluída com concentração de
imidazol inferior a 1,0 mol/L. Com isso, uma outra estratégia seria utilizar um passo de eluição
com a concentração de imidazol abaixo de 0,6 mol/L, com a finalidade de que as proteínas
contaminantes sejam eluídas nessa concentração inferior e o antígeno 503 eluído com 0,6
mol/L.
74
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Figura 22 - Gel de eletroforese (SDS-PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do
homogeneizado de E. coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE.
Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3: Carga;
Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,6 mol/L; Coluna 6: Eluição 1,0 mol/L.
Portanto, essa nova estratégia foi empregada e o ensaio foi realizado novamente com
dois passos de eluição, nesse caso sendo utilizados 0,3 mol/L e 0,6 mol/L de imidazol. O
cromatograma obtido para esse ensaio de purificação segue na Figura 23 e a Tabela 15 apresenta
o balanço de massa.
Figura 23 - Cromatograma do perfil de purificação do antígeno 503 a partir do
homogeneizado de E. coli não clarificado utilizando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de
lavagem e a eluição em degrau com 0,3 e 0,6 mol/L.
1 2 3 4 5 6 kDa
97.0
66.0
45.0
30.0
20.1
75
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Tabela 15 - Dados da purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E. coli não
clarificado para o ensaio com a eluição em degrau com dois passos.
Etapas Volume
(mL)
Proteína
total (mg)
Antígeno
503 (mg)
Pureza
do antígeno 503
Rendimento
(%)
Fator de
Purificação
Homogeneizado
Celular 100 164,0 7,0 0,043 100,0 1,0
Passante 100 79,46 4,04 - - -
Lavagem 150 55,54 0,98 - - -
Eluição 1 50 13,97 0,46 0,033 6,57 0,77
Eluição 2 50 8,20 1,05 0,128 15,00 2,98
Analisando a Figura 23 e a Tabela 15, observa-se o antígeno 503 foi eluído no segundo
passo de eluição (Eluição 2), com 0,6 mol/L de imidazol, apresentando uma recuperação de
15,0% do antígeno 503 e um fator de purificação de, aproximadamente, 3,0.
A Figura 24 ilustra o comportamento do antígeno 503 no ensaio de ALE analisado em
SDS-PAGE 12% e demonstra que a proteína de interesse eluída apresenta um peso molecular
de, aproximadamente, 56 kDa. Percebe-se ainda que uma pequena quantidade de proteína com
peso inferior a 56 kDa foi detectada no eluato. Da mesma forma, Wizemann & von Brunn
(1999) e Tan et al. (2006) durante a purificação relataram a presença de proteína com peso
molecular abaixo da proteína de interesse no eluato e consideraram que estas impurezas podem
ser proteínas contaminantes que não foram removidas durante a etapa de eluição prévia com
uma concentraçao de imidazol inferior, ou podem ser ainda produtos de degradação da proteína
alvo.
76
5. Resultados e Discussões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Figura 24 – Gel de eletroforese (SDS – PAGE) do antígeno 503 recuperado a partir do
homogeneizado de E. coli usando 0,01 % de Triton X-114 na etapa de lavagem da ALE.
Coluna 1: Padrão de massa molecular; Coluna 2: Homogeneizado de E. coli; Coluna 3:
Passante; Coluna 4: Lavagem; Coluna 5: Eluição 0,3 mol/L; Coluna 6: Eluição 0,6 mol/L.
Assim como nos estudos realizados por Clemmitt & Chase (2000), Campubrí et al.
(2006) e Tan et al. (2006), o tampão de eluição contendo uma concentração mais baixa de
imidazol, nesse estudo sendo de 0,3 mol/L (Eluição 1), eluiu a maioria das proteínas
contaminantes fracamente ligadas e a proteína de interesse foi eluída a partir da aplicação de
um tampão (Eluição 2) contendo uma concentração de imidazol mais elevada (0,6 mol/L).
Os resultados obtidos nesse último ensaio foram satisfatórios quando comparado com
os obtidos no ensaio utilizando eluição isocrática, mostrando que a estratégia de utilizar a
eluição em degrau foi eficiente para purificar o antígeno 503 a partir do homogeneizado de E.
coli não clarificado.
1 2 3 4 5 6 kDa
97.0
66.0
45.0
30.0
20.1
CAPÍTULO VI
CONCLUSÕES
78
6. Conclusões
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
6. Conclusões
• O melhor método de rompimento celular da E. coli foi o da ureia, apresentando
valores mais elevados na liberação de proteínas totais e antígeno 503. Através
da análise do planejamento fatorial completo 22 observou-se que a única variável
significativa foi a concentração de ureia (mol/L) tendo influenciado
positivamente, portanto sendo definida em 8 mol/L. O tempo como não
apresentou efeito significativo nas respostas obtidas foi fixado em 15 minutos,
otimizando assim o processo de ruptura utilizando esse método.
• Com a triagem do íon metálico tem-se que o Cu2+ foi o que apresentou maior
capacidade de adsorção do antígeno 503 e que as concentrações avaliadas (0,1;
0,5; 0,8 mol/L) não apresentaram diferença significativa, sendo então
determinada que a resina Streamline Chelanting tinha de ser carregada com uma
solução de 0,1 mol/L Cu2+. A isoterma de adsorção do antígeno 503 mostrou
bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,9885).
• A adição do tensoativo não-iônico, Triton X-114, à etapa de lavagem da ALE,
na menor concentração avaliada (0,01%) proporcionou um elevado valor de
remoção do LPS (99,70%). Logo, esse processo que integra em uma única etapa
os processos de clarificação, recuperação, purificação e redução significativa de
LPS a partir de um extrato não clarificado é bastante promissor.
• Para recuperação e purificação do antígeno 503 usando Cu2+ imobilizado na
resina Streamline chelanting por ALE, a estratégia de eluição em degrau com as
concentrações de 0,3 e 0,6 mol/L de imidazol foi a mais eficiente no processo
de purificação, com uma recuperação de 15,0% e um fator de purificação de,
aproximadamente, 3,0.
• A IMAC operando em coluna de leito expandido mostrou-se como uma boa
alternativa para a purificação do antígeno 503 a partir do homogeneizado de E.
coli não clarificado. A combinação da clarificação, concentração e purificação
de biomoléculas em uma única etapa reduz o tempo e os custos de operação.
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APÊNDICE
94
Apêndice
Ana Laura Oliveira de Sá Leitão Fevereiro/2017
Apêndice 1
Resultados do planejamento fatorial 22 para o rompimento utilizando ureia.
Tabela 1 – Análise de variância (ANOVA) para variável concentração de proteína total.
Fonte de
variação
Soma
quadrática
Graus de
liberdade
Média
quadrática Fcal Ftab
Regressão 0,79484 3 0,26495 34,82 19,16
Resíduos 0,01522 2 0,00761
Falta de
ajuste 0,00992 1 0,00992
1,87 161,40
Erro puro 0,00530 1 0,00530
Total 0,81006 5
Tabela 2 – Análise de variância (ANOVA) para variável concentração de antígeno 503.
Fonte de
variação
Soma
quadrática
Graus de
liberdade
Média
quadrática Fcal Ftab
Regressão 0,01118 3 0,00373 57,38 19,16
Resíduos 0,00013 2 0,00006
Falta de
ajuste 0,00013 1 0,00013
26,00 161,40
Erro puro 0,000005 1 0,000005
Total 0,81006 5
ANEXOS
96
Anexo
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ANEXO 1
Tabela 1: Potencial de redução.
Fonte: Atkins & Jones (2012).