dissertaÇÃo de mestrado análise da produção de celulases … · elvia denise de sousa vilela...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Análise da produção de celulases e beta glicosidase produzidas por
Streptomyces sp.
ELVIA DENISE DE SOUSA VILELA
Goiânia
2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
Análise da produção de celulases e beta glicosidase produzidas por
Streptomyces sp.
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-graduação
em Biologia, da Universidade
Federal de Goiás, como
requisito parcial a obtenção
do titulo de Mestre.
Orientado: Elvia Denise de Sousa Vilela
Orientador: Prof. Dr. Luiz Artur Mendes Bataus
Co-orientadora: Profa. PhD. Rosália do Santos
Amorim Jesuino
Goiânia - 2013
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“Cada dia que amanhece assemelha-
se a uma página em branco, qual gravamos
os nossos pensamento, ações e atitude. Na
essência, cada dia é a preparação de nosso
próprio amanhã, por isso agradeço todas as
dificuldades que enfrentei; não fosse por
elas, eu não teria saído do lugar. As
facilidades nos impedem de caminhar.”
Chico Xavier
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Dedico esse trabalho
a meus pais e irmão, que
ajudaram na superação dessa
nova etapa da minha.
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AGRADECIMENTOS
Esse é o momento em que podemos dizer as pessoas que amamos e que fazem tanta
diferença na minha vida e sempre farão, o quanto sou grata a elas por ter conseguido obter êxito
em mais essa etapa da minha.
Em primeiro lugar devo agradecer a Deus por ter me concedido a graça da saúde e por ter
me dado a felicidade de ter nascido em um lar onde todos me amam, me protegem e incentivam,
as vezes com palavras duras, mas verdades que precisam ser ditas, para que possamos crescer.
Agradeço aos meus pais, pois se não fosse eles eu não seria quem sou, pois eles me
amaram desde o primeiro momento e me amam incondicionalmente, me proporcionam a
possibilidade de estudar sem precisar me preocupar com outras coisas, isso faz uma enorme
diferença e como faz. A minha mãe que sempre me ensinou os valores de família, redução e
amor. Ao meu pai, que sempre ensinou o que é amor e sempre me fez me sentir a menina mais
protegida do mundo, e que nada nem ninguém poderia me machucar. Eles me mostraram que a
única coisa que temos nossa e quem ninguém pode nos tirar são os estudos e assim podemos
crescer e nos tornar pessoas melhores.
Muitas vezes não entendemos o amor dos nossos pais, mas é o amor mais belo e puro que
temos e sou enormemente grata por eles me amarem tanto assim. Eu os amo mais que tudo na
minha vida.
Quero agradecer também aos meus irmãos que sempre me apoiaram e me incentivaram a
crescer. Agradeço a minha irmã Erica que sempre percebe como estou e chega sempre com as
palavras e atitudes certas, no momento que preciso. Agradeço ao meu irmão Paulo Sérgio que
sempre me incentivou a fazer o curso que eu queria e me formar nele, e tomando amor pela área
da pesquisa, que muitas vezes é difícil, mas no final é o que me do orgulho. Agradeço ao meu
irmão Mário vezes ríspido em seus comentários, mas incentivador. Obrigada
Agradeço também a profa Rosália que me aceitou em seu laboratório para começar minha
iniciação cientifica e me ajudou na minha dissertação. Obrigada
Agradeço a Lorena, que me ajudou no inicio do meu aprendizado e sempre me deu
ótimos conselhos, Carol que no inicio do meu mestrado me ajudou muito me ensinando todos os
processos e a Carla do LQP que me ajudou muito, me meu trabalho. Obrigada
Agradeço com muito carinho ao meu orientador prof. Luiz Artur, por ter me aceito em
seu laboratório, confiado em mim, por sempre me motivar quando tudo dava errado, sou grata a
ele pela paciência de sempre. Sempre me lembrarei dele com muito carinho. Obrigada
Agradeço ao prof. Ivan Campos, que sempre me ajudou muito tirando dúvidas e
descontraindo em alguns momentos. Bom amigo. Obrigada
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Agradeço a Glace, secretária da pós-graduação, sempre disposta a ajudar nós pós
graduando. Obrigada
Muito obrigado a Marilene e seu grupo de oração, que sempre rezarão por mim e me
ajudaram nos momentos que eu mais precisei, me ajudando a ter paz e me mostrando o amor de
Deus por seus filhos.
Enfim, sou grata a todos que direta ou indiretamente me ajudaram, apoiaram em mais
essa conquista de muitas em minha vida. A vocês, meus mais sinceros agradecimentos e
carinho...
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Estrutura celulósica de materiais lignocelulosico, ilustrando a extremidade redutora e não
redutora da celulose e a Celobiose formada pela união de duas moléculas de glicose (adaptado de
ZHANG & LYND, 2004). 3
Figura 2- Conformação da fibra cellulose (SANDGREEN et al., 2005). 4
Figura 3- Constituição monomérica da hemicelulose. Adaptada de Sjostrom & Alén (1999). 5
Figura 4- Estrutura das Xilanas. Adaptado de Palmeiras et al., (2010). 6
Figura 5- Esquema da ação das endoglicanases, celobiohidrolase e exoglicanases, em ação conjunta na
hidrólise da celulose. Adaptado de Carns & Esen (2010). 11
Figura 6- Representação esquemática da ação catalítica do complexo enzi¬mático (celulase) sobre
celulose com geração de glicose. 12
Figura 7- Análise de atividade de Avicelase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo, suplementado
com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e extrato de levedura como
fonte de nitrogênio. 33
Figura 8- Análise de atividade de Avicelase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo, suplementado
com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e extrato de levedura como
fonte de nitrogênio 34
Figura 9- Análise da produção de Beta glicosidase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,
suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e extrato de
levedura como fonte de nitrogênio. 34
Figura 10- Análise da produção de Beta glicosidase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,
suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e extrato de
levedura como fonte de nitrogênio. 35
Figura 11- Análise qualitativa de beta glicosidase por TLC. 35
Figura 12- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de levedura,
visando o aumento da produção de CMCase pelo Streptomyces sp (isolado I7). 38
Figura 13 - Predição Matemática do ótimo de atividade para produção de CMCase. 38
Figura 14 - Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de levedura,
visando o aumento da produção de Avicelase pelo Streptomyces sp (isolado I7). 39
Figura 15 - Predição matemática do ótimo de atividade de Avicelase. 39
Figura 16- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de levedura,
visando o aumento da produção de FPase pelo Streptomyces sp (isolado I7). 40
Figura 17- Predição matemática do ótimo de atividadede de FPase produzida pelo isolado I7. 40
Figura 18- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de levedura,
visando o aumento da produção de Beta glicosidase pelo Streptomyces sp (isolado I7) 41
Figura 19- Valores das concentrações ideais de farelo de trigo e de extrato de levedura para otimização
do processo de produção de beta glicosidase pelo Streptomyces I7. 41
Figura 20- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de CMCase, com isolado I7
mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo de trigo
0,75% e extrato de levedura 0,1%. 44
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Figura 21- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de FPase, com isolado I7 mantido
por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e
extrato de levedura 0,1%. 45
Figura 22- Cinética de produção de celulases com ensaio de atividade de Avicelase, com isolado I7
mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com Farelo de trigo
0,75% e extrato de levedura 0,1%. 45
Figura 23- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de CMCase, com isolado I7
mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo de trigo
0,75% e extrato de levedura 0,1%. 46
Figura 24 - Efeito da variação do pH sobre atividade de CMCase do isolado I7. O isolado I7 foi cultivado
em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%. 47
Figura 25 - Efeito da variação do pH sobre atividade de FPase do isolado I7. O isolado I7 foi cultivado
em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%. 48
Figura 26- Efeito da variação do pH sobre atividade de Avicelase do isolado I7. O isolado I7 foi
cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%. 48
Figura 27- Efeito da variação do pH sobre atividade de Beta glicosidase do isolado I7 cultivado em meio
mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.6.6 Influência da
temperatura na atividade das enzimas testadas. 49
Figura 28 – Efeito da variação de temperatura sobre atividade de CMCase. O ensaio foi relaizado em pH
4,5, e o ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de
levedura 0,1%. 50
Figura 29 – Efeito da variação de temperatura sobre atividade de FPase. O ensaio foi realizado em pH
5,5, e o ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de
levedura 0,1%. 51
Figura 30– Efeito da variação de temperatura sobre atividade de Avicelase. O ensaio foi realizado em
pH6,0. O ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de
levedura 0,1%. 51
Figura 31- Efeito da variação de temperatura sobre atividade de beta glicosidase (pH 4,5)do ilsolado I7
cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%. 52
Figura 32- Termoestabilidade de CMCase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade relativa
expressa em porcentagem. 54
Figura 33- Termoestabilidade de FPase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade relativa
expressa em porcentagem. 55
Figura 34- Termoestabilidade de Avicelase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade relativa
expressa em porcentagem. 55
Figura 35 - Termoestabilidade de beta glicosidase do sobrenadante de cultura produzida pelo isolado I7
com atividade relativa expressa em porcentagem 56
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LISTA DE TABELA
Tabela I – Variação das concentrações de extrato de levedura e farelo de trigo respectivamente. 26
Tabela II– Composição centesimal do farelo de trigo, farelo de arroz e farelo de milho. 30
Tabela III – Atividade enzimática em função dos diferentes tratamentos (expresso U/mL) 37
Tabela IV– Atividade enzimática em função dos diferentes tratamentos (expresso U/mL) 42
Tabela V - Efeito dos diferentes íons e do EDTA na atividade de CMCase, Fpase, Avicelase e beta
glicosidase. 58
iv
1
v
LISTA DE ABREVIATURAS
Avicel- Celulose microcristalina
Avicelase- Atividade enzimática contra avicel
BGL- Beta glicosidase
BGA- Bagaço de cana-de-açucar
CBH- Celobiohidrolases
CMC- Carboxmetilcelulose
CMCase- Atividade enzimática contra CMC
DNS- Ácido 3,5- dinitrosalicílico
EL- extrato de levedura
FPase- Atividade enzimática contra papel de filtro
FA- Farelo de arroz
FM- Farelo de Milho
FT- Farelo de trigo
GGMs- Galactoglucomana
MM- Meio Mínimo
q.s.q- Quantidade suficiente para
SDS- Sódio dodecil sulfato
U- Unidade enzimática( quantidade de enzima capaz de formal 1 μmol de produto por minuto,
em condições experimentais).
1
RESUMO
No Brasil o bagaço de cana de açúcar é considerado um dos mais importantes resíduos
agroindustriais e sua utilização vêm sendo estudada. Uma das possibilidades é hidrólise
enzimática desse resíduo, visando à sacarificação e posterior produção de etanol. Uma das
prioridades de pesquisa nesta área é a busca por novos microrganismos que produzam celulases a
partir de matérias-primas de baixo custo. O objetivo desse trabalho foi o de estudar a produção
de celulases e beta glicosidases por uma nova linhagem de Streptomyces sp cultivada em
diferentes fontes de carbono. A produção de celulases e beta glicosidase foi analisada por
fermentação submersa em meio mínimo contendo farelo de milho, farelo de arroz e farelo de
trigo como fonte de carbono e extrato de levedura como fonte de nitrogênio. Os resultados
demonstraram que o farelo de trigo foi o melhor indutor para ambas as enzimas. A analise da
superfície de resposta foi utilizada para determinar as concentrações de farelo de trigo e de
extrato de levedura mais adequadas para aumentar a produção destas enzimas. O Streptomyces
sp. foi cultivado em meio contendo diferentes concentrações de farelo de trigo (0,25 a 75%) e
extrato de levedura (0,1 a 0,3%). A maior atividade foi obtida com 0,75% de farelo de trigo e
0,1% de extrato de levedura,tanto para celulases como parabeta glicosidases. As condições
sugeridas pela metodologia de superfície de resposta foram utilizadas para avaliar a influência do
tempo de cultivo sobre a produção das enzimas. A produção foi acompanhada por 12 dias. A
maior atividade de CMCase foi obtida no 8°dia de cultivo (26 U/mL), FPase no 9º dia de cultivo
(11,25 U/mL), Avicelase no 7ºdia de cultivo (5 U/mL) e beta glicosidase 9º dia de cultivo (7
U/mL). A influência do pH (3,0 – 10,0), temperatura (40 a 80°C) e íons metálicos foram
avaliados. A atividade de CMCase foi maior em pH 4.5 e temperatura de 50°C, FPase foi maior
em pH 5,5 e temperatura 50°C, Avicelase em pH 5,0 e temperatura de 40°C e beta glicosidase
em pH 4,5 e temperatura de 65°C. Vários íons metálicos analisados resultaram na indução da
atividade de CMCase e Avicelase. A atividade de FPase só foi estimulada pelo Mn2+
. O EDTA
reduziu a atividade de CMCase em 86%, FPase em 36%, Avicelase em 81%. A beta glicosidase
foi totalmente inibida. A termoestabilidade foi avaliada por pré-incubação a 50°C e 60°C para
celulases e 60º e 65ºC para beta glicosidase. A atividade de CMCase manteve-se plena por até
120 minutos de pré-incubação a60°C. FPase e Avicelase tiveram sua atividade aumentada por
pré-incubação a 50ºC. A beta glicosidase manteve atividade elevada por pré-incubação por
150minutos a 60ºC. Os resultados demostram que as enzimas produzidas por esse
microrganismo têmpotencial para ser utilizada em processos biotecnológicos.
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ABSTRACT
Sugar cane bagasse is considered one of the most important agro-industrial residues in
Brazil and its use has been studied. One possibility is the enzymatic hydrolysis of this waste,
aiming further saccharification for ethanol production. One of the main research goals in this
area is the search for new microorganisms that produce cellulases from lower-cost source
materials. The aim of this work was to study the production of cellulases and beta-
glucosidasesfrom a novel Streptomyces sp strain grown on different carbon sources. The
production of cellulases and beta-glucosidases was analyzed by submerged fermentation in
minimal medium containing corn bran, rice bran and wheat bran as carbon sources and yeast
extract as nitrogen source. Wheat bran was the best inducer for both enzymes. A response surface
analysis was used to determine the concentrations of wheat bran and yeast extract best suited to
increase the production of cellulases and beta-glucosidases. The Streptomyces sp. was grown in a
medium containing different concentrations of wheat bran (0.25 to0.75%) and yeast extract (0.1
to 0.3%). The highest activity was obtained with 0.75% wheat bran and 0.10% yeast extract for
both cellulases and beta glucosidases. Conditions suggested by the response surface analysis
were used to evaluate the influence of culture time on enzyme production. The production was
monitored for 12 days with the highest activity of CMCase obtained on the 8th day of culture (26
U / mL), FPase on the 9th day of culture (11.25 U / mL), Avicelase on the 7th day of culture (5 U
/ mL) and beta glucosidase on 9th day of culture (7 U / ml). The influence of pH (3.0 to 10.0),
temperature (40 to 80 °C) and metal ions was evaluated. CMCase activity was highest at pH 4.5
and 50 °C, FPase at pH 5.5 and 50 °C, Avicelase at pH 5.0, and 40 °C and beta-glucosidase at pH
4.5 and 65 °C. Several metal ions analyzed resulted in the induction of CMCase and Avicelase
activity, while FPase activity was only stimulated by addition of Mn2+. EDTA reduced CMCase
activity by 86%, FPase by 36%, Avicelase by 81% and beta-glucosidase was completely
inhibited. The thermostability of these enzymes was evaluated by preincubation at 50 °C and 60
°C for cellulases, and 60°C and 65 °C for beta glucosidases. Full enzymatic activity remained
after 120 minutes of pre incubation at 60 °C and 180 minutes at 50 °C for CMCase. FPase and
Avicelase activities were increased with 30 minutes of pre-incubation at 50 ºC and 60 ºC. Beta
glucosidase activity remained elevated for at least 2 hours of incubation at either 60 ºCor 65 ºC.
These results demonstrate that the enzymes produced by this microorganism have the potential to
be used in biotechnological processes.
1
Introdução
Atualmente, no Brasil tem se investido bastante em pesquisas que envolvam a obtenção
de energia a partir de fontes alternativas e renováveis, com intuito de reduzirà utilização de
energia fóssil, que particularmente tem causado enormes alterações ao clima como aquecimento
global, pela emissão de gás carbônico(SANCHEZ , 2009;PICCOLO &BEZZO, 2009).
Existem inúmeras fontes de se obter energia renovável como a partir do milho, beterraba,
trigo, cana-de-açúcar e etc., no Brasil se destaca a produção de bioetanol de cana-de-açúcar. O
bioetanol nacional vem substituindo, atualmente, metadeda gasolina que seria consumida no
país, por ser o etanol uma forma eficiente de combustível (LAVARACK et al., 2002).
O etanol produzido a partir da cana-de-açúcar pela fermentação da sacarose contida no
caldo é chamado de etanol de primeira geração. As usinas geram durante a produção do etanol
uma grande quantidade debiomassa residual, que geralmente tem sidoempregada na manutenção
de caldeiras e para gerar eletricidade, entretanto esta biomassa lignocelulósica pode ser utilizada
na produção de etanol denominado de segunda geração, garantido, desta maneira, um melhor
aproveitamento destes resíduos (BUCKERIDGE et al., 2009).
Esta biomassa é rica em lignina, celulose e hemicelulose, sendo a remoção da lignina por
pré-tratamento essencial para que haja a hidrólise dos polissacarídeos, em seus monossacarídeos
correspondentes, os quais serão fermentados a etanol de segunda geração. E a hidrólise destes
carboidratos em suas unidades monoméricas é realizada por hidrolases conhecidas como
celulases.
Neste contexto, a busca por microrganismos produtores de celulases vem crescendo nos
últimos anos e tem incentivado vários grupos de pesquisa a procurá-los nas mais diversas
microbiotas e a isolá-los de acordo com o seu potencial em hidrolisar os resíduos
lignocelulósicos.
1.1 Lignocelulose
Hoje se reconhece que os mecanismos de biodegradação dos materiais lignocelulósicos
podem ser conduzidos de forma controlada, usando fungos e bactérias pré-selecionados como
alternativa biotecnológica, por produzirem enzimas eficientes na degradação desses materiais.
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Tais enzimas tem sido de grande importância na indústria como uma solução adequada, no que
diz respeito à reciclagem dos resíduos sólidos de origem vegetal, como resíduos lignocelulósicos.
A lignocelulose é o principal componente estrutural das plantas, é rica em carboidratos. A
biomassa lignocelulósica é um material complexo que consiste de três grandes frações orgânicas,
onde a celulose é um homopolímero cristalino de glicose compondo 40-50% da biomassa da
planta. Já a hemicelulose é um polímero heterogêneo com diferentespentoses e hexoses, podendo
alcançar entre 25-35% da biomassa lignocelulósica. A ligninaencontra-se ligada a celulose e a
hemicelulose, formando um lacre físico, uma barreira impenetrável, que confere resistência e
proteção contra ataques de microrganismo e estresse oxidativo. Esta pode representar entre 25-
35% da biomassa (VARNAI et al., 2010; DOUGHERTYet al., 2012).
A lignocelulose compreende metade do peso seco dos vegetais (SANCHEZ, 2009;
ADSULet al., 2005), sendoproduzida em grandes quantidades e muitas vezes sua utilização
resulta em uma grande quantidade de resíduos lignocelulósicos que não sãoutilizados
(TURNERet al., 2007). Um dos principais fins dado a esses resíduos era a incineração, hoje com
a nova legislação ambiental, essa prática é proibida em muitas regiões do país, que exigem o
adequado destino para esses resíduos. Um dos possíveis destinos dado a esses resíduos é a sua
degradação por enzimas produzidas por microrganismos, que conseguem hidrolisar celulose e
fazer que esta seja utilizada como matéria prima por algumas indústrias (SANDRIMet al., 2005)
1.2 Celulose
A celulose desempenha papel exclusivamente estrutural nas plantas, conferindo a célula
proteção osmótica e resistência mecânica. É o principal polissacarídeo da parede celular das
plantas representando de 35 a 50% do peso seco (BAYER&LAMED, 1992). É um polímero
linear de 8.000 a 12.000 unidades de glicose ligados por ligações β-1,4 glicosídicas, sendo que a
menor unidade repetitiva é a celobiose com sucessivos resíduos de glicose, assim a degradação
desta representa uma parte importante no ciclo do carbono na biosfera (LIMA et al., 2005;
TURNERet al., 2007). Este polímero apresenta uma extremidade redutora e uma extremidade
não redutora. Na figura abaixo (Figura 1), está demonstrado um modelo estrutural da molécula
de celulose, ressaltando a extremidade redutora e a não redutora da celulose, a ligação glicosídica
β-1,4 e a Celobiose.
3
Figura 1- Estrutura celulósica de materiais lignocelulósico, ilustrando a extremidade redutora e
não redutora da celulose e a Celobiose formada pela união de duas moléculas de glicose
(adaptado de ZHANG & LYND, 2004).
Após a síntese da celulose, esta se organiza em unidades de microfibrilas, sendo que essas
microfibrilas são mantidas unidas por ligações de hidrogênio, que mantém a rede mais fixa e
com caracteristicas hidrofóbicas (DASHTBANet al., 2009; FERREIRAet al., 2009). O
comprimento das cadeias de celulose na microfibrila varia de 100 a 40.000 nm, dependendo da
fonte onde esta é sintetizada, a partir de 2000-25.000 unidades de glicose em paredes primarias
(SANDGREENet al., 2005; FERREIRA et al., 2009). Essas microfibrilas (Figura 2) também são
mantidas por interações de Vander Waals entre as cadeias poliméricas que formam zonas com
estruturas cristalinas, em sua maioria, bastante ordenadas que não permite a água penetrar no seu
interior. Estas ligações, juntamente com as zonas cristalinas, que alternam com zonas amorfas,
correspondem a dois terços da celulose presente na madeira. A organização cristalina da celulose
influência na sua reatividade ao controlar o acesso a substâncias químicas ou enzimas aos grupos
funcionais e às ligações químicas nas regiões cristalinas. Dependendo da fonte, a celulose
cristalina varia de 50% a 90% (FERREIRAet al., 2009).
Extremidade Não-
redutora Ligação glicosidica β-1,4 Extremidade Redutora
Celobiose
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Figura 2-Conformação da fibra cellulose (SANDGREEN et al., 2005).
1.3Hemicelulose
A hemicelulose é um polissacarídeo de baixa massa molecular associado à celulose e a
lignina. A hemicelulose se assemelha mais a celulose do que a lignina.Juntas formam a parede
celular das células vegetais e compreendem de 25-30% do peso seco dos vegetais (ALBERTON
et al., 2009).
A hemicelulose é um conjunto de componentes poliméricos presente nos vegetais, onde
cada componente tem sua particularidade.Este polissacarídeo tem uma estrutura complexa de
carboidratos, incluindo a xilana (homopolímero), xiloglucana (heteropolímero de D-xilose e D-
glucose), glucomanana (heteropolímero de D-glucose e D-manose), galactoglucomanana
(hetreopolímero de D-galactose, D-glucose e D-manose) e arabinogalactana (heteropolímero de
D-galactose e D-arabinose) (figura 3)(SANCHEZ, 2009 ; ALBERTONet al., 2009). A cadeia
principal pode ser constituída de uma só unidade(homopolímero) como a xilana, ou de duas ou
mais unidades (heteropolímero) como as glucomananas e arabinogalactanas, sendo que a
hemicelulose de madeira dura contém mais xilana e a hemicelulose presente em madeira mole
contém maior quantidade de glucomananas (PASTORE2004; SJOSTROM &ALÉN, 1999).O
componente mais abundante na hemicelulose é a xilana, constituindo aproximadamente 25% da
biomassa total de madeiras e gramas (ALBERTON et al., 2009).
5
Figura 3- Constituição monomérica da hemicelulose. Adaptada de Sjostrom & Alén (1999).
1.3.1 Xilana
A xilana é o principal componente da hemicelulose. É o segundo polissacarídeo mais
abundante na natureza depois da celulose. A cadeia principal é constituída por unidades do
homopolímero D-xilanopiranose ligados por β- 1,4 D-glicosídicas (SAHA, 2002; MERYANDIet
al., 2006; COLLINSet al., 2005)
Além da cadeia principal da xilana pode apresentar substituintes formando ramificações,
essa são denominadas de cadeis laterais. Entre os substituintes são encontradosO-acetil, α-L-
arabinofuranose, D-glucoronil e resíduos de O-metil-D-glucoronil.Pequenas quantidades de
ácido ferúlico e ρ-cumárico ligados a resíduos de L-arabinose também podem ser encontrados
(Figura 4) (MERYANDINIet al., 2006; KULKARANI et al., 1999).
6
Figura 4- Estrutura das Xilanas. Adaptado de Palmeiras et al., (2010).
A xilana situa-se entre a fibra de celulose e lignina, sendo essa camada responsável pela
manutenção da integridade da fibra, protegendo-as do ataque das celulases. Muitos
microrganismos, como bactérias e fungos produzem enzimas extracelulares que são capazes de
degradar a biomassa lignocelulósica, promovendo a hidrólise desta. A hidrólise enzimática
completa da xilana requer a ação de enzimas xilanolíticas, a endoxilanase β-1,4, β-xilosidase e
enzimas acessórias tais como: α-glucoronidase, acetil esterase e α-L-arabinofuranosidase. Estas
enzimas são responsáveis pela conversão da xilana em xilose (GEORISet al., 2000;
MERYANDINIet al., 2006; RAWEESRIet al., 2008). A xilose pode ser usada para a formação de
alguns compostos úteis: como a fermentação do xilitol para obter ácidos orgânicos e também
etanol (RAWEESRIet al.,2008).
1.3.2 Galactoglucomanana
As galactoglucomanas é um dos principais componentes das madeiras macias,
perfazendo de 15 a 30% do peso seco (REYES et al., 2013). É constituída principalmente por
galactose, manose e glicose. Forma o segundo principal grupo das estruturas hemicelulósicas e
são constituídas por resíduos de D-manose ligados por ligações β 1,4, podendo estar substituídas
por resíduos de D-galactose, unidos por ligações α 1,6 (SOMERA, 2008). As proporções de cada
monossacarídeo (manose e galactose) podem variar de acordo com a espécie da planta (CAPEK
et al., 2002), sendo que as galactoglucomananas solúveis apresentam maiores quantidades de
galactose do que as GGMs insolúveis (MANASRAH et al., 2012).
A hidrólise das GGMs ocorre por ação das β-endomananases e β-manosidases. Essas
enzimas são normalmente obtidas de fungos (SOMERA, 2008). Segundo Reyes (2013) as
7
galactoglucomananas poderiam ser uma fonte potencial de açúcares fermentáveis visando à
produção de etanol.
1.3.3 Arabinogalactana
As arabinogalactanas são polissacarídeos estruturais e são encontrados em todos os
vegetais superiores, estando presente na estrutura da parede celular primaria (NGUEMA-ONA et
al., 2013).
As arabinogalactanas são formadas por uma cadeia de arabinose ligada a uma cadeia de
galactose, a fibra de celulose estaria coberta por varias moléculas de xiloglucanas ligadas
covalentemente a uma unidade interna de galactose da arabinoglucana (MELLINGER, 2006).
As arabinogalactanas apresentam diferenças na cadeia principal, que leva a classificação
desta em dois grupos: as arabinogalactanas tipo I, que são as pouco ramificadas e com cadeia
principal de (1 4) β-D-galactanas e as do tipo II, altamente ramificadas que são constituídas por
cadeia principal (1 3) e /ou (1 6) β-D-galactana (OOSTERVELD et al., 2002). As enzimas que
atuam sobre esta molécula são denominadas de arabinogalactanases, as quais têm sido utilizadas
na extração de sucos.
1.4 Lignina
A lignina é encontrada em plantas terrestres, está associada à celulose e a hemicelulose,
conferindo a planta rigidez, impermeabilidade e resistência a ataques microbiológicos e
mecânico aos tecidos vegetais, sendo que o que confere essa maior resistência, é a lignificação
que ocorre nos espaços interfibrilares da parede celular, fazendo com que ocorra perda da
elasticidade da parede celular, devido a esse fator a passagem de água pelas paredes celulares,
fica reduzida (NULTSH et al., 2000; RAVE et al., 2001). A lignina é um polímero derivado de
unidades fenilpropanóides, amorfo e insolúvel em água, tem estrutura com nove átomos de
carbono, que são repetidos de forma irregular, originada da polimerização do álcool coniferílico
e álcool sinergil. Os polímerosde lignina são altamente ramificados e não cristalinos. A lignina
varia sua composição química de acordo com a fonte de origem. Essa variação determina
diferença desusceptibilidade a hidrólise enzimática (SALIBA et al., 2001; SANCHEZ, 2009).
8
1.5Utilização industrial dos resíduos lignocelulósicos
Os resíduos lignocelulolíticostêm sido utilizados como fonte de proteína e energia para a
indústria da produção de ração animal. Segundo Tamanini & Hauly (2004) resíduos
lignocelulolíticos como bagaço de cana, palha de arroz e resíduos florestais, são fontes
abundantes de carboidratos com potencial aplicação biotecnológica. Estes compostos precisam
ser hidrolisados quimicamente ou por ação microbiana para sua utilização. A hemicelulose pode
ser degrada a xilose, por ação de xilanases, o qual pode ser convertido finalmente em xilitol. O
xilitol tem sabor doce semelhante à sacarose, é anticariogênico, tolerado por diabéticos e
recomendado para pessoas obesas.
Outra possibilidade de utilização dos resíduos lignocelulósicos é sua completa hidrólise
em monossacarídeos e dissacarídeos, os quais são utilizados para fermentação e produção de
etanol. Essa tecnologia é conhecida como etanol de segunda geração. Os resíduos sofrem pré-
tratamento por agentes químicos são hidrolisados por enzimas que liberam os açucares
fermentescíveis (KIM et al., 2013) .
A biomassa lignocelulósica é naturalmente degradada na natureza com o auxilio de
diversos microrganismos, principalmente diversos gêneros de fungos e bactérias, que produzem
enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas, em condições aeróbicas e anaeróbicas. Para a utilização
industrial dos resíduos lignocelulósicos, é necessário que estes sejam hidrolisados pela ação de
enzimas produzidas por microrganismos, gerando subprodutos rentáveis (SOCCOLet al., 2010).
A conversão de lignocelulose em glicose representa a etapa crucial na conversão deste
polímero em outros produtos químicos e no bioetanol. A hidrólise deste polímero por um
complexo de celulases tem atraído o interesse de muitos pesquisadores e no desenvolvimento de
muitos projetos de biotecnologia (NASCIMENTOet al., 2009).
A busca por novos microrganismos que produzam enzimas capazes de hidrolisar a
celulose vem sendo realizada por vários grupos de pesquisa.Dentre osmicroorganismos
estudados destacam-se os fungos e as bactérias. Dentre as bactérias um dos grupos mais
promissores é aquele formado pelas bactérias do gênero Streptomyces.
9
1.6Streptomyces sp.
Actimomicetos são bactérias Gram positivas, filamentosas, distribuídas no ambiente
aquático e terrestre, a maioria é estritamente saprófitos, mas algumas espécies podem ser
parasitas associados a plantas ou animais. Streptomyces é o principal gênero desse grupo, estes
possuem três características principais: micélio vegetativo (em substrato sólido ou liquido),
micélio aéreo e artrósporos. Bactérias desse gênero parecem existir no solo por longos períodos
como esporos e o que determina seu desenvolvimento são os nutrientes exógenos (BERGEY’S,
1984; SCHREMPF& WALTER, 1995).
Os Streptomyces possuem colônias de tamanhos pequenos, inicialmente lisas, hifas
vegetativas, com micélio aéreo e ramificado e raramente fragmentado, seus esporos não tem
motilidade, o aspecto liso das colônias é modificado quando o micélio aéreo promove um
aspecto floculado à colônia, crescem àstemperaturas de 25°C- 37°C, e em pH que pode variar
entre 6,5- 8,0. Os Streptomyces são usualmente conhecidos por serem mais ativos em estágios
mais avançados de decomposição de plantas e de outros materiais orgânicos, devido à produção e
liberação de enzimas que ajudam na degradação do material orgânico, desempenhado um papel
importante no volume relativamente complexo de polímeros recalcitrantes (BERGEY’S, 1984).
Esse gênero é o mais importante do grupo, pois são os principais produtores de um
grande número de compostos biologicamente ativos e utilizam uma diversidade de compostos
orgânicos, sendo que 45% desses compostos são produzidos por Actinomicetos, 38% por fungos
e 17%por bactérias unicelulares (KAVITHAet al., 2007). Dentre esses compostos está à
produção de antibióticos que são encontrados nos metabólitos secundários produzidos
principalmente por Streptomyces spp.Dentre os compostos produzidos por Streptomyces spp.,
estão importantes enzimas envolvidas em processos industriais e em processos de degradação de
material lignocelulosico, celulose, hemicelulose e lignina (VARNAIet al., 2010;
NASCIMENTOet al., 2009), este também tem grande potencial de degradar naturalmente outros
polímeros como quitina, queratina, pectina e atuar como fungicida, podendo também ser
aplicado na degradação de herbicida (VINHA et al., 2011).
Os microrganismos, principalmente os isolados de solos, são dotados de um imenso
potencial de degradação de material orgânico. Normalmente, produzem um conjunto de enzimas
hidrolíticas. A microbiologia do solo do cerrado ainda é pouco explorada e pouco conhecida,
10
estes microrganismos presentes neste solo e sua extrema resistência no meio ambiente permitirão
os rastreamentos dessas celulases, o que poderá ajudar na superação dos desafios na produção e
utilização destas enzimas (MAKI et al., 2011; TURNER et al., 2007).
Dentre as enzimas produzidas por esses microrganismos estão ascelulases. As celulases
produzidas por Streptomyces vêm sendo estudadas devido as suas características de serem
efetivas em diferentes faixas de pH e temperatura. Outra característica importe é que algumas
delas são termofílicas. A utilização de enzimas nos processos industriais tem como gargalo o
custo elevado das enzimas e suas características cinéticas. Uma das formas de se contornar esse
problema é pelo isolamento e caracterização de novos microrganismos produtores de enzimas.
1.7Hidrólise enzimática da celulose
As celulases são enzimas que hidrolisam celulose nas ligações glicosídicas β-1,4, e estão
presentes em 13 das 82 famílias de glicosilhidrolases conhecidas (SIGHANIAet al., 2010). A
hidrólise enzimática da celulose envolve três enzimas funcionando em sinergismo:
endoglicanases (endo 1,4 β-D- glicanase EC 3.2.1.14), celobiohidrolases ou exoglicanases (exo-
1,4 β-D-glicanase EC 3.2.1.91) e β-glicosidase (1,4 β-D-glicosidase EC 3.2.1.21) (Figura 5). A
celulose é clivada por endoglicanases, as quais promovem cortes no polímero de celulose,
expondo as extremidades redutoras e não redutoras. Enquanto as celobiohidrolases agem nas
extremidades redutoras e não redutoras deste polissacarídeo liberando oligossacarídeos, dentre
estes, unidades de celobiose. As beta glicosidases clivam a celobiose, liberando duas unidades de
glicose. Após a ação sinergística deste sistema celulolítico se tem a completa hidróliseda celulose
(VARNAIet al., 2010; SIGHANIAet al., 2010).
Fungos e bactérias, presentes no solo, produzem enzimas celulolíticas que hidrolisam a
celulose com o objetivo de obter energia a partir de unidades de glicose. Um ponto de partida
físico, muitas vezes uma moagem, auxilia as enzimas a alcançarem esse substrato mais
facilmente, pois o processo biológico emprega hidrolases diferentes, dependendo do tipo de
cultura e fracionamento (TURNERet al., 2007). As enzimas celulolíticas são eficientes na
degradação de materiais lignocelulósicos.
A hidrólise é o primeiro passo da bioconversão de celulose em glicose (um açúcar
solúvel), essa etapa envolve um complexo multienzimático, sendo este reconhecido como o
11
passo limitante no desenvolvimento de processos biotecnológicose na produção de
biocombustíveis (CHAUVAUX et al., 2010).
Figura 5-Esquema da ação das endoglicanases, celobiohidrolase e exoglicanases, em ação
conjunta na hidrólise da celulose. Adaptado de Carns & Esen (2010).
1.7.1 Celulases e Beta glicosidases
O termo celulases é amplamente aplicado à família das enzimas que hidrolisam celulose
(UEDAet al., 2010). Sendo que as enzimas relacionadas à degradação da celulose são divididas
em endoglicanases, exoglicanases e beta-glicosidases, e tem capacidade de hidrolisar ligações
glicosídicas β-1,4, diferindo apenas no ponto de partida e do substrato quando hidrolisado. As
endoglicanases clivam nas ligações internas da fibra de celulose, liberando celo-oligossacarideos,
as exoglicanases atuam nas extremidades do polímero(celulose), liberando a celobiose. As beta
Celulose Celobio-hidrolases
(GH 5,6,7,9,48)
Celobiohidrolases
(GH 5,6,7,9,48)
Endoglucanase (GH 5-
9,12,44,45,48,51,61,74
Celo-oligossacarideos Celobiose
Celodextrinase Beta glicosidase
Glicose
12
glicosidases hidrolisam a celobiose em oligossacarídeos solúveis (Figura 6) (MAEDAet al.,
2012; UEDAet al., 2010).
A hidrólise enzimática tem sido uma prática, uma vez que, condições moderadas de
temperatura e pressão, exigem baixo consumo de energia, apresentando elevada especificidade e
elimina a geração de substâncias tóxicas, normalmente encontradas na hidrólise química
(MAEDAet al., 2012).
Figura 6- Representação esquemática da ação catalítica do complexo enzimático (celulase)
sobre celulose com geração de glicose.
1.7.2 Endoglicanases
As endoglicanases atuam de forma aleatória sobre a fibra de celulose, liberando
oligossacarídeos de tamanhos variados. Essa enzima cliva a ligação β1,4 liberando extremidades
redutoras e não redutoras. Esta ação é muito importante para permitir a ação das
celobiohidrolases ou exoglicanases as quais são enzimas que irão hidrolisar os oligossacarídeos
em moléculas menores, como celobiose. Elas atuam sobre regiões amorfas da celulose, abrindo
espaço para ação de outras enzimas, elas não apresentam praticamente nenhuma atividade sobre
a celulose cristalina. São encontradas em diversos microrganismos, como fungos e bactérias.
Essas endoglicanases capacitam o microrganismo a sobreviver nos mais diversos habitats.Sua
atuação permite a obtenção de oligossacarídeos menores, os quais são mais facilmente
importados pelo microrganismo (TAKENAKA et al., 1999).
13
Algumas endoglicanases podem atuar sobre outros substratos como, por exemplo, a
xilana ter atividade sobre diferentes substratos, algumas dessas endoglicanases apresentam
atividade sobre xiloglucanas. Essa característica é importante para auxiliar na desestruturação da
fibra de celulose, permitindo uma maior taxa de hidrólise (LYND et al., 2002). Isso faz com que
as enzimas hidrolisem hemicelulose, auxiliando na remoção da lignina, o que permite a melhor
ação do sistema celulolítico sobre a fibra de celulose liberando extremidades redutoras e não
redutoras para a ação da exoglicanases (celobiohidrolases) (LYND et al., 2005)
1.7.3 Exoglicanases
As exoglicanase atuam sobre os oligossacarídeos gerados pela hidrólise da
endoglicanases e são importantes para a hidrólise da celulose cristalina, pois atuam de forma
lenta e gradual na diminuição do grau polimerização. As exoglicanase normalmente não atuam
sobre outros substratos. Podemos classificar essa atividade enzimática como sendo atividade de
celobiohidrolase que pode ser denominada exoglicanase (E.C 3.2.1.91) (KRUUS et al., 1995).
Os ensaios enzimáticos utilizando papel de filtro e avicel como substrato,foram
desenvolvidos para caracterizar atividade de exoglicanase. Esses substratos apresentam grande
quantidade de celulose cristalina na sua estrutura. Com base nesses ensaios, as celulases acabam
sendo classificadas como FPase e Avicelases quando conseguem hidrolisar esses substratos.
Normalmente apresentam baixa atividade devido ao mecanismo de ação das exoglicanases, que
atuam lenta e gradualmente removendo celobiose das extremidade da fibra de celulose
(COUGHLAN, 1985). A exoglicanase catalisa a hidrólise das ligações β1,4- D-glicosídicas na
celulose e celotetrose, liberando a celobiose das extremidades não redutoras da fibra de celulose,
podem ser também denominada celobiohidrolases (CBH)(KRUUS et al., 1995; CASTRO &
PEREIRA JR., 2010).
1.7.4Beta glicosidase
A beta glicosidase é uma enzima que catalisa a hidrolise da celobiose em duas moléculas
de glicose. Estes monossacarídeosserão fermentados e convertidos em biocombustível, o
etanol.A atuação das celulases geram celobiose, este dissacarídeo normalmente exerce efeito
inibitório na produção das celulases. Assim a ação das beta glicosidasetambém remove esse
efeito inibitório, permitindo que mais celulases sejam produzidas pelo microorganismo
(HARDIMANet al., 2010 ; SCHELLER & ULSKOR, 2010).
14
As beta glicosidases têm sido descritas na literatura como glicosil hidrolases pertencentes
as famílias GH1, GH3, GH5, GH9 e GH30, entretanto algumas beta glicosidases precisam ser
classificadas. Essas famílias são classificadas em diferentes grupos por apresentarem a mesma
estrutura de domínios catalíticos e aminoácidos conservados. As famílias GH1, GH5 e GH30 são
agrupadas na superfamíliaGH-A (CAIRNS&ESEN, 2010).
Em microrganismos são encontradas beta glicosidases da família GH1. Embora muito se
tenha estudado sobre as beta glicosidases dos microrganismos, o maior foco tem sido dado a sua
aplicação, e não a sua função endógena. Estas enzimas sãofrequentementecomponentes de
complexos denominados de celulossomo, que contémendoglicanases e proteínas que se ligam a
carboidratos que são responsáveis pela ligação entre a celulose e a membrana celular(CAIRNS &
ESEN, 2010).
1.8Aplicações biotecnológicas das celulases
Dentre as enzimas utilizadas em biotecnologia, as celulases tem atraído muito interesse
devido a suas diversas aplicações. As celulases tem mostrado um enorme potencial
biotecnológico, pois podem ser usadas com diversas finalidades, como degradação de materiais
lignocelulósicos e na desintoxicação de resíduos agroindustriais (El-SERSYet al., 2010;
NARAIANet al., 2010). Entre as principais aplicações industriais das celulases estão: a indústria
têxtil, fabricação de rações animal, indústria de bebidas, tais como cerveja, vinhos e sucos, na
indústria de papel e na produção de biocombustíveis.
As celulases são muito empregadas na indústria têxtil, devido a sua capacidade de modificar
a fibra de celulose de forma controlada, melhorando a qualidade dos tecidos, sendo empregadas
também no momento da fiação, tingimento e acabamento. Quando utilizadas em detergentes,
melhora o desempenho deste, pois permite a remoção de pequenas fibrilas difusas do tecido,
conferindo assim brilho e maciez ao tecido. As hidrolases quando utilizadas na alimentação de
animais ruminantes, aumentam o valor nutritivo dos alimentos, pois possuem a capacidade de
hidrolisar polissacarídeos presentes na parede celular dos vegetais (BATH,2000; El-SERSYet
al.,2010).
Na indústria da cerveja a ativação das hidrolases ocorre durante a maltagem e a fermentação.
Na indústria de vinhos, os principais benefícios dessas enzimas ocorrem em três etapas da
15
produção, na primeira ocorre ação da enzima no momento da maceração da pele da uva; segunda
há a facilitação da filtração devido à ação dessas enzimas e na terceira e última etapa, é no
momento da clarificação da bebida e no melhoramento da estabilidade do vinho. Na indústria do
papel essas celulases são utilizadas com diferentes finalidades. São utilizadas no momento em
que ainda é popa, pois esta enzima promove a modificação da popa alterando sua resistência,
quando o papel é produzido, são as celulases que auxiliam no biobranqueamento deste, o que faz
com que o papel branco tenha uma cor diferente do papel reciclado (BATH, 2000).
Na indústria de biocombustíveis as celulases estão presentes durante a hidrólise da celulose,
liberando os açúcares e facilitando assim o processo de fermentação e posterior formação do
bioetanol (LIMAYEN & RICK, 2012).
A bioconversão de celulose em etanol envolve dois processos importantes; sacarificação e
fermentação. A sacarificação é a hidrólise de polímeros de hidratos de carbono (celulose e
hemicelulose) em monossacarídeos. Este hidrolisado em seguida é utilizado como substrato para
segunda etapa que é a fermentação realizada por microrganismos. Durante a fermentação, as
enzimas produzidas pelos microrganismos degradam a lignocelulose e fermentam os açúcares
liberados (TURNERet al., 2007).
A conversão da biomassa em açúcares, para sua utilização como fonte de energia era uma
preocupação a cerca de trinta anos atrás. Hoje em dia o número de empresas que utilizam
biotecnologia tem crescido. A utilização de enzimas termoestáveis e microrganismo tem tido
atenção especial para pesquisas na área. Durante as ultimas décadas, tem havido um grande
interesse no emprego de microrganismos termófilos devido as suas proteínas serem capazes de
funcionar em temperaturas elevadas (TURNERet al., 2007).
A necessidade de utilização de celulases ocorreu devido ao interesse em diminuir custos de
produção e aumentar a eficiência nos processos que necessitavam do emprego de enzimas que
suportassem condições extremas inerentes da produção industrial. O desenvolvimento de
processos biotecnológicos para converter resíduos agroindustriais em produtos que não sejam
tóxicos ao meio ambiente vem sendo estudado, devido,principalmente, às recentes preocupações
ambientais (NARAIANet al., 2010).
16
Enzimas termofílicas oferecem alternativas de catalizadores capazes de suportar condições
relativamente extremas apresentadas nos processos industriais, podendo ser empregadas em uma
vasta gama destes processos, devido a esta extraordinária característica de estabilidade
operacional e tolerância à desnaturação. O interesse em biocatalizadores renováveis surgiu
recentemente, visto o possível esgotamento dos recursos fósseis de petróleo, bem como a
preocupação com o meio ambiente (TURNER et al., 2007; El-SERSY et al., 2010).
O emprego dessas enzimas vem sendo largamente pesquisado, buscando também a redução
de custos de produção e o aumento de eficiência, principalmente porque por meio de pesquisas
foi possível isolar enzimas que suportam condições extremas exigidas em processos industriais.
Sendo assim, são necessários mais estudos visando à melhoria dos processos de produção de
celulases.
1.9Aplicações biotecnológicas da Beta glicosidase
A beta glicosidase é de grande interesse para conversão da biomassa lignocelulósica, essa
conversão e realizada por três enzimas, exo-beta glicanase, endo-beta glicanases e a beta
glicosidase. A identificação e a produção da beta glicosidase, especialmente aquelas com elevada
tolerância à glicose, produzidas por fungos e bactérias, tem sido de grande interesse comercial
(CAIRNS& ESEN, 2010).
Fatores limitantes na conversão da celulose em glicose para a fermentação, para a posterior
produção do etanol, incluem a inibição das celulases por oligossacarídeos, devido à falta de
concentrações adequadas de beta glicosidase produzidas por microrganismo (CAIRNS& ESEN,
2010).
As enzimas celulolíticas com propriedades desejáveis podem ser alvo de programas de
melhoramento, com auxílio de engenharia genética pode se melhorar a produção de enzimas
liberadas pelo microrganismo, tendo como objetivo o aumento de suas propriedades catalíticas
(DOUGHERTYet al., 2012).
A beta glicosidase vem sendo utilizada largamente na indústria de alimento, devido a sua
capacidade de realçar o sabor dos alimentos e bebidas, sendo que esta pode promover também
melhora nutricional dos alimentos, com a liberação de vitaminas e antioxidantes e outros
17
compostos benéficos, potencializando o aproveitamento do alimento e todos benefícios que estes
podem trazer a saúde animal (DOUGHERTYet al., 2012).
Existem centenas de compostos flavorizantes em plantas, estes compostos apresentam
estruturas beta glicosídicas. A transformação desses compostos em bebidas e alimentos, tem
qualidade enriquecida pela ação das beta glicosidase. As hidrólises das ligações betas
glicosidicas, aumentamas qualidades sensoriais das bebidas e dos alimentos tratados (CAIRNS &
ESEN, 2010).
Algumas Vitaminas são encontradas em fontes vegetais na forma glicosídica e quando
convertida em angliconas pelas beta glicosidases, melhoram a disponibiladade nutricional, pois
quando convertida essas isoflavonas são rapidamente absorvidas pelo organismo, e ação da beta
glicosidase aumenta o teor de angliconas nos alimentos, aumentando a biodisponibilidade
nutricional dos alimentos (CAIRNS& ESEN, 2010).
Alguns vegetais utilizados como alimento, como raízes, folhas de mandioca, feijão, sementes
de linho e folhas de trevo, produzem ácido cianídrico (HCN) e quando macerados durante o
preparo ou na mastigação liberam este composto tóxico.
Um dos alimentos muito consumido em grande escala na Ásia, África e América do Sul, é a
mandioca. Alguns tipos de mandioca contêm compostos beta glicosídicos cianogênicos.Quando
consumidos crus, a enzima beta glicosidase linamarase atua liberando os compostos
cianogênicos. Estes compostos podem provocar intoxicação, provocando sintomas como;
dificuldade na respiração, convulsões, paralisia e por fim podendo levar a óbito. O cozimento da
mandioca provoca desnaturação da beta glicosidase linamarase evitando a liberação do HCN
(CARBONELL et al., 2000; SCHELLER & ULSKOR, 2010).
Em adição a sua atividade catalítica, também apresentam ação de transglicosilação. Essas
transglicosilações são úteis na produção de novos oligossacarídeos e novos compostos
glicosilados, como por exemplo, glicoproteínas e glicolipídos.
Nos últimos anos as enzimas do complexo celulolítico vêm despertando grande interesse na
indústria, principalmente na utilização de compostos lignocelulosico, visando à produção de
compostos de maior valor agregado. Umas das formas de se abordar esse problema, é o
18
isolamento de novos microorganismos capazes de produzir enzimas que tenham largo espectro
de utilização, que atuem em uma larga faixa de pH e temperatura. Neste trabalho buscou-se
caracterizar as enzimas produzidas por um microorganismos isolado do solo do cerrado, produtor
de enzimas do complexo celulolítico.
19
Objetivos
2.1 Objetivo Geral
No presente trabalho estudou-se produção e caracterização celulases e beta glicosidases
produzidas pelo Streptomyces sp (isolado I7) cultivados em presença de diferentes resíduos
lignocelulolíticos.
2.2 Objetivos específicos
Cultivar o Streptomyces sp por fermentação submersa em diferentes fontes de carbono: farelo
de trigo, farelo de milho, farelo de arroz e extrato de levedura;
Aperfeiçoar a produção de celulases e beta glicosidasepelo microrganismo selecionado;
Caracterizar bioquimicamente as diferentes celulases e a beta glicosidase;
Analisar á cinética de produção enzimática;
Estudar o efeito do pH e da temperatura na atividade das enzimas;
Analisar a termoestabilidade das enzimas;
Estudar os efeitos de diferentes íons metálicos sobre a atividade das enzimas;
Analisar o perfil das celulases e beta glicosidasesecretadas em SDS PAGE.
20
3. MATERIAIS
3.1.LINHAGEM DA BACTÉRIA Streptomyces sp.
A linhagem da bactéria Streptomyces sp. utilizada no presente trabalho foi isolada do
bagaço de cana-de-açúcar seco de usinas do estado de GO cedido pelo Prof. Dr. Américo José
dos Santos Reis, da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás e estocado no
laboratório de biotecnologia de fungos da Universidade Federal de Goiás- UFG.
3.2. SUBSTRATOS LIGNOCELULÓSICOS
Para a produção de enzimas, a bactéria Streptomyces sp. foi cultivada em meio mínimo
(MM) suplementado com os seguintes substratos lignocelulósicos: farelo de arroz (FA), farelo
de milho (FM) e farelo de trigo (FT). Os farelos utilizados foram, submetidos à lavagem com
água destilada, depois foram secos em estufa á 60°C por 24h.
3.3. MEIOS DE CULTURA
As soluções foram preparadas com água bidestilada e quando necessário foram esterilizadas por
autoclavagem (125°C, 1,3 atm e 15 min) ou filtração em membrana com poros de 0,2 µm
(Millipore®). As soluções foram agrupadas de acordo com a metodologia na qual foram
empregadas.
3.3.1. Meio Mínimo (PONTECORVOet al, 1953)
KH2PO4 9,000 g/L
K2HPO4 1,500 g/L
MgSO4.7H2O 0,200 g/L
CaCl2 0,050 g/L
MnSO4.7H2O 0,010 g/L
ZnSO4.7H2O 0,001 g/L
Ajustar o pH para 7.0
3.3.2Meio Mínimo (NASCIMENTO et al., 2003)
FeCl3 (0,03%) 1,000 mL
21
CaCl2.2H2O 0,050 g/L
MgSO4.7H2O 0,100 g/L
NaCl 0,010 g/L
KCl 0,010 g/L
NH4Cl 0,300 g/L
H3PO4 (85%) 1,800 g/L
Extrato de levedura 0,070 g/L
1,000 mL de solução traço:
MnSO4 2,200 g/L
ZnSO4 0,500 g/L
H3BO3 0,500 g/L
CuSO4 0,016 g/L
Na2MoO4 0,025 g/L
CoCl2.6H2O 0,046 g/L
Ajustar o pH para 7,0
3.3.3Meio Pridham (PRIDHAMet al., 1948)
Extrato Levedura 4,0 g/L
Extrato de Malte 10,0 g/L
Ágar bacteriológico 20,0 g/L
Água destilada (q.s.q) 1 L
3.4. SUBSTRATOS PARA DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS
Na dosagem da atividade celulolítica foram utilizados os seguintes substratos: celulose-
micro-cristalina (CMC de baixa viscosidade - Sigma®), celulose semi-cristalina (Avicel –
Sigmacell - Sigma®) e papel de filtro Whatman nº 1. Na dosagem de atividade de Beta
glicosidase foi utilizado pNP-β-D-glicopiranosídeo (Sigma®) .
22
3. SOLUÇÕES
As soluções foram preparadas com água bidestilada e quando necessário foram
esterilizadas por autoclavação (120°C, 1,3 atm, 15 min). As soluções foram agrupadas de acordo
com metodologia na qual foram empregadas.
3.4.1. Solução para determinação da atividade enzimática
3.4.1.1.Solução de Ácido Dinitrosalicílico –DNS
Ácido 3,5-Dinitrosalicílico 0,75% (p/v)
NaOH 1,40% (p/v)
Tartarato de Sódio e Potássio 21,60% (p/v)
Fenol 0,54% (p/v)
Metabissulfito de Sódio 0,58% (p/v)
Inicialmente, o DNS e o NaOH foram dissolvidos em água bidestilada. Posteriormente
adicionou-se o tertarato de sódio e potássio, o fenol aquecido a 50°C e o metabissulfito de sódio.
A solução final foi titulada com HCl 0,1M utilizando fenolftaleína como indicador.
3.4.1.2.Tampão Citrato de Sódio 0,05M
Ácido cítrico 50mM
Citrato de sódio 50mM
3.4.1.3.Tampão Fosfato de Sódio 0,05M
Fosfato de sódio monobásico 50mM
Fosfato de sódio dibásico 50mM
3.4.1.4.Tampão Tris-HCl
Tris-HCl 50mM
HCl 50mM
23
3.4.1.5.Tampão Glicina
Glicina 50mM
NaOH 50mM
Uma solução é adicionada na outra até atingir o pH desejável.
3.4.1.6.Solução de Carboximetilcelulose (CMC)
CMC 2,0g/ 100mL
A solução foi preparada em tampão citrato de sódio 50mM pH 4,8, sendo aquecida no
microondas até solubilização completa do soluto.
3.4.1.7.Solução de Avicel
Avicel 1,0g/ 100mL
A solução foi preparada, no momento do uso, com água destilada sob agitação.
3.4.1.8.Solução pNP-β-D-Glicopiranosideo
Solução pNP-β-D-Glicopiranosideo 15 mM
Tampão citrato de sódio 50 mM pH 4.8
Carbonato de sódio 0,5 mM
3.6 Cromatografia de Camada Delgada
3.6.1 Fase fixa
Placa de sílica-gel (DC-Fertigfolien ALUGRAM® Xtra SIL G/UV254)
3.6.2 Fase móvel
Butanol 4 (p/v)
Metanol 2 (p/v)
Água 1 (p/v)
24
3.6.3 Solução Reveladora
Ácido fosfórico (85%) 7,5 mL
Anilina 1,0 mL
Difenilamina 1,0 g
Acetona 50,0 mL
25
4. Métodos
4.1. Obtenção de isolados de Streptomyces sp a partir de BCA.
Para a obtenção dos isolados, 50 g de BCA foram homogeneizados com 450 mL de
solução salina 0,9% sob agitação mecânica em vórtex. A mistura foi submetida à centrifugação
(3.000 g, 10 min) e o sobrenadante foi diluído sereadamente até 1x10-9
, em solução salina,
plaqueado em meio mínimo suplementado com CMC 0,5% (SANCHEZ, 2009) e incubado a
45°C por 4 dias.
4.2. Seleção em placa dos isolados produtores de celulases.
Os isolados obtidos foram selecionados de acordo com a atividade enzimática
determinada pelo teste de atividade em placa de acordo com o protocolo descrito a seguir: os
isolados foram inoculados em placas contendo meio mínimo, suplementado com 0,5% de CMC
(Sigma) e incubados a 45°C por 4 dias.
Para a revelação dos halos de atividade, foi adicionada a solução de vermelho Congo a
0,1% e as placas foram agitadas suavemente durante 10 min. Então, a solução de vermelho
Congo foi descartada, as placas lavadas com solução de NaCl 1 M até o aparecimento dos halos,
posteriormente adicionou solução de HCl 0,1 M sobre a solução de NaCl para melhor
visualização dos halos. A atividade enzimática foi visualizada como um halo claro ao redor da
cultura (CHELAPANDI & HIMANSHU, 2008). Para avaliar os melhores produtores de
celulases foi mensurado o índice de produção de celulases (IPC), o diâmetro do halo de hidrólise
foi dividido pelo diâmetro da colônia.
4.3. Escolha da melhor fonte de carbono para a produção de CMCases, FPases, Avicelases
e Beta glicosidase pelo isolado I7.
Esporos dos isolados selecionados pelo protocolo de atividade em placa foram inoculados
em meio mínimo (MM) suplementado com FA, FM e FT á 0,5% e extrato de levedura á 0,1%,
foram incubados a 37°C por 144 h sob constante agitação de 110 rpm. A cultura foi submetida à
centrifugação (3.000 g por 15 min) e o sobrenadante do meio de cultura foi analisado quanto à
atividade de CMCase, FPase, Avicelase e Beta glicosidase.
26
4.3.1 – Otimização da produção de celulases
Após seleção da melhor fonte de carbono, foi realizado o ensaio de determinação da influência
das fontes de carbono e nitrogênio sobre a produção das celulases. Os esporos do microrganismo
selecionado foram inoculados em MM suplementado com FT variando de 0,25% a 0,75% e EL
0,1 a 0,3% conforme descrito na tabela abaixo.
Tabela I – Variação das concentrações de extrato de levedura e farelo de trigo
respectivamente.
Amostras Extrato de levedura Farelo de trigo
1 0,1% 0,25%
2 0,1% 0,5%
3 0,1% 0,75%
4 0,2% 0,25%
5 0,2% 0,5%
6 0,2% 0,75%
7 0,3% 0,25%
8 0,3% 0,5%
9 0,3% 0,75%
4.3.2 – Cinética de produção das celulases
Esporos do isolado que produziu maior atividade das celulases e da beta glicosidase
foram inoculados em Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL de MM suplementado com 0,75%
de FT e 0.1% de extrato de levedura e incubado a 37°C, por até 12 dias sob agitação constante de
110 rpm. Amostras foram coletadas a cada 24 h e analisadas quanto a atividade de Avicelase,
CMCase, FPase e Beta glicosidase.
27
4.4. Determinação da Atividade Celulolítica pelo Método dos AçúcaresRedutores
(MILLER, 1959).
As atividades enzimáticas de celulase total (FPase), endoglicanase (CMCase), Avicelase
foram avaliadas segundo metodologia proposta por Miller (1959), Ghose (1987) e Adney e Baker
(1996). A quantificação do teor de açúcares redutores liberados foi ensaiada pelo método do
ADNS e os substratos utilizados foram: Papel de filtro, CMC e Avicel respectivamente. Uma
unidade de atividade enzimática (U) foi definida como aquela que libera um µmol do açúcar
redutor correspondente por minuto nas condições do experimento. Os ensaios de atividade
enzimática dos experimentos foram realizados em triplicata.
4.4.1. Determinação da Atividade Celulolítica
4.4.1.1. FPase
Expressa a atividade de celulase total, utilizando papel de filtro Whatman nº 1 (1 cm x 6
cm – 50 mg) como substrato. A atividade de FPase foi determinada homogeneizando-se 500 µL
de amostra, 500 µL de tampão citrato pH 4.8 e uma tira de papel de filtro (1x6 cm). A solução
foi mantida a 50ºC por 1 h, em seguida, a reação foi interrompida em banho de água fria. A
quantificação do teor de açúcares redutores liberados foi ensaiada pelo método do DNS, foi
adicionado 500 µL de DNS, as amostras foram fervidas por 5 min e realizada a leitura
espectrofotométrica a 540 nm.
4.4.1.2. CMCase
Expressa a atividade de endoglicanase, utilizando CMC 1% como substrato. A atividade
de CMCase foi determinada homogeneizando-se 250 µL de amostra e 250 µL da solução de
CMC 2% . A solução foi mantida a 50 ºC por 1 h e em seguida, a reação foi interrompida em
banho de água fria. A quantificação do teor de açúcares redutores liberados foi ensaiada pelo
método do DNS, foi adicionado 500 µL de DNS, as amostras foram fervidas por 5 min e
realizada a leitura espectrofotométrica a 540 nm.
4.4.1.3. Avicelase
Expressa a atividade de exoglicanase, utilizando Avicel 1 % como substrato. A atividade
de Avicelase foi determinada homogeneizando-se 250 µL de amostra e 500 µL da solução de
Avicel 1%. A solução foi mantida a 50 ºC por 1 h sob agitação constante e, em seguida, a reação
foi interrompida em banho de água fria. Em seguida, a solução foi submetida a centrifugação a
11.200 g durante 10 min a 4°C. Para a quantificação do teor de açúcares redutores liberados, 250
28
µL do sobrenadante foram homogeneizados com 700 µL de ADNS, as amostras foram fervidas
por 5 min e realizada a leitura espectrofotométrica a 540 nm.
4.4.2 Determinação da Atividade de Beta glicosidase
A atividade de Beta glicosidase foi realizada pelo método de Costons & Loomis (1969),
adicionando- se 100 μL do reagente pPNPG (pNP- β-D – glicopiranosideo- Sigma) 15 mM,
preparado em tampão citrato de sódio 50mM pH 4,8 e 100 μL do sobrenadante de cultura. A
reação foi incubada por 1hora a 50°C, e em seguida, foi adicionado 1 mL de carbonato de sódio
0,5 M para cessar a reação. A leitura foi realizada a 410 nm .
4.4.2.4. Curva padrão da concentração de glicose
A curva padrão para os testes de FPase , CMCase e Avicelase foi estabelecida utilizando-
se glicose nas concentrações de 1-20 µmoles/mL. A curva padrão para o teste de foram
estabelecida utilizando glicose nas concentrações de 0,15 a 1,5 mg/mL. As leituras foram
utilizadas para fazer um gráfico (Absorbância X Concentração de glicose). Obtendo-se assim a
equação da reta que foi utilizada nos cálculos de atividade enzimática. Já a curva padrão da Beta
glicosidase foi realizada, utilizando- se p- nitrofenol- cristalino (Sigma) de 1 a 150 mM.
4.5. Caracterização bioquímica de um conjunto de enzimas extracelulares.
O sobrenadante do meio de cultura foi utilizado como fonte de enzimas. A influência da
temperatura sobre as atividades de Avicelase, CMCase, FPase e Beta glicosidase foi determinada
realizando-se os ensaios enzimáticos na faixa de temperatura entre 40 a 80 ºC em pH 4,8.
A influência do pH sobre a atividade de Avicelase, CMCase, FPase e Beta glicosidase foi
determinada realizando-se os ensaios enzimáticos na faixa de pH de 3,0-7,0, com os seguintes
tampões (0,05 molL-1
) incubados a 37ºC: Citrato de sódio 3,0-6,5; Fosfato de sódio 7,0 e 8,0;
Tris-HCl 9,0 e Glicina-NaOH 10,0 .
Para o estudo da termoestabilidade das enzimas celulolíticas, o sobrenadante do meio de
cultura foi pré-incubado a 50°C e 60ºC e para atividade de beta glicosidase o sobrenadante de
cultura foi pré-incubado a 60°C e 65°C. As atividades foram analisadas na mesma variação de
tempo, por 0,30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 min. Todos os experimentos foram realizados em
triplicata e os resultados expressos em valores médios.
29
A influência de íons metálicos nas atividades de Avicelase, CMCase, FPase e beta
glicosidase foi avaliada. Os ensaios foram realizados nas melhores condições de cada atividade,
sendo adicionandos aos ensaios cloretos dos íons (alumínio, bário, cálcio, potássio, magnésio,
sódio, manganês e amônia) para uma concentração final de 10 mM. A influência do EDTA
também foi analisada nas mesmas condições.
4.6. Cromatografia de Camada Delgada
Cromatografia de camada delgada foi realizada em placa de sílica-gel (DC-Fertigfolien
ALUGRAM®
Xtra SIL G/UV254); 2,5 μL de glicose (1%), celobiose (1%) e xilose (1%) foram
utilizados como marcadores. Para detectar a atividade de beta glicosidase, o sobrenandante do
quinto dia de cultivo foi utilizado para hidrolisar celobiose 1%. 250 µL deo sobrenadante de
cultura foi incubado com 250 µL da solução de celobiose 1% a 50oC por aproximadamente 15
horas. Em seguida, a reação foi interrompida em banho de água fria. 10 μL dessa reação foram
adicionados para análise dos produtos formados. Para leitura, a placa foi vaporizada com a
solução reveladora e submetida à secagem em estufa a 100°C até a total visibilidade de bandas.
30
6 Resultados e Discussão
6.1 Escolhas da fonte lignocelulolítica que induz a maior atividade de celulases
Para avaliar a fonte de carbono que induz a maior atividade de enzimas celulolíticas, o
Streptomyces sp I7 foi inoculado em meio mínimo suplementado com extrato de levedura. Como
fonte de carbono foram testados três diferentes resíduos lignocelulolíticos: FA, FM e FT. O
sobrenadante de cultura do sexto dia de incubação foi utilizado como fonte de enzimas. Este
sobrenadante foi utilizado para testar todas as atividades estudadas neste trabalho.
Para estimar a produção de endocelulases foi medida a atividade de CMCase. Os
resultados obtidos estão demonstrados na Figura 3. A maior atividade de CMCase foi detectada
quando o microrganismo foi cultivado em presença de FT (1,70 U/mL). A segunda maior
atividade foi obtida na presença de FA (0,25 U/mL). A atividade detectada em presença de FT foi
6,8 vezes maior do que a obtida em presença de FA. Esse dado mostra a importância de se
avaliar as fontes de carbono para obter uma maior atividade das enzimas estudadas.
A análise da composição dos diferentes farelos testados como fonte de carbono, ajuda a
explicar as diferenças obtidas na produção das enzimas estudadas (Tabela II).
Tabela II– Composição centesimal do farelo de trigo, farelo de arroz e farelo de milho.
Farelo de Trigo Farelo de Arroz Farelo de Milho
Proteína 17,41 (Belobrajicet
al., 2011)
0,732 (Silva et al.,
2007)
0,08 (Horácio, 2001)
Lipidios 0,7 (Belobrajicet al.,
2011)
0,69 (Silva et al.,
2007)
0,36 (Horácio, 2001)
Carboidratos 44,72 (Silva et al.,
2007)
0,79 (Horácio, 2001) -
Fibras
- 1,57 (Horacio, 2001) 0,17 (Horacio, 2001)
Celulose 16,48 (Silva et al.,
2007)
0,04 (Silva et al.,
2011)
-
Valores expressos em porcentagem
A literatura científica relata que a indução de celulases é muito influenciada pelo
substrato lignocelulolítico onde o microrganismo é cultivado. Diferentes resíduos vêm sendo
estudados visando aumentar a produção de enzimas, dentre elas as celulases. Experimentos
31
descritos por Lima et al. (2005), Nascimento et al. (2009), utilizaram várias fontes de carbono
na produção de celulases por Streptomyces. Os dados obtidos por esses autores mostram que FT
foi a fonte de carbono que permitiu a maior produção de celulases. Os resultados obtidos neste
trabalho estão de acordo com os resultados obtidos por esse autores.
Os três resíduos analisados nesse trabalho podem ser classificados como lignocelulósicos.
Entretanto estes resíduos apresentam composições diferentes. A composição centesimal desses
resíduos foi descritas por Belobrajicet al. (2011), Silva et al. (2007) e Horárcio (2001). Na tabela
I esta relatada a composição centesimal desses resíduos. Em relação as proteínas o FT apresenta
uma concetranção 23 vezes maior do que o FA. Com relação a composição de celulose o FT
apresenta uma quantidade de celulose 4.200 vezes maior do que o FA, esses dados sugerem que a
maior de atividade celulolítica em presença de FT pode ser explicada por sua composição mais
rica em celulose e proteínas.
A atividade de Avicelase apresentou o mesmo comportamento da atividade de CMCase.
A maior atividade de Avicelase foi obtida em presença de FT (26 U/mL), está atividade foi 6,5
vezes maior do que a obtida na presença de FA (0,4 U/mL).
Com relação a atividade de FPase novamente a maior atividade foi detectada em presença
de FT (3U/mL). Essa atividade foi maior do que a obtida em presença de FM (22 U/mL). A
atividade de beta glicosidase tambem foi maior em presença de FT (0,45 U/mL).
Com relação a atividade de CMCase, o FT influenciou a indução de atividade de
CMCase, Avicelase e FPase com intensidade diferentes (Figuras 7 a 10). Ao avaliar a atividade
de CMCase, na presença de FT, observou-se uma atividade de 18 U/mL, enquanto que o FA e o
FM resultaram em atividades de CMCase inferiores á 5 U/mL (Figura7). A atividade de
Avicelase em presença de FT foi de 0,25 U/mL, enquanto as atividades em presença de FA e FM
foram inferiores 0, 5 U/mL (Figura8).
Os ensaios de determinação de FPase, também indicaram o FT como melhor indutor
desta atividade, tendo sido observado atividade de 3U/mL e o FM de 2 U/mL. Ainda com relação
à atividade de FPAse, o FM mostrou-se um bom indutor. Para essa atividade o FM resultou
32
numa indução próxima da alcançada pelo FT (Figura 5). O FA está associado a indução das
menores atividade das enzimas testadas (Figura 7 a 10).
Ensaios de determinação de beta glicosidase indicaram o FT como melhor indutor da
atividade desta enzima, sendo que foi observado atividade de de 0,5 U/mL. Já o FA induziu a
atividade desta enzima em 0,45 U/mL e o FM em 0,4 U/mL, ambos resultaram em valores de
atividade relativamente próximas (Figura 10). O FT novamente foi a fonte que resultou em maior
atividade. Mas para essa enzima os valores de atividades são semelhantes o que difere dos
comportamentos das outras celulases estudadas no presente trabalho.
Para a atividade de beta-glicosidase o FT também foi o melhor indutor. Entretanto essa
enzima apresentou um comportamento diferente das demais. A atividade dessa enzima foi
pequena em todas as fontes testadas, sendo que a atividade obtida em presença de FT foi próxima
das atividades observadas com os outros farelos.
Segundo Palmarola-Adradus et al. (2005) o FT contém 34% de amido, 18% de xilanas,
10,5% de glucanas, 10,1% de arabinanas, 1,1% de galactanas e 5% lignina. Além desses
polissacarídeos ele apresenta ainda 13,5% de proteínas. Devido a grande quantidade e variedade
de polissacarídeos o FT é uma boa fonte de carbono para a produção de enzimas por
microrganismos. Essa diversificada composição de polissacarídeos, provavelmente deverá
induzir diferentes enzimas hidrolíticas, tais como amilases, celulases, xilanases e glucanases
sendo essa últimas de interesse deste trabalho. Além da diversidade de polissacarídeos o FT tem
uma grande quantidade de proteínas. Para induzir a síntese de novas enzimas é importante que o
microrganismo tenha disponibilidade de aminoácidos. Tais características tornam o FT uma boa
fonte de nutrientes para a produção por microrganismos.
Por meio deste estudo, utilizando diferentes fontes de carbono, constatou-se que o FT foi
a melhor fonte de carbono para produção das celulases estudadas. Uma possível explicação seria
a composição desse farelo, o qual é mais rico em nutrientes quando comparado com os outros
farelos testados. Ele apresenta uma grande quantidade de polissacarídeos e de proteínas em sua
composição. Esses dois componentes provavelmente são importantes na indução de celulases.
33
Jang & Chen (2003) estudaram a produção de ceulases por Streptomyces sp T3-1. O
microrganismo foi cultivado em meios contendo diferentes concentrações de CMC e de (NH4)2
SO4. Eles estudaram a produção de CMCase, Avicelase e de beta glicosidase. O meio contendo
CMC (15 g/L) e (NH4)2 SO4 (2,0 g/L) resultou na maior produção de CMCase e de Beta
glicosidase. A maior atividade de Avicelase foi obtida com CMC (15 g/L) e (NH4)2 SO4 (2,0
g/L).
Figura 7- Análise de atividade de Avicelase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,
suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e
extrato de levedura como fonte de nitrogênio.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
F.Milho F.Trigo F.Arroz
Ati
vid
ade
Avi
cela
se (
U/m
L)
34
Figura 8- Análise de atividade de Avicelase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,
suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e
extrato de levedura como fonte de nitrogênio.
Figura 9- Análise da produção de Beta glicosidase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,
suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e
extrato de levedura como fonte de nitrogênio.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
F.Milho F.Trigo F.Arroz
Ati
vid
ade
CM
Cas
e (
U/m
L)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
F.Milho F.Trigo F.Arroz
Ati
vid
ade
Be
ta g
lico
sid
ase
(U
/mL)
35
Figura 10- Análise da produção de Beta glicosidase pelo isolado I7 cultivado em meio mínimo,
suplementado com farelo de milho, farelo de arroz e farelo de trigo, como fontes de carbono e
extrato de levedura como fonte de nitrogênio.
6.2 Cromatografia de camada delgada do produto da hidrólise da Celobiose (TLC)
Figura 11- Análise qualitativa de beta glicosidase por TLC.
Foi realizada uma TLC com os sobreadantes de cultura do primeiro dia de indução e com
o nono dia. Foi utilizado como substrato a CMC e Celobiose, foi feita cinética no intervalo de
tempo de 20minutos para observar se teria a formação de produtos especifícos. Foi observado
então atividade de beta glicosidase quando utilizado celobiose como substrato. O ensaio que
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
F.Milho F.Trigo F.Arroz
Ati
vid
ae F
pas
e (
U/m
L)
36
apresentou melhor resultado foi com 1hora de incubação, utilizando celobiose como substrato.
Sendo assim, baseado no marcadores escolhidos para o teste (celobiose, glicose e xilose) todos a
1% , foi observado bandas de celobiose e bandas de glicose, este resultado comprova a presença
de beta glicosidase no sobrenadante de cultura utilizado(figura 11).
Estudos de Cromatografia de camada delgada realizados por Reese & Mandels (1959)
apud Giese et al.(2003), analisaram a produção de Beta 1,3 glucanases e sugeriram o mecanismo
de ação destas observando os produtos da hidrólise enzimática da laminarina. Apesar dos
avanços na área, a TLC ainda é utilizada para determinar qualitativamente a ação de beta
glicosidase.
6.3 Otimização experimental
Uma vez determinada a melhor fonte de carbono, o próximo passo foi realizar um
experimento do tipo superfície de resposta para determinar condições para maximizar a produção
de celulases e beta glicosidase. O método de superficie de resposta permite analisar a influência
de diferentes parametros na produção de enzimas por microrganismo, tais como temperatura, pH
e concentrações dos nutrientes utilizados (BATISTAet al., 2013). No presente trabalho foram
testadas diferentes concentrações de FT e de EL, utilizando a metodologia de ponto central,
conforme descrito na tabela I.
Na tabela II estão descritos as atividades enzimáticas em resposta aos diferentes
tratamentos. Para todas as atividades enzimáticas testadas a melhor condição foi a do tratamento
número 3 (FT 0,75% e EL 0,1%).
A Figura 12é uma representação gráfica da produção de CMCase em função das
concentrações de EL e FT descritas na tabela II. Esta figura mostra o gráfico da superfície de
resposta. Na figura 13 encontra-se o perfil de desejabilidade, uma predição das concentrações
que poderão resultar na maior produção de CMCase. Os dados obtidos sugerem que as
concentrações de FT a 0,75% e EL a 0,1%. A figura 13 mostra que o FT influencia
positivamente enquanto que EL influencia negativamente.
As figuras 13 a 19 são a representação gráfica da produção de FPase, Avicelase e beta
glicosidase em resposta à variação da concentração de FT e EL nessas enzimas, respectivamente.
Para todas as atividades testadas o FT influência positivamente e o EL tem efeito contrário.Para
37
todas as enzimas testadas as concentrações de FT e EL foram preditas como sendo FT a 0,75% e
EL a 0,1%.
Tabela III – Atividade enzimática em função dos diferentes tratamentos (expresso U/mL)
Variação Avicelase CMCase FPase Beta glicosidase
1 (FT 0,25%, EL 0,1%) 1,534 U/mL 14,917 U/mL 0,900 U/mL 0
2 (FT 0,50%, EL 0,1%) 3,466 U/mL 24,218 U/mL 5,756 U/mL 0,034 U/mL
3 (FT 0,75%, EL 0,1%) 3,571 U/mL 26,788 U/mL 6,631 U/mL 0,0527 U/mL
4 (FT 0,25%, EL 0,2%) 3,501 U/mL 14,690 U/mL 5,110 U/mL 0,0410 U/mL
5 (FT 0,50%, EL 0,2%) 1,508 U/mL 21,194 U/mL 0 0,0215 U/mL
6 (FT 0,75%, EL 0,2%) 0 21,106 U/mL 0 0
7 (FT 0,25%, EL 0,3%) 0 10,319 U/mL 2,033 U/mL 0
8 (FT 0,50%, EL 0,3%) 0 10,354 U/mL 1,561 U/mL 0
9 (FT 0,75%, EL 0,3%) 0 9,183 U/mL 1,840 U/mL 0
38
Fitted Surface; Variable: CMCase
2**(2-0) design; MS Residual=362528E2
DV: CMCase
26000
22000
18000
14000
10000
z=10132;666666667+29039;*x+3102;5*y-104370;*x*y+0;
Figura 12- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de
levedura, visando o aumento da produção de CMCase pelo Streptomyces sp (isolado I7).
Profiles for Predicted Values and Desirability
Farelo
-3E4
24394,
60000,
Extrato de Levedura Desirability
0,
,5
1,
9183,0
16701,
24218,
CM
Case
,25 ,75
1,0000
,1 ,3
Desir
ability
Figura 13 - Predição Matemática do ótimo de atividade para produção de CMCase.
39
Fitted Surface; Variable: Avicelase
2**(2-0) design; MS Residual=749656,3
DV: Avicelase
3000
2000
1000
0 z=598;70916666667+6111;*x-2572;925*y-20370;*x*y+0;
Figura 14- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de
levedura, visando o aumento da produção de Avicelase pelo Streptomyces sp (isolado I7).
Profiles for Predicted Values and Desirability
Farelo
-6000,
3396,9
10000,
Extrato de Levedura Desirability
0,
,5
1,
,915001786,03571,0
Avic
ela
se
,25 ,75
,95124
,1 ,3
Desir
ability
Figura 15- Predição matemática do ótimo de atividade de Avicelase.
40
Fitted Surface; Variable: FPase
2**(2-0) design; MS Residual=1831713,
DV: FPase
6000
4000
2000
0
z=-5524;7921666667+19890;487*x+16581;3825*y-66303;17*x*y+0;
Figura 16- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de
levedura, visando o aumento da produção de FPase pelo Streptomyces sp (isolado I7).
Profiles for Predicted Values and Desirability
Farelo
-8000,
6078,5
14000,
Extrato de Levedura Desirability
0,
,5
1,
,915003
316,06631,0
FP
ase
,25 ,75
,91666
,1 ,3
Desir
ability
Figura 17- Predição matemática do ótimo de atividadede de FPase produzida pelo isolado I7.
41
Fitted Surface; Variable: Betaglicosidase
2**(2-0) design; MS Residual=,0001195
DV: Betaglicosidase
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
z=-;040333333333333+;1581*x+;13175*y-;527*x*y+0;
Figura 18- Superfície de resposta com as concentrações ideais de farelo de trigo e extrato de
levedura, visando o aumento da produção de Beta glicosidase pelo Streptomyces sp (isolado I7).
Profiles for Predicted Values and Desirability
Farelo
-,0800
,05189
,12000
Extrato de Levedura Desirability
0,
,5
1,
0,0
000,0
2635,0
5270
Beta
glicosid
ase
,25 ,75
,98466
,1 ,3
Desir
ability
Figura 19- Valores das concentrações ideais de farelo de trigo e de extrato de levedura para
otimização do processo de produção de beta glicosidase pelo Streptomyces I7.
42
Os resultados da superfície de resposta mostram que para todas as enzimas estudadas os
FT influência positivamente a expressão das enzimas estudadas enquanto que o EL tem
comportamento contrário. A análise multivariada dos dados obtidos evidenciou que a variável EL
afetou negativamente todas as atividades enzimáticas testadas. Na tabela III estão mostrados os
resultados obtidos pela análise do gráfico de Pareto.
Tabela IV– Atividade enzimática em função dos diferentes tratamentos (expresso U/mL)
Variável CMCase Avicelase FPase Beta glicosidase
FT +0,68 +1,18 +2,45 +2,41
EL -1,63 -2,95 -2,45 -2,41
FT/EL -0,87 -1,18 -2,45 -2,41
O trabalho de Palmarola-Adrados et al. (2005) relata que existe uma grande concentração
de carboidratos e proteínas no FT. Devido a essa composição o FT pode servir tanto como fonte
de carbono como fonte de nitrogênio. Podemos observar no trabalho de Shitkha et al. (2007) que
o FT foi utilizado como fonte de nitrogênio, para a produção de proteases por Bacillussp. A
composição do FT pode explicar os resultados obtidos na analíse da significância das variáveis
independentes estudadas, avaliadas pelo gráfico de Pareto, que visa verificar as alterações na
produção enzimática (LADEIRAet al., 2010). Esta análise tenta explicar a variação da produção
enzimática em resposta às concentrações de FT e EL separadamente e na interação entre elas.
6.4 Cinética de produção de enzimas
A produção das celulases foi acompanhada por até 12 dias. O Streptomyces sp I7 foi
cultivado nas condições preconizadas pela superfície de resposta (FT a 0,75% e EL a 0,1%).
Alíquotas do sobrenandante de cultura, foram retiradas a cada 24 horas e as atividades das
celulases foram determinadas. A figura 20 mostra a cinética de produção de CMCase. Pode-se
observar a presença de dois picos de atividade, o primeiro entre o segundo e quarto dia, e o
segundo pico entre o sétimo e o nono dia de incubação. A maior atividade foi encontrada no
oitavo dia de incubação (26,1 U/mL).
A produção de CMCase por S.viridobrunneus SCPE-09 incubado em presença de FT foi
estudada por Vinha et al. (2011). A maior atividade de CMCase foi observada no segundo dia de
43
incubação (0,45U/mL). A atividade de CMCase descrita nesse trabalho é maior do que a
apresentada no trabalho de Vinha et al. (2011).
A maior atividade para FPase foi observada no nono dia de incubação com 20 U/mL
(Figura 21). Avicelase apresentou dois picos de atividade, no terceiro e no sétimo dia de
incubação, a maior atividade foi observada no segundo pico com 4,12 U/mL (Figura22). Após o
oitavo dia de incubação essa atividade não foi mais detectada. A beta glicosidase apresentou dois
picos de atividade. A maior atividade foi observada no nono dia de incubação com 0,2 U/mL
(Figura 23). Estudos envolvendo cinética de produção de celulases são muito raros.
Ao análisar a cinética de Avicelase e beta glicosidase é possível perceber que os dois
picos de atividade de Avicelase correspondem a dois picos de atividade de beta glicosidase com
dois dias de diferença. Uma vez que a Avicelase atua como exoglicanase, liberando celobiose,
pode-se inferir que o produto da hidrólise da Avicelase está induzindo a síntese da beta
glicosidase (figuras 22 e 23).
Em muitas bactéria Archeas e eucariotos existem uma super família de transportadores
ABC. Este conjunto de proteínas é responsável pela captação de uma grande variedade de
nutrientes para a celula. Além disso, os transportadores ABC estão envolvidos no exportação de
drogas, fatores de virulência, proteases extracelulares, transdução de sinal e interação planta
patogêno (SCHLOSSER et al., 1999).
O sistema ABC de transporte é formado por pelo menos cinco proteínas, sendo duas
inseridas na membrana, dois componentes citoplasmáticos (no qual está inserido o sítio de
ligação ao ATP) e uma proteína de ligação presente no lado externo da membrana, a qual é
responsável pelo reconhecimento do nutriente a ser transportado. O gênero Streptomyces
apresenta um sistema de transporteadores ABC específico para celobiose/celotriose. Nos
Streptomyces também é encontrado um operon relacionado ao metabolismo de celobiose:
transporte, reconhecimento e hidrólise, denominado operon ceb. Este operon é regulado pelo
gene cebR. A proteína CebE, é uma lipoproteína que se liga à celobiose. A celobiose é
transportada para dentro da célula e se liga à proteína CebR, liberando a expressão do operon
ceb. Em presença de celobiose a proteína CebE é induzida para capturar mais celobiose, ao
mesmo tempo a proteína beta glicosidase é induzida (SCHLOSSER et al., 1996 e 1999).
44
A ação sinergítica deste sistema é bastante interessante. As endocelulases (CMCase)
atuam clivando a parte amorfa e expondo as extremidades. As exoglicanases (FPases e
Avicelases) atuam na parte cristalina liberando celobiose. A celobiose é captada pelos
transportadores ABC e induz o operon ceb, o qual expressa CebE (proteína que captura a
celobiose), aumentando a captação da celobiose e promovendo a hidrólise através da ação da
beta glicosidase. Estas ações diminuem a celobiose extracelular, a qual normalmente, atua
inibindo as CMCases, permitindo assim que o sistema celulolitico continue atuando sobre a
celulose.
Figura 20- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de CMCase, com isolado
I7 mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com
farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ati
vid
ade
En
zim
átic
a (U
/mL)
Dias
Cinética CMCase
45
Figura 21- Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de FPase, com isolado I7
mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo
de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
Figura 22- Cinética de produção de celulases com ensaio de atividade de Avicelase, com isolado
I7 mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com
Farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
-5
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ati
vid
ade
En
zim
atic
a (U
/mL)
Dias
Cinética FPase
-1
0
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ati
vid
ade
En
zim
atic
a (U
/mL)
Dias
Cinética Avicelase
46
Figura 23-Cinética de produção de celulase com ensaio de atividade de CMCase, com isolado I7
mantido por 12 dias a 37°C sob agitação de 110 rpm, em meio mínimo suplementado com farelo
de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
6.5 Influência do pH na atividade das enzimas avaliadas
A atividade das enzimas do sobrenadante de cultura foram analisadas na faixa de pH entre
3 e 10. A atividade máxima para CMCase foi em pH 4,5 com 14 U/mL, foi observado também
um segundo pico em pH 5,5, o que sugere a presença de mais de uma enzima (Figura24). A
máxima atividade de FPase foi em pH 5,5 (Figura 25). A Avicelase apresentou atividade máxima
em pH 6,0 com 5 U/mL, no entanto, observamos dois picos na figura 26, o que sugere a atuação
de uma segunda enzima trabalhando em pH 7,0. Walter & Schrempf (1995), descrevem que o
pH ótimo para atividade de Avicelase produzida pelo S. reticuli em pH 4,5-5,0. Resultados
obtidos por Tuncer et al. (2004) mostram a atividade ótima em pH 7,0, para atividade de
Avicelase produzida por Streptomyces sp. Rastogi et al. (2010) descrevem o pH 5,0 como ótimo
para atividade de CMCase produzidas por Bacillus sp e Geobacilllus sp.
Lima et al. (2005) e Alani et al. (2008) , descrevem pH 5,0 como sendo o ótimo para
atividade de CMCase produzida pelo S. drozdowiczii e Streptomyces sp, respectivamente,
enquanto Semêdo et al. (2000) descrevem como sendo o ótimo para a atividade de CMCase o pH
7,0, sendo que um segundo pico foi observado em pH 11. Já Silva et al (2008) descreve como o
pH 4,8 como sendo o melhor para endoglicanase produzida pelo Streptomyces sp, e com pico
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ati
vid
ade
En
zim
átic
a (U
/mL)
Dias
Cinética Beta glicosidase
47
extra em pH 7,0. Já Jan&Chen (2003) descrevem em seu trabalho, endoglicanases com pico de
atividade em pH 7,0 Streptomyces T3-1. Resultados obtidos no presente trabalho demontram o
maior pico de atividade de CMCase em pH 4,5 e um pico extra observado em pH 5,5.
Kusamaet al. (1986) descrevem em seu trabalho com um Streptomycessp , o pH 6,0 como
o ideal para atividade de beta glicosidase produzida por este microrganismo, um segundo pico foi
observado em pH 7,0, sugerindo a presença de uma segunda enzima. Já Faijes et al. (2006)
descreve como sendo pH otimo para atividade de beta glicosidase de Streptomyces sp E383-A, o
pH 8,5. Já Heupel et al. (1993) descrevem o pH 7,0 como sendo o ótimo para a beta glicosidase
produzida pelo Streptomyces reticuli. Resultados obtidos no presente trabalho mostram que a
maior atividade de beta glicosidase foi em pH 4,5 (0,08 U/mL), sendo que foi observado
também, um segundo pico em pH 6,5. Dados obtidos nesse trabalho sugerem a presença de duas
enzimas, onde cada uma atua em pH diferentes.
Figura 24 - Efeito da variação do pH sobre atividade de CMCase do isolado I7. O isolado I7 foi
cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10
Ati
vid
ade
En
zim
atic
a (U
/mL)
pH
CMCase
48
Figura 25 - Efeito da variação do pH sobre atividade de FPase do isolado I7. O isolado I7 foi
cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
Figura 26- Efeito da variação do pH sobre atividade de Avicelase do isolado I7. O isolado I7 foi
cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10Ati
vid
ade
En
zim
atic
a (U
/mL)
pH
FPase
-1
0
1
2
3
4
5
6
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10
Ati
vid
ade
En
zim
atic
a (U
/mL)
pH
Avicelase
49
Figura 27- Efeito da variação do pH sobre atividade de Beta glicosidase do isolado I7 cultivado
em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
6.6 Influência da temperatura na atividade das enzimas testadas.
Estudou-se também o efeito da temperatura nas atividades avaliadas variando a
temperatura de 40 a 80ºC. A temperatura ótima para atividade de CMCase foi de 50ºC, sendo que
nas temperaturas acima desta a enzima teve um declínio (Figura 28). A atividade de FPase foi
maior na temperatura de 50ºC, mas um outro pico de atividade foi observado a 70ºC, sugerindo a
atuação de diferentes enzimas, que atuam em diferentes temperaturas (Figura 29). A temperatura
ótima observada para a atividade enzimática de Avicelase foi a 40ºC (Figura 30). Já a atividade
de beta glicosidase foi maior a 65°C, mas um outro pico foi observado a 50°C (Figura31).
Experimentos descritos por Lima et al. (2005); Vinha et al. (2011) e Alani et al. (2008),
concordam com os resultados obtidos no presente trabalho, onde a temperatura ótima para
atividade das CMCase foi de 50ºC, sendo que FPase apresentou dois picos de atividade em 50°C
e um segundo pico em 70°C, sugerindo a presença de duas ou mais enzimas, já a Avicelase
apresentou atividade ótima a 40ºC. Li et al. (2008) descrevem em seu trabalho uma CMCase
produzida por um Bacillus sp. com pico de atividade a 50ºC, como a CMCase produzida pelo
Streptomyces sp I7 descrita neste trabalho.
-1
0
1
2
3
4
5
6
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 8 9 10
Ati
vid
ade
En
zim
átic
a (U
/mL)
pH
Beta glicosidase
50
Em experimentos realizados por Kusamaet al. (1986) com um Streptomyces sp foi
observado que a temperatura ótima para a atividade da beta glicosidase foi de 60°C. Já Faijes et
al. (2006) descrevem em seu trabalho a temperatura de 45°C como sendo ótima para a atividade
de beta glicosidase produzida pelo Streptomyces E383- A. Heupel et al. (1993) descrevem como
a temperatura de 40°C como sendo ótima para atividade de beta glicosidase produzida pelo S.
ritculi. Como observado na figura 31, os dados obtidos no presente trabalho mostram que a
temperatura ótima para atividade da enzima é de 65°C (0,08 U/mL).
Figura 28 – Efeito da variação de temperatura sobre atividade de CMCase. O ensaio foi
relaizado em pH 4,5, e o ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de
trigo 0,75% e extrato de levedura 0,1%.
0
5
10
15
20
25
30
40 45 50 55 60 65 70 75 80
Ati
vid
ade
En
zim
atic
a (U
/mL)
Temperatura (°C)
CMCase
51
Figura 29 – Efeito da variação de temperatura sobre atividade de FPase. O ensaio foi realizado
em pH 5,5, e o ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e
extrato de levedura 0,1%.
Figura 30– Efeito da variação de temperatura sobre atividade de Avicelase. O ensaio foi
realizado em pH6,0. O ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo
0,75% e extrato de levedura 0,1%.
0
1
2
3
4
5
6
7
40 45 50 55 60 65 70 75 80
Ati
vid
ade
En
zim
atic
a (U
/mL)
Temperatura (°C)
FPase
0
2
4
6
8
10
12
40 45 50 55 60 65 70 75 80
Ati
vid
ade
En
zim
atic
a (U
/mL)
Temperatura (°C)
Avicelase
52
Figura 31- Efeito da variação de temperatura sobre atividade de beta glicosidase (pH 4,5)do
ilsolado I7 cultivado em meio mínimo suplementado com farelo de trigo 0,75% e extrato de
levedura 0,1%.
6.7 Termoestabilidade enzimática
Para a análise da estabilidade térmica das celulases, o sobrenadante de cultura foi pré
incubado á 50ºC e 60ºC, já para atividade de beta glicosidase, as temperaturas utilizadas foram
de 60°C e 65°C. As enzimas foram foram pré incubadas por até 4 horas, alíquotas foram
coletadas em intervalos de 30 min. No teste para CMCase (Figura 32) as enzimas apresentaram
atividade maior que a inicial nos primeiros 120min de pré-incubação, sugerindo que a atividade
CMCase é ativada pela temperatura, chegando a apresentar 40% de aumento em sua atividade a
50ºC e 25% de aumento a 60ºC. Após 1 h e 30 min de incubação a atividade teve uma queda de
10% a 50ºC e 25% a 60ºC, sendo que após 3 h e 30 min de pré-incubação a enzima havia perdido
mais de 50% de sua atividade. Resultados similares foram descritos por Vinha et al. (2011). Eles
mostraram que a CMCase produzida pelo S. viridobrunneus retém 76% de sua atividade após 2
horas de pré-incubação à 50ºC. Dados descritos por Nascimento et al. (2009) descrevem que
após 2 horas de pré-incubação à 50ºC, apenas 50% da atividade de CMCase produzida pelo S.
malaysienses foi mantida.
No teste para FPase a enzima apresentou uma ativação nos primeiros 30 minutos de pré-
incubação tanto a 50ºC quanto a 60ºC. Com 1 hora de pré-incubação a 60ºC a enzima reteve
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
40 45 50 55 60 65 70 75 80
Ati
vid
ade
En
zim
átic
a (U
/mL)
Temperatura (°C)
Beta glicosidase
53
apenas 20% de sua atividade, após 2 horas de pré-incubação a 50ºC a enzima reteve cerca de
30% de atividade (Figura 33). No ensaio para Avicelase após 30 min de pré-incubação a 60ºC a
enzima perdeu 60% de atividade, sendo que em 1 hora a enzima diminuiu em 70% a sua
atividade, após 1 hora e 30 min de pré-incubação esta enzima não apresentava mais atividade
(Figura 34). Entre 30 e 60min de pré-incubação a 60°C, a Avicelases retomou parte de sua
atividade, chegando a alcançar aproxidamente 75% de sua atividade inicial.
No ensaio de beta glicosidase nos primeiros 30 minutos de pré-incubação a 60°C a
enzima apresentou 98% de atividade, sendo que após 60 min de a enzima ultrapassou os 100%
de ativação. Somente após 2 horas de pré-incubação, a enzima perdeu 60% de sua atividade
inicial, sendo que com 3 horas de pré-incubação, a enzima reteve 50% de sua atividade inicial.
Nos primeiros 30 minutos de pré-incubação a 65°C, a enzima apresentou ativação de 30%, após
60 minutos de pré-incubação a enzima se manteve estável. Após 90 minutos de pré-incubação, a
enzima perdeu 20% de sua atividade e após 3 horas de pré-incubação a enzima perdeu 80% de
sua atividade (figura 34).
Experimentos realizados por Kusama et al. (1986) demonstram que a atividade de beta
glicosidase produzida por Streptomyces sp se manteve estável a 55°C após 10 minutos de pré-
incubação, após esse período, em temperaturas mais elevadas, a beta glicosidase perdeu
completamente sua atividade.
Esse comportamento diferente poderia ser explicado pela presença de mais de uma
enzima no sobrenadante de cultura. Os dados obtidos nesse trabalho permitem dizer que a
CMCase produzida pelo Streptomyces sp I7 é uma enzima termoestável.
Em Streptomyces é comum encontrar a presença de sistemas celulolíticos apresentando
multiplas enzimas. Este parece ser o caso deste isolado. A análise dos gráficos relacionados a pH
e temperatura, sugerem a presença de mais de uma enzima (Figuras 24 a 31). Vinha et al. (2011)
mostrou a produção de multiplas celulases por S. viridobrunneus. A técnica de zimograma foi
utlizada para mostrar a produção de duas enzimas com massas moleculares de 37 e 119 KDa.
Entretanto o gráfico da variação da temperatura mostrou um único pico de atividade. De forma
semelhante, três celulases foram descritas por Nascimento et al. (2009). Um sistema contendo
54
cinco isoenzimas produzidas por S. antibioticus (ENGER & SLEEPER, 1965). Brito (2012)
demonstrou a produção de três celulases diferentes por Streptomyces sp I3.
A presença de multiplas celulases também ocorre em outras bactérias e fungos. Em
Bacillus licheniformis foi descrito a presença de cinco isosenzimas diferentes (BISCHOFF et al.,
2006). Esse complexo enzimático parece ser importante para capacitar os microrganismos a
hidrolisarem diferentes polissacarídeos em variadas condições. Esse arsenal de enzimas permite
hidrolisar as diferentes estruturas da celulose.
Figura 32- Termoestabilidade de CMCase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade
relativa expressa em porcentagem.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 30 60 90 120 150 180 210 240
Ati
vid
ade
Re
lati
va (
%)
Tempo (min)
Termoestabilidade CMCase
50°C
60°C
55
Figura 33- Termoestabilidade de FPase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade
relativa expressa em porcentagem.
Figura 34- Termoestabilidade de Avicelase do sobrenadante de cultura do isolado I7. A atividade
relativa expressa em porcentagem.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 30 60 90 120 150 180 210
Ati
vid
ade
Re
lati
va (
%)
Tempo (min)
Termoestabilidade FPase
50°C
60°C
0
20
40
60
80
100
120
0 30 60 90 120 150 180 210
Ati
vid
ade
Re
lati
va (
%)
Tempo (min)
Termoestabilidade Avicelase
50°C
60°C
56
Figura 35 - Termoestabilidade de beta glicosidase do sobrenadante de cultura produzida pelo
isolado I7 com atividade relativa expressa em porcentagem.
6.8 Efeito de íons metálicos e do EDTA sobre atividade das enzimas testadas
A Tabela IV mostra o efeito dos íons metálicos e do EDTA sobre atividades enzimáticas
avaliadas. A atividade de CMCase foi inibida apenas na presença do EDTA, reduzindo sua
atividade em 86%. Todos os íons metálicos estimularam a atividade da enzima CMCase,
resultados semelhantes foram descritos por Lima et al. (2005) para o S. drozdowiczii, onde os
íons Mg2+
, Ba2+
, Fe2+
e o K+ também estimularam a atividade da enzima, concordando com os
resultados obtidos neste trabalho.
Estudos realizados por Vinha et al. (2011) descrevem que na presença dos íons Mg2+
,
Zn2+
, Na+, Ba
2+, Mn
2+,Ca
2+, K
+ e Fe
2+ ocorre inibição da atividade de CMCase, produzida pelo S.
viridobrunneus, o EDTA também inibiu a atividade dessa enzima. Os resultados obtidos neste
trabalho estão em acordo com os dados obtidos por estes autores.
O trabalho de Franco-Cirigliano et al. (2013) estudou a influência do íon Mn2+
sobre a
atividade da endoglicanase de S.misionensis PESB-25. Eles mostraram que o Mn2+
melhorou a
atividade da enzima em 200%. Devido a esse grande efeito, eles estudaram a influência desse íon
0
50
100
150
200
250
0 30 60 90 120 150 180 210
Ati
vid
ade
Re
lati
va (
%)
Tempo (min)
Termoestabilidade Beta Glicosidase
60°C
65°C
57
variando sua concentração desde 1 até 10mM. A maior atividade foi encontrada na concentração
de 8mM.
Íons metálicos podem ser requeridos para atividade da enzima podendo eventualmente
fazer parte do complexo da enzima ou servirem como cofatores para atingir sua atividade
máxima. Manganês e outros íons metálicos podem aumentar a afinidade de ligação das enzimas
ao substrato, podendo ainda estabilizar a conformação do sitio catalítico (CHAUVAUX et al.,
1995).
Tejirian & Xu (2010) estudaram a inibição de celulases por íons metálicos. Eles citam
que Fe+2
e Cu+2
geralmente são inibidores de celulases, entretanto Mn, Co, Ni e Zn não são
inibidores, apesar de terem tamanhos e cargas semelhantes. É bastante interessante que o Mn+2
foi um ativador das enzimas CMCase, FPase e Avicelase produzidas pelo Streptomyces sp I7,
essa característica é semelhante à da endoglicanase produzida por S. misonensis.
A maioria dos íons testados inibiram a atividade de FPase, exceto o íon Mn+2
que
estimulou a atividade FPase em 43,66%, o EDTA inibiu a atividade em 36%. Em relação à
atividade de Avicelase apenas os íons K+, NH4
+ e Mg
+2 inibiram a atividade da enzima. Os
demais íons (Na+, Al
3+, Ba
2+, Ca
2+ e o Mn
2+) estimularam a atividade de Avicelase. O EDTA
reduziu a atividade de Avicelase em 81%.
A atividade de beta glicosidadase foi inibida em 5,74% pelo Al3+
. Os íons Ba2+
e Ca+
estimularam a atividade da enzima, o K+ foi o íon que estimulou a atividade da enzima mais
eficientemente, com aumento de 12% na atividade de beta glicosidase, na presença dos íons
Mn2+
e NH4+
e do EDTA não foi detectada atividade de beta glicosidase. Kusama et al.(1986)
estudou a inibição por íons metálicos e a influência do EDTA na atividade de beta glicosidase de
um Streptomyces sp. Eles descrevem que a atividade de beta glicosidase foi inibida por Hg2+
(98%) e por Fe2+
(25%), já a presença de Ca2+
manteve a atividadedessa enzima em 100%. O
EDTA no trabalho de Kusama et al. (1986) inibiu a atividade de beta glicosidase em 18%, já no
presente trabalho o EDTA inibiu completamente a atividade da enzima.
A inibição pronunciada obtida na presença de EDTA sugere que íons metálicos,
principalmente os divalentes, são importantes para a atividade das enzimas estudadas. Esses íons
poderiam auxiliar na ligação da enzima com o substrato, em uma mudança conformacional da
58
enzima ou na modificação do sítio ativo. Jonhson & Demain (1984) descrevem que a inibição de
celulases por íons metálicos pode ocorrer por ligação destes com grupo tiol que fazem parte do
sítio ativo desse tipo de enzimas. Esses autores mostraram que a utilização de DTT (ditiotreitol)
pode aumentar a ação das celulases por deixar o grupo sulfídril presente no sítio ativo na sua
forma reduzida.
Tabela V - Efeito dos diferentes íons e do EDTA na atividade de CMCase, Fpase, Avicelase
e beta glicosidase.
Íons Metálicos CMCase FPase Avicelase Beta glicosidase
Controle 100 100 100 100
AlCl3 163.6 41.9 190.77 94.26
BaCl2 138.24 88.81 161.7 108.2
CaCl2 134 94.7 111 105
KCl 142 99.14 91.4 112
MgCl2 124.64 82.8 98.1 102
NaCl 125.6 86.88 224 101
MnCl2 205 143.66 305 0
NH4Cl 126 88 22 0
EDTA 14 64 19 0
Atividade relativa expressa em porcentagem em relação ao controle (100%)
Concentração final dos íons foi de 10Mm
59
7. CONCLUSÃO
O Streptomyces sp isolado I7 é bom produtor de enzimas celulolíticas;
A melhor fonte de carbono foi o FT;
A melhor condição de indução foi predita pela metodologia da superfície de
resposta como sendo FT a 0,75% e EL a 0,1%;
A cromatografia (TLC) mostra a presença de beta glicosidase;
A enzima beta glicosidase pode ser considerada termoestável por manter mais de
75% de sua atividade inicial após pré incubação por 150 minutos a 65°C;
O EDTA inibiu fortemente as enzimas CMCase, Avicelase e beta glicosidase. A
enzima FPase manteve 64% de atividade na presença do EDTA;
O Íon Mn+2
é um forte ativador das enzimas, CMCase, FPase e Avicelase e é um
potente inibidor da beta glicosidase;
As enzimas CMCase, FPase e Beta glicosidase foram ativadas quando pré
incubadas a temperaturas entre 50°C e 60°C;
O perfil de atividade nos diferentes pH e temperaturas testados sugere a existência
de sistema celulolítico composto por múltiplas enzimas.
60
8 PERSPECTIVAS
Purificar as enzimas e caracterizar as enzimas produzidas pelo Streptomyces sp I7;
Estudar a indução da beta glicosidase em diferentes meios de cultura, variando as fontes
de carbono e nitrogênio, bem como suas concentrações;
Estudar a indução das enzimas utilizando somente FT;
Testar suas aplicações biotecnologicas;
Testar se a beta glicosidase é secretada ou não.
61
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71
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ________________________________________________________________ ii
LISTA DE TABELA _________________________________________________________________ iv
LISTA DE ABREVIATURAS _________________________________________________________ v
RESUMO __________________________________________________________________________ 1
ABSTRACT ________________________________________________________________________ 2
1.Introdução _______________________________________________________________________ 1
1.1 Lignocelulose __________________________________________________________________ 1
1.2 Celulose ______________________________________________________________________ 2
1.3 Hemicelulose __________________________________________________________________ 4
1.3.1 Xilana _____________________________________________________________________ 5
1.3.2 Galactoglucomanana _________________________________________________________ 6
1.3.3 Arabinogalactana ____________________________________________________________ 7
1.4 Lignina _____________________________________________________________________ 7
1.5 Utilização industrial dos resíduos lignocelulósicos ____________________________________ 8
1.6 Streptomyces sp. ________________________________________________________________ 9
1.7 Hidrólise enzimática da celulose _________________________________________________ 10
1.7.1 Celulases e Beta glicosidases __________________________________________________ 11
1.7.2 Endoglicanases _____________________________________________________________ 12
1.7.3 Exoglicanases ______________________________________________________________ 13
1.7.4 Beta glicosidase ____________________________________________________________ 13
1.8 Aplicações biotecnológicas das celulases ___________________________________________ 14
1.9 Aplicações biotecnológicas da Beta glicosidase______________________________________ 16
2. Objetivos ________________________________________________________________________ 19
2.1 Objetivo Geral ________________________________________________________________ 19
2.2 Objetivos específicos ___________________________________________________________ 19
3. MATERIAIS __________________________________________________________________ 20
3.1. LINHAGEM DA BACTÉRIA Streptomyces sp. __________________________________ 20
3.2. SUBSTRATOS LIGNOCELULÓSICOS _______________________________________ 20
3.3. MEIOS DE CULTURA _____________________________________________________ 20
3.3.1. Meio Mínimo __________________________________________________________ 20
3.3.2 Meio Mínimo _____________________________________________________________ 20
3.3.3 Meio Pridham _____________________________________________________________ 21
72
3.4. SUBSTRATOS PARA DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS ________ 21
3. SOLUÇÕES ___________________________________________________________________ 22
3.4.1. Solução para determinação da atividade enzimática _____________________________ 22
3.4.1.1. Solução de Ácido Dinitrosalicílico –DNS __________________________________ 22
3.4.1.2. Tampão Citrato de Sódio 0,05M __________________________________________ 22
3.4.1.3. Tampão Fosfato de Sódio 0,05M _________________________________________ 22
3.4.1.4. Tampão Tris-HCl _____________________________________________________ 22
3.4.1.5. Tampão Glicina _______________________________________________________ 23
3.4.1.6. Solução de Carboximetilcelulose (CMC) ___________________________________ 23
3.4.1.7. Solução de Avicel _____________________________________________________ 23
3.4.1.8. Solução pNP-β-D-Glicopiranosideo _______________________________________ 23
3.6 Cromatografia de Camada Delgada ___________________________________________ 23
3.6.1 Fase fixa ______________________________________________________________ 23
3.6.2 Fase móvel ____________________________________________________________ 23
3.6.3 Solução Reveladora______________________________________________________ 24
4.Métodos _________________________________________________________________________ 25
4.1. Obtenção de isolados de Streptomyces sp a partir de BCA. ______________________________ 25
4.2.Seleção em placa dos isolados produtores de celulases. _________________________________ 25
4.3. Escolha da melhor fonte de carbono para a produção de CMCases, FPases, Avicelases e Beta
glicosidase pelo isolado I7. __________________________________________________________ 25
4.3.2 – Cinética de produção das celulases ____________________________________________ 26
4.4. Determinação da Atividade Celulolítica pelo Método dos Açúcares Redutores ______________ 27
4.4.1. Determinação da Atividade Celulolítica _________________________________________ 27
4.4.1.1. FPase __________________________________________________________________ 27
4.4.1.2. CMCase ________________________________________________________________ 27
4.4.1.3. Avicelase _______________________________________________________________ 27
4.4.2 Determinação da Atividade de Beta glicosidase ___________________________________ 28
4.4.2.4. Curva padrão da concentração de glicose ______________________________________ 28
4.5. Caracterização bioquímica de um conjunto de enzimas extracelulares. ________________ 28
4.6. Cromatografia de Camada Delgada ______________________________________________ 29
6 Resultados e Discussão ____________________________________________________________ 30
6.1 Escolha da fonte lignocelulolítica que induz a maior atividade de celulases ______________ 30
6.2 Cromatografia de camada delgada do produto da hidrólise da Celobiose (TLC) _________ 35
73
6.3 Otimização experimental _______________________________________________________ 36
6.4 Cinética de produção de enzimas ________________________________________________ 42
6.5 Influência do pH na atividade das enzimas avaliadas ________________________________ 46
6.7 Termoestabilidade enzimática ___________________________________________________ 52
6.8 Efeito de íons metálicos e do EDTA sobre atividade das enzimas testadas _______________ 56
7. CONCLUSÃO ___________________________________________________________________ 59
8 PERSPECTIVAS _________________________________________________________________ 60
9 Referências bibliográficas __________________________________________________________ 61