dissecting the dynamics of dna methyltransferase 1 and related nuclear proteins in living cells

250
Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells Katrin Schneider München 2014

Upload: others

Post on 11-Sep-2021

1 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1

and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Katrin Schneider

München 2014

Page 2: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1

and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Dissertation

an der Fakultät für Biologie

der Ludwig-Maximilians-Universität München

vorgelegt von

Katrin Monika Schneider

aus München

München, den 30. April 2014

Page 3: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Erstgutachter: Prof. Dr. Heinrich Leonhardt

Zweitgutachter: PD Dr. Steffen Dietzel

Tag der Abgabe: 30. April 2014

Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juni 2014

Page 4: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Content

I

Content

Summary III

Zusammenfassung IV

1. Introduction 1

2. Results 19

3. Discussion 203

1.1 Epigenetics ................................................................................................................................................ 1

1.2 DNA methylation ....................................................................................................................................... 4

1.2.1 Dnmt1 .......................................................................................................................................... 7

1.2.2 Coupling of maintenance methylation to the cell cycle .............................................................. 9

1.2.3 Uhrf1 and Uhrf2 ......................................................................................................................... 10

1.3 Epigenetic regulation by histone variants ............................................................................................... 11

1.4 Spatial and temporal dynamics of nuclear processes ............................................................................. 13

1.4.1 Nuclear protein dynamics .......................................................................................................... 13

1.4.2 Fluorescence microscopy techniques to study epigenetic processes in vivo ............................ 14

1.4.3 Labeling and transfection strategies ......................................................................................... 16

1.5 Aims of this work ..................................................................................................................................... 17

2.1 Dissection of cell cycle-dependent dynamics of Dnmt1 by FRAP and diffusion-coupled modeling ....... 19

2.2 Cooperative DNA and histone binding by Uhrf2 links two major repressive epigenetic pathways ........ 57

2.3 H2A.Z.2.2 is an alternatively spliced histone H2A.Z variant that causes severe nucleosome

destabilization ................................................................................................................................................... 77

2.4 Structure, function and dynamics of nuclear subcompartments ..........................................................109

2.5 Cyclin B1 degrading F-box protein NIPA is localized to the nuclear pore complex ...............................119

2.6 Targeting and tracing of specific DNA sequences with dTALEs in living cells ........................................141

2.7 Controlling the mobility of oligonucleotides in the nanochannels of mesoporous silica .....................159

2.8 Bayesian simultaneous analysis of multiple FRAP images with mixed-effect priors .............................177

3.1 Spatio-temporal dynamics of epigenetic factors ..................................................................................203

3.1.1 Cell cycle-dependent localization and kinetics of Dnmt1 ........................................................203

3.1.2 Dynamic regulation of Dnmt1 by cofactors .............................................................................205

3.1.3 Connection between DNA methylation and histone variants .................................................209

3.2 Visualizing the invisible .........................................................................................................................210

3.2.1 Limitations of photobleaching methods ..................................................................................211

3.2.2 Dependence of the model choice on the scientific question ..................................................212

3.2.3 Limitations of the FRAP-based kinetic modeling .....................................................................215

3.2.4 Application of complementary methods .................................................................................217

3.3 Outlook ..................................................................................................................................................219

Page 5: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Content

II

4. Annex 221

Curriculum vitae 242

4.1 References .............................................................................................................................................221

4.2 Abbreviations ........................................................................................................................................233

4.3 List of publications ................................................................................................................................236

4.4 Contributions .........................................................................................................................................237

4.5 Declaration ............................................................................................................................................239

4.6 Acknowledgment ..................................................................................................................................240

Page 6: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Summary

III

Summary

DNA methylation is an indispensable process during development and maintaining the DNA

methylation pattern after DNA replication is crucial for proper cellular function in mammals.

Misregulation of this process is involved in cancer formation. The key protein is the maintenance DNA

methyltransferase 1 (Dnmt1), an essential epigenetic factor that reestablishes methylation of

hemimethylated CpG sites generated during DNA replication in S phase. Two domains of Dnmt1, the

proliferating cell nuclear antigen (PCNA) binding domain (PBD) and the targeting sequence (TS)

domain are responsible for targeting the enzyme to replication sites and to constitutive

heterochromatin. However, their cell cycle-dependent coordinated action and regulation are still

unclear. In order to understand the regulation of Dnmt1 as well as other nuclear factors, they have to

be studied not only in vitro, but also under dynamic in vivo conditions. Advanced fluorescence

microscopy offers a variety of methods, to gain insights into epigenetic regulation in vivo.

Therefore, we set out to dissect the cell cycle-dependent dynamics of Dnmt1. In our approach, we

combined fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) with kinetic modeling, complemented

by 3D-structured illumination microscopy, which allowed us to obtain detailed information about the

spatio-temporal dynamics of Dnmt1 and its regulation. By analyzing GFP-Dnmt1 mutants, we showed

that both the PBD- and the TS domain-mediated interactions are necessary and sufficient for the

localization and the dynamics of Dnmt1 in S phase. Based on our customized kinetic model, we

estimated an average target binding time for the PBD to PCNA and the TS domain to constitutive

heterochromatin of about 10 s and 22 s, respectively. Altogether, we propose a two-loading-platform

model, in which PCNA and heterochromatin function as relatively immobile platforms during S phase.

In early S phase, binding of the PBD to PCNA predominates. In late S phase, the heterochromatic

marks, the TS domain binds to, are in close proximity to replication sites, leading to a strong TS

domain-mediated interaction that dominates the Dnmt1 dynamics in late S phase.

Furthermore, fluorescent microscopy and biochemical methods enabled us to further investigate the

proteins Uhrf (ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains) 1, an essential factor for

maintenance methylation in vivo, its homologue Uhrf2 and the histone variant H2A.Z, exemplifying

another level of epigenetic regulation. We demonstrated, for example, that an alternative splice

variant of H2A.Z, H2A.Z.2.2, severely destabilizes nucleosomes and that Uhrf2 dynamics depend on

the methylation of H3K9. Emphasizing the methodological aspect of this work, it should be mentioned

that we could also develop new strategies to label DNA sequences in living cells, characterize

nanoparticles as vectors for nucleic acids and reveal hidden interactions of the cell cycle regulator

nuclear interaction partner of anaplastic lymphoma kinase (NIPA). The continuous integration of

microscopy developments in biological research will help in the future to dissect nuclear regulatory

networks in vivo.

Page 7: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Zusammenfassung

IV

Zusammenfassung

DNA-Methylierung ist ein essentieller Vorgang während der Entwicklung und die Erhaltung der DNA-

Methylierungsprofile ist äußerst wichtig für die korrekte Funktion der Zellen in Säugern. Die

fehlerhafte Regulation dieses Vorgangs kann zur Entstehung von Krebs führen. Das entscheidende

Protein ist die DNA-Methyltransferase 1 (Dnmt1), ein essentielles Protein, das die Methylierung an

hemimethylierten CpG-Stellen nach der Replikation in der S Phase wiederherstellt. Zwei Dnmt1

Domänen, die „proliferating cell nuclear antigen (PCNA) binding domain“ (PBD) und die „targeting

sequence“ (TS) Domäne, sind verantwortlich dafür, dass Dnmt1 gezielt an Replikationsstellen und an

konstitutives Heterochromatin gebunden wird. Allerdings ist die zellzyklusabhängige Funktionsweise

und Regulation der Interaktionen immer noch unbekannt. Um die Regulation von Dnmt1 und anderen

Faktoren im Kern zu verstehen, müssen deren Interaktionen nicht nur in vitro, sondern auch unter

dynamischen in vivo Bedingungen untersucht werden. Moderne Fluoreszenzmikroskopie bietet eine

Auswahl von Methoden, die uns erlauben in vivo Einblicke in die epigenetische Regulation zu erhalten.

Aus diesem Grund haben wir begonnen die zellzyklusabhängige Dynamik von Dnmt1 zu analysieren. In

unserem Ansatz haben wir die Methode „fluorescence recovery after photobleaching” (FRAP) mit

kinetischen Modellen kombiniert und „3D-structured illumination microscopy“ ergänzend angewandt.

Dieser Ansatz ermöglicht es detaillierte räumliche und zeitliche Informationen über die Dynamik von

Dnmt1 und deren Regulation zu erhalten. Durch die Analyse von GFP-Dnmt1 Mutanten konnten wir

zeigen, dass die Interaktionen, die durch die PBD und die TS Domäne vermittelt werden, sowohl

notwendig, als auch ausreichend sind für die Lokalisation und die Dynamik von Dnmt1 in der S Phase.

Mit Hilfe unseres maßgeschneiderten kinetischen Models konnten wir eine mittlere Interaktionszeit

für die PBD mit PCNA von etwa 10 s und von der TS Domäne mit konstitutivem Heterochromatin von

etwa 22 s ermitteln. Aufgrund dieser Ergebnisse stellen wir ein „two-loading-platform“ Modell auf, in

dem PCNA und Heterochromatin als relativ stabile Plattformen während der S Phase betrachtet

werden. In der frühen S Phase überwiegt die Bindung der PBD an PCNA. In der späten S Phase

hingegen sind spezifischen Heterochromatin Bindestellen, an die die TS Domäne bindet, nahe der

replizierenden Regionen. Dies führt zu einer starken Bindung, vermittelt durch die TS Domäne, die die

Dnmt1 Dynamik in der späten S Phase dominiert.

Darüber hinaus haben wir durch Fluoreszenzmikroskopie und biochemische Methoden ein tieferes

Verständnis über die Funktion der Proteine Uhrf (“ubiquitin-like, containing PHD and RING finger

domains“) 1, ein essentieller Faktor für die Aufrechterhaltung der DNA Methylierung, das homologe

Protein Uhrf2 und der Histonvariante H2A.Z, beispielhaft für ein weiteres Level der epigenetischen

Regulation, erhalten. Wir konnten zum Beispiel zeigen, dass eine alternative Splicevariante von H2A.Z,

H2A.Z.2.2, Nukleosomen stark destabilisiert und dass die Uhrf2 Dynamik von der Methylierung von

H3K9 abhängt. Der methodischen Aspekt dieser Arbeit wird außerdem durch die Entwicklung neuer

Page 8: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Zusammenfassung

V

Strategien für die Markierung von DNA-Sequenzen in lebenden Zellen, die Charakterisierung von

Nanopartikel als Vektoren für Nukleinsäuren und die Aufdeckung versteckter Interaktionen des

Zellzyklusregulators „nuclear interaction partner of anaplastic lymphoma kinase“ (NIPA) betont. Der

kontiniuierliche Transfer neuer Entwicklungen aus der Mikroskopie in die biologische Forschung wird

uns in Zukunft behilflich sein in vivo die regulatorischen Netzwerke im Zellkern aufzuklären.

Page 9: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells
Page 10: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

1

1. Introduction

1.1 Epigenetics

Every human being develops from a single totipotent cell. The DNA sequence within this cell is

replicated during each cell division leading to almost identical genetic information in all somatic cells

of the body. However, our adult body consists of over 400 different cell types with diverse functions

and morphology (Vickaryous and Hall, 2006). This large diversity is generated by cell type specific

regulation of gene expression. Heritable information that directs these regulatory processes, but is not

encoded in the DNA sequence, is summarized under the term epigenetics (epi, Greek: επί- over,

above, outer). Epigenetic processes do not only play a major role in differentiation and development,

but are also involved in cellular aging and the development of cancer (Hannum et al., 2013, Dawson

and Kouzarides, 2012). Moreover, multiple diseases, apart from cancer, are linked to epigenetic

factors and processes. Examples are single gene disorders, caused by mutations in genes coding for

epigenetic factors, including the Rett syndrome or the ATRX syndrome (Feinberg, 2007). In addition,

imprinted gene disorders are linked to epigenetics. Genomic imprinting describes the selective

repression of either the paternally or maternally inherited allele by epigenetic mechanisms (Morison

et al., 2005). Epigenetic alterations in genes or their control regions can lead to diseases, e.g. the

Beckwith-Wiedemann Syndrome (Choufani et al., 2013). Recently, even common complex diseases

like rheumatoid arthritis or epilepsy have been discussed in connection with epigenetics (Liu et al.,

2013b, Qureshi and Mehler, 2010).

The classical definition of epigenetics reads: “The study of mitotically and/or meiotically heritable

changes in gene function that cannot be explained by changes in DNA sequence” (Russo et al., 1996).

This includes many diverse processes like the DNA methylation system, histone modifications, histone

variants, nucleosome positioning and non-coding RNA (Figure 1). Accordingly, prions are included in

this definition, as they are proteins that pass on their changes that are not based on DNA sequence

(Halfmann and Lindquist, 2010). In addition to the modified DNA base 5-methylcytosin (5mC) the new

DNA modifications 5-hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-formylcytosin (5fC) and 5-carboxcytosin (5caC)

have recently been discovered, forming a complex DNA modification system (Figure 1). Some of the

epigenetic marks occur only for short time frames during the cell cycle and are therefore not

classically heritable. Hence, a recent definition has shifted the focus more to chromatin structure: “…

the structural adaptation of chromosomal regions so as to register, signal or perpetuate altered

activity states.” (Bird, 2007). This chromatin structure-based definition paints a much more dynamic

picture of the epigenetic landscape that will be the major focus in this thesis.

Page 11: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

2

Figure 1: Epigenetic mechanisms. DNA can be methylated (mC), further oxidized to hmC, fC and caC or transcribed to non-coding RNA. Further epigenetic mechanisms are nucleosome positioning, incorporation of histone variants or posttranslational modification of histones, e.g. methylation (me), acetylation (ac) or ubiquitination (ub).

Chromatin structure and organization

The structural basis of chromatin is a chain of basic single building units, called nucleosomes. In each

nucleosome, 145-147 base pairs of DNA are wrapped around a histone octamer, consisting of two

histone 2A and histone 2B dimers (H2A-H2B) and a tetramer built up of two histone 3 and histone 4

dimers (H3-H4)2 (Luger et al., 1997). The resulting 11 nm fiber is further compacted to the 30 nm fiber

involving the linker histone H1 (Li and Reinberg, 2011), however, the presence of the 30 nm fiber in

vivo is highly debated and details about the higher order chromatin structure still need to be

investigated (Maeshima et al., 2010). In general, interphase chromatin is subdivided into open,

transcriptionally active euchromatin and condensed, transcriptionally inactive heterochromatin (Politz

et al., 2013). It has been proposed that euchromatic fibers harbor six nucleosomes per 11 nm,

whereas the compaction increases in heterochromatin to a packing density of 11-12 nucleosomes per

11 nm (Bassett et al., 2009). Furthermore, heterochromatin can be subdivided into constitutive and

facultative heterochromatin. Both describe silent and compacted chromatin, but only facultative

heterochromatin has the potential to switch to a more euchromatic state (Trojer and Reinberg, 2007).

Constitutive heterochromatin is found at the telomeres, the centromere and at pericentromeric

regions, all composed of DNA tandem repeats (Politz et al., 2013). In mouse cells, the centromeric

region and the pericentromeric region mainly consist of minor satellite DNA and major satellite DNA,

respectively (Probst and Almouzni, 2011). Not only the degree of packaging, but also the localization

of chromatin domains in the nucleus affects gene expression. As a general rule, the chromatin at the

nuclear periphery and around the nucleoli is rather gene poor and composed of silent

heterochromatin, whereas the area in between is gene rich and composed of active euchromatin

(Joffe et al., 2010). Prominent heterochromatic structures in mouse cells are the so-called

chromocenters. In chromocenters, the pericentromeric regions of multiple chromosomes form tightly

packed foci in the nucleus. The number and localization of chromocenters differs among cell types and

Page 12: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

3

species and the clustering of heterochromatic domains could facilitate repression of repetitive

sequence recombination and transposon silencing (Padeken and Heun, 2013, Cerda et al., 1999).

Nucleosomal modifications and positioning

Epigenetic mechanisms can change the higher order chromatin structure and thereby directly

influence, for example, the accessibility of the DNA to transcription factors. Direct structural changes

are created by altered charges, which form internucleosomal or intranucleosomal links. Modifications

of the N-terminal tails of histones, or of the histone core are able to induce structural changes.

Histones can be methylated, acetylated, phosphorylated, ubiquitinated, sumoylated, ADP-ribosylated

or deiminated, amongst others (Kouzarides, 2007). For instance, acetylation of lysines neutralizes the

positive charges of the histones and loosens the DNA-histone interaction in the nucleosome (Zentner

and Henikoff, 2013, Shogren-Knaak et al., 2006). Combinations of histone modifications, often

referred to as a histone code, can change chromatin structure to a larger extend by facilitating

nucleosome sliding or repositioning (Cosgrove et al., 2004). Insertion, movement or removal of

nucleosomes is carried out by so-called nucleosome remodelers. This process has been documented at

the transcriptional start site resulting in nucleosome free regions (Zhang et al., 2011). Another

mechanism to functionally alter chromatin structure is the incorporation of histone variants, which is

further explained in chapter 1.3. Furthermore, some histone variants are differently modified at their

N-terminal ends in contrast to the canonical histones, thus creating specific modifications with a

potential impact on chromatin structure (Luger, 2006). Finally, there are indications that DNA

methylation exerts a direct effect on nucleosome stability (Collings et al., 2013, Lee and Lee, 2012).

Epigenetic readers, writers and erasers

Histone modifications or DNA methylation can also indirectly influence chromatin structure and gene

expression by activating or inactivating other proteins or pathways. In this case, the modifications act

as signals for specific epigenetic reader proteins. These readers then recruit writers or erasers,

establishing or removing new regulatory marks that directly change chromatin structure or trigger

signaling cascades (Figure 2). Often, multiple epigenetic mechanisms act together within the

regulatory networks. The establishment of heterochromatic sequences at pericentromeric

heterochromatin in early development, for example, has been reported to require the interplay of

non-coding RNA, histone modifications (H3K9me3) and DNA methylation (Cedar and Bergman, 2009).

The role of epigenetic marks in signaling is especially interesting in the field of DNA methylation, as a

whole new set of modifications and their writers, readers and erasers have been recently identified,

which are further discussed in the next chapter. This discovery has raised many exiting questions and

strengthens the importance of this research field.

Page 13: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

4

Figure 2: Readers, writers and erasers of epigenetic modifications. DNA or histone modifications have to be established and

maintained by writers and can be removed by erasers. In order to lead to a functional output, the marks have to be identified

by specific readers that process these signals and activate or inactivate other proteins or pathways.

1.2 DNA methylation

DNA methylation is present in most species, including fungi, plants and animals. Interestingly, many

model organisms like Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe and

Caenorhabditis elegans have no or only low DNA methylation levels (Feng et al., 2010, Zemach et al.,

2010). In mammals, methylation of position 5 of cytosine (5mC) in a cytosine-phosphatidyl-guanine

(CpG) context is the predominant DNA modification. Nevertheless, in embryonic stem cells (ESC)

significant methylation levels in a CpA context have been detected (Ziller et al., 2011, Ramsahoye et

al., 2000, Lister et al., 2009). In plants, methylation is found in many contexts, such as CG, CNG (N =

A,C,T,G) and CHH (H= A, C, T) (Henderson and Jacobsen, 2007).

In the mammalian genome, CpG sites are underrepresented possibly due to mutagenic pressure as

5mC can be deaminated to thymidine, but a majority of 60-80% of these rare CpG sites are methylated

(Smith and Meissner, 2013). Interestingly, DNA regions with a high density of CpG sites, called CpG

islands are predominantly unmethylated (Bird et al., 1985). CpG islands are often located in promoters

of housekeeping genes or genes that are regulated during development (Meissner et al., 2008). The

high CG content due to the CpG density might facilitate their transcription (Moore et al., 2013). In

contrast, methylation of CpG islands leads to stable silencing of the associated genes. However, the

majority of CpG islands stays hypomethylated during development, whereas hypermethylation can be

detected in cancer or aging (Richardson, 2003). Especially, CpG islands in promoter regions do not

seem to play a role in tissue specific methylation. Tissue specific methylation rather correlates with

the methylation status of CpG islands outside of promoter regions, so-called orphan CpG islands,

which often include transcriptional start sites for long non-coding RNAs (Illingworth et al., 2010).

Besides methylation at promoters and the first exon that usually results in transcriptional silencing,

the role of methylation in gene bodies is still controversial (Brenet et al., 2011). Correlation with high

gene expression has been reported, but cannot be found in slowly dividing cells (Aran et al., 2011).

Page 14: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

5

Recently, a role of gene body DNA methylation in regulation of alternative promoters has been

proposed (Maunakea et al., 2010). Besides this gene specific context, many non-coding repetitive

sequences are methylated, including pericentromeric repeats and transposable elements (Smith and

Meissner, 2013). DNA methylation is one of the mechanisms to keep these non-coding sequences

compacted and silent in order to ensure genome integrity.

In contrast to other epigenetic processes, DNA methylation is especially important in the persistence

of silent epigenetic states. While other epigenetic processes, like histone modifications can be

metaphorized as a door that is opened or closed, representing active or inactive chromatin regions,

DNA methylation rather represents the key to the door locking the silent epigenetic state (Cedar and

Bergman, 2009). The establishment of persistent silent epigenetic states by DNA methylation is not

only important during embryonic development, but also during adult stem cell differentiation of the

neural or hematopoietic lineage (Smith and Meissner, 2013). The most striking changes in DNA

methylation levels occur during embryonic development. Global waves of demethylation occur during

early embryogenesis and during the formation of the gametocytes in the embryo. Interestingly, the

paternal genome is demethylated much faster compared to the maternal genome in the zygote and

remethylation of the parental genome in the primordial germ cells also occurs on a shorter time frame

(Seisenberger et al., 2013). The DNA methylation level changes are supposed to increase the

epigenomic plasticity and to reset imprinted regions.

Methylation of cytosine in mammals is catalyzed by the family of DNA methyltransferases (Dnmt). This

family consists of 5 methyltransferases Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3L and Dnmt2 (Figure 3).

Dnmt3a and Dnmt3b set the methylation marks de novo during embryogenesis assisted by the

cofactor Dnmt3L (Moore et al., 2013). Knockout studies in mice reveal that Dnmt3b is required earlier

in development compared to Dnmt3a, as knockout mice lacking Dnmt3b are not viable, whereas

Dnmt3a knockout mice survive about 4 weeks after birth (Okano et al., 1999). Once the methylation

marks are established, they are maintained by Dnmt1 during DNA replication and repair (Mortusewicz

et al., 2005, Bird, 2002, Bestor, 2000). Dnmt2 lacks the N-terminal regulatory region and is structurally

very similar to the bacterial DNA methyltransferase M.HhaI (Dong et al., 2001). It is still under

discussion, whether the highly conserved Dnmt2 is capable of DNA methylation, but it has been

reported that Dnmt2 is able to methylate tRNA promoting tRNA stability and protein synthesis

(Schaefer and Lyko, 2010, Goll et al., 2006, Hermann et al., 2003, Tuorto et al., 2012).

Page 15: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

6

Figure 3: Roles of DNA methyltransferases. Dnmt3a and Dnmt3b methylate CpG sites de novo during early embryogenesis

assisted by the cofactor Dnmt3L. Dnmt1 fully methylates hemimethylated CpG sites during DNA replication and repair.

Dnmt2 methylates tRNAs. Closed circles represent methylated, open circles unmethylated sites.

How the target sites of de novo methylation are identified still remains unclear, but different

mechanisms have been suggested (Moore et al., 2013, Smith and Meissner, 2013). Targeting could

either occur by direct recruitment of Dnmts or by blocking of DNA sites that are supposed to be

protected from methylation. In both cases, binding of transcription factors, RNAs, histone

modifications, histone variants or a combination of multiple processes are likely to be involved.

Furthermore, methylation marks can be removed actively or passively by a lack of maintenance. There

has been a long search for demethylases, however, no enzyme that cuts the methyl group from

cytosine has been discovered so far in mammals. Recently, there has been increasing evidence that

the removal of methyl groups occurs via another pathway. It has been discovered that the ten-eleven-

translocation (Tet) proteins oxidize 5-methylcytosin (5mC) to 5-hydroxymethylcytosin (5hmC) and

further to 5-formylcytosin (5fC) and finally to 5-carboxcytosin (5caC) (Ito et al., 2011, Tahiliani et al.,

2009). The new DNA bases, especially 5hmC might not be recognized by Dnmt1 and therefore lead to

passive demethylation (Hashimoto et al., 2012). Active demethylation probably includes DNA repair

mechanisms. 5fC and 5caC are, for example, recognized by the thymine-DNA glycosylase (TDG)

followed by base excision repair (BER) (Shen et al., 2013). Alternatively, the AID (activation induced

cytidine deaminase) and APOBEC (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like)

family enzymes can deaminate 5hmC to 5-hydroxyuracil (5hmU) which is recognized by the BER

pathway (Guo et al., 2011). Moreover, the new bases might not only be intermediates during removal

of methylation, but also act as signals detected by specific readers influencing gene expression.

Recently, a study has identified readers of 5hmC, 5fC and 5caC in comparison to 5mC readers (Spruijt

et al., 2013). Specific readers for each modification were identified and the interactions with 5mC and

5hmC were shown to change during differentiation, giving first hints towards the functional

significance of the newly discovered DNA bases.

The readers of the classical 5mC marks are termed methyl-CpG-binding proteins (MBP) and can be

categorized in three groups, namely proteins containing either (1) a methyl-CpG-binding domain

Page 16: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

7

(MBD), or (2) a zinc finger (ZnF; Cys2His2) domain or (3) proteins that are ubiquitin-like, containing

PHD and RING finger domains (Uhrf) (Buck-Koehntop and Defossez, 2013). In general, the MBPs

influence chromatin organization or transcriptional activity directly or indirectly by recruiting other

factors (Fournier et al., 2012). The majority of the MBPs mediate crosstalk between DNA methylation

and other epigenetic processes like histone modifications. For instance, MeCP2, an MBD protein, binds

methylated DNA and recruits histone deacetylases (HDAC) leading to transcriptional repression (Nan

et al., 1998). Further MBD proteins are MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MBD5 and MBD6 of which MBD1,

2 and 4 bind methylated DNA, whereas MBD 3, 5 and 6 are excluded from methylated DNA (Buck-

Koehntop and Defossez, 2013). Similar to MBD proteins, many ZnF proteins bind methylated DNA in a

sequence-specific context (Buck-Koehntop and Defossez, 2013). Uhrf1 has a strong affinity for

hemimethylated sites and is able to bind Dnmt1 and target it to them. The Uhrf family will be

discussed in detail in chapter 1.2.3.

Misregulation of DNA methylation is a hallmark of cancer development. Tumor cells are characterized

by global hypomethylation and local hypermethylation at CpG islands (Berman et al., 2012).

Hypomethylation of repetitive sequences causes genomic instability, whereas hypermethylation at

promoters of tumor suppressor genes enhances cell proliferation and reduces levels of apoptosis

(Portela and Esteller, 2010, Esteller, 2011). One successful strategy of cancer treatment has been the

chemotherapeutic agent 5-aza-desoxycytidine that covalently links Dnmts to DNA thereby inhibiting

their function. Since 2004, 5-aza-dC has been approved as a drug against myelodysplastic syndrome

(Kaminskas et al., 2005).

1.2.1 Dnmt1

The regulation and the molecular mechanism of Dnmt1 has been a popular field of research for many

years. The knockout of Dnmt1 in mice is recessive embryonic lethal before embryonic day 11 (Li et al.,

1992). Surprisingly, the corresponding ESCs are still viable containing DNA methylation levels reduced

by about two thirds. In MEF cells, the knockout leads to p53-induced apoptosis that can be overcome

by depletion of p53 (Lande-Diner et al., 2007).

Dnmt1 is composed of a C-terminal catalytic domain and a large N-terminal regulatory region

connected by a linker consisting of several alternating lysine-glycine (KG) repeats (Figure 4). In contrast

to bacterial methyltransferases, the catalytic domain alone is not active (Cheng, 1995, Margot et al.,

2000), demonstrating that the regulation by the N-terminal domain is essential for the activity of

mammalian Dnmt1. However, a truncation of half of the N-terminal domain is still catalytically active

(Jeltsch, 2006). In line with this, the first 118 amino acids of the N-terminus missing in an oocyte

specific isoform of Dnmt1 are dispensable for proper enzyme function. This region contains a domain

binding to the Dnmt1-associated protein 1 (DMAP1) and is supposed to function in transcriptional

Page 17: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

8

repression (Rountree et al., 2000). Nuclear import of Dnmt1 is achieved by at least one nuclear

localization signal (NLS) located in the N-terminal region (Cardoso and Leonhardt, 1999).

Figure 4: Dnmt1 domain architecture. The protein consists of a C-terminal catalytic domain and an N-terminal regulatory

region interconnected by a linker. The domains in the regulatory region include the DMAP, the PBD, a NLS, the TS domain, a

CXXC domain and two BAH domains.

This work focuses on two domains of Dnmt1, namely the protein proliferating cell nuclear antigen

(PCNA)-binding domain (PBD) and the targeting sequence (TS) domain. The PBD mediates the

transient interaction with PCNA and is not essential for the catalytic reaction, but enhances the

methylation efficiency about 2-fold (Schermelleh et al., 2007, Chuang et al., 1997). PCNA forms a

trimeric ring around the DNA and interacts with a large number of proteins, serving as a loading

platform during replication and repair (Moldovan et al., 2007). The second domain mediating cell

cycle-dependent targeting of Dnmt1, the TS domain, targets Dnmt1 to constitutive heterochromatin

(Easwaran et al., 2004, Leonhardt et al., 1992). Furthermore, the TS domain has been implicated in

several other interactions or mechanisms. A bipartite interface within the TS domain was found to be

responsible for dimerization of Dnmt1 (Fellinger et al., 2009) and the TS domain was also reported to

mediate the interaction with Uhrf1 (Frauer and Leonhardt, 2011, Achour et al., 2008, Felle et al.,

2011b, Bashtrykov et al., 2013). The crystal structure of Dnmt1 hints at an autoinhibitory role of the TS

domain, where the TS domain has to be unfolded from the catalytic domain in order to allow binding

of 5mC (Takeshita et al., 2011).

A similar autoinhibitory role was proposed for the CXXC domain, localized downstream of the TS

domain (Song et al., 2011). The CXXC domain can bind to unmethylated CpG sites, however, its

function is still under discussion as it has been reported that it is dispensable for maintenance

methylation (Frauer et al., 2011, Bestor, 1992). The polybromo homology domain (PBHD) (Liu et al.,

1998) containing two bromo adjacent homology (BAH) domains, thought to mediate protein-protein

interactions involved in gene silencing (Jurkowska et al., 2011). It has been reported that the PBHD

interacts with the ubiquitin carrier protein (Ubc) 9, which sumoylates Dnmt1, leading to an enhanced

catalytic activity of Dnmt1 (Lee and Muller, 2009), but the detailed function of the PBHD remains

unclear. As a further regulatory mechanism, an interaction between the C- and the N-terminus seems

to be required for the catalytic activity of Dnmt1 (Margot et al., 2003). The enzymatic reaction of

Dnmts involves the formation of a covalent complex between the C6 position of the cytosine ring and

the sulfhydryl group of the cystein in the conserved PC motif of the catalytic domain (motif IV).

Page 18: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

9

Thereafter, the methyl group is transferred from the donor S-adenosyl-L-methionine (SAM) to the C5

of the cytosine, followed by the release of the Dnmt by β elimination (Goll and Bestor, 2005).

Dnmt1 is ubiquitously expressed in various tissues, but increased levels of Dnmt1 have been detected

in many cancers (Peng et al., 2005, Saito et al., 2003, Robertson et al., 1999). Given that alterations of

Dnmt1 expression levels can lead to malignancies, it is important that protein expression, stability and

activity are tightly controlled. One mechanism controlling Dnmt1 abundance is the ubiquitination of

Dnmt1 by Uhrf1 leading to proteasomal degradation of Dnmt1 (Du et al., 2010, Qin, 2011). The

ubiquitination of Dnmt1 is triggered by acetylation of Dnmt1 by Tat-interactive protein 60 (Tip60). In

contrast, Usp7 and HDAC1 protect Dnmt1 from degradation by deubiquitination and deacetylation of

Dnmt1, respectively. Dnmt1 expression is, for instance, regulated by the Ras-AP-1 and the pRb-E2F

signaling pathways (Rouleau et al., 1995, McCabe et al., 2005).

1.2.2 Coupling of maintenance methylation to the cell cycle

The abundance of Dnmt1 is not only regulated during differentiation, but also during cell cycle

progression. The protein amounts are highest in S phase and start to decrease in late S phase or G2

with lowest levels in G1 (Du et al., 2010, Vogel et al., 1988). Besides cell phase specific expression

levels of Dnmt1, the interaction with important binding partners also ensures faithful maintenance

methylation of replicated DNA. For instance, the interaction of Dnmt1 with PCNA via the PBD, couples

the localization of Dnmt1 tightly to DNA replication.

In somatic mouse cells, at least three stages of replication are clearly distinguishable by replication

markers like PCNA or nucleotide analogues like bromodeoxyuridine (BrdU) or ethynyldeoxyuridine

(EdU). The cells pass from early to mid and then to late S phase (Figure 5) (Somanathan et al., 2001,

Dimitrova and Berezney, 2002, Leonhardt et al., 2000, Goldman et al., 1984). In early S phase,

euchromatic regions are replicated leading to a pattern of multiple small foci distributed in the

nucleus, but excluded from the nucleoli and the nuclear periphery. In mid S phase, an enrichment of

replication foci at the nuclear periphery and around nucleoli is observable. In mid S Phase replication

foci, facultative heterochromatin is replicated, followed by replication of constitutive heterochromatin

in late S phase. In mouse cells, constitutive heterochromatin clusters in chromocenters, resulting in

large horseshoe-shaped replication foci upon heterochromatin replication. The molecular mechanism

of the chromatin-dependent replication timing is not yet fully investigated, but there are indications

that it is created by a stochastic process. The prerequisites for this so-called relative efficiency model

are an increasing efficiency of origin of replication activation over time and more efficient firing of

some origins of replication, thus creating an asynchronous process (Rhind, 2006). The latter could be

created by different compaction states of chromatin that regulate the accessibility of origins and

thereby influence the firing efficiency. The domino effect model states that replication affects the

Page 19: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

10

surrounding chromatin structure, leading to an increased firing efficiency of origins in close proximity

to already replicating regions (Sporbert et al., 2002). The influence of chromatin compaction on

replication timing is supported by the finding that histone acetylation can lead to a shift towards

earlier replication timing (Kemp et al., 2005, Casas-Delucchi et al., 2012). Furthermore, the replication

timing of 20% of the genome changes during ESC differentiation, in line with the fact that loci specific

chromatin compaction is drastically altered during differentiation (Hiratani et al., 2008).

Figure 5: Cell cycle-dependent localization of GFP‐Dnmt1wt and RFP‐PCNA in mouse fibroblast cells. Replication sites are

marked by RFP-PCNA (red). GFP‐Dnmt1 (green) displays a diffuse nuclear distribution in G1 and association with replication

sites in early to mid S phase. In late S phase, GFP-Dnmt1 associates strongly with constitutive heterochromatin at

chromocenters of mouse cells which persists into G2 phase.

Dnmt1 largely colocalizes with the replication pattern observed for PCNA during early and mid S

phase. However, at the end of late S phase, a part of the Dnmt1 population remains associated with

the chromocenters although replication progresses further. At the onset of G2 Dnmt1 is still enriched

at constitutive heterochromatin. There are two possible explanations for this phenomenon. Dnmt1

either completes the DNA methylation at the densely methylated heterochromatic regions or Dnmt1

acts as an anchor for further processes (Easwaran et al., 2004).

1.2.3 Uhrf1 and Uhrf2

Interaction with PCNA causes enrichment of Dnmt1 at hemimethylated sites, but a second mechanism

targets Dnmt1 directly to hemimethylated sites via interaction with the protein Uhrf1 (also known as

Np95 or ICBP90). This became apparent in 2007, when it has been discovered that the knockout of

Uhrf1 leads to reduced DNA methylation levels, mimicking the phenotype of the Dnmt1 knockout in

mice (Bostick et al., 2007, Sharif et al., 2007). One year later, structural studies reported that Uhrf1

binds to hemimethylated CpG sites by flipping out the methylated cytosine base (Arita et al., 2008,

Avvakumov et al., 2008, Hashimoto et al., 2008). Based on these results, the model proposed, that

Uhrf1 targets Dnmt1 to hemimethylated sites in the DNA sequence, although Dnmt1 seems to have an

intrinsic preference for hemimethylated DNA (Bashtrykov et al., 2012, Frauer and Leonhardt, 2009).

Furthermore, the ability of Uhrf1 to bind histone modifications provides a link between histone

modifications and DNA methylation (Rottach et al., 2010, Liu et al., 2013a, Rothbart et al., 2012).

Page 20: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

11

Uhrf1 is a multidomain protein, composed of an ubiquitin-like (Ubl) domain, a tandem tudor domain

(TTD), a plant homeodomain (PHD), a SET (Suv39, Enhancer-of-zeste, Trithorax) and RING associated

(SRA) domain and a really interesting new gene (RING) domain (Figure 6). The SRA domain mediates

the interaction with hemimethylated DNA, whereas the TTD and the PHD mediate the interaction with

histone modifications. The TTD, together with the PHD, selectively bind to H3K9me3. H3K9me3 is a

repressive mark, characteristic for constitutive heterochromatin, set by the methyltransferases

Suppressor of Variegation (Suv)39h1 and Suv39h2 (Peters et al., 2001). Uhrf1 is a member of the

RING-finger type E3 ligase family. Typically, the RING-finger type E3 ligases are involved in the

ubiquitination pathway and indeed the RING domain enables Uhrf1 to ubiquitinate Dnmt1 leading to

the proteasomal degradation of Dnmt1 (see 1.2.1). In addition, Uhrf1 harbors an Ubl domain at the N-

terminus. This domain might be involved in the proteasomal degradation pathway, but its function has

not been fully elucidated yet (Bronner et al., 2013).

Figure 6: Uhrf1 and Uhrf2 domain architecture and homology. Uhrf1 and Uhrf2 contain a Ubl domain, a TTD, a PHD, a SRA

domain and a RING domain. The homology based on the primary protein sequence between the domains in both proteins is

depicted in percent.

Similar to Dnmt1, Uhrf1 is upregulated in many cancers and, hence, considered to be a marker or a

potential target for cancer therapies (Mousli et al., 2003, Unoki et al., 2009). Furthermore, Uhrf1 is

constitutively expressed during the cell cycle in cancerous cell lines, in contrast to a peak in expression

in late G1 and at the G2/M transition in non-cancerous cell lines (Mousli et al., 2003).

The second member of the Uhrf family is Uhrf2 (also known as Np97 or NIRF). Uhrf2 shows a

remarkable structure and even sequence conservation to Uhrf1 (Bronner et al., 2007, Pichler et al.,

2011). However, there are some differences between the two proteins, especially in the TTD (Figure

6). Uhrf2 has been reported to be involved in the degradation of nuclear protein aggregates (Iwata et

al., 2009), but it is not clear whether Uhrf2 has a functional role in DNA methylation. Therefore, a

highly interesting question is thus whether the two proteins are functionally redundant or whether

Uhrf2 possesses a distinct role.

1.3 Epigenetic regulation by histone variants

Besides DNA methylation and histone modifications, the importance of histone variants in the context

of chromatin structure and gene expression has become more and more evident. Histone variants are

Page 21: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

12

important for many processes, such as DNA repair, transcriptional regulation and epigenetic

reprogramming (Bernstein and Hake, 2006). The incorporation of histone variants changes epigenetic

states either directly or indirectly by recruiting different reader proteins through a variety of

mechanisms. For instance, some histone variants harbor specific sites that can be differently modified

compared to canonical histones or introduce structural changes facilitating nucleosome sliding or

eviction by changing the histone-DNA or histone-histone interfaces (Luger, 2006).

Canonical histones are only expressed in S phase, they are encoded in gene clusters that do not

contain introns and the mRNA is characterized by a 3’-stem loop, which is not polyadenylated. These

characteristics are, however, not found for histone variants, which are differently regulated, expressed

throughout the cell cycle, contain introns and have a polyadenylated mRNA (Marzluff et al., 2008). The

incorporation and eviction of histone variants is promoted by specific chaperones (Park and Luger,

2008). For example, the exchange of H2A-H2B with H2A.Z can be catalyzed by the complex

p400/NuA4/Tip60 (E1A-binding protein p400/nucleosomal acetyltransferase of H4/Tat-interactive

protein 60) or by SRCAP (Snf2-Related CREBBP activator protein) (Billon and Cote, 2012). In

nucleosomes always two copies of every histone are present. Therefore, either one or both histones

of one type can be exchanged with variants. Furthermore, different histone variants can be combined

in one nucleosome, leading to a great number of possible nucleosome compositions.

So far, variations of the core histones H2A, H2B and H3 have been identified in mammals. The largest

family of variants has been described for H2A (Figure 7). A well known variant is H2A.X, which is

phosphorylated at serine 139, if DNA double strand breaks occur (γH2A.X) and facilitates the DNA

repair process (van Attikum and Gasser, 2005). Another example is macroH2A that is incorporated to a

great extend into the inactive X chromosome and is involved in the transcriptional repression on this

chromosome and also on autosomes (Gamble and Kraus, 2010). The histone variants H2A.BBD (bar

body deficient) and H2A.Z are related to chromatin stability. H2A.BBD is only detected in mammals

and has been reported to be involved in spermatogenesis. Furthermore, the incorporation of H2A.BBD

in somatic cells has been shown to destabilize the nucleosome (Gautier et al., 2004).

H2A.Z is conserved between different species and is essential in mouse, drosophila and xenopus

(Bonisch and Hake, 2012). It is, hence, not surprising that this variant functions in a variety of

processes including transcriptional regulation, DNA repair, heterochromatin formation, chromosome

segregation and mitosis (Bonisch and Hake, 2012). Based on the various functions regarding chromatin

stability, the dynamics of the H2A histone variants and their splice forms are of special interest for this

work.

Page 22: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

13

Figure 7: Schematic representation of human H2A variants. In contrast to the canonical H2A, H2A.X harbors a special C-

terminal region prone for phosphorylation and macroH2A contains a large macro domain at the C-terminus. The C-terminal

region is also specific in H2A.Z, whereas H2A.BBD lacks the C-terminal domain and has an N-terminal domain that is distinct

from the other H2A variants.

1.4 Spatial and temporal dynamics of nuclear processes

1.4.1 Nuclear protein dynamics

Most of the processes and interactions, which have been introduced in the previous chapters, are

highly dynamic. With the start of this century it became clear that many of the interactions thought to

be highly stable are indeed very transient (Phair and Misteli, 2000). For instance, a lot of chromatin-

binding proteins like HP1 or even the histone H1 constantly bind and unbind their target (Stasevich et

al., 2010, Schmiedeberg et al., 2004, Cheutin et al., 2003). Apparently, chromatin, including the

canonical core histones, provides a relatively stable framework, where other proteins transiently bind

to. Further stable proteins are located in the nuclear lamina such as lamin A and lamin B or

nucleoporins like NUP153 (Xu and Powers, 2013, Moir et al., 2000). Furthermore, several nuclear

compartments not enclosed by a membrane, appear as relatively stable regions in the nucleus. These

nuclear compartments include nucleoli, nuclear speckles, replication foci, PML bodies and Cajal bodies

(Spector, 2001) and they are to some extend dynamic. For example, the spatial distribution of

replication foci changes in a complex pattern during S phase (see 1.2.2). The proteins in the replication

complexes are continuously exchanged. Furthermore, nuclear compartments could be self-assembling

or self-organizing complexes that are created by accumulation of specific factors binding to each other

with high affinity (Hemmerich et al., 2011).

Regarding the question of how proteins find their target, a theory states that many nuclear factors

passively diffuse through the crowded nucleus in order to find their target in a kind of a random-

scanning mechanism (Gorski et al., 2006). As diffusion of small molecules is very fast in the range of

30-80 µm²/s (Braga et al., 2004), this random-scanning mechanism, in combination with transient

binding events, could be a fast and energy efficient way to target proteins. Furthermore, this

combination allows a very fast reaction to external factors without the need of guided unbinding of

Page 23: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

14

chromatin factors. Fine-tuning the strength of association and dissociation rates in combination with

the abundance of proteins, contribute to the creation of nuclear organization (Hemmerich et al.,

2011). In essential cellular processes, chaperones aid the assembly of nuclear components (Ellis,

2006). PCNA, for instance, forms a trimeric ring around DNA and is loaded onto DNA by the chaperone

replication factor C (RFC) (Indiani and O'Donnell, 2006). After loading to DNA, the complex slides along

DNA in one dimension. The dynamic landscape in the nucleus seems to be necessary to provide

stability as well as plasticity in the cell (Misteli, 2001). A goal of this work is the analysis of the

temporal and spatial kinetics of this nuclear dynamic landscape. Therefore, there is an increasing need

for methods that do not only provide a snapshot of the current state, but allow insights into the

dynamic interplay of proteins. A very effective technique is advanced fluorescence microscopy.

1.4.2 Fluorescence microscopy techniques to study epigenetic processes in vivo

The field of fluorescence microscopy has been rapidly growing in the last two decades. The availability

of high speed microscopes in combination with fluorescent proteins like the green fluorescent protein

(GFP) has created a variety of methods. The so-called F-techniques include fluorescence recovery after

photobleaching (FRAP), fluorescence loss in photobleaching (FLIP), Förster resonance energy transfer

(FRET), fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and fluorescence correlation spectroscopy

(FCS) (Ishikawa-Ankerhold et al., 2012). The F-techniques are complemented by single particle tracking

(SPT) (Siebrasse et al., 2007). Furthermore, a variety of correlation spectroscopy methods related to

FCS like raster scan image correlation spectroscopy (RICS) have been developed (Digman and Gratton,

2012).

Initially, FRAP was developed to investigate the lateral movement of membrane proteins (Axelrod et

al., 1976), but it was later also used for kinetic analysis of intracellular as well as nuclear proteins. The

techniques FRAP and FLIP exploit the fact that a fluorescent molecule, fused to the protein of interest,

can be irreversibly bleached by a strong laser pulse. Fluorescent proteins in a cell appear in a dynamic

equilibrium. After bleaching a distinct region or spot in a FRAP experiment this equilibrium is disturbed

and diffusion of the bleached and unbleached proteins within the compartment can be visualized

(Figure 8). Dependent on their mobility, the molecules restore the steady state equilibrium of the

fluorescence distribution. The mobility of the proteins is dependent on their size and their specific or

unspecific interactions with other molecules (van Royen et al., 2009). The fluorescence intensity in the

bleached region is recorded over time by live cell microscopy.

Page 24: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

15

Figure 8: Recovery of the fluorescence after bleaching half of the nucleus. C2C12 cells expressing GFP-Dnmt1 in early S

phase. The bleached region is indicated as a rectangle around the left half of the nucleus. Recovery is reached after about 50

s. Scale bar: 5 µm.

In contrast to FRAP, in a FLIP experiment a region in a specific compartment is repeatedly bleached

over time and the fluorescent intensity in an unbleached compartment or region is measured (Figure

9). The advantage of the latter approach is that no damage by bleaching is induced in the observed

area. Furthermore, the exchange of molecules between different compartments can be easily

analyzed. In this way, for example, the rate of nucleocytoplasmic shuttling is measured (Koster et al.,

2005). FLIP is complementary to FRAP experiments as it adds the possibility of visualizing the immobile

protein fraction in the cell. Specialized techniques like microirradiation are used to analyze the

dynamic involvement of proteins in DNA repair (Figure 9). In microirradiation experiments, DNA

damage sites are created with a strong UV laser in living cells to visualize the accumulation of tagged

proteins to the DNA damage sites (Mortusewicz et al., 2007). A specialized variation of FRAP for the

analysis of DNA methylation is the trapping assay (Schermelleh et al., 2005). This method uses the

covalent attachment of the methyltransferases to its target sites in the DNA by incorporation of the

nucleotide analog 5-aza-dC in S phase. The degree of immobilization of Dnmts can be measured by

FRAP experiments (Figure 9). If Dnmt1 is highly active, many Dnmt1 molecules will be trapped by

5-aza-dC, leading to a large immobile fraction after a short time frame.

Kinetic modeling of FRAP data allows the estimation of diffusion coefficients and even binding rates of

the analyzed proteins. FRAP has major advantages in contrast to in vitro techniques like binding assays

with fluorescently labeled proteins or surface plasmon resonance (SPR). First, as it is an in vivo method

it allows for the observation of the protein in near native conditions. In addition, a compartment and

cell cycle-dependent approach is possible to temporally and spatially characterize the mobility of a

protein. However, interactions are only indirectly characterized by comparing kinetics of the wild type

protein with its mutants or with knockout cell lines.

In order to get deeper insights into protein binding properties and functions, not only the temporal

dynamics, but also the spatial changes have to be analyzed. Maximizing resolution is a major goal and

major breakthroughs have been achieved in the last decades. The main techniques to overcome the

resolution limit of about 200 nm in conventional light microscopy are 3D structured illumination

microscopy (3D-SIM), stimulated emission depletion (STED) and a variety of localization microscopy

methods like direct stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) or photoactivated

Page 25: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

16

localization microscopy (PALM) (Schermelleh et al., 2010). Among these techniques, 3D-SIM is

especially suitable for super-resolution images in the nucleus, because the high axial resolution is not

limited to total internal reflection fluorescence (TIRF) setups. Furthermore, it is possible to acquire

images in three colors, allowing a comparison of the detailed localization of up to three different

molecules.

Figure 9: Bleaching techniques to determine the mobility of molecules in living cells. In FRAP experiments, a region in the

cell is bleached and the recovery is measured over time. In FLIP experiments, a region is repeatedly bleached and the loss of

fluorescence in another region or compartment is analyzed. During microirradiation, DNA damage is induced by a UV-laser

and the recruitment of proteins to this area is analyzed. Therefore, if the protein is enriched, the relative intensity rises to

values larger than one. In the specialized trapping assay, Dnmts are covalently bound to 5-aza-dC in the DNA. After addition

of 5-aza-dC, it is incorporated into DNA in S phase and active Dnmt1 is trapped, leading to a decreased mobile fraction of

Dnmts in FRAP experiments (black: without 5-aza-dC, red: with 5-aza-dC).

1.4.3 Labeling and transfection strategies

The investigation of nuclear processes is further challenged by the labeling of the structure or protein

of interest and the delivery of the labeled molecules into the cell.

Labeling of the designated proteins, protein modifications, DNA or RNA sequences or single bases

provides the basis for the imaging methods that have been described before. Apart from standard

techniques like immunofluorescent labeling with antibodies in fixed cells or fluorescent tagging of

proteins with GFP or other fluorescent proteins, a wide range of specialized techniques has been

developed. For instance, nanobodies, small functionalized camelid antibodies, are currently used to

label proteins or modifications in living cells (Romer et al., 2011). Alternatively, short labeled Fab

antibody fragments can be injected into living cells or small GFP-tagged domains like the MBD can be

Page 26: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

17

used to detect DNA modifications like 5mC (Kimura et al., 2010). Another challenge is the specific

labeling of DNA sequences. Besides existing methods like polydactyl zinc finger proteins (PZF)

(Lindhout et al., 2007), a new approach exploits the designer transcription activator-like effectors

(dTALE). TAL effectors are injected from pathogenic Xanthomonas bacteria into plant cells in order to

activate gene expression in their host, facilitating bacterial survival and proliferation (Mak et al.,

2013). Binding to specific DNA sequences is achieved by the central DNA-binding domain, containing

tandem amino acid repeats that differ by repeat-variable-diresidues (RVD). The code, which RVDs

detect each of the four nucleotides in DNA, has been unraveled and has since then allowed for the

construction of dTALEs binding to user-defined sequences (Boch et al., 2009, Moscou and Bogdanove,

2009). By expression of fluorescently tagged dTALEs, DNA sequences can be labeled specifically and

their temporal and spatial distribution can be monitored in living cells. The application of dTALEs for

sequence specific DNA labeling has, thus, been demonstrated and characterized in this work.

Besides labeling nuclear structures, a second challenge is the delivery of nucleic acids (DNA, RNA) and

proteins to the cells. Typically, specific gene expression vectors are transferred into cells with the help

of cationic lipid reagents resulting in the synthesis of the encoded proteins in the cells. However, large

complex proteins like antibodies are often inefficiently folded or assembled and transfer of purified

proteins into cells often leads to endosomal entrapment of the proteins or high cell toxicity (Mellert et

al., 2012). Therefore, new strategies need to be developed. Highly tunable transfer vectors are

mesoporous silica nanoparticles (Cauda et al., 2009, Rathousky et al., 2004). They are taken up by

mammalian cells via endocytosis or pinocytosis (Slowing et al., 2008). Introduction of various internal

or external chemical functional groups can optimize their properties like biocompatibility, cellular

uptake or the capability of loading and releasing molecules (Giri et al., 2007). For example, the

functionalization of the nanoparticle surface with protoporphyrin IX increases the cellular uptake of

nanoparticles and their release from the endosome upon illumination with UV light (Schlossbauer et

al., 2012). Mesoporous silica particles are not only an effective research tool, but they also have a

potential in medical applications. At the moment, the development of strategies to deliver drugs to

specific tissues in the human body is an emerging field of research. Functionalized nanoparticles could

be a way to bring the drug to a specific region, allowing release only in the target area (Mai and Meng,

2013).

1.5 Aims of this work

Although many nuclear processes have been studied extensively, the majority of the results only

represent snapshots in the dynamic and complex interplay of large regulatory networks. Therefore,

the aim of this work was to get deeper insights into the spatio-temporal dynamics of nuclear proteins

with a major focus on Dnmt1.

Page 27: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Introduction

18

At first, I set out to dissect the cell cycle-dependent dynamics of Dnmt1. To address this question, I

performed FRAP experiments with GFP-Dnmt1wt and a set of mutants to analyze the role of the PBD

and the TS domain during different stages of the cell cycle with high temporal resolution. By applying a

tailored kinetic modeling approach, I tried to decipher the specific mean residence times for the

different interactions and the corresponding fractions of interacting molecules. Furthermore, using

3D-SIM super-resolution microscopy, I wanted to gain further information about the localization of

Dnmt1 in late S phase with high spatial resolution and correlate it with the findings about Dnmt1

dynamics. As Uhrf1 is the potential binding partner of the TS domain-mediated interaction and has an

essential role in DNA methylation, I also aimed at obtaining more information about Uhrf1 and at

studying the differences between Uhrf1 and its homologue Uhrf2.

Furthermore, I wanted to further develop our FRAP approach and apply it to other nuclear proteins

like the histone variant H2A.Z or the cell cycle regulator nuclear interaction partner of anaplastic

lymphoma kinase (NIPA). In addition, I tried to find tools that facilitate the analysis of nuclear

dynamics and processes. Therefore, I have set out to exploit dTALEs for the labeling of DNA sequences

in living cells and to characterize mesoporous silica nanoparticles, which can be used to transfer

molecules into cells.

Page 28: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������

��

��� ������������� ������� ���������� ������� �� � �� ������������������������ �!"�������������������� ����� ���#��

Page 29: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Page 30: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������������ ���� ��� ��������������������� ������������ �� ���������������� ������������������� ��!����������� ������������"�����#������������"���$���%&'�%(���)���������&�����&'*���!�+�!�,�-��������������.�/�!������� 0�1�������2������ ���� 2����������������3456789:;6<:=>?@=A=BC8<DE6<:69>=9F<:6B98:6DG9=:6@<HI@6<I6JKLDM@BN8O@;@A@8<PQ<@R69P@:CNL<@ISTKNQUJVW4XWGA8<6BBYN89:@<P9@6DJZ69;8<CJWF<P:@:L:6>=9?@=@<>=9;8:@IP8<DHCP:6;P?@=A=BCJ[6A;S=A:\]6<:9L;NL<IS6<JZ69;8<_6P689ISE6<:69>=9 <R@9=<;6<:8A[68A:SJVXabcd6LS69e69BJZ69;8<CJf56789:;6<:=>?@=IS6;@P:9C8<DH@B<8Ag98<PDLI:@=<JQ<@R69P@:CN6D@I8AE6<:69[8;eL9BY776<D=9>JWhWcb[8;eL9BJZ69;8<CJcF<P:@:L:6=>N=A6ILA89F;;L<=A=BCJ[6A;S=A:\]6<:9L;NL<IS6<JZ69;8<_6P689ISE6<:69>=9 <R@9=<;6<:8A[68A:SJV4faaNL<@ISJZ69;8<C8<DX56789:;6<:=>H:8:@P:@IPJKLDM@BN8O@;@A@8<PQ<@R69P@:CNL<@ISTKNQUJVhXfiNL<@ISJZ69;8<C_6I6@R6Dd=R6;e694XJWh4Wj_6R@P6Dk6e9L89CWbJWh4fjlII67:6Dk6e9L89CWaJWh4f�m�n���n�*� ��������������� � o�����p����������������������������������� ��q������������� ������*� �����������������������'n+���� ������������������������������������o��*�p���� ��� ����� o�m�p�� ��� �����������r�����on�p ����������������������������������������������'"����� �� ��������� ���������������� ���� ������� ����� ����(�������� ������'n������� �+�������� ��������������� ,����������� ���������� ������������ ���������� ����(��� �����������������o����p�s����������q��������+� ������ ���������������������������������'n�������������� ��������������!��������+������ �s������ ������������ �� ����������������o�p��������������������������� (������ ���������������������� ���������� ������������������to��p��+ ������������ �������to���p�������� ������������ ���������'"��� ��������������m�� ���� �������������� �������������������������������� �������������������������������������o���� ��������n���u�v�p'w������������������ �����������!���(�������������������������on��� x �pn� ������ ���� ������������������*��������� �����������������

�������� ��������������� ��������������� �����������'"����������+���� ������������� ��� ��������*���� ���� ����� ������������������(���������������������������������������������������������� ������������� ��������������'w*n�y�z�nwy*{|}~���������������������������������~�������~��~�~~��������������������������������~���~��������������������������������������������������������������������������������  �������������������~��~���������� ������� �� ~��������� �� ��� {|}~���������� �������{�~������¡�¢{����£����£�~���������� ���~���������������~�~������������������¤�¥ ��������������������{|}�����������¦������§��©��ª����������~�������������������������� {�~��������������������{|}������������«� ��������� ¬���������� �������� � ��� ���������������­®} ��°���������������������������{�~�������������°�������������� ����®­�������������������������������°��������������������~������ ��������������������������¤|}��������¦����������� ¤|}����������~����±{�� {�~���������������� ²������� ����������~���³ ��~��������������������������µ��¤|} ��~����~����~�����������������{|}�������������  ��¢���� ����������� ¶������~~�����·�°��~�������������������������������� ��¹º ¨�¡© ��§ »­�³¹º ¨�¡© ���¼»½~���¹������������~�����¾�������³�����¢���������������¹}¢��{�����«��������� ½�����������±���������½������~�����¦�������¿���������� À������¡¼©µÀ������¦°��£�������Á���ÂÃ�}Â�����£�¤������{�����~���� ¥��������¿���������� ¦���������¤�~��������§µ¼¼§Ä����¦�����Ä�����¦����~������{�����~���� ±�����~������¿���������� �³ �����³ ������Å¿��¿�����Æ�����~����������°���������¢��°������������������������²����°��������������������������Ç����­����}�������

ÈÉÊË�ÌÊÍÊÌ�ÎÏ�Î�ÐÑÊÒÓÔÕÖ×ÓØÙØÚ��ÌÛÖÕÜÖÕÝ×Þ�ÐÑÞßàáÖÝÖ

â ��}��������§¼��������������³ ���¿��������� ����������������}����������������������������������~�� ���¤�������¤�~~���}����������|���¤�~~������Ä�����������¹ãã����������~~�������ã��������ã�����ã��¼ã��°�������~���������������������~~�������������������������������������������~����~��������������������°��¢����������������

äåæçèéêçäëçêìíäîéíéïðçñäëìòïóçéäëççéííäôæõèêíñéìäöïðçñä÷øùä÷úûüäýþä��������þý�þ�����þ���ä �������ä�ä����ä��ä����

�þþ�����ý����������ý����� !�ý���ä��"ä

Page 31: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��������� ����������������� ������������!"� #� ��������$���������������������������������������������������%�������������������&������������������������&��'�� � "��'�� �����������������������()���*����������������������� �������� ��'�� �������� ��������*��������� +, -��)����������������������������� ���������������$�����������������**�������������������������������������������*���,������������������ ���������� �* ���./����������������������������� ���0).������������������ ��������*123134��������*������������������������������������������������������������������ ���������������*�5���������������6��������������� �," ��/*�����������������������5�������������������*����*7������������������5������������ ���������������������������������������� ��*�������7�����������������������������6���8����������������� 5�������������� ��* ��� ������ ��� �������� �� ������*����*�����������������*����������������������������*�$�����������������8����������������������������������������������*�������*���������������9������*��������:;��<����� ���������������*������������ ��*���������7������������������6�������������������� ���������"","=��>����������������������*������������������������*�������������������������������������������*��������������������*��7*��������6�����������������������������*���������������������������������8����"?,"-�������@���*�����������������������������*�������������������*������6�������&�������� ������� ������������������*��� �$���������������6�������������"�,+#��>��������6���������� �������������������������������� 123134�'���8������*���� ������� ������ ��� �������� ���� �������������������*���������&������������������������*����������������������������������*���������������7����������������./� ������������������������������������&�����*7����������*�&���*�����������!�.��������� �%�����������&�����������������������&�����������*���������0).�6��������&����������������������������)�������������������������������������������8��&���������&�����$�����������������������������������&�*�����������������$������&������������6���������������������� ������� ������� �����������������������������������8�������������������������������� ���������������&�� ��������������$������A����������� ���� ����������������� �������*���./����������������������*�����$�������������������,������������������� ���������7�����������������./�������������������

0��������������������$����������������*�������&������������������������������������������*��B"�������������������������������������������� �* ��������������� ������� &��+������������������������������*�+���%:��+ �+"�&����&�������������������������������������� ������ ������ .;()C./�������������* ������������ �������� ���������������>���������&������������������������&���������������������*��������*����;�!���������@������&����������� �� �� � ������������� ���8� ������������ ���������������������������� ����������$��*���������������������������������� �.;()��������������������&������������������������ ��������������������������������������*���*������������������()����������DEFGHIEJKELMDGFNOMKPQRSTUUVWXYWXUZS[YZU\X]YT Y[Z[ST����6�������� ��������� 6!�.�"6!�.�=6!�.�!�.���� &�!�.���� _ "a ���!�.���� b���� � ���� ��������� ��� �����* ��++�+=�� !�.���� _ "aCb��&������ ����� !�.���� b���*� ������6������.;0�:����;"; "�*����������&�������������:a: �����������&��"#c ����� �����������?#d�C�������*���������� ������6���������������&�����������e�����8��������������(������d��������%��������������������������*�6�����������������������*��������������;�����������*�6���������������������������������������������������������������&������&����+#�=#c ���5����������������&����������������������������/���0�������!a(af��0���������������������������g������������;����&������ �������� � ������ ������������ �� B=#����!a(af�����������������0).�6�����������A��*��������*�6�������������&�����������������������* &��������� �����������*�������� �������� �� �������������������������*�6��������������&��������������������*7�����������������������*������5�������������������������� ����� ������$�������������������*?) #�_������ �����*����������������������� �������� �����"��������������������� �����������&�������������� ����������� ���$����� �� ��@��� ���6�����������!�.���� ����������������������������*:�������������������*������� ������������������*���������7���������������5��������������*��P]hR[UT\iTVXjkVll[XWm[WSTUYTXYTUZ\VXVXj\X]UZS[YZ[ST]V[lVX\ZVWXlVYSWUYWRn;���������*�6��������!�.���� ������&�����������(�� �?f����������� ��������:��������������������������*��$6�� ��� ����������7�� &�� ��������������������������������������� ��()�?d:?����*��"g����6*��������a�'�&�������������&������� #��� �����$6�����a���������.;()&��5���������*������������&���������������

o pqrst1rur1vwxtwtyzr{|}~�������������������������������������������������������

���������������� ¡����������¢�£�¤���� � ����¥�

Page 32: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������� �������������������������������� ���������������������������������������������������� !�"������������ ��# $�������%&��'��(����������'��)�**+ ,,����������&��-$������ �)����*�.�%/�0 '�������������� !�������1��������������� 2����.-�)�������3��45�67 ������������ �1��� !�"������������������%7 *���89�� (9,%����������� �7 ��#+ ������7 :�-���������%�����'�����������������'��)6�8�� 3;-���������-5-()���������� ��� �������� �� <�����)���� <�����=������������%��-#!7 '��(��4�������������<�����+7><� �((�������������������� �?��((��'��)���@8% �:� �����(� ��� ��������� �������"� +���(���;�������!!A�5/7��� ������� �)�������������� ��; ,,�������������������%#��������������������� #!����������.�'�����?�����'��)�1-���������45������'��)���'#!������(��(���� �()����;��������%*)�#!��'����'����)�����(������������������������'��)�)������(���B��������������(����������4��4��������������)���4�C�D> %���4�'���(��.��� �((�������������������������(��-�������������������.'��)�������� �;�������������4E5������������� 1������������4E����� ��%!�����4��� �)���44�����������)������'�������������'��)���������(����������������4���������������������-����� '��) �%56� �������� *����#(��. ����� !�"��������%FGHIJIKKLGJMNOJNPQRSTUVRSWGWRWGHIXYZ[RSRKQOGO=�"����������������D����(��������'�����(������(��4���������0����\]_ <�>�(���������������-���(�'��)�����������D�� �)��� ��������������� ���.��/�������������� �� �� ���� +����"�����"����� ����� a����� ��� ����� � �@8% :�����-�(��)������������������������"�%*)������-���(� '�� �?��((�� '��) � )����� ��"�����������)�����������bc�%������()����'����������'��) ,,������������-��������������������%���4���������������'�����(��������������'��) -����������(�);�4������1��45�@5�(�����;�(������1��4��� ���'��)���������"����4� ��%���()���-�����)�����(��������;�)������)�������;��(������'��)������)�4,d�6�;'����)��������"���)���������)��4�4�)��"��-�)�(���������%�)��������)���'��(��4�����������'�����������'��)�)��������-�(������������B���� �+*���4�)� ,,�� ����)�� ���������������� ��e ������������%*�(������;5�(�������)���b,�(��������)4�����'�����������4�����)������%!����������;�D����(��������'���(��-4��������*�##���+$#���4�������������������������(� =�������������(����������������(��"�-�������������� �%��������������;�������1��������?���������"��"���-������'���(��4����������������(���������'��)!����f )��(A88���%��4�%��)%��"8��8� ����� � ��� �4���4-��"���(��������4����'������������������/����%����������(��"�������)�#�((���������7��)��������#�((���������������# %

gRWhILRWGJRKLNTIK*)����)�����������������������������������4���)�.������ (��������� 4��� ��������� ��� �������1���D������������������������(����������((����)��� ����)������.������ (�����(���%*)� �����4����44�����-�����(��� �D��;�%�%4�� ��������� �)����44������)������(�����)���)��������������;)��(��"������������������� 55;��%� �����4����44�����-���(����D������"���(�����)��'��.���������������������� �i���������((����))��������.���� �b�%*)�����������������������������'����)����������)�4���������4�(������'��)jkklmnjonlpqjormlpkojposlp���tnkklmnjonlpqjormlpkojposluu%������������������)�#�((���������7��)���;�)�������-�����������������������������������(��������������4����������������44���������?������� +�/��')����(������slp����ruurmonvrjkklmnjonlpqjormlpkojposwlp%*)�+�/������"������'%C)��������(�������������B������)����(����"�������������;4���(���������44����)����) �)��������;�)���)�������)������������%7�"���������'����)������)������)��������)�������������������'��)�tnuuxknlpqjormlpkojpostnuu%!��"������(�������)����������4�)��������������������������������4�������(��������(��(����%#���)�#�((���������7��)���4������������)����������4�)���"������4(�������%$����)������������)�������������������������)�"������������;����)���4�������4B�����4�����������(�����%9����;���yuqrrz{;yuqrrxpz{;yzlxptz{ ���yzlxptxpz{�������)�4���������4�������)��4�����������(��������� �)� �����)�� ��� �������)�� ��������;��������'��)���(���������������)��(����������)��������%*)���4���(�������������(��������)�)������4�)���������4����%��B��yuqrr|yuqrrz{}yuqrrxpz{���yzlxpt|yzlxptz{ }yzlxptxpz{%*)��"��������������4��-�����)��(��������������������tyuqrrz{to |~swlpyuqrrz{}sluuyzlxptz{}stnuuuz{yuqrrxpz{~ ~uz{� �yuqrrz{� �� ���tyuqrrxpz{to |~swlpyuqrrxpz{}sluu~yuqrrz{ ~yuqrrxpz{~yzlxptz{� �~stnuuuz{yuqrrxpz{~ ~uz{� �yuqrrz{� �� ���tyzlxptz{to |swlpyuqrrz{ ~sluuyzlxptz{ � ���*)�����"������"��?�����| yuqrrz{}yzlxptz{� ��uz{%*)������'�������������)������������1�����(��������������������)�#�((���������7��)�������((����)���)�"�������������(���������%*)�����(������������)�������(��4�������(������4������;�%�%�)�(������������������������������(�������4�����(����������������(�������4����)����(�%*)���(������������44��'��)���(������)��4B�����4������������)���������������)����������������������)�������%����������(�������'��)������������������.������(��(������������)���������7�%

�xm{rnm�mntk�rkrjqm������ ����������������������� �¡�¢�£¤��¥¡��� ��¦§����©�ª«¬­

¡��§®���° ±² �³ ¤�����° �µ¶ ·�� �³�³�²� �

Page 33: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������������������� ������������������������������ �!!����������"���� �����#$��������������������� �����%����� ����%&'() �*���������!+,���# ���������##��������������! �!!�������� ��%�������*&������������ ��%-����#�� ��������#�$���#�� �!!������!##����+,*.������������/ �#����!$������##0 �!!�������� ��%�������!����������!��������1#��#� "�����������2345554/6 7*&�##�1 �8��9��:��4��� � 9��:��4�:�������!������!�0��-���� �������������#���� � ���#���� �������1 ��������;�#01 "���9��:��4�<9��:��4��� =9��:��4�:��� *>����<9��:��4�?9��:�������!�����!�0��-���� �������"�����������##��� �������*&���������1 �����0@A��4�� @���4������������ �����������������������-�� ��%�������+,*����1������;��0�� ������� �0�9�B������ <C9�B���� D /�<3@A��4�=D /�<3@���4�9��:��4���=@�������9�B��:���C 3C���E F9�B����G H4 EIF�9�B��:����� <C9�B��:���D /�<3@A��4�=D /�<3@���4�9��:��4�:���C@�������9�B��:���C 3C���E F9�B����G H4 EJF�9��:��4����� <@A��4�9�B���� C@���4�9��:��4��� 4 EKF�9��:��4�:����� <@A��4�9�B��:���C@���4�9��:��4�:��� 4 ELF"���� �<345554/* ��� M��������� ��������0 ��N< 9�B����=O/�<39��:��4���G H?���*PQRQSTUTRTVUWSQUWXY�����������#� �#��������;��#��$�"��Z���� �#��������@A��4�1@���4�� @����1��������#;#���N[19�B����4[19��:����4[ !������������N19�B����19��:���� 1���*� ���!���������1��!�#���� �������1��� �������!�0���1���*\�����������#�!!��1��������� �� ������ ����%����#������"��������-������1�����������%!�#���������##0��!��##�������$�"������#�����#0*]���� 1���;#���"���8� �!##"�Z@����� ���"������������##0 �������� ����.���#������0��#�._1&�%���a� ��� ���-�#�b��� ����������;��*�����##���@���;#��"�����[*[[c�������'���#���������*N["�������d�#����8���;#��!���&'()���;�*9�B����4["�����d�#����N[*������������������#�!������������������@A��4�<@���4���3C9�B��e f?9�B��*.�������#��!������!##�������%;���#��"������ ���0#����d��������-����*���g\h��3�i�_�� ��i�j�"����������##0�#;� "������h�#��������"�������#��%��[*[_1"����������� � ���-8!��!�������;��������;#*(##�!�"��"�"��������'�'\�;�#�����,�����1�[331'&�� ���!�.�������#,������%1k����1(������*

l�������� ���� �#��������!����&'()���;�������#0� ����� �����������!����;��!����������##�0�#������ \���3��������!���-"� �*&���� ���#���������������1������.���#������0+��� �*mXnTopqXWpT]� ���#0���1"��������� �#�"��� �!!������������!+,�*a��������� �#�������� 1�����-�#����!���+,�#"0�#� ����������#����d�##0% 8�*r"�;��1���0�$"��������� -����#��������#�!!��!���#���#�+,���"����������;� ������%!��� �*(�8���%#���1� �#������������#�$����($�$���!��������������(],��_s����� ��������*]� �� ��#�����1�"�;��1��� �!!���������������d��� ���� �#�!� �!!������ �#����0���##0��##"��%���������� �� �����*a�����!���#�%�������!� �#��-������1���(],"�##!���!;�#���+,�#���%�������;����!������;��0���;���������� ������� �0������#� � �#�*&��������1"� �;�#�� � �#��#�������������������#�b�����#���0#�����%���#0� �������8������#�����*\��������#��;�#0��##���������&'()���;���&�%���_a� .���#������0&�%���.t�1"� ��������;��8���� �*������������� ��!##"�*(���#��� �����'���#��������1�����������+,���!������ �����%����� �������" ��������;����#��0�#�����\+,��� �������#0������#��0�#���,+,�*������;��!�#8##�������#��Z�3�]!\+,�,+,���������1���!�����9��:��!��� ����������# ���;�������������# Z9��:��uv��:��5g����"������\+,�� ,+,�� ���� � 1� "�������+,�!�����&'()���;�*����" �������+,����# �!!����������##0������� ������������*]����� �#"����"\+,����������������# �;�@���4w/x3C@���4w/x�@���4w/x� uyw/x�@���4w/x�C@���4x/x@���4x/x uyx/x5g����"���"����������!!����;�������!\+,������*�_�(�+, �#0���#0��������������� �#�!����������������b�Z�w/x39��:��uvw/x� �w/x�9��:��uvw/x� �x/x9��:��uvx/x5g����"���"����������!!����;�������!\+,������*l� ���;���������;#���!�����;�������# ��0�#������#0���z������.���#������0+��� �!� ���#�� ����#��*&���������� ���;�1"��"

{ |: ��� } ���~����B �����������������������������������������������������������

�����  ���¡�¢£��¤¥�������¡��¦ §�����¤�¤�£��©�

Page 34: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������������������ ���������������������������������������������� ������������������������������������������������������ � �������������������������������������������� ���������������� ���������������� ����������������� ���� ��������� ����������������� !"������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������� �������������������������������������� ������������ �� #�������������������������������������������$%&����������������������������������������� ������������������������������������������ ���'()*+,)-./.001234560789/1.5/3:82;.<=>456?@6:A4158:B@C;40.D0C./19/24BE.215E:8>5A2FG�����������H���� ����I��������������������� ����JK ����� ��������� ������������������ ���� L�& �������M��� ���� ����J�L�&K����J��"��������K����������J������������������� �L�&K����JNJOPQ"������ ���&R� �O"�����J�������������������������������������������� ������������������������ST!ITUJ�L�&K����JV� "� ����J�� ���������������� ��� �������� �L�&K����JNJOPQWV� "�������J%"�����������������������������������������K�X������L�&K����J��������������&�Y%���� �� ��������� �� Z��������� ��������$�&K&�Y%"�� ������P�JP ��� ��������������� ��������� ������������� ������ ������������JR"�%���������������� ��O"�L�&K����J����K�����H�����$�&K&�Y%�$������� �������K�����H��������$����������������� ����������Y% ���������������������������������[�"�����������\�������������� �������L�&K����JNJOPQWV� ��������������� ������������������������������������������������������������ $� ����� ����� L�&K����JV� ��������������$� ���������� ����� �����������������]���������������������L�&K����J�����������������������&R�K����������������� �������������������������������������� �����������JR� ����������������� P"�%�������������������L�&K����JNJOPQ���������������������� ����������� ���� ����� ��������������[� ��������������� �����O"����������������������������&R�K�������������������&�Y%��������������������J����K�H���������� ����� ������������������������K������[������ ������������������������������������������������K��������������J�&�Y%�$������������K����������#�K \� �#J�#P"�G��������� _K��������������������������������#�K \� �#!"��������������������� ��������������������J����K�H�����������������������������������������

�������P� ����������������� #"�\���� �����L�&K����J�� �������� �� ���� �X���� ����������Z������������ ������������&�Y%�������������������������������������������������������������������������������J������XK��������������� ����JUU��" �������&�Y%������\�������������$� ������ �������������������������������������������J�������P%"�\������������� ������������������ ������K�����H���� �$� � ����������� ������ #%"���K������������������K�������������������������JK������������������� ��T%JU������������������H������������������������������������J������ �X������ ��������������� � ���L�&K�������������X��������� ����������������� #R"�%��������������L�&K����JV� �����������K�����H�������&�Y% ��]�$� ����������������������������������PR"�L�&K����JNJOPQ��������������������������������������������������K������� $� ����� �� ������ ���������������������������������������������`�������������������������� ������������������������ ����������������� K����� ����� �������� ������ � �������������� �[�� ����������������� #�"�&��������������� ��������� TK�������KPaK��X������� � ��K������� ����&�Y%��������������������� ��������������� &R� ����� ����J �� �������������� �[��������P�"�[����������������������K�����H���������V� ���������&�Y%��������������������� ����������� ���� ����K��������������������L�&K����JNJOPQ�����������L�&K����J��"�������K��������K�����H�������������� ��b�������������������[��������������]������� ���������������I����K���������������J����������$%&]���������������������������������L�&K����J�������� �������� ��������K ���������������������K���H����������������������������LJ����� ��������������������� ��������LP�����������K���������������������������� ���������������K����������� ����K��������$%&��������������������������������� ����������&R�K�� ����I����������������������������������������#%"�����������������������������������K��������$%&�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������H��������������� ��� �����K������������� ����������������� S"�\��������������������������������X����������$�&K&�Y%��Z��������]���������L�&K����J��� ����������������� T"�[������������ ��������������������������K�X�����$�&K&�Y%� ������������������������H������������������������� ����� ����� ����� ���������� L�& �����������������������������������������������H�L�&K����JNJOPQ �� $�&K&�Y% ��K�X�������� ���������������������� ���������c���� ����a�cLJW���LPa���������������"� ����������������H� ���K������� �$%& �X��������� ��JUIPU

defghifjfiklmhlhnofpqrstu vwxywz{|}~��|yx~y��|��|�y�~�w��~{��~{w�{w���|�w��w����

�yy����{x������������{x����������{��x�~�w����w

Page 35: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������������������� ��������������� ������� ����������������������� ������������������������������������������� ������!������������"#���������������$�!�����%��������&��������������!�������������'(�)�*����&���&���������������������!��������������������� �+�,-+����������&��(������( �������� �+�,-+������ ��������.�+%����������'���������&�������������������� /+�,-+���+0������1����������(�)�*����2�� 3�4$����!���������������� ��������������� ���������������������������1���������� �+�,-+������!���������(�)�*����&���(������( ����'�� ����� �����������������������5����6����������+$������������������������������� ������)�*�����$�����������������������6���������������������5������������ ���� ��*�������������������������+7�8�'&� �������� !�� ��� �� �������'(�)�*����2�� 3���(�)�*����4$�'��������������6������!���������������������������������+%� � �������&�� ���������������������(�)�*����2�� 3'��1�������������������������(������( �������������������&�� ��������������!������'&�����������������������(�)�*����&����������� ������!���� ���� �� (������ ( ���� ���� �+�,-+ ��������+�,-+������������&����������).79 ����������������������+%����������'��������������� ���������(�)�*����&�'��1������&����� ������������� :+;,-+;��'�������� ������!����������)�*����!����� !��������*����&����������������+<�&����'���������&����������&�����������&��������&��������������������'������� ��&���������������$�����������������+.������� ��&���������������&��(�)�*����4$�'��������

=>?@ABCD*������������������!�������������������(�)�*������������+�E�*����������������� �7����������� ��������������������� )�*'$�����������.FF.���6� ���G���������'������������.����������������������+$������������������ ���������� ���������� ������������������&������)�* ��������������������&����������������������(�)�*����2�� 3�+9��������������������������$��������(�)�*����4$��&��������������!��������������&�������������������������+�������������������������� !�����������&�� ���������(�)�*����2�� 3�4$��+(�)����������������������������!����� �������+�H�������� ���1������������������(�)�*����&��������&������������������������������. .� �������8������� 0�)�).79�����10�+%�����������'(�)�*����&������������0�'&�����).79�!����� ��6����(�)�*����2�� 3�����������������!�������� �����������+(�)�*����4$�����������������&��0�'!��������������������(�)�*����&�+%����������(�)�*����&�'(�)�*����2�� 3���(�)�*����4$�������������� ��0���������������� �<.'����� &����� ������������ ���������!���������!���������+(�)�*����2�� 3�4$���������!��������������������������� ������������+����!��I:J�+

K LMNOPQNRNQSTUPTPVWNXYZ[\]_abcdefgc_eghchicjkelmnebokebjbpqfcirstuvw

kqxyyb_fzj{|jf}~jnfb_igzjf�y�j�bij_}e}|fj�

Page 36: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������� � ��������������������� ��� ��������������������������������� �������������� !"#$%&��'( ���������)����������)*�� �+�������� ����,-,�-������.� ���������������/��)�0����)���������� ��������������)/�������1�)������������)�������,23 � �4�������/� ������)1��/�����������)��.�����������05������ ��������� !3%���������/����������*���� ���01������ ����0/����,23 ����)�6-77�� /�)�������/��������� /���)�����0���8�)�3�'���������� �������� �������� �)�9, !�������:� �/���)���� �4���������)������&% 3�����,23���1���);�����)����� �������� ����/���0���� � ��������������������!������-:� �/���� �4������-��)������&% !<%���������=>�� ����0���������*��/����,23��;�����)���)����)��� �������� �!������1�?1-��)� �4�������&?@% 3���� ����))������ ��������5���1���������� ���0�5���0)��� �1��)������������1��8� ��) !,%���������A�B-C)�������� ����0���������*�/����,23:1���������������/����)+����� ���������9,!� �/���)�:������&��)� �4������D% 2��������������)������)��;�����)��� �������� �!� �/�:������&��)� �4������B% !E%3))������� ������������1�����/����B7����C)F ����� �� 4.����� 3���������������������/���)���������A�B-C���� �������� ����������)����,23������ ��� ����)�����1�8��C)F���1���)���� ��������5��� ������!������:� �/�%:/�������1���):� ����1�0���0�� ��������)�� �������� ������� ������5��)�����������!������:� �/���)�% ����1� �GDH���)�H�!������%

IJKLMNKOKNPQRMQMSTKUVWXYZ [\]\_abcdea]cefafgahicj\klcmic\h\nodag\pq\rstu

iovww]dxhyzhd{|hld]gexhd}w~h�gh]{c{\zdh�\

Page 37: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������� � � ������������ ������������������ ����� � �!"#$��% ���� � ��� ���� �������&��%�� '(��������������� ��� ��� ���)� (�%�����*���+����������� ����%'!,����-� ./0�!"1$2��� ����� '� ������%��'���� ������� ������ � ���������'���� �*��!3(����� ���� � ���'������%����� +��� ������������������ �) �����"�$4��������%� ����)� (������� ��567"-$4������� �83,"�$���������� ��567983,"�$!������� �) �������)� (������������:� ����(�)����� �������-��� '���%� ��)� (���!3(�������� �) ��-��� '��� ������ �%)������� �',%(���������� �,%(���!3(���-��� '��������� ��567����"�� ��6$����� �',�����"����������� ������:� ���4%�����$������� ���� ���� �������� �) ��"�� ��6$�����!;��� �,%(���4����� � ��'��� �������-��� '���-�� ����� -� (4������� ��567���������� �83,� �� ����%� ��)� (������� �) !<��� �4���%� ����%� �-����� ���+��� ���4-� (� ���"�� +* ���4�� +� ��*�$� ����� �'����� �� �� (�� �(�%�!;��� �',%(���4 (�=>?@��������� �83,�� ��������%� �� �������� �) !������� ��567983, "����� � %(���� �*��4%�����$���%��'�+��� �������� ���� ���� �������� �) �������)� (������������:� ���!�� ��� � '4� � -� �� ���� ��(� �4- �(�)���,%%����� � '��* �,5!"A$B���� ������ ����� '"=>?@$�� � ������� ���(���� � ������ �- ���%� � �!7 � -� � �% ���� ,72!

C DEFGHIFJFIKLMHLHNOFPQ@R>STUVTWXYZ[\]YVU[V]Y_YVa[bTcd[Xea[XTXTfg\Y_ThiTjklm

aVVgnooXU\pqr\std\XU_]p\uovwX_Us[sTr\xT

Page 38: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� �� �� ������������������������������� ������ ���!� �������� ���"#$�����������%����� ��&%��� �� �� �����������#�� ������������ ���!� � ������������ �!�� ������ �������� �� !�' � % � ����% � ����������������(�� ������������ �������������%������������)*����� � ������������! �&���* �����#�� � ������ �� ��������' �� ��'%��"#$��!� ��)* ���������%�'�����+� ����������%������,���� +������ -� ���$�!��.�������������!�' ����� ����/0����� ��&%���������� � ����'���1� �� !���! ����������!���������2 ����&�������3452 �����%������������� � �� �������!��� !!�' ����� �����1�����%'����$�!� �1��1�� �����1���� ��!���6 ��!� �� ��� �� �� ��-%!� ����� ���������!����% �'������ � ��'���1� �� ����� ���� ����������� ����������-%!����� ��!�������7897�:;� ���! !��%������'�������,�(��<�!��� !!�' ����� ���3�2����������������$�!�!����������� �������������' � %��������� ������� ����+� ���%��� �1�� ������������%$�!�!��������������1������!���6��!� ��78979;���!��������� !�&�������� !!�' � -� ��'%*)<"�� ���'�& �� � � �� !����� �!&'���� �� ' �� =&�-�&�>&���6%�% � ����������������!����% ?���������� ���������� ������%��@������!��� ����'���1���!��� !!�' ����� �������!����'���!� !!�' � -�� ��'� � � 1�� �'�� �+� ��� ��� � �A*"&$�!��'� ��������%���% !!�' � -��� � �(�,�=! ������������ �������� ������3(2! �B����������'%A*"&$�!�C���D�A*"&$�!�E ���� A*"&$�!�C���D�E � ����% 3��2 �B���������!����%* �����F��.�������������"#$����� ���!� ���������%��!� ��� ����% �1��1�� �������,���� +�����& ���$�!�� ������������� -� ������ �� �������'����!� ������ '�������������+� ���%� � ��������% ����� ��78979;� ���� �������6������ ���� ��"#$&��� ���!� �,!�� ���' �� �� �����%�����������������1����!������� � ��������%� � ��������GHIJKHLMNOJPHIQNRSTPRUIVLPJVWXYZ[\HKSMVPKH]PJHIOHIQLPTWWJWTIOOHRRVWHNIULNV]PJOO_ITMHLW.���6�������������� -������� '� �����"#$&��� ���!� �,!�� ��� ����� ��� �� �����������������%��� ��!������� �� ��� � 1�!������a�������� � -��!���!� ���!���� ����� !������� ������� �'����'%������!� �������' �� �������� ���� ���������%��������� ����� �����!�������'��������1�������� ���&� ����* �������������������������������� ��� �� '� ���' �� ��� ����������%1�� �� �� ��&�������%�������������������������� �� ��&����������� � ��������� �!�� ������� ���%����� !��� �� ����� ������' �� ����������������& 1��%� ����� ����!������ ������� ���1�����%'������� ��������% ����� ���* �����<�������

��1�����!���6 %����'�%���������!� ����*)<"����%� �'���������������� ��&� �� ��!�������=,�5�� ������������� ����������!���!������������ � � � -�&��� '���� � �� �� ������ ����� �'�����6��� !���� ����&�������'����� ����� ����������������� 1�� �� '� ���' �� ��� �� ���������%���������D�����������1������������ ������������&! 6����!�������� ����� ���%��! ��������� �����' ���� ����' �� �������������(��� �� ��� �� �� �������� ������ ���% !������������� ������������� ����!�����!����������� �� ����� ��� ��� �� ��&�������'���1 ����5����� � � ����������$�!��������!����%* �����5�� ������6 !����� �� ��������� ���� ���������� -�&�������������� �������bc7dd����!�����������6����������!��������'�������'������������'����������������6 !����� �&� ��������� ���� ! ����%�����!�� ��(F��* �����<e���?��� ������ ?������� � �� !��� ��6����������!�����������!��*)<"��� '�� ��!������!����A*"!���!����� !���������!��������%��1������� -�������������!�'�% ��� �������* �����#�� ��bc7dd1�������������� ������ -��A*"&$�!�����6����������!��bc7dd1������6��� &!�����%����! ����������������������� �����!������ ���� �����6����� ��������� �����1��* �����#���������!����% �'������.����� �������!�� -�� *)<" ���1���A*"&$�!���������� ���� �����������!������������%� ����%� ������������ ������������&! ��'���1� �� !��@��������%� ������������ �� ��� ���<���� ����'�1��� �! ��'��� '������!������ ���!���������� 1��% �1��1�� ���1������!���6��!� ����� ��!��%�������������f897�:;!������!�����1����1 ����%��!���������������������% ����� �����!��$g? �����! !��%����$g< ����������,��! ����h�A ���,�(�� ���������� ����� ' � %��������������� �1�� �'����� ��� -�'���!���+6��� ���� � ������b;dd�� � ������ �����������h?h�<�������������������� ����b;dd1������ ��'�����������$?h� ��b;dd1��������h?h����������'�����=�B���� �� ��� 1������!������ ����� !�����������#%+6 �� ����1� �������� �����������!��� ����+ ������������ ������������������!'����������!���� ����!�����������+6����'���������� ��dij����6��� !�����%����! ���1����������*)<"�6��� !������?��� ������?�������<����������� !�����b;dd1�����������$?h������� ��� -���'�������� ������h?h�����$?h����������!� � ����������!���������dd:kk��<������ � �!���� ���������� ��������1������������ �������6��� !�����%��!� ������&���������������� -� ����� ����� ����� ��� �� ����� ����!������ �� ���!� ������� �� ����������������������1 ������%� ��������� �������'�������� ������!��$�!���� ����� ������������������%����@�������� ������ ��!���!����!�������� �� �6��� !�����%

lmnjk7non7cpqkpkr:nstuvwx yz{|z}~������|{�|�������|���z���~���~z�~z�����z��z����

�||����~{������������~{����������~��{���z����z

Page 39: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������������� ������������������� ������������������ ��������� ������������������������ ������������ ������ ��� ����������� �������������������������� �������� ���� ������� ����������������������� ������ ���������������� ���������������� ������������������ ��� ������������� � !"#$%&$"'#()*+,*)+#$)-,%#()./01!"2342,5!$"65)2$!#)27$"2$"'7&89:.5,2);$"'<����������������������������������=>?@������A=@�B���C����������� �=������=>?@������������������ �������������������D���������� ��������������� ����� � D���� � ������������ ����� 8$' +)EF>���������� ����������������������������������GH ������������������IJKLL����A=@���������� ������� �M:N��������������������� ������������������������������ O������������������������� ���������������� ������� ���������������� ��������� ����������������������������� ���� ��������������� �=��B���C������� ����BGH MBGHC���BGHP�������������������� �������N������HGHM��������N���������IQLL�G����� ������������������ ������������� ������������ ������IQRSK���IQLLSK��� ��������T��������������������������������������LUV� �������������������������������������=>?@ ���� �G���������������� � ���������������������������������������� ���������� ����IJKLL���� ���������������� ������ ������������������������������������ �����������������������������������������@������������������ ����������� �� ��������������D������ ���������������W�������������X�������� �������������M/NY�����������=>?@�����������A=@������� ����A=@������������������������������������ � ����� �� ��������������������������IJKLL������������A=@��� ����� � � ������������������������BGHXHGH�=��� ��� ����� ��������� �������IJKLL������������ �����A=@�B���C� � �������� �������������������� ��������M�� ���������N�

Z[ \]V_K`KJab_a_cdeSfghijkljmnopqrsolkqlstotuovlwqxjyzqn{wqnjvnj|}rouj~�j����

wll}���nkr�v��vr��vzrnkus�vr���v�nuvk�q�j�rv�j

Page 40: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ������������������������������� ������������������ ��������������������������������������������� ����������������������!���"�����#�������$��"% �&������������'���&()* ��������#������������#�����������#����$���������#����+��������������������������������������������!�����#� ������������������������������������������������� ���������������������������������������������,�����#��������������������������������#�-��������������"�����#�����&� ��". �����#���������������������#������,���#����/�������������'�������#�������������#��012345��/����������������������� ��������!������#������������������������������ ���&� ��6���"�����#�������$��"7 ����������#��������������&()*#�����'#��������8&*#���#�������#���������������������������� ����� �599: �������� �������#���&()*������8&*'����#�����$����;�������$���� ����������<.5: ������#�����������������#�$������=>: �?���$������0123����#������������������������ ������������� ������������������ �8&*'#����#�@�����,������ )����!�� ��� 8&*'��#�5 ���������� ���$�����������#��������������5@A: ������������� ��������������#��������������������������������������������������� �B���#�����������!������������#���������,�������� ������#�����������!��C���������������������������#��������&�8&*'��#�5���;������ �������85�����8%���#������D���������#������� ����������E>9:���������������E5.: �����������������#�������������#��0123E>� �F�����"���������$���������� ���$��� �� EA9: ���� �� $����� ���##�$���!��*�?)��#����� ��������������D��G�A. ����#�������������#�#�����������������������0123E59���� ������ �������� ����������6G:������������ ���������������F�����"��������������$�����������#����������#����� �����A>:�F#��������������#��������� $����� �� �H� �����#�����������#����������,�����������������I5>:�������������������$��������������#���������� ������5I0123E59� ����������������%>:�������$������������ ������ ������%I0123E%%� �)�5>@%%: ��������������������D�������������'���������������������������������� ������������� ����8&*'��#�5��������������������������������������#�����������F��������������#�����������$�����������#��&()*����������������#���������������������������������������������� � �������������� ��������#������#�5��������������?'��#������������������������ ��������������� ��������������������J�&��#����69 �?���������#����������������D�����������8&*'��#�5���������������C�����������$�������������������������������#������������$�������������������� �����������������?)����#����$����� #�������$�������,���#�������#������ �&()*��������8&*'��#�5K5G%B#�������������#��������������������5������

��!�����#�����������������8&*'��#�5�������#�����������������������" ����5I59@5A:L0123E.� �F�����"��������������������������������#������� ���������������������%I%7:L0123E5.� �&�# ����������������������������#�5$����*�?)����������������������"���������������#�������������#��E59����������#������%9@%6: ������������#�5����$��� �������������������������$����� ������#�5�������������������*M���*�?)�����������#�����������������'������$����������������K5G%B�����#�������������,#�� $�����#������ $� ��'�##����������������"�����#�����&� ��"59 �F�����"�����������#���������������#�������������#������,������������������$����$���8&*'��#�5K5G%B����#����������������������������� �������*M����������$�������������#����;����������$����� ���� ��������"������H���������������$���������� � #�������� �������� ��#���� ����8&*'��#�5��������"������GG: �����6%: ������ ������������&()*D��������������$��#�����8&*'��#�5K5G%B�N�"����������$���������������������������� ��������������F���������������;'������D�������������������#��������������������8&*'��#�5����85�����8%�5.:L0123E>� �������� �8&*'��#�5N�"������"�������������#�������������������������!����$����� ���� ������5I79:L0123E>�6���#��������7.:L0123E59�������������� ����������� ������������$���!���������*�?)��#���;��������������������$�����"��#����#��������������������#�������������� $����� �����������������#�����$�������,�������������������F�����"������������������������������,���8&*'��#�5N�"����5IA9:�0123E.� ���#�����8&*'��#�5��������"������������ ����������������"��#���@#�������$����� ���*M�#����������������������������������"$����� ����#������������ �����������#�#�����������8����������-�������������������#����#�D�L�������������$���� �F����������$����� ��*�?)�����������#����������������������������������������������������,���� ����������"���������K5G%B#����������������������� �������5����%��$�����������$��������������#������������������������OPQRSQQPTUC��������������#���;��$��#���������� ������������@���������� ����������#�5$�����'���������7� �#� �� �&()*���D������#������ ����#������������������#���;����������������&������#�5����� ���!�#����� #�������� ��������$��#���������������������������������@���������� ��������"��������������$��������������#�5���� �������$������ �����������������H������������� ��$������������� ���'�������&()*��������������������������������������$����#�����������$����� ������*�������������������������$������� �������,��� ��#������������������;������������������,�������%A�65�6% �H����������#�����

VWXY2�XZX��3[232\1X]_ab ccdefdghijklmifekfmninoipfqkrdstkhuqkhdphdvwliodxydz{|}

qffw~��hel�p��pl��ptlheom�pl���p�hope�k�d�lp�d

Page 41: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������������� ������������������������������������������� ����������������������������������������� ��������� ����������������������������������� ������������������ ���� ����� ����� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ����������� ��� ��� ����� ��� �� ��� ��� ���������� � �������������������������������!"#$%&'(���� ����������������� ��������� ������������) �*���������+,-.������������ ��+/012���������-��������������� �������+345678����������-���������������������+).9*�).9:�9.9-������������+����������������������������*;;< ������ ��-�=��������������) �*������������������������ ���������������>������ ������������ ��������?���*;�+).9*-�����������������������������+).9*-���������������������*;< ��::<���������������) �*��������@�����+A;<-���������) �*B�@������������@�����+C;��A;<�������������-���������������������9D � �����������������+).9:-�������� ����������������������������@�� �������@������������������� ����������� *E��::�+).9:-��������������������:C��:F<��������������������������9.9�����>���/012��:;;�������������;��A�*<�G����������@H.�+I-���� �������������������������������������9D ���J9����������������������������>��.9+����������������99-�

KL M6NO1PNQNP82R121S0NTUVWXYZ[\Z]_abc_\[a\cd_de_f\gahZijakgaZfZlmb_eZnoZpqrs

g\\mtuu[bvfwxfbyzfjb[ecvfb{u|f}ef[yayZxbf~Z

Page 42: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������ ������������������������������ ����� �� ���� ��������������������������������������� ������������ ��!���"��������� ����#������ �������� #�������# ��������������������������$�%������ ��&����� ������������������!���������� ��'�#�( �� !������ ��������)*�#� ���#���� ��������+��������#��� ������������ �����������,��-��������������#����������+ �������� ���.������������# ���+ �� �����&����� � �������!.�������������������������� �����#��� &/ ��� �� ��/��������������+��+���# ������� ����%����� ���� ���# �������� ����#��� ���� �� ��������� ��# ��� ����0���������*��������%���� �����������#���� ����� �� �����#�+�#���%����� �#��� �������%��� �����������# �� �1�������� ��+ � ���������� ����������%�������������������� ��& �������� �� � ��������1����#��������������/���+�%��#������ ����2/2����� ���3���4566+ ���%� !������� �������� � �# ��� �������#������������!��&������+��+����� � �&��� �� �����& � �������& �##�������� �& ��+ ������#������# �����78%7������ ��&%�� ��������������#�������� #�����&3������������������� ���� � ����� �� + ��������#��� ��&����#������� ���)*������������#����'/2�� �����#�����&#��������������%����� ����������� ������#��� ��������������#�����*���������#���� �������������������/2%���������&� ��������# ��������#�� ������������&��� �������%#����&��� �������#�������������� ������# &� ���������/2����/ ��� �� ��/��������9����� ���������������#����������� ������ ��� ��+��&�������� ������%���&# &������������� ���� ���� ���������� ����� �������� ������#��� ��#����4566���� ��� ���������� #�������� �����������������#���� �����+ ��������������&���� #����������:��;���+�%���������&� #���� � �������������������� ��������& �& �� ����� ����������*��� #�����#�������� ������������� ���������#�� !���������������������3��<5=>?@A@B@ACD<EF?? �������'�#�(������������2G*����� ����# ������������+�� �����# &�� ��������������#������� �� ���������� ������� �� %���������������� �&�����3������# ����'�#�(�� �������������������� � ���������� �����������������������&����� � ��������������%�������� �������������� � ��# �����������+���� +�������������������� ���������3�� � ���������������� �������# &��� ���� �&��� ���� �����������&����������# �����# ��� ��� ������� ��������������# �����# ��� � ��� � �H�� �����I����� ���� H������I������������� ��0��&�������3�� ����������������� �� ��������������������� �3���������%�7%�J��'�#�(����� ���������������+��&�������� ��������������#����������������� ��������������!��2G*�K��(�9�� ��%'�#�(���� ������� +��������������� + ���&����������������������'G*#���&�� ���� ���%���# ���#���3�� ��� ���������� ����� ����$8��9��� ��������������#������ ��������#������������������ ��&�����������������

�����'�#�( ������������������������+���&� #����*�������#�� ��������#��������������������#���#������& ������ ��������������+ � �����&��������������� �� ������!������ ��������������#������������%� �� ����0� �����������������'G*� # ��������&��� ���������������� �� �������� �+ � �������������������������� ��#���&� ������+������� ���+���#�����������%���� #���%���1� ���3� ��������� �� ����&�# ��2/2 ��+����������������;���+�%�&����# �������!������� #������� ���)*���+���� ���&%��� !����� ����������������������� ��1� ����&���������� �� �������� ��&%����������#��� ��)*�� � %��� ���+������������ ����!������� ���.�������&+ � �������45= ����;���+�%���#������������ ���� ���������� ��������� �����������&������������������������������ ���#��� �������������&�����+�������� ����� ����#�� ����� ���+��#����#����#������'������������������ �������#����%�& ����� ��������#�����%���� ��������� �� ��� ����������������������������&��������������&� #�������������-�� +�������� �����L' ������ ��# �� �������&��# �����+��+��������� �� ������������� ���������'�#�( ����������������� &������#������&������#��%�������#�� ��������������/2��� ��������# �������������������������# �����'�#�(�9���������&%��1� ���3�������#����&������ +� �� �����������������+� ���� ��# ������MN������������� �+� ����L'%���� ����������������� ������������������������ ��#�� ���� ����������N8 ���8O�9� ���� ���������+�����������%�������� ����#��� ���������� ����������2G*���� �������������� ������'�#�( ������ �������������� ��������3�����&��# ����� ���'G* #���&� ���� �,��9� �������%��� +��� ������������������������������������� ��# �������� ���/2� ����&��������� �� �� ��%���������������������# �����;2��������� �� '*�9 ����� ���#������� ������� ���%���������� ��������������L'�#��� ������������� �& �� �������� ��# ���#��� ������������� �� �� ������ � �&��������������#�� ���%����+�%������ � ��#��� �#����#�������� ����% ���������������������� ��# �� �����.���������'�#�(!���������� �& �� �� �����#�� ����������L'��.������������'�#�(��� ��� �������� �� �� ������� ��� ������ #�������������������� ������������� � �������� ��� ��#�����0�������������;����% ����� ����+� ���� ��# ��#�������� ������ �& �� ��%��� �#������� ����� ����9����� ����� ��� �#�����&�:0N(���� �& �� �������������������3������������������+���������/2�%����� ������#�������������+ � �����&%�������&��� ���������#�� �� ���P��������� ��%�L'�#��� ��������� ��� ���������2G*�� �������+����� �� �� ���;���+�% ����� �����������������������+�� ������� ���������������� �� ����+��%����'�#�(� �����# &��� �����+�����# � �� �� ��������3�%#���� �����#����%������ � ��� � ��# ��������3� ���� �� ����#��

QB<EDA<R<AS?TD?DFU<VWXYZ[ \]_abcdefgc_eghchicjkelmnebokebjbpqfcirstuvw

kqxyyb_fzj{|jf}~jnfb_igzjf�y�j�bij_}e}|fj�

Page 43: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ���������������������� ������������������������������������� ��!����������"�������������������������������������������������#����#��������������������$�" ��������������������%��� ���������������������������� � ����� �������������������� �� ����������� ����� ��������������#� �� ������������������������������������#����%����������������� �������������������� ������#��&��������'�� ���������� ���������( ��!����������������������� ����#����������� ������� ��! � ����� ���� ��) ������ � �������� ����%*+,-!*.!/0�%���#���������������� ��$����������������������� ����������%������������������( ��!����&��������� ��� ��!� ���#���� 12�� ���������������� ����������#�����)1��( ��!��������)1�� ��!�������������������������-3!0��� ��� ������ �� ������� ������������������������ �����-������� �� 1����� 30����������� ��� �&���������������� �������������������$�" ��������� ����� � ������������������������������ ������� �������������������� ���� ����� ��������4�������� ��� ������������������� ������������������������� ����� ������)����������5�������� ����� �������&�-�����%*+,��*0�� �������� ������� ������� ����������

6789:;<=�������������������������� ����������.���������������� ��!�21���%���� �������������������������������������������������������� ������������ ������)������������#���>'�������� ����� ����������?���&��-����%*+,��*0� ��!������������������ ��������������������������� ����������@�����������������������������A����-���0 �������������������� �������������& ���� ���� ������������������?������-����( ��!�����0 ������������� ����� ��������������#� ����� ������������������������������� ��!���������-BCDE ��)!�FGDE ���� ��0�������������� �����������-���������0�������������������?��H��� ������IJKKLM���������#��������� ���� ������� ���� �� ������������� �����������?���������� �������������������-N���������O0�� �������@����� ���������������#��������P �������������� �������4�������������� ��-��������0��������BQDE �������� � ��!�����������������#� ��" ���������@�����������-�������0�� ���������������-!$IJKKLM0��B!D�-!0�������������21�� ���� ���?�������������������� ��!�������������#������������-IJKKLM0�� ����� ������)�����������������#�������� ��������������������������������������&�����#��#������������������� �������#���������������-Q0������������ ��&�� ���������5��������-Q�0��������������-Q�0������� ������������ ���� � ������� �������� ����� �������&������5�������� �������)�� ������������ ����������� �� ��?��������������������������������� ����� ����������������������-��&�����������0��������������������� ���������������-!$IJKKLR0��BQQ���#��#���BQGE �� � ��!�����1�������� ����������������� �����4���������������������������������������������� ��������� �������������&����������" �������������������������������������������������������#� ����� ������ ����� �� #��������������� �?��������-*0�� �������������������������������������������������������)Q� ��������� ����� ���� ��!���������������� ������ �� ?����������������������� ���������������������������� ��!-S0�T����� ����������������������� �����������#���������������������� ���������������������P ��� �� ���?�������������������������������������������� ��� ��������������������������H��

UV WXYZ[\Y]Y\_ [_[abYcLRdMefghfijklmnokhgmhopkpqkrhsmtfuvmjwsmjfrjfxynkqfz{f|}~�

shhy���jgn�r��rn��rvnjgqo�rn���r�jqrg�m�f�nr�f

Page 44: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ����� ������������������������������������� �������� �������� ��� �������� �� ��������� ������������� �������������� ������������ ����!"�� ������ �������������������� �������"������������!#� �� ��"���� ����������� ���������������"��������$ ��� ����� �� �� �%&����� "�������� �#�"����"�������"����� ���"�� ���������������������� ���������� �"� �������������� � ������������������ � ���'�!��� ���������(���������������#��� ���)� ���������� ������ ���*+��,� ��#����������������� ��������������� ����-"��� ��# ������������������������ ����"��������� ����)� ��� �� ��� ���!#��������"���"������������� ��"����������� ����������������������� �����������$ ��� ����������������� �����.��� ��������!��������� )��� ������������������� (��������� ��!"� /" � ��� ��!���������� ��!������� �� ��� �"����� ��!���"�� �� � ������� � ��� � �����0����"�������������1+!1&21*��3�������! �����������#����������"� /" � ������������������� �����������$ ��� ��''��3"�������"� ��# ����������������������� �������������������������"��� ������� ������� ��������� ������ ������������������������� ������ )���� ����������.������������"��!#�������������"������ �� ������������������ ��������� � ������#��(4�#������/"��� ��� �����/"�� ��� ������"�� ����������"���"�35�� ���� ����� � ��!������� �� ��)� �����#���������� �����"��35��������� ��� �)��"����������������� ����6�����!�"������� � �������"�� ����� � ����������������� 7�� ��!)��� ������������!������� ��!���������"��������������������� ���"�# ��������������!�� ������� � �� �������# ���� �������������������������#�������� ����� ������������������������ �� ��������(� �������"������� �������������������������� � ��� �� ���� �� � �������35���"����������������!�� ���� ������ ��������#��(������������������������ /"��� ��� �����"�������� ��"� �����"����"��������� ����� ��# ��������������"������� ����� ��� �"� ����� �� ��� ���!�����"� ������������������������6"���������� �����# �� ���� �������������������������������"��� �������"�� ���� ����� ����� ����� ����� ����#��(�,���� ����������� � �� ��#������ �������������������� ������� ���������� ����#�8����$ ��� ������������ �������� ���"���� ��� ����� �������� �������������"������������������� � � ����3"�������"� ��# ����������������� �� ����"����������������� �� ����� �����$ ��� �������������� ������������ ���������� ����9:;;<=>=?@ABCDA@A "������������������ ���������5 6�� ��E "��������$������2'! "��������3 �"����2�+!

"��������F��������� "��������5���������G1H21IJ�AKL?MN<=DO>=?@9,�����(P���� Q�� �������P"� � ����������"�� ��"�� ����,����������"���3��� ��5 �R! "����� % �����!������� F� ���!���� �����"!��� ��3��"�����$������������������ �������,��"���������(� (���F"S�������%��# �� ���������� � ����������������"��� ��T:?DU?O��"�����3�����"������ �������G�3% 38$5H��� 38 1I*�� Q�V ��� V� �JW����������.� � �� ��F"� ��G�.F ��Q�V�JW8"���� � ���� "�"S�8 ��"��"��3�����"���8F83�X ��������G��Q�V�J�Y� �#���"����������.������� �����������������������8 �$����������.�Y��8$�������.������� ����F�������(5������� ��������F����"����������"���V �� � ������.F�5 �V ����,� �������# �����%���"��� �����V �� � ����F"� ���V F���3#���"�����������X"������� ��# �� ����X"�����5���������"�� ��X5�������V�������"����3"�� ��������������������E��"�����3�����"������ �������G 38$5H��V� �J�Z[\]_[a\bcbddebfb\��������������B=T=B=?K=9��5� (!,��&++g� ��� � �����4�� � � ����� ����� ��������"��� �� ���� ������������heicb!jjk!*&H2*'&�&�8 ��!���&++&����������� ������������� ����� ������lb\bdmbno!pq!12&��'�%�"���!3�!Q������!P�%�!X���!��!P��(����%�"���!V�!��"���!P�!%���!P�,�!V��������!Q����P��� ���!5��&++'�.��"�� �����"��� � �������� ����������� ���r_b\_b!stt!*Iu2*u&�*�8�����!$�Q��&+++�$�����������������������������vifow[xolb\bo!y!&'uH2&*+&�H����(�������"(!X�����������7!�����&++I�$������� ����������������� �� ������z[_{foz[|{}do~_eo!pk�s!&�1g2&�g'�1� ���������!V�!Q����!��! ���!3�!5�� ��!��!F� � ����!��!5�����"��!��!�������!F������V��������!Q��&++g����� �������� ������� ��# �������� ��� ����� ������� ������ ������� ��� ��� �������������������� ���hi_xb_~_�d�bdo!s�!*'+�2*'�&�g� ���!3�!Q����!��!Y"��!��!5�����"��!��! ���������!V�!Y����!X�!������!$�!V�����!%����V��������!Q��&++g���F$��"���� �� ������� ��# �������� ��� ����� ���� ���/" ������� �������������������� �� ��"���������oZbxxz[xo!pkq!H1H2Hg��I���"���!V� �!.��!Q�.�!Y��!$�,�!��!Q�Q�!�"!%����V !8�3���uug�Q"������������ ���H�F�����������������������������$��������&�,�3��r_b\_b!�kk!�uu12&+++�u�F�������!%�V�!�������!8����P������! ��&++g�����!����������������� ��� �����(�Zbxx!p�y!11H21gu��+�V��������!Q�!����!��,�!,� ��!Q������8�����!$�Q���uu&�������� ����/"����� ��������������������������� ����������� ��� �� ���� ���"��� �Zbxx!kp!I1H2Ig'����X��#����!Q���! ���������!V�!V��������!Q�����������!F����&++*�5�� ��� ��� ��������������� ����� ���������"� ��%&���F �������wz��b|o!�!��I�2��I1�

hi_xb_~_�d�bdbec_{����� ���������������������������������� �������¡¢����£¤�¥¦§

���¢©ªª���«�¬­��®�������«��°ª±�²����®�®�­��³�

Page 45: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ����������������������������������������������� !"#$%&'()#&*$+#,$-+)./012�2312����4�5�����6�7���7���8�9������5�5����8�:�:���������;�������5���<�6�7�=�����>?���8�@���������A8�����?�B'&(�����C����5D�E�������E2F���������E�<�����G���������G�9���G������<���������������������%&'H!BIJ/2�132����K������?���������7���G�������8�����@����5����8���7�����1�D�G�<������������>�������������9����5D�E������L�D��9��9���>M�EE��<��G�������%&'H!BIJJ1�131����F��NN�8���NO�P�Q��8��6�D�R��5� �@�����5�S��������������������������>T�<����5�����1�5���G�����9���������G�<������������>�������������9����5D��������������L�D���%&'H!BIJJ1��31�F��U������������������6�D�V���<R�S����G87�6�G�9���5�;�������<R�����1����5D���������L�D��M�E�F>������G����������������������W�%&'H!BIJJ1�U31�2��C�S����G87�?��6�?�;���N�T�A����8��T������5����6�G�9���5�;�����C�L�D��E���������������������<�������������������������G�����+#,BX#BY.Z�CU�3�CUK��1�5E��<��S� ����7G�����6�O�����F��D�T����������9�����<[E��E�����\����<�]!BX* _B(( ,"($.J1K32���2�D����;����������a��6�6�����������\W�����D�T[��������<E��������9���������G��N�������N��<G�����%&'$_B((,"($Y;�KF3;�KC����T����D������7��������������?�����G��������<�EE���G�����,Xb,b"���<��<�%&'$cBb$d"($_B(( ,"($e12132�C���� �EE��G���>5G�����=6����T��������O�������4���N���E������������M�����G���E���������8�������N��<G�����+#,BX#BY//1C32�����T����D���5G��\��T�;�9��P�G���N�6������A=���?�S����������<��O�S�����7����7������������K�O��9����������������GE������>G��������������G�����,Xb,b"[�����>�����������<������G�����<���������G������G����������8���G��������E��������d"($_B(( ,"($eIU4243UK����4��W�������?�EE����;�5G�������<��6�;����;����Q�99Q�Q���2CU�7�9����������������9�����������M�����G��G�E����9���G���<��G�N���8�����G�� ,"fgh$i$.j��FF3��U2��K�5����N�G���6�7��������S�����������7G�����6�O������������G���<���9�����<��G��������������8�������������N�G����[������<������D�T���������kd li$em���F3��4K��F��������������S����P��������Q�������7�G������G����������G�����N��<G�����G�����N�����9�M�����G��G���������9����������E����9���G���<�n,'"#gBo$_B(( ,"($..J�43����U������7����7�����������������G��������G����G���������G�����G����� ,"#gBo$i$YJj�2C34����C�������7��5G�������?�7�����D�7���� ����������������5���G�������G�������������G�����G������9G��E���������_H!!$lf,X$_B(( ,"($eIC231F��1�O���8�5��������7����7������������U����������G����N����[����\G8��<�����G�����G�����_H!!$lf,X$_B(( ,"($.0�1K3�2���2�7��������������T������������G�[��E��G�����������G������G����G�������<����WE��������+#,BX#Bem.1K431KC�4��7�������;����7������������U�����������E����E�������9�����G����G�����������������������%&'$cBb$d"($_B((,"($ZFK�3FKU�4��5G��������� �������T�7������5�5��� �Q����� �?���T�S��8�S�������7���<�������O���������7�O�B'&(�����1�5�9������G���������G�������<��<�������G����E���E��������4�����G�������������������G���G�E��+#,BX#BYe/�44�3�44U�4��O���������7�O�5��� �������T�7�Q��<�6�O���9�N�8���:�������Q�V��<����������5����6�Q�����1������>������������������������9���<������>\���M�����G��G���G���G�E�9�����G������������������ ,"fgh$i$mIK2FC3K2C��44�p��Q� �������������5E�����������L�EC���L����G�������9�q����������������9�������������������G���������������������������i$_B(( ,"#gBo$..eK423KKK�

4K�5��9����7�;�a����6������8���8�7�7�������E�Q�����C���G������G���=������������G��<����M�����G���E��������������������)X&($ ,"#gBo$Yj02F322�4F�D����G���?������;�����8��S���<�����T�P��8���D�������7�� �������������D���9����L�����1�O������������G����G����=���������������G���������9����E�G�\G���T���nhr!,*"o&eZ2�321�4U�T����D���O���8�5������7������������K�7������������������GE������9�����<��G��������,Xb,b"����<E����9���G���<��G���G�E��dB'g"* kXsho"($YZJ4243K�K�4C�������O��������;�����=��7�6������P����O�����K�����G����=��<M�����G��G���G�N���G��N�������G����E������������<���<9�����<�N����� H(($d&'g$ ,"($jj�F�F3�FKF�41��8��8�����2C4�:����������������������W��������������W������8�������E���G�E���:�[T����NS��������8��������tX*uX'B!X&',"X&(+hof",Ho"XuXv"!o&',"X]gB"!h��8�������?����S���E���EE��UC3�1��42�5G��������� ������=����D���� �����������������<��������E��>����������M�����G��G���G���G�E��i$_B(( ,"($.m/�UF3�CF�K��5��<6�D�G�8�9���A�S������������T������6�������5���G��������7��>���G��E��W��N��������������������9����������������G����������������+#,BX#BYY.��4U3��K��K��S�G������T������5�D�9����D�6����Q����D�����222�D�G��9��������������G�������>F�������������������::�5�����>�����8�����G���N������������G�G��N�����9���������������i$ ,"($_gBo$eZI44���344��2�K��Q���D�6�7G?��N��6��7������>5����7������D��G�T� ������������>������������EO>�E�G�\GG�������>F������������������G��N����%H#(B,#)#,* cB$Y0���C�K4�T������5�S�G������Q����D������D�9����D�6���222�D�G��9��������������G�������>F�������������������:�;WE�������E���\G��������G��E������������N�������������G�������������i$ ,"($_gBo$eZI44���344����KK�5G��������� �5E�����;���������T�V��<����?�7��<��6�S�������7����� ��������������F����EE�����G����[����G�N������=����������������������������G��N�������N��<G�����%&'$dB'g"*eCF�3CFU�KF�S��<�6�7G�����6�O��������>�����G�7�����C�����G����>���������������������D��������9�q���������N�M�����G��G���G�N��������E����9���G���<� ,"fgh$i$me�U2K3�C�4�KU�S��������6�7���>S������=��?��������<�������;����9��<6�����U������G���<���G�����9�������������������������G������������9���������G����E�������� ,"fgh$i$m/�1C13�12K�KC�5E��<��S� �T�<�D� �5��N��N��������7G�����6�O�����K�����������9�����<���G�����9�M�����G��G���G�N��������E����9���G���<� ,"fgh$i$0j4KC434K2F�K1�7��6�����E5����D�5G����=D� ���<��O����8��� ������:���������<��5���������������E������9�������������E���G�����������G����>����������������<w��D�T�EE��G������ ,"fgh$i$.//��C13��11�K2�5E��9�����������<T� �������������������7������F�T���G���������������������<E���������������������������G���<A8�=�8����<��������������E��������%H#(B,#)#,*cB$YY4F��34F�1�F���������D����G���7�����<����S�������5�������<��?����������5�Q��<7�p��Q�5����<6�5E�����B'&(����������������9�����<E��E������������G������RR=��G\�<������������������������ x"+lXBj��UU�C�F��;������5G��9�����7����� ��<��O����D�EE�?������������:5Q:G��������>���������<G��E��W�����E����G��������N�����������9�����<���G��������9�G�������9���=�����G��N������� !"#$%&'()#&*$+#,$-+)./Z�21C43�21C1�F��R����O�5q����������8�7�O�N����S�P��N���T�6�����N����5�������������������������S�S��������T�:���� �<����V�����C��������G�����������G��������G�������������<����O������G�����O����������G���������kd li$ej�4�43�4�K�F4�Q�G������7�Q����G8Q���� ��<���8�6���������������������������M�����G���E��9����������N��<G�����G�����N����<����

yz %H#(B,#)#,*cBB&!#g{t|}~�����������������������������������������������������

���������������������������� �¡�¢�����������£�

Page 46: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� �������������������������������������������������� !�"#�$%�&�������'��(����)��*��+���,��-�..���������/��&���������/����0������+�/�1233#4-���������5���+�66������66��������������+�6���������������7�����7�8�������� �����7�6������+���.������6�7�8�����9��:������; "$!; #"�$$�&��<��*�)����=�����>�1233$4'��8�������66������6������������8���������5���+����?@AB�������2#�3!2# C�$��*����,��)�����>��D5�+��-��-�����E��F�����<�F����G��+�5�<��/�1233#4-�����+�E=H���+�8�8����������� ��+�����������IJ�K:LM�N��$3%C�$ �O�8���<��*�P��Q�.�<�-����*����<��/�F�123C34>���������6�����+=R'H���S��������� ����7��S��T���������6�7������7��+��������UAV�WMVXAY�ZZ�;��!; 3�$"�)����E�'�=����F����>�/�1C#"#4[�L��LM\X]MXMBB��L�/�7�F�����,�5_�<�$#�F�����-��0�����-��Q����+�=����,�������O�1233%4'��8����������66��������8�����6���������8����5���+���� ��+���������?@AB�����Z�;$C"!;$2%��3� ���F��G���7����(����H��7���E�123CC4R�+��������6*,'8��7������6����C����������������8���a��������[bc�MbB���;#2!%32��C�R�����7�'��=����>��H��7���E��&��������d�-��)�����=����G���7����(�123C34O7�8������8���������,�#$��������*,'8��7����������7������8���a�������[bc�M�cYc�eB]MB��f��C #�!C"3%�

�2�G���&����-�����-�O�1233#4)g-P���������7�����*,'8��7������6����C���� �������c@MW����N�h�%%#!%�C��;�0��� ��H�P��>7��+�_��)�8������<��-��g���7����'�Q��(�����/�R��=��7���E�R��>7��+�i����H��7���)�123CC4'8��7�����������7���7���������5���7���5�������j�����������������������8����7�8��*,-OC����������[\V�KVXbcV�����������h��%2!%"��%�*��D��)��+�/��F��+�_��D7���_��E����Q��_��+�)��Q���(�_��i��_��F������/��-�<�5��.�)�*�MV\��123C34*,-OC������������+�������������������������+�����S�������������������������� �����S�����������Kc��K�L\���f��"3��$�,�����/�'����-����R�1C#�$4'��8���k8��7��6�6�������8���8�.������U�W?bV����Z�;3"!;C;����=��7��>�123C;4lLmMXMLcMm�Xn�mmbB��LIX�cMBBMB�)���+��(�������+�� �G���(��P7�)�H��P<����-��/����8����R��E����Q�'��/������7�R����G��0�1C##�4*��� �*,'��������8��7������6�������� �������8�����8���������8������nMoM��?WMLV�h���;C#$!;23$��"�-�����+��*��=�����+��Q��&���8����)��R��7�����g��&��������d�-��Q���<���F�0��)�����=����G���7����(�1233#4,�#$��������5��7���� �*,'8��7������6������*�8�;����*�8�;�����8����������+��������������+�6�7� ���>-p��8������8���������8������9��:]M?��hq�C2$#!C2�%�

[bc�M�cYc�eB]MBM\Xc@rstuv wxyz{y|}~����~{z�{��~��~�{���y���}���}y�}y���~�y��y����

�{{����}z������������}z����������}��z���y����y

Page 47: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

45..67879:-,;87:<=�47>&?���� !� !��?/���'!%��##�/#�/?�@���A��� ������ �����B�CDE���3F3GGHI�� J������K��� ���� ���J��L3M�NOPQRSTS���U�������V3��� ���J������ ������� LFWFMLGM����������D���� �������� ��J������ ������U���B�CDE���3U��B�CDE���3X3YGZ���B�CDE���3[@�U�����������U���������������� ��\�������]����� �F��������������� ������������� ��J���A��� ��\���� �� J����� ���J��J�����L_M�abcbd�!(�)�?'&&�!1'��'$@���������\� ������� ����� ����������K��������������������������K��\���� U� ���K��� ���� ���J��L3M�eDf]�DGgD���A���������L��\��MU� ��������h������������������_ijk������� U�������J������������������������� J��������������\�lfC�A�������� �k���� ���� �����\ ���m���������K��lfC����� � ����� ���J����k����������k����� L��K���������� �������m���������K��lfC����� � M��!(�)�((/! ��'�!�!1'!%�n'#/'�� ! "?�#'��n��>&?���� !#�n�#�o��D���� ������������� �������� ��J������ ���������� �A��� ��\B�CDE���3�� ��� U��� �������o��3�ep����� �����K�� ��� Lk�����������������M���������������A�����������J���]��U���i�eq@�����DrD3ii�����D���������������CFofU� ���������Z���\���� CFofU� ������ ��������J����U��������� ���������������J���CF3iLfJ���M���� ������������D��� �����J������s�\������f��A������eHtL��K����\��M�@������\B3��������������J���ef3iU� ��� ���\��� �������E���3U�����oD��������p� YD��\�@���������U� ��������������H�� ������� K�������J�����J�����K��� � �������]������\�������������J������ ���Zu��f �������\U� ���������� ���K��� ���� ���J��LtM��������������J���� U������s�\������f��A������tvv��f��A������eHtL��K����\��M�F��� U���������� ������U���3j\W��tw�YD���������DGD�����������������J�������x���� �����Lx�����u�J�������� M�k�������� �����K�� ��E���3L����\���� ����A�\���� M����������� U������ ������Gj����\� ��� Li�ej�]D�� �����M��x�������Y�3LC����Z����M� ��\����EJ� ��������������� �����������������EfC� ������\�yJs��� J���UGiij�zU����A����������Js��� ��������U������Js��� �]�\������3Giij�z�����K����������������� ���������� �������U�����������A��� ��\���� U���������������B�C����� ���J��U���eii���Giii\���K���� U������ ������L�����\�� ���lfC�A�������� M���������������������������DE���3������ ���������� ���� �J��\����� �J���������������� ���� ������� �Gi���� L���� ���������� ������M��{i���� L���D���� ��������� ��J������ ���������� M��� �����K����U����K���\����������������K������ ������ �������K�����D���� ���������� U������������������� ���������K������ U��������������| 0�((/! &?���&��'�� !'!%}����?!*# �'!'#$���F�D����������������������U� ����J�������� � U� ���������� ���K��� ���� ���J��LeMU�����������U��\����\� �����A����������������3ei�ko�F��3�\W��Eo� ��Lf����F���M�G�kk\F�G

Page 48: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

���45������ �����6������57���8�9:������������������ � 6��������������������� ��� ������:� ���; ��� ���������������������6�����:� � ��73<�=>�� ?@A��@B�C�4C<�=D�A��<�C�=EF>G9�>�������:��;���������������������6���� :���� �����������6������;H�������?F���4CG4<7 ��F���4������ ������;����8����������������8��5��� �����8�� 9��������?IADG4JF4<7K9���� �����?L�I7M����9������ �����?N?G����7��;��?G������9��������������?����������?��� �����6���� :������������O�;������@MI7F����8�9��G��5������CPKQJKB7��8����;��9��'�'� RR���� !'!%! R('#�S'�� !�����������;� ���� :�������� ����������T������8�������U?6�����L�� ?��������73��5������� 9�F��� �� ��:��;���������8����������� :������������6����;���;� �������� ��;���VWXYZ[\]���;?�������;� ������;:���������:���������5���������������8���:� ��������=�������� ���� �8������:����5�����������������;��� �������� �7M_� 9H>������������������79:� �����������������6��������;���abWcWde\fdcgh�������������;���������6�������������������� �������>���8��������;��;�����6������� ����?����������� :� � ��������������������M_��>�� M_�:� ������8���������6�������ij9�������6������������:����������������� �����6�������M_�:���� ����������������6�������;6�����7����� �������������������������O���5� ����������� ����������������;���KG9����������6��k;�����M_�7lm9��� ������������:� �����������������:������abWcWde\fdcgh���������>������;���8���� �8������:������ ��������� �������=�E5���:��k �����M�:����7���������������;���Kn9����o���p��;��� :���6��k;����� �6��������� �����;��qr���st:���uvw����� �����;���������������;������� �����8����������W�G���������8����xyz{|}~����� :� �������� ����8���;�������� �����;�� �6�����8���� ������������� 4<?3<�����6�������;��������������� � ����8���;�������� ���8����6�����8���� �G���������;������� ������������� ����������;�� �6���������� �������������������6���� ��6���������������6�������;?6�?����� �����������5����6��������������� �����6�8����6���:������������������������������������������� ��������� ������ �6�����8���� :������������6���������������:��������������� �����G�������;������6�����8���� :�������������:���� ¡¢£¤¢¥¦§¨ ©ª«¬������;��­®���°±²²�>���������������?��?�������������� ��6�������;������:� �6��������8���� ����������������� �����8���� ³µµ���¶·�>��8���� :� ��������������������������� ������������ �������7C<¹9�����6���������;����������� ��� �6��������������� �����: H>���� ������6�������;������:����������������� ���������� ���������� �������������������;�������;�����O���5� ����������� �������������������6������5�� ����������� 7º��;���9���������������;����5� �������� ��� �6��������������7���������������;���KA9�>��6�������;����� :� ��������������:�����������:��;E�������7�49�:����I ���� ���������6������5�� ���������������>��;���»¼ ½¾¿ÀÁÂÃ����;����5� � ÄÅÆÇÈÉÊËÌÍÎÏÐ���������������� ���������� ������������ � ÑÒÓÔÕÖ×ØÙÚÛÜÝ��� �����8���������C<¹�����6����������� ���������6�ÞHß àß à

á â

Page 49: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

45 6789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]_abc defghijklmnopqrst u v�wxy�����������z���� ���{|}}}���~����������z����������� �����z����� ������� ���z����������z���� ������������� ����������������� ������������� �������������������������������� ����������������y�����������������z������ ���z���� ����������������������������������������������� �������� �������������������� ����������y�� �� �����z������z���������z������������������������� �������������������z������������ �������� ������������������z��������� ������������ ���������� ���� ������z��������������z����w� �������� ����� �������������� v���������������������x�y�������������������� ��z������������ ¡¢£¤¥¦§©©© ª«¬­®°®±²³´ � ���������������z���� �µ�����������������������������v¶·x�� ������������ �� �������� ����z���������� ���������� �¹����� �������������������z���vºw»x������������������·w»�� ��� ����������� ��� �����¼'�½�('���'#( %�#y������������������� � �������� ���� ���������� � ���������z������z� ����� ����������������������������������������¾��������������� �y��������������� ���¿����������À�Á���������������� ��������� ��������������������������������������� ���z��� �������� ������v¿Ãx��������������� ���¿��������À�Á� ��z����������� ���¾Ä� ���������������� ������¾����vÅx�y����������������� ������������������ ���¿������������� ���� ����������������Ä�������� ���¿��������������� � ���������������������Æ�������� ��� �������� ����� ������������������������� ������������������ÇÈÈÉÊËǺËÉÌÍǺÎÊÉÌȺÇ̺ÏÐÑ���ÒËÈÈÉÊËǺËÉÌÍǺÎÊÉÌȺÇ̺ÓÔÕÕ��� �������������� ������������ ������� ��������� ������������ �����������Ö���z���������������×ØÙ�������������������ÚÛ���z�������������� ��� ������ ������� ����vÜx��� ����������ÎÝÝÎʺËÞÎÇÈÈÉÊËǺËÉÌÍǺÎÊÉÌȺÇ̺ßàáâ ãäåæçè�y�� ������������������ ������z�� �������� ����������� ������������� ���� ����¿��� ����������� �Ö��������� ������������� ��������������� ������é��� �������� �����������������������������ê������ vë�ì x�����������z��������í���������������� ��������é��������� �����z�������� ��� ������������ ����� ����������������� ���� ��������������������� �������������������������������� ������ �������� ���¿����������À�Á������ ����������������� ������ ������������������������������� ���������������������������������������� �������Ö�������� ������� ��������������������������������������������� ���¿������� ��������������������������z����� ���������������������������������� ���������������������ÒËÝÝîÈËÉÌÍǺÎÊÉÌȺÇ̺ïðñòò�ìz�������������� ������������������� ����� ������������������������������ ���� ������� ��� �����������������������������z��������� ������������������������������������������������� ���� ������������������������������������������������������������z����������������������óôõ� ����ê���������������� �ö� �������������������������� ������ �������y�������������������������������������� �z���������������� �����������

÷÷÷÷÷øùú û ü �ü ������������� �� ������ ������� ������� ����� ��� ��������� � ���������������� ! � "#$%&'()*+"#$%&'()*+"')%(), ---. /01

Page 50: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

������������������������4���������5�������65������������������� ����� ��������������������������������� ��5�������������5�5������ �������� ����7��� ������4��� �5����������� ���4��6����4��������� 89:���;<=>?��� �����7����@��7������ABCDD������ �����6�������������������� �����������������6�5������������������������ � �E������������5��������������� ���� ������5���7��������������������������� ������ ������ ��������������@�������4��6��� ��������� ��������������� �������5��������������� � ��� ����7� �5�������6������������ ������F��GHIJKLL�MNOPQRSTT�UVWXYZ[\���]_abcdef����������������� ����5��������������5����������� �����5������������5������� ������ ���� ����4����� �����������5�������������� ����������� �@�� �������������� ��������� �������������������5���������g�����hijkklmnopqrrstuvwxyz{{���|}~������������������������������� ����������������������� ������� ¡¢£¤¥¦§§���©ª«¬­®¯°±²³ µ¶·¹º»»�@���7������������ ����5�������������� ������� ������������������ �� ���5��5�¼½¾¿ÀÀÁ ÃÄÅÆÇÈ ÉÊËÌÌÍÎÏÐÐÑÒÓÔÔ� Õ�Ö×ØÙÚÛÜÝÞßàáâ ãäåæçèéêëìíîîïðñòòóôõö÷ø��� Õ��×���� �������� ��������������������� ������������� �������������������� !"#$%&'()**+,-./01234566789:;<=>?@ABCDDE� Õ�3×������FGHIJKLMNNOP QRSTUVWXYZ[\]^_ abbcdefghijjklmnopqrsstuvwxyz{| }~����������������� ������������� Õ��×������ ¡¢£¤ ¥¦§©ª«¬­®¯°±²³³µ¶·¹º»� Õ�¼×���� ���½¾¿ÀÀÁÂÃÄÅÆÇÈÉÉ������������� ������������������ÊË������ Õ�3×�Õ�¼×������������5��������� �������������5�����6������� �����ÌÍÎÏÐÑÑÒÓÔÕÖ×ØÙÙ�4����� ���5� ��� �������������� �����������������7����Ú���������4������ ������ � �������5��� ���� ��������7������7��Ë��� ÛÜÝÞßàáââãäåæçèéêëìíî � @�� ����4� ��ï� �������������������ð���������������� ���5���5�7������������� ���7�������� �������6�� � �����Õ�Ö×�Õ��×���Õ�3×�Õ�¼×�5�7���������7� ���������������Ë������ ������������ �����ñ������� ���6������� �������� �����������������7�������ògÊ���ó� �������������ôõ��������������� �������� ����������� � ��� ���������������� !� 4����"#� ����������7����������$%�@�� �Ë��������� ����������&'()������������ ���������������5�� ��������������������������7������7��Ú�4�7���4�� ������������ ��5������������Ë����5�����@�������������������*+,--.� ��� ������5���� ���������/01233 4567�������� �����5���� 89:;;< =>?@ABCDEFGHH� Ú��������������������IJKL� �� �5����� ������ ����7����5�����MNOO���PQRSS�@����� �� �5�������������������5�����6����������g���T������������������ ������� � ���������������������������� ������� ������������������������@�� �������� ���

Page 51: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

������4����� �������������������5���6����������7���� ���������������� ���������� ����� �����8��7�����9������� 4�������������� ������:��������������� ���9������������;<=>?>@AB?CDDEFGH�I�� ���� ��� �������������������B?CDDJD<K=>LM>LND>@JDEOH�7���� ���������� ��� 4������������:��������������� ������7��� ���9�� ���� ��9�P8Q�����I�����7����FG ����������7� ����������������7�������������7�����9������� ������������7�����9R�������������� � ��:��������� ����� ����������������FG������ ���������S��� � ��:�������������������7�����9������� ��������������������� ����7����4������7�� TU VWXYZ[������\�������]_abcdef���ghijklmnopqr� ����������� ������Rs7����������� �����7������������7������� ������ ��� �����t����4���uvwxyz{|}~������������������������������������ ¡¢£¤¥¦7������������������R§7����������� 4����� ���������7����������� �������������������7�©ª«¬­ ���®°°±²���� ������������� ��������������� ���� ����� ������9�����³��FG�I������������ ���R�������������t���� �� ���7��7�µ¶·¸¹º »¼½¾¿¿ÀÁ ÃÄÅÆÇÈÉÊËÌ ÍÎÏÐÐÑÒÓÔÔÕÖ× ØÙÚÛÛÜÝÞßàááâãäåæçèéêëìíîïðñò � óôõö÷øùúûü��� ����� �� �������������������� !� """"""#$%&'()*+,-./01 2345678 9:;<=>?@AABCDEEFGHIJKLMNOPQRS� 4����TUVWXYZ��������� ���R��������P8Q������ [\]_aabc defghijkk lmnopqrstu v wxyyz{|}~����������� �������������������� ���� ¡¢£¤¥¦¦§� E�H©ª«¬­®°±±²³ ´µ¶·¹º»¼½½ ¾¿ÀÁÂÃÄÅÆÇ È ÉÊËËÌÍÎÏÐÑÒÓÔÕÖ×ØÙÚÛÜÝ Þßàáââãäåæçèéêëìíîîï ðñòóôõö÷øùúúû� E��H��������� � ������� ������������ !"#$%&'()*+� E�,H-./0123456789:; <=>?@AB CDEFGHIJJKLMNNOPQRSTUVWXYZ[\� E�6]H��7����� � �����7 ��t�������� ���������� ���� ^_ abcdeef ghijklmnopqrstuvw � .'x'(���x����('�� !I�������������������������� �t������:��4� yI���������������� z{|}~� ����������������������������t���� ���������������������� ��������������� ¡¢£¤¥¦§ ©ª«¬­®°±������������������� ²³�µ¶��7�������������� �7����������� ������·����5�������������������������������������������� ��� ����9�����������7��4��� ������������ ���� ���������9����� ���� ������������������ ���:��4� ���������� ����� ����� ���t���� 4�������� �����4 y¹º»¼¼���½¾¿4��������������������������E ���������������I�7��6���9���ÀÁ�����������������Â������� ���������7�t�H�I�� ����� �ÃÄÅÅt����4� ����]�]]3E �����P� ��� ������H�ÆÇ�4� ��� ���È����������� �t����������P8Q���t��ÉÊËÌÍÎÏÐÐ4� ���È�����ÑÒÓÔÕÖI��� ������������ �� ���������������� ������ � ×ØÙÚÛÜ ÝÞßààáâãäåæçèéêëëìíîïðð� ��������7���4������ ���������������������������9t����7�� 4� ����������7���� � È���� � ���������I������������ñ�����RF�����9������E6]H

Page 52: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

4� ����������������5������� �����������6���� 4����������7���� ���� 8������� ����� 5��4�������5 ��6���9:;���6������ ������������������������ ��� � ���������������������7����������������������������������<�� � �������=��4�6����5�� �>����� �6�����������<�� � 4��������������4������ �������?�����@A�����<�������B���6�����5� ����4� ������� ��������� ����������6���� �B�� ���������4� �����������������<��5�������������������<������������� �������� ���@����������9:;���������������6������6� ���5�����������5����� ���C�������������� � �� ���5����������5���4��������� ���@��������9:;����DEF G�HI@G�3I���G�JI@G�KLI4�������������� ��6��4������F���� �����4��� ������<��L�LM�4��������� ����������������������5 ��6����������6���:�� ���4���4� 4��������9G9E�6��������N���B����OLKK�9������������������ �����N�������<�P������:� ����I�Q�� ������������������������ ��������9:;���6� ������������������������ ������ ������6� ������� ��������������� ����E���K��� ����������4��� �:����������6�4������6�5����� �������� ��������6���<����6����������� ������� ��������������6���������� ������ �������� �����������������4�6������ ��������������4������� ���� ��������������:6���<��<������ ����������������� � ������ �����5������C���� ����� ��D������� � ����������������� �� �<���5��������������� ��� ��5�����@��@����6����5������R/(�S������������� � �4���4�� � ������ � �����5������������8����5��������5�������� ���@��������������� ���@����������9:;���� � �����DEF � ��������������������� ���C������ �������������5�6�DEF �6����5����������� ���@��������9:;���4�6������ ��6��6� ���G��������������C�����I�������������������C�C�������������������� ���4�������������������� ��6����DEF ���������� ���@��������������������� ���@����������9:;����C������������������� ������������DEF � �� ����� �5��� ��GKKI��������� ���@��������9:;�4��������� �����4 T: ���UVWXYZ[\]__abcddefghijklmnopqrrstuvwxyzz{|}~������5�<�6��������������4�������������������������������C������������� �� ���5���5�6��B����������<��6����5�� ���� ������� ���� �������������������������7��� ��<���?�����@A�����<�����������������6������@���������5������ �4���8������������������� ¡¢££¤¥���������5�6���������� �4��������¦ § ©ª«¬­®¯°±²³ ¦ µ¶·¹º»¼½¾¾ ¿ÀÁÂÃÃÄÅÆÇÈÉÊËÌ̦ ÍÎÏÐÑÒÓÔÕÖ×ØÙÚÛÜÝÞßàáâãäåå¦ æçèéêëìíîïðñòò¦ óôõö÷øùúûüýþ���������� �����¦ ������������� !"#$%&'()*+ ���,-./012¦ 3456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNO ���PQRSTUV¦ WXYZ[\ ] _abcdefghijjklmnn ���opqrstu

Page 53: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

4�� �5���� �����6� ��������������� ��5��������� ���7�������89:������; %�#�< ������������� � �6�� ����������� 6���������������=�� ��>? �������������� ����� ������������ ���������>? ��6�� ���� ���=������������ ��@�����A�������B�6�5���������� C6�������������������������������������������������>? � 6������������5���������A����������D���� �A���������������������������C����DC��C���������������������ED�?FEGHF ����������������������������������6�5������������������������� @������� ����� ����������������� � ��������� ������������������������������������������������ �I���� ���������A����=������������������ ����D�?6����������5���� >? ������A�������5��������������5������5� � =������� ���=��=�����������J����� ����������� ���6���5������������ �����������������6����������K� ������J����� ��A���� ������ ������������������������9�������������5��� ������� �������LDM���5� E��A���NI������������������A���OF�6�������J�������5�������������4��������������� � �����6 PD �J������������L� ��� �������������������>? ������������ ���A�� �������������6��� ������5���=�������� � E9>? F���������������������=�������� E?>?F�4�� ���5������������������� PEGF ���9>?��?>?� ��� ���������������QRSTUV��=����������� �����=��=�5������������� ����P WXYZ[\] _abc�8����6� ����9>? ���?>?����� ����������6�� �����>? ������ �LDM���5��EHF 46��� �����>? ����������� �= ������������������ ������������ �����������6����6�9>? �������� ������� �������5�deffghijklmnoopqrstuvwwxyz{| }~������������������������������� ������8����6� �6�� �������������5����=����9>? ��=�����ENF D�>?���������������=��� �������������������� �������� �K�P����� ¡¢£¤¥¦§©ª���«¬­® °±²³µ¶·¹º���»¼½¼¾¿ÀÁÂÃÄÅÆÇÆ�8����6� �6�� �������������5����=����9>? ��=�����È�����5������������5���� �������=�5����� ���� =���� �������� � �4���������6���� �������=� ���� �������LDM���5� ����������� �������� ��6� ������������� ������A���A����� ������ 6��������������������A��������J������6���� ������� �������ÉÊËÌÍÎ� ������ �������=��6���ÏÐ���GÏÐ�4�� � �� ��� �����������5���������6���� ��� ���������� ����5������� 6����������� ��� � ������K���4���� �����A���� ���� ���ÑÒÓÔÕÖ×ØÙÚÛ�ÜÝÞßàáâ�ãäåäæçèéêëìí�îïðñòóôõö���÷øùø���������������� �������5��6���6 �������������6��������������=� �����4�� � �����������������6����6�9>? ������?>?�=���������� � ����������������6������9>?������?>?� �@�����A������������������������������ ��������������A�������=����9>? � ��������=�����������5����=����9>? � ����������=�����=�5����� �4�� �������5����=������� ���������������A�����4����������������������� �������������� ��������������������� ���������5����=����9>? � �����������4�������6��������������A���=����9>? �

Page 54: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

��� �������� ��� ������� �������������������4�5��6�� ���� �������� ������ ������ ���� ��������������789���:� �4�� ��� ��� ��;�� � ���������<�������5����=>? ����������������������������������:����5���@A..BCDCEF-,G,C+C,CEHC@I� ������������J�����������K� ;�����L�9��M��<�����N��>��<���O�P��?���� ��>�?����J���������L�Q6RRST4��������������U������:� ����V�������=W8���������� ���� �����:�������:��<���� �XYZ[\Z]_�a�bSIcbSd�6� J���L��e����9��ef����>��O����������7��g� �N�8��O���� ���7����J��K�QIhhdT=���:�=W8���� ������������� ���� �����:���� ����� ���5������ ������� �i\j\klm\nZ�)aa�oIhSco6RS�o� ������������J��L�������8�����������7� ��<�W��>�����<���=��7���5�����p��?���� ��>�?����J���������L�Q6RRbT=������ ��=���I�����������;������������������������������� �������� ����������:��������������=W8������������Xqrk\srtrs_u\�vw�xoRIcxoI6�x� 7�������8��N�������K��W�;�f�=��P�� <������9��y��f����7��?���� ��>�?��J���������L����7���5�����p�Q6RR3Tg����������������������V�������������������������5��� ����������9?W8�z{|}s_mY~�Y}r]mZ��a��hIch3�S� >�����<���=��������<���N��P�����������7���5�����p��P����������>��N���f������K�������������J���������L�Q6RRhTW�hS�������� ;�������:�=W8���������� ���� � �=���o����=���o5����������� ���<������ �������<�����:����?>y������������5������ ������� ��[��u\l�)��I6ShcI6dx�d� 9�����7�=�����������9��K�5��?��y�����:��O��=���8��eV����N��P��;��=�4��L�<���g��P� ����>����>� �����4�Q6RRxTg��5������������������������c�������������������� ��:�:�U�����c����� �����<����� ������<������������������������;��f ������������������ �[ k�\kk�sk�a��dohocdxR6�b� 9�����7�=��g�� f����8����>� �����4�Q6RRxT>�� �����������������������5�����<�������������:�:��� ��<�����5�������<����� �����[\Z]_�n�{m k�v�w�ohocxIx�3� ?�������g��?��;�����K��L���V���>�O������y��� �g�Q6RRxT?���������V��<������ ���������:������:� ����������������� �����<���<5�����<�:��� ��qkk[YZ]�sk����ISIScISxS�h� ����<���P�J����>�W�����O�g�Q6RRST�789����� � ��5�����<U���������������<��}\n_�\kk�sk�)w�3xchI�IR� W������O�8����>����7�QIhdST8�������>����������������>�����V������� mlqZ����oR3coIo�II� ���� �?�Q6RIoT�n�\}\nr\�}is��qsn�}r\ \������<���L�����5��<�I6� 8f��f��L�QIhboT��9����:�P�W����? �f����Q�� �T��n_�nZ\}nYZsnYk�{ml sqmn�n�}mYZsn�]\}{�P����� �U8f�������N��������6dbc63I�

Page 55: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

3

45..67879:-,;+<=5,744)

4/&&#�(�!�'>$+�1/>�)?4&���"����$���� "�@�'!��0�!(�)'!��* %$A-)B'!%#�C�#� "��� &��'!%�!% 1�! /��!(�)�D&>���� !?E-F������ ������G��HIJ����KLMNOPQP��R������ ������� ESTSF ��J ��������U���I ������G������������J����� �R��������������������������KLMNOPQP���� ������R��VIWX��EYFZ� ����R�������� � G�[� �� �G������������\U���I]IW����R�����HIKLMNOPQP���� ESTSF�R��������R�����I_aU������HIJ����� �b\����EcdaU�FJ� � ��� �������G��������EeF��������f���������������U���I�g��� �����[�� � ��Gh������� ���J���Ei��a��j����F�k�� ����� ��� ��J ������ ������[��g���������� ���G�� ���������[���������l�����J��� �G��������������G�������U i� �G������������������������� ���� �����U���I����R��� �G�����������m�i �G��������������n�G����[���g��� ��G���� E�g��������a��R�� ���� aFJ����g������������������ � E�����G��������o i�g�������� R���JF�E�Fp���������[��[��������������\U���I]IW����R��� �G�������� �����m�i\U���I�g��� ��G���� E����� �����G�������G���� ���������������g��� ��U���IF������[������\���� ������SdSId���� E����G���� ����F���������G���[���������������������R���J� � ���j����R�� �������� ���������[������ �

Page 56: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

56

5/&&#�(�!�'7$+�1/7�689 �'#�:'�� ! ";+.0�!(�)<�'!%;+.0�!(�)=>5�!7�#'�� !� �!% 1�! /�.?@-8A�BCD���3E����A�BCD���3FG��������������H�������BIJK� ������������H������������������ ���������L�H�����H���������� �A�BCD���3E�� � �������E���������������������H���H����L� ��� ������L���M��BIJK�A�BCD���3E������� �� ����N�������������������������������H��� ��O����������� ���������� �������AP�A�BCD���3FG� ��E �� ���������� ��������E�����������������������H����������� � ��H� ��������� ������E���������������������������������������H��� � ����������O����������� �������L�� QRS��

Page 57: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

33

45

4/&&#�(�!�'6$+�1/6�574/&�606�� #/�� !�('1�!1 "8+.0�!(�)� !��6/���'!%�!% 1�! /��!(�)79-:;<;3<������������=��� ��>��� ��?@�A=B���3C���������� ������C�������D���� �?��� �����?���� A;EF9�����������������?<F:����� ����� ���?���?�������=������G�����D��H����D����������@�A=B���3� �������C���������=��� ����������������9I�:�J��������������?������� ���������G=���K���������LB=��M���?� ���N� ��C��9O:;�= ������?������?���� B���3� ��?���PF3Q����D�����?�����C���A;EF��H������ ������������� ����� ���D������������������������������ �� �D ��H�����@�A=B���3C���;<;3<���� 9������������F�����?<F:�9R:;<;3<�����>��� ��?@�A=B���3S3T<U���H��������=��� � ��?�� ����������D��������C��������?A;EF��D��������������� ��� 9�����������������?<;:������

Page 58: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

��5������5������67� ���������8���� �9������ ����������������������9��������������5:�����5���� ����������9��67����������:�� ;<=����3=�>�� �� ?�@A

@/&&#�(�!�'B$+�1/B�ACD/'!���'��E��E'#/'�� ! "+,-.�F&�B�(�!��C>-?G��������9��������HI� >:��������������:��J5�����?�������� ����� �������������>K?L�������� ����9�����������HI� ����������M������8������HMN�8��������>O�NPQ���3R�R�������� �������S�����?�>T?Q�����������������:�������5������������ ������������ �������������� �G������������ ���������� �����������������5��������� �������:�����������:���������5���� ���� ���������������:����������� �:������������� �������G��:�������5������ ����������:�����9���5������ ����������5������������5<UV�����:����������� �� ��������:�����:�������>�?7������ ��������������������������S����������������WR���������R���:�������5����������������

Page 59: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

565/&&#�(�!�'7$+�1/7�689/'!���'��:�+,-.�:'#/'�� ! ";+.0�!(�)<�<��='!%<��= /�,+.0.>?-� �@&7���� !8A-BC�������D������D� ���AEB�������� ������D���AFGHIB����� �������J��K��� �����L�MNMJOP��� � ������������Q�������R�MNS���3T����������

Page 60: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

56

5/&&#�(�!�'7$+�1/7�689/'!���'��:�+,-.�:'#/'�� ! ";+.'!%;+.0�!(�)� !��7/���8<=���>������=������=� �� ��������������� ������� ����� ������������ ��>���������>�����?�� ����� �����>��� �������������������������=������������@�����������������>ABC�

Page 61: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

56

5/&&#�(�!�'7$+�1/7�689 :'#�!�� (&#�;" 7('�� ! "<+.� !��7/���'!'#$=�%*$>?@>@A�7'&&�!1'��'$B-CD���������� ������ ������� ������E����� ����� ������F�����B���������GHGGC�����������������I������������� �JF� ������F����4J�K�J�D���LG���B3HGGC��MG���B3HNGC��� �����E����O������������P�QJR���3I� ��I ����� ����S��������SS��S�������T�

Page 62: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

������������������������������ ����������5�� �������� �������6���7������������6�����7����������������8�� �6����8�����������9�����������:;�7�;�< �6 �����������;���������� �6 ����� ��� ��������� ��=�������������=��������������=�� ����>�?;@���3A34BC ��D � ������ ����=������������E����������������������� ��������������4F���������������5����=�����:;�7�;�<;�������E�;� ��������� �� ������������>�?;@���3G5���������� ����������������>�?;@���3A34BCHG5���������� ��������������������� �����>�?;@���3<3BBIJ������ ���6��������������� ������8�������7���; �6 �����������9��K�����������������=�������� ���� ��D �������������������==��=�������E�����:;�7�;�<����������LMNA���������8���� ������������:;�7�;�<;�����������6���7�����6�����;����������EO?����� � �C9������EO?��� ������� ���������� ����� �����������:;�7�;�<����6��������� L���������N����������� ������=����������� ������ ��������6�����������������3BF �����6�������=L��=�������N��� ��D��5����6������������ ���������������������8����������������������3BF ������ � D�������6����������LPN5���;��������������� ��������6����������� ��>�?;@���3D�������=������������� >�?;@���3A34BC�>�?;@���3G5��>�?;@���3A34BCHG5�����������������������8�������>�?;@���3<3BBIJ������������������ �����:;�7�;�<����������5���� ��� ��=���=�����=�������6���������������7����=������������� �6�������������������������������=���8�����������9��������������������� �����7���������������Q����8������������������ ���������������������6���7�����6�������������6��D�����������7����� ����� �D�������� �� ��������=�����6 ��8�����>�?;@���3D������D��6�>�?;@���3A34BC�>�?;@���3G5����>�?;@���3A34BCHG5��R�������������� ���������������8������ ����������������� ��=��STS/&&#�(�!�'U$+�1/U�TVW�!����%�&�!%�!�� "X+.0�!(�)Y� !�Z�%���'!��� �Z�*#�'�Z* U%�U[%�""/�� !0� /&#�%\�!�����VE���� ������8����=� ������EO?���� ���� ����������� ������=����8������8� ��������������� �EO?L�������N��������������8����������=��� �������� �LE]� N� ����������O ���D� ������� �����������6������ �������6�����E]� ��������� ���������6�����6��������������=����� ���;������������� �

Page 63: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

565/&&#�(�!�'7$+�1/7�68,�#'��9�!/(*�7 "+,-.�:&�7�(�!��;��<=�7 > !� 7�; %����!���9�( *�#��$�#'����8?�����������@���A�����BCD�E�������� F������G�D�������� ���������F���3HHI������������JHKLMN��E����������G�D��������J3KLMN�O ��@�������������������������KLM� �����������G�DPK���3��� ����� F�������� �������Q������������������� ����� �C��������������F�KLM � ��������������� ���������������������� ������?����������KLM��� ���������F� ��� ������������R������������� �5)S5/&&#�(�!�'7$+�1/7�)S8T!��7'��� !*��;��!�!(�)'!%.UV-��'* #��<�%*$W)XYZ(/�'�� !>*/�! �[5%�#��� !8J-NDM\C� ��P������������F���G�DPK���3����] _abcb��� ���A������ ���JMdMN���� �D�������E����� ��MdM���� F��������F��� ��A���E��� ��@G�DPK���3F��G�DPK���3e3fgh��G�DPK���3i?�F���������������������F������G�DP?���JM�����?�jN�?��������������������������� F��� ��������A��K�PDCGh�����������A�G�D��DM\C �����������A���� �JkNe�����������������P������������DM\C������l��������������P������������F���G�DPK���3F��

Page 64: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

56..7898:;-,<;-=7855) 5/&&#�(�!�'>$;'*#�)?@�##�$�#�%�&�!%�!�A�!����&> &�>���� "B+.'!%B+.0�!(�)� !��>/���'!'#$C�%*$+,-.?D�������� ������E���������F������ �GH�����E��������������IJKL�����������������M����N���� ���O������3PPQ�������������������M������ �R���M���� S�TR����� ����5U 5/&&#�(�!�'>$;'*#�)?5�C�0%�&�!%�!�VWXYYZ'#/�� "B+.0�!(�)[�'!%B+.(/#��(�>�?\]__M���� �����������E�a�������������O�����b�c���������dec������������b�cfg���3h��h����h� �����������������������ijkllM���� �

@ !��>/��� ��'1� m nopqr s)tUp�rb�cfg���3h� ����� � 3P uu�vSP�w w�wSP�3������ x3 uv�ySP�y z�wSP�w����� 33 u4�wSP�y 4�wSP�zb�cfg���3{3zxT ����� � xP uu�|SP�| w�3SP�x����� 3y uu�3SP�y y�|SP�|b�cfg���3}~� ����� � 3| uu�xSP�y w�4SP�x������ 3z u4�uSP�y |�xSP�w����� 3| uu�|SP�w z�PSP�|b�cfg���3{3zxT�}~� ����� � 3v u4�uSP�z w�zSP�w 3 3| 3PP�xSP�| P�vSP�Pwb�c�������� x 3w uu�xSP�| 3�PSP�3 | 3x 3PP�xS3�| 3�ySP�x@ !��>/��� ��C�pA�'r �%�""3b�c xv 3�P|xb�c y| P�zv|b�c 3P4 P�||b�cfg���3h� x3P ����

Page 65: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������������������������������������������ ! "��##�$�#�%�&�!%�!�%$!'(��� "�!(�)*$+,-.'!%%�""/�� !0� /&#�%( %�##�!12

34

567 !��8/��� ��'1� 9:"8��;<= �>7:�>7);<= ?8��@�>7);�= A ""@�>7);)B�= :�>7C;<= ?8��@�>7C;�= A ""@�>7C;)B�= :DED;<=F�GHI���3J� ����� �3KLK�MN3�O3 34�MN3�OP�PNK�Q K�3ORK�K3 H H H K�SNK�T������M3QS�QNM�33 T4�TN3�L3K�MNK�PK�33NK�K3 H H H O�3NK�S����� 33Q3�4NM�SM 3P�SNT�M4�LN3�O K�MQNK�33 ML�MNT�LMM�3NM�3K�KQNK�KKM�TNK�SF�GHI���3U3SMV ����� �MKLO�LN3�43 3T�4N3�4L�LN3�K K�3LNK�KS H H H 3�MNK�T����� 3QSQ�4NM�QM 4�LNM�Q L�QN3�T K�Q4NK�MP MM�SNM�T3L�4NM�4K�KPNK�K33�SNK�SF�GHI���3WX� ����� �3OPS�QNM�L3 MM�KNM�SS�LNK�Q K�3SNK�K3 H H H 3�QNK�O������3SSP�4NO�M3 TK�3NO�3L�QNK�L K�3TNK�K3 H H H M�KNK�Q����� 3OQL�TNM�Q3 OK�TNM�SL�LNK�M K�3MNK�KK H H H 3�ONK�TF�GHI���3U3SMVYWX� ����� �3PP4�MNM�S3 34�3NM�SL�MNK�S K�3TNK�K3 H H H 3�PNK�O 3Z 3O3KK�K K H H H H H H HF�G�������� MZ 3T3KK�K K H H H H H H H OZ 3M43�3NM�L3 L�KNM�P 3O�4NQ�SK�T4NK�K3OH H H K�4NK�Q5/&&#�(�!�'8$['*#�6\7�##�$�#�%�&�!%�!�&8 &�8���� "]+.'!%]+.0�!(�)� !��8/�����8'���%*$_�!����( %�#�!1\�������� ������a���������b������ ���Icd������a������ ������e���a�������� � ����������a����f�������������g�X������������a����������� � �a��e��������hijkl�mnopq���rsts����� �����g����������� ��������� a����J������f������ ��Icd3�IcdM��dcd��� �����e����X��������������a����������� � �������� uvwxx�yz{{�������� ����� �������������|}~���������� ����������g�e��a����������Icd3���IcdM������ ��������� ���e���� �������e���� N�Vc������������������� ��������� �����������������e���� ����3Y�����������

Page 66: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������

��

�������� ��� ��������������������� ����������������� �!��"���# �$�% ����������������������&�����#�����

Page 67: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Page 68: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ������ ��� �� ���������� ���������������������� ���� ���!"�������#$%&'()'*+,-%.)$/%'*'$01,2.3+%'4/'(-565*+7'8/.9$('-,$:-','(;-%.<$/%'(5*+(-'8-%.3$%'($=%$>-%.<$%'(=-,,'(;-%.?(8%-$@1//$*+.$(8A-'(%'*+B-1(+$%8/CDEFGHIJKLHMHNHKOPQOHRSTPHUVJEOHWXYZS[KTUMSOU\]H\N\IV__KOF SOUST]\T_OUSITKUSFaT\USHObWHSOWSJEOHWXc_abJdYeT\fXKFSTOSTbUTghYihjkhaNKOSIIlJKTUHOPTHSFYeSTMKOV��m�����#-(--no%-44'1('4%-;>,$/-8pq9r?$4&-,,$4+'4/1(-718's*$/'1(4p>//+-*%144/$,t$(87-*+$('4/'*,'(tp-/&--(/+-4--o';-(-/'*4';($,4$%-4/',,o11%,q>(8-%4/1186A-%-&-'(u-4/';$/-/+-7>,/'v817$'(o%1/-'(w+%2x/+$/'44'7',$%/1w+%2y.$(-44-(/'$,*12$*/1%127$'(/-($(*-9r?7-/+q,$/'1(6z'(8'(;$44$q48-71(4/%$/-$*11o-%$/'u-'(/-%o,$q12w+%2x817$'(4/+$/'(8>*-4o%-2-%-(*-21%+-7'7-/+q,$/-89r?./+-4>p4/%$/-127$'(/-($(*-7-/+q,$/'1(.$(8-(+$(*-4p'(8'(;/1A{<|7-{+-/-%1*+%17$/'(7$%t46=@?)$($,q4-4%-u-$,-8/+$/,1*$,'}$/'1($(8p'(8'(;8q($7'*412w+%2x'(u'u1%-~>'%-$('(/$*//$(8-7�>81%817$'($(88-o-(81(A{<|/%'7-/+q,$/'1(p>/(1/1(9r?7-/+q,$/'1(6z-4'8-4/+-*11o-%$/'u-9r?$(8+'4/1(-p'(8'(;/+$/'4*+$%$*/-%'4/'*21%w+%2x.&-$,4121>(8$(1oo14'/--no%-44'1(o$//-%(12EXT]j$(8EXT]h8>%'(;8'22-%-(/'$/'1(60+',-EXT]j'47$'(,q-no%-44-8'(o,>%'o1/-(/4/-7*-,,4.EXT]h'4>o%-;>,$/-88>%'(;8'22-%-(/'$/'1($(8+';+,q-no%-44-8'(8'22-%-(/'$/-871>4-/'44>-46�*/1o'*-no%-44'1(12w+%2x'(EXT]j���-7p%q1('*4/-7*-,,48'8(1/%-4/1%-9r?7-/+q,$/'1($/7$�1%4$/-,,'/-4'(8'*$/'(;2>(*/'1($,8'22-%-(*-460-o%1o14-/+$//+-*11o-%$/'u-'(/-%o,$q12w+%2x817$'(47$q*1(/%'p>/-/1$/';+/-%-o';-(-/'**1(/%1,12;-(--no%-44'1('(8'22-%-(/'$/-8*-,,46�63-,,6z'1*+-76yyx�x����x�|{.x�yy6�x�yy0',-qvB'44.�(*6� ����m�wA@=y�wA@=x�9r?:��A�B?���r�A�5��r�:�9�=�3?���r5��)�#�r���359r? 7-/+q,$/'1($(8+'4/1(-718's*$/'1(4$%-7$�1%-o';-(-/'*7$%t4'(u1,u-8'(/+-%-;>,$/'1(12;-(--no%-44'1(.'(+-%'/$(*-12*+%17$/'(4/$/-4.;-(17-4/$p','/q.$(8*-,,>,$%8'22-%-(/'$/'1(�z'%8.x��x�<1>}$%'8-4.x����@-'t.x����6:'4%-;>,$/'1( 12-o';-(-/'* o$/+&$q4.,'t- -%%1(-1>49r?7-/+q,$/'1(.7$q,-$8/1*$(*-%$(81/+-%8'4-$4-4��1(-4$(8z$q,'(.x����6�o-(~>-4/'1(4*1(*-%(/+-*%144/$,t$(87-*+$('4/'*,'(tp-/&--(8'22-%-(/-o';-(-/'*4';($,46#-(17-v4*$,-9r?7-/+q,$/'1(4/>8'-4%-u-$,-8$*1((-*/'1(p-/&--(9r?7-/+q,$/'1($(8+'4/1(-718's*$/'1(465o-*'s*$,,q.9r?7-/+q,$/'1(*1%%-,$/-4&'/+/+-$p4-(*-12A{<�7-/+q,$/'1($(8o%-4-(*-12A{<|7-/+q,$/'1(�:-'44(-%-/$,6.x����6�+'4*1%%-,$/'1(7$q'(o$%/p-*$>4-8pq9r?7-/+q,/%$(42-%$4-44o-*'s*$,,q%-*1;('}'(;+'4/1(-718's*$/'1(46=1%'(4/$(*-./+-8-(1u19r?7-/+q,/%$(42-%$4-9(7/{$$(8'/4*12$*/1%9(7/{B4o-*'s*$,,q%-*1;('}->(7-/+q,$/-8A{<�7-8'$/-8pq/+-?�@�v9(7/{v9(7/{B�?99�817$'(��1'-/$,6.x�����/$('-/$,6.x��|�69(7/y.&+'*+'4'(u1,u-8'(7$'(/-($(*-7-/+q,$/'1(8>%'(;9r?%-o,'*$/'1($(89r?%-o$'%�B-1(+$%8/-/$,6.y||x�:1%/>4-&'*}-/$,6.x����.4o-*'s*$,,q7-/+q,$/-4+-7'7-/+q,$/-89r?�z-4/1%$(8�(;%$7.y|�{�)%$8+$(-/$,6.y||��$(8$441*'$/-4&'/+*1(4/'/>/'u-+-/-%1*+%17$/'(u'$'/4/$%;-/'(;4-~>-(*-��5�817$'(��$4&$%$(-/$,6.x����6@-*-(/,q.w+%2y�$,41t(1&($4ro|�1%�3z)|��+$4p--(4+1&(/1,'(t9r?$(8+'4/1(-718's*$/'1(4$(8+$4-7-%;-8$4$(-44-(/'$,*12$*/1%21%/+-7$'(/-($(*-12;-(17'*9r?7-/+q,$v/'1(6#-(-/'*$p,$/'1(12EXT]j,-$84/1%-7$%t$p,-;-(17'*+qo17-/+q,$/'1(.$o+-(1/qo-4'7',$%/1FOMUj���-7p%q1('*4/-7*-,,4��534��z14/'*t-/$,6.x����5+$%'2-/$,6.x����6w+%2yp'(84+-7'7-/+q,$/-89r?u'$$5��$(8@�r#$441*'$/-8817$'(�5@?�817$'($(8/$%;-/49(7/y/1'/44>p4/%$/-127$'(/-($(*-9r?7-/+q,$/'1(�z14/'*t-/$,6.x����5+$%'2-/$,6.x����?%'/$-/$,6.x����?uu$t>71u-/$,6.x����A$4+'71/1-/$,6.x�����'$(-/$,6.x����@1//$*+-/$,6.x�y��6�+'4/$%;-/'(;$*/'u'/q12w+%2y'4p$4-81(4o-*'s*p'(8'(;/1/+-+-/-%1*+%17$/'(7$%tA{<|7-{u'$$/$(8-7�>81%817$'(���9��<$%$;'$(('-/$,6.x����@1//$*+-/$,6.

���� ¡¢�£ ¤¥¢¢�¢¡�¦§� ©¥ª§«¬�­?@��3B�®°±²³ µ¶·°³± ¹º»·¼¹½¾±¿ÀÀÁÂÁÃÄÃÅÁÃÆÇÈÁÉÀÀÊ

x���?88'/'1($,4>oo1%/'(;'(21%7$/'1(7$qp-21>(8'(/+-1(,'(-u-%4'1(12/+'4$%/'*,-6#%$(/4o1(41%�9->/4*+-=1%4*+>(;4;-7-'(4*+$2/�9=#�6<$%'(=-,,'(;-%Ë4o%-4-(/$88%-44'4�(/-%u-/�(/-%($/'1($,#7pA.w(/-%4*+,-'44+-'7.#-%7$(q6C31%%-4o1(8-(*-/1�9%6A-'(%'*+B-1(+$%8/.9-o$%/7-(/12z'1,1;q��.B>8&';:$n'7','$(4w('u-%4'/q:>('*+.�xy�x),$(-;;v:$%/'(4%'-8.#-%7$(q6�v7$',�+6,-1(+$%8/Ì,7>68-@-*-'u-8y?o%',x�yy�?**-o/-8yy:$qx�yyÍ9��y�6y��xÎ�*p6x{y��Í�x�yy0',-qvB'44.�(*6)>p,'4+-81(,'(-y|:$qx�yy'(0',-q�(,'(-B'p%$%q�&',-q1(,'(-,'p%$%q6*17�6

Page 69: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ����������������������������������������������������������� !� "#� ��$%&�'��������� ���() ���*������ ���#)+������ ���#),����������� ���#��-����� ������%����.�*�/*����������0�������������'!���������� ���(�����0��0���������������������������������������'1�%������� ���2�������������� �������������������������� ����� �����������������'3����������� ���4��������� �������������*������������������������*���������������%�����*���������������'���������� ���#���������*� ����������������0�����������*�����������%����������������������5 ������������*��������������������%���6�������������7��%��%��6��*���������������������89:;<=9>?9@A8;:BCA?;DE<;??=C@FC@?:<GF:?.H%������������*������"-1 I-171!5 �����7"-1 ��"-1������*��������������������%��0�*���'J%����������� ���K)-������������ ���#),����������� ���#�� ��������H%������������*���������0���1!I������*��LMNOP7�����5 Q,I���4(( RI�".5.S�$������"-1�*���������*��� ���LMNOT��5 'I����������� ����������%������LMNOP������1!I�������������%! "7LMNOT7"-10������$����������%����*�����H%������ ������*���������0� ���� ���������%������7��%�������*������0����%�H������1!I'������� �#2#���1!I7�����*���������$������������������������������������U����������$*������ ���������2V���)�����1������ ���������KV�#K)����������$*��V1������ ���������2V�#K)���������� $*��V1������ ����������V�4��$��������H������������*���������0���1!I*����0����%%��%�������������������%������������/*����� �������/*����������������U�����U+.II1W� J1JX11 )�����U" �1�J- �"+-� ��������*�������0��6����5 ��/*������$���*���*������*��������"-1������*�������*���������%���������������"-1�*�����F;>>FG>:G<;Y:<9@?Z;F:=C@YF;>>?C<:=@[Y9@AA=ZZ;<;@:=9:=C@�.+�#�$����� ,.-� ��.J!������*��*����������������������'J��������������� ���4)I����������� ������������H��%�������W%��������Q��0������S���*������������������,.-��.�(LMNOT\]\.J!�����������������������7"-1�������7"-1 �H%������ ������*���*���-*".5. �� QI����S���������������*����*��������*������.J!�������������"-1%���0������(2���������������������- !J ��������*����Q3�����������S�.J!��������.�( ��_� ��.�(LMNOT\]\�����*��*����������������������������������'J��������������� ������$��.J!�������_,2 ��5�Q.�!R,, "������S����*��*���+�����*��7,.,Q"���73IW "���7����� 5 S��*�����������a�������0�����*�Q1 W����������"��� *����S ����, b7�����%���������Q"���73IWS ��, W7��*����� ����c��%������ ���d�c������%������Q1 W����������"���S�$����*�����*%%��7

����� ��� � ����c��������������*��W�- Q,��%��� $����*�� ! S�<@9=?C>9:=C@YFA@9?e@:B;?=?Y9@AfG9@:=:9:=g;<;9>h:=8;EF<I5 �����������5 ������������%���������������'J��������������� ������./*�����*�������5 ����*�����I���7���1!I���$�/,��"���.H%������,�����,HQ %%��3��������S�����4K��-���I���7���1!IJ����� Q %%��3��������S���������������*����*��������*������$����������$�/,��"����H%����������������*��U"�%�Q ������U,�######�Ki��S *����Q ������U,���(442&Ki��S��*����Q ������U,���K���(�i��S�"����H%��������0�����������������"�%�������*����*���������%����0�!$,����Qjj!$,����S�=@g=:<CA@9k=@A=@[9@AB=?:C@;h:9=>E;E:=A;k=@A=@[9??9e$���0�����������������%���������������%��0�*���'-��*����W������� ���#)I����������� ������5�!%"�5 �*������������%��*����%�����H�������������'-��*����W������� ���#������������������������5 �����QJ*%%���������-��J43V�S�������7���%�%�������%*��������$ ,I ���l*�����Q1JW "������)J*%%���������-��J4 S�1�%����������������������KU�Q%�%��c"-1�*���S�������������������%���������I$����K��������������H���-�������������� ���%�����������������*��������������+#�������+#��������7���%�%����������������KU�Q%�%��c"-1�*���S�������������*�����5 �*���������������$����������������%���������I$���&���������������H���=88G@CZ>CG<;?F;@F;?:9=@=@[9@A9@:=kCA=;?-����*�������� ,.-�������.J!��������������0����%�������������������������������7"-1Q,.-�����S ����7������������������7"-1��I-171!5 Q.J!�S�!��������6H�������a����4a�����������13J��%����������13J�����������a $����m7����$��%���7��������������������6�������+#������������0�������%�����������Q ��0�,���S��������������7��������������l*������ ��H�-�*��K#(Q,����*���1����� .*���� RIS�$��������������*���U� ������UK�� ���%���0��� �13J������������a$����7�����a3J �"-173���Q!�����$�� "������S���*���������"-1�������������������� ��H�-�*��(22�!����������*������������� 1�����*����n��������Qn�����W���������� 3*������� ! S���������������������������*����$!JJ1K R3J���������������������������%�QW��� o������ "������S����&�Hc��(5 1���7 %�������������������l���0��"-1 ��H�-�*��(22 I-1 �� ��H�-�*��K#(�����H�������(227���������������K&�7��������� ���%���0��������������������������������������K��pK��%H��� �%H�������������������������%����������� ������qrst uvvwxyz{|}x~�z�z�~�|�{v�x�|�~|������y�q �v�y�z�v�ux����zy�|vu�x�|�{y�

Page 70: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������������� ��������� �������������������������� ������� ����������������� �� !"#$%� ��&'�'(�)�*�)+,)��!�'!�'�)�-�!./�0�)�����0�1��2345567(�1010��8��*1�, 10�1��*,)1�!�����'(�)�� 1� '�1& ,)����9�!3�, ��)1�!1,:;-�1� !<�='';>�1�)�!?4*�8��)�!�='@2A�1�'�1''0,(� ���1�)���,���� 1(�)��,))��1�!-&�����)���'1)�1�, ='� �10�/1��B#��*�=�;� ,+C����D.$-)��,++�1��23455E7'1�)1� �(�10�+)���(0� �**),8���1��&0��+)��,��)&(�')���0�!2F�10� 10�>)'1G5'�+1�)-����0� �3�����'(�)�1�B� ���)&HI5�'� !10� � � 1�)���',+H'2� ����������� � ����<� ,���AJ$(�'�',��1�!(�1010�KC$�*AJ$L� �M�1?K���� @� !H2IN�(�)�-�'=�>1��, ��)1�!='� �10�OPAJ$L�10&��1�, ;<,�! M�1?P&�, )�'��)�0@���,)!� � 1, 10��� =+��1=)�)Q'� '1)=�1�, '2%)���)'�R=� ��'+,)��S,)'�1����1�'(�)�$$$$T;<$<$$$U$TUU$UTT< ?+,)(�)! *)���)@� ! UU$T<$TTTT;U$<TTTTUTT?)���)'�*)���)@2",)��*��>��1�, (�='�!K���� V,1/1�)1%,�&��)�'�� HWK���� V,1/1�)1%,�&��)�'�-=++�)'=**���� 1�!(�10524�L!JT%'3524NL+,)(�)!*)���)3524NL)���)'�*)���)3H2G�L -�1�� �?/����@� !X5�L 1�1)���10&;����, �=�;�0�,)�!�?TL$U3/����@2L�S,)'�1����1�'(�)���*��;>�!� �'� �����*��>��1�, � !*&),'�R=� �� �)���1�, '(�)���))��!,=1-&Y�)�, ,'1��<�-V?Z��3<�)�� &@2���������� ����#�'=�1'(�)��8*)�''�!�'��� '[/A ,)��� '[/OL2T0�!�++�)� ��-�1(�� 1(,��� ���=�'(�'� ��&9�!-&/1=!� 1Q'\;1�'1� !(�'�, '�!�)�!�''1�1�'1�����&'�� �>�� 1� ��'�,+] 525I?_@� !0��0�&'�� �>�� 1+,)] 5255H?__@2��������������� ����� ������a� �����b���� �������� ������ #��� 1�&3Z0)+H0�'���)��!�'� �''� 1���+��1,)+,)10���� 1� � ��,+AJ$��10&��1�, 2/�R=� ��� ��&'�')������!10�1Z0)+40�)-,)'>��)��,� �9�-��!,��� ''�����)1,Z0)+H?"��2H$@3-=1�1'),��� 10�)��=��1�, ,+AJ$��10&��1�, �''1���= ����)2F��,�*�)�!10��8*)�''�, *�11�) ,+cdefg� !cdefh� O/U'� !',��1������'3!=)� �!�++�)� 1��1�, � !� !�++�)� 1��1�!�,='�1�''=�'?"��2HijA� !/=**���� 1�)&"��2/H@2C 1�)�'1� ��&3-,10�� �''0,( ,**,'�1��8*)�''�, *�11�) 'k(0���cdefg�'�8*)�''�!� O/U'� !!,( )��=��1�!!=)� �!�++�)� 1��1�, 3(0��0�'�, '�'1� 1(�10*)���,=')�*,)1'.L=1,�1��23HllIk"=S��,)��1��23Hll:kV,*+ �)�1��23455573cdefh�'=*)��=��1�!� !0��0�&�8*)�''�!� !�++�)� 1��1�!�,='�1�''=�'2T0�'(�1�0� 10��8*)�''�, *�11�) �)�=�'���� '1�+= �1�, ��)�!= !� �&,+-,10�� �'� !�'�, '�'1� 1(�1010�!)�'1���,'',+AJ$��10&��1�, � cdefgmnm O/U'!�'*�1�10�*)�'� ��,+� 1��1cdefh������'2T0�)�+,)�310�,**,'�1��8*)�''�, *�11�) ,+-,10�� �''=���'1'!�++�)� 1+= �1�, ��),��',+cdefg� !cdefh� !����,*�� 12opqrsr tuuvwpxyyzu{ywwpv|u}xxy{|v~��{~s}|���{~���{p|q�p~~y{y|xp}�xpv|r�����y�}xp�v�x�p|yv~x�y���xp��v�}p|}{��pxy�x�{yv~��{~sp|�v�u}{pwv|xv��{~�r�|��xy{�p|}���p��pxp|��p�y�v�}p|�����pw~v��v�y���}x}|�y����v{�v�}p|������}u�}|x�v�yv�v�}p|������}���}|�����}wwv�p}xy�������v�}p|}|�}��xy{�p|}�{y}���p|xy{ywxp|q|y�qy|y�������v�}p|r����y{wp|�p�}xyu{p�}{�wy��y|�ywp�p�}{pxpywv~wp|q�y�v�}p|w�yxy{�p|y�����}wx�wy}{�����xw�����s��s r�zu{ywwpv|}|}��wpwv~��{~s}|���{~����y}��xp�y���p|���w}|�wv�}xp��y��w������{p|q�p~~y{y|xp}xpv|v~�x¡s���w���}|�p|¢}{pv�w}���x�v�wyxpww�ywp|�v�u}{pwv|xvx�yyzu{ywwpv|�}x}p|���w���r�zu{ywwpv|�y¢y�w}{y{y�}xp¢yxv��{~sp|�x¡£¤������}�¥v~�p~~y{y|xp}xpv|���}|�xv�p�|y�������{~swyxxvs�r��v�|}{y�y}|w[��v~}x�y}wxx�vp|�yuy|�y|xyzuy{p�y|xwr

¦§ ©ª«¬§­®¬¬¬«©°±§®²³±µ©¶ ®§§·©«µ±¯¹ª«º«ª¹²±µ§ª °±ª¹±ª»°¶ ²©­¼ ¼½¾¿

Page 71: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� �������������� ������������������������������ !"��#$������%���&'��#���()�*�)��+���*,$)*-�����)�./�0��#���)����&�'��#�������1#���&�(�#*�)234*0����()������56��$'�0�)���&7.-889:3)�0�)��#;���$�)#�.-88<: 6����+$���&7.-8=8>7?�@�&�)��,$)*=.$������%���&(�(��#�'��#�������1�)����&�#�$��,$)*-()�*�)�����&&1'��#���ABC=D-8E��#ABF<@�B(�(��#��C3��7-"E7�$��'��#����+�����1�*,$)*-��@�#����#'1�$��� '0�����$�4A #�@���C3��7-GE7H���������&1.�+��1&����� �*ABF<.0�#�))�()������# �� $���)�+$)�@����.

IJKLML NOOPQRSTJUQVJWXJWKOYRQPRQZZJUQQPJKQWQTJ[\SR]ZV_RYMLaWUJTROVJWXJWKRSTJOZOYbcORQZ[QWTddSVQdQXZcVZTRSTQOUQRVOcWXeIfYcZJOWPROTQJWZgQRQXQTQR\JWQXLhijJZTOWQjklSWXjmlTSJdVJWXJWKZPQ[Jn[JTJQZOY_RYMLoOgWSRQ\QSWZpoqOYVJOdOKJ[SdXcPdJ[STQZLrijJZTOWQjkTSJdVJWXJWKZPQ[Jn[JTOY_RYMsJTZTSWXQ\tcXORXO\SJWuttqvsJTZfjqXO\SJWSWXJTZttq\cTSWTuwMxmhwMxyhvLoOgWSRQ\QSWZpoz{OYSTdQSZTTRQQJWXQPQWXQWTQ|PQRJ\QWTZLNiq}hVJWXJWKPROPQRTJQZOY_RYxs_RYMSWXOYZJWKdQuo~hsttqvSWX[O\VJWQX_RYMXO\SJWZuttq�fjq�o~hvLoOgWSRQ\QSWZpoz{OYTRQQJWXQPQWXQWTQ|PQRJ\QWTZLqiq}hVJWXJWKPROPQRTJQZOY_RYxs_RYMSWX_RYMwMxmhwMxyhJW[O\VJWSTJOWgJT JZTOWQlTSJdPQPTJXQVJWXJWKLoOgWSRQ\QSWZpoqOYTRQQJWXQPQWXQWTQ|PQRJ\QWTZu_RYxs_RYMvSWXOYTgOJWXQPQWXQWTQ|PQRJ\QWTZu_RYMwMxmhwMxyhvL�SdcQZgQRQWOR\SdJ�QXTOTQVJWXJWKRSTJOOYQS[eIfYcZJOWYORcW\QT dSTQXq}hgJTOcTJZTOWQlTSJdPQPTJXQLoTSTJZTJ[SdZJKWJn[SW[QOYXJYYQRQW[QZVQTgQQWTQVJWXJWKRSTJOZgJTcWlSWX Q\J\QT dSTQXq}hJZJWXJ[STQX��f��L��Lz�Iijk��\QkPQPTJXQVJWXJWKV _RYxs_RYMsSWX_RYx�o~hgJT JW[RQSZJWK[OW[QWTRSTJOWZOYq}hZcVZTRSTQ[OWTSJWJWKQJTQROWQ[QWTRSdQ\J\QT dSTQXuzvORWONPeZJTQuIvLoOgWSRQ\QSWZpoqOYVJOdOKJ[SdXcPdJ[STQZL�SdcQZgQRQWOR\SdJ�QXTOTQVJWXJWKRSTJOOY_RYx�o~hgJTOcTq}hL���� ������������������������������������� � ¡�����¢� ��¢¢�¢��������£�����

Page 72: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������������� ��� ������������������ ��� ���������������������������������������������������� �!�!"�#��$��������%��������� ��� ������������&���������������������%����������'(��)*(��+*,'#%����$�������-��#�,�����������.�����������'-���/,����%������� %������ ��������������������������������0��������� ���� ����������������������������1* ��� � ���������&���� ������ �����$����%������������1*'-���2,������� ���������1*������� ���������&������ ������� �&������.�������������������������� ��'#%�����������-��#�,��� %����������������� %��������������� ��&��� �1* ��� ���������� &���� ���������������������'-����,�3����������� ��������������������$����.�����������������%�������.������� ������� ��� � �����$����%������������1*���� �������������&����&����� ������ ����������������1*����&�� %������������������������������������������������.���� ��������������&��%����������������������� ��������������� ���������������$������������������%�������� �'(��)* (��+*,���&������������1*���������������&��$������� �%�������� ����������$����$����.����������������������%����� ������ �����$����%������������1*'-����,�3������������4������� ������� �1*������������� ��� ������� �������������������'-���5 -,����&������������ ������1*�����%����� ��� �'��� �6#�*,&������&��������������������&�����������1*���������$����������.������%������������������������� ��������� ��������������%������������������� � �������������������������7��3� ��� �%������������������� �1*������������������������#�*�������������� ����������� ���%���� � .��� �������������� ������������.��� ����������������1* ����%������� ���������������������89::;:<=:>8<:?@<A?>B<BCCDB<E?8F>G;H=GIC9J9BC>BH?FA>B9HKLME9AHD:<A?>B������������%����%��������N����� ��� � &��4���������� �$O-P������%���������&��� �������������7���%����3�&������'&�,5#2� ��� �������N�������%���%�������������������������������������'P�,'-���* /���#%�����������-��#)*Q2,������������&��������������7���P����������N������ �&������������������N����� ��� ���������������.��5#2���������7������������R���1*����������� ����������� ������ ��������'��S,���%�%������� �!!T"��5#2����7������&���R����������������� ������#%�����U��'VWXYZ[\],�������N����� �!!�"���S������������������������ �������1*�������������VWXYZ[\]5#2����&�%������������%�����������������0� �%����� ������N����P����S%�����VWXYZ[\]5#2� ����������������N����� ��� �����������������%�������1*����������'-���*,�2���������� ��%��������� &���%���������.�������'_5-�,���&����$�����N����� ��� ��������������7���P� &���&�������������VWXYZ[\]_5-��P���������� �!!�"'-���/,�*��� �%�������������'��� �(��)*(��+*,������������������������������������ ���%���������������P��&�_5-�'-���/,��������������� ��� ������N�������������&���������.����� %�������������������������'#%�����������-��#)� 5,���������������� ���� �������������������� ��� �����������&���� ����� %��������a%������������������ ���������������'-�*P,���������&����VWXYZ[\]_5-��0���������������� �%��������%�����������������%���� bcdefe ghiijiklimnkicokpcmqkqrrsqktcnumvwxlvyrhzhqrmqxcupmqh{f|}thpxsikpcmqe~�gmqvmnkitcruhnpcmqumv��hr�p����|�kqr�j�f}xrq��guplkquchqpish�zlhuucqdwxlvy��b�kqr�b���g�~kqrnmjqphlupkcqhr�cpx�~����xcnxzlhvhlhqpckiisxcdxicdxpu�{e�hldhrctkdhuklhrcuzikshrmqpxhlcdxpucrh��b��dlhhq��~���lhr�e�nkih�kl��te��gmqvmnkitcruhnpcmqumv��hr�p��bukqr�j�f}xrq��buplkquchqpish�zlhuucqdwxlvy��b�mlwxlvy�y��~�y��~��b��hlhcttjqmupkcqhrvml{f|}thfkqrnmjqphlupkcqhr�cpx�~��e�hldhrctkdhuklhrcuzikshrmqpxhlcdxpucrh��b��dlhhq��~���lhr�e�nkih�kl��teg��sqktcnumvwxlvy��b�kqrwxlvy�y��~�y��~��b�cqic�cqd��burhphltcqhr�sxkivqjnihjub�~�kqkisucue�b�cuuxm�qkulhvhlhqnhegjl�hulhzlhuhqpthkqu����vlmtkpihkup�qjnihce

� ¡¢£¤¥ ¦§¥¥¡¥¤¢©ª §«¬ª­®¢ §  °¢¤®ª± ²£¤³¤£²«ª­® £ ©ª£²ª£ © ¡«¢¦µ µ¶·

Page 73: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� �������� ���������������� �� �������������������������������������������������������� ����������!"#$%&'()*�+����������,�-.�/0��12�������334 � ������5�)*�+��,�-6��0��725������������������������������������������5�)*�+��,�-���80��129������:����� ���������;6</��6��������������������:����+��:�6=2�3�>����:������������ ������������������������������������� �����5��� ���������������������>;6</��6���? ���������������@��������;�������������:��������������:�����ABBCDEFGHIDJHKLHKMBNGODABPJHKDLQOENRGGLSCOLLBPFHK���������������� �����5��� ���������������:�������������9�9������ ����� �:���������T��U��������������������334�����5���������������������������:���������;4������+��:��V2�V�����������;4��������������������������5������:��;6�����������9�9����+��:��W2��������������������5������5�������������������������;4������334�� �������9������������������������:�X �9����:��������������334Y�;4�������������9������� ������������������:��;6</���,��6�����9������������:��334�5����5���������������������9�����:����� �������+��:��W���7V2�X�? �������:��������������������������������5����>��:�����������5���������������������������������������������������66��:��������������������9����������334+X 99�����������:�X.V2�X��������������>����:������5������334����;4��������������:������������5����������:������:���������������+X 99�����������:�X.V2�3����5�����? �������9���������������������9������������9������5��� �;4 ���334�5�:��������������������������������������������� ��+X 99�����������:�X.W2�Z���������9���������������������>�����������334Y�;4����� ��������������>���� ������������������������:�������;6</���,6���9�������������:������334+��:�7W2�3��������:����������>�����������334Y�;4����� ���5����������������������������:����������������������:��;6</��69�9����+��:�7W2�3����� �� ::������������9������������9����������������������5�������9�������������������������:��������������������>����9�������������:��������������>����:������������:���334����;4�������V������ ����������9�����������>���? ��������������������W�3��������������������������[����������1\;�����������������QOEN]FKLQOENRFEDKBGNQKAGHBKF _EDLQKLFKGHKDA3�������:���5�������������������� ������������� �����5�9������������������������ �����[�>���������������������5���4���+X 99�����������:�X12 ::����:������� ��������4ZV������������3������ ��� �������������5�����9�������a9������������������������"&bcdefe*X=�������������4ZV��������������������g������������9����? �����:�h��������9���a9��������������������:��i������������4ZV������������������=9�������g����������4ZV��"&bcdefe*X=���������������������4ZV��������������������+��:�.2�3����� ��9������ �������������������5���������������������LHAQ HBKj������9�����������������������������i������5������������������������������9�:������:�����: �������V>��? ��������5�������������>������>����4ZV�����������9�����������5������9��a�9�:���������������������:�������� ��������� ���� ��i��� ��������� �� �� ����� :����a9�����������*9�:��������: �������������4ZV������������>���������� ���������>����9���5��������������� �����������������5����������������:���������������� ����

klmnon pqqrstuvlwsxlyzlymq{v|s}q~xlyszvuyzs~��zqt����zq~ulyq{�|t{�n���l�vqys����vst~lyu�vul�xlyzlym�rs}l�}lv�q{v|s���q{�|t{�uyzq{v|s}q~xlysz���uyz���zq~uly���������q{�|t{�uyz�|t{�n�|q�yuts~suy�0���{tq~uv�su�v�l�lyzsrsyzsyvs�rstl~syv�n���l�vqys����~s�xlyzlymq{v|s}q~xlysz�������zq~uly�q{�|t{�uyz�|t{��|�xtlzrtqvsly����uyz���rs}l{�ly�stvsz�ly�st�s��sy}s�zstlwsz{tq~�|t{�uyz�|t{��ts�rs}vlws���uyzu�vtsv}|zs�svlqy�|t{�}qy�vt�}vn�|q�yuts~suy�0���{tq~uv�su�vv|tsslyzsrsyzsyvs�rstl~syv�n

� ¡¢ £¤¤¥¦§ ©ª«¦¬­ ® ­¬ ª°©¤­¦±ª­¬ª­²±³´ §µ� ¶¤ §­ ·¤µ£¦··· §±ª¤£ ¦ ª°©§³

Page 74: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������������� ����� ���������� ������������������������ ����������� ���� ���������������� �� � ��� !"��������� ������� ���# ��� ����������$� !"� ����� �������� �$�� %�"� ���� ���&�������� �������$��������#����$������������������������'��� �������� ����������������������������� ����� ���������������� ��������()���(������������ ���*$�� �������������� ��� &�������� +&& ,�-����� � ��������������������� � ����()���(���� �.���������� $���� ����$� ���� ���� �������������� �������������� $$��/ ������ ��������������� � ����������������������$� ����������� ��01234567�!��������������������� ��� *���#�� �()���(� � �� ���� �� ����������� � �� ��������� �8����������� ���������9�������� ��������������� �� ������� $��$ ��������$�� � ����� �� ������ *����:�� ���/ � �������������������� ���� � ����������������������� !"��������������� !"�� �� � ��������.�� �#��� �� ������� ������ ����� � ����()���(���� �.�����������; � ��������� �������� !" ��� � �� ��� � ����()���(���� �.�����������<� ���� ����%/="<.������������� ������� ����� ���� ������>��� ���������� �� ��������$� !"� ��()���������� ���*��;���*�������������&��������������������� ��������������$� ����������#�� !" � ����� ����� � ����� ��������� �������"����������#�������������-%=(������������� �����?)�����$����������� � �� �������� ��� !"�)�������������" ����� ����$���������9��#������������ ����������# �����$��� �� � ������� �.�������������9���#�.�������������������� �������������@��!������������� ��&& AB� ���� ����������� �������������#��� �� ��

� � ����()���(���� �.�����������&���������$��#������ �� �� ��������� ���$��� *������ � �� ����&& � �B� ���� ��%�������� ������ �����#����������������� *����:�� ����#�� ������� �� � ����� +B� ,� �������� ������ ����� ��C��� C���� ���� ��������.����������� ������������&�������������� !"��������� DEFG1HIHJ%<��;���*���������@K%�������������@�������*�������������� ���� ��������� ������DEFGL�� ��#��� �������������������� ������ ������� ���������"�� ���������9��� ��� ��������*���� �� ������ �� �#���� �� � �������DEFG1������$�����#DEFGL��!"��$��� J%<��#��#��� ������������� ��DEFG1������ �-����$��������� ���������#��������9������ ������ ���� ������� ���� �&�������������������9��������������������� !"��������� DEFG1���� ������������� ������ �� �������� �����#�� ��������� � $$����#�$���������� �$� ����� ����������� �� +�,�������#����:����������������� �� ������:�� �� ���������������� ���#����������� ����������;����� ����������$�� � ������������ ����������$� !"� ����� ����*�#���������������������� ���������������� �������� ��������� ������ ���������������������������� �� �� ����������� �������� �J%<��MNOPQRSTUVWTPXY&����������������������J =+!�$����/ ����������;��������������;���� �-",���Z�J%<����-���*8*� �+�/)J!<� ������ �$������ ���;������)����Z��� ,���&)8J%<����&�����Z� �#� +-�9.B�� */ ��������/��� �������� �J���. ����>�������[���� �,������\D]_E a-J>�� ���[� ��%�����+"����.;��� � ��./ �������>�������-�� ��=��#�-�9��� �� $�����-� ��[���� �,������\D]_E aJ%<��&��#��*#����������������!� ��������/ ���$�-� �+!/-,� ������ ��������� ������>����� ������ �����+ >[,%>;b?b� �%>;bc?����=�[�B��<�%�%��)�%��� �<�>�#�����������������/ ��� ��� �� �������B������!� �;�&��. �����+/ ).!;&,� ����/ ��� ��� ��-�9B�� *�������%�������-�������� �<�������=��%� ��+/-B�%.=%,�Bd�������#�����[�������%����=��%� �-� �+=%-,�eTfTeTPNTY"�������- �-��������BZ����%Z����?�/���������� �#��/����Z�;������ �/ ���g(bA?��"����-�>����� [�"���� -��� ��B�<����� ���&�-����-�%� .)����h;�;�� ��<���������>�������������� ��������� �.������&�b�� �� ��������9������ � ���$���;����;��������<���� (��gi�(Ai�c�"������%>������"� ������������ ����������� ������� ��������������$��Z-��;�����giiiAibi�"���)�"�����-�&�����!�*�����j�%���*�#�-����c����� �� �����.���������� !"�����%�"����� ���>��������.k�� ����� ���!�����?iigc�cAc���"$$�*���$[h�d��*��Z��l��%�=j� �� %�;�� ��<�"���#����<�� ��.B��� � %����c�%������������������� �� �����.���������� !"�����%�"���� ������ ���>��!�����?iigc��Ac�i�

mnopqp rstuvwxyrstuzwt{x|}u~x�}n|xw���t{y~xywx}nx����p����{}s��w}n|xwxw���n�|u�}�v������~stuvH�H����wxy|u~stuvH�H����{�}|�n�w���{��t{��nxorstuv��m�|trstuz��m�p����}twx�n{x}��{��t{��nxorstuv��m�wxyrstuz��m��{t{n�|�w}{y��m����|t}nxo��swu}{t}twx�u{��}n|xwxy����{}s��w}n|x�{�{��|u�w�|t�w}{��n}{�t{�{w}��{t{wxw���{y���n�~��}{}t{w}�{x}����w���n��w}n|xwxyynt{�}��t|�{�~{x�nxop�}w}n�}n�w��noxn��wx�{|uynuu{t{x�{�nx����{}s��w}n|x�{�{���{}�{{x~stuvH�H����wxy~stuvH�H �����n}s{�}|�n�w���{��t{��{yrstuv��m�|trstuz��m�wt{nxyn�w}{y�����p�qp�s|�xwt{�{wx����ut|�}st{{nxy{�{xy{x}{��{tn�{x}�p

� ¡¢£¤¥ ¦§¥¥¡¥¤¢©ª §«¬ª­®¢ §  °¢¤®ª± ²£¤³¤£²«ª­® £ ©ª£²ª£ © ¡«¢¦µ µ¶·

Page 75: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� ���������������� ����� ������������������� ��������!� ������� "#����� ���"�������$% &� ������ ����$����� ������'()'*�+','��������-�. "�����/,(��0�% &���$���� �1������1����� ���$����������������)2���3����� ���4�� ���#���3���$�� �����1� ���!����� 0���% &�2��� ���&������5�&,�)666/+667(�����&������% &���$����� #����� �� ��#�"� �������$�8� ��%�9�7)7+��������������:��;���9�2<������&�2����� ��:������ �;����*�5-�=�#��$������� �� ��� � "% &���$����� � ����� ���������� ��(�*)�*7�+�*7'���� ����&�������&���>�������" �������$�-����� �!����������*����5-�=1���$)< ��"� ������������"�������"���1���� ��������#$� ��� ���1�����?2�������������6)'�/+'('���������;�2�#����� �������=��������8�����2��� ��9� ���%�=����22��� �#���.�����'� #/6�������� �!�� �� "#����� � ��0��0������4���� ��"�������9��$�������������')�6�7+�6(6�;��0��� -2�����������@�@�� �����-��������������'���#������� !� ��#� �� �������� ����� "�1% ������ "8�� ��#������;��<��#6)��,�+��,7�=���� "�������������5�=������@� "��8�@�� �����-����/�%��������� �1% &���$���� �1����������������$�����"������$���� �:������������7)6��+6�,�=�������@�� �����-����/�&9�������� � !���������9�����$1��% &���$���� �1���������9��$� �% &�� �� "� ������&�������(*)����=�A����&��������>��������>�-�������>�����;�&������=�����������������������������//,���� � "� ��##� "�1 #/6"� �0����� ������ �9�� ������#����� ����������0�������#����1������ ���8� ��/)��(�+��(6�-�������-�-���� :��B�� "�����������:������ �;���� "�����,������&���� �15-�=�C�#�6!���$��$���� �����1���% &����D� �����'66),�7+,�/�-�������-�-���� :��B�� "����� "�����/�5-�=�������������!���� #����� ���"��������#������� !���#���������������0�� % &���!$����� � ������ ����3����� ��;#�"� �����'),+�'�-�� �-� �-%�-���� ���2���� :��2����@���/,/�����!�����������"� �����$�9����#�D�� ��� ��� "���#��$��������� ������� �8� �**)6�+6/�-�#1 ������������:������:�����"����&�@���>����� ��������4:2�<����2���� ���������.��2/��� �9����� ��&&��� �� "#����� �� 9��9��� �����"������ �1��#���������..��#���D#������ ��� ������7�)���+��,�-���� :��5#���$�$&��E�--�B�� "�����>���� "�������; �$����� ������������ ��"���1������������#���3���$�1�1���$�1A�� A������ ��$�� ������$������ ����������������*)(,+'(�.0���&� �"�����>���������@���������>�� �����%���-�%������ ��� � ����A������/�. ��� ��������"������� �1#��$"����� ��""��!"�����$������4���� !#���������$����:��������,')/*/7+/,�(�:� ��2&���$�� ������*�����#�"� �����1�� ����������,)7,(+7/������"�� �2�&����@�E� :�F� ":����,�.��2/��� �9�����$��/-(�� �� "#����� �� �� "#����� ���4���� ���� 0���������������� 1���!��� �������������,)*�6+*�*���:��;���9�2<�:������ �;�2����� �����/�5-�=��� ��8/�� �#������#����� #����� ����#��� ����"������ � ����� ������ ������&�������(*)'/(+6�6���%������:���� ����-�� "2������ �A��=�������� �������������������" ���� �1% &� �����$���������� ������$�����@(�����!���� � ����������������*)���*+���/����������������*�������� ���3����� �� ������1� ���� �������,)7/(+*�6�

@�� ������5���>�%���A��&&����� ���0��"5�2����!���"��@������������� ��@�;�:� �0�� ��2�����&-����(���9(/�!������������ �-(�$�� �/���$����� �������% &���$����� ���A�������������#������#����� ����������������� ����������()��/�+�����@�� �����-�2�"�&F�F����-5��������-��//��&���"��� "��4�� ���������% &���$���� �1�������������1% &��#������� � ����� ����������*�),76+,*(�@�-�.�� ��F� "F�%� �� ;��F$�����:�&�����%�2����%:����7���������������1������!�#���3�����!����1����� �-(�'�(�$����2�=2-%3 "���1 5�=� �����''�)/�+/6������ "��%�=���� "��������� �����������5��� �#���.����� ����F;��#���=�@�� �����-����/� #/6� �������0����� �9�% &���$���� �1�������% �(�� �% �(��� ���������#�"� �������� �� "�1���9������#������� ���$� �����������;��<��#��)��6/+��7'������ ��&��������� ���8�-�F�� �"��-� �:���9���� ��&�B�� "����� ���� �;� �������:�11�%��8 ����&�:�� ������@� ���;�����,�8� ��!�����% &���$����� �#��1#����#��� �� ���11��� ������������ �����'6')*77+**���������0���<�����������@�F�����:�����������@�� �����-����6��������� ��1% &���$���� �1�����.��% &��#���������2��� ���&������5�&���),/�6+,/�/�������5���$����-���"����������;�������-�����0����//6������������������� �1���� ���� ��� �����$��!�����#���3�1��� ������#����� �##���� "� ����#�����1��������$���� ������$��$���� ����� ��"�������D#������ � �$#��������� �������2����1�,)7'6+76*� ��$ �@���&�F�����:��&99����98����������&������������%�� ��&�����!-���� �&�B����F� ">����� ��������� =�&���0�����-�%��!2�"� � �����������" ���� �1����9��� ������ �������������!����0���������������� �$5-�=��:��������G;#��������1#�� �H�<�����E������� ���� ;�@���:��%�>� "B�;��A�� �!����"�-���#��2�@� �2�&�����%���� "���������-����*�% ��(@�� ����� ���$!������$�� �'�1����� �-(���� �9����$����� �1% &� �����'',)*�'+*�*�<�� �:� � �����&������. ������&��$�������������0������/����������������1������" ���� �1-(�'���$����� �������$���% &���$���� �1�����(&&���!% ��(!% ��(@���� �;��<��#��)��(6+��'��2�#�����2��������8���� �5�������=���"�������2�������%���� �@����� �&@�%����#���&���#���=�@�� �����-������ �=�<����2��� �#���.�����,����2-%���� �1 #/6I5-�=�J��� 9��9��� ���"�!���������"� ������ �1#����� �������������������� �������������/)(66'+(67(�2�����&-�<K�������%��������� -����������������������1����F��#����������2�"� ���@��� ������������&�<#��9����%�$�������������:� �0�� �������@����1�����9(/������ ����$���� �!1�������#��������� ������������� � �"� ����������$�������*)(�(+((*�2����� ��������%�������� ��:�-�� ����@�@�;�:�� ��������������:��//*�������9����!��������D#������ � ���������������� �1���1���!�� "����� �% &���$���� �1������ ������&��������6)'777+'7*(�E�� ��@���:��� ���:�B� "@�F�����:�B���������,����������� �������$������#8�� �� "�1�����&���� 1����� 5-�=��:��������,(I6�J)(''/�+(''/'�����F����*���������$� �C�D������$�1�#�"� ����"� ���"������ � ����� ��9���#� �� �����''*)'�6+'(�����������5�B��"��������$����� �������#���&�����������@�� !�����-����,�&9�������� � ����#1������������� �1� ���� ���������0���C������� �1���� #����� ���������2��������*)�,�+�,/�LMNL OPPQRSTUVWRXYTZTYX[V\UPYR]VYXVY ]_ [SaL bP SYTcPaORcccTS]VPO[RdV\US_

Page 76: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ �������������������������������������������� ����!�� ���������"�#$�������%&"� ���'�����������%���� ���(!�������"����������%��%)*+�,#-.�*�/�������0�1�2����������&2�����% &����,������3�������1�1� ����4��� ���� ���(������%0'���5��0�����1 �����%�"����3��� �������*+#*).##/����� ���������� �����������%��1"�������1�&�����0���6� ���%�� ��������������,�&'�� ��%�4&� ������������7���������������� ������'�����%�������%���������3� �����������4&"� ���'�������"����������%��%)$+/)��./)�������42���������5�0�'�%���������5����7� ��%���8����������1�2���9�����!:�%�5�;���'�����<5� ��:���=� ������%�'�:�<5�����:�%�5������,�������������"�#$ ������%���1����������������0'�������1&� ���� ���'�����&"��"����/$�+#�*.#������0����&� ���1������������ ���%�� ����$�� "����%�%�%�������'������1����4� 4����%�����'���������1<5�9�5�4�1 ��� ��������������%�"����������%��%))+)$��.)$�*��97�1���9�5������ �������� ��� ��������������������������%���3���9' ����>�����(�������4$!�'��?' ���'��'��%�����1��� ��&"��"����������%��%)*+��*���%� ������'�5�7���:� �5�;���5�0�'�%������5��������%��5� ���� ������:��%��5�7����8�6������"�5�'� �2�<5��������-�������������4%��4!���7���0����'�4 ��%�� 0'����%�� ����%������0%�����4&"� ���'����%4��%�%&� ���&� �)����&� �)0�����% ���%��+*�$.*�/�6��5���"�%��������"�5� ��;����/�� ��#����8�!���1��������%�&� ����0���%�� ���'�! ������1���%����� ����<���1����)+,-��.,-���

@ABCDEFAGHIFFBFECJKAHLIMKNOCP HAAQICEOKRISDETEDSLKNOADIJKDSKDUJPBLCGV VWXY

Page 77: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ����������

������������������������� �!""#$%&'�'(")'$$%#*�"+&&')*�#,��-�.��+*/��-�.0 �1(")'$$%#*�+*+23$'$�#,��-�.��+*/��-�.0�43�5'+26&%7'�895�/:)%*;�/%,,')'*&%+&%#*�#,�1<9$�=%&>�&=#�/%,,')'*&�;'*'&%?�4+?@;)#:*/$�A=&�1BC�ADE�+*/�=&�FGHI�AJEE �K)+*$?)%"&�2'L'2$�#,��-�.��+&�/+3�M�#,�1N�,#)7+&%#*�+)'�:$'/�+$�)',')'*?'�"#%*&�A$'&�&#�BE �<>#=*�+)'�7'+*$�O�<P�,)#7�&>)''�&'?>*%?+2�)'"2%?+&'$�#,�#*'�4%#2#;%?+2�'("')%7'*& �

Page 78: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� ��������������������������������������� ��!��"#����$���%��!&#�'����������������"����$���%�(�)�*����������) �*�+,-++�������.'������������/�%0012�3��4�����5� �)6�/�7889:�( �������)��;���)���6��������������"����$���7�!5"<=�>"<>#��)����?������<����)���6����)/�����$���%������� ��������������$���7����?����� ��6@��/�����)�?�� �?�)��� ��5@�AB�.+6���� �*��/�%070:��!C#�D>E8��>� )���F������ ����������� 6�6�*���������F@������������� 6���) ���)����$���%��� �

Page 79: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� ������������������������������������� ��� �!�� "�#$%�!�� &'�()*�!$+�#$%�����������#��%�,-.��/����#����("�������#����$�%����������������$*�0�����$�/�#��%�0����1'23�������/�� ��%�!�� "+456����!�� &+456'�7#������0�����/�8����%����3'9:�$�$+%�$#�/��$;�6.4��#$%�#$#��<�%�0����#� �/������$�����#$$���(=�����$�=>?@���#$$��A�4��B�#����#��*����%������.==@991�(/$������#��%��/����#��*A�.==@2CD-�(����������#��%��/����#��*�#$%�456'�(E*�F#$%��$��$�������0����G/#$�� ��%�0����?�#;�H�I.��#�� A�&11CJ'�=��G/#$�� ����/$%�,-.K������$��#����A�;����L#�/���� �/$��/$%�,-.��#$%��0�����/���#���%� ����������������$%�$;�,-.��$�/���#$%��#$%��/���G/�$����$���#��<�%��������;����L#�/���� �����456��#$%�'�.���L#�/���0����$���#��<�%�����������#��L����$%�$;��#����� �!�� "����/$������#��%��/����#��'�7��0$�#�����#$��M�7,� �����������$%���$%�$���N������$��'�7�#������#����;$� ��#$������0��$�������$%�$;��#������ �/$+�#$%�����������#��%�,-.�����$%��#��%O�P6�Q�1'19'�� �

Page 80: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� �������������������������������������������� �!"# $��������%�&��"��� �#����'�������(��)'#�*��%+���� �����,���%������%�� � �-���&��./�0123�456�072�������89:;�<��=>�%�0?23��#��%��������-�#�%%��'�!"# $�@AB+�����%�&�#������#��% ������&��"���CAB�B�DE��-�#�%%����F����#������%���'*�%"�>��"�%��%��'�%�G>��#(�#�������+3�$HHIJ�������*���#%�������&��"�KEBL+�M�#'����,�'�%��#����%�����������"��#�'"�+�>�����(�#�I�N,+�L��&��./�����456�=>�%��"��!"# $� *%�����#���������*,*����%������#�����#���"���#��"#�,������������������ ��"�������������%��'������,��"����������F��%�012�072+�L������#�%�3�!"# $�@AB�%"�&%��� *������%��#%����*����#���%�#�(*����������89:;�<������%����������'��"����������������OP5Q,�P�,��"�������� �#�����������������BO����8�8R�0?2+�0S2�����0T2�>�����#�(����� �@AB�!"# $�����KEBL�%�'���%����&��M=A%�������89:;�<��M=A%+�4"����##�%������'�B��#%�����##����������� ������%�C�U�>=M��#������*������ #�,����������%�������%+�4"��%� �&�#��V��������0B�#)���=�,�#2�&�%�*%��� �#������%�%3�%�������'��"��������*���*%��%�#�'����� �����#�%�+�D�����"���B��#%�����##����������� ������%�#��'�� #�,�W/�����/� �#���# �������������������������+�� �

Page 81: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� �������������������������������������� �!"� #�����!"� $�������%&�'()������������ ��"���������*+�����������'**,)�����-.,�������%� ����/����������!"� $�����!"� #����"����%&�����%%�����+����%� ���!"� $0�12�2�3����3�4�.56##7&#8�923����3���:6;7<=&#8�>�3���3?���3�@5*A:B8�C���3��2D���?�3�E-F==##=#=<<&#8�G���2��2H���3�I-F<$;<B6&$8�J��2��3���D�3���:$;K56&#&�����%%�����+����%� ���!"� #0�12�2�3����3�@7K*;;&#8�923����3���:<#K5$&#8�>�3���3?���3�@;L,M$&$8�C���3��2D���?�3�@5*-N#&$8�O�2���2�E-F77;$6$&#8�J��2��3���D�3���:$;K56&#P�Q���3�����3�I-F6#;$K7&$&�����R%�%"�R��"��%�������������S�%�����%�� ��"��**,�����-.,�������%&���%��+���T����%��/�����%��+�%���������U�%"����P�R"����S�%�����%�%"�R�������%��/���/��%+�%���+����%�������V���R��"���%��+�%��������� ���&�*"�������������%�����"�������� �+�������"��**,�� �!"� $������"�����U�������������R����**,�����-.,� ������������V���R��"������������U�����%&�'W)�X�"��������+������� ���������������%��+��%�����+������"������������ ��"��%�����"�������������"��%R�SS����� ����U���%�Y+����%&�� �

Page 82: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� ����������������������������������� �!�"�����#�!�"�$�%&'�()*�+,-��"".�,/����/���,��,�������-"0����#�123-����� �123-!�"�$� �123-!�"�$& �123-43�5 �123-43�6 �123-43�7�,��123����������80��,-�9/�����#����4:;�<$=���88�'�>,���������������������������������� �!�"�$����#�!�"�$&'�(?*�+,-�"".�,/����/���,��,�������-"0����#�123-!�"����,����.�������������80��,-�9/�����#����4:;�<$=���88�@�123-!�"���(1-!�"��* �123-�.��,���,������>-���"���8���#�+-���"���8�/����,��!�"���(1-!�->���" �1-!�-+���"*���#���.�����#�!�"����,����.����(1-!�"����-$A< �1-=B�$�A-C�< �1-!�"���C$A-����*'�>,������������������������������.88-8��D���!�"�� �����>-���"���8�/������#��������D����D���E.�����(1-=B�$�A-C�<*'�F���/�������,����/.��(G*���8���H���,�&,.�#�������,���(I*�����8,�#�#'�+,-�"".�,/����/�����,������/���,�"�#�.���D�����123����/�JK,��&�.�������8' ��AALM'�+,-/����/�����#�"0�-��DD�#�/�,�����������#������#�.���D���",.���",�,�8,��8�/��"��0�����-"0������&,#0�(G�H���,D�� �1��"��0*���#����4K3-�,��+0N-�,�O.D���#����,�#��0�����-",.�������&,#0�(B�D"� �1��"��0 �,��P��Q�,��G"".�,K��������R�&,���,���� ��BS ����/����H�80*'��� �

Page 83: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� ������������������������������������ ���!"��#�������!"����$�#���%����&��� ��"'��%����(�)*+� ,�����#�����!"��#���&�- ./ ���'���������������&�%����0��1�2��������������������'�����3�����$�(�����������������������4�%���"%#2��������- ./ �#��5"3�����)6789�:�%,��$+(�);+��� ����3���"����&�%��%���%�������&���"'�����%�������%�'���&�%����0��1�

Page 84: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� ��������������������� ��������������������������������������������� �������� ��������������!"#$���������������������������%��� �� ������ ��������&����� ���"����������%����������%����������������������� �'�� ������������������&�����%����������������������� ������ ����&&������&� �����������������������(����&&������ �����%�����%��%��������)��� ��%���&�����������&��**+������,������������- �*���(� �����������&������������������������� �����������������(����%����)%�������%�� �,.-�/ ��������������&������ ������� �0������������������������� ��������,"�%���1�����234���������-�������������������5� ������%6����7%66��������������5�8��������� ����9�:;�&���$%:����������� ���������� ���������������� ��������������������������������������������������������� ���������������� �������%6 �;���������������������&��������������������<����%��������**+������ �����=>??@ABACDEFG�HAIAFACJAK��LMNOPQRR�STU�SOVWXYOWZU�[\]\U�OPU�_\]\�aab\�cPOVW�[NQdWZZefV�gehY�cPOVW]\�ieQjYQhQfedZ�cfhWNfOheQfOX�kklmnob\�LNfQXp�qU�iQNpQXe�rU�qQjj�]U�_dYgWpW�s\�aan\�sYW�_tc__oSuTvr�gQNwZjOdWl�O�gWMoMOZWp�WfxeNQfPWfh�RQN�jNQhWef�ZhNydhyNW�YQPQXQVz�PQpWXXefV\�ieQefRQNPOhedZ�lk{|oak\�}yW~��U�[WehZdY�S�\�k{{�\�_tc__oSuTvr�Ofp�hYW�_geZZo[pM�eWgWNl�Of�WfxeNQfPWfh�RQN�dQPjONOhexW�jNQhWef�PQpWXefV\�vXWdhNQjYQNWZeZ�k�l�kbom\�QhYMOyWN��U��QXVYOpN�qU�SyzXpWNPOfZ�_U�_dYWjWNZ�LU��ONpQZQ�S�U�rWQfYONph��\�aa�\�L�xWNZOheXW�fOfQhNOj�RQN�MeQdYWPedOX�Ofp�RyfdheQfOX�ZhypeWZ�gehY�RXyQNWZdWfh�RyZeQf�jNQhWefZ\�SQX��WXX�[NQhWQPedZ��l�o{\�_dYNQpefVWNU�rr�\�aka\�sYW�[zSur�SQXWdyXON�}NOjYedZ�_zZhWPU��WNZeQf�k\mWpehQN�WpehQNZ\�_jQNMWNh�LU�TQPOefV�[U�rWQfYONph��U��ONpQZQ�S�\�aa|\�[��L�OdhZ�OZ�O�ZhOheQfONz�XQOpefV�jXOhRQNP�RQN�hNOfZeWfhXz�efhWNOdhefV�uwO�Owe�RNOVPWfh�POhyNOheQf�jNQhWefZ\��ydXWed�LdepZ�WZ�mmlm|ko�\���

Page 85: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells
Page 86: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������

���

�������� ��� ��������������������������������������� ��������������������������������������������� ���!�������

Page 87: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Page 88: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� ������������������������� ����������������� ��������������������������������������� �������� ���������� ����� ����!�"�#���������� ������������ ��"� �������$����� �����%�� &�#�'(�(���(�)�*�� (�+������%�������� ���� ,���� ���-���� ����.�"�������"�&�.�*��"�������&�.�/�-���� ���� ������0����� �����1���.�0234567894:8;<=;>4?@>67AB;>;CDEFG;><HA@84:6:G8HI:J8B8@84EK@GLBCH=6MB9B>B6:JHN:BO47JB8D=@:B?PEQRSST=@:B?PEU34567894:8;<AB;>;CDEAB;V4:87@9EK@GLBCH=6MB9B>B6:JHN:BO47JB8D=@:B?PEQU2WUX>6:4CCH=678B:J7B4GES34567894:8;<AB;?P49BJ87DIIEN:BO47JB8DY4C4:JZ@7CE[SRWSY4C4:JZ@7CE\34567894:8;<X7;84;9B?J6:G]BC:6>76:JG@?8B;:E=6MHX>6:?_HI:J8B8@84;<AB;?P49BJ87DEQU2WU=678B:J7B4GEW34567894:8;< P49BJ87DEK@GLBCH=6MB9B>B6:JHN:BO47JB8D=@:B?PETI:J8B8@84;<=;>4?@>67I99@:;>;CDEa4>9P;>8V 4:847=@:B?PEb4796:Y4J467?P 4:847<;7c:OB7;:94:86>a46>8PEd 4:847<;7I:84C7684GX7;84B:]?B4:?4=@:B?PeIX]=fEQ2Sdd=@:B?P6:GQ34567894:8;<XPDJB?JEN>9N:BO47JB8DEQ[RQ2N>9Eb4796:DY4?4BO4Gg;O49Z47QEUR22hY4OBJ4G6:GF??4584G=67?P[EUR2U���ij��ii���������� �������������������������������(���� ��������������(�� �(�������(��������������� ��k�� ������������'�l������'���������m�����n�������� �������������� ����'�������������� ���������l� ���������� ���� �������'����o� ��������� �������� �� ����� ��� �����������j+���'�����������������������k�����(���������� ���#����k ���� ��� �����(��pqrprs�o�������'������ ���� �����������t� ��� �� ��k������� ����������(�'������������l�����'�� iu ,v �� �j�� ����� �������o������������� ��������l���������������������� �������� �1�(���� �������l�����pqrprs��pqrpwxs����������������l�������' ��������������� �����tj� ��������'yt l��((������� ����������o������� ���l��( ��������(�������tj%i�����������k��� pq zp{p|s ������ ������� ������������������������� ��������������������!� �� ���� ����(���� ��(�'���������������������������������'��������������

����� �� � ����� ���������� � ��� �� �� �����}���l�� �����~� '���(�� ����������'1�k ���� �� ���� �� � ������ �������(�(����������'����������������������������������1�k�������u+ij~���iu~+����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��¡����¢£����������¤��¥¦¢§�������¦£��������������� �����©��������������������������������������������������������������������� �ª�«��� ��� �������� ¬�©���� ���������� ������������������������������������ �������������������������������¤���������©����������¡£�­����������������������������������������©��������®���������«����������������������¢�£���������������������������������������������������������������������������������������������������������«������������������������������������������������������������������������®�����©����������������©�������������������°������������������������������������������������� ���������������������� �±�������������������������� ��������������²³¢ µ �¦µ¶§¢¡· �«²³¢ µ �¦µ¶§¢�·¹����²�����������º�������������������°�������������������� ������������»�����¬��������������²³¢¢¦µ¼ ¼¦¡�¼¢· �«²³¢ µ �¦µ¶§¢�¡¼·¹����²������������������º ������«������½�������������²»�����¬����������������������� ������������¾��©��������¿«�����¬����½���À����¿«����¿Á¦¡Â¾�¾Ã�

ÄÅÆÇÈÉÆÊÆÉËÌÍÈÌÈÎÏÆÐÑÒÓÔÒÑÕÖÕ×ËØÉÙÔÓÚÔÓÛÜÝÞÎÏÝßàÌÒáâ

ã�����������£�¶¦��½������� �¿«����¾��©������½�������������¿��������������������������������������������°�����©�°��������������������°���������»�����������²ää������©������������ä��������ä����ä¡�¶£�������������������������������������������������������������������������������������©�����������������������������������

åæçèéêëèåìèëíîåïêîêðñèòåìíóðôèêåìèèêîîåõçöéëîòêíå÷ðñèòåøùúåøûüøåýþå��������þý�þ�����þ���å �������å�å����å��å����

�þþ�����ý����������ý��������ý���å�� å

Page 89: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������������ ����� ������������� ����������������������������� ����������� ����� ������������������ ����������������� �����������������!������� ���"��� ������� ���������#������ ���$%&$$������������ ����������������� ���������� �&��� � � ����������� � ��� ��� ���&������ �� �� �������!���������������� �!����������������$�&$'��(������ ��&��������������������������������������������� ���$)�������������������!��� ����������� ����������� � �$*��+� ������ �"��� ���&���������������� ��������� ��� ����� �����,��� ��$��&��� ���������������� � � ����������� ��$-��.������������� ���� ������������/���� � ���������� �� ������&���� �������������������� �!�� ��������$0��(������ ��&��������� � �������/!������ � �� ����,��� ������� �� �������� �������� ����� ���������� ��������$���'��+������������&�������������1 � �!������������� ����� ��1 �������������������� �����&������$����������&�/�����)������� �������������!$��������!�&���2/��1������������� ���1 ���� ���������� ���������3 �����4�5�&�������������������� ��� ��������� �� � �������������� ������� ��� �&��� ������������ ��������6!�����������������*��-�����������#�������� � ������ �� �����1 7!�����������������0������&1���� �����������2���� ����������������!������,��� � �����������������&������������������������ �� �������8��� 1����������96� ���/�������� ��������������������������������������������/������&1����������������� ���������7���� � ��������� ����������������� ��������������������������� ��1 �������������� ����� ��1������������� ����: ���� ���������������������������������&1������ ������� �������������� �� �������� ��� !�����&� ����"������ ����������!�����2��)%%;6�); +4�%� +4�%����<97�4������ ��� ����/���=>?@?A���@>?@BCA��������&�����������1���� ��������������D.�������� ��&��� �������������� �����#�� �"���� ������������ �������� �� ���� ������ � �������� ������ ���� � ������ ������ ����� ���������������������� ����������������/��������������������������������� ���� ������� ������������������� ��EFGHIJFKLFMNEHGOPNL<��<�����������D�����������D��� ������� �� ����������� � � ���QRSSTUSVUWRXVWYZ[\RTV]ZX_ QaYZbTSZ]Zc7��������1����� 1���.DdD ������4��������!������1���$%e(7<�<��������$e����������;������ !�������'-f7���*e 7���7����1������������������(g����. �9 ����������<���������� ������ �������������h��������� ���( �������� ������������ �&(�7<����� ���� ��/������ ������������<�!����������D�����������D��� ������� �i

jk RlmWR[[]ZYZYSn[][96��� ���� �����.6��������� �1������� ����������� ����������������.���1��������,��1����������������������#����2���� �� � ����o����������)0%�9 ����� ��1������������ �����,��� �� �49 $����D5<�������<����������������� �1��� ������B!������1 !������ �������� �&����� ����������� ���96� �� � �������������������1��� ������������#������ �p�������5� �������p� �������&���������� ������&������ ����35� �����p�� ����&�����&���� ����� ��&� ����������&��������&�������� ���/&���� �����&����������� ������������3���� p�� ����� ��q][VZRRlVWYTV]ZXjrsqrtQmUW]uTYV]ZX[UTW[RcWYb]RZVXTRSSUSYW\WYTV]ZYV]ZYZb[YSV[VYv]S]VnRlmRW]wRZV[�����/������ � ����� ���1��� ��������� ������������'%������ ���1�������������94��4o7������� ����������������(����� ��1��������������������� �����x�%f7�.������ �D6��������������� ���������������� �!��� ������ ����<�����������D�����������D��� ������� ��(����� ���� � ��� ������������ �/���������1���������� ���������������� ����'$�''�1������ ���������( �������� ���������� �����<�����������D�����������D��� ������� ��ZV]vb]R[( ������������ � �������!�����2����� ���y������&�������� �������� ��� ����7!������������ �����ggdz997< ������1����������,���4������<��������o� ��� ����g������� ����� 5<� ����{�&�������������.���� ����� ������!�����2�� � �� ������� ����������1��� ��������� ���������������� ��y������� ��$�$$!$$ ����+�g$������1��������������������9���y��������� ��������&����'�1���������������4�����!����" |����!<������� �������������������������������� ��� �� 1�����2�������2���� ��( �� 1��� ��������������� ����1������pyg�4.� ���!�*--0&<����7�,�&yg(4�9 ����������<�������&y�����$'��'&�����&y�'��$-�$&�������� y����� �7!�������p�)$-)&����36!�������p�$0��'&������( �� 1������ ��!������� �������������� �"���1�����������!� � ��pg(4!��������g(4!5����� ����yg(4���� ��� ��� �������y������1����������� �����94!� �:�������� ��������� ��������������1���d7o �����������������&��� ������ �����1���������������d7o�����������.������ � ���� ���!����� ������ ����������� ���� ���� ����� �@>?@BCA�������� ���� � ��� 1�� ������� � ����+9.��!��������� ��������� �����o+!7�9��_SUWR[TRZTRw]TW[Tmn \TRSS[YZbT}Ww [wR[4�������� � ������������ � � ���������� �~ ���!��������� �� ��1��� ��������� ������ �����')��8���!2��� ~ �������� ������� 1�� ���� ���� �

� �����@���@�������C��������������������������������������� �������¡¢����£¤�£¥¦£

���¢§���©�ª«��¬­�������©��®�°����¬�¬�«��±�

Page 90: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������� �� ��� ��������� ����������� �������������� ���� � ������� ������� ����!"� ��#��$�������%&���'(��)' ���������&& ���������*������� ��%+������������������������������,���������-������#�. �� ��#��������/���0�1*��� 2�������*/����� ���� ��� '�/�3�45 .�6 ���0��0 ��/������� 2�0������������ �������789:;<=>?@A<><BC;DEBBC<FG������������'������������H�����������H�������� ����IJB;KD>CLABA@>D;K>DC<FMCBN;OC<A;PC=LC<P>DDPQDBQR>SJTU9VW;<=O;LLL@>PBRAO>BRCPC=><BCEP;BCA<AXYZ9[\]L@>PCEPPN;@>RA<>PAO@D>?>L�_� �����5�������0 G�*a� ���� G�*a� � ����'-_�&��!��������� �����5��� ������������������� ��!��!�/����.b%.��� �0�*����������_& H'�H'��������������/���������$�!���������/���c�������������5������������� ��������/������'�����*�������H�����������H�������� ����IH������ ���*����� �H'�����������������������������.6������� ��!�� �� '������������ H����������� H�������� ����I� ������������/�����������������,����/������'������������d�!��'��TOOQ<AeQR>LP><P>OCPRALPA@fAXP>DDPfPD>]=>@><=><Bg7:]\[Z[h;<=g7:]\[Z[ZPNRAO;BC<C<PAR@AR;BCA<������������5������������!����0�.i������ ��� ������ ���������/������'������������H�����������H�������� ����Ij?@R>LLCA<AXR>PAOKC<;<BNQO;<NCLBA<>@RAB>C<LC<klmnopqmnqrmstquqvwqxpsAPB;O>R;<=<QPD>ALAO>R>PA<LBCBQBCA<������������5�������%����,����������!�������� ����������� ��!���.y���������� �����������������!��� �� (� ��������0 ��� ���*����������0������ ������ �����0 �� �.y%����G�����������z{|z}~�� ���������� ��������� �����������%���'��*����������H�����������H�������� ����IJC<FD>OAD>PQD>7A�RLB>RR>LA<;<P>><>RFfBR;<LX>R'��0�� ���� ��� G������� ������� � ����0� �����/�����G4)d����0������ ���!������������/�������!��������#���/�����*���� �����#������ ��b������� ��!���������������'������������H�����������H�������� ����I�AD>PQD;ROA=>DC<F;<=��LCOQD;BCA<Ld������ �����������0�������'�4�*���� ����#������y���� y�����������%��������0����H�)4�./�� �,�������/������������������0��������!��/�� �,�����GG���6������0��������������d��������� ���0������ �����������0����H���&&��� �������i������������������'�4� ���� ������y��d���������0�����/������ �����������0������ ���������� �����/��� ������� �������� �� ��������0����������#������ ��a����G����b���H�����0���� ���������������������)�.���d��������0(*�����������&*��������

����������������������%������0�������0�������� �����������0�!����0(�%��0������ ����/������0&*�������� �������� �� ��a ���y�� i��� ���d��������� ������������#������������!�5������y� (�&����������������b���d������ ������������������ ��������� ����0 ����������� ���������������0��������0��� ��������������������������*���������������� ������������������0��'�4����� *�����H��������������� �����������.����#�� �b������(�d�����!������0�H)����������������������*/�����/������������0#�������������00����������d�� �b��H���"� ������������������#��� b��%��������0���������������/�����������%��� ������#��������/�����������!������������/b����������#��������� ���#���0����������������/��� �����������0#�������G������%��������� ��������0��/ � ��� .��� �� ������/���������������/������#����� ��������������������.� �� �������������������������� ��#� ��a� �������d�������� ��������0��� �� ������������0���//���� ��/������#����� ����������������#�����.� �� ����������� ��a� ��������������9DB>R<;BC�>L@DCPC<FAXYZ9[\[ZAPPQRLqvwqwsd�����*������ ������* ��������00����������#��0����������������� ������ ���/�� ��a#��������5�����#����!������ �% 6��-�������%��� ��a� � �G������������� ����������� �����!����������#������� �������!� 0��������0 ,#� ��//����� 0��� ����� ���'������������G�0���'��������0�&4��� ��,����!������� ��0������ ���������� ��a� ���a� ���!������ ��a� � �a� � ��4(�%����0������/������������ �#�������������� �����'������������G�0���'���������0������� ��a� ������������ ��������������*�������#������� ��z{|z|��-���������0��%����!������� ���/����a� � �4(���!������ ����� ������������{}~������}��� ��� (������� �����* ���2�� 0�!!������������������{����������-���������%��� ����0������ ��/����������5������������������������/��� ¡¢£¤�� ���/��#����������������0������%�� ���0�������¥�~z�����~z�����~z����%�� �����¦���������}}��%����0�������{���§��zz���������*��/���*���������������z}©~zª«���©������������������-�����/�������������%��������5 �������/��������%���������*��0������������� �%�/����������%������������ ������������������a� � ��������G���������� �����#������������0�������/�����%������ �������5����������!!����������!���% ������������ �������������/����� ¡¢£¤�� ����� ����%�/����������%�����������������������������������������a� � %������0���������� �������#��0�������#�����0�����!!��%�����!����������������//���� ��%������0�����2��������������� ���������5������a� � �������������0�'��������0��%�� ����������� �a� � *��� �, ������ ���������%������������2������ 0������%��00�����0����a� � ��0��!����������� �, �(�5�%���������������������������0����������� ��a�4(������5�����������//���������� ������������������������/���������������#��&4 ���&4��

�����z�¢�z��¬����~�©­¡®¡ °±²³±µ¶·¹º¶³²³º»¶»¼¶½³¾¿±ÀÁµÂ¾µ±½µ±ÃŶ¼±ÅƱÅÇÈÅ

¾³³ÄÉÊʵ²¹Ë½Ìͽ¹ÎϽÁ¹µ²¼ºË½¹ÐÊѽҵ¼½²Îα͹½Ó±

Page 91: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ �������� � ��� �� ��������� ����� ����� � � ��������� ��������������������������� ��� ������������������� � ���� ���� ��!��"#�������������� �� �� �$% ���$% ���������������������� ����� ����� ������� �� �������������� � ����������������&������ ���� ��'(��)*�+,-. ���� ��#�/��� � ���������������������������0����� ��������$+% ����������������������������� �����������0� ��&����������������1 �1�����2������ � �����&������ � ����1 ���� ��� �� ��� ���� ������� ����� ��345356�7� ��������1 � ��� ����������!0� ����������-����������� ���������������������� �0 �� ����� � �� ������ ���� �8#�"� �� ������� � �!0� ����� 9� �� ����9����������� ��������:��+��:�����;#��������� <=><-���?���������$+#� �����������@ � � �� �������� ���������A���9� !0� �������������B�����#����������������&�� ��� ��� ��&�����������������/8#����� ������������������������ �������� � ���� ���� ��2 �� �� �������#�@ ����� ������ ���� 1 ����������� � ����� �����& ��� � ��� 1 � ��� C����� ������� ��9�����������������DC<DE!#�����F ������ ����������/8� ���� �!#�G���B��������������������#�� �� �1 ��������� ������ �� �������������� ��� ������� ��� ���0�������0��������������������������� �������� ���� � ����� ��������������B������������������������#�/��� � �������� &�������������0� ��&� ���H 9� �� � ������ ����� �������� � ��� �� ������ � ����������� ������������������� � ��� ���� �!#�/��������������������������� ����� � ���345356��� ������ ��� ���� 1 ��IJKLMNONOPQRSTUPSVVWPXYZTRZTSU[\PXUZY]TZ SUPX<1���� ������ ��� ��� �� �������1 �1����345356�� � ����������������� �� �������������� ���&� ����� ��� ���������� ������������0��� �"� ��������?�������������B������������ ��/8����� �� ���������������#�� � � �� �

_abcdefadghi_jkgljgdgiadghimn mopqrpqsqrpqsqs rt st ut vtwxxywxyz{xywy|yw}{~{�~wx����}x~��~��y{~|wxxywxyz{xywywyw}{~{�~wx����}x~��~��y|~|wxxywxyz{xywywyw}{~{�~wx����}x~��~��y|~| �t|{�x~}xw|w|{�x~}xw|w|{�x~}xw|wpqrpqsqrpqsqs �t rtt�|�~����w�~xz���z{���|�~����w�~xz���z{��

nt ot �tw}�{ww�����|w�}���wx�w{yz�y}y~w}�{ww�����|w�}���wx�w{yz�y}y~w}�{ww�����|w�}���wx�w{yz�y}y~�|�~����w�~xz���z{�� rrt rstyw|�wxxx}�����y{��xyyxyw|�wxxx}�����y{��xyyxyw|�wxx�y~~�{ ��y|}��y|w�� �r �s�u ���u��v�hb�gi��h�agi� �

�pqsqs��pqsd�ai�b�g�d�� trtstut

vt�tnt��� �c�a�c�ayehdh�s�{{y���{���ys�u dc�dg�k�ca�dih��af fji�ih��affji�dj�h�rfji�dj�h�sk�ca�ddj�h�r khicdj�h�d�e�hg�dj�h�h�a�edj�h�k�ca�ddj�h�s dhdaf�cdafk�agi�g��hba��j�bc�ckcffj���hidaffhkcbc�ck�afbh�dc d�afa�j��c�jffahkfhi�ada

�cj��gdiga�k�cj��gdiga�kihi�cigfffcb¡ ¢ �pqsqs�p�pqsqs�p�pqsqs�p�pqsqs�p�pqsqs�p��ys�u�c�a�c�ayehdh�s�{���u|u

�pqsqs �c�c��c���a�c�������abdghi�

JP£¤T[¥N/� ���&��������������¦#9D!������"���������� � ������� ����� ����� �������� �� ��&�����������������"�� � ������F ���<D�7���<§8� ��� ���� 1 ��!������� � �� ��������� 1 � �������� ����7#� � � ��� ����&�������� ����������� �� � 1 ������������� �� ��� ����������������������� �����#� ��� 1������������� ��� ���� 1 � ����� � ���� ���� ��!��"��©#������������� ���������������������������� ������!����@ ������ ���§�ª �����+�+��#�/� ������������� ��������� �����?�������������������������������� � ���������� ��?�������:����� ��������� � � ���� ������������9����������� ��������� ���� ����� �� ���������� ������������� ������������������ ����� ����� ������������� ����������� <=><-���?���������$+#�§H��§)��� ������ � ���������������<����0� ��&��������������������«¬­®°46±°²³®�H+#��µ#/8��� ���DC<DE!����& ���������������� � �������<2:�¶=�< E�< E:������G�·�#����� ��/<=7=#� ����� ������������������B�������B<�����B��!0� �����#������� �� ����������������� ���������#���� ����� &���� �����1 ����������B�������������������� ���� � ����� ��� ����������������B����������������������#�

¸ ¹º»®3»¼»3½²¾®²®°»¿ÀÁÂÃÁÄÅÆÇÈÉÊËÌÈÅÄÊÅÌÍÈÍÎÈÏÅÐÊÑÒÓÊÇÔÐÊÇÏÇÕÖËÈÎ×Ø×ÙÚ×

ÐÅÅÖÛÜÜÇÄËÝÏÞßÏËàáÏÓËÇÄÎÌÝÏËâÜãÏäÇÎÏÄàÊàßËÏå

Page 92: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ��������� ����������������������� ������� � � ��� �� ������ ���� � !���� ������ ������������"� ����������� #��������$��������%&�&����$������������&���������$����������� ������ ������������������� #��"��������� ��� '������� ��()�&����$������������&�)� ����' *����' � *#�������� ���� �$����$���� � �"���������� ��� '�������+�������' � ������ ������ #����� ��������#���"���"� �����"���������������������� +#��"�"������������������� )���)���������,����-)��� ."� ����� "�#�"����������������� #����������� ���������$��$���� ������ � ���������"������ � (�/���� ���$��� ���+����' � ���"������� ��������"������� �������� ��������� �$���������)��+ ���� �����"�����"������� $��"�"��� �$������������ ���������� ����������+����' � �#� �������������� ��$�����"��$� �$� +#��"�������� ���� ����������"� ����������������������)�+ ����� �����"����� ���������������"��$����+��"���"���� ���������"����"���������������� .��� ��$���������#���������������� ���,01��������������� �$���������������' � �#�����,��$�������� �$� �� ��� � �������� ������������� ����' � �#� ���������()��������� ���������$������� �$� ��������%�+ ���� �����"��' � �� ����������� �$��� ������� .�����2��"���������' � �"��$������������������$��������+#�� ����� �����345����"��$�����678�������� ���$������� ()���� � �������+� �������+�"�� �$���������)��+����' � �� ������$����������� ����+#��"���$�����$���� ��� �����"��$�����������9�� )� �������������������/���� ����$������� �� +#�"����"� �2���"���"� �������������"��� ������������$������ �$���������"������������ #��"��������"��$������"����$������:;<:<4 .��� ��"� ���������+#��������$�� /���� ��� ������� ����� �"������"�����=���������$��� #��"������� > ��� ��������� ? �����$��� ���#�$�������� �"�?�������"���������� ������� #��"�������������� �����$��� "�������$����� �����"��� ��������$���������"����@A$B@A$ �����������������������9)���&����$������������&9� � �������+������� "�#�� �"� "��"� � $������ (� ����� �+�������+�' *����' � * "�#��� �# �������+#"�"� �������$���#��"�������� �������@�� ����)��"� ������ ���������"�����#���� �$� ������������� ��=��?������@9�+#"�"#�� ��� ����������������$��� (����� �����+����' � � "�#���������� �����������"������)��+#��"CDEF ��������/���� ������"�������*$�� %������ � $�������������������,��������=�� ������#��� ��� ����������� ��������� #��"�� �+�����$��������� �# ���������� �"����� ������"�����$�����������G*H��� ���������������"���������"���������������������������������� ���#���' � ������"������������ �������90+&����$������������&9%���!� ���' � �� #�� ���)��+#�������,����� ��������������������������� ���������������$���� �IDF+G*H�C* * ���@�F+G*H�C� @ +�� �������-����$���� �����G*H�CE J ���� � �� ������� �#��������� #��" � G*H� ���"��������IKL$�� (� ����� �+�������+�' *����' � * "�#������ �$�������������������$������� �#������� #��"G*H����"��������DK*I$������ �������� �#��� ��"������#��"�G*H������#"��� ����$���� ��+#�$�� �����"���?��"� �����* E�@JK@I�����"�"� ��������������������*M�@D+@L�+���"01��� ������������� +���������"����*M "�# �������$�"�� �����������"������ ������� (� ����� ��� ' � � ��� )��+�������������������* E#� ������� N����$���������+#��"������ ���"������' � ����)��������� ������* E "�#����� ����������+������������ ����� ���,01��� ���������' � ����)�� (������$���#��"��������������"�$������ � +

OPQRSTURVWXYWZ[\[\ ]_TUR \Q Z[a Z[\[aZ[\[\ ]_TUR \Q Z[a Z[\[abPQRSTURVWXYW

cTURc defghi Vjfjfhkl efghi _Wfmeing\ooaoodoopooqooaooo rstuvwxyz' � ����2� ���"����� ���� ����������������������"��$���� �{������ ����$������� �������� ��������������� "�# ��������2��������������� ������� �$����� 01�#� ������ ������#��"0��(����� |����������""���� ������ "�#����"������$�N����-���}�����+0��(}���� &�����~@A$ ���0���������$��� ��$����"� � ����� ������������ ��������� ���������� ������� �$����� N������$��� �������� "�#����#����}�����-0��(}���� &�����~*EA$ ���%"��$�������$���������� ���������� �������' � �#� ���� ���#��"N1� ����#���������,������ ��$������� �$� � ��� ��� � ��������������������� ( ����� 01� ���$ �� ������ ��� � ��������������� #� ����2��������� ���������"��� � ����� ������� �������������$������� �$� �$��?��#��"� ���� ?�#����$������������2����() ����"��� ���M���������������"���� ���������' � ������+���M�9������$�

��65�:6�6:�3��3��867����� ������������������������������������������ ����¡¢�¡£¤¡

��� ¥¦¦���§�©��ª«�������§��¬¦­�®����ª�ª�©���

Page 93: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������������ �������������������� ��������������� �������������������� ����������� � ��� ��� ���� ���������� ��� ��������� ��������� ��������� !"�#$%&'! ($%)*! +,�- %-!-��.%/-# #$0# (-.+1#*'# �&./%)*-! *��%&!*-!% 2���� ���� �������� ���������3�45���� ������� ���6�7���������������� ���� ������� �����5������������� �����89�:;<� �� ������������ ��� =���8>;<�?� �����45���� ����������������� ���������� ����@�� ��A�� �����������B� �����B����� ������A������������������������ �������C�� ������������ 5���������� �2�������A��� ������������ � ������ 5�A���� ������8?������� ��D����?EF<��DG7H�����5�� �� 8����5���I D���� E4 � � �� �5���I?������� ��D����?EJ<�?����� ���45���� ��������� � �� KDH56�7 86�7BBB< � � KDH5����B8����BBBE<��������������� ���� ������������� ���������������� ���������� ����5��� � �� ��������� �� �5���DG7H�6� �������������� � ������45���� ���� �����3��� ���A��L� ������������� ���������� �2�� ���������A��������� �@�����45���� ����� ������������������3��� ����� �������������������� ��A�������������45���� ����� �����KDH56�7 �� �����86�7B;:<� � ����� �������������3�45���� �������� ������86�7B;:M4�����<�7������� ���� ���� ��� ��������������������������� 6�7BBB������ ����� ��������������L� ��������� ������������� �@�����45���� ����� ���������������� ��� �����3��� ������������������������NOPNPQ�2�������A������������������������L� ������ ��������� ��������5����� ��������A��� ���������������������� �����������B8��� ������RBSB�9<������8��� ������RBSBBE<� ���45���� ����� �����6�786�7TTM4����B� �6�7TTM4����������������<�U ������ ���� �������L� ������ ����������� ������ �������B��� ���������������U �� ������ �������� �@��45���� ����� ����������������� �������� 5���������� �������������� ����������� ����� � A�� ���� �� ����� ��������������� �6�7��5�����3����L� ������ ��@�� ��������! -#/*&-�1!-.V�W��X�Y#&!Z&[\]_* $ abW]&.*Y#/% #&%)Y0#c#�* $!�$#Y%�!-#$! -%&./%)*-! %�-�!$#%d XY.*�#e���������� ��������� �������������������� ����� ����������������������� ��� ��������� �� �����������?� �����������������������A ������������ � �� ����� ?AB5������ 72H5���� �� �������� �������������3��������� ���� � ����6�7S6�JA���6�7��S6�J�����A���� ����������8B;�>B<�A�A� ��������������������������������������������������� ��������� �6f������ �6f����������������� �KDH5����B�5�����A��?Ug74��������������� ���������� ����������KDH5������ ����B� ������5��������������� ��������������� �KDH � ���������� ���� ��3���@�� ���������������������8D����h� �?������� ��2����?B����������������������� ��3������� �<�i����������j���������� ������L��� ��� ���������� �k!(�/#l�2����j��������������� �� ������������� ������������� ���@�� ��5���� �� ��� ��8W<6f5KDH�����A�����5j������������������������ ���� �D����� �mQn� �opq����� ����������@������ ��A�������� UJA���rKDH8���<�r6�78������<� �rK7HF6 8������<�8s<DG7H@�� ��3����� �������������KDH��� �����������=������ ��� �� ��������������� �������������KDH�KDH5������A���5���6�7���� ����� L������ �6B�;� ������������� ����� Br86HBr<�t�� �������B;S�R����������A �������� ������u���������������������8b<DG7H@�� ��3����� �������������8J<������������KDH�KDH5������ A���5���6�7�����B������� � ���� ��� �������8v<w�� ����������������� ��DG7H������H������A������������������������ ��x���������� �A���5���� ����� �6�7���� ��� ���������A�����6B�;� �6HBr������� ��5���� � ����3��� ���DG7H�����u����� ������?F8���?������� ��D����?E���� �5���DG7H� ��� �������������<�

y z{on|No}oN~m�|m|�qop����������������������������������������������������������

������������ ¡��¢£����������¤�¥�¦����¢�¢�¡��§�

Page 94: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������� �� ������������������������� ��� ����� ���� ����� ��������� �������������������������� ������������������ ����� ����� � !�"!#$��������%&'(�����������������)�*����)��+����� ,-./' ��� ��� 0���1�/0�2�'!� 2�'!�$��)��+� & ����0/$���������������������������� ������� ���� ���)�)����� ������+��� ������� ��� �� ��������� ���������� �����%&'(����������� ����� ������,-./'���2�'!���)��+� & ����03$���� ������)�� ���� ���� �� ����)� � ���%&'(����� & ����0.$�2��������������� )����������� � ) ������������/�� ��� ������� ���� ��� ��� ��� ����)�� ���������� ������������)��+��3�������������������� ���������������������������� ���������� �������)�� � ��� ���� ) ����� ��)������, �������,-./'���2�'!�����������)��+���������� ��������������������� ��������� ���������)���.��4��������������+���������������������� ��� � ������� �%&'(���������������������������� � ��� ��������,-./'���2�'!���)��+�������� ��������� � ����� ����������� ��� )���(�� �� ��������� �������%&'(��������(������������� ������+���� �.��4�����,(�������� ��� �������5�6( �������� �������(����� 7�� ��������� ��� 7����8���������) ������ & ����#$�%&'(��������(��������������)�� ���� �������)�� ������ 7�� �������� � �������������� ����������� �� 9���������� ����������,-./'���2�'!���)��+��������������� ���������������������������� ��)�����������/����� ��� ��������� ������������)�� ���� �� � ������������ !!$�,��� ���������������/�� �+���� ���������������� !4$����%&'(��������(������+�� �� �� ���������� ��� ����� ����)���������)�� � ��� � �� ������ ���� � ������������������� ��� ����� �2� ����������� �������� ����������� �������� �����)�)���������2�'!����,-./'��)��+���� ��� �����������( ������� ��������������������������� ��,(��������������)����� �����+��������:;<=>;=<?@>A?BCDEFBGHIHIJEKL;D<MFB=EN<DODB;AFE;PBDP>;?MD<QP@RFBC?BRDBA?B>DSTUV<D?;AFBCPBE;<=>;=<?@@WRDE;?VF@FXDRB=>@DPEPMDEY����� �������� )����������� ���������� ����������)����)��� 9�������������2�'!����

ZZZZ ZZ

Z

ZZ

Z ZZ

ZZ

ZZZZZ

ZZZ Z ZZZZZZ

ZZ

ZZ

ZZZ

ZZ ZZ

ZZ

Z

ZZZ

ZZZ

ZZZZ

ZZZZ

ZZ

Z

ZZ ZZZ

ZZZ Z

Z

ZZ

Z Z[\]_a

bcdcefghaijkllmnokpopmpq

rnmorsqmsjrqtuZZZ ZZ

ZZ ZZZZ

Z

ZZ

Z ZZ

ZZ

ZZZZZZZZ

ZZZZZZZZZ

ZZZ

ZZZ

ZZZ

ZZZ ZZ

ZZ ZZZZZZZ Z

ZZ

ZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZ Z

ZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZ ZZZZ

ZZ ZZZZ ZZ Z ZZ

ZZ ZZZvwxyzw[{zvz|}|~�zx��x}_y�zw\ �x��~vyx����x}_z �x}aaxzw}aa��~~zxy~� z~x\��zx��x\a��v{�~v [[a[� fgh�i��qrgo���osg�l�fr�mnu

��x\ao�glpfm�|~�zxo�glpfm�gq�m�ogkqfrm�j|~�zxo�o��x\a����h�gksno�rsnm��gsq�lrs�sqj�

[\]_a

fghaijkllmnokpopmpqrnmorsqmsjrqtu ��x\ao�glpfm�|~�zxo�glpfm�gq�m�ogkqfrm�j|~�zxo�o��x\a����h�gksno�rsnm��gsq�lrs�sqj

[a[� fgh�i��qrgo���osg�l�fr�mnuZ

ZZ

Z

Z

ZZZZZ

Z ZZ ZZ

ZZZ

ZZZZ

ZZZZZ

ZZZZ

Z ZZ ZZ ZZZ ZZ Z ZZZ

Z

ZZZZZZZ

ZZZ ZZZZ

ZZ

Z

ZZZZZ

ZZ Z

Z ZZZ ZZZZZ ZZ

ZZ ZZ

ZZZ ZZZ

ZZZZ

Z ZZ

Z

ZZZ

ZZ

Z ZZZZ

bcdcdZ ZZZZ ZZZ ZZ ZZZZZZZZZZ

ZZZZ

Z

ZZZZZ

ZZZZ

ZZZZ

ZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZZ

ZZZZZZZZZZZZZZZZZ Z ZZ ZZZZZZZZZZZZZZZZ

ZZ

ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZ ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ Z

ZZZZZ

ZZ ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ ZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZZZZZZZZZZZZZ

Z

ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ

Z ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ Z ZZZZ Z

ZZZ

ZZ Zvwxyzw[{z vz|}|~�zx��x}_y

�zw\ �x��~vyx �� ��x}_z�x}aaxzw}aa��~~zxy~� z~x\��zx��x\a�������v{�~v [

�������o���� �����o ¡¢obcdceo �����o¢¡ obcdcdoo£�����o ¡¢¤o ¥���¦�§o�x}aa �[}{ ^ {�oiaa�u ��x\a�x� �[ ^ }_]{oiaa�au��x\a � \ � {aoiaa}]uy~� �][ ` }�oiaa[}u��v{ �{} {a \oiaa{�uxzw}aa `¨a � {�oiaa{[u�~vyx }_[ {{}oia�__u��zw\ }\ [ \oia _}u©ª«¬­ ®°± ®²­o³² µµ¶��zx �� [ \[}aoiaa[u ��x\ao�o|~�zx��x}_y ��a[ []aaoiaa u��x}_z � }� [[ oiaa uvz|} [�} [}a\oiaa u�� }�} { }}oiaa{�uyzw[{z a a �a_oiaa}uz~x\ �][� ] �[oiaa}u |~�zx|~�zx �[[ [_�}oiaa]u����� �z __{oiaa[auvwx �{ � a¨ oiaaa_u·FC=<D¹H�������� ���� ����/��(�� ��,-./'���2�'!�����������)��+��%&'(���(���������/��(�� ������������)��+����������º����������+�� ��%&'(����� U$���%&'(����� »$����,��/.(������������*������� ����(������ ���� ���� ��������������������� � ��¼�������½ %&'(�����$��¼������½ %&'(�����$���(����� ��%&'��������������

FC=<D¹H.��� ������������������ ������ ���� ������� ������¾, �������'���� �9������ �������� ����/����� �� ����� ���������� �����¿)�)��������,-./'��)��+ �����)�)��������2�'!���)��+ � ������� ����� ���� � � �����'����� ���������/��( ������� ������ ����������������� ¼��������� ��½$������� � ��� ������)���9������� ���� �������$������(��) ���� ���������$�,�����,���)������2����,������ ������ ���� ������� �� K$� ������,-./'���2�'!���)��+)�)��������� ����)�� 7��� �� �� ���� �����������������1������������)�� �� ������������ ��� ��� ��� ���%&'(������ ���� ��)��� �����9��$�������������� ���������(��� �������� ��,�����,���)������2����,������ ������ ���� ������� ������� ����)�� 7�������� ��

ÀÁÂÃÄÅÂÆÂÅÇÈÉÄÈÄÊËÂÌÍÎÏÐÎ ÑoÒÓoÔÕÖ×ØÙÚÖÓÒØÓÚÛÖÛÜÖÝÓÞØßoàáØÕâÞØÕoÝÕoãäÙÖÜoåæoåçèå

ÞÓÓäéêêÕÒÙëÝìíÝÙîïÝáÙÕÒÜÚëÝÙðêñÝòÕÜÝÒîØîoíÙÝóo

Page 95: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������� ����������� ������������������������������������ ��� ���������������� ������� �� ������������ � ���� ���� ������� ��������� �!������ �����"� ����� ��� ������� ��#!�������#����������$������������� ������������������������ ���� ������ � %��� ����&'(&)*+����� �������� � ���� ����������� ����� ,��

!������ ������������,-%,�.���,/0����������1������/�2����������������� � %��������������� ���3���� �"����� ������������������ �������%����,���������4���������� ��� �������������� ����������� 01�����5�% ������ 2�.�� ��!�� � � ������!�������%����� ����� ��������� ��������������� ������� �������� ������#���� 0/42%��� ����� ��� ��!��01�����5� ���%���������2�6����� �����%�������������������1�������%���������!���$�.������������������������7,�.����� %��������������������������0,-7,/2��������� ����������������� 01�����5������%���������2%����� �� ����������3���� �� �8�7��9:���� � ����� �������������� 01�����5.2���� %�$����.�������������������������� �����"� ��������#����������������7,�.����� ���0,-7,/2��������� �� � �#������� �;�������������������0��#��������1������/.����2�6������ ���%�����������$��� ������ � ��3����� �� ��!��� ������������������������������������������� ����������� ���������������&'(&)*+%����� �� � ���91�#����� ������ ���� ������������������������� ��� ����� ���� &'(&)*+������!���������������������������� ��� �������%������� ���������������� ��� �������������7,�.����� %0,-7,/2��������� ���8<����#��������=>����5?4@8<�� �������� �;���������A4A4������� ������ %������� �������,��������4��������������� ��� ��������������� ���8<����4A4������� �������%���� � �������� ��� ������!���9: ������ �������������������������� ����01�����B�2%��������������;��� ����������=>����5?4@8<������������3������������� ��� ���������!���������� � ��������������������

CDEDF CDEDEGHIJKLM MKNOPQRSSOMOKTM

RUTMNIJKLM VWX YSZ [\X] VWX_YSZ QMNM VWX YSZ [\X] VWX_YSZ QMNM

abcdefgh����4���������������!����� ����������������������������#���� ����������������������4�B�� ���� ��������� ���91�#����40���2���#�����0�����2����� ����������:�i��!� ���"����������������������������#�� � ���� �8<��� ������� ����������8��6�������"��������#3�������!����������� ����������!���������������������91�#��������� ����� %��&'j&)k������������ ��������������3��������� ������%������������#�� � ������ ������ ����������������������� ��������������:�i��������������������� ����#������������������������ �l���������� ��������� �������� ���091�A�����m:�iA���m8��6A���2��������nop��q rsqtuvw\ Exy_zQ\Z{ |}s}~t|}s}sK NMKTM��TKQMNTMTNKQMNSRQMNFE�����yHF Ey �y �y xy Fyy FEy

�E\��S��O�QM_zQO{ \ Exy_zQ\Z{ ��O�QM_zQO{

K NMKTM��TKQMNTMTNKQMNSRQMNFE����yHF Ey �y �y xy Fyy FEy

CDEDFCDEDEu �E\ ���S�� ��TKQMN SRQMNTMTNKQMN�E\ ��SF��[K �CDEDFCDEDE�� ��TKQMN TMTNKQMNSRQMNCDEDF CDEDEF��[Kabcdef�h�������� ������ ������ ������ ����������� ����,�.%,-���,/&'(&)*+�0�2��"����� ���������������������������������� � �������������������,-%,/���,�.������ ��#����������������,��0 ������2��.��0�� ������20����!����2����������������40 ������2�������0�� ������20������!����2����$ ����� ����������������� %�� ����������� %�������� ������� ���������� ����!���0�21������� ����� ��������,��#����������������� %.��#������������������ �������� 0���2������4#����������������� ��������#������������������ �������� 0�����2��������"����4�� �8�7��9:��� ��������������� �������������

� �k���&���&�j��j��*�������_ ¡_¢£¤¥¦§¤¡ ¦¡©¤©ª¤«¡¬¦­_®¦£°¬¦£_«£_±²§¤ª_³_³µ¶³

¬¡¡²·£ §¹«º»«§¼½«§£ ª¹«§¾¿«À£ª« ¼¦¼_»§«Á_

Page 96: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������� ��� �� ������� ��� ��������� ��������������� ������������������������ �� �!����� "#���������� �� ���� $�������%�������$�������� � ������&'� �����%���� ����������$ ����(�����)������� �� ��������� ���� ����� ��� �'� ������ �!����� " ���������������(!������*��+�� ��%��$������� ���� �������������������� ����'��������������$

,-.��$����%����������� �� �� ����/������������$ ������0 ������� ���$������� �������� �����'������������������.1��2����� �����(0�'� $���������� �� � �� ��������0 ���� ������� ���$��� ���� �����������������&'� ������������ ��������3�������,����� �� �����������(0��������&'� ������������ � ������'�$�������$����,�4�� �� � ���������$������ ����� �� �������������(!������*�0����������������� �������������$������'���������������������� �������/�� ����� ���� ����������� ���'�������������� ������������ �� 0������ ��� ������������ ������/5�����$(����� �� �������(67869:;����� ���� ��� ��������������� ������� �� ��������� ��� �!<�/�.=��2�������������� ��� ��� �������%�0����������������������������� �� � ������������ �������������� �������������� ��������,�3�� ����������� �!�����"���/��%� ����������������� ��%������� �������������� ���� �� ����)����� �������������>�$��������0��� �������������$��3?���� �>��� ����!� 3��%������ ��� ��������� ������ ��$$����������� ������ �������� $ ����3� ��� ������������ ���������� ���������� ����������������������������(2#�!����� "���� � ��%�� ���� !<�/ ������5�� 0����� �������������� �� �� ������������������44���-44�& '��0������������$���%���� ���������#�� ����������� �2� �����(0����������$��������� �� �%����(������������ �� �������(���� �������� �5�������������������� ���� ��@����������� �� �5����� $�� ���������������� ���3A�B��!<������ ���� ������������� ���������������� �������%����������C�������������� ��� ���������(�$$���������������� �����'����D���E������� ��� �#� �������>� ���� ��������������*4�0�����$����&� �������� $����� �� �� ������� ��, �������������( !����� �"� � ������2� �������0���� �������� ���������� ����������,,,A0���������� ����(�������� ��� ����!<���!�����A�0��� �������� ���������(����� ���� !<���������������(!������A#������ �(�/�� �67F6G6H;���� ��%��������������� ����� ������� $3���� �����(�$$����� ������ ���������!�����1�������@����(0��$$����� ���� ������� ������ %�����&� ���E����( ��@��� �������� ������(�# $����� ��������� ����,�������,,,A���5���������� $��������������B��(��������� �� �� ��� ���� �������������������� ������� �� ���������������� ���� �������� ���3A0�������������@� ��(�����������������������������������@���'3$( ,,��������������>(�����������** ����������3A��� �����!�����1#������������(0�������� ������# $����$�������������� � �� ��������(��������������($�����I ������� �!�����1��+��� �������������������3A���������������(���� ��%��� �����$��������%��� ���%�%���� ������� �$����� ���� ����������� �� ���%�������� ������)� �������� ���!�����1���2� �����(0��� ����� ���� �������� �������� �5�����$��������� ������(����� ������������������� � ���������� ���

J KLMNOLOPNOLOLKLMNOLOPNOLOLKLMNOLOPNOLOLKLMNOLOPNOLOLKLMNOLOPNOLOLKLMNOLOPNOLOLQ RL PL PSTUVWXYZ[\]U _ __ __LQQQQPaQPQQ bcKLM

VWdef[\UaQ LQQRQQ SQQghijk clmnNOLOLopqNOLOPNOPKLMrVWdef[\U

NOLOLNOLOPKLMPOLQORQOSQOTPOQQOLQQ QQ RQQ aQQ SQQ sQQtuWvkgwhfvewXYqfhjveYwX

w\YX [hwu\WegxYqfkwfQf\UfVWde

y hjvtuYYzVMU

PQQLQQQQRQQaQQPQQQpi { | { | { |KLM NOLOP NOLOLtuYY d}sMVz ~ KRKLoKKLM NOLOP NOLOL_ _ _NOLOP NOLOL cKcNf[V{kYu\

Ps�zW

������������� �������������� �� ����� �� � �����&'� ����� ������������ ������ �����������3��0����,�������� ������������ �� ����� ��������'��( �������������� ����0�����������-� �A"� ��%�������'� � ���������� ���������(�����%�*� ��������������� � ��� ������ ��������������$������� ����()���(,1� ������������� �� ��������%������ ���������($�� ��� �$�������� ��� ����(��������� ��������3��%������ ��������� ��$�� ����(�!�������%�������$�� ��� ���������(�$�������� ��� ����(�� ����(2#� �����2 B<�� ��������������� ����������� �� �������������,��������������������������������$�� ��� �� %� ����)��� ������3A������(���������' ���������� ������(�������)� ���3���� %������ 0���������&������ �� ���������������3��0����,�������������� ��� ���� ������ �������������� $&'� ���� �>��������'��� ��������� ���#�����()������� ���������'�������$,-.���!���������������������������( � $$������������� ������ ����� ��������������(!������*����&������ �� ���������������3��0����,�������� ��� �����������������(���������'� ����������������������� �������� $ ���� �!<�/ ��� �������%���� $���� �������������� ����������)���4�& '���������� ����� �����& $ �>��� ��� ���� �����������$��3? �!����� �� � ��������������������� ������ �������� $ ����������� ���� �� ��� ����������������������������(2#� �����!�������(��������������3���� � ��� ������������

��HG�6H�H6�F��F��:H������ �f��f ¡¢£¤¥¦¢��¤�¦§¢§¢©�ª¤«f¬­¤¡®ª¤¡f©¡f°¥¢f±²f±³±

ª��°µ¶¶¡�¥·©¹©¥º»©­¥¡�¦·©¥¼¶½©¾¡©�º¤ºf¹¥©¿f

Page 97: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� ����������������������������������������������������� ����������������������������� !"#$""!%&'�� �(��)�(� �������*�����������+��)��(� ������,-�. ���������������������� ������ �������������������������������������/ ������0������+�������������.�,�,������������������������������ ��������������������������������(� ����*�������� ���������.�,�,��������� �����������������������������10�����������������.�2���.�,�2� �����������+���������*�������(��)��� ����������������3��+�� ����������� ���4��.�,�,���)������������ �10���������4�������������+���������������������+ �� ����� ��� �� �����/� ���)��(������.�,�, ��� ������������������������������������������������������� �� �� �� ������,- ����������������������3��+����� �� ������������������,-� ������ �(�� �������������������+������5678�������)�������������(� �,-�.��(����������������9:;<= ��� 9:;<; ����� ��������(� ���+��,-2��������������+���������������������������������������5628�'��������+�(������������� ��� � �����,-�.�,5�,->?8�����+���������������0������+���������������.�,�2���.�,�,�@A-������������/ ��������������������� ��.�,�,��� ��+����������������0����*�������� ���� �������������������B��@A-�����+�3��*�������(����� ��������������+� �������������������� �������������� ���������������������� ������0����+� ��� ��'�������(�������������������������� �������0�������� ����������������(� �������� � ������������������������������� ���������������C�������������������+������������ �����������.�,�,0����*���4���������+� ��������������((����������������������������� ����������(� � �����������������������������(����)��+0�����'���������������( �� ��.�,�,D��������������������������������+�E�����0����*������������� ���������������*��� ���������������������������56,8����������� ������� ��

F

GHIJKLKLJKMGHIGHIJKLKMMMN

OPQRSTUVWSQXRYTRTUZ[ \]WV_Xa bNHbLcbLHbMcbMHbcHcMHMc TRTUZ[

dQeSVRWTYfNYghYSX fLiKJYjbSTUQRkeY\la dQeSVRWTHMLNmcnopG

WqVQRYj WqVQRYr

JKMJKLKMMMNJKLKLstbuVWSXUY\lL a XvQQS[

HLHHmHHnHHpHHMHHHMLHHMmHHMnHHMpHHLHHHWqVQRYj WqVQRYr

wxyz{|}~��4��.�,�,10�����������������������*����� �����������������������������������5�8����������������.�2�.�,�222����.�,�,10�������10� ���5+����(�����������������10���������������� ������������)�������8����� ��(� � ��0� ���� �������5����������������7���������A0 ���8����5����8������������(�5�� �8�������� ������������� �(�����������+����������������+>�����6���������������������������,-�.0�������������������5�8������������������(�����������)���A�����������22,��,-�.5����1+������������+8����������� ���+����� ���������� ��������������������������������������������� ��.�25( ��8�.�,�222�5�� ����+8��.�,�,5���)���+8�����������������������������������������������������5�8������������+��������C0��������������(�����������27����22������������,-�.������10���������������������������������������������������5�8����������������������+��(���������������������������,-�.������0��������������

�� �������<�������������;�=;Y� Y¡¢£¤¥¦§£ �¥ §£©£ª «¥¬Y­®¥¢«¥¢Yª¢Y°±¦£©Y²³Y²µ²

«  ±¶··¢�¦ª¹ºª¦»¼ª®¦¢�©§ª¦½·¾ª¿¢©ª�»¥»Yº¦ªÀY

Page 98: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������� ���������������������� ��������������������������� ������������� ���������� ������ ������������������ ���������� �������������������������������������������������� ��������������������������� ��������������������������� ����������������������� �������������������������������������������������������������������� ����� ����������������������� ������������ ������������������������������!����������� ��������� ��������"����������������������#��$%������ ������� ����������������������������������������������������&������������������������������������������'��(���������� ������������������� �� ������ ���������� ������������������ ������������(�� ����������)����������*��������� �������������������������������'���������������������+,-�./�0/1�*�����������������������#�����������������2����������������������������� ����������������!��������������( ��������������������'�����������3�������������������� ���������� ����������� ���� 2�����������)����������*������������������������������������������������������������������������������������������������2���������������������'����������+41������������������������������������-��(�� ������2���������-,������������������(��������������#�� ��������������������5 ������!�����������������������������������������67���������������� �����������������������������������������#����� ����� 389:����2�8�� �������� ��(�� ������ ��(������������������'�����(�������#��;#�*���������#����;#�*��������������������������������������������������� ��(���������������������������������� ���������������� ������������������������������������-�������������� ��������������������� ������������ �����������������������������������( ������������������*���#�������������� ���������� �������� ����������������������������� �������������������������������� ����������������<����������#���� ������ ���������������� ������+991�=����������������������������� �� ��� �� #��� �� ��������� ����� #�������������������� ����� ���� �������� �� ������� �������� ��(����� ������������ �������������� ��������!�����������#������ �������+0,1������!�������������������#�����������������������������������������������������������������������������+0,1�3�������� ��������3�=4:������������������������������������������(��������������#����;#�*�������������#��;#�*�����+0.1�3�����������������������������������������������������(��������<�������������������� )��������������������������� �� �� �������� ���������� �������������������������������������

���� ����������� �������� �� ����� ��� ��(������������������������������� �������������������������������� ������������������������$��8���������������)���������3���������������5���!��2������������������������ ����������������������� ����� ����������� �������+091����>9�����������������������������&�#����+9:1����!�����������������������������7�-��� ��(�����+001�����)������?@A?B?CD���������������� ��������������������������������������)����������������������#/���������'�����������������������������������������������( ����������������������������������?@E?FGD��������������H��������������������������(��#��������������� ����������������������� ��������������������� �������������������������� �����(�������������-�7���������������������������������������� �����������������6������ ������������ �������������������������������63������������� �������������������������������#������#/�/������(��������+041� ����������������������� �������������������������������� ��������������������������� ���������������H�� ������+041������)��������������(�������������������� ����+0I1����������������������������������������������������� ����������� �� ��� ����� ������ ������������������������&����������� ���������������������� ������ ����������������������������������������� ������$������( ��������������������� �������������+1�� ���������������������������( ���������������������( �����������������������������'������������ ����� �������������������*����������������������������'����������(�������� �����������+4:;4�1������������� ����������!������� �( ���� ������ ����� ������� �����������������������������'���#������������������������=�������������������������������������������������������������(���������������������JKLLMNONPQRSTURQR�� ��������H������������� =�����V�� �������� ����-��� ��������$������-;�0���� ��������>�������>������RWXPYZMNU[NONPQJ ����������)��H�������>�\����#�\���)���2�>��������>�#��'�����$�>�]�����8����'������������� � ������������) ������������ �������������_$8� � ����������������_$8 ������������������ ������������������H������� �*��������������������>�#���'��� �>���������>�������������� ������������������� �*������������������(������������

abCBc?CdC?eAfcAcgGChijklj mmnopnqrstuvwspoupwxsxyszp{u|n}~ur�{urnzrn��vsyn��n����

{pp����rov�z��zv��z~vroyw�zv���z�ryzo�u�n�vz�n

Page 99: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������� ��� ��� ������������ �������������������� �������������������������������������������������� �!"�����#������ $��������%&$"'()$��������*��+%�)�����(,�-�(��.����.�)�'/ �������*��*0�1���2���� ��� �"�����2���������,����������#������ %�2�$'%���.�'/ �3����������*����4�����)������2���� %3�4)2'%���.�(5�2�(2�2����)�����'/ �,������#������ 3������%�5�2�'/ � �����������2�6�4����� #������ )� ������2�������� ��� 3������� .��� )������� %�24#)�.)'%�)�4�()�2�7����-�)�'/ ������������&������4��*��� 0��������� ����*�%�&-�0��'%�-�)�'�$�����*������������� ��*�8&$"�9:;<=>?:@=;?ABAC?C?D?AEA;?�0������������FG�GFG�HGIJ���������(-�,�%JKLL'9MB:ED?=;�)���*��(0�1N����O������� (3�(0������ ���()�2�(P������(0�-��������()���%OQQL'3 �������������������*�������*��������������RSTUVAWUXB:?A:E=>C(Y(JQ+ZJJK�[���������(,��������()���%OQQ\'� �����������8�������������*�������*1���]=:>MAEU9A ]=:U(_(+Q+Z+Ja�b��������(2�(�����(4�(-����(��-����&������()�%OQQa'�����������������������8�������(�����������������������������cde>AU]=:>MAEU(f(aJZLK�+�#����(3�(4��� (&�(#�*����(,�()����������(P�(0�1����(-����������(7�%OQQO'�������O���������O�g����O�h�9dBBUiT=;UjA;A?UkAWU(fl(J\OZJ\K�\������(5��������(&�7�%OQQO'� ���������������8�����6������������� ����*������������m�� ������O�������������n���� ��������������]=:>MAE=C?Bo(f(+Kb+Z+KbK�a�7��*(��N�(�����m����(2�5�(#���(3�(-��*��(0�5����-����(2�)�%OQJJ'-�������������*������ � ������������O��h3��������������*�������p:U9AU]=:U(qf([LaJZ[LLb�L�) ����(2�)�()���()���("����"��(&�(#�� ���(5�.�(2����($�(����� �(��(�������(��($������2���������(3�(������(5�(�����(5�5�A?D�%OQJJ'� �������*�������� ������O�����r���������J������*���#)3���������������������������*�sd>A=>t>=uCVACU(qv(O++KZO+aQ�K�w�*���(3�(�����(3�(7�������(��(,�*(#�(�����(.�(�mm�(��(&��x�()�(3 ����*��(��(.��m�3�������(��5�($�������m�3������(P�A?D�%OQJQ'�������O�3����������*������ ��������������(���������*(��� ������J������*�Xy:cjA;A?U(z(�JQQJO[b�JQ�������(4����3��(5�%OQJJ'4���������������� ������O��h��� ���������*������6���������������������]=:>M=E]=:TMoCt>?D(f_fv(OKQZ[QO�JJ�2��r���(2�(.�{����(.�("������(��.����"�������(.�%OQJQ'#���������* ������������*����������� ������O��h��*��������������RT=|A;A?=>C(Y(O\aZOaO�JO�&�����(#����3 ���*(4�%OQQK'������������������*��������������� ������������O��h�]=:>MAEU9A ]=:U(_}(JKZO+�J[�)������(��("����(0����"�������(.�%OQQK'#�*��������*����6������������������������������� ������O��h�]=:>MAEU9A ]=:U(_}(JaKZJLL�Jb���������(&�"�(3�x�*��(��($�������2�������(N�(� ���()�(.��(4�3�(7����(5������������(5���%OQQa'�O��h��������������m������*����� ����������� ������������*������������������������������������Xy:c]=:U(Y(�LJ�

J+�h�����(2�($��� ��(��(h ��*(-�(h ��(2�(3��(��(w������(��&����"��1��()���%OQQK'�������O��h��������1� #0����� ����� ���������������������������#0���sD?dBA(zf(bJKZbOO�J\�#��*�����(&�(������(.�(#��*1��(4��������� ���(&�5�%OQQ['4��������� ����� ������������������ ��1� �O��h�����*������������������������Rp]i~U(ll(J+KKZJ\Qa�Ja�#��*�����(&�("������(���������� ���(&�5�%OQQb'#0������������������������������������O��h��� ����������*��*�����sD?Uc?Bd>?Up:U]=:U(ff(\+QZ\++�JL�h�������(5����� ����(��%OQQL'�O��h8���1���� ���c?Bd>?dBA(fz(J\\ZJaK�JK�&�� ���(&�(2�2�����(��($�m��(.�(#�����(4�)���������(5�%OQJO'�������O��h������ ����������n����*��%4)�'*�����������*����������������������������������*����������������������������*��������9D;>AByA??U(qfY([LZba�OQ�w������2���($�()��*(5�h�()� ��(��.�()������(&�(#�������(2�&�(0���()�)�(4������(-���(����� ���(&�5�()��m����(3����3����()�5�%OQJO'������������O��h��������*���������n��������������1� *�������*�����������*��������������*���������jA;:EAVACU(ll([QaZ[OJ�OJ�3������(2�.�(�����()�)�(&������(&�(����� (2�(,�������(#�0������������()�%OQJQ'3 ��*�����O��h�����������&0��� �����������*��������� ���*�������jA;:EAVACU(l�(J[L[ZJ[KQ�OO�)������(��("����(0�("������("����"�������(.�%OQJQ'�O��h�����6���������������������������������������������������9A 9o>A(v([\bZ[aQ�O[����()�(-�����(3���(& ��(#�(��r����(2���(2����(3�,�(#������(����() � (4�-�(.��(5�(- ������(��(���������(2�)�A?D�%OQQL'"��������������������*���������������� ������������O��h���������1� �������������*��������p:UcoC?U]=:U((JLL�Ob�,�����.��m(5�2�("��m���m�#�����(#�(&�� ���(&�(�� ���� �(����������(5�%OQQK'� ���������������������������1� ������O��h���������� ������%�O��h�J����O��h�O'��������������1��������������� ������� ���������������������]p9RW:U]=:U(v([J�O+�����(��3�(0������(,�3�(2� �����(#�(5�����(.���()� ����(2�($���(4�("��������(2�(������(��2����5�����(P�0�%OQQ\'��������������������������������������������n�������� ���� �������p:U9A XB:?A:E=>C(Y(J[JbZJ[O+�O\���������(&�(3����(2�(��1���(��()� ������(4�������P�����(5�%OQQ\'3 �������m������ ������O�����O����������� ���������������������n����������������������p:U9A XB:?A:E=>C(Y(+bJZ++O�Oa�&�� ���(&�(�� ���� �(��(#���(-�.�(,�����.��m(5�2�(2�&�����(&�()�����2�����(��(w��� ���(0�(������*(3�3�(����m��(2�5�() �����1�m(5�A?D�%OQQK'3 �������m������ � ������O��h�J����O��h�O��������������������]p9]=:U(}(L\�OL�)���������(,�(h�m���(4�3�(.��(4�0�(&�����(#����3 ���*(4�%OQQa'2������r�����������O��h�����*��� ��������������1� ��� ����������������� ����� �������p:U9AU]=:U(l}(\b+aZ\b\L�OK�7��������()�2�(2������()�0�(������ (3�(������(.�(2�����(��(2� ����()�()����(��(2����(#�(.��� ���(��(-������(,�A?D�%OQJQ'�����n��������� �������m������1����������������n� ������[�������(�[�g����[�N�~U9AU]=:U(fv�(aaaZaKJ�[Q�) �� ��(&�(&������(��.�(�����(3�&��������()���%OQQa',6������(���n������������������ �������sD?UXB:?:>U(l(Jbb+ZJb+a�[J�7������(5�(#�����(4����������(7�%OQQJ'.������3$�J�� ���������������������������������������*��1 ���������0\a������p:U9AU]=:U(lf([LOQZ[LOK�[O�7�����(&����$��**�(����%JKLb'��� ����� �r��������������������������������������� ��������������*������������t;DU]=:>MAEU(fq_(JbJZJb[�[[�h ��*(��(#�����(&�0����3�����(��#�%OQQ+'"������1��������������mJ(� ������O������� �������������������������������������� ���* ����������9A(flq(OJKZO[J�

�� sd>A=>t>=uCVACADB>M�������������������������������������������������������� �

����¡¢¢���£�¤¥��¦§�������£��¢©�ª����¦�¦�¥��«�

Page 100: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� ������������������������������������������������������� �!���"#$$%&������'(�� (���)�������*�� ����+����������� (� �, ����-��� ��������- �����.��� ��.���(�� � ���.� �.� �/0123456782593:2;3<:8�=>?�@���A@��B��%�C��.���������D�������!�������� ��������� �������� �+������������E��������F� �����C���).�����������������-�����G657�"#$'$&H���������+������� ����(�����.� ���-���.�I����(��,���-�*�(�-����� �� ����.��� �������������� �JG77�=K?�B@LABM$��@�C��.������������������N������ �+�����O��((���N�N��+�� ����������C������P�������� �����������������-����������������Q�..�� ���Q�"#$$L&��� ��+��� �����-�*Q�RR����� ��� �.� �)���.���)�������*�� �������) �����JG77�=S=�%MA@B��L�!�T�������������"#$$M&��TH���������� ��-�(�(����������, ��������� �����+���������(�(���I���-�.� � ��� �� ���(�����.�I����(������U�����, ������4563V;16G2WX173�?Y�'�@LA'�L#��M���� ��������� �� ���Q���"#$$M&� ��.� ��.�����*��*� ���� �� ���+����� �����*�Z� )���� � ��+�+��/0123456782593:2;3<:8�=>[�#�'%A#�#$��B��)�����Z��D��)����.��-���.�P���N�����!�E�����\��!�����+����)����������O���]������E�-�����"#$$�&P� �� ���������*�� ��� �.� ���(���� �� *��.�� �.�������� ���� ����Z�� G6W19_ Xabc173�Sd[�#�A����$�Q�� ���.����E����)���Q��N���������P��!���������� ��������N���.���"'BBB&�U��� �.���* ���*�������-�� �* ��� ����������������I��������� ��� �.�(� �������-�Z� �U��� � �e3 173V;173�?ff�#'�A##B��'����\������ �)���������\����P� �����)�����Z��P��-� �.)����Q��.���� �������E�)�������������E�-�����"#$$�&Z� ��� �.� ��������-����� ����+�������#������-��������)''M�� �(��� �*�Z�� ^Vge3�?S���'�A��#���#���� ������C������������-�����������)���������������Q�������E��-�� ��������������!���"#$$B&Z� ��� �.��� � �.��)�����.������ ���� ��������) ��-��I.��� ����PDQ�/0123456782593:2;3<:8�=>Y�'%�$MA'%�'����������������h�) ����+�D����� ����!����E�.����!�"#$$%&��� ����������+���T ��������V;1iWb_3e3�fj��%$MA�%##����Z���D���� ������k����.�����������E����� ��Q����Z����� ��������+ ��-�+�\����N�� ��"#$$@&���I��� ���.���� ��-��I.��� ����PDQ�� ��-��. l �.(��� ��������������)����T(���.��� �e3/Wb_3JWGc3V�==>�##'$�A##'#���%�E���Z������(����� ���Z��N��-�\���� ������k�������(���)�)����D���-���P������N�� ��"#$$%&� ������PDQ.�� ���.��� ������ ��-����**� ��-���.��� ��� � ��-����������-I�� ���T ��������V;1iWb_3e3�ff�#B�BA#B%���@������\��N��!��!�������)���E�����!��k���-����h���-�N��\��-�P��!��(�������E���P��E���Q�G657�"#$$�&�(����I ���-�*�� �,���*��.��� ����.� ���� �.������� �*(������ �� ���� ����� ��I(�� �U�����..� ���� �� �� ������� �e3J1cim63JWGc3�?K�'BBBA#$'#��L�N��-����N��*�P����!����������N������.����������!� ������"#$$�&��+���(.�������� ���-�*�-�������.���*�� �,����e3J1cim63JWGc3�?[�''%LA''L���M��������������� ���������)�)�!�R�"#$$#&�� ���*, ����-����������*��-�IU�����)���.� ���-� ���'I!!.����lRR�����.��������������+����������e3J1cim63JWGc3�?S�'@#�A'@�'��B�����-���D���������Q��Z����� ���������� ����������C��������"#$$�&�����-�(��.��� ��*�.(��� ������-)*�� ���� l*�� �I,���(���.������������� �) ��� (� ��/016G;X_�[d�@LMA@M��%$�����P����!���� ��������Q��.���� ���������E�-�����"#$$$&!�) ��� ��� �����*��� ��� �.� ���(���� �� ��������-���+�������� �����#��h�4563:60m263V;173�d�''#'A''#��%'�����-���D��Z��� �����D��(�����!������C��������"#$$@&�� ��.(��� ��(��(���� �����)D���� �..������e3 173n05iW^19G73�?[��M'A�M@�%#���-� ���Q����� ���-����R �����������.���������.����Q������������N��������N��] ��)�.����R�����������������"#$$L&�� �����#�.������)� ��-�������)�� ���� ���

� ��)�������* ����� �������� �V;12WGc3V;1iWb_3oG_3J1ccmX3�S[d�@#LA@�#�%����������Q�����������N�����������C����������� ����������.����+��"#$$�&�� ����+�������#��� ��*�� ����� �������)������� ��� �.�� ^VgoGi3�[�L'%AL#$�%��E�+��������Q�p�-���������k����������������"#$$$&P�(���T ���-��*�� �����'�'�� ���.��������+��-��.�� ��� �456m0G�K>f�ML�AML@�%%�Q�p�-��������-�P��\�������������������"#$$%&�'*�.��)�� ���� ������� ��� �!�������*������-����� ����������)���!I���.������.����e3V;173JWGc3�?f>�#LM$BA#LM'��%@��� �����Q�����O�������� ��P��� ����������������Q�"#$$$&�)��.� ������-�*�� �����'�� ���.��������+��- ��� �456m0G�K>f�MLLAMM'�%L��� �+� ��Q����������������������Q����� Z���)�����"#$'$&�� � ���-���������-.� ���� .�*����������� ��������+� ��� l������-������P������) � � ^Vge3�?j�'##%A'#���%M� �.�������-�E��N�� ������������.��������)��h����� ����������..��� ����"#$$�&��-�I������I.������)(�(������� �*��'�������� ���.�����*.�..����� ��� �^173V;173JG773�=[�#M'BA#M���%B�!�������Q��� Z�������������������Q�����������������-���������� �����Q�"#$$�&��������� ��* ����������� ���.������.��� �)�)��.� ��'������-�:2;GX2G�?jj�L#'AL#%�@$�!���� ��������N��� ���P����� �����������P����Q��.���� ������"'BBB&P�-��� �*+�������� ������ #�+���U�����*����� �(������+���(.����456m0G�Sjj�@B�A@BL�@'�E����\��E�+� U���Z�������������"#$$B&Z������NP'I!l��� ���.����I.���*)��- �.(��T� �����+����((��-*�� ���� ��� �.(����� �V;12WGc3JG77V;173�fd�LBBAM'%�@#�!���\��������������� �E����� ��������� ��Q��E����N���.�����E��N� �����������!�����)�P�!����!�����)���N�"#$$%&Q��.�..�����\E'(������� � ����� �������*���QPP��qQR�@$�� ����� ��)����� *��� ����P!�� �.(��T� �e3V;173JWGc3�?f>�'�@@%A'�@L$�@��P����������������!���\����� ����������� �E��N� �����������!�����)�P�!��!�����)���N����!���+�����!�"#$$@&����, ������*���.��P!�� �.(��T������.���� ���.�����)�� ��(������-����� ����+�������#��h������ ��� �.� �V;12WGc;_60b�K[�%@L'A%@LL�@����)���\������ ��N��E����N���Q�������!������"#$$�&��� ��������*�� ������ �� ��+������*���Z����� ����� ��)����� *��� � �.(��T*��.)�� �����.�� � 173JG773V;173�?K�'MM�A'MB@�@%���-����������������E������*����Z������������)���\��]���)�P�Q��!���������������������!������"#$$M&D�*'� ���(���*��.*��Z���.��� ����� �.��)�����+�����������)���� ���.����� ��)���������Q�I��(�������T ���-��*�� �����#�+������ � 173JG773V;173�?f�##%LA##L$�@@�����)����� U�� ���D����+�)�Z������ ��������������D��E�r�..��E�����������E����P��������"#$$B&Q���� ���.��� ��������� ���.��� ���� �(� ��� ��(���)����-������-�**� � �*���� ��(�������#��h��(� ������/s1:nGXG63�[��'$$$@ML�@L�N��P���Q �������������N���"'BM#&������� �*�� ����+������ )���� � ���� ���-�� ��$*��.�' ��� �JG77�S=��@LA�L��@M�P�.� ��.)���������R����R� ����� �R�"#$$%&��� ������)��.� �*�� ��� �.� ���(���� ��l �.(��� �������� ��� �.� ��������-�� ����+������ �/016G;X_�[f�@M�A@B@�@B����Q��D�������Q��F-������������!��.���������+�����P����N�� ��"'BB@&������-��������� �������������� ��-��.��� ��� lr���� �� ��� ���� �����-)���� *���������� ��-����������� ��-��� �(����/0123456782593:2;3<:8�jS�@#@�A@#@M�L$�P� .� ���Q��������-�Q���� ����-���������E����-����������-���������� ��P�"'BBB&�� ��-��PZ� �� ����-.�� ��� ����.� ���#�'� �*��. ����T(�� ���� �.������+�� ��.������*�.��� ��� ����� ���*��.���������+� (�� ��-�4m27G;282;9_oG_3�?d��@M%A�@MB�L'��� ��� ��������������������-���T�!�� ��**���������E������������"#$$%&(�� ��-��-����� Z��.���������������-���� ����.� ���#��4563:60m263 173V;173�=?�@#�A@#%�

4m27G;282;9_oG_G502Wtuvwu xyz{|z}~������|{�|�������|���z���~���~z�~z�����z��z����

�||����~{������������~{����������~��{���z����z

Page 101: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� �������������� ������������������������� ���!���"�����#�$������� � %!��$���!��&'()*+,-./),0*1)2*31/�456�7��7�87���9��:�;�$�����<��=������;��;��>���������?��=��@����A��<�����B�C����%����?��=�C��@�!�� ��;��D������D�����%����E�F-,.�����9��>GH�IA��!������$����:��"����������������������� �������������@�;���%������!���������JKLMN*�OP�:Q7R8:Q�9��9�@����������D������A����7��D����!����������� ��������������S�����%���!����?�����������$%������!�� ����!TJU2VFWF-2)X�Y�:ZQ8:����R�E���!�� ��"B ����?���C��>�����������D�����[������E��������B������77���������$%������� @�;�\������]�������� �GI[Q�� ��!����"��!������$��]�!������������ ��$���!�����$����� F..�4__����8�7:��Z����������������������C���� ��?���B�����!�� �C�C����77�@������@�;�\�������� �����%����a%���� ��������������� %�������K(.*bFWF-*bFW(c2)X*�OdY��Q�8��Z����>%�>�@��;��!������%?�e��>%�B�@���������C�]%$%� �����>���<����>%�B�����R��f�����f��������������@�;\"������$!��%����������� ��;�E"��������� �������g� ��$��+,-*1-'h)-*K(.*L2(.*�4O�7�Z987��7��Q�����B��\��$�B��>������B%����E��$�>��\ �������A����� ������������@:�:H@�;�\��%����������"���������$�%������!��!��?i�%������!�" �����$����j� ���������!���������� ����$%��������$�����+,-*bFWF-*�_4��978�9R��������B����A����� ������������I%������!����������!��������� ��������������@:�:���@�;�\�bFWFXkFl*�O4�7R7�87R���Q��B ��f��?��E����>�������@�A�����7�;������ ��!������������������������������ ������@�;������$����g��%��� ��!� ���������m� ��!���!��N* F..*L2(.*�4YO�:�R8:Q9�Q7�G� ���� ��������;��e����"����]���C��\ ���C��C����������;������<�>��C������� �C��@���]���C������;%���������7��@�;���S��m"� ��!���!�"������� ����������������!�!!���������!��$�������+h).F2)/)20XnFX*�Pd�7�Q�87�Q��Q�������������;��I�?������C��E� f��;��>�����!��D��@%��������;�������!�� ��?�<������77�;%��a%�@�; ����������������%����� �������������������������� ������$�����+,-*1-'h)-*K(.*L2(.*�4o��R8:��

pq +h).F2)/)20XnFXF,')rstuvtwxywz{|}~��|yx~y��|��|�y�~�w��~{��~{w�{w���|�w��w����

�yy����{x������������{x����������{��x�~�w����w

Page 102: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

� ��� ���� ����� �� ��� �� ������ ����������������������������� ��!�� ���"� ����� �� �� �

��# $�

$�% &&� ��&&� ��&&� ��&&&� � ����

'�(� ')*�+ #�,�$#�,�$�-����.�/����0� 0��0��#�,�$�-����.�/���� � � �

1��&�&�& &�&�&�&!&

"&+&�&& ����/����/������2����/�����2���� '�$��3'4%� ���������� /��������5������ /��������5��

6&�&�& &�&�&�&!&"&+&�&& ���/����/������2����/�����2�

��� '�$��3'4%� ���������� /��������5������ /��������5��

7899:;<;=>?@A�BCD8@;�7EF�GH;=>CICJ?>CK=�KI�LMNMN�OPQ���R�������/��/������������.�����3���/�����/5��5/���.��R���/��������.�2������/����2��R5������S'��#�T��������.�/���SR���-33UUU�� ������RV�23V���3+�� +T�W��/���X��������Y5������SW�$T��/����������������/Z�V/�[0������V�/�V����������VR��V/�[��������/�������Z��Z����������������.������3���/�����/�������/�U������������/���/��5������������.[������.����������.�/��� [��6$�S�����5���������/[�#�V5/����%T��/���R�U�����#�SR[ /�����������\W�$��.��������������$]��T0�$��S�����.���.�/���������.��������.�/����0� 0��������T�����$��S�����.���.�/����������.�'����T�)���������6$�����������������.����R��������.�/���/����������������R��/�VR��OQ��V�/����V������2��5�����������.����1]���.��/��6$�U��R��1]��V���/�����./���'�(������')*�+ �������$]�0�/�������2��[0�5���V�#,$��S�0������������� T��/�#,$��S%0�������������T��/���/����/��)��/���������2�����.���������S���,���T0�����O_Q��.��0�����������OQ��$]�������5/��� [�Y�6$�������/�����������'�$�������'4%��6���/����V���/�����U��R�5��/�2�/����/����/�������S���$�T�U�/��5�������������������.���������R/��R����OaQ����5�� ����U��R�/���� ��������0�/���� ���������������������/������'�(��R�����������2�������������.����[��.� ��R0�/������������������/� ������[����������� ������S���T�)Y5���������V�U������5/��� [�������5��������V��.��R����� /���� �.�/������ ��[����5 ������S �����T)

������5b��/�� /�� '�(�/��/��'�(�/�� /� ���!���!��Z1�

Page 103: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��

������������������ �� ��

�����

��� ��� ��� ��� ��������������������������������������������������������������� �� �� ������� � �� ���!"�#�� �$%%�� �%��$�%��� ���$�%��� �%�$������� %��$������� %�$���� ��$��

&'(()*+*,-./0�123'/*�&45�67./.8-*/29.-2:,�:;�<*=.�>0:-:�8*))�)2,*?�?-.@)0�*A(/*??2,3�B1CD<4E�F./2.,-?G�HEI�� J�KLMN���O�MN�L�KL�O� P�P�Q����R��STMPM�������� �O�!O� U����������M �O$��LV�UL�T#�WO��� �PX�O�OPWT������ �����M PLM�O�!��UXP�UL�T#��L��OXMY �NML��M�K�L�OM ��������MN���� �N�WML�O�� ���� P� O�PT�!"�#��O�OXMY �M �PX��L�UXP��HZI����W M��MP�MN�YXM����������PL��PO�KL�K�L��NLM����R��STMPM�������� �O�OP���T���KL�OO� U��������Q�L�� PO�����W M��MP�Y�PX�[���� P��MT�!PMK#�PM��M�K�L����KL�OO�M ���Q��O�MN��NN�L� P��������Q�L�� PO��\�KL�OO�M �MN����������� ��������O��W�X��MY�L�PX� �NML�PX��MPX�L�Q�L�� PO�� ��������O�M �T��P��P�����WO� U�\ R��Q� ����\]W����M�� U�Y�O�� OWL���T�[��� ��� P��MT�����W M��MP�Y�PX�� P��MT��U�� OP������� �P�L�� WO�!�MPPM�#�OXMYO�O�����L���KL�OO�M �MN����P�UU������� ��������M�K�L��Y�PX�� MU� MWO�KLMP�� �

������ ����� ��������� �� [������! �P�L�#

������ ����� ��������� �� [��[��� �\ R\ R�Q�

�������V�

��������

Page 104: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������� �������� � ��� �� ������������ �������� � ��� �� ��� �� ���

��������� �������� � ��� �� ������������ �������� � ��� �� ��� �� ���

� ��� ��������� �������� � ��� �� ������������ �������� ���� �� � �� � ���

���� �����

�������� ��������

���������������� ��!��������"# ��!$$%&�������!�����!���%&������������'��!�����!$$%&�����

�(����

��!��������

��!��� %&�������!���

�������' ��!�����!$$ %&�������!

$$ %&�������������� �������� ���� �� � �������)*����

!

�� �� �� '� +� �� ����������+

�����$���� ������������ �������� � �� '� ����� ��������� �������� '� �� � ��� �� �������

'�� ��� '�� ���

�,� ���

Page 105: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ��������� ��������������� ���������������� !"#�$%&$'()$*+�+,�$-./0.+$�*01/$,2,)./�2+.3(/(+4�,5�6(/7�+4&$�.*7�)0+.*+�89"�-.'(.*+2�02(*:�2&(**(*:�7(2;�1,*5,1./�)(1',21,&4<�"�2).//�*01/$.'�.'$.�=3,%>�,5�8$?.�@4,+,�1$//2�$%&'$22(*:�A #B+.::$7�89"�-.'(.*+2C�8D<EC�8#DF�,'�A #�./,*$�6.2�&G,+,3/$.1G$7�.*7�+G$�'$1,-$'4�,5�+G$�5/0,'$21$*+�2(:*./�6.2�),*(+,'$7�5,'�0&�+,�H�G,0'2<� ,'�$.1G�1,*2+'01+C�2$/$1+$7�+()$�&,(*+2�,5�,*$�$%$)&/.'4�+()$�2$'($2�.'$�2G,6*<�I1./$�3.'�J�H�K)<��L��?,*:B+$')�=ME�)(*>� !"#�N0.*+(5(1.+(,*�10'-$2�,5�.-$'.:$�A #�2(:*./�'$1,-$'4�.5+$'�&G,+,3/$.1G(*:�'$/.+(-$�+,�5/,0'$21$*1$�(*+$*2(+4�&'(,'�+,�3/$.1G(*:�.'$�7$&(1+$7�5,'�6(/7�+4&$�=2,/(7�/(*$2>�.*7�)0+.*+�=7.2G$7�/(*$2>�A #B+.::$7�89"�-.'(.*+�1,*2+'01+2C�8D<EC�8#DF�.*7�A #<�O$.*�10'-$2�,5�DE�+,�9P�(*7(-(70./�1$//2�.'$�2G,6*�5,'�$.1G�1,*2+'01+<� ,'�1/.'(+4�$'','�3.'2�.'$�,)(++$7<�=I$$�./2,� (:0'$�QR�.*7�QS�5,'�2G,'+B+$')� !"#�10'-$2�.*7�I0&&/$)$*+.'4� (:0'$�I9T�5,'�*0)$'(1./�-./0$2�.*7�2+.*7.'7�7$-(.+(,*2><��U��V0.*+(+.+(-$�$-./0.+(,*�,5� !"#�10'-$2<�#/,+�2G,62�1./10/.+$7�G./5B+()$�,5�'$1,-$'4�=+DW9>�-./0$2�,5�7(55$'$*+�1,*+',/�1,*2+'01+2C�6(/7�+4&$�.*7�)0+.*+�89"�-.'(.*+�1,*2+'01+2�3.2$7�,*�3(B$%&,*$*+(./�5(++(*:�,5� !"#�7.+.�=X�2+.*7.'7�7$-(.+(,*�=IY>C�2$$� (:<�I9T�5,'�*0)$'(1./�-./0$2>��Z��I1G$).+(1�'$&'$2$*+.+(,*�,5�A #B+.::$7�=:'$$*�3,%>�89"�-.'(.*+2�7$/$+(,*�.*7�7,).(*�26.&�1,*2+'01+2�02$7�(*� !"#�2+07($2<�89"�(2�7$&(1+$7�(*�4$//,6C�R37�(*�&0'&/$C�[<DW<9<DW<9<9�(*�,'.*:$�6(+G�[<9<9\2�0*(N0$�SB+$')(*./�.)(*,�.1(72�G(:G/(:G+$7�(*�'$7<��]��.3/$�,5�)$.*�G./5B+()$�,5�'$1,-$'($2�=+DW9>�.*7�'$2&$1+(-$�),3(/(+4�5'.1+(,*�2(_$2�=X�IY>�.2�7$+$')(*$7�5',)�$%&,*$*+(./�5(++(*:<�G(/$�.�2(*:/$�$%&,*$*+(./�50*1+(,*�6.2�2055(1($*+�+,�5(+�A #�./,*$C�.//�,+G$'�A #�502(,*�&',+$(*2�6$'$�5(++$7�6(+G�.�3(B$%&,*$*+(./�50*1+(,*�(7$*+(54(*:�$(+G$'�.�5.2+�=+DW9�a�M9�2>�.*7�.*�(*+$')$7(.+$�5'.1+(,*�=+DW9�E<QB9E�)(*>C�,'�.*�(*+$')$7(.+$�.*7�.�2/,6�5'.1+(,*�=+DW9�b�D<H�G><�

T c� +DW9� 5'.1+(,*�def�5.2+�=2> 2/,6�=G>� 5.2+� (*+$')$7(.+$� 2/,6��A #� Dg� E<h�X�E<9� B� B� � DEE� B� B�8#DF � Dh� D<M�X�E<Q� E<Q�X�E<D� B� � i9�X�M� Di�X�M� B�8D<E� DH� MD<i�X�9Q<H� P<P�X�h<g� B� � MD�X�DQ� QP�X�DQ� B�R37 � Dh� 9<H�X�E<i� P<E�X�9<H� B� � H9�X�g� hi�X�g� B�B�[<9<9 �� 9P� D<D�X�E<Q� g<Q�X�h<D� B� � gi�X�i� 99�X�i�89"DEH� DE� D<h�X�E<Q� Dh<H�X�9<g� B� � Q9�X�h� Mi�X�h� B�89"DEHjS[<9<9� Dh� 9<D�X�D<E� DE<M�X�H<9� B� � QE�X�DE� gE�X�DE� B�89"iijS[<9<9� DH� D<D�X�E<9� 9<g�X�E<M� B� � iQ�X�i� Dg�X�i� B�� � �89"� 9h� B� Dg<Q�X�M<i� h<E�X�D<h� � B� 9H�X�P� gH�X�P�[<D � DQ� B� i<h�X�g<g� D<M�X�E<g� � B� Di�X�DD� i9�X�DD�[<9<D � DH� B� DM<i�X�P<H� h<P�X�9<H� � B� 9i�X�i� g9�X�i�89"DDD��[<9<DDDQ� Dh� B� DE<g�X�i<E� D<H�X�D<9� � B� h9�X�DP� Hi�X�DP�89"iijS[<9<D� 9H� B� DM<g�X�DE<P� h<9�X�9<g� � B� 9i�X�DQ� g9�X�DQ�� DQ� B� DQ<H�X�P<D� D<P�X�D<D� � B� hh�X�Di� HM�X�Di�

SA # R37 89"��������[<D [<9<D[<9<9 89"DDD89"DEH89"DEHjS[<9<989"iijS[<9<9 ��������[<9<DDDQ

5.2+(*+$')$7(.+$2/,6 [<DR37[<9<D[<9<9[<9<DDDQ89"DDD89"89"DEH89"iijS[<9<D89"iijS[<9<989"DEHjS[<9<9

YE<EEE<E9E<EhE<EMDE9EQEDEE9EEQEEhEEHEE

89"iijS[<9<D8#DF8D<E+ DW9�=)(*>

(*+$')$7(.+$�=)(*>

Page 106: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

� ��� ������������ ��� � ���� ����� ��� ��� ����� ��� �������������������������� ������� �������� ������� ����� !"#�#$%����� !"#�#��&&��&����������������������

'�(���(���(�(')'�( �' �' *' �' �'' ��'������������������������+�,-�� .�,/� ��' .��0/12334565789:; <=>2:5 1?@ "#�#� A5B89C=4=D5B E=B8F75B FG8965:B =7 9 B5H257G5IA5357A578 69775:#J�K L+�,-����M �N O-���P �N �������M�M� Q-��M Q�R��M� O�����MR� �-��M ���� Q�R��M�R .�S ��S ���S ���/ �M ��� +����M�R ��S ����� �M ����� T��� �UO��RR� �M L� ��,�� �N��� O-��N������MS �������M�M� O�����MR T��� R�O����� �M ��V W�W)X�YL �M R���M� T��Q �����RR�� ���,,��M� �,-�� JZK W�[� �U�,-R��M �Q������&��OQP �N ��N�,�M& �������MR -R�M& �������M�M� Q�R��M�RS �R �R����� �M \�&-�� *S �-� T��Q �Q� -R� �N ������������ .R�,� ,�M�/ �M ������������ .�RQ� ,�M�/ O�����MR �MR��� �N ���� J!K \������MR �����RO�M�M& �� �������RS ��������R �M ����R �O���� �M W-OO,���M���P \�&-�� W�� T��� �M�,P[� �P ��V W�W)X�YL �M R���M� T��Q �����RR�� ���,,��M� �,-��

������������ ������

Page 107: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��� ����� �����������

�� ��������

������������ �!"#�����$%�&'�(��)"#�(��*+��*�*��,��*(*��(�,*���"�"�#�)"++������-./�0��"���(1�23�456789�67:6 ���7;�<�8675�=>=?�<�@���;6 :��>5����8 6 5�<�7>� �A=7 > 3B?�6� ;5�6�<=:��5=7>�7;��7>7>C43�7�7����47>5 =>=>:��=59�6����D�������76�������E=59�=>46� �=>:� �7C>5��7;��� �������� 3�7�F=:C6��G����C�H�6��=><=4 5��6��8�45=I��@���;6 :��>5�3�>:59�=>�H8�

Page 108: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������������������������ ���������������������������������

�������������� ����������

���� �������������������������������������������� ������������������������������������ !"���������� ������������������������ �����#$��%������&'�(�)*+,-./01�234567,+89748/.�:;)<�+==7>7+8>1�?+09@9�9247>A74,+201�A7924B0/,�9A4378B�CD��E@>.+494,+9�/2�F�,G�E/H.I�J/2/�79�=7.2+0+6�@978B�<JK�L�M�/86�<JK0+65NO)�L�FIP�/86�/�9247>A74,+201�2A0+9A4.6�QK�R�FIMS�T�FISSUI��<A+�9+-/0/2748�V+23++8�.43�/86�A7BA�:;)<�/2�)�R�FIW�QWFX�:;)<�+==7>7+8>1U�@9+6�24�/8/.1Y+�2A+�6/2/�-0+9+82+6�A+0+�79�,/0Z+6�V1�/�6/0Z�B0+1�.78+I�'[(�H4,-4972+�4=�0/3�6/2/\�<JK�/86�/6672748/.�618/,7>�=7.2+0I�<A+�234�67,+89748/.�-.42�4=�9247>A74,+201�?+09@9�:;)<�+==7>7+8>1�0+>406+6�372A�/�,4848@>.+494,+�9/,-.+�>482/7878B�]IDIM�Q<)�-C�IPU\�24B+2A+0�372A�2A+�48+567,+89748/.�-04_+>27489I��+976+9�6@/.�./V+.+6�8@>.+494,+9\�2A+�9/,-.+�>482/78+6�/.94�7,-@0727+9�4=�64840�/86�/>>+-240�48.1�>4,-.+*+9I�8.1�V@0929�372A78�/�9247>A74,+201�0/8B+�4=�K�R�F�T�FI�/0+�9A438I�<A+�A7BA�>48>+820/2748�4=�,4.+>@.+9�78�2A+�9/,-.+�>4,V78+6�372A�2A+�97B87=7>/82�/,4@82�4=�978B.+�./V+.+6�7,-@0727+9�>/@9+�92048B�,@.275,4.+>@./0�20/7.78B�Q.+=2UI���97B87=7>/82�7,-04?+,+82�4=�2A+�6/2/�a@/.721�79�0+/>A+6�V1�0+,4?78B�2A+�,@.275,4.+>@.+�+?+829�@978B�<JK�L�FIP�/86�<JK0+65NO)�L�FIP�Q07BA2UI�

Page 109: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ������������������������������������������������������� �!"#$%�"&�'()%$"*"!$�+,*$#�"'�-./01�2(+%3*4$#�)56*7,%�*75()7(5$�#,7,�89:;�)"'7,3'3'<�10=�86$%%">;?�-.@�85$#;?�-A�8+%($;?�-B�8<5$$';�,'#�CD/�8<5,6;0�@"E�43<4%3<47*�5$<3"'�#$23)7$#�3'�F3<(5$�G/0�

Page 110: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������������� ��� ��������������� �������������� � � ����������������������� ����� ���������������� �������� !"#"$%�&'�#�%"&(�!���$)�#"%�*)���+������� ���,� ��-�� ���,�.�+����������������/��0122�23415�6171�87964�34�:;<;�=1>3?=�@ABBC�5?DD21=14E1>�63EF�GHI�J0K�@K38=LC�L4>�GI�D143M32234N5E71DE9=OM34�97�PH�Q8N=2�814EL=3M34�@0GRS�M1225C�LE�TSU0�L4>�PI�0VRW�XF1�Y92296348�F?=L4�M122�23415�6171�?51>�34�EF35�5E?>OZ�[<\R]T�@1= 7O943M�_3>41OC�[1aL�@M17b3c�ML7M349=LC�[1aL�\O9E9�@M17b3c�ML7M349=LC�dRVK�@95E195L7M9=LC�FJe�@Y3792L5E5C�K\fgfK[�@41?792L5E9=LC�L4>�EF1�Y92296348�=9?51�M122�23415�6171�?51>Z�gh[TXT�L4>�0GRSW�[?=L4�M122�23415�6171�E7L45Y1ME1>�?5348�J?i141�[:�@j9MF1�BDD231>�KM314M1C�L4>�=9?51�0GRS�M1225�6171�E7L45314E2O�E7L45Y1ME1>�?5348�a3D9Y1MEL=341�RHHH�@h4b3E79814C�LMM97>348�E9�EF1�=L4?YLME?717k5�345E7?ME3945W�lWRWG�L4>�lWRWR�6171�M2941>�Y79=�[1aL�M:gB�34E9�DXS2?1T�@g9bL814CW�J97�1cD7155394�34�F?=L4�M1225�lWRWG�lWRWR�e>�L4>�>121E394�97�>9=L34�56LD�=?EL4E5�6171�M2941>�34E9�EF1�D<iJAf0G�b1ME97�@0294E1MFC�E9�81417LE1�gfE17=34L22O�EL881>�D79E1345W�J97�53=D23M3EO�1iJAfEL881>�M945E7?ME5�L71�71Y1771>�E9�L5�iJAfEL881>�EF79?8F9?E�EF1�E1cEW�A2L5=3>5�M9>348�Y97�iJAf[RB�@[RB�EOD1�G�gAmHHTPHGWGC�L4>�iJAfe>�@[RBWe>�EOD1�RNT�gAmPnRnPGWGC�6171�_34>2O�D79b3>1>�O�<=32O�e1745E134W�XF1�D2L5=3>�M9>348�Y97�iJAflWG�6L5�L�83YE�Y79=�KLMF3F379�;LE5?4L8L�EF1�[GWHfiJA�M945E7?ME�6L5�_34>2O�83b14�O�;WoW�[14>p12�@GC�L4>�EF1�iJAf[AGq�M945E7?ME�6L5�D79b3>1>�O�XW�;35E123�@RCW�KEL21�M122�23415�6171�5121ME1>�63EF�rHH�Q8N=2�inGs�@ABBC�L4>�34>3b3>?L2�M122�M29415�597E1>�O�?5348�L�JB0KB73L�=LMF341�@e1ME94�:3M_34594CW�<cD7155394�21b125�9Y�iJAfD79E1345�6171�t?L4E3Y31>�O�?5348�L�JB0K0L4E9�=LMF341�@e1ME94�:3M_34594CW��J97�1cD7155394�34�uv�wxyz�lWRWG�lWRWR�e>�L4>�>9=L34�56LD�=?EL4E5�6171�M2941>�34E9�EF1�D<XfRGL@{C�b1ME97�@g9bL814CW�A2L5=3>5�Y97�1cD7155394�9Y�71M9= 34L4E�F?=L4�[RB�[Re�[T�L4>�[n�6171�_34>2O�D79b3>1>�O�j917E�KMF413>17W�0294348�L4>�A0j�L=D23Y3MLE394�LMM?7LMO�6L5�b173Y31>�O�51t?14M348�@;|iCW���� �����} �� ���,�& ~� !+�����-�� ���,���������-�� ��� ���,�#$����/� ���,�������/����� �-�� ��� �������� � ���� ���}������� ��BM3>�1cE7LME394�9Y�F35E9415�6L5�>941�L5�D71b39?52O�>15M731>�@TCW�[35E9415�Y79=�[<\R]T�M1225�6171�51DL7LE1>�O�jAf[Aa0�L5�D71b39?52O�>15M731>�@nCW�J7LME3945�6171�>731>�?4>17�bLM??=�L4>�5E971>�LE�fRHU0W���J7LME394LE394�1cD173=14E5�6171�ML7731>�9?E�L5�>15M731>�D71b39?52O�@PC�63EF�=3497�MFL4815W�e731Y2O�R�c�GHS�M1225�6171�715?5D14>1>�34�G�=2�?YY17�B�5?DD21=14E1>�63EF�HWGI�gAnH�34M?LE1>�Y97�GH�=34�L4>�M9221ME1>�O�M14E73Y?8LE394W�XF1�D1221E�6L5�6L5F1>�94M1�63EF�?YY17�B�L4>�34M?LE1>�34�?YY17�e�Y97�TH�=34W�XF1�715?2E348�MF79=LE34�D1221E�6L5�6L5F1>�94M1�63EF�?YY17�e�L4>�715?5D14>1>�34�K:K�29L>348�?YY17�@MF79=LE34�Y7LME394CW�BYE17�5943Y3MLE394�@:3L8149>1�e397?DE97C�L4>�>14LE?7LE394�4?M213M�LM3>5�6171�>187L>1>�O�14p94L51�@�|jC�E71LE=14EW�B22�M14E73Y?8LE3945�6171�D17Y97=1>�LE�rWPHH���Y97�P�=34�LE�nU0�1cM1DE�EF1�Y34L2�941�@RHWHHH���Y97�RH�=34�LE�nU0CW�XF1�592?21�Y7LME394�6L5�9EL341>�O�M9= 34348�EF1�5?D174LEL4E5�9Y�L22�M14E73Y?8LE3945�@34M2W�6L5F348�5E1D5CW�A79E1345�6171�D1221E1>�L5�>15M731>�@rC�L4>�715?5D14>1>�34�K:K�29L>348�?YY17W�h>14E3ML2�M122�1t?3bL214E5�9Y�592?21�L4>�MF79=LE34�Y7LME3945�6171�L4L2Op1>�O�3==?4929EE348W�

Page 111: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ����������� ����������������������������������� �������������� �!"#$%$%�������������&����'�����������(��)*����+�������)!),�����$-�����������.����$�������.�%���$�����) /0�����1�+&2&3���������������4//������5������� ��������� ���3������� ��� ���$��6������+,����3�����%������� �%-7.$�/����� ��������� ��������� �������) /0� ��������������� �� ������������������ ���'��+8$%���9�����%������� �:7.3$�0������ �����1"8�1��'��������)*��������������'������� ���� ���� ��+;������3��:���(����� ���'���� �� ��� ���������� ����������� ������'� ���� ���'��+8�$�������������<���� �:7.�'�������;�=�����,>:���� ��3$�0� �����������(������ �����������'����� �=������� �����������?�����4�0���� � ��� ��5����0����!�� ���������� ���������������� ���������$�!'�� ����������'���������� ����������� ���������&�����'�����4�0���������� ��+0���� �/���������3��� �� ��%����;�������?��+0���� �/���������3$�!'�������'����������� ��������������������� �� ����/.0������� � ������������?�������'����� $��������� �� ����� ���������+�3�������� ���������������� ���������������������� ���� ���������� �$�0� ������������ ���'����;�������� ����������'�� ��� �����'�� �����'����+������/����.������$��������4//�������)4/0�������� ��������� ����+5����0�����,����3���$�1�/�� ���*"���3���� ������������ ���� ������ �� ������������������������ ��-��������.����������� ������ ���� '�$�.����� ���������� �����'����?���� ���������������������� ���� ���������� ����������?�������'����� ���$���@ABC�DEF�GHIJEGEKLDM�NLKKLEO��50!������� ������������'��������6� ��PQ)>�P�*������������=�������������� ��+!�=��)���3�R'������ ������ ��&������ �������������.S%����'����������&��'����������+:3��� �� ������������������$�/�� ��������� " ������&���=�� �����%4� ��������������������%����� �������� �� ����� �&����� ����$���������������������� �����&���=�� ������� ������ �'� $���������" ������&���=�� ����������?"� ��=������������ ���� �&����� �����������������$�/���� ����8"�����������������&�������T� �����R'�� � � �&�&��'� ���$�/������� ��������" �"������������������������� ��� ���������?������� ��� ��&��'����� ������ ���� ������&��'��������������� ����� � �� ��������� ��� �&��'����� �� ������� � �U��$�/����&��'������'� ��� ����������������'�������&��'���� ����&��'���'����������?� ���� ������� ������� � �������������������� � �����'��������$�$��������� ������������"��"��R'��� ���$�/���������?��50!��'�&������'� ���&��'� ����R'�� ������������������'���� ��������'��+<3V�0��'���������� ���� ����������������'�� �������� ���� ��� ��Q+ 3���� ����'����������&��$�W XYXYZ [ \[ []^_\_ 3�+3+ � ` �/����������� �� ���� � �������� ��������� �����'������������� ��� ��'������ �� ����"����� ������������ �%� Za^ $�/������ ������� ������%����0���� ���� ���������� �����&�'������&����'�&���������� "�R'����� ���?� ���������� ��$�/���������������' ��' ��� ���������������"����� ����+���$�� ���$���3������ �������������� ��b]cd\de��'�� ��������� ��df[ghijg\[k[l]����=���+���$�����$���3$��S�����'�&���� �������������� ������'� ��������� ������ �=���� ������'� ����� ���������'������������� ������� ������ ����������� �� ����������������������� '� �&�����" ����������&��$��

Page 112: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�� ������ ���� �������������������������������������������������������������������������������������� ����������������������������������� ����������� �!������������ �����"������ ����� ������������� ��������������� �#��������������������������������$%&��������������������������"��������������������������������������� ������������������������� �!������"���������������������������������������������������������������������������������������"���������������� �������������������� �'��������"��(�������������������� �����������"���������������������� ����������)�*����������������������"������������������������������������������������������������������������������������������� �+�����������������������������������������������������������"�� ����������������� ����� ��� ��,-./01�234-451�0./10267�82-9�.:264�.;2<3�26�;100�;=0-=>1�?,@ABCD�.6<�:.33�351;->4:1->E�?F,D�2<16-2G2;.-246�4G�HIBJKL351;2G2;�;9.51>461�;4:501M13�#�N�����������������"�$%&�O � ����$%&�O � �������PQN!R����������������������������������������������������������� ���STU �V�������������������������������������������� ���S�WX���V�R���WX���'����#R���#�Y X��X �WZ�V&[XU����������������������������������������������\�+]'!�S���U�����X W���]''����������������� �� W�_"\_� �[XX�_�����������������������������$%&������SR�����U� ��a������[bR �c�����������������a����������������������������� �������������������������������"���������"��� �� �P���������������������]�V�&!$+�"����SQ�����"��U����������������Y������������"�����"��������������������������������������"��������" �����������������SPU�������� ����������N'd�*���������������������������������������� ���S�XU �&�����������������������������������������������������������"�������������NR��������S&�����c��������U���������W���� ������������������������������������������� �eW�_���������������������&����P���&���R�Y�!d�a�_��������S]� ������U �&�����������������������������"�������"�������� ���WZ���fXZ�c���������������� ��� �X �W���\����S�������c)�YXZ��������������X WZ������������U�������X���� ��'���P���������������������������������� �!� ���������P�S�\(�aXX����fWXU���������������������*����������������������������� �fX�XXX������������������\(������ �[XX�� ���������������� ���XXX�XXX������������R������S�������� �����"������ ��XXX���Ug���������������������������������������������������� �'���W����������������� ����������������������������������������S���"��������� �W�XXX������������������ �����"������ ��WX���U� ��"�������������������������������������S������������"��aW�ZU������������������������������������������� ���������������������������*������� �&���������������"����������������"����������������������������"��������"�����������������������"�������"�������������������h����� �'��������������������������������������������� �WXX��������������������������������������� �TX����������������������������� �W���� �������������������(�������"�������d������ ������������S��U�S�������� � � eU��������������"������!�����������������"����S��U������ ��������������������"�����Q&Q�����������������������a fY�������������������������������������"����������������� �%�� �������������������������������������������� ��������������� � �[�SO � ����������U�����X �W�SO � ����������U �!�������������� ������������������� ������� �������P�������������'�����P� ��i<j�>1502;.-246�0./10267k�lm�nlop�1M->.;-246�.6<�G0=4>13;16;1�:2;>43;45E�-4�.33.E�;100�;E;01�<1516<16-�qrsLKJIJI�;9>4:.-26�26;4>54>.-246�

Page 113: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� �������������������������������������������������� ������� !�"#�$������%&�'(�������������������������)*+�,-�-������,-�-��������#����������������� �.���������/0�1/23�����������������������-�*���/0�1/23�����������#�)*+�,-�-�������������������������������+$4�������� �������������������������5������� ����� �-�6�7������8����#��������9�������+$4&-�7���������#������������������������������������������� ��������6�������������� 4�:��&����+$4����������:��-�6�7������8����-�������������:�)*+�,-�-����������/0�1/23������������������������������6�����������������+$4���������������������������� ��-�;�������:���������������������������������������-��6�7���������+$4� +$47&-�;���������������5�����������-�6�7������8��������+$4�����������#��������������%��������������������������%��:�� ����� �6�$4;����+$47&-�$������!�"����������#������������� ��������������)*+�������� ��������%&���� �����������%��:�� ����-�<������������!�"������������������ �����:������=����������������7���>����>��#�'����� 4?'#��������5��������;�����*� ����@'� <�A����:��&�������������� ����������� ������������� ��&&-������������ ��������������������:B���C;+<����+$47������������������ ��������������������������D������������ ����:����� �� D������E����������&-�F�������������:��:������������������+������CD���������������� ;�������+�������&��G ������������H��B�-'��+���;���������.����A�� ?���� &#�����49;+�!4��������������C�������� +����������&#�8�������� ����������������������������������-�<��:�����%��������������������5����������������������� �.�����������������������������A�������A�� ����� ��������������#���������#����� ���������������:#�4���F�I8#�=-�-����:��:�����������%�:�#�;�������+�������&-����JKLMNOOPQR�SRT�LUMPVPWSXPQR�QV�MNWQYZPRSRX�[UYSR�[POXQRN�LMQXNPRO�PR�\]_ab�ac�daef_�QWXSYNM�SRT�YQRQRUWgNQOQYN�MNWQROXPXUXPQR�SRT�hiSON�TPjNOXPQR�QV�MNWQYZPRSRX�YQRQRUWgNQOQYNO�>�����������������#�� ������������������������������������������� �=&-�C9;���������� ����������������������������������"��(�����������������:������������������H���� �����������������:��G ����� �'&�%�����������������C�������I����-�;�����;A�<���:�����#�����������C9;���� ����������:������������������������������ ���� ��:�����!� ���������� F������&-�;���������� ���������������������������:������������������ �=#��&-�*���>�;�����,-�-��� �������#��������A��������������C9;�����������������k�������l�����,-�-��� �������#�,-�-��>�$������#� >=�>'&���������������C9;�����������������k�k�������-�;�������������������C9;����A�� ��������!�4;� ��:��6�����A��+;)!��������A���-�6��:�����:��-�<�� ��������������� �������������������=�m�� ��&�������������:�������������A�� ���������6�����A��+;)!� ������������&-�7�������5������������������������� ��������������������#����������������:������������������������A���-�6��:�����:��#�� ��������������������� ���� ��:�����!� �������������������������������������5�������(6�4C4�+;)!�������$��5��������������������������������:������� ������-�!G ������ ������� �������� ���:&�������:���������������������� �������9��� 4�:��&���������������=��m������9�����:���� ����� �=-(�����7��>�������-�#�H�����n��#���-��6�)�������#������C77#�����������&-�7�����������������������������������������A�� �����������!)7;-�C9;�������������5������������B���������������������#�������������������������������5��� ��:�C9;���������:���� ;:������7�������:��&��������������$�������5��� ;:������7�������:��&-���

Page 114: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������� ����������������������������������������������� ��!"���#"$%&�'�'�(%�%)�*+�,-./�./0+12-3.+/�+/�4-53�6787/67/3�/9:57+4+27�43-;.5.3<�4./,57=2+57:957�>?14371�174+/-/:7�7/71,<�31-/4071�@42>AB*C�27-491727/34�+0�69-5�5-;7576�/9:57+4+274�01775<�6.0094./,�3D1+9,D�3D7�0+:-5�E+5927�+0�-�:+/0+:-5�2.:1+4:+87�F717�8710+1276G�*+�3D.4�7/6�-�69-5�5-;7576�HIJ�;8�KLM�F-4�8178-176�94./,�6<7=5-;7576�81.2714�@NOMCP�-�KLM�37285-37�:+/3-././,�3D7�QRH�@HSC�47T97/:7�-/6�4.U�-66.3.+/-5�;-474�+/�7-:D�4.67�3+,73D71�F.3D�6L*V4�@>.//W<274C�-/6�3D7�VD94.+/�KLM=8+5<271-47�@>.//W<274C�./�-�VXA�17-:3.+/G�K<7�5-;754�F717�-3�8+4.3.+/�QI�@6+/+1�6<7P�*-21-C�-/6�8+4.3.+/�YR�+/�3D7�17E7147�431-/6�@-::783+1�6<7P�M57U-QSZCG�M�2.U3917�+0�3D.4�5-;7576�KLM�-/6�9/5-;7576�KLM�@2+5-1�1-3.+�+0�H[IRC�F-4�9476�0+1�2+/+/9:57+4+27�-4472;5<�@477�-;+E7CG�N3�.4�F755�\/+F/P�3D-3�9531-=5+F�:+/:7/31-3.+/4�+0�/9:57+4+274�-17�81+/7�3+�;7:+27�./43-;57�./�3<8.:-5�7U871.27/3-5�,7+2731.74�@HQCG�*+�2./.2.W7�49:D�7007:34�27-491727/34�F717�8710+1276�94./,�-�H[YIR�2.U3917�+0�6+9;57�5-;7576�3+�9/5-;7576�/9:57+4+274�-3�-�3+3-5�:+/:7/31-3.+/�+0�YI�/]�./�:+2271:.-55<�-E-.5-;57�*B�;90071�@.,2-=M561.:DP�8_�ZGQC�:+/3-././,�HR�2]�K**�-/6�R�2]P�RR�2]P�SRR�2]P�IRR�2]P�QRR�2]�-/6�ZRR�2]�L-X5P�17487:3.E75<G�*D7�4-28574�F717�./:9;-376�-3�3D7�17487:3.E7�4-53�:+/:7/31-3.+/�0+1�H�D+91�-3�YHaX�;70+17�-�61+8�+0�YR�b5�F-4�893�+/3+�:+E71�45.84�@]-1.7/0756C�0+1�6-3-�:+557:3.+/G�*D7�:+E71�45.84�F717�:57-/76�F.3D�Yc�_7552-/7U�NNN�@_7552-C�-/6�F-371�81.+1�3+�4.5-/.W-3.+/�0+1�HI�2./�F.3D�Yc�@=-2./+81+8<5C31.73D+U<4.5-/7�@.,2-=M561.:DC�./�M:73+/7P�-/6�:+-3./,�F.3D�SR�2,dHRR�b5�8+5<73D<57/7�,5<:+5�@2VBe=fM�]g�IRRRP�h-<4-/�O.+�N/:GC�./�66_Yi�0+1�H�DG�*D7�:+/0+:-5�27-491727/34�F717�8710+1276�+/�-�:943+2�;9.53�7U871.27/3-5�47398�94./,�895476�./37157-E76�7U:.3-3.+/�@VNBC�@HZC�F.3D�5-4714�-3�IY�/2�@V.:+=*M=�V.:+T9-/3P�8+F71�;70+17�3D7�+;j7:3.E7�kRbgC�-/6�QSR�/2�@hK_=K=X=QSRP�V.:+T9-/3P�8+F71�;70+17�3D7�+;j7:3.E7�kR�bgC�-3�-�17873.3.+/�1-37�+0�YQGQQ�]_WG�*D7�059+174:7/:7�F-4�478-1-376�0+1�8+5-1.W-3.+/�-/6�:+5+1�-/6�6737:376�+/�0+91�-E-5-/:D7=8D+3+=6.+674�@,177/�:D-//75�MlA_=HSP�176�:D-//75�MlA=HQP�V71\./�B5271CG�VD+3+/�-11.E-5�3.274�F717�17:+1676�94./,�0+91�4./,57=8D+3+/=:+9/3./,=2+69574�@O7:\71m_.:\5�VX=HIRC�-/6�6-3-�F-4�81+:74476�94./,�:943+2�4+03F-17�F1.337/�./�]M*hMO�@]-3Dg+1\4CG� ./:7�3D7�-/.4+31+8<�+0�3D7�2+57:9574�F-4�/+3�+0�.28+13-/:7�0+1�3D.4�4396<P�8D+3+/4�+0�.67/3.:-5�F-E757/,3D�;93�6.00717/3�8+5-1.W-3.+/�F717�271,76�./3+�+/7�6737:3+1�:D-//75G�K-3-�F717�:+557:376�0+1�HR�2./�-/6�3D7�:+557:376�8D+3+/4�F717�4+1376�./3+�3D177�6.00717/3�:D-//754P�/-275<�6+/+1�6737:3.+/�-0371�6.17:3�7U:.3-3.+/�@,177/CP�-::783+1�6737:3.+/�-0371�6.17:3�7U:.3-3.+/�@176C�-/6�-::783+1�6737:3.+/�-0371�6+/+1�7U:.3-3.+/�@0173CG�h-;7576�:+2857U74�6.0094./,�3D1+9,D�3D7�0+:-5�E+5927�+0�3D7�2.:1+4:+87�17495376�./�;91434�+0�6737:376�8D+3+/4G�M/�-55�8D+3+/4�;9143�47-1:D�@MVOC�F-4�-885.76�F.3D�3D7�:1.371.-�+0�6737:3./,�-3�57-43��8D+3+/4�F.3D./�IRR�b4�F.3D�-�3+3-5�+0�-3�57-43�QR�8D+3+/4�871�;9143�@HkCG�>1+2�3D7�8D+3+/�;91434P�3D7�3+.:D.+2731<�@�C�-/6�>AB*�B00.:.7/:<�@nC�F717�:-5:95-376�@./:596./,�3D7�817673712./76�:+117:3.+/�0-:3+1C�-::+16./,�3+[�ooopopn qrst �P�-/6� ppooop ooop� ssst qqrr �gD717�op�-17�3D7�176�8D+3+/4�-0371�,177/�7U:.3-3.+/P�pp�-17�3D7�176�8D+3+/4�-0371�176�7U:.3-3.+/P�oo�-17�3D7�,177/�8D+3+/4�-0371�,177/�7U:.3-3.+/�-/6�(�.4�-�0-:3+1�:+117:3./,�0+1�3D7�6.00717/3�700.:.7/:.74�+0�3D7�176�-/6�,177/�6737:3.+/�:D-//754�@HJCG�]953.=2+57:95-1�7E7/34�F717�172+E76�01+2�3D7�6-3-�-4�674:1.;76�;75+F�94./,�uv��w�x�-/6�uv�$�yz{|n�w�RGQ�0+1�-55�:+2857U74�/+3�4D+F./,�2+57:95-1�6</-2.:4G�A72-././,�

Page 115: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������������� ������������ ����������������������� ������� ��� �������������������������������� ��� �� ��������������������� �������� ������������!���������������������� �������������� ������������ �������"�� � ������ ����������� ��������#$%&�� ���� �����''�������'�()�*���������������������� ����������������������������#$%&��������&���'� �����'���������������������+�� �'����'�������� ����� � ����������,�������������'� ����� � ���'�������������� ������-�.�/�*����������� ���#�������01���&���� ����������,��� �� ���'� �����'���������������� ����2�34�� �������'��������������'� ����� �����������'��� ��� ���������� �� �����������561!�7�6��!�7�6�6������89:;<=>�;?�:@>ABC:;>9D@>=E�9<9FAG�3������������������� ����������� ���� ��������� � ��������������������� �� ������ �����'����&������������� �������� �' �� ������ �����'� ����H������� ���� �����������,����&��������� ������''��� ����� ������������������������� � ������������������ ����H������� �� ��������� � � ������������'���� �������H����� ������� ��������������#��������������������� ������ ���������������#$%&�������� ��������� ���������!����������'��������#$%&�� ����H�� !���� �������������� ���'���''���� �������������� ��� ����� ��������#$%&��������2�������!������� ���������������H������������ ������������������ ����������������� ���������� ���������������������H���������������� �����������#$%&��''���������5������!��� ������������� �����''�����������H�������� ��� �������H� � ����H� ������������H ��� � ������� ����� ������������� ����''���� � �� �������� �������������� ��'����������������������� ����� ���H����� ����'����'�� ������������I��������� �����''������������������������������� �������������� ��������������''���� �������'��� ����������� ���������� ��� ������������*��'� �������� ������� ����������������'��������� �����'������ !���������� �� � �'��� ������ �����'�����������J�� ����'������� ��� ����� ���� ��&���� ��� �����������& �����'�������K L K L MNN�����N�� OPPQQOPPQQPQR ?E9AA;A=>?E9AA;A=>SE99FA;A=>SE99FA;A=> TUTUTTUTV �WXY�������QZ���� ������� ���� ���!�PZ���� ����������� ���!�[�����' ������� ����'��� �����''���� ��''���������'� ������������������ � ��������������O���� ������H��� ��� ������������ �����������'���� ������� ������� ���O�\�]8_]8 ]]ab��I���+����������� �� ���& ���'� ���������������������������� ������������"�� � ������ ��������� �� �������� ����'���� ������ � ����I����� ���!���� �������������� ���� ������������*��#$%&��������������������H������������ ����'������������+���������������� ���������������cI%��� ��������'�����d�E9eA;A=>E9eA;A=>Of-E9e PPQQPQR TUTVT �� ���WgY�&�������� � �� �������� �����'� �������������������������� ������7�6���������������&%��5�h�0!����2�34������������������ �����'����������������� �������������H���������������I�������� ��� ����� �������������''� ��'��� ������ �����H������� !� ������� � �����'�������������H�������������� ��(�����2��i�������� �����������'�PQR�j������PQRE9eCOf-�j���0���� ���& ������ ����������������� ������������ ��'� ������������ ����������������� ���� �������R����������� ������-������������� �������������� �������������� ����������������������� ���� ����������������� ������'���� �� �#$%&��''������������ ������� ��������������� ���#�������0i����

Page 116: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������������� �� ��������� ������������� ���� ������������� !����"�#$�%��$&'( �&�$ �'��� �)���&�*( '+(��("�,$ �$ ��� ���()��$��'$( �,%�'���*-'�+#$ ����(#�$ �.�/012�3456��789���:;�<-�:;�=��� *���'$ �����)>�$+ ��?����� �@�$ ����A$�,�+'��B����$ �����C�� ���$&'��$�������D!���$ '� � )��("�&'�,�����'�+()�+(#�'$ ��(#�$ &�,%��% �#$)�����,$ �$ ��EF05GF5��7HH��:��-:� �D� ���)�'�+��B��B(+#� ���I��?��$&��*B�� ����J����C�����:!�KL'+�)'$( ��M�+$"$)�'$( �� ��� ��%&$&�("��$&'( �&�NOP�QR1P1F��7���== -�= :�=� S$���#� �������$�� �+���>��C( $&)���*��T&+�����I����$&�+��?����'��$&�������'+��,������+J������I�( ��+�'�����U+�##�+��K�5P�O2V������!�T�� '$"$)�'$( �� ��)��+�)'�+$��'$( �("�'@(� (W���M+$#�'�-&M�)$"$)��$&'( ���D�W�+$� '&���DX�� ���D��.�3522�/012��YH9��:::-:<�� � S%&()J��������$��%����� ����++��S������!�I(&&�("��*Z-�-)�+(#�'$ ��&&()$�'$( �M+�)���&�'�#M�+�'�+�-$ ��)����+(@'���++�&'�("�'&C>[:�)���&�\12�3522�/012��7Y��D;��-D;�<�[� S�&&����B�� ��Z�������]T���<;=!�?�#�'�(��"(+�'����� '$'�'$W��+�)(W�+%�("�M+('�$ �$ ��$��'��&(��'$( �$ �'���M+�&� )��("���'�+�� '&�� ���$M$�&�_GO2�/01F456��Y8���=�-�=D�:� a�� �������(,�+'&��B>�� ��*�$+ &��C������ !�A� (#�-@$����% �#$)&�("��'�������$&'( ����?�W�+$� '�'��'�M($&�&�+�M+�&&��b,�&���M+(#('�+&�"(+��)'$W�'$( �'�+(�����$&'( ���(&&�3522��Y7����<-�D��;� ���$+���B��A(+&J$���?�� ���$&'��$�������=!����&�+�#� '�("��% �#$)�M+('�$ �,$ �$ ��'(�)�+(#�'$ �$ �W$W(���&$ ��M�('(,���)�$ ��#$)+(&)(M%�\5P41cd�eGfg612��hi��D<D-=�=�<� j�+#���� �����K,�+����*����'�+�&���Z����+J&�����B� $&&(W�����C�''�+��Z��I����UU��k�&� ���j���%#� ��??���'� � ,�+����A�5P�O2V������!�l�� '$'�'$W��$ '�+�)'$( �M+('�(#$)&�� ���� (#�-@$���M+("$�$ ��("��M$�� �'$)��$&'( ��#�+J&�� ��'��$+�+����+&�3522��Ym7��<[:-<;����� j�+#���� ����������+��US��B� $&&(W������$n �MM����SS��W� ��)��$J��Z���j�+$�+���?��C��'$&&� �������'� � ,�+����A���� ����� ��$##�+&��������:!�����)'$W��� )�(+$ ��("�ZTTB�'(� �)��(&(#�&�,%�'+$#�'�%��'$( �("��$&'( ���D��%&$ ��=�3522��YY�� ;-[<���� *(L����� ���� ��������;!���Ll�� '�� �,��&��$���M�M'$���$�� '$"$)�'$( �+�'�&��$ �$W$����$����MM,-+� ���#�&&��))�+�)$�&�� ��M+('�(#�-@$���M+('�$ ��� '$"$)�'$( �NOP�/01P5F4G12��7o���D[:-�D:����� ���$)��?�� ���$')�$&( ��������;!�?�)��#$)���#�'�(��"(+�"�&'�� ��&� &$'$W����'�)'$( �("�B>?�&% '��&$&�$ �W$W(�QR1F�NOP2�_FOc�EF0�p�E�_��Y9i���=� -�=����D� B%�+���>��K��%�'��#� ����#������S�$'���*I��C�(�����*��J+�W�+'�%�������'��+�n� ��]��� ��I���+��U�����=!���)( &'$'�'$( �("� �)��(&(#��)(+��M�+'$)��&�"+(#�+�)(#,$ � '��$&'( �&�� ��B>?�\5P41cd�eGfg612��hi���D-==��=� ��&'+(#��?��I(@�+%�����S$��� �������*�(�����U�,$&'������ ��S$�(#������<<<!����� )��#('$"&�� ��"+���� �+�$�&�("�&���)'��� �'�+���� �� ( - �'�+��� �)��(&(#��M(&$'$( $ ��B>?�&��� )�&�.�\12�/012��788����D-��<�� � C�(�����U( �&J%��U����+J�������(&������B%�+���>���� ��&�#%��B��+�#�'�$)J��B���I�%,(�+ ������ ��I���+��U�����=!�>�)��(&(#�&�

Page 117: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������������������� �������������� ���������������������� ������������ !�"#�$%#�&&�'(&&�'���)�� *����#���#�+�� �#���#���,� #�-�#�-�.���#�/�#�0������#�/�#�1��#�0�#�2����3�.�#�4������/���#�5����6�7789��,�����:�������:������� :�������� ��� ������������(:���,��-;<1��=>!?�@ABC�D?AE�F?G�H�F�D#�IJK#��L&7�(�L&�&���M�� N,�� #���0�#�O����.��#�<�#�� �,��#�5������2�:�#���5��6�77L9�P,������� �����Q����������RG!STUV�"#�WX#�&L7�(&L�������� �� #�<�#�N�����#�Y�#���:�����#�0�N�#�2�, ��#�1���#��,�,� #���#�0������#�Z������[���#�/��6�77)9�/��(�������:���������(:���,��-;<1������ �:�\���:�� �������3���� ������Q� �:�����"�=TUV�]T��R#�IIJ#����7&(����'���8�� 2#���0�#�0��������#�����#�[���#�Z�#�N�����#�Y�#�N,.�������#�4�#�<� ���#�;��������[���#�/��6�77L9����, ���-;<1�:��, :����3���������������,��������:���,���,�������� ������(��� �Q����������RG!STUV�"#�WW#��8&8(�8L&����

Page 118: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������

��

�������� �� ��������������������������������������������������� �����������

Page 119: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Page 120: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������� ������ �� �� ����� �� ���� �� ������� �������� ��������� �������� � !������ "#$�%��%�& � '�(%��� �� ������)���*%����#$� +%��$����&,$%��-#.%-��#����������/.%�$�����0���00%�%����1��2�#����-#�-�%���3�.3%�� ��� �$%� �%4-.������ ���� #���.1���� �0� �-#.%�#� �#��2%��(�.��2� ���� 0-�#����5� 63%�� �$%� /���� �%#��%�� #�-��.%��0�#���� � 2�.%#-.��� ���-#�-�%� � ���%��#������ ���/��������.������.� 2���7#������� $�3%� (%%�� �%�#��(%�� ��� �$��#���%8�5�6���$%���%����%��0��$%���9%��#�.%�:;��1�#�1���..�4��/$1�%.�3%��� �����#� ���/�$���� �0� (��2�.%#-.%�� ��� ���2�#� �%��.-�������� ��� �$%� ��$%�� ���%� .�4$�� 2�#���#�/1� �..�<�� ����4$��� ����#�2/.%8� ���-#�-�%�� �0� .�3��4� #%..�� ���� ����-%�� ��� �%�.� ��2%� (-�/���� �%��.-����5� '%#%��� ��3��#%�� ��� .�4$�� ���� %.%#����2�#���#�/1� ��%� �������4� ��� #.��%� �$%� �%2/���.� ���� �/����.�%��.-����� 4�/� 0��2� �$%� ���2�#� -/� ��� �$%� #%..-.��� .%3%.5� 6.�#$�..%�4%�� ���� �%<� ����4$��� ��%� �..-�����%�� <��$� %8�2/.%�� �0=>?� �%/.�#������ ���� �-#.%��� /���%��� �1��2�#�5@���������=%/���2%��� �0� A��.�41 � ,%#$���#$%� B��3%�����C�� =��2����� � D%�2��1&=%/���2%����0�A��.�41�EE ��%��%��0���E��%4���%��F���%���"#�%�#% �+-�<�4��8�2�.����� B��3%����1� �-��#$ � F.��%44;���������%� � D%�2��1)E�����-�%� �0� ��.%#-.��� �%��#��% � G�#-.�1� �0� �%��#��% � B��3%����1� �0+��(�� � F���-4�.����%�/�����4� �-�$���H� ������� � �� ��������I#������J(��5�-;���2�����5�%K� ���� +%��$���� *%����#$� I*5+%��$����J.2-5�%KL������ M����� �� L���� N����O�� &P�& � QRHSTUVW,$��� �%3�%<� #�2%�� 0��2� �� �$%2%�� ���-%� ���%..� ���-#�-�%� ���� �1��2�#�X���%�� (1� Y����� "<%�.�<� ���� D�-�%�9� =��-�%�?3��.�(.%� ��.��%� W�$� Y��-��1� &P�&PTWW;PZS[\]� U� �%%� 0����� 2���%�F-(.��$%�� (1� X.�%3�%�� +��5M_� abacdeb���bQa bQbaafg���� �� ����������� �� ������� �� ����hij�kl�mno�pnoqjrs�tupjvwpjr�xy�sij�ywvpjwr�noj�sij�vioutuzrutjr�sins�uvvw{l�|xrvojsj�sjooxsuoxjr�ny|�noj�nyviuoj|�nssij� ywvpjno� jy}jpu{j� ~�������� hij� mnvs� sins� turs� ywvpjno{ouvjrrjr�uvvwo�uo�ns�pjnrs�rsnos�ns�viouturutjr�tn�jr�sijtsij�vixjm�uoqnyx�xyq�mnvsuo�xy�sij�ywvpjwr���ousjxyr�xy}up}j|xy� ���� oj{pxvnsxuy�� sonyrvox{sxuy� ny|� ���� {ouvjrrxyq�joj� muwy|� jyoxvij|� xy� muvnp� rsowvswojr� ~���� hij� }noxjslum� ywvpjno� rsowvswojr� xppwrsonsj|� xy� �xqwoj� �� onxrjr� sij�wjrsxuy� um� iu�� sijrj� |xrsxyvs� rsowvswojr� noj� nrrjtkpj|ny|�tnxysnxyj|�xy�sij�nkrjyvj�um�rwk|x}x|xyq�tjtkonyjr��pwuojrvjyvj�{iusukpjnvixyq�j�{joxtjysr�|jtuyrsonsj|�nrwo{oxrxyqpl�ixqi�tukxpxsl�um�{ousjxyr�xy�sij�ywvpjwr�~����

rwqqjrsxyq� sins� sij� uvvwoojyvj� um� |xrvojsj� ywvpjno� rsowvzswojr� xr� sij� yjs� ojrwps� um� nrruvxnsxuy�� |xrruvxnsxuy� ny||xmmwrxuy� j}jysr�� hijrj� j�{joxtjysr� npru� xy|xvnsj|� sins|xrsxyvs�rsowvswojr�vuwp|�kj�qjyjonsj|�kl�rsnkpj�kxy|xyq�nr�jpp�nr�on{x|�j�vinyqj�um�xsr�vut{uyjysr�~����hij�vutkxzynsxuy� um� �wuojrvjyvj� {iusukpjnvixyq� j�{joxtjysr� �xsi�xyjsxv�tu|jpxyq�vny�xy�{oxyvx{pj�{ou}x|j��wnysxsnsx}j�|nsnuy�xysonvjppwpno�kxy|xyq�{ou{josxjr�~����hij�uvvwoojyvj�umtwpsx{pj�ny|�}noxnkpj�xysjonvsxuyr��xsi�wy�yu�y�ywtkjorum� kxy|xyq� rxsjr�� iu�j}jo�� tn�j� xs� |xm�vwps� su� tnsijtnszxvnppl�|xrrjvs�uws�xy|x}x|wnp�tukxpxsl�vpnrrjr��hiwr��|jr{xsjsij�{ojrjys�ru{ixrsxvnsxuy�um�sij��xyjsxv�tu|jpxyq�~���sijxyijojys�pxtxsnsxuyr�um�sijrj�jyrjtkpj�tjnrwojtjysr�vnppmuo� vut{pjtjysnsxuy� kl� rxyqpj� tupjvwpj� sonvxyqr� nr� |xrzvwrrj|� kjpu�������� �� �� �� �� �� ��������� �� ���� ��������yj� um� sij� mwy|ntjysnp� ywvpjno� mwyvsxuyr� ny|� sij� turs{outxyjys� ny|� voxsxvnp� j}jys� |woxyq� sij� vjpp� vlvpj� xr� sij{ojvxrj�|w{pxvnsxuy�um�sij�jysxoj��j{x�qjyjsxv�xymuotnsxuy�hij� vinppjyqjr� um� ���� oj{pxvnsxuy� noj� jnrxpl� rwttnozx�j|�� �uwqipl� r{jn�xyq�� iwtny� vjppr� yjj|� su� oj{pxvnsjnkuws���kxppxuy�����������knrj�{nxor�xy�inpm�n�|nl��rsnosxyq�nssiuwrny|r�um�rxsjr�uy����viouturutjr��{ojvxrjpl�vu{lxyqjnvi� ny|� j}jol� knrj� {nxo� uyvj� ny|� uypl� uyvj�� hij� |xrzvu}jol� ny|� kxuvijtxvnp� vinonvsjox�nsxuy� um� sij� ���|uwkpj� ijpx�� ny|� ���� {upltjonrjr� uwspxyj|� sij� knrxvtjvinyxrt�kws�vuwp|�yus�j�{pnxy�sij�jm�vxjyvl��{ojvxrxuyny|� vuuo|xynsxuy� um� vjppwpno� ���� oj{pxvnsxuy� ~���� �xyvjsijy� ny� ntn�xyq� vut{pj�xsl� wymup|j|� nr� vuwyspjrr� yj�mnvsuor� �joj� x|jysx�j|� sins� vuysoxkwsj� su� sij� jm�vxjyvlny|� {ojvxrxuy� um� ���� oj{pxvnsxuy� s� xr� vpjno� sins� ���� oj{pxvnsxuy� ¡¢� £¡£¤� xr� tuoj� siny� ¥wrssij� rwt� um� npp� {nosxvx{nsxyq� mnvsuor� ny|� jr{jvxnppl� siju}jonpp�vuuo|xynsxuy�ny|�{ojvxrxuy�xr�mno�mout�kjxyq�oj{ouz|wvxkpj� ¡¢� £¡¦§¤�� �pojn|l� jnopl� monvsxuynsxuy� j�{joxtjysrxy|xvnsj|� sins� yj�pl� rlysijrx�j|� ���� ny|� turs� um� sijoj{pxvnsxuy�nvsx}xsl��nr�nrruvxnsj|��xsi�ixqijo�uo|jo�rsowvzswojr�~��������s�sij�vjppwpno�pj}jp�����oj{pxvnsxuy�vny�kj}xrwnpx�j|� kl� xyvuo{uonsxuy� um� tu|x�j|� ywvpjusx|jr� ~����xttwyu�wuojrvjyvj� rsnxyxyq� um� oj{pxvnsxuy� mnvsuor� ~����j�{ojrrxuy� um� �wuojrvjys� mwrxuy� {ousjxyr� xy� px}xyq� vjppr~���� ny|� n{{jnor� ixqipl� uoqnyx�j|� xy� muvnp� rsowvswojr��xqwoj� ���� hij� rwkywvpjno� |xrsoxkwsxuy� um� sijrj� muvxvinyqjr� siouwqiuws� sij� �z{inrj� ~���� xy� n� {nssjoy� sinsouwqipl� vuoojr{uy|r� su� sij� wy|joplxyq� vioutnsxy� rsnsjr~������ ny|� vinyqjr� |woxyq� |xmmjojysxnsxuy� ~��������jvjys� rsw|xjr� in}j� n||ojrrj|� iu�� ���� oj{pxvnsxuy� xr

©ª«¬­«®­� °±­¬±� «²� ³³³µ¶¬±¶·¬¶²¶°¹

<<<5�#�%�#%���%#�5#�2� L������ M����� �� L���� N����O�� &P�& � QRHSTVW

Page 121: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������������� ������������������������������������������������������������������������������� ����� ����������������� ������������������������������������������ ��������� ������� ��� �������� � � ������������ �������������� !� " #$%� ��� ��������� &'(� )������ ���� �������� ������ � � ��������� ����� ��� ��� ��������� ���� �� ������������ ���� ��������� ��� ����� ����������� ������������� ���������� ���������� &'(� ������������ ������ ��*+��,��-������ �������� ���������� ������ ����������� ����� �����.������ �������� ������� /�0&� ��1��� *&./23� ���� /32����������� ��4��� ��� ���� ��� ��������� ����������� ��5���������� )���� ��������� ��� ��� �6�������� � � ,77781777

9:� ;<==� >?@AB?A@<� CDE� EFDCGHB>IHJA@<� K

LMNNOPQ�RSTPTUP�TP�LOVV�WTUVUXYZ[\� ]_\ab�cd�efgh\_�ia_fgaf_\i� ej�ifkgclm_al\eain�Z[i�gchc_dfh� ii\lkhb�i[coi� � _ejcl�gchh\gace�cd�efgh\_�ia_fgaf_\i�cki\_]\j� ej�iafj\je�cf_� hk�c]\_�a[\� mia�b\_in�phh�a[\i\� jiaega�ia_fgaf_\i� []\� e� gcllce�a[a�a[\b� _\�dc_l\j�kb�jbelg� ii\lkhb� ej� jiii\lkhb�m_cg\ii\i� ea[\� ki\eg\� cd� c_qereq� l\lk_e\in;A@@<D?� stHDHuD� HD� ;<==� vHu=uJF� w:xwy� z{|}~89�� ooonig\eg\j_\gangcl

Page 122: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������� ����������������� ���������������������������� ����� �� �������� ���� ��� �� ���� � �� ����� ����������� � � ���� ������������ ����!�������������!����������� ���� � �� ����� ����������"�� #��� �� �$������� ��� � � �� �� �� ���������� ���� ����������� �������� ���� ��������������� � ������� ������������� � ��� �� ����� �� �������� ���� #���� ���� � �������� �� %� ��� � � �&� ��������� ���� � � �� ����������� � ���#��� ������� �������� ���� � ���������������� � #���� ����� ����� � ������� �� ����������������� ����� �� %� ���� �� �� �� '()� ���������&� ������������� �� ����� � ������� �� ��� �� ���� '() ���� � � ���� � *+,� -+� ��� �� � �� ����� ������ ��������.�/0&�'()�����������.�10&���������� �� ���.230���������� �� '()� ������� .2�0� #� � ����� �������� �� ��� ������ � #���� �#� �� ����������� ��� ���������� ��� ������ ����� �� ���� �� ���� �������� �!����� �������� ����� �� ���� '()� ������� �� ������ 45()� .2�0� ����������� ���� ���� ���������� ����� �� ���� �� ������������ ��) �45()���� ��������� �#��������������� '()� �������� ��� #���� ��$������� ������ ����� ��� ������������������ � ���������� ���� �������������&���� !�� ��� ��� � � � � �� �#� ���� ��� �� �������� � ����6�� ������� ����������&� ��� #� � ������� #������� ������������ �!���� � ������� �� ����� ��������� ������ � ���� ��!������ 78� 979:� ��� ���� ������ �� �������� � �� ���� ����������� ������� ���� �

��� �� !�� �� � #���� ����� ��� �� ;��� ����� ���� �������<��������� �$������� � �� ������ ���� �� ������������ � �������� '()� ���� �� %&� ���� ;��� ������� ��������'����� � #����� � ����� ��������#�������� �������� �������� ��� #���� 45()� ��� ������ ��������6����� � �� �������� ��� ������ =����� � 45()� ���� ��$������ ���� ����� � �� ������� ����� &� ���� ����� ���������� #���� ��� #���� ��� ��� ������ � ������� #������������� ��� � ��� ������ ������ �� � �$������� �������� � �� �� ��#� ��� � .22&2>&2�?0�� ��� � ���� � ���� � � ����� ���� ���� ������ �� '()� ���������� ����������������������������������������������� ������ �� �� ��� ���� ������ ������ � '()� ��� ��� ���������������������� �� ����������������������� ����������� ������ ����� ���� �� ���� �� ���45()� �������� ����� �� 6����� � ������� ���� ��������� �� ��� ���� �� �� ��� ����� � #� � �� � ������ �� ����� ���������� � � ���� � � '()� ������� .2@0�� %���� �����&� ��������� ���� 45()� ���������� ����� ��� ��� �� �� ���� '()��������� ���� �� '���� ���� �� ������� '()� ����������� ��� �#����� �� � ��A������ .220�� ��� &� ����� ����������������� ����������B�������������� ������ � ������A����������������������� �78�979:� ����� �� ������ ����� �������!������������������������C� �� ��� �� ��� �&� �� � ���� ����� ����� � � � ��� ��������� � � � ���� ����� �� ����� �� ���� ������������� ����� &����6����� ����������������� ������������������

DEFGHEGFIJ� KGLHEMNL� OLP� PQLORMHS� NK� LGHTIOF� SGUHNRVOFERILES� WXYZ[\[� ]� _a� bcdMeGFI� fghij�klmno�mp o�qp orr�� qpstkuv�wkvxyuzz{nku|}v j~�umw�~ �ln}y�plwk{xw{|vor�mp orr�mp or�qp��|zlwuyl{m��{wl i�wz��x��|zlwuyl{m�wz�xy�k�ij�}�zl�

��t���� �l~��l�z~�����w{m�{z�yl{mstkuv�wkvxyuzz{nku|}v �l~��l�z~�����w{m�{z�yl{m��qpo�qpo�qp

h�kk�my��|lml{m�lm�h�zz��l{z{nv����Y�����X��[���Y[��X�[�����[�������XY�\�X�������\�\����������\�YX��\�����[YZ�Y\�[���X ����Z���Y[��������¡���[������¢���£¤�[¢���Y¥\�X��\�Y����Y�\�[��¤�¥�[��[����\� [�� ���� Y�����X��[�� �[� ���� ������XY� ��¡���� ���� ���� Z[�¦��� ����§�  YX¥©� �X\� X� Z�X����Y� [�� X¦[��� �¢[� �X�[����Y\� X�Z� ���� ����Y�� Z���[�Z ��[��� X� �[�¦���Z� ��� ��� [�� X¦[��� ª��«� X��� �[�Z��\�Z� ���[� X� ������\� ¢���� X� Z�X����Y� [�� ¬Bª­�®��� ���� �[�[�Y���Y��� W��� Y�� �  Y���«� �°� ±�²c�³W©«���������YX���[XZ�� ���X��[Y���[Y�����Y�����X��[���X��[Y\«��X\�X�Z�X����Y�[��X¦[���b����¢������������Y[\�[���X��¥�Z�\��Y�X¦��«�������XY�Y�����X��[��[��� X�Z� ���\��Y\� XY�� ��� ���� YX� �� �Y[�� c­­� �[� ª­­­����

¢¢¢�\������Z�Y�����[�� GFFILE� µVMLMNL� ML� ITT� ¶MNTNeQ� ª­cª«� f·²¹Bb¬

Page 123: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������� ���������� ��� ���� � ����� �� �� ���� �� ����� � ���� ����� �� ������ �������� ��� ��������� ������ ������������� �� ���� ������ �������� ���� ��������� ���� ������������� � ���� ���� ������ ������� ��� �� ������ ������ ���������� !� ��"� ��#$%� #�&�!� &'� !��()$�&)$ *)$!� ��� #+$� �* )$*!,��� -��� ��. ���� �� ����� �� �������� ��� �����/0�������� �� ������ ����� ���������� ��� 12� 3145� ������/�. ���� ��� �������� �� ����6� ������ ���� ��� ����0���������� � ����� �������� � -�� ��-����� � - ������� ������� �� �� �������� 789� �� ��������� �-�:;������ <=�,������������� ����� ��������� ��� � ����������������� ���� ������ ���� 0�������� ������ ����> ��/- ���� ������������ 78?9� � �� � ����� ��� -���� �� �� ������ �� �� �������� ��� ��-� ���� ���� ���������� �� ������ �� �������� 78@9�� ,����� ������ �� � ������������������-� ��������� -���������-��� ������������� � ����� �������� ���� -�� ��� ��� -��� �� ����� ������������ A�� ������ ����� ��� ��� �� �������� ����/� ����������������������� -�� �����-���� ���������������������� ��� �� �� ������ ���� �� ����� �������� ���������� ���� �� �������� ���� ���� �������� ����-����� �������� 6���� ��� ��-���� ���� �������� ���� ��� �����/������� �� � B� �� ����������� �� ����� � C�� ���� �� �/� ������� 78D9� ��� ������ ��������� E2� F14GH� �� ������������������������ ��������I�����������������������-� ���� � ��/���������������������� ���� �� ����������� �� ����� ��� 7JKL9�� ,���� �� ����� ��� ������������� �������� �� ���� ��� ��� ��� -��� �� �������������� ��� ��-���� �����,��� �� ���� �� ������� �������� ��� ����� 7J<9� � �� ������������ ��� ���� ��� ���� �/�/����� � ��� ��� ���� �� �������������������������������� - �� ����0��������M�� ���� ��� � ���� �� �� ������ �� ��0����� :,AN;=� ���/���� 7JO9� ��-��� ���� ����� ���� �/�/����� � ��� ���� ��� ��� ���� ���� �� ���������� ���� �� ���� �� �� � ����� ��������� ���� <KK���� ���� ��� ���� ���� ���� ��� M�� �������� � ���� ������� � ���� �� 0�������� 0��� ������� �� 0�������� ���� ���� ������� 7J89� �� �������� �������� �� ������� �������� ����� -���� ����� ����� ����������:���������������� ���=����� ��������������������������� ����� �����������-��������������������P������� ��������������������������������� ���������6/���� � �� ����� � ��� �������� ��� ���� ��-�������� �����-������������������-�� ��� ���,���� �������������� �� �� ������� ���� �� ���������� ������ ���� �������� �� ���� �� ����-��� �� �������� ��� �� ���� ���� �������� �0����������� ��������������������:������ -����� ���- �/�����Q�7JJL�JR9=��S���� ����� ����� ��� -�� ��������������:;������ 8�� ��� � ���=� ��������� �������� �� ������ -����������� ���� ���� ��������� ����/������ ������� �������� ���� ������� :;������ 8�� ����� � ���� ��� T-��=�� ���� ���� ��� �� �� ������� -�� ��� ��.�� �������� � -������������� ���� �� ���� �������� ��� ��� ���� �� ���/�� ��������� U����������� ��/������ � ������ �� ������� ����������������������-������� ��������� ������� ���� ����� �� ����� �� ������������ ,���� �� ������ � ������� �������� �� �������� ���� ��� �� ��� ��/��������������������������V���� ���� ��������� ������ ����6� �� �������� ���� ���� ������ � �� ���/�� ���� ���� ������������������ ������.�� ����� ���-������ ��� ��� ��� ������ ����6���� 7JW9�X�-�� ���������������������������� �������� B��������������� ���� ���� �� ��� ���� �� ����� �� ���� �/���� ��

YZ� [$))� !#%* #*%$� ��"� "����� ! \�(*%$� ] _ abcbdec_fgabcbdec_fghijkljm

g�nog�no plikqqkr�stu_hppkvw�xymvmlv�mv�_kjj�zmljl{f|}~��}���}��� ���� �����}�~� ��� �������� �����}�~�� ��������� ������~������}���~����� �����~}~� ����� ������� ~����~�~� ����� ���� ������ �����}�~�������}�}�� �������������� }~�� �}��� ����� ������ �������� �����}�~����������������������}���}��������������}���}��������~}������������~�����~��������~� }�� ���� ���~�� ������~�� ����� }������ �}����� ��������� ����}���������� ������� ����}��� ��� ��������}��� ��������}��� ���� ��}~� ����� ~������~����� �}~��}���}���� ����~���~� ��� �� �}��� ~����� � ¡ �¢£�� �}��� ���~��}���~����� ������ ~�¤������ }�� ~������������� ¥��}��� ��� ~}����� ������������ �����}�� ������ ��������~� }�� ���� ���� ��� ������������ �������~�������������~� ���� ~������ ¦��� �����~����}��� ���}�� ~���~~�������}�}�� ��������~� �������������� ������ �}���}�§���}��� }���� ����������~�� ��� �Z� Z� ���~�� ������~�~�� ��� ~}����� ��������� ����� ����}~�����������������������������~��������������~~����~}�����Z©Zª��}�������� ��~~� �}������ «��� �}���� �����~����~� ��� ¡¬���� ���� ���� ������ ��§����}���� ~����� }~�  Z�Z�­��®� Z�Z�­��� ������� ����}�~� ���� ��~��}���� }�� °±±²�

[*%%$�#� ³ ���&�� ��� [$))� µ�&)&(�� Zª Z�� ¶·¹¡©Y�� ����~�}�����}��������

Page 124: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������� �� ��� ��� ���� ���� ���������� ��������� ���������� ����� ���� ��� ��� �!����"� �� ������ ���������� �� #!����� ���� $������� ��!���� ���� ��������� ���������� � ����� ���� ����� ������#��#������ ������� ������� � ���%� ����� ���� �������$ ��������������������&'���������������������#��#�������������������������������������������������� ����$��������� ������������� ���� ���" ����� ���������� ��� ��%���� ����� ���� ����� �������� ���� �� ������ �����$����� ��� ���� ������ ������ �� ���� ������ ���� ������������()*+,,-.$������"� ������ ���� !����� ��$����� ��� �������� ����� ����� ���������� ����������� ��%���� ������ �$���������$���������� ��������"� ������� �&/�� ���!���� ���� ��$�"� �� ���#�$�������$��$��������%��#����������������$��������!��� ������������ 0!!�� ���������� �� ��� ������������ ���� ������ ���������� ��������"�����1#��"���"�����������"�23��$���45����� ������������ �� ���$��$���� ���� ������ �!������� ����������� ������� ��� �������� ����� ������� ���� !���� ������%��"� �� ���������� !"� 6������ ��"����� ���$��$�������� ��"�#��������� ��������"� ������"� ���� ��� ���� !���� $��������� ���������$��� �� ���� �� ������ $���#�$!$�����0� ���" ������ 7� �&4��� ���� ������"� ����������� ����!���#����� �� ��"�#��������� ��������"� ��� �����%�� !������ �� #����������������������$��������������������� !�������� �����%������������ ��������"��8�9� ������� �������%����������������� ������������� ������"��������"����!�������������� ��$�"� �� ���"��!��� ��� ��� �$ ��� ������ �&:��.��������%�� ������ ���� ��������� ��������"� ��� �� !������� ������������� ������������� ������"������$���������$���������� ��������"� ��%�� �������"� !���� $���� ��� ��$����������� ������� ������ �� �!��������� ��� ��%������ �$ ��� ������&����7�������������������������������������$��������������� ����$��� ������ ��������"� ������;$��� ����$����� �!�%�������������� �������$������� ��������� �����������������<�������������������%���� ��������%������������������������ ��������"���������������� ������������9������ �#!������ ����� ���� ���� �� ��� � ������ ����� ���%��������� ����#!�����������������!��������%�����������&�&&����� ��������� ����������"� �������� ����� ���� ������������ �����������&=>>�� ���� $������ ���������� ���������%�� ��������"� �����$��������;$�����������������������������$��$����������%����%����� ������� �� �����$���8���� !$�� ���� ������ ��� � ������ ����� ���� ����$���� ��� ���%��#����������� ����� ���� %��$ �� ���$��� ���� ����� ���������� ����� ���� �� �� ������� ���� �������� ���������� �����$ ����� ���������������� !��� ��� ��� �������������$�����������;$����������� ��������������� ����������$�� $������� ����� ���$ $������� ������ �� ����� �&���?@-A,B+CDECFCA*GH������9���������������������� � !�������$����!������"������������$������������!$������ �%��� ���� ����� "������ H�� ���� ����!���� ��� I��9��� <$��� ���J�%��� K�$L� ���� ���� 0������� M������ ��� � ���� ��������� N$�� ��������� ���

!�����$��������!"��������������J�$������3�����$����� ���������2J3K5���� I��9� ����� �$�������� ���� ���� K�� ��� M������"� ��� O�$������� ������������ 2<M<35�?PPCADQR� ?S� T)PP+CFCA*UVW� DU*UX$���� �����"� ����� ����������� ���� ����� �������� ���!�� �$��� ��� ���� ������� %������� ��� ���Y/'�/'/=Z[���!�4'//�/4�''��\C]CVCA@CG� UAD� VC@,FFCADCD� VCUDQAE_abc� de� _bfghij_b� gkfabacfl� imjgcnao� pgfngk� fna� abgdo� de� baqgapln_qa� maak� ngrnjgrnfao� _cs>� de� cahg_j� gkfabacf>>� de� difcf_kogkr� gkfabacftu>> vdjwab� xl� ybafn� zl� {djdqag� |l� ydanjab� }l� {_b_hdrji� yl� ~_ifn� �l�ijjab�{l��gjc��l��ba�ab��l�{ aghnab����������s���VCC�DQFCAGQ,AU+FUPG�,]�U++�@�V,F,G,FCG�QA��)FUA�FU+C���V,�+UG*�A)@+CQ�UADPV,FC*UP�UGC� V,GC**CGu� ����� ����� ����l� �sat��ux� �_�db� fdib� oa� edbha� cfio�� qgci_jgwgkr� _jj� ��� hnbd�dcd�ac� gk� _� ni�_k�mbdmj_cf�_ko�gk� _oogfgdk� fna�_ifndbc� �a_ciba�_ko�ogchicc�fnagb�baj_fgqaogcfbgmifgdk� gk� fna� kihjaicu�u� �ba�ab� �l� �ba�ab� �s� ��V,F,G,FC� *CVVQ*,VQCG � A)@+CUVUV@�Q*C@*)VC�UAD�ECAC�VCE)+U*Q,A�QA�FUFFU+QUA�@C++Gu�¡���¢�£¤�¥��� ���tl� ¦s�§�©�tu©u� { ahfdb� }ªs� «)@+CUV� D,FUQAGu� ¬� ­���� �®�� ���tl� ¯°s�±§t�±§©u�u>> n_gb��}l��gcfajg��s�²QE��F,�Q+Q*W�,]�PV,*CQAG�QA�*�C�FUFFU+QUA@C++� A)@+C)Gu� ¡��³�� ����l� °µ°s�����§u�na� �bcf� ¶idbachakha� ndfdmja_hngkr� bahdqab�� �a_ciba�akfc� oa�dkcfb_fgkr� fna� cibbgcgkrj�� ngrn� �dmgjgf�� de� bdfagkc� gk� fna� kihjaic� de� jgqgkr�_��_jg_k� hajjcu�u� ª_�dko�x|l� { ahfdb�}ªs�«)@+CUV�GPC@-+CG·�U�F,DC+�],V�A)@+CUV,VEUAC++CGu� ¡��� ¢�£� ¸��� ­���� ����� ���©l� °s����t�u�u� n_gb��}l�{h_e�og� l��jmg��l�¹ahabdq_�ºl�}a��xl�»w_fd�yl�vbdpk�}�l¼_rab�zl�vicfgk��l��gcfajg��s�½+,�U+�AU*)VC�,]�DWAUFQ@�PV,*CQA�@�V,FU*QA� QA*CVU@*Q,AG� QA� ¾Q¾,·� *�VCC�DQFCAGQ,AU+� ECA,FCG@UAAQAE� UAD� DWAUFQ@� QA*CVU@*Q,A� AC*B,V-G� ,]� @�V,FU*QAPV,*CQAGu� ¸��� ­���� ����� ����l� ¦°s�©§©����u�u� �iajjab�~l��_ww_�}l�{f_caqghn��ºl��h¿_jj��ºzs�À\?Á�UAD�-QAC*Q@F,DC+QAE�QA�*�C�UAU+WGQG�,]�A)@+CUV�PV,*CQA�DWAUFQ@G·�B�U*�D,BC� VCU++W� -A,Bu� ­³ � ÂÃ�¥� ­���� ����� ��t�l� ¦¦s��©�ttu±u� �n_rgk� ¹»l� {fa_b� º¼l� �_bodcd� ��s� (VEUAQÄU*Q,A� ,]� Å«?VCP+Q@U*Q,Au�|k� ÆÇ��¡³®��³È���ogfao�m���gcfajg��l�{ ahfdb�}ªu��djo{bgkr� ¼_bmdb� ª_mdb_fdb�É� ��t�s_����©�u� �djo� { bgkr� ¼_bmabcahf� vgdjl� qdj� �u§u� vabawka���l��deea��}{s�«)@+CUV�PV,*CQA�FU*VQR·�UGG,@QU*Q,A�BQ*�ACB+W� GWA*�CGQÄCD� Å«?u� �®��¥®�� t§��l� ÊËs�§t�§©ut�u� ªadkn_bof� ¼l� �_bodcd� ��s� �UVEC*QAE� UAD� UGG,@QU*Q,A� ,]PV,*CQAG�BQ*��])A@*Q,AU+�D,FUQAG�QA�*�C�A)@+C)G·�*�C�QAG,+)�+CG,+)*Q,Au� Ì¥�� ¢�£� ­Í���� t§§�l� ΦÏs©�©©©�uttu� ¿_Ð_�ib_� ¼l� �dbgf_� �l� {_fd� �s� T*V)@*)VU+� ,VEUAQÄU*Q,AG� ,]VCP+Q@,A� D,FUQAG� D)VQAE� Å«?� GWA*�C*Q@� P�UGC� QA� *�CFUFFU+QUA� A)@+C)Gu� ÑÒÃ� ­���� ¢�È� t§±�l� ÎÓs�§t�§�ut�u� vb_qd� �l� �_hodk_jovb_qd� ¼s� ÔRQG*CA@C� ,]� *B,� P,P)+U*Q,AG� ,]@W@+QAÕPV,+Q]CVU*QAE� @C++� A)@+CUV� UA*QECA� D)VQAE� *�C� @C++� @W@+C·UGG,@QU*Q,A� BQ*�� Å«?� VCP+Q@U*Q,A� GQ*CGu� ¬� ­���� ����� t§±�lµÓst��§t���ut©u� ªadkn_bof�¼l��_nk� ¼ l�Öagkwgabj� l� { dbmabf�xl��ba�ab��l�×gkÐ�}l�_bodcd� ��s� ÅWAUFQ@G� ,]� Å«?� VCP+Q@U*Q,A� ]U@*,VQCG� QA� +Q¾QAE@C++Gu� ¬� ­���� ����� ����l� °Ës��t�±�ut�u� �_c_c}ajihhng� �{l� vbabd� xl� �_nk� ¼ l� {djdqag� |l� Öifw� xl�ba�ab� �l� ªadkn_bof� ¼l� �_bodcd� ��s� ²QG*,AC� U@C*W+U*Q,A@,A*V,+G�*�C�QAU@*Q¾C�Ø�@�V,F,G,FC�VCP+Q@U*Q,A�DWAUFQ@Gu�¡��­�ÙÙ³¥� ��ttl� ¦s���ut�u� �_c_c}ajihhng� �{l� q_k� va��aj� ºzl� ¼__ca� {l� ¼abha� ¼}l¿dp_Ð� }l� �agjgkrab� }l� {fa_b� º¼l� ªadkn_bof� ¼l� �_bodcd� ��s

T*V)@*)VC � ])A@*Q,A� UAD� DWAUFQ@G� ,]� A)@+CUV� G)�@,FPUV*FCA*G� �_bodcd� ��� ���� ±©

pppuchgakhaogbahfuhd�� �)VVCA*� (PQAQ,A� QA� �C++� ÏQ,+,EW� ��t�l� ¦°s�§�±�

Page 125: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������� ��� ��������� ��� ��������� ��� ��������� ��������� ������ ������� ��� ������������ ����� ��������� ����������� � !� � "#$$�� %&'($#�$#)*+,-.+/0.$1"*�$2�� 3'4-5%657-.'-� 89� :-;&.<0-� =(� >���� ?@A� �������� ������� ��������� �BC�D�� $)2E9� FGH($*E5$I"�$1�� JKL66M6� NO9� =6,%6.<&,� PQ9� PR6ST&.� U3(� ?���� � ������V�������� ?@A� ����� ������ ��� ���������� ���� �� ���W� ��������� ���������������X��������� ��������� ��������Y��� �X �����Y���������� ?@A� ������ ���� Z� [���� \�]�� $))"9� GG($#)_5$$$#�$E�� `a� N9� O6..b� 8c9� P',/d� ef9� g'hi6.T� Uj(� ?������������ ��k�� ������ ���V������ ���� ����� ������ ������� ��� ������� �l� ������ m���������� �������� n]�� \�]�� [���� "##_9� G("E1"5"EE$�$)�� ='.-T-,'� o9� 36<0&p-.� 89� g'hi6.T� Uj(� ?��������������Y���� ������� �����Y������� ������ ���� ������ ���� ��� AqY�� r����������������� �� ����� �������� s>t@uvY�� � ��� ������wD]�� �BC���B�� x��� yx�� "##I9� GzG($2E2$5$2E22�"#�� =-TT&,� LP9� Ud-.� c9� f.&;,� {=9� o|i-h� j89� PTa-.T� P9� U'%-4&� cO9PSd'h%0.-aT� Q3(� }���� ������ �������� ��� � ����� ���� ��� �������������� ��������� ��� ���������� ������ n]�� [���� \�]�� $)EE9~("$I)5"$_E�"$�� g6���9�fh&;�::(�q���� ������� � �����������������[����[����"##)9� ~("*"#5"*""�""�� g6���9�fh&;�::(���G����k��������� �������� ����� ���������k��������� �������� ������� X����� ��� ��������� �� �������� Z� [���� \�]�"#$#9� GmG($"E_5$")1�"*�� :-S0<&,� U89� e&4i&� 8(� }���� ��� �������� ���� ���k��� ������ �� ��������� ���� ����W� ������ �� ���� �� ����� ������V����� �����k����� ��� ��� ��X ����� � ��������� ���� ������������ ��� ������ ��� ����� ������ Z� [���� \�]�� $))E9� G�z($"E_5$")_�8�Td&.&a/d�|a-,T'T-T'p6�-,-hb<'<�&M�.6Rh'S-T'&,�<'T6<���� �C��',�4-44-h'-,S6hh<� -,%� Td6� .6h-T'&,<d'R� T&� .6Rh'S-T'&,� M&.0<� -,%� Td6'.� R.&/.6<<'&,� ',<T.6TSd6%� U�8� �i6.<�"I�� P-%&,'� �9� Q-.%&<&� jQ9� PT6h�6.� {=9� 36&,d-.%T� =9� �',0� U(� ���k�� ���������� ������ ���������� ��� �������� ���� ��������������V���������?@A������ �������Z�[����x���"##I9�GGH(_*_*5_*2_�"_�� Q<6.6<,b6<� �9� PSd;-.�� �9� g.66,� Qj(� A������� ��� ����� ������� ��������������� �����k������Y������������������ ��� ���\n[� [���� \�]�� "##)9� Gz(EE�"2�� f-%%6h6b� U9� Qd-/',� cJ9� PSd6.46hh6d� 39� j-.T',� P9� e&4i&� 89Q-.hT&,� ej9� g-dh� 89� U&4-',/� e9� f'.0� �9� 36&,d-.%T� =� �C� B��(�������������������� ���������� ����������������������� ��������� �����Y����������� ����� �� ��� ���� �������� ���� � !� "#$#9� l~(6E�"1�� L&i6.,-�L9�3'/-<&p-�89�j-h',<0b�:9�eh'<<�89�P'6/6h�8:9�Qp-S0&p-��97'%h6.&p-� =9� j-<-T-� j9� 7'-h&p-� j9� N-<0-� o� �C� B��(� u�� ������ ��� ��� ��� ?@A� ����� ������ ��� lY?W� ������ �� ���� �������Y��V�������� �������� ������������Y������Z�[����\�]�����"##_9m�($"25$*E�"E�� Q-.%&<&�jQ9�36&,d-.%T�=9��-%-h5g',-.%�f(�}����������������������������������� ���� ������� ��� ?@A� ����� �����W� ���� A� ������F� ��� �X ���� �� ���V�� ��� ��k�� ����� ������ ��� ?@A����� ������� [���� $))*9� H�()1)5))"�")�� 36&,d-.%T� =9� e-/6� 8 9� `6'6.� =�9� f6<T&.� O=(� A� ��������������� �� ���� ��� ?@A� ���������������� ��� ������ ��� ?@A����� ������ ��� ���������� �� ����� [���� $))"9� HG(E2_5E1*�*#�� g6.-.%� 89� L&a,%.'&a0&MM� P9� N-4'hh&,� c9� P6./6.6� :Q9� j-'h-,%� �9�a'pb� :e9� 8h4&a�,'� g(� q�� ����� ������ ������� �� HY?k����������� ��� ������ ����� ��� ��� �G�z� ��k����� ��� ������������k�� �� ���� G� ���� �������������� ���� �� ����� ���������n\�� !��� "##29� H(E$15E"*�*$�� JTT6.h6'� j9� `-.i.'S0� {9� �-/6hda<� O89� =-a/� O9� PhaRRd-a/� g980i-.'� j9� 8-<� e89� PT6',<i600� L9� f-006� J9� L.&0-,� ={(����Y����� ������k������ ��������������������� �������� ������]Z� $)))9� G~(*E*I5*EII�*"�� `-.i.'S0� {(� q�� ��VV��� ��� ��@A��� ���� ���������� \�]� B� "###9� FF())15$##2�**�� PSd6.46hh6d� 39� =-6446.� 89� PR-%-� 79� N&<',/� �9� j6'h',/6.� U9N&Tdi-a6.� �9� Q-.%&<&� jQ9� 36&,d-.%T� =(� ?���� �� ��� ?���G������ ����� ���� ��� ����� ������ �� ����� ���� ���� ����� ��

��������� ������ ��������� �� ��� ?@A� ����������� ����������� � !� � "##19� l�(I*#$5I*$"�*I�� PR&.i6.T�89�U&4-',/�e9�36&,d-.%T�=9�Q-.%&<&�jQ(���@A�� ������� ���������� �������� ��������� ���� ����������� ������ �������V���������������������������������������������� �!� �"##_9ll(*_"$5*_"E�*_�� PR&.i6.T�89�g-dh�89�8,06.d&h%�N9�36&,d-.%T�=9�Q-.%&<&�jQ(�?@A���������� ����� ����� ������� ��������� ��� ����k���������� ������������k���������������������������k��������� ���������� ��������� n]�� [���� "##"9� Gz($*__5$*2_�8� S&4i',6%� �a&.6<S6,S6� Rd&T&ih6-Sd',/� -,%� <R-T'-h� .6S&p6.b� -,-hb<'<&M� U�8� .6Rh'S-T'&,� %64&,<T.-T',/� Td-T� .6Rh'S-T'&,� M&S'� %&� ,&T� 4&p6� iaT.-Td6.� %'<-<<64ih6� -,%� .6-<<64ih6� -T� Td6� U�8� T&� i6� .6Rh'S-T6%� ,6�T�*2�� j&.Ta<6;'S�� J9� 36&,d-.%T� =9� Q-.%&<&� jQ(� ������������������� �� ��� ���������� �������� �� ��������� ��� ?@A� ������������� Z� [���� \�]����� "##E9� Gz�($_2"5$_2)�*1�� f-,S-a%� 89� =a6T� P9� N-iaT� g9� {hh6,i6./� :(� ������� �� �������k������ �� ������� ��� ����� ��k����� ���� ���� ��������� �� ��� ��������� ��� ����� ����W� �}A��� ����� ������������� ����������������>t���[]���x�D�� �¡BD�]D�wD]C]�]� �"#$#�"#$#(R%i� T&R)#�*E�� j'<T6h'� O(� �������� ����� �W� ����� ������� ���� �� ������ ��� ����� ���� ����� ������������ x������� "##$9FmG(EI*5EI1�*)�� e6%6.<&,� O(� q�� �� �������� o,� ¢��� ������ £� 6%,� "#$#+$$+"2�{%'T6%� ib� j'<T6h'� O9� PR6ST&.� U3�Q&h%� PR.',/� =-.i&.� 3-i&.-T&.b¤"#$#(-###2*E�� Q&h%� PR.',/� =-.i� e6.<R6ST� f'&h9� p&h� *��I#�� =-,%;6./6.�L{9�Q&.%6.&�:89�g-hh�:g(�������k��������� ������������� ����� ��� ��� ¥������� �� ��� �� ����� ���� �� ���Y�������������Y����� ���� ������ n]�� \�]�� [���� "##_9� G("#"5"$$�8�%6T-'h6%�i'&Rdb<'S-h�-,-hb<'<�&M�Td6�<T.aSTa.-h�Sd-.-ST6.'<T'S<�&M�,aSh6-.¦&./-,6hh6<K9�Td6'.�R.&T6',�S&,S6,T.-T'&,�-,%�Td6'.�R6.46-i'h'Tb�T&�4-S.&54&h6Sah6<�I$�� P'6i.-<<6� :e9� Lai'T<Sd6S0� �(� ������� ���� ���� ��� ����� ����������� �� ��� �������� � ���������� ���� ������� ��������� ��� n�C�]� � n]�� \�]�� "##)9� ��(*I*5*2$�I"�� N6S05e6T6.<&,� P39� U6..� �U9� PTaa.4-,� �(� t������� ���������� ����� ������ ������ ��������� ��§� ����� §����� �� ��� ��� ��� sqt}��v�� []��� x�D�� � ¡BD�]D� wD]C]�]� � "#$#�"#$#(R%i� T&R1*�I*�� j6%',-�j89�PSd;'hh6�e(�������� �� �� �������������� ���� ������ ��� ���� ����� ���� ����� ��� ������� ���� ����� ��� k������\�]� B� � "##"9� F�(1_E512I�II�� g.a,;-h%� U9� j-.T',� Nj9� fa<Sd4-,,� c9� f-�6TT5:&,6<� Ue936&,d-.%T�=9�Lai'T<Sd6S0��9�Q-.%&<&�jQ(����k����������� ����������������� ��� ��� ������Y���� ���� ������� \�]��� � Z� "##E9m�("EI15"E_E��<',/�-,�',6.T�R.&T6',�Td6�-SS6<<'i'h'Tb�&M�<ai,aSh6-.�S&4R-.T46,T<�;-<46-<a.6%�',�h'p',/�4-44-h'-,�S6hh<�;'Td�-�p6.b�d'/d�T64R&.-h�-,%�<R-T'-h.6<&haT'&,�I_�� PR6'h� :9� Lai'T<Sd6S0� �(� ������� ����k����� ���� ����� ����������� ��������������� ���������������� ������ �����\�]�����\�]��� ��CB� "#$#9� G~zl(*)25I#I�I2�� 36&,d-.%T� =9� N-d,� =e9� Q-.%&<&� jQ(� ��� ������� ������ k�������� ����� ���� ������ ����� ������������ ?@A� ����� ������� �������������� [D�C� !�©� ��ªBD�]C� «���� �¬�D� $)))9� m(*I_5*_$�I1�� g.a,;-h%� U9� P',/6.� N=9� N&aT� j(� @� ����� ������� ����� �� ��}@A­�������� ���������� �BC�D�� "#$$9� �H�(***5*I$�IE�� j&.�89�Pah'4-,�P9�f6,5®'<d-b�N9�®a,/6.�P9�f.&%b�®9�Pd-p5O-h�®(?���� �� ��� ������� �}@�� �� ��� �������� � ���������� ���������� ������ ��� �� ����� ����� ��� ������� ������ �BC� [���� \�]�"#$#9� GF(_I*5__"�I)�� P'6i.-<<6� :e9� c6'Td� N9� U&i-b� 89� 36&,d-.%T� =9� U-,6d&hT� f9Lai'T<Sd6S0��(�?�� �����������������������}@������� �������� ��������� ������������������� ���������wD]���BC����B��x��yx�� "##E9� Gz�("#")$5"#")2�_#�� N'TT6.� :g9� c6'Td� N9� c66,6,%--h� 89� P'6i.-<<6� :e9� Lai'T<Sd6S0� �(>���� ����� �� ��� ��� ���� ������� ���� ���� ��� ����� ��� �������������� w�]x� ���� "#$#9� �(6$$2*)�

EI� ����� ���� ����� ���� ����� �

�������� �������� ��� ����� ������ "#$"9� F�(1)­E_� ;;;�<S'6,S6%'.6ST�S&4

Page 126: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���� ���������� � � ���������� � � ��������� ��� �� ������ ��� �!�"#"� �$����%� &��"� '�%'�� (�'"� '�!)�� *� +,--� ./0-� 12�2 345��6�7�8���1�� 9:��� ;< � =��>�� �� � ?�:��� � � =������ @ � =�A�� B B����A���� � � @���C�� D � DE�������� � � ?��C���� � � ;��� F�G�%'���%H$� H"'I���'��"�� �J� KL�� !�$)(�"H �� M�� +,--� 1228 3N3��1627�181��O�� ?�����P �;��E����Q ������PR �?�:��E���S �=:��T����9��UI��I"��#��(�% ��%H$� �"�H%�VH���%� �J� !�$)"�W� �(� � �%� �%�H'�I�(H%� '�$$ �� X0-� +,--� 12�2 � N4��627�6Y��Z�� =:�������B ������������ �@������B �@���� �F�E��[ ����������� @:���7�������� D � =������ <S�� \�"��'H$� '�% �"�'���%� ��"�%�HW '� ��%��%]�$]� �I�$�'� ��J� _\KU#MMM#��!�%��%�� $H(�%� �ab/,cb,� 12�� � NN3��6�67�612����� ����A�:��R �d��>����9 �D����A�� �e�T�C�< ������������ �=����Q ?��C���� e � ;������ 9 � @:f�����E� � � ;���E�� @;� ,g� h-i�UH"����%�� H%�� �"H'�%�� H%����% � �%� $�]�� '�$$ � j��I� &��"� '�%�%H%�W���� �� khg� X,gl0mn� 1226 � N�oo87ooY��6�pp ��:� q � ��r7��� s � <�����C� DB � t�� u � ��C�� v? <�r��E��� @S � B��� u � v���E��� @� � DE���� �u�� �� ��%���'H$$)�%'����� �H�� J�"� '�""�$H���� $��I�� H%�� �$�'�"�%� (�'"� '�!)� �J�%�H'�� '�$$ w� �� �� w� H%�� �"�H%� ( �� xy0a� ./0-� 12�� 4���22�2Z��D����:���E��z�������T�>���������f�����������>�{��/c�n/g|�r�E:����������{� z�����E� ��� �������r�� ��>��� ���� �������� ���E��zf��8�� �T����T� B� � ��T�E� �v � =���A�>� [=�� }���$$�%�� �H�HH'"� � $HW w� ��%�(� w� !H'�� H%�� ��(��� khg� +,--� ./0-� 1226 ~���Y27��YZ�

_�"�'��"�w� J�%'���%� H%�� �)%H(�' � �J� %�'$�H"� �W'�(!H"�(�%� � ;���E�� ,g� h-i� o�

TTT�E��������������� \�""�%�� �!�%��%� �%� \�$$� ���$��)� 12�1 � ���8Y�o�

Page 127: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells
Page 128: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������

���

�������� ��� ���������������������������� ����!"#$��%�������&��� �� '���(�������������)������

Page 129: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Page 130: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

121

Cyclin B1 degrading F-box protein NIPA is localized to the nuclear

pore complex

Kulinski M1*, Schneider K2*, Illert AL3, Lemeer S4, Kuster B4, Leonhardt H2 and Duyster J3

1Department of Internal Medicine III, Technical University of Munich, 81675 Munich, Germany

2Department of Biology and Center for Integrated Protein Science, Ludwig Maximilians University Munich (LMU),

82152 Planegg-Martinsried, Germany

3Department of Hematology/Oncology, University Medical Center Freiburg, 79106 Freiburg, Germany

4Chair of Proteomics and Bioanalytics, Technische Universität München, 85354 Freising, Germany

* - Both authors equally contributed to this work

Abstract

NIPA (nuclear interaction partner of ALK) is an F-box-containing protein that defines a nuclear SCF-

type ubiquitin ligase (SCFNIPA), which targets nuclear cyclin B1 for ubiquitination and proteasomal

degradation, thereby contributing to the timing of mitotic entry. Here we show that NIPA is localized

to the nucleoplasmic site of the nuclear pore complex (NPC). Interestingly, we identified the

nucleoporin TPR as a scaffold protein, which forms a very stable interaction with NIPA at the NPC. The

C3HC zinc-finger motif located in the N-terminus of NIPA is responsible for the interaction with the

nucleoporin TPR and disruption of this domain leads to mislocalization of NIPA from the NPC to the

nuclear interior. Moreover, inactivation of TPR by RNAi results in destabilization and subsequent

degradation of NIPA. Based on the localization of the F-box protein at the inner site of the nuclear

pore, we propose an intriguing mechanism for cyclin B1 degradation, through formation of a “cyclin

trap” directly at the gate, targeting the substrate for ubiquitination just upon entry to the nucleus.

Introduction

Subcellular compartmentalization of the cell by membrane systems allows for the separation of

essential processes. As a result, the transport of material between those compartments is crucial to

maintain proper cellular functions. The passive and active nucleocytoplasmic transport through the

doublelipid bilayer of the nuclear envelope is regulated by the nuclear pore complexes (NPCs), large

multiprotein gateways composed of several copies of 30 different nucleoporins (NUPs)1,2.

NPC architecture is based on the octagonal symmetry with distinct, structured subunits: cytoplasmic

and nuclear coaxial rings placed on the periphery of outer and inner nuclear membrane, respectively;

the main translocation channel is formed of eight elongated structures termed spokes and connects

Page 131: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

122

both coaxial rings thereby also forming a spoke ring; peripheral NPC components, such as short,

cytoplasmic filaments emanating towards the cytoplasm and filaments forming the nuclear basket

converging into the distal ring 3-7. The nuclear basket, also called a “fish trap”, can facilitate

interactions between transport complexes and serves as a docking site during cargo translocation8-10.

The central architectural element of the nuclear basket is constituted by the translocated promoter

region (TPR), which is anchored to the NPC by NUP15311,12. TPR is a 267-kDa protein of a bipartite

structure: a large N-terminal domain forming a double coiled-coil and a nonhelical, highly acidic C-

terminal domain, not dominated by a particular type of secondary structure13,14. Besides its structural

role in the assembly of the nuclear basket, TPR has been shown to be involved in mRNA export

control15,16, activation of the met oncogene17, nuclear protein export18,19 as well as spindle checkpoint

control20,21 and ERK2 nucleo-cytoplasmic translocation22, thus demonstrating multifunctional

properties of the NPC. Additionally, recent studies point towards the involvement of NPC components

in DNA damage repair23,24, regulation of both transcription25,26 and autophagy27 as well as in

posttranslational modification with small ubiquitin-related modifier (SUMO) proteins28-30, suggesting a

prominent role for the nuclear periphery in cellular physiology.

We previously identified NIPA (nuclear interaction partner of anaplastic lymphoma kinase) as an F-

box-like protein, which together with SKP1/CUL1/ROC1 defines the SCFNIPA complex as a family

member of the SCF-type ubiquitin ligases31-34. NIPA is responsible for the subcellular regulation of its

substrate, cyclin B1, in interphase, thereby contributing to the timing of mitotic entry31. Cell cycle

dependent inactivation of the SCFNIPA complex is governed by the inhibitory phosphorylation of NIPA in

late G2 phase by the action of cyclinB1-CDK1 and ERK2 kinases33,35, leading to the disruption of E3-

ligase activity. Although the molecular mechanism of protein degradation that controls cell

proliferation is well known, many mechanistic questions still remain elusive36.

Here we show that NIPA is associated with the NPC by a direct interaction with the nucleoporin TPR.

We identify the zinc-finger motif within NIPA to be responsible for the binding to TPR and moreover

that disruption of this domain leads to the dissociation of NIPA from the NPC. We therefore propose

an intriguing mechanism for the regulation of cyclin B1 nuclear abundance by recruiting ubiquitin

ligase mediated degradation to the gates of the inner nuclear envelope.

Materials and methods

Plasmids, antibodies and immunological procedures.

Details of the construction of various plasmids are available from the authors upon request. The

plasmids for FLAG-NIPA-pcDNA3.1 wild type, zinc-finger mutant and nuclear localization signal (NLS)

mutant were kindly provided by C. v Klitzing. GFP-NIPA wild type and GFP-NIPA zinc-finger mutant

Page 132: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

123

were subcloned into pEGFP-C3 vector (Clontech). cDNA of NIPA was cloned into pcDNA-N-SF-TAP

(vector was kindly provided by M. Ueffing37). pcDNA3.1-FbxO9, pcDNA3.1-Fbw2 and pcDNA3.1-Fbw11

plasmids were a generous gift provided by F. Bassermann. Vector encoding human pEGFP-TPR was

obtained from Addgene (Addgene plasmid 35024, P. Frosst18). Plasmid transfections were performed

using TurboFect (Thermo Fisher) or Lipofectamin 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer’s

instructions. Antibodies used in this study included mouse monoclonal antibodies from Sigma-Aldrich

(-actin (AC-15); FLAG-M2), Santa Cruz (NIPA (B-10, sc-365058)), ActiveMotif (α-tubulin (5-B-1-2)) and

Abcam (NUP153 (QE5)); rabbit polyclonal and monoclonal antibodies from Sigma-Aldrich (ZC3HC1

(HPA024023)), Abcam (p-NIPA (ab63557)) and Cell Signaling (NUP98 (C37G10)); and goat polyclonal

antibodies from Santa Cruz (TPR (C-20); Lamin B (M-20)). All secondary antibodies used for

immunofluorescence were from Invitrogen (Anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488; Anti-Rabbit IgG, Alexa

Fluor 594; Anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 594; Anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488 and Anti-Goat IgG,

Alexa Fluor 594). Extract preparation, immunoprecipitation and immunoblotting were performed as

previously described31,34,35. Nuclear fractionation was performed using Dounce homogenizer as

previously described38.

Immunofluorescence staining and structured illumination microscopy.

Cells were grown to 80% confluence on high precision microscope cover glasses (Roth), fixed with

formaldehyde and permeablized with 0.5% Triton X-100 in PBS containing 0.02% Tween-20 (PBST).

After blocking (2% BSA in PBST) for 1 h), staining was carried out by incubation with the primary

antibodies (1 h at 1:200-1:500 dilutions in 2% BSA). Slides were then incubated with secondary

antibodies (typically 1:400 in 2% BSA), postfixed with formaldehyde and nuclei were counterstained

with DAPI (1 g/ml in PBST). Finally, cover glasses were mounted onto microscope slides (SuperFrost

PLUS) in VECTASHIELD (Vector Laboratories). Confocal images were taken with an UltraVIEW VoX

spinning disc microscope (PerkinElmer) assembled to an Axio Observer D1 inverted stand (Zeiss) and

using a 63x/1.4 NA Plan-Apochromat oil immersion objective.

3D-SIM was performed on a DeltaVision OMX V3 (Applied Precision) system equipped with a

100x/1.40 NA PlanApo oil immersion objective (Olympus), Cascade II: 512 EMCCD cameras

(Photometrics) and 405, 488 and 593 nm diode lasers as previously described39,40.

Live cell microscopy, fluorescence loss in photobleaching and quantitative fluorescence recovery

after photobleaching analysis

Live cell imaging, fluorescence loss in photobleaching (FLIP) and fluorescence recovery after

photobleaching (FRAP) experiments were performed on an UltraVIEW VoX spinning disc microscope

(PerkinElmer) as described before41. For acquisition the 488 nm laser line was set to 8-20%

Page 133: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

124

transmission and the exposure time was set to 200 ms. For bleaching the 488 nm laser line was set to

100% transmission.

In FLIP experiments a rectangular region in the nucleus of 5x5 µm was repeatedly bleached. 2-4 cells

were bleached in parallel. After 2 initial prebleach frames with a time interval of 5 s, 21 bleach cycles

were performed. Each bleach cycle consisted of a bleaching event of 500 ms followed by 2

postbleach frames with a time interval of 5 s. To evaluate the data, the mean intensity of the

peripheral region, was determined over time. The outer border was determined using the “Auto

threshold” function and the inner border was determined by eroding the selected region 4 times.

Afterwards, the background intensity was subtracted from these results and the intensities relative to

the first postbleach frame were determined. The measurements were performed in Fiji42 followed by

calculations in Excel.

In FRAP experiments a rectangular bleach region, covering approximately half of the nucleus, was

chosen. Like in the FLIP experiments 2-4 cells were bleached in parallel. In order to capture fast

kinetics (Fig. 1D) 10 prebleach frames with a time interval of 1 s were recorded, followed by a bleach

event of 700-900 ms and 60 frames with a time interval of 1 s and further 4 frames with a time

interval of 1 min. For the detection of slow dynamic processes (Fig. 4D) z-stacks of 3 µm with a step

size of 1 µm were recorded every 2 min. After 2-12 prebleach frames, the points were subsequently

bleached manually, with a 10-15 s delay between bleaching and the first postbleach frame.

In long term imaging experiments a z-stack of 10.5 µm with a step size of 1.5 µm was recorded every

10 min for about 30 h. To avoid photodamage of the cells the ATOF of the laser was set to low

transmission values of 8%.

siRNA

siRNAs were purchased from Eurofins and were used to transfect subconfluent HeLa or U2OS cells

using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. NIPA siRNA

corresponded to sense CAGAUUGAAUCGUCCAUGAd(TT)31 and TPR siRNA to sense

GUAAUGAGCAGCAAGCCAGd(TT)43. A firefly luciferase siRNA served as a control.

Purification of NIPA interactors

HEK293T cells were transfected with an NIPA-tandem-Strep-single-FLAG-tagged (NIPA-SF-TAP)

construct as described previously44. Purification was performed as described45. The final eluate was

boiled in LDS buffer, and then separated on a NuPAGENovex 4‐12% Bis‐Tris Mini Gel. Gel lanes

containing separated immunocomplexes were cut into slices and in-gel trypsin digestion was

performed following standard protocols.

Page 134: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

125

LC-MS/MS and data analysis

Dried samples were dissolved in 0.1% formic acid (FA) prior to LC-MS/MS analysis. Nanoflow LC-

MS/MS was performed by coupling a nanoLC-Ultra (Eksigent, CA) to a LTQ Orbitrap XL mass

spectrometer (Thermo Fisher Scientific, GER), using a 20mm x 75 um ReproSil-Pur C18 (Dr. Maisch,

GER) precolumn followed by a 400 mm x 50 um ReproSil-Pur C18 (Dr. Maisch, GER) analytical column.

Peptide mixtures were analyzed during a 110 min gradient from 0 to 40% B (0.1% FA in AcN). The

eluent was sprayed via emitter tips (New Objective) butt-connected to the analytical column.

The mass spectrometer was operated in data dependent mode, automatically switching between MS

and MS/MS. Full scan spectra (from m/z 350 – 1200) were acquired in the Orbitrap with a resolution

of 60 000 (at m/z 400) after accumulation to target value of 1E6. The 15 most intense ions at a

threshold above 5000 ion counts were selected for collision‐induced fragmentation in the linear ion

trap (LTQ) at a normalized collision energy of 35%. Peak lists were extracted from MS data files using

Mascot Distiller v2.2.1 (Matrix Science, UK) and subsequently searched against the Human IPI

database version v3.68 using Carbamidomethyl cysteine as a fixed modification and Oxidation (M),

Phospho (ST) as variable modifications. Trypsin was specified as the proteolytic enzyme and up to two

missed cleavages were allowed. The mass tolerance of the precursor ion was set to 5ppm and for

fragmentations to 0.6 Da. Data interpretation was performed with Scaffold2, v3.3.0. Proteins were

filtered using a minimal protein identification probability of 99% and minimal peptide identification

probability of 95%.

Cell culture

HeLa, U2OS, primary NIPA-deficient MEFs46 and HEK293T cells were cultivated in DMEM

supplemented with 10% FCS and penicillin/streptomycin or gentamycin in a humidified atmosphere of

5% CO2 at 37C.

Results

We previously characterized NIPA as an F-box containing protein, which is localized exclusively in the

nucleus, by using affinity-purified polyclonal murine NIPA antiserum31. This antibody yielded a bright

immunofluorescent signal, staining the whole nuclear interior. Recently, more specific antibodies,

raised against human NIPA protein, have become commercially available (Sigma-Aldrich HPA024023

and Santa Cruz sc-365058) showing explicit staining of the nuclear periphery. As shown in Figure 1A

(and Supplementary Figure 1) these antibodies detect NIPA at the nuclear periphery. To gain more

insights into the precise localization of NIPA at the nuclear periphery, we performed super-resolution

imaging, with 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM)40. With this imaging technique, we

analyzed the localization in respect to the nucleoporin NUP153 and a structural component of the

Page 135: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

126

nuclear lamina, LaminB47,48. NIPA was found at the nuclear periphery in a region still stained by DAPI,

but rather below NUP153 and Lamin B, suggesting not the nuclear membrane localization but rather a

nuclear basket association (Fig. 1B).

Although immunostaining can reveal protein location in the steady state, it is not sufficient to provide

information about the dynamic localization49. To obtain a more detailed picture of the subcellular

localization and dynamics of NIPA, we generated a GFP-NIPAWT fusion protein and examined the

localization by a combination of fluorescence loss in photobleaching (FLIP) and fluorescence recovery

after photobleaching (FRAP) (Fig. 1 C, D).

In FLIP experiments, the molecules in a region within the cell are repeatedly photobleached by an

intense laser pulse. A decrease in intensity outside the bleached region allows for assessing the

mobility of a protein between intracellular compartments and for measuring the kinetics of

recruitment to the bleached region from various cellular areas50. When massively overexpressed, GFP-

NIPAWT shows a diffuse nuclear localization in contrast to the endogenous protein, which is localized at

the nuclear envelope (compare Fig. 1A and 1C middle panel). However, when GFP-NIPAWT levels were

low, a profound localization to the nuclear periphery was observed (Fig. 1C, lower panel). The

repeated bleaching in the small nuclear region resulted in almost complete loss of fluorescence inside

the nucleus, leaving a strong signal in the peripheral compartment. These results show that the NIPA

molecules at the nuclear envelope do not diffuse through the bleached area in the observed time

frame of two minutes, indicating that NIPA is bound stably at the nuclear envelope. In contrast to this,

the diffuse nuclear fraction of the protein when artificially high overexpressed is very mobile,

comparable to free diffusing GFP. Together these results indicate that NIPA is stably bound to the

nuclear periphery. In a complementary approach we used FRAP to further analyze the dynamics of

GFP-NIPAWT. In FRAP experiments, the recovery of intensity in a bleached region is observed over

time. The faster the recovery, the more mobile the protein is. Like in the FLIP experiment, we could

observe a very fast recovery of the nuclear fraction of GFP-NIPAWT in high expressing cells, comparable

to free GFP in the nucleus (Fig. 1D). However, in low expressing cells, we did not see a recovery at the

nuclear periphery even after five minutes. Full recovery takes up to one hour (Fig. 4D), confirming the

strong association of GFP-NIPA with the nuclear envelope.

Next, we wanted to determine if NIPA localization at the nuclear envelope changes during cell cycle

progression. Live imaging of cells expressing low GFP-NIPAWT was performed while the cell entered

and accomplished mitosis (Fig. 1E). The nuclear envelope is disassembled during mitosis in higher

eukaryotes and integral membrane proteins, such as lamin receptors or nuclear pore proteins, are

dispersed throughout the endoplasmic reticulum51,52. NIPA shows a strong membrane co-localization

until the cell reaches mitosis, where the envelope localization disappeared, most probably around

Page 136: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

127

nuclear envelope breakdown (NEB) (Fig. 1E). At that time the cell entered prometaphase and NIPA

became soluble in the cytoplasm. Membrane localization reappeared around nuclear envelope

assembly, analogous to other NPC proteins53. All these data suggest, that NIPA is strongly anchored to

the nuclear envelope.

Figure 1. NIPA is localized and stably bound to the nuclear envelope. All experiments were performed in HeLa cells. (A) Representative confocal image of a cell stained with antibodies against endogenous NIPA (green) and Tubulin (red). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). (B) 3D-SIM super-resolution images of cells stained with antibodies against endogenous NIPA (green) and NUP153 or Lamin B (red). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). Eight-fold magnifications of the outlined regions are shown. (C) Representative FLIP experiment of GFP and GFP-NIPA

WT in high and low

expressing cells. A rectangular region of 5x5 µm indicated by the dashed line was repeatedly bleached. (D) Representative FRAP experiment of GFP and GFP-NIPA in high and low expressing cells. A rectangular region covering half of the nucleus indicated by the dashed line was bleached once and the recovery in this area was observed over time. (E) Life cell imaging of a representative GFP-NIPA transfected HeLa cell undergoing mitotic division. Images in A, C-E were acquired at a confocal spinning disc microscope and optical mid sections are shown in all images. Scale bars: 5 µm and 1 µm (magnifications).

Page 137: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

128

In order to determine biologically relevant interactions of NIPA, we combined tandem affinity

purification (TAP) with mass spectrometric analyses. Table 1 shows a selected list of targets found in

our screen.

Table 1. Identification of NIPA interactors by mass spectrometry. HEK293T cells were transfected with a NIPA-tandem-Strep-single FLAG-tagged (NIPA-SF-TAP) construct and after purification with Streptactin and FLAG resin, samples were separated on an SDS-PAGE Gelelectrophoresis. Gel lanes were cut into slices and in-gel trypsin digestion was performed followed by LC-MS/MS analysis. Table 1 represents proteins with the highest sequence coverage.

As a third score we identified S-phase kinase-associated protein 1 (SKP1), which together with NIPA

builds a functional SCF ligase. Interestingly, as a top scoring protein we also identified the nucleoporin

TPR with the highest sequence coverage. TPR is a structural element of the NPC constituting the

nuclear basket. Thus it´s high affinity to NIPA found in the proteomic analysis strongly suggests a co-

localization in this nuclear compartment. To further investigate the interaction between NIPA and

TPR, we performed immunoprecipitation assays (Fig. 2). As a control we overexpressed different F-box

proteins (FBPs) to eliminate the possibility that TPR was a “sticky” protein that bound non-specifically

to other proteins in vitro. We transfected FLAG-tagged NIPA, FBXO9, FBW2 and FBW11 into HEK293T

cells and performed precipitations using anti-FLAG beads. NIPA was the only F-box protein (among

four tested) that co-immunoprecipitated with endogenous TPR (Fig. 2A). Additionally, after nuclear

fractionation, FLAG-tagged NIPA was efficiently immunoprecipitating TPR from the nuclear extracts

showing that the NIPA-TPR interaction takes place in the nucleus (Fig. 2B). Vice versa overexpressed

TPR was able to co-immunoprecipitate endogenous NIPA (Fig. 2C) confirming a specific interaction

between TPR and NIPA. Altogether, in agreement with the results of mass spectrometry,

immunoprecipitation experiments proof that NIPA specifically binds to the nucleoporin TPR.

NIPA was previously characterized as an F-box protein, containing an NLS domain for the nuclear

localization as well as a zinc-finger-like domain in the N-terminus as a potential substrate interaction

motif33 (Fig. 3A). Following the identification of TPR as an interaction partner of NIPA, we were

interested to identify the exact TPR-binding region within NIPA. Therefore we generated FLAG-tagged

NIPA constructs by introducing point mutations into the characteristic motifs and performed co-

Page 138: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

129

immunoprecipitations against endogenous TPR (Fig. 3B). HEK293T cells were transfected with FLAG-

tagged NIPA: wild type (WT); zinc-finger mutant (ΔZnF) and nuclear localization signal mutant (ΔNLS)

along with an empty vector as a control and immunoprecipitation was performed using FLAG beads.

Consistent with previous results, FLAG-NIPAWT binds efficiently to TPR (Fig. 3B). Interestingly, a

mutation in the zinc-finger-like domain of NIPA resulted in complete abrogation of the binding to TPR,

showing substrate interaction abilities of the zinc-finger domain 33 (Fig. 3B).

Figure 2. NIPA protein interacts with TPR. (A) HEK293T cells were transfected with the indicated FLAG-tagged F-box proteins (FBPs) and then immunoprecipitated (IP) with anti-FLAG beads. Immunocomplexes were probed with antibodies against indicated proteins. (B) FLAG-tagged NIPA was overexpressed in HEK293T cells and cell fractionation was performed to obtain nuclear fractions (NF). IP was performed using anti-FLAG beads, blotted and probed with anti-TPR antibody. Empty vector (EV) was transfected as a control. (C) TPR was overexpressed (OVE) in HEK293T cells and together with endogenous (END) protein immunoprecipitated with anti-TPR antibody. Co-immunoprecipitation with NIPA was detected in Western blot using anti-NIPA antibody. WCE – whole cell extracts.

In order to determine whether binding to TPR via the zinc-finger domain is required for NIPA to

localize to the nuclear envelope we performed FLIP experiments using GFP-fusion proteins (Fig. 3C,

Fig. S2). Cells expressing GFP-NIPAWT, GFP-NIPAΔZnF or GFP-NIPAΔF-box were repeatedly photobleached

in a central nuclear region, and images were taken in between. GFP-NIPAWT was localized at the

nuclear membrane after photobleaching (Fig. 3C upper panel). In contrast, photobleaching of the GFP-

NIPAΔZnF protein resulted in the loss of fluorescence in the whole nucleus including the nuclear

envelope (Fig. 3C middle panel). This indicates that the zinc-finger domain is necessary for anchoring

NIPA to the NPC. Next we photobleached cells expressing the GFP-NIPAΔF-box mutant, to determine if a

functional SCF-complex is required for anchoring NIPA to the NPC. Bleaching experiments

demonstrated no requirement of a functional SCF complex, because the F-box mutant of NIPA, which

is unable to bind to the SKP1 subunit of the SCF, was still present at the nuclear envelope after

photobleaching (Fig. 3C, lower panel).

Page 139: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

130

Figure 3. Zinc-finger motif in NIPA is responsible for the binding to TPR at the NPC. (A) Domain structure of NIPA depicting zinc-finger motif (ZnF), F-box motif and nuclear localization signal (NLS). (B) HEK293T cells were transfected with FLAG-tagged

NIPA constructs: NIPA wild type (WT), NIPA zinc-finger mutant (ZnF) and NIPA nuclear localization signal mutant (NLS) and empty vector (EV) as a control. Whole-cell extracts (WCE) were immunoprecipitated with anti-FLAG beads and the indicated

proteins were detected by immunoblotting. (C) Representative FLIP experiment of GFP-NIPAWT

, GFP-NIPAZnF mutant

and

GFPNIPAF-box mutant in HeLa cells performed at a spinning disc confocal microscope. A rectangular region indicated by the

dashed line was repeatedly bleached. Scale bar: 5 m. (D) Super-resolution 3D-SIM optical mid sections from HeLa cells

transfected with GFP-NIPAWT

or GFP-NIPAZnF mutant. The fixed cells were stained with antibodies against endogenous TPR

(red) and the GFP signal was enhanced using the GFP-booster (ChromoTek, green). Nuclei were counterstained with DAPI (blue).

Finally we also applied super-resolution microscopy to study the importance of the zinc-finger domain

for NIPA localization at the NPC (Fig. 3D). We investigated GFP-NIPAWT and GFP-NIPAΔZnF mutant

protein in HeLa cells. In agreement with previous findings, the wild type protein was located at the

NPC, co-localizing with TPR (Fig. 3D left panel), whereas the zinc-finger mutation resulted in

subnuclear mislocalization of the protein from the NPC (Fig. 3D right panel). Taken together, these

data strongly suggest that the zinc-finger domain encoded in the N-terminus of NIPA is responsible for

the interaction with the nucleoporin TPR and that this interaction localizes NIPA to the nuclear pore

complexes.

The role of TPR as an architectural element of the NPC was reported previously11. However, in another

report the scaffolding abilities of TPR have been controversially discussed12. Therefore, we aimed to

assess whether TPR is required for anchoring NIPA to the NPC. In order to determine the ability of TPR

Page 140: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

131

to tether NIPA to the NPC, we suppressed TPR synthesis by synthetic siRNA in HeLa cells (Fig. 4A). As

shown by western blot analysis, the level of TPR was specifically reduced after 72 h of treatment with

siRNA with immunofluorescence. Interestingly, down-regulation of TPR at the same time leads to

degradation of NIPA, whereas transient down-regulation of NIPA by siRNA treatment had no clear

effect on TPR expression (Fig. 4A). These data indicate that TPR is required for the stability of NIPA.

Figure 4. TPR constitutes the essential anchoring element for NIPA localization at the NPC. (A) HeLa cells were transfected with siRNA and subjected to immunoblotting with the indicated antibodies after 72 h. (B) U2OS cells were treated with siRNAs (NIPA and TPR) for 48 h and stained with antibodies against endogenous NIPA (red) or TPR (green). Nuclei were

counterstained with DAPI (blue). Scale bar: 5 m. (C) Different mouse embryonic fibroblasts (MEFs) cell lines derived from NIPA deficient (-/-) or NIPA wild type (+/+) mice were subjected to immunoblot analyses and probed with indicated antibodies. (D) Representative FRAP experiment in GFP-NIPA

WT or GFP-TPR expressing HeLa cells. A rectangular region

covering half of the nucleus indicated by the dashed line was bleached once and the recovery in this area was observed over

time with spinning disk confocal microscopy. Scale bar: 5 m.

We next analyzed down-regulation of NIPA and TPR by siRNA for their nuclear envelope localization.

As seen in Figure 4B, cells treated with TPR siRNA showed partial depletion of TPR which lead to

severe down-regulation of NIPA from the whole nuclear compartment. In contrast, knockdown of

NIPA with siRNA did not alter the localization of the TPR staining at the nuclear periphery (Fig. 4B).

Furthermore, results from different immortalized MEF cell lines, obtained from NIPA wild type and

knockout mice, showed similar TPR levels in cells lacking NIPA expression when compared to the wild

type (Fig. 4C). Hence, TPR downregulation alters the distribution of NIPA in the nucleus and is

Page 141: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

132

therefore crucial for its proper nuclear localization and stability, whereas NIPA depletion has no visible

effect on TPR expression or localization.

To further investigate the anchoring abilities of TPR towards NIPA, we compared protein mobility

using the method FRAP. We employed FRAP analysis to test the nuclear kinetics of the GFP-tagged

NIPA and TPR by bleaching the fluorescence in half of the nucleus with a high-power laser and tracking

the rate of nuclear membrane recovery over two hours. The recovery of GFP-TPR at the nuclear

envelope was slower than that of GFP-NIPA, denoting slower TPR protein dynamics, thereby

suggesting a stronger association with the nuclear envelope in comparison to NIPA (Fig. 4D). In

summary, these results strongly indicate that TPR acts as a scaffold protein targeting NIPA to its stable

binding site at the NPC.

Discussion

Post-translational modifications are fundamental controlling mechanisms responsible for intracellular

signaling pathways. Ubiquitin-mediated proteasomal degradation of proteins plays an important role

among them, since it was shown to be crucial for the control of cellular events like cell-cycle

progression54. Due to their ability of substrate recognition, F-box proteins play the main role in

ubiquitin-mediated proteolysis. We previously characterized a new SCF-E3 ligase SCFNIPA, in which the

nuclear F-box protein NIPA is responsible for targeting cyclin B1 for degradation in interphase, thereby

contributing to the timing of mitotic entry31.

In this study, we have analyzed the localization of NIPA in more detail and were able to show that

NIPA is not only part of the nuclear envelope but is mainly localized to the nucleoplasmic face of the

NPC. We found that the localization of NIPA to the NPC is mediated by its binding to the nucleoporin

TPR at the nuclear basket. A previous study pointed out the controversial role of TPR as an

architectural element of the NPC12. Although it was revealed that TPR is tethered to the NPC by the

interaction with NUP153, the question whether TPR itself acts as a scaffold onto which other NPC

components need to be assembled still remained elusive. Here we show that TPR is the anchoring

protein for NIPA and that this strong interaction is essential for the proper localization of NIPA to the

NPC. Silencing of TPR by synthetic siRNA resulted in destabilization of NIPA and it subsequent

degradation, confirming the role of TPR as a scaffolding protein. We also identified the zinc-finger

motif in NIPA as being responsible for the binding to TPR and showed that disruption of this domain

leads to mislocalization of NIPA from the nuclear pore. In contrast, mutation of the F-box domain did

not affect the localization, indicating that a functional SCF complex is not necessary for the association

with the NPC. These findings implicate that NIPA is a nuclear pore associated protein and suggest a

functional relevance for its localization.

Page 142: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

133

Previous reports by others have shown that TPR is both a substrate and a scaffold for activated ERKs22.

It was reported that phosphorylation of TPR by ERK stabilizes their interaction what in consequence

positions ERK2 for the phosphorylation of further potential substrates at the NPC. In addition, ERK-TPR

interaction regulates the translocation of activated ERK222. Moreover, Kosako et al. demonstrated that

ERK is a physiological nucleoporin kinase and suggested a role for TPR in ERK-mediated

phosphorylation at the nuclear pore55. Interestingly, our recent study revealed NIPA as an exclusive

substrate of ERK2 and that this phosphorylation leads to disruption of the SCFNIPA activity35. Hence, we

hypothesize the existence of a scaffold located at the NPC, constituted by the filaments of TPR, which

allows for positioning of both, the kinase and the substrate, in close proximity. In this model, ERK2

may require a platform constituted by TPR to efficiently phosphorylate NIPA at the NPC. We observed

lack of a phosphorylation in the SDS-PAGE when NIPA was overexpressed in cells with mutated zinc-

finger motif, supporting our assumption (data not shown). Zinc-finger mutation abrogates the binding

to TPR, leading to mislocalization of the protein to the nuclear interior (Fig. 3). As a result, it is

conceivable that ERK2 cannot phosphorylate NIPA due to the loss of its anchoring site at the NPC.

Spatial control of the proteolysis is emerging as an important regulator of mitotic transitions56.

Anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C) could serve as an example of controlled protein

degradation in space and time. It has been proposed that the Cdc20-APC/C complex, associated with

the mitotic spindle, targets cyclin B for degradation in the early phase of mitotic exit therefore

activating the Cdh1-APC/C complex further to target cyclin B for destruction throughout the cell,

leading to mitotic exit57. Other regulatory mechanisms exist which rely on the compartmentalization

of the protein turnover. For instance, ER-associated protein degradation (ERAD) is an ubiquitin-

proteasome based system responsible for the degradation of membrane and luminal proteins of the

endoplasmic reticulum, and E3 ligases participating in this process are localized to the ER/nuclear

envelope58,59. Also SUMO proteases were recently connected with the filaments of the NPC28,29,60. All

these evidence argue for the growing importance of the spatial control of protein degradation,

restricting the recognition of substrates and functional proteolysis to specific cellular compartments.

Although at this moment, we can only speculate about the exact function that NIPA may have at the

NPC, our findings, which revealed NIPA localization at the nuclear pore, are especially relevant with

respect to the ubiquitin proteasome system. This study provides additional evidence on the specific

localization of an E3 ligase, which could predestinate its function according to the substrate of NIPA –

cyclin B1. Therefore we propose a model, complementing our previous observations31, in which NIPA

guards the genome integrity by controlling cyclin B1 abundance in space and time (outlined in Figure

5). Consistently, NIPA localizes to the nucleoplasmic site of the NPC by the interaction with TPR and is

able to transfer ubiquitin directly on cyclin B1 when it crosses the nuclear barrier prematurely in

interphase. Such a model suggests the formation of a “cyclin trap” directly at the gate, targeting cyclin

Page 143: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

134

B1 for degradation just upon entry to the nucleus (Fig. 5A). At the G2/M phase of the cell cycle, NIPA is

phosphorylated, what leads to dissociation of the SCFNIPA, allowing for accumulation of cyclin B1 and

subsequent mitotic entry (Fig. 5B). Thus, according to our model, the NPC localization of NIPA could be

essential for the spatial control of cyclin B1.

Figure 5. Theoretical model of SCFNIPA

activity in the regard to its nuclear localization. The model postulates that the SCFNIPA

complex is a gate guardian of the genome integrity by promoting degradation of cyclin B1 during interphase. (A) Cyclin B1 enters the nucleus through the NPC (1), is directly ubiquitinated (2) and headed for the proteasomal degradation (3). (B) In the G2/M phase NIPA is phospohrylated (2), leading to the dissociation of the SCF

NIPA complex and its subsequent

inactivation. Cyclin B1 can accumulate in the nucleus (3) triggering the G2 – M transition.

Recently, Niepel et al. reported that Mlp1 and Mlp2, the yeast homologues of TPR, are major NPC

basket components and showed that these proteins constitute a dynamic interactome, together with

Esc1p and the proteasome61. This finding, which connects the proteasome to the vicinity of the

nuclear pore, is a fascinating endorsement of our model suggesting that the whole protein

degradation machinery might be organized at the same, specialized subcellular compartment – the

nuclear pore complex. In this regard, TPR could function as a scaffold for NIPA, its regulatory kinase

ERK2 as well as the proteasome within this model: upon translocation of cyclin B1 to the nucleus, NIPA

directly transfers ubiquitin on the substrate, targeting it for immediate proteasomal degradation in

situ and ERK2 directly controls NIPA during the cell cycle phases. Thus, our model provides an

explanation for a tight and highly efficient guardian against the premature mitotic entry, maintaining

genome integrity.

Page 144: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

135

In summary, we have further characterized the previously identified F-box-containing protein NIPA as

a novel nuclear pore associated protein and proposed that the specific localization of NIPA to the NPC

may have a potential implication in the spatial control of cyclin B1 during mammalian cell cycle.

References

1. Cronshaw, J.M., Krutchinsky, A.N., Zhang, W., Chait, B.T. & Matunis, M.J. Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex. J Cell Biol 158, 915-927 (2002).

2. Raices, M. & D'Angelo, M.A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature reviews. Molecular cell biology 13, 687-699 (2012).

3. Unwin, P.N. & Milligan, R.A. A large particle associated with the perimeter of the nuclear pore complex. J Cell Biol 93, 63-75 (1982).

4. Maimon, T., Elad, N., Dahan, I. & Medalia, O. The human nuclear pore complex as revealed by cryo-electron tomography. Structure 20, 998-1006 (2012).

5. Lim, R.Y. & Fahrenkrog, B. The nuclear pore complex up close. Current opinion in cell biology 18, 342-347 (2006).

6. Goldberg, M.W. & Allen, T.D. High resolution scanning electron microscopy of the nuclear envelope: demonstration of a new, regular, fibrous lattice attached to the baskets of the nucleoplasmic face of the nuclear pores. J Cell Biol 119, 1429-1440 (1992).

7. Hoelz, A., Debler, E.W. & Blobel, G. The structure of the nuclear pore complex. Annu Rev Biochem 80, 613-643 (2011).

8. Kiseleva, E., et al. Yeast nuclear pore complexes have a cytoplasmic ring and internal filaments. Journal of structural biology 145, 272-288 (2004).

9. Grossman, E., Medalia, O. & Zwerger, M. Functional architecture of the nuclear pore complex. Annual review of biophysics 41, 557-584 (2012).

10. Shah, S., Tugendreich, S. & Forbes, D. Major binding sites for the nuclear import receptor are the internal nucleoporin Nup153 and the adjacent nuclear filament protein Tpr. J Cell Biol 141, 31-49 (1998).

11. Krull, S., Thyberg, J., Bjorkroth, B., Rackwitz, H.R. & Cordes, V.C. Nucleoporins as components of the nuclear pore complex core structure and Tpr as the architectural element of the nuclear basket. Mol Biol Cell 15, 4261-4277 (2004).

12. Hase, M.E. & Cordes, V.C. Direct interaction with nup153 mediates binding of Tpr to the periphery of the nuclear pore complex. Mol Biol Cell 14, 1923-1940 (2003).

13. Zimowska, G., Aris, J.P. & Paddy, M.R. A Drosophila Tpr protein homolog is localized both in the extrachromosomal channel network and to nuclear pore complexes. J Cell Sci 110 ( Pt 8), 927-944 (1997).

14. Hase, M.E., Kuznetsov, N.V. & Cordes, V.C. Amino acid substitutions of coiled-coil protein Tpr abrogate anchorage to the nuclear pore complex but not parallel, in-register homodimerization. Mol Biol Cell 12, 2433-2452 (2001).

15. Skaggs, H.S., et al. HSF1-TPR interaction facilitates export of stress-induced HSP70 mRNA. J Biol Chem 282, 33902-33907 (2007).

16. Bangs, P., et al. Functional analysis of Tpr: identification of nuclear pore complex association and nuclear localization domains and a role in mRNA export. J Cell Biol 143, 1801-1812 (1998).

17. Park, M., et al. Mechanism of met oncogene activation. Cell 45, 895-904 (1986).

Page 145: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

136

18. Frosst, P., Guan, T., Subauste, C., Hahn, K. & Gerace, L. Tpr is localized within the nuclear basket of the pore complex and has a role in nuclear protein export. J Cell Biol 156, 617-630 (2002).

19. David-Watine, B. Silencing nuclear pore protein Tpr elicits a senescent-like phenotype in cancer cells. PLoS One 6, e22423 (2011).

20. Lee, S.H., Sterling, H., Burlingame, A. & McCormick, F. Tpr directly binds to Mad1 and Mad2 and is important for the Mad1-Mad2-mediated mitotic spindle checkpoint. Genes & development 22, 2926-2931 (2008).

21. De Souza, C.P., Hashmi, S.B., Nayak, T., Oakley, B. & Osmani, S.A. Mlp1 acts as a mitotic scaffold to spatially regulate spindle assembly checkpoint proteins in Aspergillus nidulans. Mol Biol Cell 20, 2146-2159 (2009).

22. Vomastek, T., et al. Extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) phosphorylation sites and docking domain on the nuclear pore complex protein Tpr cooperatively regulate ERK2-Tpr interaction. Mol Cell Biol 28, 6954-6966 (2008).

23. Lemaitre, C., et al. The nucleoporin 153, a novel factor in double-strand break repair and DNA damage response. Oncogene 31, 4803-4809 (2012).

24. Oza, P., Jaspersen, S.L., Miele, A., Dekker, J. & Peterson, C.L. Mechanisms that regulate localization of a DNA double-strand break to the nuclear periphery. Genes & development 23, 912-927 (2009).

25. Franks, T.M. & Hetzer, M.W. The role of Nup98 in transcription regulation in healthy and diseased cells. Trends Cell Biol 23, 112-117 (2013).

26. Sarma, N.J., et al. The nuclear pore complex mediates binding of the Mig1 repressor to target promoters. PLoS One 6, e27117 (2011).

27. Funasaka, T., Tsuka, E. & Wong, R.W. Regulation of autophagy by nucleoporin Tpr. Scientific reports 2, 878 (2012).

28. Zhang, H., Saitoh, H. & Matunis, M.J. Enzymes of the SUMO modification pathway localize to filaments of the nuclear pore complex. Mol Cell Biol 22, 6498-6508 (2002).

29. Lewis, A., Felberbaum, R. & Hochstrasser, M. A nuclear envelope protein linking nuclear pore basket assembly, SUMO protease regulation, and mRNA surveillance. J Cell Biol 178, 813-827 (2007).

30. Werner, A., Flotho, A. & Melchior, F. The RanBP2/RanGAP1*SUMO1/Ubc9 complex is a multisubunit SUMO E3 ligase. Molecular cell 46, 287-298 (2012).

31. Bassermann, F., et al. NIPA defines an SCF-type mammalian E3 ligase that regulates mitotic entry. Cell 122, 45-57 (2005).

32. Ouyang, T., et al. Identification and characterization of a nuclear interacting partner of anaplastic lymphoma kinase (NIPA). J Biol Chem 278, 30028-30036 (2003).

33. Bassermann, F., et al. Multisite phosphorylation of nuclear interaction partner of ALK (NIPA) at G2/M involves cyclin B1/Cdk1. J Biol Chem 282, 15965-15972 (2007).

34. Klitzing, C., et al. APC/C(Cdh1)-mediated degradation of the F-box protein NIPA is regulated by its association with Skp1. PLoS One 6, e28998 (2011).

35. Illert, A.L., et al. Extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) mediates phosphorylation and inactivation of nuclear interaction partner of anaplastic lymphoma kinase (NIPA) at G2/M. J Biol Chem 287, 37997-38005 (2012).

36. Skaar, J.R. & Pagano, M. Control of cell growth by the SCF and APC/C ubiquitin ligases. Current opinion in cell biology 21, 816-824 (2009).

37. Gloeckner, C.J., Boldt, K., Schumacher, A., Roepman, R. & Ueffing, M. A novel tandem affinity purification strategy for the efficient isolation and characterisation of native protein complexes. Proteomics 7, 4228-4234 (2007).

Page 146: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

137

38. Gu, H., Liang, Y., Mandel, G. & Roizman, B. Components of the REST/CoREST/histone deacetylase repressor complex are disrupted, modified, and translocated in HSV-1-infected cells. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 7571-7576 (2005).

39. Schneider, K., et al. Dissection of cell cycle-dependent dynamics of Dnmt1 by FRAP and diffusion-coupled modeling. Nucleic Acids Res 41, 4860-4876 (2013).

40. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science 320, 1332-1336 (2008).

41. Thanisch, K., et al. Targeting and tracing of specific DNA sequences with dTALEs in living cells. Nucleic Acids Res (2013).

42. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods 9, 676-682 (2012).

43. Kuznetsov, N.V., et al. The evolutionarily conserved single-copy gene for murine Tpr encodes one prevalent isoform in somatic cells and lacks paralogs in higher eukaryotes. Chromosoma 111, 236-255 (2002).

44. Mendoza, M.C., Er, E.E. & Blenis, J. The Ras-ERK and PI3K-mTOR pathways: cross-talk and compensation. Trends in biochemical sciences 36, 320-328 (2011).

45. Fernandez-Saiz, V., et al. SCFFbxo9 and CK2 direct the cellular response to growth factor withdrawal via Tel2/Tti1 degradation and promote survival in multiple myeloma. Nat Cell Biol 15, 72-81 (2013).

46. Illert, A.L., et al. Targeted inactivation of nuclear interaction partner of ALK disrupts meiotic prophase. Development 139, 2523-2534 (2012).

47. Moudry, P., et al. Nucleoporin NUP153 guards genome integrity by promoting nuclear import of 53BP1. Cell death and differentiation 19, 798-807 (2012).

48. Worman, H.J., Yuan, J., Blobel, G. & Georgatos, S.D. A lamin B receptor in the nuclear envelope. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 8531-8534 (1988).

49. Phair, R.D. & Misteli, T. High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus. Nature 404, 604-609 (2000).

50. Ishikawa-Ankerhold, H.C., Ankerhold, R. & Drummen, G.P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules 17, 4047-4132 (2012).

51. Ellenberg, J., et al. Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis. J Cell Biol 138, 1193-1206 (1997).

52. Yang, L., Guan, T. & Gerace, L. Integral membrane proteins of the nuclear envelope are dispersed throughout the endoplasmic reticulum during mitosis. J Cell Biol 137, 1199-1210 (1997).

53. Bodoor, K., et al. Sequential recruitment of NPC proteins to the nuclear periphery at the end of mitosis. J Cell Sci 112 ( Pt 13), 2253-2264 (1999).

54. Hershko, A. & Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67, 425-479 (1998).

55. Kosako, H., et al. Phosphoproteomics reveals new ERK MAP kinase targets and links ERK to nucleoporin-mediated nuclear transport. Nature structural & molecular biology 16, 1026-1035 (2009).

56. Pines, J. & Lindon, C. Proteolysis: anytime, any place, anywhere? Nat Cell Biol 7, 731-735 (2005).

57. Raff, J.W., Jeffers, K. & Huang, J.Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J Cell Biol 157, 1139-1149 (2002).

Page 147: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Kulinski, Schneider et al.

138

58. Swanson, R., Locher, M. & Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & development 15, 2660-2674 (2001).

59. Bays, N.W., Gardner, R.G., Seelig, L.P., Joazeiro, C.A. & Hampton, R.Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nat Cell Biol 3, 24-29 (2001).

60. Zhao, X., Wu, C.Y. & Blobel, G. Mlp-dependent anchorage and stabilization of a desumoylating enzyme is required to prevent clonal lethality. J Cell Biol 167, 605-611 (2004).

61. Niepel, M., et al. The nuclear basket proteins Mlp1p and Mlp2p are part of a dynamic interactome including Esc1p and the proteasome. Mol Biol Cell (2013).

Page 148: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript in preparation

139

Supplementary figures

S1

Supplementary Figure 1. Nuclear localization of NIPA detected with antibodies. The experiment was performed in HeLa cells. (A) Representative confocal image of cells stained with antibodies from Santa Cruz and Sigma-Aldrich against endogenous NIPA (red). Nuclei were counterstained with DAPI (blue). Images were acquired at a confocal spinning disc microscope and optical mid sections are shown. Scale bar: 5 µm.

S2

Supplementary Figure 2. Quantification of FLIP experiments shown in Figure 3C. Background corrected intensities of the peripheral region of the nucleus relative to the first postbleach image of GFP-NIPA

WT (blue) and GFP-NIPA

ΔZnF (orange).

Page 149: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells
Page 150: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������

���

�������� ��� ����������������������������������������������� ��!�� �"#�����$�%������$$����

Page 151: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Page 152: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������������� �������� ������ �������� ����������� �������������� ������������������������ �����!��"�#����������������$� ����%�"����� ����&���$�����'��(����������������')*+,-./0+1/23452627899:;<0-1=526278-1>45250-7517:?+1/+.32.91/+7.-/+>@.2/+51AB5+1B+C<15BDE?9@ACF:G<>H57C-I50565-1JK15L+.J5/8C<15BD:MN)ON@6-1+77PC-./51J.5+>:Q+.0-18-1>N*+,-./0+1/2345262789:Q+1+/5BJ:G<>H57C-I50565-1JK15L+.J5/8C<15BD:MN)ON@6-1+77PC-./51J.5+>:Q+.0-18R+B+5L+>S<7<J/TU:NU)TVR+L5J+>W2L+0=+.O:NU)TVSBB+,/+>*+B+0=+.X:NU)T�&����Y���������������������������Z��� ���������� ��� �� ��� �� �� ���� $��������� � ������������� ������������� ������ �������������� [������ �������� ������ ����������� ���� � ������$$���� ������\ �������� ��������� ��������� ���������������\��]�������� ���� _[ �� ��������$���������� $ ����_�������������������$��� �� ��������%�����a\�������� ��������$�b�� �����������[���$ ������ �� ���������������� ���������� cde_�� ����%�Z��� ���$�� ��$��%��� ��$ ��� [(%����!���������� $�b�� �������� ����� f�\������ ���gh igjk�%����!�����_���\ ����������]����������� ������� �����$�ghlglm�����������cde\$ ������$�b�� �������������� ��������������$������ [������������$�b�� ��������������������������$������%�����������\��� � �����\�����!����������$��������\��� �������%�$�� ��������������������������$�����$�b�� �����������[d����� ������������Z����\$��� ����������������% �������� ����%��$������������$����� ������$� ������������$����� [d����� ����%���������� ���������� ������ ����������������� ������ ����$������%��$������ �� ���������� \�������� � ����� ���������� ���� ��������������� ������� ��������%�������� ��������������������������[

#���n�oY�#n�pqrstuvwxyzsv{|}~wqvu�q{}��sw}qv~�ts�s�u��qtu}vu�}�uvuw}��uvu�u��tsw}qvsv{|sru�uuv}vwuv~}rut�}vru~w}�swu{qru�w|u�s~w{u�s{u~��|}tuw|u�u}~vq{q��ww|sw|}�|u�q�{u��|�q�sw}v ~w���w��u~sv{v��tus��uvq�uq��sv}�sw}qvst~q�ts�}��q�wsvw�qtu~�w|u�s�u�s�tu~~s�uvs�tuwq~�~wu�sw}�svst�~}~{�uwqw|u}�w�sv~}uvwsv{��s�}tuvsw��uw|sw�svqvt��u~w�{}u{}vw|u�utt�ts��qvwu�w���tw}�qtq���q�u~�uvw������|���}{}�sw}qv������uvs�tu{w|u~}��twsvuq�~r}~�st}�sw}qvq���tw}�tuxyz~u��uv�u~}v��u{�utt~sv{}v{}�swu{w|uwu��}wq�}stq��sv�}�sw}qvq�stt�|�q�q~q�u~}v}vwu��|s~uv��tu}�����v�uvu�st�w|u~��v��tus�{}~w�}��w}qv q��|�q�q~q�st~u��uvw~�}w|}vw|uv��tu�~sv{�}w|�u~�u�wwq�|�q�q�~q�uwu��}wq�}u~~uu�~wq�q��utswu�}w|w|u}��uvu{uv~}w�sv{w�sv~��}�w}qvsts�w}r}w�� ¡¢��£u~}{u~w|u~u�uvu�st��}v�}�tu~q��uvq�uq��sv}�sw}qv�w|u�u}~��vq��qq{ur}{uv�u�q�~�sw}st��u��q��sv}�sw}qvq�w|u�uvq�u{��}v�{}��u�uvw}sw}qv�¤��¥|u~u�|sv�u~}v�uvq�uq��sv}�sw}qv{��}v��utt�ts�{}��u�uvw}sw}qv�}�|w�u�s�~u{���|sv�u~}vw�sv~��}�w}qvsts�w}r}w��xyzsv{|}~wqvu�q{}��sw}qv~s~�utts~stwu�u{��qwuq�u�q��q~}w}qv��q�u�s��tu�w|u{�s�sw}��uvq�u�uq��sv}�sw}qv{��}v���q�uvu~}~�s~t}v�u{wqw|uu���u~~}qvq��uw|�t��wq~}vu�}v{}v���qwu}v~�¦��§}�u�}~u�{urutq��uvwstu���u~~}qv�swwu�v~q�w|uv��tus�uvrutq�u��qwu}v~§s�}vzp�§s�zp�sv{w|u§s�}v£ �u�u�wq��§£©��qvw�qt�u�}�|u�stwuw|u�}v�q��s��twsw}ru|uwu�q�|�q�sw}vsv{�uvuu���u~�~}qv�swwu�v~�ª��¥q�|swu�wuvwsv{}v�|}�|�s~u~w|u�utsw}ruv��tus��q~}w}qvq��uvu~}~�s�~uq��qv~u��uv�uq�w�sv~��}�w}qvsts�w}r}w��u�s}v~wq�u�ts�}�u{�«¥q�|q��q��u~�qv{uv�u~|q�t{�us{{�u~~u{�¥ut¬­¢® ® �°ª¢ ± ²�s�¬­¢® ® �°ª¢ ±¦²³�s}t¬|�tuqv|s�{w t���{uµ�u~uvwz{{�u~~¬¥|q�s~§s|s�u�¶�£µ�·uvu�st·uvuw}�~� v}ru�~}w�q�¥�¹�}v�uv�ª °ª¦¥�¹�}v�uv�·u��sv��©q�u�w�q��}w�u��¶�£µ�·uvu�st·uvuw}�~� v}ru�~}w�q�¥�¹�}v�uv�ª °ª¦¥�¹�}v�uv�·u��sv��pq��u~�qv{uv�u�s�st~q�us{{�u~~u{wq�u�s~w}sv£�tw�svv�¥ut¬­¢® ® �°ª¢ ±±²�s�¬­¢® ® �°ª¢ ±¦²³�s}t¬��tw�svv �}q�t���{u

º�»¼½�»¾»�¿�À½�½Á»ÃÄÅÆÇÈÄÉÊÉË¿Ì�ÍÇÆÎÇÆÏÈÐ�ÁÂÐÑÒ�ÇÈÓÔ

Õ¥|uz�w|q��~� °�±�µ��t}~|u{��Ö��q�{ v}ru�~}w�µ�u~~�¥|}~}~svÖ�uvz��u~~s�w}�tu{}~w�}��wu{�v{u�w|uwu��~q�w|up�usw}rupq��qv~zww�}��w}qv§}�uv~u�|ww�¬��usw}ru�q��qv~�q��t}�uv~u~��±�°���|}�|�u��}w~�v�u~w�}�wu{�u�~u�{}~w�}��w}qv�sv{�u��q{��w}qv}vsv��u{}�����qr}{u{w|uq�}�}vst�q��}~��q�u�t��}wu{�

×ØÙÚÛÜÝÚ×ÞÚÝßà×áÜàÜâãÚä×ÞßåâæÚÜ×ÞÚÚÜàà×çÙèÛÝàäÜß×éÜÚÜêèÜã×ëìí×ëîïð×ñò×óôõö÷×øù×úõûõüñõý×þ��×þ���

�÷÷��ùý�ø� øý��øôýù�ö�øýóúø�ù�ø�õ�× ýøü×

Page 153: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������������� ������������ ���� �� ������������� �������������������������� ����� ����� �� ������ ���� �� ��������������������������������� ������� ��������� ��� ����� ��������������������������� ��� ����� !�������� ����"!�# � ������ � ��������$���� ����%&'������������������������$���������� ������� $� ���(�)*!�+���$��� ���� ����� � ��� ,��������� ���� ����%&'����������� ����� ��������� ��� $����������%&' ����������'� ���� $������������������������������������ ���� ��� ����� �������))!��� � � ���������������,�%&'�������������� ��� �������' ����-�� ������ ��������� ����� ���������� ����,�%&'����������������� ��.��/+�/���,�����0�!������� ���1-��%&'������ ������)/2)3!���������������������� �������- �����,������� ���� 0�! �� ������-�,��%&' ���� ���������� 0���$����������� �������������� ������,�%&'���������456467�)8�)9!����������������� $� ��������������������):2/)!�&�$�� ������� �0 ���� ����� ����� �����.-�����������������������$���0����������������� ����$�����������,� ����;�� �������� ���� 0������������������������������� -� ���$���������//!�+���$���� ����� ���������� ������������������ �� �$���������$������ ���� � ��������� �� � ����� �� 0� �� �� ,���%&' ���� �������������� �� �� $� ��-�;������ ����� �����'�<�!���� ������ �� ����������=>5?@7A75>B��� ���%&'�������� �� ������C�� � ���������� ���� ��������� ��������,� ��/12/:!������� ����'�< %&' ������������������ ���� �������11218����������� ��� ���������� ���� ���������������������������� ���-$�������� ������,����������)/��)1�������� �������� $�������������DE%�!�/"�/(!����� ���� ������ ������� �� �� ���� DE% �� ���������� ������� ����� ����,��� ������ ����%&'��������������������-�,�� ���� ������������� ������������ �����������'�<���'�<�!���������������������� ,��� ������� ����� ����/12/:�1*21/!�+����������� �������� �����'�<���� ������ ���� ���� ����������� $�%&'�����������$��������#����� �� �'�<��������� �$������ ������������C���� ��� ������ ������������-���� ��������<F.�! �������� ������������� ������� ���� ���456467����;�� ���GHIJKLHMNHOPGJIQRPNSTUVWXYZ[\V]_Z]X[\+/ .- ������������ �������������������� ��� ���+/-�D� !������������$������11!�������������������.�a)�&bc**:9//�1!��.�a8�&bc**:9/9�1!��������,� �������������������� �� ���� ��F�-.�a) �13!�� ��- ���<)3�%&'�18!������� $������������� ����� ����� ��

�� �������$����.bE!����� ���������� ��D� ���������� �������d�%&'� ���.bE-�D� -�����d��������������$������19!�efgh����������������<i D d'1�d'���j ����!�� ��d�� -��� ������������ ���� !��'�<&k.- ������������!�� �d�� -��� ����'�< %&' ��������!������� $�������������� �� �d��� �� ��� ����<i Dd'1�������$���� �-��� ��� ����-������������� )�� /���� �������� ��1l ��d�$������� ����� ���������� ���������������.�. �''�� ��� �-��� ��� ����������������� 1�� 3���� �/:!��'�< &-��.- ��������������������,�� ������� 8�� 9� :�� "��� (�� )*������� $����������� ��d��� �� ��� ������������ ��$�������������� ����� �������������� ������������<i Dd'1����d�� -��� ������� ����<i Dd'1��� �'�<&k.����%&' �������� ����������� ����������/3!�������$� �d�� -��� ��� � �����-���������<i D d'1��� �'�<&k. ������� � ���� -���'�<� )�<i D-d'1 �dm���'�����''�'�''�'�.'��.'��. /�<i D-d'1 �dmD�.'��..��.�'��'�.��...''�.. 1�<i D-d'1 ��d�.�.-''���..'����.�.'''������'�..'...�. 3�<i D-d'1 ��d�.�.-''��D�.������.�..''..����'�'..'��� 8�� �������.�.�''�����'�.''� 9�� D��.�.'����'''�.�...'� :'$��1&- ��� ��d�������.�.�.'..'���'�...'��.���.�.�.'. "'$��1&- ��� ��d'�''D'''���.�.'��'����''�'..�.��''����.'�� ('$��1.- ��� ��d'�''�������.�.�'�''���''�'.��.�.���'� )*'$��1.- ���� �� ��+d! ��d''��D������.�...��'��'�..���'��..�....noTTZ_T]_op]U\VqoZ]X[\U\Yr_[oVZo\ZosUZ]XtU]oYZoTTV[]X\u+<v/(1������������� ����� ������� ����������������/:!�w)<F.��1:!������� ��������� �-��� ������%�������l���,�<����l�������������� �� �)9x �� ����$������� �������!�*�)�b y-������ �� ������d�$ �����!�/�b �-��� ��-���)zb<b���-����� ����������)**{k�������-���)**|�k��� ��� ������ ''������ �������+!�)***{k����������� ������d� �b������!�)|b %*1/8()��1|b .+dD((*/)}'a��b�������1"!~��������� ����<F.����������������������� ���/***�d�$ �����!������� � ��������� ����l��� ���- ����������������-�� $� �������� ����'.F!������������ ����'.F'��dd��� ��%�;����!�

� �����4�f�4�B��B�>��@���������������������������������� 

¡��¢£¤¤�¥�¦�§��©ª����¥«�¦���¤��¬�«�¥©�©�����

Page 154: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������������������� �������������������������� !"�#$%��&����'��(�����������)�������*������(�+,����-./0*&��&(�)���1,2 ������&��� �������&� -/345�6"�0��) ��7����)�&�����*&���� �87�����&�9#&&�������&����������������������:�����������&�����(��7��*&�"�)9������������&���(��������;�)�������&������"�����'�������<7������ �����" - ��=����"��09 1>:?!)��"�)��&!@!7�������)&��-A$ B0��)��� *'��&�7�&�����(����8����):��)����"����&�(�����&�)�)'��������)��)C����������)@44"��87&�'��9�&�����(���:����)�**��!���C��)�(����"���)��)�����;�)(������D��"&�����������&*�(���9A&'����������������������(�����������)�������*����������������� !"�#$%���������(���"E� ! �F$ ��)D@G!"E� *&��&(�)����7����)�&�����*&���� ��)E� �87�����&�9HIIJ��K����K���������LM�����N ��B""'�&7����7�����&�(��7��*&�"�)��)�������)��*&��-.O09<��7,44&*D�P@O.#���������������������*����)(�������� !"�#$%�*'��&�7�&����&��������� !"�#$%�����:���7����Q���:(�����Q����)��)����)9�� *'��&��(���7'���))&(�'��������� !#��7-140-���&"&��=0��)�'�R����)�&(��������&�����'����� "&'�� "&�&��&��� ����!�� �����&)� -E&���:,,2,11?444,09�&��&"7����&�&*7�&������Q���:�������� !"�#$%� ���� (��� ����) �� E�)�&!B""'�&7����7�����&�$����-EB $0�'**��9%�����*�&"/34444�����(���'�R����)�&(��������&�����'�����"&'�� "&�&��&�������!�� -E&���:,,2,11?444,0:������7&����&�������!�GS,-$���":��,41/20��)������7&����&�������!��F G-$���":��@3/1.09HIIJ��TJ�����������������LI������KUB""'�&�������� ��) .A!�B�D (��� 7��*&�"�) ��)�������)7��Q�&'���-1,09G���V�:������'��'��)&��&Q��!���7�(���C8�)(���1W 7���*&�"��)���)�*&�,4"��:(����) (��� G�# - G�: 494,W #(���@40 ��)7��"������;�)(���493W #���&�S!,449G&��7��"�����) ���&�)��� �����&)���(���)��'��) �� ��&�=����&�'��&�- G�#:1W �&Q������'"���'"��09�&Q�����7�(��������(������'����)(���7��"�����)���&�)��������&)��&�'��&����)��=�'"�)���"����*&�,X@����&&"��"7����'��Y(��������*���7��"�����)���&�)��������&)���(���)&��(��� G�#9�&��""'�&!�B�D:�&��7��"���-����!�� 0��)���&�)��������&)���(����77���)C���Y�'���Z'�����:�����(���7&��C8�)(���1W7���*&�"��)���)���) 7��!������) *&������)�;���&�9D����)�;���&�(��������)&'�*&�@)�����./[�Y7&�������)�;���&�(�����������')�)@\�������&)�'"�������-���0��./[���)49,\�����?,[�-1,09#��7�&��*&�"�R&������������7����(����������)��7&��!"����������������&�'����"&'���&�,AF$-7��"���]3>!���$�$$$$�#�$$$$#�$���)3!#�$$�# ��# �$$ �#� �$# �0:������)(�����.!)_# �����=!���������&�:��))���&�Q�)�������)�;���&�"�8�'��-34W *&�"�"�)�:,4W )�8�����'�*���:,\���0����&���������&�&*,4X@4��65�9�&��'�����AF$�&'�!�����������:A$ B(���))�)�&������&�)��������&)�

�&�'��&��&���C����&���������&�@5�6"�9�&Q�����7�(���"&'���)������*�)�"�)�'" -���������): ���&�%��&���&����0��)�����)(����&�&���������7&����9�&��&(���7��"��������&)���(���'��)]����!�� -E&���:,,2,11?444,0:����!��"�� G, -����� ��';G�&�����&�&��: ��!?@,/0: ����!�'���&7�&�"�� -G@.:���"�!$�)����:G433?0:����!=����&��&���-�'�&�""'�$�:�$ ,?,,!4,4,0��) ����!D1P@4"�. -$���":��O43.09#�����&�)��� �����&)���(�������!�������&�R'����) �& A�%���� V'&�&7�&�� 3O1 -+��=�&�B""'�&E�������:/,,!343!,3@0:����!"&'���&�R'����)�&$��8�122��)333-B�Q���&���:$@,@4@��)$.,3/40:����!�&���&�R'����)�&��.-+��=�&�B""'�&E�������:/4?!,??!,120&�$��8�?1/-B�Q���&���:$@,11/0��)����!�'"���&�R'����)�&��.-+��=�&�B""'�&E�������:.4O!,?3!44.09������&7����������&��&�����=�&*&7����������&��(����&������)'�����%����#��� 3�&�*&���"���&��&7��Z'�77�)(��� ���$7&?.\6,91F$&���"!"����&�&�R����Q���)������(����8������&������143:122:3?,��)?..�"9A�)�����)7�'�!�����B"���+7�&���"(���'��)�&�&"7������*&��8������&"�������*����(���V'&�&���&"�����&�*&�������=�:�&������E�G�"����6����=���)�&����������"���&���������-1@:1.09a�b��� I������KUcTJ�������� ���Kd���N ���d�����LeJ��������b�TJ������������b��U����Kd���N ���d������ U�%�Q������"�����:V'&���������&����7�&�&���������-�%B 0��)V'&�����������&Q����*���7�&�&���������-�E$ 0�87���"����(���7��*&�"�)&���_����fghi&S�7������)���"���&��&7�- ��=����"��0��)�������)��*&��-1109 �&�&���������(��7��*&�"�)'�����(&����!���&��(��������&'��&!&7����'�����C����-$<#�0&*���122�"�������������&,44W �����"����&�9�&���Z'���!��&�&*�E$ &��%B �87���"����:���122�"���������(������&@4W �����"����&�9B��E$ �87���"����:�����'�������������&�&*@93\@935":�&Q�����&�����&"&������-��07������:(����&���9$*���@47��������*��"��(������"������Q��&*@44"�:�����CQ������(����������)-j?34"�09#���,347&��������*��"��(������&�)�)(������"������Q��&*@44"�*&��&(�)��2447&��������*��"��(������"������Q��&*344"�9#��"������������&*��������'�������&�(��"���'��)&Q����"�9A����&�!�����&�:)&'����&�"���;���&���)����'����&�&*������*��"����&Q���-klmn0��)���"&����*�����&�-op0(���7��*&�"�)��)�������)��*&��-1309#��&'�����&*����'���'�*&�����Q��'���&�(��)����"���)'�����"����&������)(���������C��)���'"�����&�9#�����'���&*,1�����(����Q�����)9B��%B �87���"����:�77�&8�"��������*&*�������(���������)����������'�������&�9%�=�������E$ �87���!"����:"'���7�������(����������)��7�������9$*����������CQ�7��������*��"��(������"������Q��&*1�:14������������(���7��*&�"�)9����������������&������)&*�����������Q���&*j/44"�*&��&(�)��,4��"�*��"��(������"������Q��&*1�9B�����*��"�:�;!����=&*/5"(�������7��;�&*,5"(�����&�)�)�&����=*&��8���)��*�9#&�Q��'������)���:���"������������&*�����'�������&�&*@4\@47�8��(��)����"���)&Q����"�9

qrstuvswsvxyzuyu{|s}~n�l� �������������������������������

����������������������� ��������¡� �����������

Page 155: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������������� ������������ ���� ���� ������������������� ��� ����� �������� ��������������������� ���������������� ���������������� ��!"����� ������� #������� ������ ������$ ������������!���$� ����$��������������$������%��&'����������� ��� �������()��!*� ����+���$ �$ ���� �)����$����� ,+�� # ���-!./�&!&0$ ���� ������,����! 0$ � �������������1$�����2 -�!�� ��������� $ ���������������"3�������� ���� ����������� ��$������ ������'/�-4!56789:7;<==>7?877>@<ABCBDEFGHCHIEAJKLMNOPQRSGTSUGTSFGCTMEVHDNEFBUUGFBWXPGCMHYNBZBUUN���������������"[(� ������ ������� �\]"��+�����_a_ab�������� ��� �]+���$�� �c�d�������������������� � ��������e+��������1f+�cc�c"c""""��c""""�+�f�����$�����$ %��� ����������� ������� ����� ������+� �� ������+� ��� ���� ��g�����$��� ��������g��� &�!��� �&+������������$ %��� ����������� � ������������---/�----�����������$���$��� �������������$�������������&h�!i %��� ����������� ��������������$ %��� ����$�������!��������������$ ���������� ���������� �����$���� �� ������� ���$���$���� ��� �������� ���������� �� �����������������������"��&.�!����������������� ��� ��, ���� �����������$�����$ %��� ����������� ����������� ���� �$���������$��������� ���� ����������"[(����_a_ab�� �����\]"�������!j���������"[(������� � �������$ %��� ����������� ��c�d+$��"[(��������� ��� �� ���$����(g������� ������������������������������ ����"�g�������!"�������������������������� ������� ������ ��)���������������������,������c�d+$��"[(�$� ������� �� �������� ����������k(l e����������������!�����������)���������� ������������������c�d+$��"[(�$� ��������������������������+���$ ���+ ���� ������������)� �����#�����������������������������g�����$��� ��������g �!�� �������������m���������"[(������������$ %��� ����������� �����������$��n��������_o_pq�������, +�������\+��������������\+�*gk�����������!j���� �������� ����������������� � �������$ %��� ���������$����������$$����� ���������������������+�� �+�, ���������c�d+$��"[(�������$ %��� ����������!���������� � ����,������ ���(g���������������� ���+ ��, ���������c�d+$��"[(����� ���������� �$ #��������� ����������� � �������!*�������� ����������c�d���� ��)������� �� �� ������+�� ��,�������\"d*+�� ������� ����� ��������$����� ����������&������ -�k&l -$���� $ �#������������������������+$ ������������������$ %��� ����������� ���&'���������\������� ����!�������$������������� �#���������� ���� ��,���������������������c�d��������������������)�������� ������ ��, �����������������\�$������ ����!*$$���� ������ � �������������$���� ��� $ �#������������������ ��� $�����

��� ����� ����c�d����� ��,� ��������������� ����������� ������������������\������� ����!���������$� ���������� ���������)�������������������+$ ������������r�d+��)� ��r�d+��)1� ���#���� ����������$ �������������� �� ��� �������+�� ��,���������c�d+$��"[( �����g�����$��� ��������g�" ���������c �� ����������������������)� ����)1�� ���������&e�!� #����������������� � ��$����� ���� ����c�d+$��"[(���������������������� ��, ���������$ %��� �������\]"_a_absOSBAJKLMNOPQRBCEtUBNWXPNBuYBCZBFDEZGCTvYDGCTFSBZBUUZwZUBxyzxz{"������� ������������������ ��, ���������c�d+$��"[(��� � ��,�������� ������������������+��������!|������ ����������� �������������� ����)��������k �+r�d�g�����$��� ��������g��������+ ��,� ����� ���$ ��� �� �$��� ���� ���� c�d+$��"[(+��������!��������������������������� �����\]" ����� ��������� ����� ����������c�d+$��"[((g������������g+�� ��$ �#��r�d+d�]"�1-� �� �������$���������� -���$����� ����������� ����������� ���� �����������$ ����!|�����������������������������g+�� ���������c�d+$��"[(�)��������������� ��� �� ������)��������$ %�� � ������� \]" ������� "� g�����$��� ��i���g��!*$���� ��������c�d+$��"[(� ��� ��� �$����� ��g+�� ������� ������������� �������������������� ����������&1�1-�������� " ����!]�)���� � ��,������� ��, ���������c�d+$��"[(�������$������!"������������"[(������� ��,�������$���$�������$������� ������ ����������� �����$����� ������� �� ���� ���� ������ ��������� ��������� ��!r����� ����������$�� �� ��� ������������� ����� ��$��� �������������)��������������g�����$��� ��������g��!*���������������� �������������#� ������������ �$ �����"[(��+������ ������� ������$ %��� ����������� �������� ����������� ��)�������$����� ���\]"�����������������$�������1��!���������������� ���� �������$ ��� ������ ���� ������ $������$���� ������������������"[(������ ������������ ������+ ����������������������������� ����$ ���������+$��� ���n������"[(������� �� ������ h�1 �!PCEUwNGNHIxyzxz{}DHFBGCvwCEMGZNDB~BEUNENFDHCTtYFvwCEMGZENNHZGEFGHCHIFSBAJKLMNOPQR�GFS��N�������� ������ ������"[(����� ���� ������������������$���$��������$���������$��������������� �����_ a_ab\]" �������#�����������c�d+$��"[(��$������ ��!�� � ������������������ $�������c�d+��"[(��������������������$���r"d ���[*d�)����$����!����$���������������� �$���$��� �� ���� ��1��1&���������������$� �+���$�����������������������������$����������������������c�d+$��"[(!�������r"d�)����$��������� ��� �$ ������ �������������������� �� � ���m����������������������������$���������" ����!���� �����������������$����� �+�������������������� $��!*����� ����������[*d

� �q���_���_�o��o��������������������������������� ¡��¢£¤

¥��¦§�©�ª�«¬��­®����©�ª�����°��©­�­�¬����

Page 156: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��� ������� ���������������� �������� ������ � !

�!�"��#$�%��������&��'%�() ���$�������$�%���������� ������� �������(���%*$����!����� ��++,,�-�"!-��.+�� ,+/���,� +�0� !! �12!- �120� 12!� 12���- ������� $3����4���-"0���- ������� $3����4����5��0'.�����

�����$67$��89

:�������%:�;<=>?@ABCDEFGHIFJHDKDLJMNOPQRSTUVCWJDSFXDYTFJNGGHJNYNZNFJTHKSD[TNZNYHENKJYDSNYHEMNJNYDEMYDSFJHK\]_JDZaEMNSFJHEYNZYNTNKJFJHDKDLFKFEYDENKJYHESD[TNEMYDSDTDSNbHJMJNGDSNYNT]cGFEd_SFXDYTFJNGGHJNT]eYNNK_SHKDYTFJNGGHJNT]bMHJNFKfJMNGDKeFYSDLJMNEMYDSDTDSN]GHeMJeYFg\hiNYiHNbDLFK[EGN[TTMDbHKeS[GJHZGNMNJNYDEMYDSFJHKENKJNYT]jj_eYNNK_bMNYNJMNSFXDYTFJNGGHJNklVHTEG[TJNYNf\jjTGDEFGHINKNmJJDJMNK[EGNFYZNYHZMNYgFKfJMNK[EGNDGH]fFYdeYFg_l FKfFYNT[YYD[KfNfcgGNTTEDKfNKTNfEMYDSFJHK]GHeMJeYFg\]V_cDJJDS aEMNSFJHEYNZYNTNKJFJHDKDLJMNOPQRSTUVCWFGHeKNfJDHJTcHKfHKeTHJNbHJMHKJMNSFXDYTFJNGGHJNYNZNFJT]cGFEdFYYDbT\UMNfUVCWHTEDSZDTNfDLFKlRJNYSHKFGfDSFHK]lUk_FjRJNYSHKFGfDSFHK]jUk cNFYHKeK[EGNFYGDEFGHIFJHDKTHeKFGT]lCa FKfFENKJYFGYNZNFJfDSFHK\klVJFYeNJYNEDeRKHJHDKHTSNfHFJNfcgJMNnokTbHJMHKNFEMUVCWYNZNFJ]cG[N_Z[YZGN_gNGGDbFKfYNfNGGHZTNTLDYnokTcHKfHKeJDJMNcFTNTO_V_UFKfj_YNTZNEJHiNGg_THKeGNGNJJNYEDfNLDYFSHKDFEHfTFKfK[EGNDJHfNcFTNT\VYNZYNTNKJFJHiNYNZNFJTNp[NKENbHJMnokT]Z[YZGNHTTMDbKcNGDbFTEGDTNR[Z]THKeGNGNJJNYEDfNLDYFSHKDFEHfT\UMNEDSZGNJNTNp[NKENHTTMDbKHKa[ZZGNSNKJFYgPHe[YNaq\lDJNJMFJJMNSTUVCWHTGFEdHKeJMNjRJNYSHKFGFEJHiFJHDKfDSFHK\PDYiHT[FGHIFJHDKFKfHSS[KDZYNEHZHJFJHDK_JMNfUVCWHTlRJNYSHKFGGgL[TNfJDOPQ\]r OPQRUYFZZ[GGRfDbKLYDSsWtuvwUENGGTJYFKTHNKJGgJYFKTLNEJNfbHJMJMNOPQRSTUVCWEDKTJY[EJ]JYFKTHNKJFKfFxqWajEGDKNTJFcGgNmZYNTTHKeJMNOPQRSTUVCW]TJFcGN\ySS[KDfNJNEJHDKcgFKFKJHROPQFKJHcDfg\]z wkRHSS[KDRPyasDKTJFcGNOPQRSTUVCWWajTbHJMZYDcNfHYNEJNfFeFHKTJSFXDYTFJNGGHJNYNZNFJT]STRPyas\{NEF[TNJMNOPQTHeKFGHTTJYDKeGgYNf[ENfcgwkRPyas ZYDENf[YN_FKFKJHROPQFKJHcDfgbFT[TNfJDiHT[FGHINOPQRSTUVCWGDEFGHIFJHDK\lDJNTJYHEJEDRGDEFGHIFJHDKDLJMNOPQTHeKFG]eYNNK FKfJMNPyas ZYDcN]YNf\l[EGNHbNYNED[KJNYTJFHKNfbHJMkVQy]cG[N\

|}~���~�~���������~������ �

]EDKJHK[Nf

%��%�����%��%��������%���%�� ¡¢��£¤¥¥�¦�§�©��ª«����¦¬�§���¥

��­�¬�¦ª�ª%©���%

Page 157: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������� ������������������������������� !"#$% �&�����'(��(�������'���(��'���������� !������#(��%��'�� ��'������)��*+����,� #�'(��'%"#-%.��(�������'����������/0�'��+����,� �����'�������������� !��'��������#(��%�����(1,������'����"1,���&���'��2�� 1��3#�'(��'%"#4%.��(�������'����������/0��������� !������#(��%�����(�������"1,���&���'��2�� 1��3#�'(��'%".�'��'��567�"������8������������)*'�������'������*�"#9%3�������'����(��!.���'�� 0������(�*�������� !#(��%":����'��;'��������'('����*����*���'���#'����<=>?@�A;��%�'�B����������&�"C�����'��;*��'�'������� ������(��B�����*����&'��B�����*���������#��%'��*����'����" �)��'��;��'�B�)��*�������� !�*�)'�*'�'������������'����'����'��2'����'������(����'�����*� ��'�D'������*�������#���*�*�)�����%",����)���������'���)��*1��3#���%"����)*'���'�B�����*���'�*0����/�������"�����'(�'����(������'�������'��������".�'��'��5;6E�F1;?E�"

G HIJKLMJNJMOPQLPLRSJTUVWXYZ[\Z]_aZbcZd_e_f[_gZhijZhklm

naaopqqcrgsbtubgvwbgcrxsbg]qdbycxbrv_vZugbfZ

Page 158: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������� �������� � ����� ����� ����� ����� ������������������ ��� ��� �����!� ��������� �������� ����� ����� "���� ������ ������

���������������#��

� � �� �� �� �����$����������% �����&���'��������!��((������������((�

)*+ ,������� ��������������� �� �� "� -

�� �� � � # � � " � -������.���������% �����&���'

���

/0123456789:;<;=>?@;A;BCD>D8E=F@GCA;9>HD8EIJKLIJKM9DNOPQ;AGKRJSIJKTCJUOK;AGJPVKW78A=>AX8XDB>A@D>AG>H;=@=F@>A=@AD>=C9@;DX<@9@A=;<@;DLYF@<@;DG;DF@GB>A@D>AG>H;=@=F@TB@;HF@G<@Z>8ADWNF@;<<8YF@;GD:8>A==8=F@>A=@AD>=C9@;DX<@9@A=;<@;D>A=F@:8D=TB@;HF=>9@:8>A=DWNF@D@<@Z>8AD;<@9;ZA>[@GTC;E;H=8<8EE8X<>A=F@B8Y@<:;A@B8E\]W_H;B@T;<DSa9\X::@<:;A@B;AGba9\B8Y@<:;A@BL\] W\cU@:<@D@A=;=>?@JUOK@d:@<>9@A=E8<IJKL=F@D=;TB@IJKM9DNOPQH@BBB>A@;AGKRJSIJKWOH><HXB;<<@Z>8A\G;DF@GB>A@Y>=F;G>;9@=@<8EeWa9Y;DTB@;HF@GW\f U@:<@D@A=;=>?@JPVK@d:@<>9@A=8E=F@IJKM9DNOPQWO<@H=;AZXB;<<@Z>8A>AG>H;=@GTC=F@G;DF@GB>A@Y;D<@:@;=@GBCTB@;HF@GW77D>A=F@XATB@;HF@GF;BE8E=F@TB@;HF@GH@BB\b;AG>A;AXATB@;HF@G<@E@<@AH@H@BB\e;<@F>ZFB>ZF=@GW\g hX;A=>=;=>?@@?;BX;=>8A8EJUOK@d:@<>9@A=D\;?@<;Z@8EbeibjH@BBD H89:;<>AZIJKM9DNOPQLKRJSIJK;AGIJKWQ<<8<T;<D<@:<@D@A=D=;AG;<GG@?>;=>8AW\kU@:<@D@A=;=>?@T;HlZ<8XAGH8<<@H=@GL;TD8BX=@>A=@AD>=>@D8E=Y877D>A;TB@;HF@GH@BB\bLTBX@B>A@;AG;AXATB@;HF@G<@E@<@AH@H@BB\eL<@GB>A@>BBXD=<;=@G>A\]W

mnopqrosortuvquqwxoyz{|}~ �������������������������������

����������������������������������������������

Page 159: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� �������������� ����������������������������������������������������� ���������������������� ������������� ���������� ����������������������� ������������������������������� ���������!����� ������������������������������� �������������� ���� �������"���#������������������� ������!��������������������������������� ��#���!��������������� ���$�%&�#'()� ��������*������������ ������������������������������ �����'� ��� ��� ��� ������� ��� �������������������������������� �� ������!���������� �������+������� ���������������������������� ������������,,!,-��.��������������"��/'%�����������������$�%&��#'()!�����"��������������� �����������������"��0��������������)"���������������!���������!�������� �"������� ������1234 ����������� ����!���� ������������������������#'()�������5�������������6���+�������������������������� ���$�%�77�!��������������� �"�����$�%&��#'() ������ ����������� ���������������'��'�����������������������������������������!���� ������������������$�%&��#'()�������� �����&������#������������� ������$�%&��#'() �����5�������������8' ����������/'%������������ �������� ����"������������ �������������(.%������������)"��������������� ����!$�%&��#'()9����� �� ������� �������������� �������������������� �����������23������������!����:��8�����!������� ������������������������5� ��� ������������!����2���"������ ���������������9���&�� �� ��1,34 �"��23����� ������������ ������������������� ��� �����������!���������� ��������� �&�������$�%&��#'()����������������!����:����"������������������� ���������!����������;�&����%;�<$�%�������������5�������������������:,������������������������� �"���������������:3������������������� �"���"�������/'%�������������������������������9����� �� ����(.%�������������������'�������=������������������7��������&�������������������������#'() ������ ��>?@ABCD���������"����������#'()���"�EF"������������ ����������������� ������������20!,0�!���� ����������������������������#'()����8'� ��A?@A@D�����������������������������#'()����������������������������8'������ ���� �������� ������!������������� ����!�����"���������������� ������������ ���������#�������������$�%&��#'()���������� �������� ��������������������� ���������� ������������� ������������8' ����������+�������������������"��������������������������������� ������������������������������#����� ����������������� �������"�&�������� ������������������ ����������� ������� �������������� �������������.��������!� ������������#'()� �����&���������������������������������"��8'������ ��A?@A@D�G�����������������#'()���������������������5������������������������� ����!����������9����� ����#'()����������������"� ��������������� �� �8' ������ ��������������� ��� � ���

H����"��!�����������#'()� ������ � �������� �������� ������������������������� ���������������#'()��� ���������������.����������!�����������������"��8'������ ��I��������������"����� ���������������������� ������ ���������!�"��&������������ ������������������ ������ ������������ ������������#'()������������� ��"������� ���� �� �����������8' ������ ����������������������������������������"��� �����=��� ������� ������������ ���*�����!������������������������������#'()���"���������������"�������"�����"������ ��������������"�������������� ���������������� ������;������������ �������������������� �� �8'������ ������"��� �����#�����"������� �&�������#'()������������������������ ����� ��� � �������"��������&��� �� �������������������&�*�������� �������������� ��JKLLMNONPQRSTURQR=��������������������"��������8'/ ������RVWPXYMNUZNONPQJ#�������������+������[�"�����;���\.�����������������(������.�(�!(�����6��"������!(�����]������"��������%;�<$�% ������ ��#�������+#�����%�����������������������:�����,���������� ��&���� ��������������!��������+�������[������� ����������������������KPU_PZ#������� ������ ������������ ����\=��27��#�(�!= :3,7��.�=����=��-7-��a�(�]I���#����������������� ��� #�(��I ��� 8���������� .�������"�H��� �\��a�(�]I�������������������� ��b����������� ���� ����\)��=���� a�(�]I#��.������������H��%��� +/����� �= �������H��� ���������������(���= ��� ���.H%/=&(=����c�#����c�=��I#���������������������b��������������� ����\��&=/!��������c�#�]���������������� ��� �����<����� ������ ������������ �����dD?eAfBDgA?BhChiBiBjBhkh?B�#�(���� �&��"������������������� ����������������������#'()��SNNSNPVNJ:����*��!'�!c����!$�!=���"��!.�!c������!��!=��� ����!c�!�����!��!H�����!=�!)���!/�!������!��!=��� ���!H�/�hBjl��233,�#����&�������������������� ������������������������������ ���������������������������mnDopADlq!r!�:,0�2�H���!8�(�!%����!%�)������ +����!G�'��2332�$������������������ ���������9��� ������ ���*������� ����������������� ������������������������ ������.=a�sqdhllpADlq!tuv!0,�w0-�������� �!H�/����%���!'��233-�.�������������� ����������������������������������������������������� �������������� �������&������������� ��������mnDopADlq!x!�:�y�7� �����!��=�!���+���"�!(�!����!c�)�!������!��!a�����!'�!������!)�!$����� ���!��!H�� ����![�'�!(����!=�!/��+!G�

z {|flhAf}fAFi~hihjCf������������������������������������

������������� ��¡¢�����£��������¤�£��¡�¡� ����

Page 160: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������� ����������������������������� ��������� ����������� �������� ������� !�"�� #$%#&�'()&�*&�(�+����#,�#-������� #.����/������#0����&�1������� �� ������������������� ����������� ����� ���������2344 567" !�"�� 8�9 #:;#('�)('<�'�,����#��#=��>����#.�#?�>�@#1�#A�B��>���#0�#C�����#D�#-������� #.����C������#E�����(E� ���C�AFG��������� �������B�������F����������� ������������ ����B���� ��������������� �� ����H 2���I7J� #K%L#*MM)*M�*�/������#0�#N���#��/�#D�������#O�#/����� #C�/�#O��G�#/�#P>�����#E�#C����#D�Q�#1����#1�#R������#S�#T�����#-���������&M-,S���������UC��VB�� ����� � ��������������� ��������� �����������������B�� ��������� �� ����2���#KW:#(X)(<X�X�S�G��� #C�C�#/ ����� #��#-�#A�#N�������#C�#/B���>#A�#EB����#�����,����� #��/��&<<'0������������� �����1?���VB�����������B����� ����������F����������� ���������� ���B������������ ��U���������������� ����H 2���I7J� #K$W#&'X()&*���<�DB�G��#D����,����� #��/�����&0� �������������� ����1?��������������������B�� ��G�QT&' �������� ������� ��� ������ 2���I7J� #$#&M)&M<�&��A�����#/�E������Q��B������������� �������������� ��������B�����YZ7�"Z�#:L%#&&�)&&'�&&�O����#D�#/B������#O�R����N���#A�E��&<<X.�� ���FART�B������� ������G�������� ������������������������������������������������������2344 I7J� #[#M**)MX(�&��O�B�#�����&�D�����������������\�������� �������������� ������� ����������� �������������B�� �����������������B�� ����] �9 I7J6_a #b$#&)�&�&M�T�G�#C�c�#T������#=����A��� #S�������&1������������� ����������C���.�������\������� �����d""3 �9 I7JZ_�e #f;#M&M)M��&�/����#1�+����,��G��#C�R�000�����1��������������VB����F�����\�1?�FG��������� �����2344 567" 2_�e I7J� #b#M)M<�&(�-�����B #,�0�#R�����#T�#D��������#R�#E��@��#D�#.���@���#T�+����������P���#,�+�����*-�������������������� � ���1?���VB��������ARTF ������������ ������\������� ������3Z��7ZdZ7ga �a #$W#�&�*�&'�C����F1��B����#C�/�#,��@��#��#,���B�#+�+����C������#E�C����&�D���� �������B�� ������� ��������� ������B��E�CT�S� �B �� ������F�� �G����������������������� ���������� �����3Z��7ZdZ7ga �a #b;#�&*'�&*�C� �����#D����+�B��#+�O�����XP���F\�����B�������h ����i ������ �����������jJ� k_�4 #K%#&���)&��*�&X�l����#R�1�#E�����#+�C�#-��#m�-�#,��B��n�B�#C�E�#S��@#+�E�#�B�B� B�#/�#+�������#��C�#T�� �B�#E�.�#A������#T�1����.�����#E�C�����(.�������\���� ��������B��B������������� ���B����������������F\�����B�����������34�#b$W#'')'(&�&<�T�� �B�#E�.����C������#1�����(A��� ���� ���B��������\�����B����������� I7J��Z_"J� #:$#<'*)<*M����/����#1�+�#1�����#,�#,�����#S�S����,��G��#C�R�000��&<<<D�>������ ������������i��������� >���h����� ������������������\���������������������������� ��(oFA??FMo1?� ���� ��VB������p4JZ ����dZ�g YZ7 qYd#L%#�*(X)�*'M��&�+�B��#+�O����/�����#+�1����&�D�-=?�h�>������������G�� ������������ ���� ����������� ������� �9 jJ� 2���I7J� #Kb#<)((����1�R��������#-����&&E�������PR?����� I7J��Z_"J� #:L#'X&)'X��M�P����#R�#C���#-�#-��� �#/�#O��B��#/�#C�B���#A�������� �#T����&&=�\���� ���� �B� �������VB����F�����\�D�-����� ���������B�� ������������ �������� ������� I7J��Z_"J� #:L#&<)&(M���E��G� ���#S�#=��������#+�#.�B����#+����-�����#D����&&�����G�����B� ��D�-=F ���1?�G�������������G����B������������3Z��7ZdZ7ga �a #$L#(*<�)(*<<��(�E�����#+�C�#D��#/�#r���#A�#,����>#O���#N���#+�#s��#1�R�#E���#s�#T������#1�=�#-�B��#=�#.��@���#/�+���������&&�D�-=�B����������� �� B�������\���� ��������� ������� I7J��Z_"J� #:L#&M)&X��'�E����B�#E�E�#-�#-�#T�� �@#E�#R���#s�#E����B�#.�#,�����B����#1�O����P�B#+�O����&�D���� �� �������� �����

����������B�������������D�-=F/S1s������������ ����p��"�jJ� I7J� #f[#M&&)M�&��*�,B� ����#/�#E��G� ���#S�#/����� #C�/�#D�������#O�#/����#R�#=��������#+�#-�����#D����-������� #.����&�D���� �� �������� ������� ��� ���������� �� ��B���� ��������G����G�������������D�-=��������G� ������������ ������\�����3Z��7ZdZ7ga �a #b;#(M'X)(M**��X�,���#+�#/������#.�#/�������@#/�#-�������#��#.���#/�#O��#/�#-�����#D�#?��@� �� #�����,����#l�����<,���@��� ��������1?�G�����������\�� ���D�-F ���000����� ����YZ7�"Z�#$:%#&(�<)&(&���<�E����B#E����,��������#������<��������������������1?�������� ���G�D�-����� ����YZ7�"Z�#$:%#&(�&�M��C����@#D�#1����#=�#C���� ���#E�#N���#-�#P����#m�#/����� #C�#,�����#+�#/����#?�#,��������#�����Q�� ��#1����&&=�\���� ��������������G�����B� ��D�-=?���� ���D�-����� ��FG�������� �B� ����1?� ���� �����3Z��7ZdZ7ga �a #$L#*X*<�M&�EB�������#C�#E��G� ���#S�#-B ��#R�#1��������#?�#-�����#D����C� �����#D����&&������D�-=�B�����������������G���������������� ����� ��� ������G��� ���>� ���> �i��� ���3Z��7ZdZ7ga �a #$L#<�XM)<�<M�M��,��������#��+����Q�� ��#1�R����&&D�-����� ���h�B� �����G����� �������1?� ���� ����YZ7�"Z�#$$$#&XM)&X'�MM�E�� ��#S�E����C������#E�C����&�C����� ���������� ������B�� �����������G���������B�������� �����tdYuIH #:b#&�'')&�*��M�?������#��-�#cB���F�G��������#E�#c� ��#+���#S��G�B ��@�#=�#C���G��#T����-�����#S�����&.� ��������� ������� �������������������h�� ���� ���G� >������ �������.T&��� �����jJ� 2���#f#*�<)*M<�M(�/�����#+�#EB �#E�#D�@�G������#/�#/B� �@�#0�#0>��� �B#��#=���#D���#/�����#+�#E��B ���FO���@�#m�#D�����#D�#c@��B��#O����������*D��/S���� ���?�<(����� ��������� �������� ����G�����B� ���1�� & ��� ���� ��1?�����34�#bW;#<�X)<&��M'�E�� B��>���#c�#S� �G�B��#l�#C������#E�C����-������� #.�����'1������� �������B� ��� ��1?�-�����0���000 �1?��������� ����3Z��7ZdZ7ga �a #$b#M(�M)M(M��M*�-�#=�#,�� ��#D����+�������#S��&<<�D���� ���B � ����� ��1?��� ��� �����������������B� �����G�������� ���� ��2���#%L#<&()<�'�MX�m���#r�-�#N���#+�#?������#+�#,� ���FE�����#-�#1�G��#,�#N����� #+�#C����#T����/�� �#������XD�����B��� � �����G������� ����������F����>������34�#bW$#(&<)(�M�M<�E��������#1�#R��������#O�#,B� ����#/�#S� �G�B��#l�#,�������#0�#O���@�� #N�#/����#R����-������� #.�����<?�<(�� ���� �>� �������1?��� ��� �����������#1�� M����1�� MG#�������� ��������� ������������� �������CEQ����� ������G������� ��������ujI5 �6 #K;#&�(<)&�'���S� �G�B��#l�#P�������#O�#EB���������#/�#/�������#��#C������#E�C����-������� #.�����X������ ������� ������G��������������B�� ������ B����>� �vB������� �B������� �����jJ� 2���p4J��Je7Za#f#�X�)�X<�&�/������#0����C�����#E����&�M1FR0/.���B� B�����������G����>� ����B��� �������j��_JgajJ� I7J� #%WL#&&*)&�'���S����G�����#c�#,�������#1�#/������#R�#Q������#T�+�#,B�@���� #.�#C�����#C�#R�������#-�#C�����#D����+����#,�����X/�� ���VB�� � � �������������vB������� ����G�����B������ �B� B���h���G����#�� ����#�� ������2_4JeJaJe� �a #K%#(�M)('��M�N�� ��#+�#+����#,�#,�����#��#��G���#.�#,����� �#T���#EB����#/�#/�������#E�S�#C�����#D�#C�����#E����/������#0�����'D�>����������������R0/.��M1F����������� ��������B�����2�Jw�"�� !�"Je� �a #KKb#M'*)M*X��/��������#O�#RB���#C�#1�G��#��#S� ���#��#r��#N�#N���#T�#�������FC�� ��#+�E�#?����@�>�@�#E�E�#O������#=�#/�����#Q���������&M1����� ��������������F�������� ����������1�� &G�RS�T�������B����F��B��������������3Z��7ZdZ7ga�a #bK#X'�)X*'�(�/����������#-�#.������#��#/����#R�#S�����#?�#E��������#1�#S� �G�B��#l�#C������#E�C����-������� #.�����*1�������

�3Z��7ZdZ7ga �a��4Z_xyz{| }~��~�����~��~��������~���~����

����������������������������������������~����~

Page 161: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������������� ������������������������������������������������������������������������������� !� "#$%#&'(�)&'�*�&+�,��������#-�#�.����/0���#1�#2��#3�#4����.#5�#6��.��#7�#8��9���#:�#8�;����#,�#<=��#0�#,������#,�#,�����#>��?@��A*(�*B2�C�D�����/��=����������;����.����/���.����������@?"E�?FG� #H#+I+)+J*�&I�5����#>����0���#4�K�A�LJLB7�=���C�A.����B��������������.�������������.���9�����M�������.���������D�����������������;�������;� ����������.�=�����������N�OGP�� #%#&(I)&�&�&J�0����.�#��3�A�LJ(B���.������������������=��=��Q�P"N�O�?"#%$#�'�)�&'�&L�7����=#>�#3�.����#8�#K��.���#2�#R����#7����7=�����#0�A*((&B:����.��K8�����������������������;��������������������������K'�SETU!�V"#%#&L()&L+�W(�6������#K�#<���#K�8�#X��9��#8�#,��;�#��#0�#:�#Y��Z#�����0�����#7�0�A*(((B������������������������������������.�����["\���T�G�"#]H#*I�)*J(�W��7������#R�#Y�.�/>����.#0����:��/8������#7�3�A*(�'B6�����=���9����������������������� ���_=�����:�63���@?" ?a��?"EG�"T�G�"#bc#�'*�)�'*&�W*���.#��#R��#0�#8��#d�#7����=9#7�#X��.#-�#Y�=#-�4�#,��#R����R��#��A*(�*B,�=��=��;�������e=��/����f���.�����������;�:�6������� ���O��#$$%#I*()I*'�W'�1���Z� �/��Z����#K�0�#��Z����#<�����=���#g�8�A*(�*B�������_=�������������������e=�)2<�8#2618#26�8#2<3:���2617�EG������ #]h#&(&I)&�'*�W&�8���#<������7�����#:�A*((�B4������������.�������������������.��.��@?"!�i"EG�"\���T�G�"#b#JLJ)L(I�WW�0��#��>�#,����#0�6�#,���Z�#��#:���Z�#7�#3�����#7����6���������/,�� ��9#-�A�LL+B����=��������;�������g��.�����������;����������.����� ���O��#bh$#ILI)J(��W+�4���#7�#2���#:����K�=�#K�A*((WB�=����������������=�����.����;�2<�8���2618�������.���\�aa"UV�O"T�G?��FOG�"#]j#*J)'&�WI�7�Z�#-�2�#>��Z��#7�,�#4��#7�,�#k�����#<�#K�;���#0�K�#Y�Z�����#��#R=#��#6��Z ���#,�K�#7�;��9#<�#3�����#-��?@��A*(�'Bl=�������������������:�63/��������������=..��������������������������� !� "#]#&��J)&�*J�

mn ����������� !� �@a�Fopqrstuvtwxyz{t|}t~y�y�uy�t���t����

�{{����}���|��|���|x�}��z�|�w�~|�}�|��y�t��|�t

Page 162: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

������������ ������������������������������������������������ ������� !�"#$�$%&'($�)*$%�($+,'%-�.(+/$�).�&#$�.01')%�*()&$'%�'1�1#)2%3�456�'1�#'-#7'-#&$,�'%�-($$%8�($*$+&�,'9+('+:7$�($1',0$1�;<=>?�2'&#'%�$+@#�"ABC�($*$+&�+($�#'-#7'-#&$,�'%�:70$8�*0(*7$8�D$77)2�+%,�($,�.)(�<=>1�:'%,'%-�&)�&#$�:+1$1�48�A8�"�+%,�E8�($1*$@&'9$7DF�G'%-7$�7$&&$(�@),$�'1�01$,�.)(�+/'%)�+@',1�+%,�%0@7$)&',$�:+1$1F�������������H�I������J�������������������������K���������� ������� !�B'9$�@$77�'/+-'%-�).�($*7'@+&'%-�1&+:7$�456L/1"ABC�@$77�7'%$�;-($$%?�@)&(+%1.$@&$,�2'&#�<56L6EMA�;/+-$%&+?F�������������� �����N�� O�����������������K������������� ������� �����������������I������P�������������������������������I��������Q���������������������������!�R$1&$(%�:7)&�1#)2'%-�*()&$'%�7$9$71�).�&#$�456L/1"ABC8�E$%*S�+%,�E:TU�'%�&#$�1&+:7$�456L/1"ABC�CG�@$77�7'%$F������������� �����V����I������������������ ������� ���������P�����������������������������;A?�B'9$�@$77�'/+-'%-�).�($*7'@+&'%-�1&+:7$�456L/1"ABC�@$77�7'%$�;-($$%?�@)&(+%1.$@&$,�2'&#�<56LE:TU�;/+-$%&+?F�;S?�B'9$�@$77�'/+-'%-�).�($*7'@+&'%-�1&+:7$�456L/1"ABC�@$77�7'%$�;-($$%?�@)&(+%1.$@&$,�2'&#�<56LE:TW�;/+-$%&+?F�;E?�B'9$�@$77�'/+-'%-�).�($*7'@+&'%-�1&+:7$�456L/1"ABC�@$77�7'%$�;-($$%?�1&+:7D�&(+%1.$@&$,�2'&#�XYSL<56�;/+-$%&+?F�A(()2#$+,1�*)'%&�&)2+(,1�)%$�($*($1$%&+&'9$�@#()/)@$%&$(F�G@+7$�:+(13�W�Z/F������������� �����[��J�����I�������������������������������� ������� �\������] �� ������ �!�;A?�<$*($1$%&+&'9$�5B6�$T*$('/$%&1�).�&#$�1&+:7$�456L/1"ABC�@$77�7'%$�+%,�6_53456�;5B6�).�&#$�456L/1"ABC�&+$%�.()/�5'-0($�aS�.)(�,'($@&�@)/*+('1)%?F�A�($@&+%-07+(�($-')%�'%,'@+&$,�:D�&#$�,+1#$,�7'%$�2+1�($*$+&$,7D�:7$+@#$,F�E#()/)@$%&$(1�'%�&#$�0%:7$+@#$,�#+7.�).�&#$�:7$+@#$,�@$77�;U?�+%,�'%�+%�0%:7$+@#$,�($.$($%@$�@$77�;Y?�+($�#'-#7'-#&$,F�E)%&'%0)01�7'%$1�'%,'@+&$�&#$�'%&$%1'&D�/$+10($/$%&�+($+18�2#$($+1�,+1#$,�7'%$1�'%,'@+&$�&#$�:7$+@#$,�($-')%1F�A(()2#$+,1�*)'%&�&)�&#$�'%&$%1'&D�/$+10($/$%&�+($+1�'%�&#$�*)1&:7$+@#�&'/$�*)'%&1F�"#$1$�($-')%1�+($�/+-%'.'$,�:D�+�.+@&)(�).�.)0(�'%�&#$�7)2$(�*+%$71�.)(�:)&#�1&+:7$�456L/1"ABC�CGE�7'%$�+%,�&#$�6_53456F�G@+7$�:+(13�W�b/�;0**$(�*+%$71?8�U�b/�;7)2$(�*+%$71?F�;S?�c'%$&'@�*()*$(&'$1�).�4568�456L/1"ABC�+%,�6_53456�+%+7Dd$,�:D�5<A6F�M�'%,'@+&$1�&#$�%0/:$(�).�+%+7Dd$,�@$7718�ef�&#$�/):'7$�.(+@&')%�+%,�ghij�&#$�#+7.�&'/$�).�($@)9$(DF�k$+%�9+70$1�l�1&+%,+(,�,$9'+&')%�+($�7'1&$,F�������

Page 163: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����

���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� �� ����������������������������� ������������������������������������������ ����� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������� ����������������������������������������������� ���������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ����������������������� ����������������������������� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ������������������������ ������������������������������������ �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� �������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��������������������������������������������� ���������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������������������� ��������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ��������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������������� ��������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������������������� ��������������������������������������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ����� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ������������ �����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������

������ �!"#$%�&'(�$��)

Page 164: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������������������� ���������������� ������ ���������

� !!�������"#$��% "�$�

Page 165: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells
Page 166: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���� ������� �� ����� ����� ����� ����� ������ ��������������� ��

��������� ������

� �

�������� ����������� � �!"#�$�%& '����! #()*�+�$�+,�+-$�+��+�$�+� �+.$,+/--+0$��+��+�$�+�1������

2

%344�������5���63����

Page 167: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells
Page 168: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������

��

�������� �� ������������������������������������������������������ ���� �������������!����������� ���

Page 169: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Page 170: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

�������������� � ����������

������������ !"#�!$%&'(�)*+#�,�"-.�/)'01��$234$2* 5

����6�7�8��9:8��9�;��

�8��<���8���8=�<�;��>?@A�BCDEFA�GHFIJA�KL551�MM1��NO

����PQRS���TIUSV?��W�����>XIV���YEZVS[[UHCIJ��W�����\HFJQD���YEZDIQ?IJ��W�����TSFZHJ���YEZIJRIVVIZ��W�����]IQDJQEZ���TISDZHJ?F��W�����PZSRH[���IQD��W_�����HD?���ZJQ[FSaZ���JbCEZVI���_�����5��c�7� ;78����defgeh�fgi�jklf�minkmi�oihi�fgipkqrs�oihi�lejihneho�khm�tuv�ehfipwipihni�xtuvey�zifg{ml�gk|i�kffpknfim�ehnpikleho�ehfipilf}�~{�i|ips�fgi�wpkoeji�{jeo{h�nji{femil��feje�im�eh�oihi�fgipkqr�khm�tuv�ehfipwipihni�kpi�iklejr�miopkmim�khm�fgipiw{pi�pi��epi�p{��lf�mije|ipr�lfpkfioeil�eh�{pmip�f{�pikng�fgiep�fkpoif�

lefi��efgeh�fgi�nijj}��h�oihi�fgipkqrs�w{p�i�kzqjis�fgi��uv�hiiml�f{��i�fpkhlq{pfim�ehf{�fgi�nijj�h�nji�ls�iefgip�knfe|ijr�{p�ehmepinfjr�m�i�f{�fgi�melklliz�jr�{w�fgi�h�njikp�ih|ij{qi�m�peho�zef{lels��gipikl�letuvl��lim�eh�q{lf�fpkhlnpeqfe{hkj�oihi�lejihneho�{hjr�hiim�f{��i�mije|ipim�f{�fgi�nrf{l{j}�������������{hli��ihfjrs�|ipr�mewwipihf�fkpoif�lefil�hiim�f{��i�kmmpillim�f{�kngei|i�k�lkwi�khm�iw��neihf�mije|ipr�{w�fgi�wpkoeji�{jeo{h�nji{femil}��������������il{q{p{�l�lejenks�ehnj�meho�fgi������zkfipekjl�ehfp{m�nim��r�fgi��{�ej�n{z�qkhr�������s��������{p��khfk��kp�kpk�vz{pqg{�l�x��vy�frqi�zkfipekjls�������s���������piqpilihfl�k�|iplkfeji�njkll�{w�q{p{�l�hkh{zkfipekjl}��gili�zkfipekjl��pik��fgi�j{ho�lfkhmeho�q{pi�le�i�n{hlfpkehf�{w��i{jefil��r�{wwipeho�q{pi�le�il�pkhoeho�wp{z�k�{�f������hz}��{pi{|ips�fgiep�lqine��nkfe{hl�l�ng�kl�q{pi�mekzifips�l�pwkni�qp{qipfeils�khm�f{q{j{�oeil�nkh��i�fkej{p�zkmi�knn{pmeho�f{�ehme|em�kj�pi��epizihfl}��kpe{�l�kqqjenkfe{hl�w{p�zil{q{p{�l�lejenk�zkfipekjl�gk|i��iih�l�ooilfims�l�ng�kl�z{jin�jkp�lei|ils�����������nkfkjrlels�����������ngp{zkf{o�pkqgrs�����������lfk�eje�kfe{h�{w�n{hm�nfeho�hkh{lnkji��epil��������������khm�h{|ij�mp�o�mije|ipr�lrlfizl}���������������tinihfjrs�fgi�q{fihfekj�{w�zil{q{p{�l�lejenk�hkh{qkpfenjil��efg�k�mekzifip�{w�k�{�f�����hz�w{p�fgi�mije|ipr�{w�letuv�ehf{�zkzzkjekh�nijjl��kl�geogjeogfim}������������h�fgi�qpilihf�lf�mr��i��feje�im���v����frqi�zil{q{p{�l�lejenk�qkpfenjil��efg�hkh{z�ifip�le�im�fizqjkfi�wpii�q{pil�f{�nkppr�q{fihfekj�oihi�fgipkqi��fenl�ehlemi�fgiep�q{p{�l�hif�{p�}��r�|kpreho�fgi�ngizenkj�hkf�pi�{w�fgi�{pokhen�q{pi�w�hnfe{hkje�kfe{hls�fgi�j{kmeho��igk|e{p�{w�fgi�qkpfenjil��efg�letuv�nkh��i�f�him}�di��lim����{pilnihni�pin{|ipr�kwfip�qg{f{�jikngeho�x�tv�y��������������f{�eh|ilfeokfi�fgi�mrhkzenl�{w�letuv�khm�lg{pf�m{��ji�lfpkhmim��uv�li��ihnil�ehlemi�fgi�qkpfenjil}��{pi{|ips��i�lg{��fgkf�fgi�{�lip|im�m{��ji�lfpkhmim�{jeo{h�nji{femil�pizkeh�ehfknf�ehlemi�fgi�nkp�peip�qkpfenjil}����K�� �9�79��� �¡89;998�����{�p�mewwipihf�z{me��nkfe{hl�{w���v����zkfipekjl��ipi�lrh�fgile�im¢�xey��hw�hnfe{hkje�im�x£uys�w�hnfe{hkje�im��efg�xeey����z{j¤�nrkh{qp{qrj�x��ys�xeeey���z{j¤�kzeh{qp{qrj��¥����z{j¤�nrkh{qp{qrj�xv���ys�khm�xe|y���z{j¤�kzeh{qp{qrj��¥����z{j¤�qgihrj�xv��gy}��pe{p�f{�fgi�j{kmeho�i�qipezihfls�fgi�

¦��7���8�§�©��6�=8�87<�ª��ª�8§��;���78 �9�c��©��«���;©�����9�ª��6�9�¬��9�­8�8;��ª�8§��;���78 �9�9� �8��§����7©��¬<��� �98���;8�§������§8���;��¬�� 9�7©�7� �§� ����98�<�8��=8���§8;�����®8�����79����9�=8�;��¬�78=���;�8��¬�78;��9���<�¬�®8 ����9����97�7�§<�7�� ��8®��7©�9��7©��¬�78;9�7��7©�8�7�§�7�987�9��¡�®���¬���7�����¬¬�¬8�7�� ��8®�<�®�©8;��9°�©���®�°��±8�9���=�77��� �97�� 8�§����7©����8§��;���78 ��©�97�8�7��;78��9��� �7©����8�§��;���78 �� <���8;9�8�98 ��;�8��¬�78;��9��²��8�®�978§�7� �7��¬��7������­³�5µ�7<¬����9�¬��9�98�8;��¬�78;��9��� ��¬�7�7©�8���� 8�§�;©��;7��8978;9��87©�98 « � �¬�� 8�§����7©��9��;����;78����8¶�78������7©�8�¬��9���7��·��²��9©���7©�7�7©��98 « �¬7�·��;�¬�=8�87<����7©��¬�78;��9�;���=��;��7���� �=<�7©��;��¬�9878������7©����;78�����§�¬9�����9;��;���;�®�<���7��¬©�7�=���;©8�§����9����79��®���� �98¶�� �¬�� ��7���=8�87<����98 « ��� � �=���97�� � �¡« ���8§��;���78 �9��87©8��7©����;78����8¶� �98�8;��¬�78;��9��� �¬�®8 � ��®8 ��;�����7©��97�=8�87<����7©����8§��;���78 �9�8�98 ��7©��¬��9��¹��;�°���97 <� ����97�7�9�7©��¬�7��78��������9�¬��9�98�8;��¬�78;��9��9�������9������7���78®��§���� ��8®�<�8�������� 8;8����

�¡ªcº�5L�5LLK»� ���KL55L5¼½µ�����¾%.�¿.����$+-&À�1����¾%.�0.���ÁÂ4&-ÃÃ+'Ä$%�1����Å%-Æ.�¿.���Ç$23�1����Å%-Æ.�".���Ç%ÈÄÂ4&$��"$3É$%�Æ-%�Ê'3-ÃÂ2$3Â$�Ë"$ÊÁÌ�'3À�"$3É$%�Æ-%��3É$(%'É$À�Å%-É$23�ÁÂ2$3Â$�ÍÄ32Â4�Ë"�ÅÁÍÌ�ÄÀÎ2( Í'Ï2*2&2'3à Ð32Ñ$%Ã2ÉÈÉ�ÍÒ3Â4$3¾$Ó'%É*$3É�-Æ�"4$*2ÃÉ%ÔÇÄÉ$3'3ÀÉÃÉ%'Õ$���1�Ö�×OO�ÍÄ32Â41�)$%*'3Ô�� *'2&Ø��Â4%2ÃÉ-Ó4.+%'$ÄÂ4&$ÙÂÄÓ.Ä32 *Ä$3Â4$3.À$Ú�+$23Ù&*Ä.À$������/.���ÁÂ43$2À$%�1����¾%.��.���ÁÂ4$%*$&&$4���ÛÜÝ��ÄÀÎ2( Í'Ï2*2&2'3à Ð32Ñ$%Ã2ÉÈÉ�ÍÒ3Â4$3¾$Ó'%É*$3É�-Æ�Ç2-&-(Ô)%-Õ4'À$%3$%�ÁÉ%'Õ$��1�Ö��Þ��Å&'3$(( Í'%É23Ã%2$À1�)$%*'3Ô����Å%-Æ.�#.����$-34'%ÀÉ��"$3É$%�Æ-%�Ê'3-ÃÂ2$3Â$�Ë"$ÊÁÌ�'3À�"$3É$%�Æ-%��3É$(%'É$À�Å%-É$23�ÁÂ2$3Â$�ÍÄ32Â4�Ë"�ÅÁÍÌ�ÄÀÎ2( Í'Ï2*2&2'3à Ð32Ñ$%Ã2ÉÈÉ�ÍÒ3Â4$3¾$Ó'%É*$3É�-Æ�Ç2-&-(Ô)%-Õ4'À$%3$%�ÁÉ%'Õ$��1�Ö��Þ��Å&'3$(( Í'%É23Ã%2$À1�)$%*'3Ô�ÛÜÝ��Å%$Ã$3É�0ÀÀ%$ÃÃØ�Ð32Ñ$%Ã2ÉÔ�-Æ�ßÏÆ-%À1�¾$Ó'%É*$3É�-Æ�Ç2-Â4$*2ÃÉ%Ô1�ßÏÆ-%À�ßà��×áÐ1�Ð32É$À�/23(À-*��

Page 171: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������

����� ������������������������� �!��"#� �$%&�$�'

((()*+,-./012*3)45 ((()6*7518*39:85(9);/,

(835</2382538=1*1<);/, >?@A�BCDEFA�GHFIJA�'KLL#�MM#��NO

PQRSTUV�WXYZ[SWX�\S]�XWQSVWX_�QPY�WaX�bcdefg�YSWXQUS[]�hUiUjk�ST_�WaX�WXYZ[SWX�QXX�YSWXQUS[]�QX]l[WX_�S]�\aUWX�]P[U_�ZP\_XQ]�hPQ�_XWSU[]�]XX�mSWXQUS[]�ST_�mXWaP_]kn��bVSTTUTR�X[XVWQPT�YUVQP]VPZo�hbpmk�YUVQP]VPZo�UYSRX]�P�WaX�bcdefg�YSWXQUS[]�QXjXS[X_�]ZaXQUVS[[o�]aSZX_�YUVQPYXWXQe]UqX_�ZSQWUV[X]�WaSW�]aP\�S�V[XSQ�WXT_XTVo�WP�SRRQXRSWX�UT_XeZXT_XTW�P�WaXUQ�lTVWUPTS[UWon�mPQXPjXQr�UT�S[[�]SYZ[X]�l]X_�SRRQXRSWX]�VST�sX�Ps]XQjX_�WaSW�VPT]U]W�P�W\P�PQ�YPQX�UT_UejU_lS[�]ZaXQUVS[�ZSQWUV[X]�h�tuvwxy����z��Skn���{URlQX��f�s�_U]Z[So]�S�]VaXYSWUV�P�ST�bcdefg�ZSQWUV[X�ST_�VQP]]e]XVWUPT]�WaQPlRa�S�ZPQX�PQ�WaX�_UXQXTW[o�lTVWUPTS[UqX_�ZSQWUV[X]n��|UWQPRXT�]PQZWUPT�U]PWaXQY]�P�WaX�_UXQXTW�]SYZ[X]�VPTe}�QYX_�WaX�ZPQP]UWo�P�WaX�YSWXQUS[]�h{URlQX��f�Vkn�dVVPQ_UTR[or�S[[�]oTWaX]UqX_�bcdefg�YSWXQUS[]�VPTWSUT�S�ZPQPl]�TXW\PQ~�WaSW�U]�SVVX]]Us[X�QPY�WaX�PlW]U_Xn�{lQWaXQYPQXr�WaX�UTWQP_lVWUPT�P�PQRSTUV�lTVWUPTS[UqSWUPT]�[XS_]�WP�S�QX_lVWUPT�P�WaX�YXST�ZPQX�]UqX�so��n�ifn��TY�VPYZSQX_�WP�ST�lTlTVWUPTS[UqX_�]SYZ[X�S]�]XXT�so�WaX�QX]l[WUTR�ZPQX�]UqX�_U]WQUslWUPT]�h{URlQX��f�_r�]XX�S[]P�sX[P\kn���TXe_UYXT]UPTS[��eQSo�_UQSVWPRQSY]�P�WaX�_UXQXTW�]oTWaXe]UqX_�bcdefg�YSWXQUS[]�UT_UVSWX�WaX�YX]PZPQPl]�TSWlQX�P�WaX�ZSQWUV[X]�h{URlQX��f�Xkn��aX�����_SWS�lQWaXQ�]aP\�WaSW�WaX�UTWQPe_lVWUPT�P�lTVWUPTS[�RQPlZ]�[XS_]�WP�ST�UTVQXS]X�UT�WaX�������jS[lX�ST_�Wal]�WP�S�QX_lVWUPT�P�WaX�ZPQXeWPeZPQX�_U]WSTVX�VPYZSQX_�WP�lTlTVWUPTS[UqX_�bcdefg�h]XX�blZZPQWUTR��TPQYSWUPT�hb�kkn���aX�lWU[UqX_�P[URPTlV[XPWU_X]�h]U�|d�ST_�_]�|dk�\XQX�[SsX[X_�\UWa�S�RQXXT�hd���g��k�ST_�S�QX_�XVUWSs[X�hd������|k���lPQX]VXTW�_oX�SW�WaX����ST_�g��XT_]�P�WaX�PZZP]UWX�]WQST_]r�QX]ZXVWUjX[o�h{URlQX��f�kn��UWa�WaX�_oX�ZSUQ�sXUTR�[PVSWX_�PT�WaX�]SYX�]U_X�P�WaX�_Pls[Xe]WQST_r�UW]�]WSsU[UWo�VST�sX�WX]WX_�WaQPlRa�{�Q]WXQ��X]PTSTVX�pTXQRo��QST]XQ�h{�p�k��lZPT�XVUWSWUPT�\UWa�RQXXT�[URaWr�XTXQRo�WQST]XQ�\U[[�WS~X�Z[SVX�QPY�WaX�QX_�XYUWWUTR�d���g���h_PTPQk�WP�WaX�d������|�hSVVXZWPQk�_oX�ST_�UW]�SQeQX_���lPQX]VXTVX�VST�sX�YPTUWPQX_n�bUTVX�{�p��U]�PT[o�XXVWUjX�\UWaUT�S�_U]WSTVX�P�sPWa�_oX]�P�SsPlW��if��TYr�S�_XTSWlQX_�P[URPTlV[XPWU_X�_PX]�TPW�oUX[_�S�{�p��]URTS[�h]XX�b�kn��������y�z���]lYYSQUqX]�WaX�_SWS�XWQSVWX_�QPY�TUWQPRXT�]PQZeWUPT�ST_�����YXS]lQXYXTW]n��aX�WXQY��ZPQXeWPeZPQX�_U]eWSTVX��l]X_�UT�VPYsUTSWUPT�\UWa�����_SWS�U]�TPW�U_XTWUVS[�WP�WaX�WXQY��ZPQX�]UqX��l]X_�PQ�_U]Vl]]UTR�TUWQPRXT�]PQZWUPT�_SWSr�]UTVX�\UWa��eQSo�_UQSVWPYXWQo�PT[o�WaX�_U]WSTVX�sXW\XXT�WaX�_UXQXTW�[SoXQ]�hPTX�VXTWXQ�P�S�ZPQX�WP�WaX�VXTWXQ�P�WaX�S_�SeVXTW�ZPQXk�VST�sX�VS[Vl[SWX_�ST_�TP�_UQXVW�VPTV[l]UPT�SsPlW�WaX�\S[[�WaUV~TX]]�VST�sX�_QS\T�h]XX�b�kn��T�VPTWQS]Wr�TUWQPRXT�]PQZWUPT�YXWaP_]�_UQXVW[o�oUX[_�WaX�ZPQX�]UqX]n�cPWa�WXVaTU�lX]�V[XSQ[o�]aP\�WaSW�WaX�UTWQP_lVWUPT�P�lTVWUPTS[�RQPlZ]�[XS_]�WP�S�QX_lVWUPT�P�WaX�ZPQX�_UYXT]UPT]n��UWa�S�QX_lVWUPT�P�WaX�YXST�ZPQX�]UqX�QPY��n��TY�h�|k�WP��n��TY�hd��akr�WaX�ZPQXeWPeZPQX�_U]WSTVX�S[]P�]aQUT~]�QPY�f�ng�TY�h�|k�WP�f�n��TY�hd��akn��aX�_UXQXTVX]�UT�WaX�cp��]lQSVX�SQXS]�QX]l[W�QPY�WaX�VPeVPT_XT]SWUPT�P��p�b�\UWa�WaX�_UXQXTW�lTVWUPTS[UqX_�PQRSTPe]U[STX]r�S[[�aSjUTR�S�]ZXVU}�V�UT��lXTVX�PT�WaX�VPT_XT]SeWUPT�P�WaX�]U[UVS�sSV~sPTX�ST_�PT�WaX�QXYSUTUTR�ZPQX�jP[lYXn��aU]�sXaSjUPQ�aS]�S[QXS_o�sXXT�QXZPQWX_�UT�PWaXQ�SQWUV[X]r�X]ZXeVUS[[o�PQ�SYUTPZQPZo[WQUXWaPo]U[STXn������i�����������tuvwxy�����]aP\]�UYSRX]�PsWSUTX_�\UWa�VPTPVS[�[S]XQ�]VSTTUTR�YUVQP]VPZo�P�WaX�PlQ�_UXQXTW[o�lTVWUPTS[UqX_�bcdefg�YSWXeQUS[]�]l]ZXT_X_�UT]U_X�WaX�sl XQX_�[SsX[X_e]U�|d�]P[lWUPTn������ 8¡015��L�)������&���¢£��$¤�£$�%��¥�£&��¦§"���©��£$¢��ª��%«�¬£$�$¤�«���$��%¬�¢���£$«�ª ��­�¦¢�%%$%�����¢£��%��$¢��ª¢�©®�$����ª��¥�¬%¥¬%¢£$�%��$¤�«�°±­#�¢®�%�©��©®��¥¬%¢£$�%��$¤�«��²­#���$%�©��©®�³¢®�%�©��©®��¥¬%¢�£$�%��$¤�«�"²�²­��%«���$%�©��©®�³©&�%®��¥¬%¢£$�%��$¤�«�"²²&­�¦§"���©��£$¢��ª �&��ª®%£&�ª$¤�«�©��£$¢��ª������$¢����£���ª$¤�«#�ª©&��$¢���®�ª&�©�«��%«�£�%«�£���������£� ��­�¦¢&���£$¢��¥��%�¦§"���©��£$¢����%«�¢��ªª�ª�¢£$�%ª�£&��¬�&���©����¥���£&��«$¥¥���%£�®�¥¬%¢£$�%��$¤�«�©��£$¢��ª �¢­�±$£����%�ª��©£$�%�$ª�£&���ª��¥�°±����¢µ���¢£�%���ª­#��²�©¬�©���«$����%«ª#����¢��¶�³���¥¥ª�£­#�"²�²���¬��£�$�%���ª#�·���¢��¶�³���¥¥ª�£­��%«�"²²&���«�«�£ª#����¢��¶�³���¥¥ª�£­ �«­�²����ª$¤��«$ª£�$�¬£$�%�¥���°±����¢µ���¢£�%���ª­#��²�©¬�©���«$���%«ª­#�"²�²���¬��£�$�%���ª­��%«�"²²&���«�«�£ª­ ��­��¹�º»¹�«$¥¥��¢£�����ª�¥���°±����¢µ­#�"²²&���«­#��²�©¬�©��­#��%«�"²�²���¬�­�¦§"���©��£$¢��ª �&��$%£��«¬¢£$�%��¥�¥¬%¢£$�%������¬©ª���ª¬�£ª�$%���&$�&�����¼���½��¬���%«�£&¬ª���ª�������©����£��©����«$ª£�%¢� �¥­�¦¢&���£$¢��¥��%�" ¾ ¶��%«�" ¾ ·O±�������«���$��%¬¢���£$«��«�¬����ª£��%« ����©�ª$»±"��ª�¿�����ª��#��#��%«�À���©�«ª¹±"�ª�Á¬�%¢�ª�¿�������«�«�$%£��£&��¦§"���©��£$¢��ª �&��«®�������ª�����ª$£¬�£�«��%�£&��ª����ª$«���¥�£&���©©�ª$£��ª£��%«ª��%«�£&¬ª�����¿�¥���£�ª£$%����$��%¬¢����£$«��ª£��$�$£®��®�ÂÃ�ª£�����ª�%�%¢���%���®�£��%ª¥���»�­ ��

Page 172: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������

����� ������������������������� �!��"#� �$%&�$� '

((()*+,-./012*3)45((()6*7518*39:85(9);/,

(835</2382538=1*1<);/,>?@A�BCDEFA�GHFIJA�KLMM#�NN#��OP

QRS�TSUSVWX�YZ[V\YS]SVXWV_S�YST\\V\aT�WV]Z[XST�WVS�TSSb�WT�TRSVZ[WXXc�TRWSd�\efS[]T�]RW]�\[[WTZ\bWXXc�W__VS_W]Sg�hb�[\bi\[WX�YZdTS[]Z\bT�\i�jkkR�WV]Z[XST�]RS�TZlmj�n�a\VST[Sb[S�[Wb�eS�[XSWVXc�dS]S[]Sd�ZbTZdS�]RS�WV]Z[XS�ZbdZ[W]Zb_�]RW]�]RS�WV]Z[XST�oSVS�Ta[[STTiaXXc�X\WdSd�oZ]R�TZlmj�pqZ_aVS��r�Wsg�tZb[S�]RS�[\bu�bSYSb]�\i�]RS�\VS�Wbd�]RS�TS[Zu�[�Zb]SVW[]Z\b�oZ]R�dZiiSVSb]�iab[]Z\bWX�_V\aT�[Wb�Zbn�aSb[S�]RS�Sv]Zb[]Z\b�[\Siu�[ZSb]�\i�]RS�dcS�XWeSX�TZ_bZu�[Wb]Xcw�\bXc�]RS�VSXW]ZUS�WY\ab]T�\i�TZlmj�Zb[\V\VW]Sd�ZbTZdS�]RS�WV]Z[XST�WVS�SUWXaW]Sd�RSVSg�q\V�SvWY XSw�Zb�jkxk�WV]Z[XST�\bXc�We\a]�yz{�\i�]RS�WY\ab]�\i�TZlmj�dS]S[]Sd�ZbTZdS�]RS�jkkR�WV]Z[XST�ZT�\eTSVUSd�ZbdZ[W]Sd�ec�W�X\oSV�TZ_bWX]\b\ZTS�VW]Z\�pqZ_aVS��r�esg�QRS�\eTSVUSd�UWVZW]Z\bT�Zb�]RS�n�a\VST[Sb[S�Zb]SbTZ]ZST�[Wbb\]�eS�TZY Xc�daS�]\�W�

dZiiSVSb]�|aSb[RZb_�\V�SbRWb[SYSb]�\i�]RS�n�a\V\R\VS�eVZ_R]bSTT�]RV\a_R�]RS�dZiiSVSb]�iab[]Z\bWX�_V\aT�Zb�]RS�TWY XSTw�TZb[S�]RS�iVSS�XWeSX�dcST�d\�b\]�TR\o�TZ_bZu�[Wb]�n�a\VST[Sb[S�Zb]SbTZ]c�n�a[]aW]Z\bT�ZbTZdS�]RS�i\aV�dZiiSVSb]�TWY XST�pdW]W�b\]�TR\obsg�x\bTS|aSb]Xcw�]RS�\eTSVUSd�UWVZW]Z\bT�YaT]�VSTaX]�iV\Y�W�dZiiSVSb]�WY\ab]�\i�Zb[\V\VW]Sd�TZlmjg�hb�[\b]VWT]w�xk�Wbd�}m�WV]Z[XST�d\�b\]�]W~S�a�dS]S[]WeXS�WY\ab]T�\i�TZlmj�pqZ_aVS��r�[�Wbd�dsw�SUSb�]R\a_R�]RS�bZ]V\_Sb�T\V]Z\b�dW]W�\i�QWeXS�����[XSWVXc�TR\o�]RW]�WXX�i\aV�WV]Z[XS�]cST�WVS�W[[STTZeXS�Wbd�\Sb�]\�Wb�Sv[RWb_S�oZ]R�]RS�TaVV\abdZb_�SbUZV\bYSb]g��Z]R�]RS�a]ZXZ�Sd�[\bi\[WX�YZ[V\T[\c�TS]a�[\b[Sb]VW]Z\bT�\i�TZlmj�d\ob�]\�We\a]����������Y\X��������Zb�T\Xa]Z\b�[Wb�eS�dS]S[]Sdg���QRS�\VS�TZ�ST�[WX[aXW]Sd�iV\Y�bZ]V\_Sb�T\V]Z\b�\i�]RS�dZiiSVSb]�TWY XST�VWb_S�iV\Y�ygr�bY�pjkxksw�yg��bY�pjkkRsw��gr�bY�pxks�]\��g��bY�p}ms�pTSS�QWeXS����sg��\oSUSVw�]RS�\USVWXX�X\WdZb_�eSRWUZ\V�[Wbb\]�eS�SvXWZbSd�ec�W�TZY XS�\VSTZ�S�SiiS[]g�QRS�\VS�TZ�ST�\i�]RS�xk�Wbd�}m�t�j�z�YW]SVZWXT�WVS�SUSb�TXZ_R]Xc�XWV_SV�]RWb�]R\TS�oZ]R�iab[]Z\bWXZ�W]Z\bT�]RW]�d\�WXX\o�TZlmj�Zb[\V\VW]Z\bg��S�]RaT�W]]VZea]S�]RS�\eTSVUSd�eSRWUZ\V�]\�Wb�abiWU\VWeXS�Zb]SVW[]Z\b�\i�]RS�WV]Z[XS�TaViW[ST�oZ]R�]RS�bS_W]ZUSXc�[RWV_Sd�TZlmjg�jXX�ZbUST]Z_W]Sd�t�j�z�YW]SVZWXT�\TTSTT�RcdV\vcX�_V\aT�\b�]RSZV�TaViW[S�]RW]�YWc�eS�WV]ZWXXc�dSV\]\bW]Sdg�QRSTS�pdSV\]\bW]Sds�RcdV\vcX�_V\aT�Wbd�]RS�[cWb\V\cX�_V\aT�TSSY�]\�VSSX�]RS�TZlmj�eS[WaTS�\i�]RSZV�bS_W]ZUS�[RWV_S�dSbTZ]cg�hb�[\b]VWT]w�]RS�WYZb\V\cXiab[]Z\bWXZ]c�W]]W[RSd�]\�]RS�\VS�oWXXT�\i�]RS�jkxk�Wbd�jkkR�WV]Z[XST�TSSYT�]\�iWU\V�TZlmj�a]W~Sw�oRZ[R�YWc�VSTaX]�iV\Y�RcdV\_Sb�e\bdZb_�eS]oSSb�]RS�bS_W]ZUSXc�[RWV_Sd�TZlmj�Wbd�]RS�pV\]\bW]Sds�WYZb\�_V\aTg�QW~Zb_�]RSTS�[\bTZdSVW]Z\bT�Zb]\�W[[\ab]w�]RS�Zb[VSWTSd�X\WdZb_�[WW[Z]c�\i�jkkR�TZXZ[W�WV]Z[XST�[\Y WVSd�]\�]RS�jkxk�WV]Z[XST�[\aXd�WXT\�VSTaX]�iV\Y�]RS�SXS[]V\T]W]Z[�VSaXTZ\b�eS]oSSb�]RS�bS_W]ZUSXc�[RWV_Sd�TZlmj�Wbd�]RS�[cWb\V\cX_V\aTg�jddZ]Z\bWXXcw�VS[Sb]�o\V~�iV\Y��SXXWSV]T�S]�WXg�����������dSY\bT]VW]ST�]RW]�UWVZW]Z\bT�Zb�]RS�SXS[]V\T]W]Z[�Zb]SVW[]Z\bT�eS]oSSb�W�_aST]�Y\XS[aXSw�Ta[R�WT�]RS�dVa_�Z]VW[\bW�\XSw�Wbd�]RS�\VS�oWXXTw�Sg_gw�ec�WdW]Zb_�]RS�oW]SV�[\b]Sb]�ZbTZdS�]RS�\VSTw�XSWd�]\�W�dZiiSVSb]�dVa_�VSXSWTS�VW]S�Wbd�]RaT�WXT\�dZiiSVSb]�dVa_�dcbWYZ[T�ZbTZdS�]RS�t�j�z�bS]o\V~g�j�[\Y WVZT\b�oZ]R�aVSXc�WYZb\V\cXiab[]Z\bWXZ�Sd�t�j�z�WV]Z[XST�oWT�b\]�\TTZeXSw�WT�]RS�[\VVST\bdZb_�Tcb]RSTZT�T\Xa]Z\b�dZd�b\]�cZSXd�W�YST\\V\aT�\odSV�ea]�Wb�abdSu�bSd�_SXW]Sd�T]Va[]aVSg��m\]WeXcw�]RS�Ta[[STTiaX�X\WdZb_�\i�jkkR�Wbd�jkxk�WV]Z[XST�oWT�dS]S[]Sd�ec�]RS�ql�Q�TZ_bWX�\i�[X\TSXc�\TZ]Z\bSd�jQQ�z�r�Wbd�jQQ���ym�n�a\V\R\VSTg�QRZT�[XSWVXc�ZbdZ[W]ST�]RW]�]RS�TZlmjT�oSVS�VSTSb]�WT�d\aeXST]VWbdSd�RceVZd�Y\XS[aXSTw�oRZ[R�ZT�STTSb]ZWX�oZ]RZb�]RS�]RSVWSa]Z[�[\b]Sv]�\i�_SbS�TZXSb[Zb_�ec�lmj�Zb]SViSVSb[Sg�x\b]V\X�YSWTaVSYSb]T�abdSV�dSbW]aVZb_�[\bdZ]Z\bT�TR\o�W�[\Y XS]S�X\TT�\i�ql�Q�TZ_bWX�pTSS�thsg�m\�TZ_bZu�[Wb]�X\TT�\i�TZlmj�n�a\VST[Sb[S�ZbTZdS�]RS�jkkR�Wbd�jkxk�WV]Z[XST�oWT�\eTSVUSd�oZ]RZb����Rw�dSY\bT]VW]Zb_�X\b_]SVY�T]WeZXZ]c�\i�TZlmjT�ZbTZdS�]RS�WV]Z[XST�WT�oSXX�WT�ZbTZdS�]RS�TaVV\abdZb_�eaiiSVSd�T\Xa]Z\bg��QRS�We\US�VSTaX]T�V\UZdS�SUZdSb[S�]RW]�WYZb\V\cX[\b]WZbZb_�iab[]Z\bWXZ]ZST�iWU\V�TZlmj�a]W~S�Zb]\�]RS�YST\\V\aT�YW]SVZWXTg��S�bSv]�WZYSd�]\�[RWVW[]SVZ�S�]RS�Y\eZXZ]c�\i�\XZ_\ba[XS\]ZdST�ZbTZdS�iab[]Z\bWXZ�Sd�t�j�z�WV]Z[XSTg��S�]RSVSi\VS�W XZSd�n�a\VST[Sb[S�VS[\USVc�Wi]SV�R\]\eXSW[RZb_�pqljks�Wbd�~ZbS]Z[�Y\dSXZb_�]\�dS]SVYZbS�]RS�dZiiaTZ\b�[\bT]Wb]T�\i�

����*=35��M)������$�����%������$�%��%������������$����������������������� ��&�����%�������$ �#��&��¡����¢������£��¤P��¥���%���&�����%������¦��¢���§��������¢�����������%$�����%������$�%����� �"��$�$�%����#��&����������������$���%��������$%���������������$������������������$������������ �� �$�����%������$�% � ����� ©��%�������$ ��£%�¥ ¡����¢������£����������¥ ©��%������¦��¢���£���ª��������¥ «�������������$���%���£%�¥¬� ­ ® P�� � ­� �ª �« ­ ­� � P �� �"«�« P ­� � ªª �� �"««& P ­ °­� � ªª �� P

�����±8²015��K�)���������$%���&�������$��$�������¢%��$�%��$ �����������¢��¡"�������$���� ���%�������$������$�%�����¡"�������$������$����¦���$%����¢�����������¢�$�%���%��$%$%��³�¢������%�������������$��"��%������$������¢%���$�%��$ ���§$�&������$%���������%���&�%����"««&�#������$%���������%�����%���������"«�«�#�������%����������«�#�������¢%�¢%��$�%��$ ��������$������¬�� ��&��$������§������¢$��������µ�$�$%���&��"��¶ ª��������%��������$%���&��"��¶°¤P��·����³�¢������%����$�%��#��&¢���%�����������$��"���%�������% � &$���³�¢������%�������&�����������$��"���%�������������$%�$����&��"««&��%��"«�«�����$����#��«��%��¬������$���������$%�¢%������ �¶%���§���³�¢������%���$%��&���¢���¢%�$%�����¢�$�%���%������������ ��&����%��&��%��$%��%�$�����������������������������%������O�� ��

Page 173: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������

����� ������������������������� �!��"#� �$%&�$�'

((()*+,-./012*3)45 ((()6*7518*39:85(9);/,

(835</2382538=1*1<);/, >?@A�BCDEFA�GHFIJA�KLMM#�NN#��OP

QR�S�TUVURW�XWYZ[\�]��_����aW�QX�QbcdTWSRW�Wd�RdWU�WeSW�WeU�SccSTURW�XWSRZSTZ�ZUfQSWQdRX�ZQXcgS[UZ�QR�hQiYTU���S�SRZ�j�Zd�RdW�TUk�UVW�WeU�UTTdT�QR�ZUWUTbQRQRi�WeU�bUSR�k�YdTUXVURVU�QRWURXQW[l�jYW�dTQiQRSWU�mTdb�WeU�QReUTURW�eUWUTdiURUQW[�dm�WeU�ZQmmUTURW�bUXd�cdTdYX�cSTWQVgUX\�nYVe�eUWUTdiURUQWQUX�STU�W[cQVSg�mdT�WeUXU�bUXd�cdTdYX�XQgQVS�bSWUTQSgX�ZYU�Wd�WeU�UoQXWURVU�dm�SZXdTcWQdR�XQWUXl�ZUSZ�URZX�SRZ�XWTYVWYTSg�ZUmUVWX\�]��pqr����seU�UmmUVWQfU�ZQStbUWUT�dm�WeU�VQTVYgST�jgUSVeQRi�uva�QR�WeU�huwx�UocUTQbURWX�ySX�SjdYW�z��{�b\�|UWUTdiURUQWQUX�dVVYTTQRi�yQWeQR�WeQX�gURiWetXVSgU�bQieW�SVVdYRW�mdT�XdbU�dm�WeU�fSTQSjQgQW[�dm�TUVdfUT[�}QRUWQVX�djXUTfUZ�mdT�ZQmmUTURW�jgUSVeQRi�XQWUX\�~UWSQgUZ�ZQmmYtXQdR�XWYZQUX�dm�bdgUVYgUX�QR�bUXdcdTdYX�edXWX�eSfU�ZUbdRtXWTSWUZ�WeSW�eUWUTdiURUQWQUX�ZYU�Wd�XWTYVWYTSg�fSTQSWQdRX�QRZUUZ�dVVYT�dR�XYVe�S�gURiWetXVSgU\�]��p�����hQiYTU���j�ZQXcgS[X�bUSR�TUVdfUT[�VYTfUX�mdT�WeU�z��jc��TUZ�l����jc��jgYU��SRZ�r��jc��jgSV}��ZX~�w�XU�YURVUX�ZQmmYXQRi�QRXQZU�wxxe�n�wt�p�cSTWQVgUX\�seU�TUXYgWX�VgUSTg[�ZUbdRXWTSWU�S�XQ�UtZUcURZURW�ZUVTUSXU�dm�ZX~�w�bdjQgQW[\�aR�RUQWeUT�VSXU�mYgg�TUVdfUT[�ySX�djXUTfUZl�QRZQVSWQRi�S�ZQXWQRVW�QbbdjQgU�mTSVtWQdR�dm�bdgUVYgUX�cTUXURW�QRXQZU�WeU�cSTWQVgUX\�]��_�����aW�QX�QbcdTWSRW�Wd�RdWU�WeSW�jgUSVeQRi�dRg[�QbcgQUX�WeSW�WeU�k�YdTUXVURW�gSjUg�SWWSVeUZ�Wd�WeU�~�w�iUWX�QTTUfUTXQjg[�QRSVWQfSWUZ�SRZ�WeYX�WeU�~�w�jUVdbUX�QRfQXQjgU\�|dyUfUTl�WeU�ZX~�w�QX�XWQgg�cTUXURW�SRZl�ZYU�Wd�QWX�QbbdjQgQW[l�bS[�jgdV}�WeU�SZXdTcWQdR�XQWUX�QRXQZU�WeU�cSTWQVgUl�cTUfURWQRi�RUy�k�YdTUXVURW�dgQidRYVgUdWQZUX�mTdb�ZQmmYXQRi�Wd�WeUXU�XQWUX\�aR�VdRWTSXWl�jgUSVeUZ�bdjQgU�~�w�bdgUVYgUX�XedYgZ�jU�SjgU�Wd�ZQmmYXU�dYW�dm�WeU�cSTWQVgU\�seU�ZSWS�

�Q��WeU�z��jc�XQu�w�dgQidRYVgUdWQZUX�QRXQZU�wxxe�SRZ�wx�x�cSTWQVgUX�SRZ��QQ��~�w�ZdYjgUtXWTSRZX�dm�ZQmmUTURW�gURiWe��z�l����SRZ�r��jc��QRXQZU�wxxe�cSTWQVgUX\�seU�YWQgQ�UZ�ZdYjgUtXWTSRZUZ�gSjUgUZ�dgQidRYVgUdWQZUX�eSfU�SR�UXWQbSWUZ�gURiWe�dm�SjdYW���Rb��z��jc�l�z��Rb�����jc��SRZ���Rb��r��jc�\�wgg�XU�YURVUX�yUTU�TSRZdbg[�VedXURl�edyUfUTl�QW�ySX�SXVUTWSQRUZ�WeSW�WeU[�Zd�RdW�mdTb�gSTiU�eSQTcQRX�dT�jYjjgUX�WeSW�bQieW�SZZQWQdRSgg[�SmmUVW�ZQmmYXQdR\�seU�bUSXYTUbURWX�XWSTWUZ��e�SmWUT�QRVYjSWQdR�dm�WeU�cSTWQVgUX�yQWe�WeU�dgQidRYVgUdWQZU�XdgYWQdR�SRZ�~�w�XWStjQgQW[�ySX�SiSQR�VdR��TbUZ�WeTdYie�hu�s\��hdT�huwx�UocUTQbURWX�XbSgg�VQTVYgST�TUiQdRX�dm�QRWUTUXW��uvaX��yUTU�jgUSVeUZ�j[�S�eQie�QRWURXQW[�gSXUT�jUSb�Wd�TUXYgW�QR�S�jgUSVe�XcdW�yQWe�S�ZQSbUWUT�dm�SjdYW�z��{�b\�seU�jgUSVeQRi�XQWUX�yUTU�TSRZdbg[�VedXUR�QRXQZU�WeU�cSTWQVgUl�UQWeUT�VURWTSgg[�dT�VgdXUT�Wd�WeU�UZiUX\�hgYdTUXVURVU�TUVdfUT[�ySX�djXUTfUZ�mdT����q�p�bQR\��USR�VYTfUX�yUTU�VSgVYgSWUZ�mdT�WeU�XQu�w�SRZ�WeU�~�w�XU�YURVUX�QR�WeU�ZQmmUTURWg[�mYRVWQdRSgQ�UZ�cSTWQVgUX�j[�SfUTSiQRi�WeU�TUVdfUT[�}QRUWQVX�dm�SW�gUSXW����jgUSVe�XcdWX�USVe����������������Sl�j�\����U���TXW�bUSXYTUZ�WeU�bdjQgQW[�dm�XQu�w�QRXQZU�wx�x�SRZ�wxxe�cSTWQVgUX��hQiYTU���S��SRZ�mdYRZ�XQiRQ��VSRWg[�mSXWUT�TUVdfUT[�}QRUWQVX�dm�XQu�wX�QRXQZU�WeU�V[SRdcTdc[gtVdRWSQRQRi�cSTWQVgUX�ZUXcQWU�dm�WeUQT�XbSggUT�cdTU�XQ�U��XUU�sSjgU�����\�wX�ZQXtVYXXUZ�mdT�hQiYTU��z��WeQX�bS[�jU�ZYU�Wd�SR�QRVTUSXUZ�TUcYgXQfU�QRWUTSVWQdR�jUWyUUR�WeU�XQu�w�SRZ�WeU�V[SRdcTdc[g�iTdYcX�VdbcSTUZ�Wd�WeU�ceUR[g�iTdYcX\�w�XQbQgST�XgdyZdyR�dm�WeU�ZQmtmYXQRi�XcUVQUX�YcdR�QRXUTWQdR�dm�ceUR[g�iTdYcX�ySX�djXUTfUZ�

������8�015����)�������"�������������������% ����%� $¡¡��$�%����¡¢��$�%£��¡���£&�� $¡¡���%£���$��%�����£$ ���$%�$ ��£&��¡�%�£$�%��$¤� �¥¦"��§���£$���� ��©����������ª$%�£$����¡�£&�������$�«"�����������$%�$ ��"����¡�%�£$�%��$¤� ���£$�����¬����%©��% �$%�$ ��"��&�¡�%�£$�%��$¤� ���£$�����¬����ª© ��©�"��&�¡�%��£$�%��$¤� ���£$�������� � �­$£&�����®«"�¬�� ©#�����®«"�¬����©��% �°����®«"�¬����ª© ��#� ©������£���¡�£&��ª$%�£$���� ��$%��­$£&� $¡¡��$�%����¡�¢��$�%£���±²³ FµH ����% ��¶²·¹º ��� �£���$%� �¡���£&��£­�����$�������£$�%��$%����&���� �� ��©��$�«"�$%�$ ��"������£$�����¬����%©��% �$%�$ ��"��&���£$�����¬����ª© � ©�"��&���£$�������� � �­$£&�����®«"�¬�� ©#�����®«"�¬����©��% �°����®«"�¬����ª© �»&�������������$% $��£���£�% �� � ��$�£$�%�¬�#��©��% ��£�% �� �������¬�#� © ��

Page 174: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������

����� ������������������������� �!��"#� �$%&�$� '

((()*+,-./012*3)45((()6*7518*39:85(9);/,

(835</2382538=1*1<);/,>?@A�BCDEFA�GHFIJA�KLMM#�NN#��OP

QRSTU�VU�WVXYZ[��\�]�_[Z_a�VUbVc[�cRc�cR[�dZ cVSU�Sd�VeeSf]V_[�eS_[Y_[Q�VUZ[Q[Q�QVXUVg�Uc_a�TVcR�VUZ[QVUX�_[UXcR�Sd�cR[�hij�bSY]_[fQcZUbk�lRVQ�SY_b�][�[mn_VU[b�]a�QcZSUX[Z�bQSZncVSU�Sd�_SUX[Z�bQhij�VUQVb[�cR[�nSZSYQ�U[cTSZo�bY[�cS�U�VUZ[Q[b�U[XcVp[�RZX[k��i[mcq�cR[�e[U�r�YSZ[Q[U[�Z[Sp[Za�YZp[Q�T[Z[�g�cc[b�cS��bVddYQVSU�eSb[_�VU�SZb[Z�cS�[mcZ c�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQ�Ub�cR[Z[]a�sYUcVda�cR[�eS]V_Vca�Sd�cR[�S_VXSUY_[ScVb[Q�VUQVb[�cR[�e[QSnSZSYQ�nZcV_[Qk�tU�SZb[Z�cS�b[QZV][�cR[�bc�b[sYc[_a��eSb[_�QQYeVUX�cTS�bVdd[Z[Uc�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQ�TQ�U[[QfQZa�uQ[[�[m[en_Za�bc�VU�cR[�vYnnSZcVUX�tUdSZe cVSUwk�lR[�YcV_Vx[b�eSb[_�dSZ�cR[�r�YSZ[Q[U[�Z[Sp[Za�YZp[��yuzw���VQ�XVp[U�VU��{sYcVSU�|�k�}u~w�|����[mn���~�}��~~ ������~�}��~~ ���|��~�}��~~ ����u�[mn���~�����~ ������~�����~ ���|u��~�����~ w���[mn���~�}��~~ ������~�}��~~ ���|��~�}��~~ ����}�}��~u~w���}�����u~w�}�}��~u~w�� � ��u|w���TVcR�������������Ub�cRYQ�cR[�cTS�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQ����}��~����Ub�����������k�lR[�QYn[ZnSQVcVSU�nZe[c[Z������VUbVc[Q�cR[�Z[_cVp[�SUcZV]YcVSUQ�Sd�cR[�cTS�nSnY_cVSUQk�lR[�p_Y[Q�Sd������u]_[ R[b�dZ cVSUw�Ub������udY__�TVbcR�c�R_d�e mVeYe�Sd�cR[�]_[ R�QnScw�T[Z[�[mcZ c[b�dZSe�cR[�[mn[ZVe[Uc_�bc�udSZ�b[cV_Q�Sd�cR[�eSb[_VUX�Q[[�vYnnSZcVUX�tUdSZe cVSUwk��Sbf[_VUX�cR[�e[U�r�YSZ[Q[U[�Z[Sp[Za�YZp[Q�Sd�WVXYZ[��\��Ub�]�` SZbVUX�cS��{sk�|��aV[_b[b�cR[�cTS�e[U�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQ����}��~����Ub������������dSZ�cR[�eS]V_[�nSnY_cVSUQ�VU�[ R�Qen_[�uQ[[�WVXYZ[��\��Ub�bwk�lR[�e[U�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQ�S]cVU[b�dZSe�QV�ij�VUQVb[�j ¡ �nZcV_[Q�uXZ[[Uw�Ub�VUQVb[�j  R�nZfcV_[Q�u]_ow�Z[�bVQn_a[b�VU�WVXYZ[��\�q�TR[Z[Q�cR[�bc�dSZ����]n�hij�uZ[bwq�¢��]n�hij�u]_Y[w�Ub�£��]n�hij�u]_ow�bVdfdYQVUX�VUQVb[�j  R�nZcV_[Q�Z[�bVQn_a[b�VU�WVXYZ[��\�bk�lR[�_fY_c[b�p_Y[Q�Sd����}��~����Ub������������Z[�_VQc[b�VU��¤¥¦§���©�k�lR[�Z[Sp[Za�oVU[cVQ�Sd�cR[�£��]n�bSY]_[fQcZUb[b�hij�Z[�cSS�Q_ST�cS�][�g�cc[b� YZc[_a�]a�cR[�YcV_Vx[b�eSb[_k�lRYQq�SU_a�U�Ynn[Z�_VeVc�dSZ�cR[�e[U�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQ�SY_b�][�b[c[ZeVU[bk�lR[�e[U�bVddYQVSU�S[dg�V[Uc�Sd�cR[�dQc[Z�bVddYQVUX�nSnY_fcVSU����}��~���� U�][�ccZV]Yc[b�cS�S_VXSUY_[ScVb[�eS_[�Y_[Q�bVdfdYQVUX�VUQVb[�cR[�e[QSnSZSYQ�RUU[_Q�Sd�cR[�vªjf|«�nZcV_[Qk�lR[�b[c[ZeVU[b�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQ�uQ[[�l]_[����w�_V[�TVcRVU�cR[�ZUX[�Sd�cRSQ[�oUSTU�dSZ�bVddYQVSU�baUeVQ�Sd�SZXUV�eS_[Y_[Q�QYR�Q�ba[Q�SZ�bZYXQ�VUQVb[�e[QSnSZSYQ�e c[ZV_Qq�TRVR�VQ�VU�cR[�ZUX[�Sd�RYUbZ[bQ�cS�cRSYQUbQ�Ue���¬Qq�­��\���q��\¢��q���|��®��Ub�Q_VXRc_a�]Sp[�cRSQ[�dSYUb�dSZ�VUcZnZcV_[�bVddYQVSU�VU�x[Sf_Vc[Qk�­������®��lR[�QV�ij�VQ�QVXUVg�Uc_a�Q_ST[Z�VU�cR[�nR[Ua_fSUcVUVUX�nZcV_[Q�Ub�cR[�hij�bVddYQVSU�Q_STQ�bSTU�TVcR�VUZ[QVUX�bSY]_[fQcZUb�_[UXcRk�j�sYUcVccVp[�eSb[_�dSZ�cR[�Z[_cVSUQRVn�][cT[[U�cR[�e[U�bVddYQVSU�S[dfg�V[UcQ����}��~����Ub�cR[�_[UXcR�Sd�cR[�bQhij�VQ�][aSUb�cR[�QSn[�Sd�cRVQ�nY]_VcVSUk�lR[�Z[_�QVcYcVSU�SY_b�SU_a�][�nnZSmVe c[b�]a�cR[�vcSo[Q{VUQc[VU�[sYcVSU�­��|��®��dSZ�U�[__VnfQSVb�eSpVUX�_[UXcRTVQ[�VUQVb[�cR[�nSZ[k�­�����®��°ST[p[Zq�[dd[cQ�QYR�Q�cR[�VUc[Z cVSU�Sd�

cR[�RVXR_a�RZX[b�S_VXSUY_[ScVb[Q�TVcR�cR[�RUU[_�T__Q�cRc�SY_b�VUr�Y[U[�cR[�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQ�TSY_b�USc�][�VU_Yb[b�VU�cRVQ�Q[k����[XZbVUX�cR[�Q[SUb�Q_ST�bVddYQVUX�nSnY_cVSUq�Vc�TQ�nZ[pVfSYQ_a�QRSTU�cRc�cR[�nZ[Q[U[�Sd�]VUbVUX�QVc[Q�U�][�b[c[c[b�Q�U�±[dd[cVp[�bVddYQVSU�S[dg�V[Uc²k�­������®��lRVQ�[dd[cVp[�bVddYQVSU�cRYQ�Z[d[ZQ�cS��Q_STVUX�bSTU�Sd�cR[�VUVcV__a�YURVUb[Z[b�bVddYQVSU�bY[�cS�]VUbVUX�[p[UcQk�°ST[p[Zq�cRVQ�TSY_b�USc�U[[QQZV_a�[mn_VU��bVQcVUc�Q[SUb�nSnY_cVSUq�]Yc��X[U[Z_�b[Z[Q[�VU�cR[�S]Q[Zp[b�e[U�bVddYQVSU�S[dg�V[Uck�tUc[Z[QcVUX_aq������������bS[Q�USc�QRST��_[Z�cZ[Ub�dSZ�cR[�bVdd[Z[Uc�Qen_[Q�VU�SUcZQc�cS����}��~���k�td�cR[�S_VXSUY_[ScVb[Q�b[XZb[bq�Z[QY_cVUX�VU�cR[�nZ[Q[U[�Sd�QRSZc[Z�_][_[b�dZXe[UcQq�SU[�TSY_b�[mn[c�cS�g�Ub�dZXe[UcQ�TVcR�RVXR[Z�baUeVQ�SenZ[b�cS�cR[�VUcc�bSY]_[fQcZUbQk�³[�cRYQ�ccZV]Yc[�cR[�S]Q[ZpcVSU�Sd��Q_ST�bVddYQVSU�S[dg�V[Uc�USc�cS�cR[�[mVQc[U[�Sd��bVQcVUc�Q[SUb�Q_ST�bVddYQVUX�nSnY_cVSUq�]Yc�ZcR[Z�cS��e UVd[QccVSU�Sd�cR[�VUR[Z[Uc�R[c[ZSX[U[Vca�Sd�cR[�Qen_[Q�Z[QY_cVUX�VU��pZVcVSU�Sd�cR[�bVddYQVSU�S[dg�V[UcQk�­��\¢��®�����)�µ/2;3098/2��tU�SU_YQVSUq�cRVQ�QcYba�QRSTQ�cRc�cR[�_SbVUX�][RpVSZ�Sd�S_VXSUY_[ScVb[Q�VUcS�vªjf|«�nZcV_[Q�ZVcV__a�b[n[UbQ�SU�cR[�QYZd[�dYUcVSU_VxcVSUk�¶UdYUcVSU_Vx[b�Ub�aUSnZSna_fdYUcVSU_Vx[b�vªjf|«�SY_b�USc�][�_Sb[b�TVcR�QV�ijk�³[�ccZV]Yc[�cRVQ�][RpVSZ�cS�U�YUdpSZ]_[�Z[nY_QVp[�VUc[Z cVSU�Sd�cR[�U[XcVp[_a�RZX[b�QV�ij�TVcR�cR[�U[XcVp[�RZX[�b[UfQVca�Sd�cR[Q[�dYUcVSU_�XZSYnQk�°ST[p[Zq�TR[U�b·YQcVUX�cR[�QYZd[�nS_ZVca�Sd�cR[�nZcV_[Q�]a�ScVUX�cR[�RUU[_Q�TVcR�eVUSnZSna_�XZSYnQq�cR[�Z[nY_QVp[�VUc[Z cVSUQ�X[c�Z[bY[bq�dYZcR[Z�RabZSX[U�]SUbVUX�QVc[Q�Ub�dpSZ]_[�¡SY_Se]V�VUc[Z cVSUQ�Z[�VUcZSbY[b�Ub�cRYQ�cR[�nZcV_[Q�][Se[�` [QQV]_[�dSZ�QV�ij�Ub�U�][�_Sb[bk��SZ[Sp[Zq�cR[�vªjf|«�nZcV_[Q�SY_b�][�_Sb[b�TVcR�hij�bSY]_[fQcZUbQq�ZUXVUX�dZSe����Yn�cS��bSY]_[fQcZUb�Q[sY[U[�Sd�£��]n�VU�_[UXcRk�lR[�QcZ[cR[bfSYc�£��]n�S_VXSUY_[ScVb[�bSY]_[fQcZUbQ�Rp[��_[UXcR�Sd�]SYc�\|�Ue�VU_YbVUX�cR[�_][_Qk�lRVQ�VQ��QcZVoVUX�S]Q[ZpcVSUq�QVU[�cR[�nSZ[�QVx[Q�Sd�cR[�e[QSnSZSYQ�QV_V�Qen_[Q�SU_a�ZUX[�dZSe�]SYc� £�Uek�lR[�dc�cRc�dVZ_a�_SUX�hij�Q[sY[U[Q� U�][�_Sb[b�VUcS�e[QSnSZSYQ�QV_V����¹*=35��K)��������º»��¼�½����%�½$¾¾»¿$�%�º��¾À�º$�%¼¿�¾���¼&��¾�¿¼��%½�¿��Á�½$¾¾»¿$%��Â�»��¼$�%¿�Ã�Ä�¿¼�%½��½��������¾�¼&�����%Å �� "ÆÆ&�Ç%���È¿É "Æ�Æ�Ç%���È¿É¿$ÊË" �ÌÍÎÏFÐH ����Ñ��Ò P��Ó��������Ô��� P��Ó������ �ÌÍÎÏFÐH ����Ñ��Õ Ö��Ó�����Õ���Ô��Ò ×��Ó��������ÍÏØÙ�Ú ����Ñ��Õ P��Ó��������Ô��� ��Ó������ ��ÍÏØÙ�Ú ����Ñ��� Û��Ó��������Ô��Ö ×��Ó����������Â�ÜË" �ÌÍÎÏFÐH ����Ñ��Ý ×��Ó��������Ô��� Õ��Ó������ Þ��ÍÏØÙ�Ú ����Ñ��� ���Ó��������Ô��� P��Ó������� ÞÝ���Â�ÜË" �ÌÍÎÏFÐH ����Ñ��Ö Ý��Ó��������Ô��� Ý��Ó������ Þ��ÍÏØÙ�Ú ����Ñ��� Õ��Ó��������Ô�� Ý��Ó������� Þ×���Â�ÜË"� �ÌÍÎÏFÐH ����ß��� ×��Ó��������Ô��× ���Ó������� Þ��ÍÏØÙ�Ú ����ß��Û ×��Ó���������Ô��� Ö��Ó������� Þ

Page 175: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������

����� ������������������������� �!��"#� �$%&�$�'

((()*+,-./012*3)45 ((()6*7518*39:85(9);/,

(835</2382538=1*1<);/, >?@A�BCDEFA�GHFIJA�KLMM#�NN#��OP

��QHJFRESI�TUH?RDV�WRFX�YRZ[>�\�]$�_#�_&�����$%����&�a$����b�_&��c��_$d���e$_&�$fg"�e���h��$%� �]���_&$�ci�c��#�_&��$bb���%_�j�bi%d_$�%��$k��lm"��n�c�e�����_�$%���b_���i�b�d_�%_�����a���e����$��a��$%�oml��ibb���pc���q��P rs��%��������$fg"�p���cs�e��� ���_���d�%d�%_��_$�%��b�����t�n��������t����_����d&��b�_&��$bb���%_�lm"��n���c�� �u&�%�_&����c���e����$%di��_��b���v�&��_������_��c���_i���$%������_���$a��_&��$fg"�ibw�d$�%_�_$���_���dd� �_&��c��_$d���pd�%_�����hc��$��%_�&�e��_&�_�%��$%d������b�$fg"�j��x�i���d�%d��d�i���������a��$%$��_&��lm"��n�c��_$d����b_���_&�_�_$��s �u&��c��_$d���e����_&�%��$d��d�c$d���j�$%a�_$��_��$%�����c���d&������$������$%�_&���ibb����$fg"���i_$�% �u&��b����e$%���i������������$fg"��i����_��%�e��i�\�ny���"��z���"��z���z""�z�z�"��"uu{|rPg�vy}�vy���z��"���z��"���"zz�"�"�z��"uu{nv�ny�p�m"�����#��~__$%��%#������%js �u&���i����_��%���i�%d��e����%���j�d&��% ���GREJUYEU����IFC��\�u&��$bb���%_���$��%id���_$��lm"��n���c���e�������i����%����l�n���d�%b�d��������d�%%$%���$d��d�c��p�������$�"�s���b����e\��%�j�_&������%�x�i���d�%_�j��������e���hd$_��e$_&������g���������$__$%���_�nrv�%��_&��i�&���r�h�� v�g"��$��$����$�%�����d_$a��p��$�o��%�g��x�i��s�u&��x�i���d�%d��e��w��_�����j������� c�$__���p�]u#�z��r���nrv�|vvs�$%�d���$%�_$�%�e$_&�����%��c� �w��_���p�o�|n�s�$%������_���_�d_�_&��]f�u�x�i���d�%d��$�%���b����_&�����x�i���d�%_�j������� �u&��]f�u�$�%���e���_�d_��e$_&���c&�_��i�_$c�$�� ���BSCUJIYEIDEI�ZIEU@IJ��H�FIJ�QXUFU�SIHEXRDV��BZ>Q��GIHYCJI�IDFY�\�u&��i_$�$k��d�%b�d����_ic�$�$�%_$d���_��_&���_ic�$%_��id�����a��e$_&�_&��b����e$%��� $_$�%����__$%��b���_&��]f"o����i����%_\�$%_����_$�%�_$���c���b����\���v�� �b����}���%�e�b�����e����d�����a��j�r�}����d�%���b��������d&$%�}�d$�di��������d&$%�����$�%��b����c$h���$%�$���_�� �u&������d&$%��$_��e����d&��%���%���j����%�_�$bb���%_�c��_$d����%�����e$_&$%�_&��c��_$d���p�$_&���d�%_����j����d�����_��_&�����s �]�����d&���c����_����_��������d&$%��c�_�e�����%��jk� ��%$a$i�����d�a��j�di�a��e�����h_��d_��b�����d&�����d&$%���a�%_��%�_&�%��a����� �u&����_&���b��_���a��i�_$�%�$%������_����_�$%�x�i���d�%d����d�a��j�di�a��$��hc��$%��$%��_�$��$%�_&��licc��_$%���%b����_$�% ����[>��I�CIDEIY��UJ�BZ>Q�GIHYCJI�IDFY�\�u&��b����e$%���g"��i����_��%���i�%d��e����i�\�ny���"������"�������""�����"��"uu{|rPg�vy}�vy���u������u�������uu�����u��"uu{nv�ny�b���_&����c��g"#�ny���"������"�������""�����"����"������"���"uu{nv�vy}�vy���u������u�������uu�����u����u������u���"uu{|rPg�ny�b���_&��v���c��g"#�ny���"������"�������""�����"����"������"����u��"uu�u�"�"���uu"�u�"��uu�"uu���"���u�"uu{nv�vy}�vy���u������u�������uu������u���u������u����"��u""�"�u�u���""u�"�u��""�u""���u���"�"uu{|rPg�ny�b���_&��|���c��g"��%�ny���"������"�������""�����"����"������"����u��"uu�u�"�"���uu"�u�"��uu�"uu���"���u�"u��u�u��"��"u"�uu"�u"��u"����u��u��uuu�"uu{nv�vy}�vy���u������u�������uu�����u����u������u����"��u""�"�u�u���""u�"�u��""�u""���u���"�u"��"�"��u��u"u�""u�"u��"u����"��"��"""�"uu{|rPg�ny�b���_&������c��g"�p�m"�����#��~__$%��%#������%js �u&��c��d�i���b������$%��_&��lm"��n�c��_$d���e����$�%_$d���_��_&���b���$fg" �����0��/1782���2+/1,*78/2��licc��_$%���%b����_$�%�$��a�$������b����_&�� $��j�{%�$%���$����j����b����_&���i_&�� ������;�2/(354�5,5279��� ���������_�bi��_��" �����j�b���c��a$$%��c������ �b���]f"o��_���a��i�_$�%��%�_��� ��$d&���$�b���b�i$_bi��i���_$�%��%�$di $�% �! l ��%�u � �e����icc��_���j�_&���%_��%�_$�%�����d_���_��o�������g�%�m$�u�d&%����j�p��!�gmus �" $_$�%���j#�! l �e������icc��_���j�_&���%_��%�_$�%�����h�o��%d��f����d&�ld&����b�������di�����%�����i�����$b��ld$�%d��p��ofl��ls �]$%�%d$���icc��_�b����_&��g�%�j_�� �

������������� ������¡��¡¢£¤�£��¤¢¥£¡¢����¢��¦ �§¦�¤¢©� ª«�¬��� ¡£�¡¤ª­�®� �£¤¤��¤¢§���¥¤��¡¢¦�������¥����¡�¦¢�¦�°� �­�¡°�¢ ��¡£±¢¤¢¡ª�¢��¢¦��¡°�������� �����£¡� ¢£¤��¥��¤¦�±��� �©���±ª�²³µ«�¶� ��¡�¦ª�£¤���¦�����¡ £¡���¡°£¡�¡°��¦¢®®��¢���¦ª�£�¢¥���®��¢³· �¢��¢¦��¡°��¡���¤£¡��¹¡ £¥¡�¦��£ ¡¢¥¤���¥��¤¦�±��¡���¦�¡° ��§°�£¦¦¢�§�®��¥¡¢��£¤�§ ����«�µ°���¹�� ¢���¡���°�º�¡°£¡�¡°��¦¢®®��¢���¦ª�£�¢¥���®�¡°��»· �¥ ¢¡¢¥£¤¤ª�¦����¦����¡°�¢ �¤��§¡°�£�¦�¡°£¡�¤��§�»· ������¥����°�º�£�°¢§°� �¡��¦��¥ª�¡��§�¡�¢���±¢¤¢¼�¦�£¡�£¦�� �¡¢����¢¡���¢��¢¦��¡°���� ������¡º� ½«��¾�¦� �¡£�¦¢�§�¡°��� ¢�¥¢�¤���¡°£¡�§�©� ���¤¢§���¥¤��¡¢¦��¦ª�£�¢¥��¢��¢¦��¡°��¥°£���¤���®������� �����¢¤¢¥£�¢���®�§ �£¡�¢��� ¡£�¥��®� �¡°��¦��¢§���®���¥¥���®�¤�¦ �§�¥£  ¢� ��º¢¡°�¥��¡ �¤¤�¦� �¡£ ¦�¦� �¤�£����®�£�¦ �§��©� �£�� �¤��§�¦��� ¢�¦��®�¡¢��«�µ°��­��� ��¡�¦ª��°�º��¡°£¡������� �����¢¤¢¥£��£¡� ¢£¤��£ ��£�©� �£¡¢¤���¤£¡®� ��®� ��¢³· �¦�¤¢©� ª�£�¦�¡°£¡�¡°�ª���£±¤��£¤¡� �£¡¢©���¡ £¡�§¢���®� �§����¡°� £�ª«����¿)�ÀÁ�518,527*3��5;78/2���QJI�HJHFRUD�U��ÂI��SHFIÃBJII��Ä>ÃÅÆ�QHJFRESIY�\�u&��������c����lm"��n�c&��$d���c��_$d���e����j%_&�$k��b����e$%����c��d�i�����%�����j�$%_��id���j�!�_$j����_��� �Ç��rn��È���%���_���i���j�ld&�� ��i����_��� �Ç��r|��È��b���c��id$%�����c���i�$�$d��c&����������_�$h�b����$�bi%d_$�%��$k�_$�% �u&��i�b�d_�%_�o�i��%$d�o�v�pv ���#�c��jp�_&j��%���h$�s����c��jpc��cj��%���h$�s�P���c��jp�_&j��%���h$�s���s�e�� $��a��$%�&j��d&���$d��d$�p|����#�� n�������t���s ���_j�_�$��_&j������%$i������$��p�u"m#�� |��s�e��i������d��i�b�d_�%_�$%�d���$%�_$�%�e$_&��#v#n�_�$��_&j���%k�%��pu�m#�� v��s�����e���$%�����%_�_��$%d�����_&��c����$���_�� ��u"m��%�u�m�e�����$h��e$_&�n�����b�$_$����e�_�� �"b_���d���$%$%��_&����i��i���i_$�%�e$_&�_&���d$$d���i_$�%#��_&�%���pci��#�����s�e��� ��i%���_$��$%� �li���i�%_�j#�_�_���_&j����_&�$�$d�_��pu�{l#������s�e��� ����ce$� �u&����i�_$%���$h_i���e��_$����a$����i�j�pn����c�s��_�vn��É���b���rn��$%���b������$%��_��%b�����$%_���%��i_�d��a��po�����%_�i��%_����c�%js�b���&j��_&������_���_��%_��_�Pn��É���b�����&�i��i%���_�_$d�d�%$_$�% �li���i�%_�j#�_&���$h_i���e��_���_���_��n��É���b�����& �u&����i�_$%��e&$_��c�e���e��w��_�����i_#�e�&��e$_&�$_$����e�_���p������s��%��_&�%���pci��#�������s��%��$���_�|���É���b����%�_&�����& �]���_&��j%_&�$��b�bi%d_$�%��$k��$�$d��c��_$d��#���d��_�$%�������b��d_$�%�pic�_��������Ês��b�_&��$�$d���i�d��pu�{ls�e����c��d��e$_&���bi%d_$�%��$k��$�$d���i�d� �u&��bi%d_$�%��$k��$�$d��c��di����e���\����g��v���|�l$p{�����n�s�v��b�����$%�c��cj��#���|���n�l$p{�����n�s�v��b���c&�%j����%��g��v���|�l$p{�����n�s�v��b���dj�%�c��cj��bi%d_$�%��$k�_$�% �]�i��$bb���%_���$w�d�_$�%��b�lm"��n���_��$���e����j%_&�$k�\�p$s�i%bi%d_$�%��$k��pzgs#�bi%d_$�%��$k��e$_&�p$$s�������Ê�dj�%�c��cj��p�os#�p$$$s������Ê���$%�c��cj���Ë������Ê�dj�%�c��cj��p"o�os#��%�p$as�n����Ê���$%�c��cj���Ë��n����Ê�c&�%j��p"oo&s ���h_��d_$�%��b�_&������%$d�_��c��_��b����_&��lm"��n���_��$���e��c��b������j�&��_$%�������b�_&��e&$_��c�e���_e$d��i%�����x�ih��_�����É���b���v���$%�$%���������b�����i_$�%�d�%_�$%$%��d�%d�%_��_��&j��d&���$d��d$�p�����s��%��_&�%���p�����s �u&��lm"��n���_��$���e���c���_���j�w��_��_$�%��%�e�&��e$_&��_&�%���p������s��b_�����d&��h_��d_$�%�_�c �u&��_��c��_���h_��d_����c���e������_�$%����e&$_����$�c�e�� ���QHJFRESI�ÌXHJHEFIJRÍHFRUD�\�u&��b�i��$bb���%_�lm"��n���c���e����d&���d_��$k��e$_&�d�%%$%�����d_��%��$d��d�cj�pl��s#�%$_����%���c_$�%��%����Î���j�$bb��d_���_�j �l����$d�����c&�e������d�����%�����{���l��|n��]�d�%%$%�����d_��%��$d��d�c� �g$_����%���c_$�%����i����%_�e����c��b������%���Ïi�%_�d&�����g�a��r�����$%_�i��%_ �u&��_�id_i����b�_&��lm"��n�c�e���e���_���$%���j�i$%����ld$%_���Î�l�����c�e���$bb��d_���_���$%��ÐÑÑ���m�����m��%_�%��d�__��$%�������_�j �]����_&����_�$%��Î���j�$bb��d_����� �_&��c����_��c����$_�%d��e����d��di��_��pb����_�$�����licc��_$%���%b����_$�%s �

Page 176: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

����������

����� ������������������������� �!��"#� �$%&�$� '

((()*+,-./012*3)45((()6*7518*39:85(9);/,

(835</2382538=1*1<);/,>?@A�BCDEFA�GHFIJA�KLMM#�NN#��OP

������Q���R�����" �S �����%T��U�����#���� �" ���VW���#���V ���X��T��#���Y �Z �V ���V����#���" �S ���[\W$\]���#��_HDFA�I__A���MaaL�#��b�#��c�� �������Q��R�����Y �V ���!��\����#���S �����%���U��%T��#���d ���e���%����#���V ���[\����#���Y �Z �V ���V����#��fA�I__A�ghiEjIkA���Maal�#����m� �������Q�n�R�����e �" ���e��%��#���e �e ���[\��%���#��� �� ���o$������#��pIDI�qjIJA���KLLr�#��sb�#��tt�� �������Q�u�R������ ���V�U��#���[ �� ��������#���Y � ���d��U��#���v �� ���d��U��#��wHFA�GHFIJA���KLML�#��x�#��P� �������Q�m�R�����! �" ��� &$\�&��T��#���S �����%�����#���e �� ���"%T��y�%��#��wHFA�zI@A�{JC|�{h}Ei@A���KLML�#��x�#��u�� �������Q�~�R�����[ �� ���[�������#���" ���"U$%���#���Y �� ����&�%��#���" �d ���[�%T&W��#���X �� ���VW$��#���� �! ����&���#���e � �� ���[�&��#���e ���[\���$%���#���� �Y ������y�����#���� ��������yU$��#���� �V ����������#���Y �S ���e��U$%��#���Y ����$%��#���! ��������#���! �� ���S�]�����#���! �� ��� �%���#���� �X ���Y���y��#���� ���Z��&����#���V �� ����$y�%&��T\��#���V ���Y�������%��#���V ���!������#���V �" ���V�$����#���V ���[�$%$��yW�W��#���V �Y ��� �$%y\�$%��#���� �V ����&�%��#���S ���"��������#���[ �" ���X����y��#���[ ���e���#���[ �! ���!�$�WU��#���v ���X����%T��#���� ���!�y����y\$��#��� �� �����%\�����#���� �! ���v����#���V ���V�%�&���%��#���V �" ����$W���$%$��#���V �" ���v������#���" ���T����W�������y��#���� ���V�����&��%��#���d �S ����W��$y��#���v �e ���V�TT�%��#���V �Y ���������#��wHFA�ghi�FIEjDi_A���KLML�#��b��#���P� �������Q�P�R�����Y �[ ���X��U��#���Y �� ������\W�$��#��� �Y ���S�\&��#���V �� ������%��$����#���� �v ���!��y����#���! �e ���[�&�$\\��#���� �v � ����&W��#���e �� �����y�%��#���� � ���[&�����T��#���[ �X ���V��W���%��#���Y �X ����$��$%y��#���Y �� ���[�&��%U����#��fA�>kA�jIkA��iEA���MaaK�#��ss��#����tnu� �������Q�t�R������ �v ���!��y����#���V �� ������%��$����#��� �Y ���S�\&��#���� �� ������\W�$��#���Y �[ ���X��U��#��wHFCJI���MaaK�#����x�#��P��� �������Q�c�R�����e �� ���o&����#���Y �� �����%���#���� �[ ����W���#���Z ���V���y&��#���� �� ������T�$�Uy�%��#���X �� ����&���U���#���� �e ���[\W�U���#���EhIDEI���Maa��#��b�x�#��mut� ������Q����R�����e �� ���o&����#���� �[ ����W���#���Y �� �����%���#���X �� ����&���U���#���� �e ���[\W�U���#��fA�>kA�jIkA��iEA���Maa��#��sb��#��~�u� ������Q����R�����[ �Y �� ���X$��$%����#���� �Y ���V�!$�����#���V ���[&�\%��$��#���� ���!$���#���� ���d�\U����#���e ��� ����$�����#���v �Y ���d$%%���$���#��fA�>kA�jIkA��iEA���KLLr�#��sb��#��tuc� ������Q���R�����e ���� �e����y��#���V ���e��y��#���X �� ���[��y��#���d �" ���Y����y��#��jIkA�zI@A���KLLK�#��s�b�#��n~�m� ������Q��n�R������ ���S���$%��#���S ���[�&�$T\��#���V ����������#��>D|I�A�jIkhI��DFA��?A���KLL��#�����#��m��� ������Q��u�R�����Z ���d�\U����#���Z ���[\��U��#���v ���X�$%��#��fA�j�}A�jIkA�g���KLLr�#��s�x�#����PnP� ������Q��m�R�����X �������#���V �� ���v�WT��W��#���e �V ���"%\�%���$��#��>?@A�GHFA���KLLM�#��s��#��m~�� ������Q��~�R�����e �Y �����\\��#���Z ���d�\U����#���V �" ���V���$y��#���X ���d��\y�&�U��#���v ���X�$%��#���Y �e ��������y��#��fA�>kA�jIkA��iEA���KLL��#��sb��#��nc�� ������Q��P�R������ �" ���V�%���#���V ����W���#���v �" ����$���#���� �� ���o&����#���� ���v���%�$��#���Y �� ���[\�TT��\��#���Y �� ���o$%U��#���" �� ���Z����#��fA�>kA�jIkA��iEA���KLML�#��s�b�#���~c�� ������Q��t�R������ �����WT���#���� ����%���U���#���" ���[�W����#���e ���"��$��\��#���� ���X��W�&����#���Y ���S�T�����#���v ���X�$%��#��wHDi��IFFA���KLML�#��s��#��utu� ������Q��c�R�����" ���[�W����#���" ���[�&��yy��W����#���Z ���SW\&��T\��#���� �����WT���#���v ���X�$%��#���� ���X��W�&����#��wHDi��IFFA���KLML�#��s��#��n~tu� ������Q���R�����v ��������T��#���� ���YW%���#���Y ���V$�&���$y��#���� ���X��W�&����#��wHDi��IFFA���KLLa�#��x�#��tPP� ��

�%$\$�\$���VW%$�&��Z�V�#�X$�����$%��Z�\���U��X�Z��VW%$�&#���$[�y��XVX����%T�\&��[�X�Puc��e����$y����\��W������U%����T��T �����S���$��T��YW%���P#����dW��$y&�T��%�$%���� ����Q���R�����e �d �������$y��#���� �� ���o&����#���Z �V ���!&�y&����#���� �" ���!&�\$���#���Y �� ���[\�TT��\��#���Y �� ���o$%U��#��fA�>kA�jIkA��iEA���KLLa�#��s�s�#���~t~� ������Q��R������ ���S����#���v �� ����&W��&�%yU����#���e �Y ���X&����$��#���� �� ���dWT������#���S �" ���V$y\��\\���#���Z ���!�W���#���d �Z ���d��y�T��#��JiEA�wHF_A�>EH?A��EhA���>���KLLr�#��s�b�#��Pc� ������Q�n�R�����[ ����$�$��#���X �� ���v����%��#���� �[ �� ����$%��#��wHDikI?A���KLL'�#��b�#��cc� ������Q�u�R�����[ ����$�$��#���X �� ���v����%��#���V �d ���[\�����U����#���� �[ �� ����$%��#��>D|I�A�jIkhI��DFA��?A���KLLr�#�����#��m�nt� ������Q�m�R������ ���v��%����#���X �� ���v����%��#���� �[ �� ����$%��#���! ��� �%���#��wHFCJI�wHDiFIEjA���KLL'�#��b�#��cm� ������Q�~�R������ ��������#���Y ����W��#���V ����$�%���#���� ����W���#���o ����$��#���Y �� ���o$%U��#���� ���v���%�$��#���kH__���KLML�#����#����tm� ������Q�P�R�����e ���" ����T��#���e �� ���!�������#���Y ���[�&��yy$%�����#���� �����y�%��#��� � ��� �����#��ghi�¡j�}A�fA���Ma'��#��s��#����mm� ������Q�t�R�����e �� ���!�������#���e ���" ����T��#���Y ���[�&��yy$%�����#���� �� �����y�%��#��� � ��� �����#��ghi¡j�}A�fA���Ma'��#��s��#���n�m� ������Q�c�R�����v �! �� ���V���$y��#���[ ���� �e��[��T\��#���d �����%���y\���T\��#���Y ���e����y\����#��jHJkA�zI}A���Maaa�#��s��#����mn� ������Q�n��R�����" ���[����$��#���� ���e�¢%���#��jIkA��D|A�fA���KLMM�#��s���#��uum� ������Q�n��R�����Y �� ����$���#���Y �" ���X����#���[ �� ������%���#���! �� ���[�%���#���Y �! ���Y��%��#���� �[ ���!���#��fA�wHDi}EhA�wHDiFIEjDi_A���KLML�#��s��#��c�� ������Q�n�R�����[ �S ���o&�%���#���� ���v����#���o �� ����W��#���Y �� ��� �%���#���� �� ����$W��#���� �� ��� �%��#��GhEJi¡A�GI}i¡A�GHFA���KLML�#��s�s�#���PP� ������Q�nn�R�����S ���V������\y��#���V �X �Y ���S�������y��#���! �����W\&���T��#���V �����%�[��������U��#���� ���e����������#���Y �" �� ���Y��������#���� �����%�T�%�V��\����#���d ���"W�Wy\$]%y��#���Y ������U�%y��#���Y �" ���V��\�%y��#��j�}A�jIkA�jIkA�j�}A���KLMM�#��s��#��P�~� ������Q�nu�R�����v ��������T��#���� �" ���V£&�y\�$%��#���Y ���X���&$%�����#���V ���S$�T������#���� ���"��%$\y�&��#���S ���!�&%��#���! ���d�%�����#���! ���V£���%��#���Y ���V$�&���$y��#���� ���X��W�&����#���v ���X�$%��#��jIkA��CJi¡A�fA���KLLa�#��s��#���~~�� ������Q�nm�R�����" ���o£�%����#���Y ���!$�y\�$%��#���V ���e���$%�����#���� ���X��W�&����#���v ���X�$%��#��wHFCJI���KLL'�#������#��P�m� ������Q�n~�R�����Y ���!$�y\�$%��#���X ���d��\y�&�U��#���� ���YW%���#���S ���X���%��#���v ���X�$%��#���� ���X��W�&����#��wHFA�GHFIJA���KLL'�#����#��n�n� ������Q�nP�R������ ���YW%���#���Y ���!$�y\�$%��#���X ���d��\y�&�U��#���v ���X�$%��#���V ���XWTT���#���� ������%U��#���! ���V£���%��#���Y ���V$�&���$y��#���� ���X��W�&����#��fA�>kA�jIkA��iEA���KLL��#��s���#���~nt� ������Q�nt�R�����V �X �Y ���S�������y��#���� ���e����������#���� ���¤]$�$��#���X ���VW�y��#���X �� ���[��y��#���d �" ���Y����y��#���� ���� �e��[�&�������#���e ���� �e����y��#���Y ������U�%y��#��JiEA�wHF_A�>EH?A��EhA���>���KLL'�#��s���#���~�n� ������Q�nc�R������ ���e����������#���X �� ���[��y��#���e ���� �e����y��#���Y ������U�%y��#���V �X �Y ���S�������y��#��jIkA��iEA�zI@A���KLML�#���x�#��uP�n� ������Q�u��R������ �" �Y ���S�$\y��#���Y �Y ���Z���]�y��#��wHFA�I__A�ghi_A���KLLM�#����#����um� ������Q�u��R������ ���e����������#���V �X �Y ���S�������y��#���� ���X��\&������Wy�%��#���! �� ����$%��#���d ���e�T��U����#���d �d ���d�y�����%���#���d �" ���Y����y��#���e ���� �e����y��#���Y ������U�%y��#���X �� ���[��y��#��>D|I�A�jIkhI��DFA��?A���KLML�#���x�#��c�t� ������Q�u�R�����V ���d��%%$�����#���� ������������$��#��jIk j�}jIk���KLLL�#��s�#����� ������Q�un�R�����" ����$%y\�$%��#��>DDA�j�}A�gIJ_hD���MaLr�#��s��#��muc� ������Q�uu�R�����X �� ���[����W���#���S �� ���d�����#���e �" ���[\��������#���Y �� ���V�Z������#��ghi¡j�}A�fA���KLLl�#�����#��nuPn� ������Q�um�R�����" ���!�\$�����#���[ �����T����#���d �� ���[�$�%$�\$y��#���Z �� ���d$%\���#��fA�jJikHFi|JA�>���KLL��#��ssbb�#���n� ������Q�u~�R�����" ���[�&��yy��W����#���e ���[�&�����\��#���Y ���!��&\��#���� ��� ��%����#���v ���X�$%��#��fA�>kA�jIkA��iEA���KLL��#��s���#���mmt� ������Q�uP�R�����[ ���X�W%�W����#���d �� �������\\��#���� ���v�������#��fA�>kA�jIkA��iEA���Ma¥��#�����#��n�c� ���

Page 177: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

���������� ��������������������������� �����!����������!��"#$$� %&�����!��!'������!'���()�*&!+�,�����-.�/$#�$##"0123456788789:;<=>?@=AAB>CDEFG=HBAB?IJ3JABC=>KLAF=?B2FMN>DEFO1>=LE1>>FAMJ3GFM=P=@=KMQBABL1RSTUVWXUYZ[\]WY_YUaaXbcWd[ebfdSg_gWSZWd[VUfbd_WdTWYYW[hWSgdS_VWUgbdZf[RUTbaiWSg[jbgZk dSafUlidmc_YWj

Page 178: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��

������������ ������������������������������������������������ ���������!����!���� ������ �"���� � ����!� �#$�%&'(�)*+(,-.�/0*,�123,(44+56*7.�8597&:�123:*&-*7.�)(9357�123*7'*,,*3.�;*&:7&23�)*(:357-9.�%3('54�<*&:=�>?@�A37&49(B3�<7C623,*=��DEF�GF�HIJKL@.�DEF�MF�NOPLKQQJ>RIE.�SEKTF�GF�#IU?.�SEKTF�VF�#EWROPLI�VI?XIE�TKE�Y>?KQOUI?OI�ZVIYN[�>?@�VI?XIE�TKE�\?XI]E>XI@��SEKXIU?�NOUI?OI�R?UOP�ZV\SN [�HR@_U] >aUbULU>?Qc?UdIEQUXWX�e?OPI?��DIf>EXbI?X�KT�VPIbUQXE$�#RXI?>?@XQXE>gI�hh�ihjkk�R?UOP.�lIEb>?$�mb>ULn�OPEUQXKfPFJE>IROPLIoORfFR?UbRI?OPI?F@Ip�JIU?oLbRF@I���qF�NOP?IU@IE.�DEF�HF�NOPIEbILLIP�HR@_U] >aUbULU>?Qc?UdIEQUXWX�e?OPI?��DIf>EXbI?X�KT�#UKLK]$�lEKgP>@IE?IE�NXE>gI�r�irhsr�SL>?I]] >EXU?QEUI@.�lIEb>?$��SEKTF�tF�HIK?P>E@X�VI?XIE�TKE�Y>?KQOUI?OI�ZVIYN[�>?@�VI?XIE�TKE�\?XI]E>XI@��SEKXIU?�NOUI?OI�R?UOP�ZV\SN [�HR@_U] >aUbULU>?Qc?UdIEQUXWX�e?OPI?��DIf>EXbI?X�KT�#UKLK]$�lEKgP>@IE?IE�NXE>gI�r�irhsr�SL>?I]] >EXU?QEUI@.�lIEb>?$��

Page 179: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��

������������ ����� ������������������������������������������������ !�"�#$��%�" &&��'��(���)�& �)������*+$,�-.�)��&�����) (!�-)�/����"����� !�"0��1���2���$��$2����" )��!'�)3�45$,�-.�)3�'�!����!����'�-'.-���"��)�&�--�/)6�� 78 9:;<=����>8?@AB�C��458 7DEFG5H�I�����JKL�J�M����������M�N������ ���� ���L�1���'����'��� )� '�2��������)�7��!"�����2���$��$2����" )��!'��453�/� '��'�!����'�-'.-���"�&��������*+$,�-.�)����� !�"��%�#$��%�" &&��'������%3�����"�2 '��"0���IO�������������������������������PIQRST����������������������������U����1���). ��� - �%��&������VW1�) (!�-��)��!� !" '�����&���) VXY�)��� - �%� )�"���!)�����"� !�'�!���-����).����!��/�����) VXY�/�)�"�(��"�"�����.(��"�'���)�"�2Z�[� (.���\�]0�!-%�����Y11 �_��"%��-���-�/�)��a' ��"����_b�!���!"������"%��-���-)�Y11 �_���!"�Y11 �cbdX�/����"���'��"�) �.-��!��.)-%0�e.�-$-���-�"�) VXY��a' ��"��%�����(���!�-�)���- (���)��/)��� )) �!� !�����&��$��"���!(��".������VW1���������''�2����"%��Y11 �cbdX��.��!���� )) �!��&�����"�!���Y11 �_�� !�����%�--�/���!(�� !����.&&���"�)�-.� �!����2Z�d�[� (.���\��]0�f!�'�!���)�3��&���� !".'�"�"�!��.��� �!��%��"" � �!��&��%"��'�-�� '��' "3������VW1�) (!�-� !�����&��$��"�"���'� �!���!(��" )�22���)�/� -��%�--�/��� )) �!��&�����Y11 �_��"%�����22���)�[� (.���\��]0���

Page 180: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��

��

������������� ������ ������������������ ������������ ���������������������������������� ������������� ! �"# #$�%&'()�&*%&$#��+&*,-.,-/ !�01�+, �23��*$�-4#*/ !�01�+, �23�0)5543�6�*78&,*� &9#$�:;)!<1�-�.8&7 #%=�> �,.#%7#*7#�%&?*� �,6�)@@A�1�B�$,*,.��*$�)@@A�CDE(��77#-8,.�$/#��8�-F�E�0�3��*$��8�-F�<�0"3=�)68#.�$#7.#�%&*?�84#�-F�84#�>'G@�%&?*� �,6�84#��77#-8,.�$/#�$&%�--#�.%�7,+- #8# /�H4& #�84#�$,*,.�6 �,.#%7#*7#�&%�.#7,I#.#$�&*$&7�8&*?�$#?.�$�8&,*�,6�%&'()�"/�$#*�8�.�8&,*=�@4#�&*8#*%&8/�%7� #�"�.��-- &#%�8,�� �-�*# %=�J���������K���K��������������LM������GI� ��8&,*�,6�>')5�8&+#�%#.&#%�0%##�N,I&#�<3�H�%�-#.6,.+#$�H&84�O+�?#PQ<R��*$���8,+�8#$�-.,7#%%&*?�"/���%#8�,6�%# 6!$#I# ,-#$�+�7.,%=�@4#�&+-,.8#$�&+�?#�%#.&#%�H�%�6&.%8�7,*I#.8#$�8,�S!"&8��*$�T��%%!6& 8#.#$�0B�-&U# �.�$&�%3=���8�%#8%�H&84� �8#.� �$.&68�,6�-�.8&7 #%�$�.&*?�.#7,.$&*?�H#.#�7,..#78#$�"/�&+�?#�.#?&%8.�8&,*��%&*?�84#�VWXYZ[\]�- �?!&*�,6�O+�?#P=�(#U8�6,.�� �&+�?#%�,6�84#�8&+#�%#.&#%�+#�*�6 �,.#%7#*7#�&*8#*%&8&#%�H#.#�#U8.�78#$�6.,+�84.##�.#?&,*%�,6�&*8#.#%8�0'AO%3_�84#�" #�74#$�.#?&,*�03�84#�8,8� �-�.8&7 #��.#��0a3��*$���"�7b?.,�*$�'AO�,�8%&$#�84#�-�.8&7 #%=�@4#�" #�74#$�.#?&,*�H�%�$#6&*#$��%�6, ,H%_�84#�&*8#*%&8/�,6���7.,%%!%#78&,*�84.,�?4�84#�%-4#.&7� �" #�74#$�

Page 181: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

� ���

��

������������ ���������������������������������������������� ������� ������������ �������������������������������������� ��������������������� ������ ��!"������������������������������������������������������#��������������������������������������������!��� ������������� ������������ ��������������������$�������������������������� ��% ���������������������������������������� ��������������������������&�����$������� ������������'��� ����� ���������������� ����������������(�� ������� ������������&)*+,-./012 &,3 ��������������������������� �������������������������������� ���������� �����������������% ������������������������������4��4��% �������������������������������4��4������������������������������������������(�� ��5��� ������������������������� ���������(�� �� ��������������������������� ��������������������������� �(�����% ���#���������������������������(�� ��6����7���������������������������������8�����'������������������������"���������6�9����������������(�� ������&�����$������������#�����������������(������������������:�����������(�� ���;��������������������������������� ������������������������ ��������(�� ������<�������(��������(�� ����������������������������� �������������(����� �(���������������������������(����������������=6�����(�� �������(����� �(����>?@AB�C��D7E���������� ��4���������DF7�������������������4�����������4��:�G�:�����H"��7EE�"�� ���������#���I<74=:������������ �

Page 182: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��

��

������������� �������������������������������������� !���������������!����"��#������$��%�� �$�������#���&%�' �����%��(��#��"�)�� )���"�&�)��%*��������������� !����"���)�#�!����&���!! "��+�,#��"���)� !�������#�!�-��.�#�!�&���������� ����&%�/��)����01�234567������ ��#����)�&�������&%�8� "9�!�!5:7�����;�<�))%+5=7�����#����))�-��(�9���(��9#��#��"���)�-�))�&����!���&������&����+��>�����!������#��9#���&)���#��(��$�����!���!�"9)������$��!�&)�����!�?���������������-��#��#�������@ABCD*�-#����@��!��#����������!���������ABCD��#��&)���#��(������!��%��������������9�!������C+�,#������������������� �&)���#����) ���9#����EBCFGD������9�!������C������"��G��!�(�$���&%��� HEBCFGDHG IJ@ABCDEBCFGD� K8LM��� ������#��&)���#��(�����#�!�9�!�����+�8�����*�������� !�����!��!! "��+�/�����&)���#��(�-��#���������!��)�(#��9 )!����������"�������$�)�N*�-#��#�����!����&��!#������"9���������#���#��������!�������� !������"�!*��#����������������9����)������#���) ���9#��������#��&�(�����(�����#������$��%�9#�!��KGIOM��!�(�$���&%��� EBCFPDIEOQRS�TJ@NABCDU� K86M��-��#��#��������)�#�"�(���� !��) ���9#������������������EO+�V'+�86��!��#��!�) ���������#�������������)�V'+�8L+��W���!�"9)����%*��#��X�"� ��Y����&)���#��(���� ���������"��N��!���9��!!���&%���9���"�����Z��� Z[@NABOD� K8:M��/!! "��(���\� !!����)�!��������!��%�9����)�*�ABCD�����&��-��������!��� ABCDI]_OabcdefJ Cag h� K8=M��-��#�ag�#��#�)�?-���#����ci�#��(#������_O�#������)�)�!���9�-��+��

Page 183: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

� ���

��

�������������� ������������������������������������������ ����������������������������������������������������������������� ������������ �������������������������������������������������������� ���������������� ��� !" #$%&������'&�����$��������(&����� )*+,�������&��������� ���������� ������-����./��*0��� �./��*+� �����������������������������������������./��*1� ����������������������������������������������������������������������������2��� ���3�� �������������/������������������������������������������������������������������������ ��������������� ���������������������4������ 56��78 58 !49:6��78 � )*�,��3��� �����������������������������������������������3���������������������� ���������8;$��������������� <=�8 !>?@AB��� 6=��78 CD�� )*E,�������6=��78 �������������������./�����������FG ���� ��������������� ���������������./��*1��3������������?���������� �����������/����������� ���� �@���������������������������������������� ���������������������������������������������������������������������������������� ������� �������������������������������������������� ��������������������H=�8 ��� H=�8 IJ<=�8 K<=�$ LJ<=�M K<=�$ L� )*N,��O���� �������*��������PQR������������������������������������������������������������������� ���� ������������������ �������

Page 184: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��

��

� �������� ��� ����� �������� ������ ��������������� !"��#� ���$%"&'&�"�(�))�*�'+!,-&%!)� !"���� ���. /01 � ��23���'%��"&''+)&%!�&!�-�%�"&$�!)&%!)4�5!�-�&)�'%�$�-���'� ,-&%! *���,%6��7�,+�6��&)�&!"�8�!"�!-�%'�-���9*� ,�&!:�8 � $�-���;4�<�&)���,%6��7�$%"�*�"�),�&9�)�-���" - � ))+$&!:�%!��8%8+* -&%!� !"���!,��%!��"&''+)&%!�,%�''&,&�!-�04�=,> **7?@A� " 8-�"�-�&)�'� ,-&%! *���,%6��7�,+�6�B�- C&!:�&!-%� ,,%+!-�'� ,-&%! *�9*� ,�&!:B�DEFE�%!*7�8 �-�%'�-���$%*�,+*�)� ���9*� ,��"B���&,��&)�,*%)���-%�-����� *�)&-+ -&%!4��� �����#�G�G��� ��� ����� ������#� ������ ��22��������G�&)�-���9*� ,��"�'� ,-&%!4�<�&)�$%"�*�, !�-��!�9��'&--�"�-%�-���" - �)�-B�&4�4B�-���'*+%��),�!,����,%6��7�,+�6������4�<���$%"�*�%'�HI4��22���I+&��)�-���8 � $�-��)�G� !"�-���.��)���HI4��23��-� -���)+*-�'�%$�-����6 *+ -&%!�%'�-����J8��&$�!- *�" - 4��K%��-�%�"&''+)&!:�8%8+* -&%!)�HI4��22�9�,%$�)��� �����#�G�GLMNO� ��#� PQ��O ��#�P��#O ��#�PR�SOGLMNO� �� � PQ��O �� �P��#O �� �PR�GLMNO� ��#� PQ��O ��#�P��#O ��#�PRP���#����ST�� ������#���U� ��2V����&-��-���-�%�"&''+)&%!�,%�''&,&�!-)�0#� !"�0 4�<���)+8��8%)&-&%!�8 � $�-���S�,%!-�%*)�-�����* -&6��,%!-�&9+-&%!)�%'�-���-�%�8%8+* -&%!)4����WXY�Z[\]]�_a�bcddefcXg�haheij_caXf�5!�K&:+����k� !��J�$8* �7���,%6��7�,+�6��%'�)&l>m�"&''+)&!:�&!)&"�� !� $&!%8�%87*n� !"�,7 !%8�%87*n'+!,-&%! *&o�"�8 �-&,*���9* ,C�)8%-)��&)�)�%�!4�K&--&!:�-���" - �+)&!:� �$%"�*� ,,%�"&!:�-%�HI4��22� ))+$&!:�%!*7�%!��"&''+)&!:�8%8+* -&%!��9*+��*&!���&)�!%-�)+''&,&�!-4�5!�,%!-� )-B� �$%"�*� ,,%�"&!:�-%�HI4��2V� ))+$&!:�-�%�$%9&*��8%8+* -&%!)�

Page 185: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

� ���

��

������������ ��������������������������� ���������������� ��� �������� ������������������������������� ���������������������������� ����� ��������������������������������� �������������������������������!�"���������������� ���������������������� �#����$%������������ �������� ���������&'()*+�,-.�/010�234+5'6(�7'18�36+�064�173�4'99):'6(�;3;)501'36:.����������� �������������������������������<������� ������!=��������������������>��������?��������������>��%�����?���"@"� ��������A����B�>$C������������������������� �����������������������������#����$$������������������ ������������������������������������������������#����$%��������������� ����������������������������������������������� ������������������������DEF� GHHIJKKLMNOPQRSOQPGOTSUKPVK�DWF� XO�YZ[\LS]�XO�_O�SII[\�aO�bcG\[MMPQT[L�_O�_\MSQ�dO�dO�d[NN�efghijk�l�mnop�qr�EsttO�DuF� XO�vO�bSwxIyMPM�efghijk�l�mnz{�|q�}tO�D~F� aO��O�vc�y\\�����ig�������efg�����z����uW}O�

Page 186: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

��������

��

�������� ��� ������������������������������������������������������ ��!���"�#$����%���&��&���

Page 187: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells
Page 188: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

179

Page 189: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

180

Page 190: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

181

Page 191: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

182

Page 192: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

183

Page 193: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

184

Page 194: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

185

Page 195: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

186

Page 196: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

187

Page 197: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

188

Page 198: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

189

Page 199: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

190

Page 200: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

191

Page 201: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

192

Page 202: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

193

Page 203: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

194

Page 204: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

195

Page 205: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

196

Page 206: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

197

Figures

Figure 1

Figure 2

Page 207: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

198

Figure 3

Figure 4

Figure 5

Page 208: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

199

Figure 6

Page 209: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Feilke et al.

200

Page 210: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Manuscript under review

201

Page 211: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells
Page 212: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

203

3. Discussion

Although Dnmt1 has been studied for over 25 years (Bestor et al., 1988), the detailed regulation of

maintenance DNA methylation still remains to be elucidated. Especially the cell cycle dependency of

the regulatory interactions increases the complexity considerably. In order to gain new insights into

the regulation of DNA maintenance methylation, we set out to dissect the cell cycle-dependent

dynamics of Dnmt1. Our approach of combining FRAP with kinetic modeling enabled us to get

quantitative insights into the binding processes. Furthermore, FRAP and related methods enabled us

to analyze the dynamics of the factors Uhrf1, Uhrf2 and the histone variant H2A.Z. Emphasizing the

methodological aspect of this work, we also developed new strategies to label DNA sequences in living

cells, characterized nanoparticles as vectors for nucleic acids and detected new interactions of the cell

cycle regulator NIPA.

3.1 Spatio-temporal dynamics of epigenetic factors

3.1.1 Cell cycle-dependent localization and kinetics of Dnmt1

In order to dissect the cell cycle-dependent regulation of Dnmt1, we obtained detailed temporal and

spatial information using FRAP in combination with kinetic modeling as well as 3D-SIM super-

resolution microscopy (Schneider et al., 2013). By analyzing GFP-Dnmt1 mutants, we showed that

both the PBD- and the TS domain-mediated interactions are necessary and sufficient for the

localization and the dynamics of Dnmt1 in S phase. In early S phase, binding of the PBD to PCNA

predominates. In late S phase, we observe a shift towards the TS domain-mediated binding to

constitutive heterochromatin (Figure 10). Based on our customized kinetic model that will be

discussed in 3.2.2, we estimated the mean residence time (Tres) describing the average binding time of

the PBD and the TS domain to their targets. The Tres was about 10 s for the PBD and about 22 s for the

TS domain. The short Tres indicate transient interactions, which are in the range of the binding

behavior of many nuclear proteins (Phair and Misteli, 2000, Phair et al., 2004b). Transient interactions

facilitate the fast reaction of nuclear processes to external and internal signals. Based on our

measurements, we propose a two-loading-platform model, in which PCNA and constitutive

heterochromatin function as relatively immobile platforms during S phase. Furthermore, the

interaction of the TS domain with constitutive heterochromatin is stronger than the interaction of the

PBD with PCNA. If the specific heterochromatic marks, the TS domain binds to, are in close proximity

to replication sites, Dnmt1 binding is shifted towards heterochromatin, a situation mainly

encountered in late S phase and presumably in G2. In early S phase, these heterochromatic sites are

sparse, not accessible or distant to replications sites and therefore the interaction with PCNA is

dominating. Besides specific binding partners, modifications changing the conformation of Dnmt1

might also be involved in the switch observed between early and late S phase. Several modifications of

Page 213: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

204

Dnmt1 have been reported, such as acetylation, ubiquitination, phosphorylation, methylation and

sumoylation (Du et al., 2010, Lee and Muller, 2009, Esteve et al., 2011), but their cell cycle-dependent

appearance has to be further investigated. Furthermore, it is still uncertain, whether DNA methylation

takes place on unpacked DNA or on DNA wrapped around nucleosomes. In vitro and in vivo studies

give indications that Dnmts methylate mainly unpacked DNA, but to some extend Dnmt1 also seems

to be capable of methylating specific sequences in nucleosomes (Felle et al., 2011a, Okuwaki and

Verreault, 2004). The latter might function as a mechanism in G2 ensuring complete maintenance of

methylation, if the process of maintenance methylation is much slower compared to replication and

not enough Dnmt1 molecules can be recruited to unpacked DNA. Slow DNA methylation would result

in hemimethylated sites in G2, which could explain the association of Dnmt1 with constitutive

heterochromatin, which is CpG rich and replicates late, in this phase (Easwaran et al., 2004).

Figure 10: Two-loading-platform model for Dnmt1 in S phase. Dnmt1 binds via the PBD to PCNA and via the TS domain to

constitutive heterochromatin. In early S phase, the interaction with PCNA is dominating. In late S phase, the specific

heterochromatic marks, the TS domain binds to are present in close proximity to replications sites. This leads to a stronger TS

domain-mediated interaction that dominates the Dnmt1 dynamics in late S phase.

Moreover, we identified another MC for Dnmt1 with a mean residence time of about 10 s present in

all analyzed stages, including G1/late G2, when the Dnmt1 localization is diffusely distributed in the

nucleus. This MC even persists in Dnmt1 mutants, where several regions are affected. In addition to

mutations in the PBD and the TS domain, neither mutations in the ZnF (Frauer et al., 2011) nor N-

terminal truncations (unpublished data; bachelor’s thesis Anna Ulraum) resulted in faster kinetics in

G1/late G2. Although we cannot exclude a specific, S phase independent interaction with for example

chromatin, we attribute this fraction to anomalous diffusion in the nucleus. The common

phenomenon of anomalous diffusion is further described and discussed in 3.2.3.

Page 214: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

205

In addition to the temporal information, we analyzed the spatial distribution of Dnmt1 wild type

(Dnmt1wt), a TS domain mutant and a PBD mutant in late S phase. Using super-resolution microscopy,

we found that the Dnmt1wt localization is extended towards constitutive heterochromatin outside

replication foci, if the PBD is mutated (GFP-Dnmt1Q162E). Interestingly, only a part of the chromocenter

is covered. Based on pulse-chase experiments with the replication marker EdU, we hypothesize that

the regions GFP-Dnmt1Q162E binds to consist of postreplicative heterochromatin containing the direct

binding partner of the TS domain. The identity of this binding partner is still controversial and further

discussed in 3.1.2. In addition, these results could point to a competition between the PBD mediated

binding to PCNA and the TS domain mediated binding to postreplicative heterochromatin. This could

explain the enrichment of Dnmt1 at constitutive heterochromatin in G2, when the replication of DNA

is completed. PCNA would then be distributed diffusely in the nucleus and the TS domain could recruit

a larger fraction of Dnmt1 molecules to constitutive heterochromatin.

An interesting question is how the interactions of the PBD and the TS domain influence the catalytic

activity of Dnmt1. We obtained first insights into this question by performing a trapping assay, in

which Dnmt1 is covalently bound to 5-aza-dC (see 1.4.2) (Schermelleh et al., 2005). The results

confirmed that the PBD is not essential, but enhances the probability for the covalent complex

formation by approximately a factor of two (Schermelleh et al., 2007). If a central part of the TS

domain is removed (GFP-Dnmt1ΔTS), trapping is still possible in vivo, but the kinetics are considerably

decreased. This finding is in accordance with the fact that a radioactive assay revealed that the methyl

group is still transferred to DNA in vitro (PhD thesis, Qin, 2011). However, this mutant cannot rescue

methylation in Dnmt1 knockout ESCs indicating that the functional TS domain is essential for the

maintenance of methylation in vivo (PhD thesis, Qin, 2011). Taken together, GFP-Dnmt1ΔTS seems to

be incapable of significantly restoring and maintaining methylation levels over several cell cycles in

vivo due to its slow catalytic reaction kinetics.

3.1.2 Dynamic regulation of Dnmt1 by cofactors

Although we demonstrated that the TS domain is required for the correct localization and kinetics of

Dnmt1 in S phase, the direct heterochromatic interaction partner of the TS domain remains unknown.

Most likely the interaction partner is Uhrf1, however, it is still debated, whether it is the direct

interaction partner of Dnmt1. It has been reported that in vitro Dnmt1 and Uhrf1 interact via the TS

domain (Frauer and Leonhardt, 2011, Bashtrykov et al., 2013, Achour et al., 2008, Felle et al., 2011b),

but controversial in vivo data about the localization of Uhrf1 during the cell cycle exist. If Uhrf1

mediates the targeting of Dnmt1 to hemimethylated DNA via its SRA domain, one would expect Uhrf1

at replication foci in early S phase. However, most publications describe only the association of Uhrf1

with heterochromatin, and they often do not mention, whether this association takes place

throughout the cell cycle or only in a specific phase (Rothbart et al., 2013, Nishiyama et al., 2013). In

Page 215: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

206

late S phase, Uhrf1 associates with PCNA or other replication markers, when constitutive

heterochromatin is replicated, but it is unclear, if Uhrf1 associates with also PCNA in early S phase and

if Uhrf1 is diffuse or associated with constitutive heterochromatin in G1 and G2. In some cases, Uhrf1

colocalization with PCNA in early S phase has been described using an anti-Uhrf1 antibody (Uemura et

al., 2000) or a GFP fusion protein (Bostick et al., 2007). We observed that GFP-Uhrf1 and Uhrf1-GFP

associate with chromocenters throughout the cell cycle (unpublished data; master’s thesis Veronica

Solis) and similar results have been published using antibodies (Citterio et al., 2004, Papait et al.,

2007). In some publications that claim colocalization of Uhrf1 with PCNA, the early S phase stage is not

shown (Sharif et al., 2007). Therefore, it is still not clear, whether Uhrf1 targets Dnmt1 to

hemimethylated sites in early S phase. Trapping experiments that covalently bind Dnmt1 to 5-aza-dC

revealed that Dnmt1 is covalently bound to DNA in early S phase, strongly indicating the presence of

methylated sites in early replicating euchromatic DNA (Schermelleh et al., 2007, Schneider et al.,

2013). If Dnmt1 binds via the TS domain to Uhrf1 at hemimethylated sites in early S phase, we would

expect different kinetics and localization of GFP-Dnmt1ΔTS compared to GFP-Dnmt1wt in early S phase.

Indeed, we observe a reduced association of GFP-Dnmt1ΔTS with replications sites in early S phase and

a change in the kinetics compared to GFP-Dnmt1wt, but we cannot resolve a distinct TS domain

mediated MC in early S phase with our model. Based on our results, we cannot definitely answer,

whether the TS mediated interaction of Dnmt1 with constitutive heterochromatin is directly

dependent on Uhrf1. Uhrf1 knockout studies are only of limited informative value, because the low

methylation levels in Uhrf1 knockout cells (Sharif et al., 2007) could by itself already explain the almost

diffuse localization of Dnmt1 in late S phase in these cells (Bostick et al., 2007).

Uhrf1 cannot only bind to hemimethylated DNA, but also to H3K9me3 (Bostick et al., 2007, Rottach et

al., 2010, Rothbart et al., 2012). The function of H3K9me3 binding is still unclear, but it might act as a

double safety mechanism to ensure methylation at heterochromatin and to protect euchromatic

regions from inappropriate methylation. We were able to demonstrate that binding of H3K9me3

peptides further increases the specificity of Uhrf1 for hemimethylated DNA in vitro (Pichler et al.,

2011). Vice versa, the affinity for H3K9me3 is enhanced by binding of hemimethylated DNA. In the

literature, contradictory data about the question, whether the TTD or the PHD mediates the binding to

H3K9me3 are present (Rottach et al., 2010, Karagianni et al., 2008). In recent publications, there is

more and more evidence that the PHD has a general affinity for H3 or a specific affinity for unmodified

H3R2 and that the TTD harbors the specificity for H3K9me3 (Rothbart et al., 2013, Xie et al., 2012,

Cheng et al., 2013, Rajakumara et al., 2011, Wang et al., 2011, Pichler et al., 2011). In conclusion,

coordinated action of both domains seems to be required for H3K9me3 binding. Due to contradictory

data, it is still unclear, whether the interaction of Uhrf1 with H3K9me3 is essential for DNA

methylation or not. Both scenarios have been reported (Rothbart et al., 2012, Liu et al., 2013a).

Page 216: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

207

Differential analysis of methylated late replicating heterochromatic and early replicating euchromatic

DNA might give new insights into the necessity of Uhrf1 histone binding for maintenance methylation.

Despite the similarity in the overall-domain structure between Uhrf1 and Uhrf2, Uhrf2 cannot restore

the low methylation levels in Uhrf1 knockout ESCs (Pichler et al., 2011). Furthermore, we found that

Uhrf2 alone has no preference for hemimethylated DNA, but binding of Uhrf2 to H3K9me3 modified

peptides induces a preference. Similar to Uhrf1 the affinity of Uhrf2 for H3K9me3 is enhanced by

binding to hemimethylated DNA. Until now, no data from an Uhrf2 knockout have been published that

would give important information about its function. Nevertheless, we and other groups have

demonstrated that Uhrf1 levels are high in ESCs and low in somatic cells (Hopfner et al., 2000, Fujimori

et al., 1998), whereas Uhrf2 possesses an opposite expression pattern (Pichler et al., 2011). This

opposite expression pattern has also been observed during embryoid body differentiation, hinting at

different roles of Uhrf1 and Uhrf2 during differentiation and development. We hypothesized that

Uhrf2 might have a tight control function in differentiated cells, whereas Uhrf1 is less stringent,

allowing more plasticity in undifferentiated ESCs. Furthermore, it was shown that Uhrf2 binds strongly

to 5hmC and that overexpression leads to increased 5hmC, 5fC and 5caC levels by Tet-mediated

oxidation (Spruijt et al., 2013). These results could point to a role of Uhrf2 in DNA demethylation,

supporting the hypothesis of Uhrf2 as a control protein in somatic cells possibly assisting in the

removal of misplaced methylation marks. Further experiments have to be performed to analyze the

distinct roles of Uhrf1 and Uhrf2 in DNA methylation and demethylation.

Recently, a new publication proposes a way, how Uhrf1 could indirectly target Dnmt1 to

hemimethylated DNA sites. The authors have shown that the RING-finger type E3 ligase Uhrf1

ubiquitinates H3 on lysine 23 (H3K23ub) (Nishiyama et al., 2013). This new modification is bound by

Dnmt1 via the TS domain (Nishiyama et al., 2013). The Uhrf1 RING mutant, which is defective in H3K23

ubiquitination, fails to mediate the rescue of DNA methylation levels in Uhrf1 knockout cells and its

overexpression leads to a diffuse Dnmt1 localization. As the H3K23ub modification seems to be

replication-dependent, it is tempting to speculate that this modification occurs only on postreplicative

chromatin and might be the link for S phase-dependent targeting of Dnmt1 to heterochromatin. These

results are summarized in a stepwise loading model consisting of three steps (Figure 11). (1) Uhrf1

binds to hemimethylated DNA via the SRA domain in close proximity to H3K9me3 recognized by the

TTD and the PHD and ubiquitinates H3K23 via the RING domain. (2) Dnmt1 is enriched at replication

sites by binding to PCNA. (3) Dnmt1 binds to H3K23ub via the TS domain as a requirement for

methylation of the hemimethylated site. In addition, there might be still undetected modifications or

binding partners that mediate the binding of the TS domain to heterochromatin.

Page 217: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

208

Figure 11: Stepwise loading model at hemimethylated DNA. (1) Uhrf1 binds to hemimethylated DNA via the SRA domain

and to H3K9me3 via the TTD and PHD, leading to ubiquitination of H3K23 by the RING domain. (2) Interaction with PCNA

enriches Dnmt1 at replication foci. (3) Dnmt1 binds to H3K23ub via the TS domain, followed by methylation of the

hemimethylated CpG site. Only domains mediating the illustrated interactions are depicted. Closed and open lollipops

indicate methylated and non-methylated CpG sites, respectively.

Another layer of complexity is added by the fact that the TS domain alone fused to GFP binds with

very high affinity to constitutive heterochromatin throughout the cell cycle (Easwaran et al., 2004;

diploma thesis Daniela Meilinger; master's thesis Veronica Solis). Only in early to mid S phase, the TS

domain is less enriched at heterochromatin and a rather diffusely distributed fraction can be found in

the nucleoplasm (data not shown, diploma thesis Daniela Meilinger). The potential of the TS domain

to bind replication independent to constitutive heterochromatin has to be masked in the full length

Dnmt1 protein, because we usually do not observe Dnmt1 association with heterochromatin in G1 or

late G2 phase. This is in accordance with the structure of Dnmt1, in which the TS domain is inserted

into the DNA-binding pocket of the catalytic domain (Takeshita et al., 2011). One hypothesis is that a

conformation change upon binding to a specific signal like H3K23ub flips the TS domain out of the

catalytic pocket, resulting in tight binding of Dnmt1 to its substrate, stabilizing the catalytic reaction of

Dnmt1. The signal bound by the TS domain could be identical with the signal leading to the release of

the TS domain from the catalytic pocket like H3K23ub or the TS domain could then bind another

substrate, for instance, another histone modification like H3K9me3, methylated DNA or Uhrf1.

Confocal imaging can be used to exclude potential interacting molecules, if they are not colocalizing

with the TS domain. Therefore, it will be interesting to see the distribution of the new histone mark

H3K23ub during the cell cycle.

A histone modification could be involved in the release of Dnmt1 from heterochromatin in late G2.

Phosphorylation of H3S10 in late G2 by the Aurora B kinase leads to the dissociation of HP1 from

H3K9me3 at constitutive heterochromatin (Mateescu et al., 2004, Hirota et al., 2005) and could serve

Page 218: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

209

as a mechanism to remove Uhrf1 or Dnmt1 from heterochromatic sites. The association of Uhrf1 with

H3K9me3 is independent of H3S10 phosphorylation (Rothbart et al., 2012). However, Dnmt1 might

directly bind to H3K9me3 and could be released upon H3S10 phosphorylation (Patricia Wolf, data not

shown). This would explain why Dnmt1 is lost from constitutive heterochromatin in late G2 (Easwaran

et al., 2004). Furthermore, there is evidence that knockdown of Dnmt1 leads to reduced H3S10

phosphorylation (Monier et al., 2007), possibly caused by changes in the local chromatin environment

due to local demethylation.

DNA methylation is not only orchestrated by targeting Dnmt1 to the correct sites, but also by

regulating its abundance and activity. Besides the already mentioned ubiquitination by Uhrf1 and

deubiquitination by Usp7 (1.2.1), inhibition of Dnmt1 by non-coding RNAs has been recently

demonstrated (Di Ruscio et al., 2013). Accordingly, long non-coding RNAs, produced during

transcription, inhibit Dnmt1 activity at these loci, thereby keeping actively transcribed regions

unmethylated. Furthermore, the potential of active DNA demethylation by Tet proteins has added a

new layer of regulatory potential to the field of DNA methylation (Pastor et al., 2013). Besides the

pathways illustrated in the introduction (see 1.2), dehydroxymethylation of 5hmC to 5C directly by

Dnmt3a and Dnmt3b has been reported in vitro (Chen et al., 2012). If the direct conversion of 5hmC to

5C by Dnmts occurred in vivo, this would open a large regulatory potential as Dnmt3a and Dnmt3b

could immediately methylate the newly generated 5C sites back to 5mC. In cooperation with Tet

proteins and Dnmt1 they would be able to regulate DNA methylation via numerous pathways in a very

dynamic fashion.

3.1.3 Connection between DNA methylation and histone variants

DNA methylation might not only be connected to histone modifications, but also to histone variants. It

has been reported that the incorporation of H2A.Z and DNA methylation are mutually exclusive in

plants, indicating that H2A.Z protects DNA from methylation or vice versa (Zilberman et al., 2008). This

mechanism seems to be conserved and has also been identified in mammals (Conerly et al., 2010).

Moreover, inhibition of Dnmts by 5-aza-dC leads to incorporation of H2A.Z into chromatin and is

essential for gene activation after 5-aza-dC treatment (Yang et al., 2012). The described results

demonstrate the importance of histone variants as epigenetic regulators and hint at a connection with

DNA methylation.

One way how histone variants may influence epigenetics is via changing nucleosome stability. It was

very interesting to see that a splice variant of H2A.Z is present in human cells with highest levels in

brain tissue (Bonisch et al., 2012). In contrast to H2A.Z, the splice variant of the isoform H2A.Z.2,

termed H2A.Z.2.2, can affect nucleosome stability. In FRAP experiments we could attribute around

78% of the H2A.Z.2.2 molecules to a fast recovering fraction, whereas about 82% of the previously

Page 219: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

210

characterized H2A.Z.2.1 molecules recovered slowly, pointing to an enhanced exchange of the splice

variant in chromatin. Furthermore, we demonstrated that a specific sequence in the C-terminal part is

necessary for the fast kinetic exchange of H2A.Z.2.2 by weakening the interaction with H3. Like H2A.Z,

H2A.Z.2.2 interacts with the Tip60 and SRCAP chaperone complexes (Bonisch et al., 2012). This

establishes an interesting link to Dnmt1, as Tip60 has been shown to regulate Dnmt1 levels by

activating Uhrf1-dependent proteasomal degradation of Dnmt1 (Du et al., 2010). One could speculate

that the incorporation of the active mark H2A.Z in chromatin constitutes a safety mechanism that

degrades Dnmt1 at actively transcribed sites. Further experiments have to be performed in order to

investigate this potential connection and the specific function of the splice variant H2A.Z.2.2. It will be

interesting to analyze the functions of histone variants during development and disease, especially in

connection to other epigenetic processes like DNA methylation.

3.2 Visualizing the invisible

For all complex nuclear processes, it is of fundamental importance to understand them not only in

vitro, but also in an in vivo situation. Advanced microscopy in combination with fluorescent proteins

like GFP offers a variety of techniques that enables us to gain deep insights into epigenetic regulation

in vivo. New or improved ways of delivery, labeling or quantification of results can further help us to

address biological questions about nuclear dynamics.

A great advantage of the photobleaching method FLIP (see 1.4.2) is the exposure of regions, where the

proteins strongly binds to, if the binding sites have been masked by a large diffuse mobile fraction. For

instance, by bleaching the mobile fraction, we revealed that the protein NIPA binds strongly to the

nuclear periphery. Before, the localization of the protein has only been described as nuclear

(Bassermann et al., 2005). NIPA is a mammalian ubiquitin E3 ligase that ubiquitinates cyclinB1

(Bassermann et al., 2005). At the G2/M transition, NIPA is inactivated by phosphorylation and cyclinB1

accumulates, allowing mitotic entry. Our data demonstrate that GFP-NIPA needs several hours to

recover in a FRAP experiment at the nuclear periphery in contrast to the diffuse fraction in the

nucleoplasm that recovers in the range of seconds. A functional role of the nuclear fraction cannot be

excluded, however, antibody staining showed that this fraction is rather small for the endogenous

protein and might be an overexpression artifact of the exogenous construct. Detection of hidden

patterns of protein localization can reveal colocalization with other proteins that has been masked

before and give therefore new functional insights. In this context, the localization of NIPA at the

nuclear envelope has led the attention to in vitro data indicating the nucleoporin translated promoter

region (TPR) as an interaction partner. Using in vivo FRAP and FLIP experiments in combination with in

vitro coimmunoprecipitation experiments, we demonstrated that the ZnF domain of NIPA is mediating

the interaction to TPR. The extracellular signal-regulated kinase (ERK2) phosphorylates NIPA at the

G2/M transition (Illert et al., 2012) and interestingly it has been reported that ERK2 is also able to

Page 220: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

211

phosphorylate the protein TPR, leading to a stabilization of their interaction (Vomastek et al., 2008).

The same study hinted at a role of TPR in modulating the translocation of ERK2 into the nucleus.

Furthermore, it has been shown that protein degradation can be linked to specific cellular

compartments like the endoplasmic reticulum (ER) in a process called ER-associated degradation

(ERAD) (Christianson and Ye, 2014). Based on our results, we hypothesize that NIPA could act as a

“cyclin trap” at the nuclear pore complex by degrading its target cyclinB1 upon premature entry into

the nucleus in interphase. Further studies will give important insights into the functional role of the

cell cycle regulator NIPA at the nuclear envelope.

3.2.1 Limitations of photobleaching methods

The majority of today’s imaging methods are based on fluorescent labels. This has the great advantage

of multiplexing several molecules labeled with different colors combined with a very high contrast. For

in vivo imaging approaches, usually fluorescent proteins are utilized. Besides GFP, a large variety of

proteins with excitation and emission maxima in different wavelengths are available (Crivat and

Taraska, 2012). The attachment of these large fluorescent proteins (about 30 kDa) can, however,

change the properties of the tagged proteins. Therefore, immunofluorescent control experiments

confirming the localization of the protein are required. If the location of the endogenous protein is

different, methods based on fluorescent tags cannot be applied. For instance, the localization of Uhrf1

is still ambiguous as described in 3.1.2 and is probably influenced by the GFP-tag. Furthermore,

experiments involving irreversible bleaching of labeled molecules might introducing phototoxic effects

and thus damage the living cells. The influence of DNA damage on FRAP data has been only

superficially investigated, because it has been assumed that no effects arise in the short period of

acquisition. However, recruitment of Dnmt1 to damage sites has been already recorded in a time

period as short as two minutes (Mortusewicz et al., 2005) and the period of image acquisition after

bleaching can be extended to multiple hours (Bonisch et al., 2012). In addition, it has been reported

that scattering of light could even induce photodamage in neighboring cells (Dobrucki et al., 2007). In

our experiments we did not detect damaging effects in the desired observation times. However, it is

very hard to exclude hidden effects that might influence the kinetics.

Besides the potential effects of cellular damage, cell movement is a known problem of photobleaching

experiments (Goldman and Spector, 2005, Trembecka et al., 2010). The combination of image

registration and a minimal total region of interest (ROI) have improved the evaluation, but only a

perfect image registration gives absolutely reliable results. Especially half nucleus FRAP is challenging,

because the loss of fluorescence is interpreted by the image registration algorithms as a strong

movement of the cell and the registration of the last prebleach and the first postbleach images was

not possible. Bleaching of a specific line or circle circumvents this problem, because the outline of the

nucleus is always visible, but the averaged signal to noise ratio decreases due to the smaller area of

Page 221: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

212

the bleached region. Moreover, the nuclear positioning of the small bleach regions influences the

results, especially when placed at the boundary of the compartment (Mai et al., 2013). Furthermore,

half nucleus FRAP is beneficial, if the localization is heterogeneous and the different compartments

are too small to be selectively bleached. This is, for example, the case for the very small replication

foci, Dnmt1 binds to in early S phase. Another effect that needs to be avoided is axial drift, which is

often caused by temperature fluctuations. Therefore, a stable temperature outside and inside the

incubator is recommended. In long-term FLIP or FRAP experiments, the imaging of z-stacks over time

helps to detect and to compensate for axial drift (Bonisch et al., 2012).

The photoswitching properties of the fluorophore are often neglected in photobleaching experiments.

Upon excitation some molecules are transformed to non-fluorescent dark states (Dickson et al., 1997).

In this state, bleaching of the molecules is very likely. However, a small fraction of the GFP molecules

can revert from this state in a process called photoswitching (Bourgeois et al., 2012). The size of this

fraction is influenced by the excitation intensity, which is changing between acquisition and bleaching,

whereupon the size of this fraction is changing. Hence, after bleaching, a part of the molecules

switches back to the fluorescent state, which is noticeable as a small recovery of the average

fluorescence in the whole nucleus after bleaching. Photoswitching was like bleaching by acquisition

corrected to a large extent in the FRAP evaluation procedure. Recently, specialized corrections have

been developed and should be implemented into the standard evaluation (Mueller et al., 2012). All in

all, a lot of improvements have been made to increase the reproducibility of FRAP results by refining

the evaluation for a more robust outcome of FRAP experiments.

3.2.2 Dependence of the model choice on the scientific question

The quantification of the results of a FRAP experiment is critical to provide objective parameters

describing the curves. Usually, the FRAP curve is described by a mathematical equation with specific

fixed and variable parameters. The process of finding the variable parameters of the equation that

describe the curve optimally is referred to as fitting. Besides fitting the curve with simple exponential

equations, several mathematical models are available consisting of sets of equations based on physical

laws. The mathematical models include diffusion models, diffusion-reaction models and

compartmental models (Figure 12). Choosing the appropriate fitting procedure out of the existing pool

is not trivial and can lead to inaccurate results (Mueller et al., 2008). Kinetic models often depend on a

specific geometry of the bleached region and the FRAP approach needs to be adjusted accordingly.

Furthermore, the choice depends on the homogeneity of the dynamic populations. Often, the proteins

do not only interact with one, but with multiple interaction partners. If the interactions are

characterized by distinct association rates (kon) and dissociation rates (koff), they can be separated in

the fit. However, if kon and koff values of interactions are too similar, they cannot be separated.

Therefore, we are using the term mobility class (MC) to describe a dynamic subpopulation. Moreover,

Page 222: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

213

a MC must not necessarily describe an interaction, but could also arise, for instance, from atypical

diffusion like anomalous diffusion. The reciprocal of koff is the Tres indicating the average binding time

of the protein, if a single interaction is characterized.

Figure 12: Choosing the appropriate model for the quantitative evaluation of FRAP experiments. (A) FRAP curves can be fitted with an exponential equation or a sum of exponential equations. The resulting t1/2 and MF are dependent on the size and geometry of the bleached region and can only be compared to equivalent experiments. The other models are based on physical laws and allow the quantification of diffusion coefficients and/or association and dissociation coefficients (kon/koff), as depicted. (B) Flowchart representing the decision path leading to the choice of the appropriate model. If the number of interactions cannot be predicted, the results of different models need to be compared.

Sum of exponentials

The simplest equation to fit the corrected and normalized FRAP curve is an exponential equation

(Phair et al., 2004a). From the exponent of the solution that yields the best fit, the half time recovery

(t1/2) can be calculated. If the curve does not approximate 1 during the recorded timeframe, the

mobile fraction (MF) should be extracted as a second parameter. However, this value is dependent on

the time the recovery has been recorded. Most FRAP curves extracted from nuclear proteins contain

more than one MC and have therefore to be fitted with a sum of exponential equations (Phair et al.,

2004b). This will result in multiple t1/2 and a segmentation of the total populations into separate

fractions. The decision of how many populations are present is not trivial and has to be carefully

assessed (see 3.2.3). Using this method, proteins with different kinetic populations can be compared

with each other. This has been applied before to study the number of kinetically distinct populations

of the RNA polymerase II (Darzacq et al., 2007). We have fitted data with the sum of exponentials to

analyze of kinetic populations of the canonical H2A.Z and a splice variant H2A.Z.2.2 (Bonisch et al.,

Page 223: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

214

2012). H2A.Z and its splice variant contain different fractions of highly mobile and rather immobile

proteins. The FRAP experiments revealed large differences between the relative amount of

nucleosomal incorporation of the different constructs (see 3.1.3). However, the resulting parameters

are not absolute values, but describe the protein in the chosen setup relative to other proteins and

can only be used for a comparative analysis.

Diffusion model

Whenever absolute values like diffusion coefficients or association or dissociation rates (Df, kon, koff)

are required, special mathematical models have to be applied that are based on physical principles.

The resulting parameters are protein specific and in principle independent of the setup. The models

have to be tailored to the experimental approach or vice versa. One of the most frequently used

models is the diffusion model. This requires data from a FRAP experiment with a specific geometry of

the bleached region in order to determine the diffusion coefficient. Usually, the geometries include

spot, spot array, rectangle or line bleaching (Hagen et al., 2009, Kang et al., 2012, van Royen et al.,

2009, Xiong et al., 2014), but by subdividing the nucleus in squared regions, the diffusion coefficient

can even be extracted from half nucleus FRAP (Beaudouin et al., 2006). In the last decades,

sophisticated models have been developed, including a range of parameters like the bleach profile,

nuclear 3D geometry or bleach duration (van Royen et al., 2009, Mazza et al., 2007, Braga et al., 2004).

The more measurable parameters are taken into account the more realistic the results should be. We

have applied spot FRAP in combination with a diffusion model for the analysis of the diffusion of

oligonucleotides in nanoparticles (Lebold et al., 2012). Based on the assumption that the diffusion rate

of the nucleotides inside the particles is correlated with the diffusion of nucleotides into the particles,

we found interesting differences. The diffusion is dependent on the functionalizations of the particles

as well as on the length of the oligonucleotides (see 3.2.4). Interestingly, we identified a second

diffusion rate, which was rather independent of oligonucleotide length and particle functionalization.

The nature of the second population is unclear, but one explanation would be that at least two types

of diffusion are present. Studies using particle tracking give a much more detailed picture on the

random walks of the molecules and allow the differentiation of a large number of diffusion types.

Particle tracking has been applied to single dye molecules in nanoparticles (Kirstein et al., 2007).

Analyzing the mean square displacement over time revealed indeed different types of structured and

unstructured diffusion. A mixture of these different subclasses could lead to the second class, we

observed.

Reaction-diffusion model

Even more complexity is generated in reaction-diffusion models that introduces one MC to the

diffusion model (Sprague et al., 2004). The mobility class is described by kon and koff and the

corresponding fractions of free and bound protein are determined, adding at least three more

Page 224: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

215

parameters to the model. As most nuclear proteins diffuse and have at least one specific interaction

partner, reaction-diffusion models are widely used in order to quantify FRAP-based molecular kinetics.

Examples include RNA, transcription factors or HP1 (Braga et al., 2007, Sprague et al., 2004, Muller et

al., 2009). However, extension of these models to two or more MCs is mathematically very

complicated and in general not used for data obtained by FRAP experiments.

Compartmental model

If more than one interaction has to be quantified, a different type of model has to be applied. The only

solution so far is a compartmental model that comes with the disadvantage of neglecting diffusion.

This means that it is only applicable to proteins that diffuse so fast that all free proteins of the whole

nucleus are bleached by the time of the first postbleach image is recorded. In contrast, binding has to

be so strong that no proteins unbind during the short time between bleaching and recording the first

postbleach image. Although compartmental models have been applied for a range of proteins (Phair

et al., 2004b), most of them do not provide the necessary prerequisites. Hence, ignoring diffusion can

lead to an incorrect estimation of binding time (Sprague et al., 2006). In order to address this problem,

we have implemented a size-dependent correction factor for diffusion in the compartmental model

used for half nucleus FRAP (Schneider et al., 2013). In our approach, GFP-multimers were analyzed in

order to approximate the diffusion of proteins of different sizes in the nucleus. Besides the apparent

advantage, the measurement of the correction factor is also error prone, because not only the

molecular size, but also the shape of the control protein has to resemble the protein of interest in

order to estimate diffusion correctly. Furthermore, the factor kdiff is only a correction factor and does

not give information about the diffusion coefficient.

Often more than one model is applicable to the dataset, which generates the possibility to compare

them with each other. For example, a protein with one MC should give the same koff with a reaction

diffusion model and with a compartmental model. First comparisons have revealed significant

differences between the kon and koff values of the glucocorticoid receptor obtained with different

bleach geometries in connection with different models (Mueller et al., 2008). By comparing the

approaches, the errors were identified and the resulting improved model was applied to other

transcription factors. So far no gold standard has been established for the quantification of FRAP

experiments. This would be a major benefit as results obtained with different experimental

parameters and different quantifications could be easily compared.

3.2.3 Limitations of the FRAP-based kinetic modeling

All the mathematical models try to reproduce reality, but have to be always a simplified version.

Therefore, the user has to keep in mind the known limitations of these methods. All the described

fitting options have the problem of potential overfitting (Mai et al., 2011). The more variable

Page 225: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

216

parameters are included in a model, the closer the fit will be to the curve. Especially models with

multiple MCs harbor a variety of parameters. Therefore, parameters have to be approximated and

fixed in order to gain valuable results. In our approach, we have quantified the fraction of bleached

molecules and fixed the koff value of the MC with the slowest mobility (Schneider et al., 2013).

Assuming that the slowest MC represents the catalytic reaction of Dnmt1, we based our estimations

on in vitro data that have reported a dissociation rate of about 0.005 s-1, which is equivalent to a mean

residence time of 200 s (Song et al., 2011). After fixing the parameters, it has to be tested, whether a

model with less MCs would give similar results compared to a model with more MCs. The model with

the smallest numbers of parameters should always be preferred. The determination of the number of

MCs is referred to as model choice, because different models for the various numbers of MCs exist.

We have established specific model choice rules in order to choose the appropriate number of MCs

for GFP-Dnmt1 in each cell cycle stage. The application of standard model choice criteria like the

Akaike information criterion (Akaike, 1973) was not successful as the differences between the quality

of the fits were too small. In order to obtain robust results, we wanted to find a way to model

parameters that fit multiple cells instead of fitting individual cells and averaging the results. Therefore,

we have included mixed-effects into a nonlinear regression model in a Bayesian framework (see 2.8).

In order to assess this approach, the equations were based on a simplified compartmental model that

neglects diffusion, but allows an analytical solution of the differential equations. The proposed mixed-

effects model provides a much better fit than the fixed-effects model I and is thus more robust. This

indicates that implementation of mixed-effects in more complex models can improve the robustness

of the results.

Another limitation is the focus of FRAP models on the koff. Changes in the kon value influence the

protein dynamics in the cell. For instance, a protein that binds with high affinity and specificity to its

target, but stays associated only for a short time might give very similar kinetics as a protein that

diffuses very slowly through the cell (Figure 13). In both cases, the FRAP curves can look very similar.

The phenomenon that proteins that bind with high affinity to their targets and therefore diffuse only

very short distances until the next binding site is present has been described as diffusion-coupled

FRAP recovery (Sprague and McNally, 2005). As this diffusion-coupled recovery is often not corrected,

the Tres values present an upper limit of the real value, because short times of diffusion might have

interrupted this estimated binding time (Mueller et al., 2008). There are ways to detect diffusion-

coupled recovery (Beaudouin et al., 2006), however, the ability to discriminate between those two

cases is still limited.

A third limitation is that most models only account for normal Brownian diffusion. However, there is

increasing evidence that diffusion in the nucleus is anomalous (Bancaud et al., 2009, Wachsmuth et

al., 2000). This means that the root mean square displacement is not directly proportional to time. The

Page 226: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

217

reasons are suspected in the crowded environment leading to hindrance of diffusion by obstacles or

corralling in labyrinth-like environments (Sokolov, 2012, Saxton, 2001). A model for anomalous

diffusion in point FRAP experiments have been developed recently (Daddysman and Fecko, 2013). The

authors reported that diffusion in HeLa nuclei is anomalous and that GFP seems to diffuse according to

normal diffusion in chromatin free regions in polytene drosophila nuclei.

Figure 13: Intermixing of diffusion and binding in FRAP. Very similar FRAP curves can be explained by different kinetic properties of the molecules. Either, molecules that diffuse very fast and have large kon and koff values (red) or molecules that diffuse very slow and have no specific interaction (blue) could result in the illustrated kinetics.

In order to overcome these limitations in the future, cross validation of the results not only with other

models, but also with other techniques using fluorescently labeled proteins in living cells should be

conducted. The techniques include FCS and SPT. Both methods can be applied to extract diffusion

coefficients and residence times. Recently, point FRAP and FCS have even been combined in one setup

in order to gain comparable results with both methods (Im et al., 2013). In this way the cross

validation is performed in one single experiment. Another approach has used data obtained with SPT

in order to choose the correct model for FRAP and FCS analysis (Mazza et al., 2012). Here, all three

methods were used to validate the results. With this approach they were able to detect and solve

discrepancies in residence time and the fraction of bound protein. FCS is mainly used to determine

diffusion rates of proteins, but with fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) binding

kinetics can be specifically determined between two differently labeled proteins and their diffusion

coefficients can be directly compared (Schwille et al., 1997). This has the advantage that the binding

partner is known, whereas in FRAP experiments this can only be indirectly determined by mutational

analysis. Advantages of SPT and FCS are the drastic reduced phototoxic effect compared to FRAP as

bleaching is not necessary. However, FRAP provides a much more global picture of dynamics inside a

cell.

3.2.4 Application of complementary methods

Besides photobleaching methods, several other tools in fluorescence microscopy enable us to obtain

detailed information about spatial and temporal regulation of molecules. Labeling proteins in in vivo

experiments is commonly used, but DNA sequences have been so far mainly labeled in in vitro FISH

experiments. We have applied dTALEs to visualize major satellite (ms) repetitive DNA sequences in the

Page 227: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

218

nucleus in living cells (msTALE) (Thanisch et al., 2013). This enabled us to follow the movement of

these repetitive sequences during the cell cycle or even differentiation. Instead, fluorescently tagged

proteins like HP1 or MBDs have been used to visualize methylated sequences in vivo. Disadvantages

are that heterochromatin-binding proteins might be specifically regulated in the cell. For instance, HP1

is displaced from chromatin by H3S10 phosphorylation in G2 (Hirota et al., 2005). We showed that our

msTALE is still bound in G2, even when HP1 is diffusively localized in the nucleus. Recently, two more

publications have also demonstrated the application of dTALEs to label repetitive DNA sequences

(Miyanari et al., 2013, Ma et al., 2013). They demonstrated that also repetitive sequences like

telomeres or minor satellites can be labeled. Furthermore, application of the bacterial CRISPR/Cas

system, which is like the TAL effectors adaptable for site-specific genome engineering, even allowed

the detection of single loci (Chen et al., 2013). Our analysis of the binding dynamics by FRAP revealed

that the msTALE binds much stronger to DNA than a polydactyl Zn Finger (PZF:GFP) construct directed

against a similar sequence (Lindhout et al., 2007). As it has been reported that the localization of DNA

influences the transcriptional activity of the corresponding sequences (Reddy et al., 2008), the strong

binding of the msTALE could be exploited to manipulate chromatic regions. It has been shown in

zygotes that fusion of the nuclear envelope protein emerin to a polydactyl Zn Finger, binding to major

satellite sequences, tethers pericentromeric heterochromatin to the nuclear periphery (Jachowicz et

al., 2013). The authors found that their manipulation lead to defective silencing of pericentromeric

heterochromatin and impaired development of the embryos.

The application of FRAP also gave valuable results for the characterization of other tools. We have

used this method to learn about the diffusion of oligonucleotides in nanoparticles. The nanoparticles

might be versatile vehicles to enable transport of proteins in single cells or whole tissues. We

demonstrated that unfunctionalized and cyanopropyl-functionalized particles cannot be loaded with

oligonucleotides (Lebold et al., 2012). Addition of aminopropyl or a combination of aminopropyl and

phenyl groups enabled loading of the particles with siRNA. Furthermore it is possible to load fairly long

oligonucleotides of 90 base pairs of DNA into the particles. Further fine-tuning of the

functionalizations of the particles could result in vectors with different properties, like fast or slow

release of nucleic acids, for different purposes. These findings are valuable when it comes to using the

nanoparticles as carriers of therapeutics.

Besides labeling and delivery also high resolution spatial information is very valuable. Using super-

resolution 3D-SIM microscopy, we analyzed not only in detail the association of Dnmt1 to

chromocenters in late S phase, but also the detailed localization of NIPA at the nuclear envelope. We

demonstrated that the latter is localized slightly inside the nuclear lamina and the nucleoporin

Nup153, but on the same level as its interaction partner TPR. Increasing resolution is also gained with

other methods like STED or localization microscopy (PALM, dSTORM). However, these methods lack

Page 228: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

219

the increased z-resolution of 3D-SIM and only a maximum of two labels can be multiplexed

(Schermelleh et al., 2010). However, they are being further developed and for localization microscopy

first setups have reported an axial resolution of up to 20 nm (Xu et al., 2012).

3.3 Outlook

Besides our new findings and developments, many new ideas and questions are arising. We have

shown that FRAP is a very powerful tool to study the nuclear dynamics in vivo. Therefore, further

developments of this technique are still of great interest. Especially the combination with new

technical innovations can extend the applicability of this method. Automation of not only the

evaluation, but also the acquisition of imaging data has been further developed. Both, automated

detection of cellular features and automated imaging at multiple positions have been demonstrated

and the latter is already implicated in many commercial microscopy systems (Held et al., 2010, Conrad

and Gerlich, 2010, Edelstein et al., 2010). Recently, these techniques have been combined, enabling

automated FRAP on a confocal microscope (Conrad et al., 2011). A low resolution image is acquired in

a defined region and immediately analyzed by the software Micropilot (Figure 14). If a cell in this

image fulfills the preset requirements, a FRAP experiment with the selected cell is automatically

started and recorded. Then, the scanning process is continued by acquisition of further low resolution

images in the predefined area. The great advantage of performing experiments with a long recovery

time without the need of intermediate user interactions allows the performance of FRAP experiments

overnight. RNAi screens using automated confocal imaging have been successfully performed in the

past (Neumann et al., 2010). Using Micropilot, FRAP-based screens can be run, gaining information

about the localization and the kinetics of the proteins at the same time. Automatic FRAP experiments

produce large datasets and generate the requirement for efficient data handling and processing. The

macros for FRAP evaluation that have been developed in this thesis, could be further automatized and

extended by adding quality criteria to automatically detect factors like z-drift.

Figure 14: Automatic FRAP experiment. In order to detect cells fulfilling preset requirements, a low resolution image is acquired in a defined area. The image is analyzed by the software Micropilot. If a suitable cell is detected (red outline), a FRAP experiment is started. When the FRAP experiment is finished or If no suitable cell can be detected, the stage is moved and the next low resolution image in the defined area is acquired. The procedure will be repeated until the defined area has been scanned.

Furthermore, the evaluation at a single cell level could be enhanced by measuring the recovery in

every pixel. Plotting the results in form of a heat map in the nucleus enhances the spatial resolution of

Page 229: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Discussion

220

FRAP and diffusion-coupled kinetics in the nucleus could be illustrated. Usually the presence of

diffusion-coupled kinetics is tested in an approach, in which the nucleus is segmented into stripes and

differences in the kinetics are analyzed in respect to the distance to the bleach border (Beaudouin et

al., 2006). In order to gain more resolution in FRAP experiments, one could also think of implementing

a scanning system for bleaching in the widefield path of 3D-SIM microscopes that are fast enough for

super-resolution live cell imaging (Shao et al., 2011). The fusion of both methods would allow maps of

protein dynamics in relation to a marker protein with very high resolution.

Not only technical issues need to be addressed. Due to recent findings, new questions emerged

regarding epigenetics and especially Dnmt1. Recently, mutations in Dnmt1 have been linked to the

diseases hereditary sensory and autonomic neuropathy type 1 (HSAN1) and autosomal dominant

cerebellar ataxia, deafness and narcolepsy (ADCA-DN) (Winkelmann et al., 2012, Klein et al., 2011).

Interestingly, all mutations were located in the TS domain. It will be interesting to apply our

knowledge about Dnmt1 in order to unravel how Dnmt1 is mechanistically linked to this disease.

Furthermore, discoveries about the influence of factors like RNA on Dnmt1 regulation have been

made. They revealed that non-coding RNAs block Dnmt1-mediated methylation at a large number of

gene loci (Di Ruscio et al., 2013). Using deep sequencing of RNA, DNA methylation in combination with

proteomics, global information about the regulation of DNA methylation will be unraveled that is not

anymore limited to single loci. Most importantly, the discovery of Tet proteins and their DNA

modifications hmC, fC and caC has opened a new field of questions concerning the role and regulation

of epigenetic marks that need to be addressed.

In the future highly sophisticated techniques will be more and more important in order to understand

biological questions. The interconnection of biological research and technology will help us to

understand the dynamic regulation of epigenetic mechanisms in living cells, leading to further insights

into the functional role of epigenetics during development and disease.

Page 230: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

221

4. Annex

4.1 References

Achour, M., Jacq, X., Ronde, P., Alhosin, M., Charlot, C., Chataigneau, T., Jeanblanc, M., Macaluso, M., Giordano, A., Hughes, A. D., Schini-Kerth, V. B. & Bronner, C. 2008. The interaction of the SRA domain of ICBP90 with a novel domain of DNMT1 is involved in the regulation of VEGF gene expression. Oncogene, 27, 2187-97.

Akaike, H. 1973. Information theory and an extension of the maximum likelihood principle. In: PETROV, B. N. & CSAKI, F. (eds.) 2nd International Symposium on Information Theory. Budapest: Akademiai Kiado.

Aran, D., Toperoff, G., Rosenberg, M. & Hellman, A. 2011. Replication timing-related and gene body-specific methylation of active human genes. Hum Mol Genet, 20, 670-80.

Arita, K., Ariyoshi, M., Tochio, H., Nakamura, Y. & Shirakawa, M. 2008. Recognition of hemi-methylated DNA by the SRA protein UHRF1 by a base-flipping mechanism. Nature.

Avvakumov, G. V., Walker, J. R., Xue, S., Li, Y., Duan, S., Bronner, C., Arrowsmith, C. H. & Dhe-Paganon, S. 2008. Structural basis for recognition of hemi-methylated DNA by the SRA domain of human UHRF1. Nature, 455, 822-5.

Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E. & Webb, W. W. 1976. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal, 16, 1055-1069.

Bancaud, A., Huet, S., Daigle, N., Mozziconacci, J., Beaudouin, J. & Ellenberg, J. 2009. Molecular crowding affects diffusion and binding of nuclear proteins in heterochromatin and reveals the fractal organization of chromatin. EMBO J, 28, 3785-98.

Bashtrykov, P., Jankevicius, G., Jurkowska, R. Z., Ragozin, S. & Jeltsch, A. 2013. The Uhrf1 protein stimulates the activity and specificity of the maintenance DNA methyltransferase Dnmt1 by an allosteric mechanism. J Biol Chem.

Bashtrykov, P., Jankevicius, G., Smarandache, A., Jurkowska, R. Z., Ragozin, S. & Jeltsch, A. 2012. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chem Biol, 19, 572-8.

Bassermann, F., Von Klitzing, C., Munch, S., Bai, R. Y., Kawaguchi, H., Morris, S. W., Peschel, C. & Duyster, J. 2005. NIPA defines an SCF-type mammalian E3 ligase that regulates mitotic entry. Cell, 122, 45-57.

Bassett, A., Cooper, S., Wu, C. & Travers, A. 2009. The folding and unfolding of eukaryotic chromatin. Curr Opin Genet Dev, 19, 159-65.

Beaudouin, J., Mora-Bermudez, F., Klee, T., Daigle, N. & Ellenberg, J. 2006. Dissecting the contribution of diffusion and interactions to the mobility of nuclear proteins. Biophys J, 90, 1878-94.

Berman, B. P., Weisenberger, D. J., Aman, J. F., Hinoue, T., Ramjan, Z., Liu, Y., Noushmehr, H., Lange, C. P., Van Dijk, C. M., Tollenaar, R. A., Van Den Berg, D. & Laird, P. W. 2012. Regions of focal DNA hypermethylation and long-range hypomethylation in colorectal cancer coincide with nuclear lamina-associated domains. Nat Genet, 44, 40-6.

Bernstein, E. & Hake, S. B. 2006. The nucleosome: a little variation goes a long way. Biochem Cell Biol, 84, 505-17.

Bestor, T., Laudano, A., Mattaliano, R. & Ingram, V. 1988. Cloning and sequencing of a cDNA encoding DNA methyltransferase of mouse cells. The carboxyl-terminal domain of the mammalian enzymes is related to bacterial restriction methyltransferases. J Mol Biol, 203, 971-83.

Bestor, T. H. 1992. Activation of mammalian DNA methyltransferase by cleavage of a Zn binding regulatory domain. EMBO J, 11, 2611-7.

Bestor, T. H. 2000. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet, 9, 2395-402. Billon, P. & Cote, J. 2012. Precise deposition of histone H2A.Z in chromatin for genome expression and

maintenance. Biochim Biophys Acta, 1819, 290-302. Bird, A. 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev, 16, 6-21. Bird, A. 2007. Perceptions of epigenetics. Nature, 447, 396-8.

Page 231: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

222

Bird, A., Taggart, M., Frommer, M., Miller, O. J. & Macleod, D. 1985. A fraction of the mouse genome that is derived from islands of nonmethylated, CpG-rich DNA. Cell, 40, 91-9.

Boch, J., Scholze, H., Schornack, S., Landgraf, A., Hahn, S., Kay, S., Lahaye, T., Nickstadt, A. & Bonas, U. 2009. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science, 326, 1509-12.

Bonisch, C. & Hake, S. B. 2012. Histone H2A variants in nucleosomes and chromatin: more or less stable? Nucleic Acids Res, 40, 10719-41.

Bonisch, C., Schneider, K., Punzeler, S., Wiedemann, S. M., Bielmeier, C., Bocola, M., Eberl, H. C., Kuegel, W., Neumann, J., Kremmer, E., Leonhardt, H., Mann, M., Michaelis, J., Schermelleh, L. & Hake, S. B. 2012. H2A.Z.2.2 is an alternatively spliced histone H2A.Z variant that causes severe nucleosome destabilization. Nucleic Acids Res, 40, 5951-64.

Bostick, M., Kim, J. K., Esteve, P. O., Clark, A., Pradhan, S. & Jacobsen, S. E. 2007. UHRF1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells. Science, 317, 1760-4.

Bourgeois, D., Regis-Faro, A. & Adam, V. 2012. Photoactivated structural dynamics of fluorescent proteins. Biochem Soc Trans, 40, 531-8.

Braga, J., Desterro, J. M. & Carmo-Fonseca, M. 2004. Intracellular macromolecular mobility measured by fluorescence recovery after photobleaching with confocal laser scanning microscopes. Mol Biol Cell, 15, 4749-60.

Braga, J., Mcnally, J. G. & Carmo-Fonseca, M. 2007. A reaction-diffusion model to study RNA motion by quantitative fluorescence recovery after photobleaching. Biophys J, 92, 2694-703.

Brenet, F., Moh, M., Funk, P., Feierstein, E., Viale, A. J., Socci, N. D. & Scandura, J. M. 2011. DNA methylation of the first exon is tightly linked to transcriptional silencing. PLoS One, 6, e14524.

Bronner, C., Achour, M., Arima, Y., Chataigneau, T., Saya, H. & Schini-Kerth, V. B. 2007. The UHRF family: oncogenes that are drugable targets for cancer therapy in the near future? Pharmacol Ther, 115, 419-34.

Bronner, C., Krifa, M. & Mousli, M. 2013. Increasing role of UHRF1 in the reading and inheritance of the epigenetic code as well as in tumorogenesis. Biochem Pharmacol.

Buck-Koehntop, B. A. & Defossez, P. A. 2013. On how mammalian transcription factors recognize methylated DNA. Epigenetics, 8, 131-7.

Cardoso, M. C. & Leonhardt, H. 1999. DNA methyltransferase is actively retained in the cytoplasm during early development. J Cell Biol, 147, 25-32.

Casas-Delucchi, C. S., Van Bemmel, J. G., Haase, S., Herce, H. D., Nowak, D., Meilinger, D., Stear, J. H., Leonhardt, H. & Cardoso, M. C. 2012. Histone hypoacetylation is required to maintain late replication timing of constitutive heterochromatin. Nucleic Acids Res, 40, 159-69.

Cauda, V., Schlossbauer, A., Kecht, J., Zurner, A. & Bein, T. 2009. Multiple core-shell functionalized colloidal mesoporous silica nanoparticles. J Am Chem Soc, 131, 11361-70.

Cedar, H. & Bergman, Y. 2009. Linking DNA methylation and histone modification: patterns and paradigms. Nat Rev Genet, 10, 295-304.

Cerda, M. C., Berrios, S., Fernandez-Donoso, R., Garagna, S. & Redi, C. 1999. Organisation of complex nuclear domains in somatic mouse cells. Biol Cell, 91, 55-65.

Chen, B., Gilbert, L. A., Cimini, B. A., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Li, G. W., Park, J., Blackburn, E. H., Weissman, J. S., Qi, L. S. & Huang, B. 2013. Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System. Cell, 155, 1479-91.

Chen, C. C., Wang, K. Y. & Shen, C. K. 2012. The mammalian de novo DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B are also DNA 5-hydroxymethylcytosine dehydroxymethylases. J Biol Chem, 287, 33116-21.

Cheng, J., Yang, Y., Fang, J., Xiao, J., Zhu, T., Chen, F., Wang, P., Li, Z., Yang, H. & Xu, Y. 2013. Structural insight into coordinated recognition of trimethylated histone H3 lysine 9 (H3K9me3) by the plant homeodomain (PHD) and tandem tudor domain (TTD) of UHRF1 (ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1) protein. J Biol Chem, 288, 1329-39.

Cheng, X. 1995. Structure and function of DNA methyltransferases. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 24, 293-318.

Page 232: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

223

Cheutin, T., Mcnairn, A. J., Jenuwein, T., Gilbert, D. M., Singh, P. B. & Misteli, T. 2003. Maintenance of stable heterochromatin domains by dynamic HP1 binding. Science, 299, 721-5.

Choufani, S., Shuman, C. & Weksberg, R. 2013. Molecular findings in Beckwith-Wiedemann syndrome. Am J Med Genet C Semin Med Genet, 163C, 131-40.

Christianson, J. C. & Ye, Y. 2014. Cleaning up in the endoplasmic reticulum: ubiquitin in charge. Nat Struct Mol Biol, 21, 325-35.

Chuang, L. S.-H., Ian, H.-I., Koh, T.-W., Ng, H.-H., Xu, G. & Li, B. F. L. 1997. Human DNA-(Cytosine-5) Methyltransferase-PCNA Complex as a Target for p21WAF1. Science, 277, 1996-2000.

Citterio, E., Papait, R., Nicassio, F., Vecchi, M., Gomiero, P., Mantovani, R., Di Fiore, P. P. & Bonapace, I. M. 2004. Np95 Is a Histone-Binding Protein Endowed with Ubiquitin Ligase Activity. Molecular and Cellular Biology, 24, 2526-2535.

Collings, C. K., Waddell, P. J. & Anderson, J. N. 2013. Effects of DNA methylation on nucleosome stability. Nucleic Acids Res, 41, 2918-31.

Conerly, M. L., Teves, S. S., Diolaiti, D., Ulrich, M., Eisenman, R. N. & Henikoff, S. 2010. Changes in H2A.Z occupancy and DNA methylation during B-cell lymphomagenesis. Genome Res, 20, 1383-90.

Conrad, C. & Gerlich, D. W. 2010. Automated microscopy for high-content RNAi screening. J Cell Biol, 188, 453-61.

Conrad, C., Wunsche, A., Tan, T. H., Bulkescher, J., Sieckmann, F., Verissimo, F., Edelstein, A., Walter, T., Liebel, U., Pepperkok, R. & Ellenberg, J. 2011. Micropilot: automation of fluorescence microscopy-based imaging for systems biology. Nat Methods, 8, 246-9.

Cosgrove, M. S., Boeke, J. D. & Wolberger, C. 2004. Regulated nucleosome mobility and the histone code. Nat Struct Mol Biol, 11, 1037-43.

Crivat, G. & Taraska, J. W. 2012. Imaging proteins inside cells with fluorescent tags. Trends Biotechnol, 30, 8-16.

Daddysman, M. K. & Fecko, C. J. 2013. Revisiting point FRAP to quantitatively characterize anomalous diffusion in live cells. J Phys Chem B, 117, 1241-51.

Darzacq, X., Shav-Tal, Y., De Turris, V., Brody, Y., Shenoy, S. M., Phair, R. D. & Singer, R. H. 2007. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol, 14, 796-806.

Dawson, M. A. & Kouzarides, T. 2012. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell, 150, 12-27.

Di Ruscio, A., Ebralidze, A. K., Benoukraf, T., Amabile, G., Goff, L. A., Terragni, J., Figueroa, M. E., De Figueiredo Pontes, L. L., Alberich-Jorda, M., Zhang, P., Wu, M., D'alo, F., Melnick, A., Leone, G., Ebralidze, K. K., Pradhan, S., Rinn, J. L. & Tenen, D. G. 2013. DNMT1-interacting RNAs block gene-specific DNA methylation. Nature.

Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. & Moerner, W. E. 1997. On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein. Nature, 388, 355-8.

Digman, M. A. & Gratton, E. 2012. Scanning image correlation spectroscopy. Bioessays, 34, 377-85. Dimitrova, D. S. & Berezney, R. 2002. The spatio-temporal organization of DNA replication sites is

identical in primary, immortalized and transformed mammalian cells. J Cell Sci, 115, 4037-51. Dobrucki, J. W., Feret, D. & Noatynska, A. 2007. Scattering of exciting light by live cells in fluorescence

confocal imaging: phototoxic effects and relevance for FRAP studies. Biophys J, 93, 1778-86. Dong, A., Yoder, J. A., Zhang, X., Zhou, L., Bestor, T. H. & Cheng, X. 2001. Structure of human DNMT2,

an enigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA. Nucleic Acids Res, 29, 439-48.

Du, Z., Song, J., Wang, Y., Zhao, Y., Guda, K., Yang, S., Kao, H. Y., Xu, Y., Willis, J., Markowitz, S. D., Sedwick, D., Ewing, R. M. & Wang, Z. 2010. DNMT1 stability is regulated by proteins coordinating deubiquitination and acetylation-driven ubiquitination. Sci Signal, 3, ra80.

Easwaran, H. P., Schermelleh, L., Leonhardt, H. & Cardoso, M. C. 2004. Replication-independent chromatin loading of Dnmt1 during G2 and M phases. EMBO Rep, 5, 1181-6.

Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R. & Stuurman, N. 2010. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 14, Unit14 20.

Page 233: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

224

Ellis, R. J. 2006. Molecular chaperones: assisting assembly in addition to folding. Trends Biochem Sci, 31, 395-401.

Esteller, M. 2011. Epigenetic changes in cancer. F1000 Biol Rep, 3, 9. Esteve, P. O., Chang, Y., Samaranayake, M., Upadhyay, A. K., Horton, J. R., Feehery, G. R., Cheng, X. &

Pradhan, S. 2011. A methylation and phosphorylation switch between an adjacent lysine and serine determines human DNMT1 stability. Nat Struct Mol Biol, 18, 42-8.

Feinberg, A. P. 2007. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature, 447, 433-40. Felle, M., Hoffmeister, H., Rothammer, J., Fuchs, A., Exler, J. H. & Langst, G. 2011a. Nucleosomes

protect DNA from DNA methylation in vivo and in vitro. Nucleic Acids Res, 39, 6956-69. Felle, M., Joppien, S., Nemeth, A., Diermeier, S., Thalhammer, V., Dobner, T., Kremmer, E., Kappler, R.

& Langst, G. 2011b. The USP7/Dnmt1 complex stimulates the DNA methylation activity of Dnmt1 and regulates the stability of UHRF1. Nucleic Acids Res, 39, 8355-65.

Fellinger, K., Rothbauer, U., Felle, M., Langst, G. & Leonhardt, H. 2009. Dimerization of DNA methyltransferase 1 is mediated by its regulatory domain. J Cell Biochem, 106, 521-8.

Feng, S., Cokus, S. J., Zhang, X., Chen, P. Y., Bostick, M., Goll, M. G., Hetzel, J., Jain, J., Strauss, S. H., Halpern, M. E., Ukomadu, C., Sadler, K. C., Pradhan, S., Pellegrini, M. & Jacobsen, S. E. 2010. Conservation and divergence of methylation patterning in plants and animals. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 8689-94.

Fournier, A., Sasai, N., Nakao, M. & Defossez, P. A. 2012. The role of methyl-binding proteins in chromatin organization and epigenome maintenance. Brief Funct Genomics, 11, 251-64.

Frauer, C. & Leonhardt, H. 2009. A versatile non-radioactive assay for DNA methyltransferase activity and DNA binding. Nucleic Acids Res, 37, e22.

Frauer, C. & Leonhardt, H. 2011. Twists and turns of DNA methylation. Proc Natl Acad Sci U S A, 108, 8919-20.

Frauer, C., Rottach, A., Meilinger, D., Bultmann, S., Fellinger, K., Hasenoder, S., Wang, M., Qin, W., Soding, J., Spada, F. & Leonhardt, H. 2011. Different binding properties and function of CXXC zinc finger domains in Dnmt1 and Tet1. PLoS One, 6, e16627.

Fujimori, A., Matsuda, Y., Takemoto, Y., Hashimoto, Y., Kubo, E., Araki, R., Fukumura, R., Mita, K., Tatsumi, K. & Muto, M. 1998. Cloning and mapping of Np95 gene which encodes a novel nuclear protein associated with cell proliferation. Mamm Genome, 9, 1032-5.

Gamble, M. & Kraus, W. L. 2010. Multiple facets of the unique histone variant macroH2A: From genomics to cell biology. Cell Cycle, 9, 70-69.

Gautier, T., Abbott, D. W., Molla, A., Verdel, A., Ausio, J. & Dimitrov, S. 2004. Histone variant H2ABbd confers lower stability to the nucleosome. EMBO Rep, 5, 715-20.

Giri, S., Trewyn, B. G. & Lin, V. S. 2007. Mesoporous silica nanomaterial-based biotechnological and biomedical delivery systems. Nanomedicine (Lond), 2, 99-111.

Goldman, M. A., Holmquist, G. P., Gray, M. C., Caston, L. A. & Nag, A. 1984. Replication timing of genes and middle repetitive sequences. Science, 224, 686-92.

Goldman, R. D. & Spector, D. L. 2005. Live cell imaging : a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Goll, M. G. & Bestor, T. H. 2005. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu Rev Biochem, 74, 481-514.

Goll, M. G., Kirpekar, F., Maggert, K. A., Yoder, J. A., Hsieh, C. L., Zhang, X., Golic, K. G., Jacobsen, S. E. & Bestor, T. H. 2006. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2. Science, 311, 395-8.

Gorski, S. A., Dundr, M. & Misteli, T. 2006. The road much traveled: trafficking in the cell nucleus. Curr Opin Cell Biol, 18, 284-90.

Guo, J. U., Su, Y., Zhong, C., Ming, G. L. & Song, H. 2011. Hydroxylation of 5-methylcytosine by TET1 promotes active DNA demethylation in the adult brain. Cell, 145, 423-34.

Hagen, G. M., Caarls, W., Lidke, K. A., De Vries, A. H., Fritsch, C., Barisas, B. G., Arndt-Jovin, D. J. & Jovin, T. M. 2009. Fluorescence recovery after photobleaching and photoconversion in multiple arbitrary regions of interest using a programmable array microscope. Microsc Res Tech, 72, 431-40.

Page 234: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

225

Halfmann, R. & Lindquist, S. 2010. Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits. Science, 330, 629-32.

Hannum, G., Guinney, J., Zhao, L., Zhang, L., Hughes, G., Sadda, S., Klotzle, B., Bibikova, M., Fan, J. B., Gao, Y., Deconde, R., Chen, M., Rajapakse, I., Friend, S., Ideker, T. & Zhang, K. 2013. Genome-wide methylation profiles reveal quantitative views of human aging rates. Mol Cell, 49, 359-67.

Hashimoto, H., Horton, J. R., Zhang, X., Bostick, M., Jacobsen, S. E. & Cheng, X. 2008. The SRA domain of UHRF1 flips 5-methylcytosine out of the DNA helix. Nature, 455, 826-9.

Hashimoto, H., Liu, Y., Upadhyay, A. K., Chang, Y., Howerton, S. B., Vertino, P. M., Zhang, X. & Cheng, X. 2012. Recognition and potential mechanisms for replication and erasure of cytosine hydroxymethylation. Nucleic Acids Res, 40, 4841-9.

Held, M., Schmitz, M. H., Fischer, B., Walter, T., Neumann, B., Olma, M. H., Peter, M., Ellenberg, J. & Gerlich, D. W. 2010. CellCognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods, 7, 747-54.

Hemmerich, P., Schmiedeberg, L. & Diekmann, S. 2011. Dynamic as well as stable protein interactions contribute to genome function and maintenance. Chromosome Res, 19, 131-51.

Henderson, I. R. & Jacobsen, S. E. 2007. Epigenetic inheritance in plants. Nature, 447, 418-24. Hermann, A., Schmitt, S. & Jeltsch, A. 2003. The human Dnmt2 has residual DNA-(cytosine-C5)

methyltransferase activity. J Biol Chem, 278, 31717-21. Hiratani, I., Ryba, T., Itoh, M., Yokochi, T., Schwaiger, M., Chang, C. W., Lyou, Y., Townes, T. M.,

Schubeler, D. & Gilbert, D. M. 2008. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol, 6, e245.

Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H. & Peters, J. M. 2005. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature, 438, 1176-80.

Hopfner, R., Mousli, M., Jeltsch, J. M., Voulgaris, A., Lutz, Y., Marin, C., Bellocq, J. P., Oudet, P. & Bronner, C. 2000. ICBP90, a novel human CCAAT binding protein, involved in the regulation of topoisomerase IIalpha expression. Cancer Res, 60, 121-8.

Illert, A. L., Zech, M., Moll, C., Albers, C., Kreutmair, S., Peschel, C., Bassermann, F. & Duyster, J. 2012. Extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) mediates phosphorylation and inactivation of nuclear interaction partner of anaplastic lymphoma kinase (NIPA) at G2/M. J Biol Chem, 287, 37997-8005.

Illingworth, R. S., Gruenewald-Schneider, U., Webb, S., Kerr, A. R., James, K. D., Turner, D. J., Smith, C., Harrison, D. J., Andrews, R. & Bird, A. P. 2010. Orphan CpG islands identify numerous conserved promoters in the mammalian genome. PLoS Genet, 6, e1001134.

Im, K. B., Schmidt, U., Kang, M. S., Lee, J. Y., Bestvater, F. & Wachsmuth, M. 2013. Diffusion and binding analyzed with combined point FRAP and FCS. Cytometry A, 83, 876-89.

Indiani, C. & O'donnell, M. 2006. The replication clamp-loading machine at work in the three domains of life. Nat Rev Mol Cell Biol, 7, 751-61.

Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R. & Drummen, G. P. 2012. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules, 17, 4047-132.

Ito, S., Shen, L., Dai, Q., Wu, S. C., Collins, L. B., Swenberg, J. A., He, C. & Zhang, Y. 2011. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science, 333, 1300-3.

Iwata, A., Nagashima, Y., Matsumoto, L., Suzuki, T., Yamanaka, T., Date, H., Deoka, K., Nukina, N. & Tsuji, S. 2009. Intranuclear degradation of polyglutamine aggregates by the ubiquitin-proteasome system. J Biol Chem, 284, 9796-803.

Jachowicz, J. W., Santenard, A., Bender, A., Muller, J. & Torres-Padilla, M. E. 2013. Heterochromatin establishment at pericentromeres depends on nuclear position. Genes Dev, 27, 2427-32.

Jeltsch, A. 2006. On the enzymatic properties of Dnmt1: specificity, processivity, mechanism of linear diffusion and allosteric regulation of the enzyme. Epigenetics, 1, 63-6.

Joffe, B., Leonhardt, H. & Solovei, I. 2010. Differentiation and large scale spatial organization of the genome. Curr Opin Genet Dev, 20, 562-9.

Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P. & Jeltsch, A. 2011. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem, 12, 206-22.

Page 235: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

226

Kaminskas, E., Farrell, A. T., Wang, Y. C., Sridhara, R. & Pazdur, R. 2005. FDA drug approval summary: azacitidine (5-azacytidine, Vidaza) for injectable suspension. Oncologist, 10, 176-82.

Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. & Dibenedetto, E. 2012. Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data. Traffic, 13, 1589-600.

Karagianni, P., Amazit, L., Qin, J. & Wong, J. 2008. ICBP90, a novel methyl K9 H3 binding protein linking protein ubiquitination with heterochromatin formation. Mol Cell Biol, 28, 705-17.

Kemp, M. G., Ghosh, M., Liu, G. & Leffak, M. 2005. The histone deacetylase inhibitor trichostatin A alters the pattern of DNA replication origin activity in human cells. Nucleic Acids Res, 33, 325-36.

Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y. & Yamagata, K. 2010. Visualization of DNA methylation and histone modifications in living cells. Curr Opin Cell Biol, 22, 412-8.

Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T. & Brauchle, C. 2007. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat Mater, 6, 303-10.

Klein, C. J., Botuyan, M. V., Wu, Y., Ward, C. J., Nicholson, G. A., Hammans, S., Hojo, K., Yamanishi, H., Karpf, A. R., Wallace, D. C., Simon, M., Lander, C., Boardman, L. A., Cunningham, J. M., Smith, G. E., Litchy, W. J., Boes, B., Atkinson, E. J., Middha, S., Pj, B. D., Parisi, J. E., Mer, G., Smith, D. I. & Dyck, P. J. 2011. Mutations in DNMT1 cause hereditary sensory neuropathy with dementia and hearing loss. Nat Genet, 43, 595-600.

Koster, M., Frahm, T. & Hauser, H. 2005. Nucleocytoplasmic shuttling revealed by FRAP and FLIP technologies. Curr Opin Biotechnol, 16, 28-34.

Kouzarides, T. 2007. Chromatin modifications and their function. Cell, 128, 693-705. Lande-Diner, L., Zhang, J., Ben-Porath, I., Amariglio, N., Keshet, I., Hecht, M., Azuara, V., Fisher, A. G.,

Rechavi, G. & Cedar, H. 2007. Role of DNA methylation in stable gene repression. J Biol Chem, 282, 12194-200.

Lebold, T., Schlossbauer, A., Schneider, K., Schermelleh, L., Leonhardt, H., Bein, T. & Bräuchle, C. 2012. Controlling The Mobility Of Oligonucleotides In The Nanochannels Of Mesoporous Silica. Advanced Functional Materials, 22, 106-112.

Lee, B. & Muller, M. T. 2009. SUMOylation enhances DNA methyltransferase 1 activity. Biochem J, 421, 449-61.

Lee, J. Y. & Lee, T. H. 2012. Effects of DNA methylation on the structure of nucleosomes. J Am Chem Soc, 134, 173-5.

Leonhardt, H., Page, A. W., Weier, H. U. & Bestor, T. H. 1992. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. Cell, 71, 865-73.

Leonhardt, H., Rahn, H. P., Weinzierl, P., Sporbert, A., Cremer, T., Zink, D. & Cardoso, M. C. 2000. Dynamics of DNA replication factories in living cells. J Cell Biol, 149, 271-80.

Li, E., Bestor, T. H. & Jaenisch, R. 1992. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell, 69, 915-26.

Li, G. & Reinberg, D. 2011. Chromatin higher-order structures and gene regulation. Curr Opin Genet Dev, 21, 175-86.

Lindhout, B. I., Fransz, P., Tessadori, F., Meckel, T., Hooykaas, P. J. & Van Der Zaal, B. J. 2007. Live cell imaging of repetitive DNA sequences via GFP-tagged polydactyl zinc finger proteins. Nucleic Acids Res, 35, e107.

Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. M., Edsall, L., Antosiewicz-Bourget, J., Stewart, R., Ruotti, V., Millar, A. H., Thomson, J. A., Ren, B. & Ecker, J. R. 2009. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature, 462, 315-22.

Liu, X., Gao, Q., Li, P., Zhao, Q., Zhang, J., Li, J., Koseki, H. & Wong, J. 2013a. UHRF1 targets DNMT1 for DNA methylation through cooperative binding of hemi-methylated DNA and methylated H3K9. Nat Commun, 4, 1563.

Liu, Y., Aryee, M. J., Padyukov, L., Fallin, M. D., Hesselberg, E., Runarsson, A., Reinius, L., Acevedo, N., Taub, M., Ronninger, M., Shchetynsky, K., Scheynius, A., Kere, J., Alfredsson, L., Klareskog, L., Ekstrom, T. J. & Feinberg, A. P. 2013b. Epigenome-wide association data implicate DNA

Page 236: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

227

methylation as an intermediary of genetic risk in rheumatoid arthritis. Nat Biotechnol, 31, 142-7.

Liu, Y., Oakeley, E. J., Sun, L. & Jost, J. P. 1998. Multiple domains are involved in the targeting of the mouse DNA methyltransferase to the DNA replication foci. Nucleic Acids Res, 26, 1038-45.

Luger, K. 2006. Dynamic nucleosomes. Chromosome Res, 14, 5-16. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. & Richmond, T. J. 1997. Crystal structure of the

nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature, 389, 251-60. Ma, H., Reyes-Gutierrez, P. & Pederson, T. 2013. Visualization of repetitive DNA sequences in human

chromosomes with transcription activator-like effectors. Proc Natl Acad Sci U S A. Maeshima, K., Hihara, S. & Eltsov, M. 2010. Chromatin structure: does the 30-nm fibre exist in vivo?

Curr Opin Cell Biol, 22, 291-7. Mai, J., Trump, S., Ali, R., Schiltz, R. L., Hager, G., Hanke, T., Lehmann, I. & Attinger, S. 2011. Are

assumptions about the model type necessary in reaction-diffusion modeling? A FRAP application. Biophys J, 100, 1178-88.

Mai, J., Trump, S., Lehmann, I. & Attinger, S. 2013. Parameter importance in FRAP acquisition and analysis: a simulation approach. Biophys J, 104, 2089-97.

Mai, W. X. & Meng, H. 2013. Mesoporous silica nanoparticles: A multifunctional nano therapeutic system. Integr Biol (Camb), 5, 19-28.

Mak, A. N., Bradley, P., Bogdanove, A. J. & Stoddard, B. L. 2013. TAL effectors: function, structure, engineering and applications. Curr Opin Struct Biol, 23, 93-9.

Margot, J. B., Aguirre-Arteta, A. M., Di Giacco, B. V., Pradhan, S., Roberts, R. J., Cardoso, M. C. & Leonhardt, H. 2000. Structure and function of the mouse DNA methyltransferase gene: Dnmt1 shows a tripartite structure. J Mol Biol, 297, 293-300.

Margot, J. B., Ehrenhofer-Murray, A. E. & Leonhardt, H. 2003. Interactions within the mammalian DNA methyltransferase family. BMC Mol Biol, 4, 7.

Marzluff, W. F., Wagner, E. J. & Duronio, R. J. 2008. Metabolism and regulation of canonical histone mRNAs: life without a poly(A) tail. Nat Rev Genet, 9, 843-54.

Mateescu, B., England, P., Halgand, F., Yaniv, M. & Muchardt, C. 2004. Tethering of HP1 proteins to chromatin is relieved by phosphoacetylation of histone H3. EMBO Rep, 5, 490-6.

Maunakea, A. K., Nagarajan, R. P., Bilenky, M., Ballinger, T. J., D'souza, C., Fouse, S. D., Johnson, B. E., Hong, C., Nielsen, C., Zhao, Y., Turecki, G., Delaney, A., Varhol, R., Thiessen, N., Shchors, K., Heine, V. M., Rowitch, D. H., Xing, X., Fiore, C., Schillebeeckx, M., Jones, S. J., Haussler, D., Marra, M. A., Hirst, M., Wang, T. & Costello, J. F. 2010. Conserved role of intragenic DNA methylation in regulating alternative promoters. Nature, 466, 253-7.

Mazza, D., Abernathy, A., Golob, N., Morisaki, T. & Mcnally, J. G. 2012. A benchmark for chromatin binding measurements in live cells. Nucleic Acids Res, 40, e119.

Mazza, D., Cella, F., Vicidomini, G., Krol, S. & Diaspro, A. 2007. Role of three-dimensional bleach distribution in confocal and two-photon fluorescence recovery after photobleaching experiments. Appl Opt, 46, 7401-11.

Mccabe, M. T., Davis, J. N. & Day, M. L. 2005. Regulation of DNA methyltransferase 1 by the pRb/E2F1 pathway. Cancer Res, 65, 3624-32.

Meissner, A., Mikkelsen, T. S., Gu, H., Wernig, M., Hanna, J., Sivachenko, A., Zhang, X., Bernstein, B. E., Nusbaum, C., Jaffe, D. B., Gnirke, A., Jaenisch, R. & Lander, E. S. 2008. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature, 454, 766-70.

Mellert, K., Lamla, M., Scheffzek, K., Wittig, R. & Kaufmann, D. 2012. Enhancing endosomal escape of transduced proteins by photochemical internalisation. PLoS One, 7, e52473.

Misteli, T. 2001. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science, 291, 843-7.

Miyanari, Y., Ziegler-Birling, C. & Torres-Padilla, M. E. 2013. Live visualization of chromatin dynamics with fluorescent TALEs. Nat Struct Mol Biol, 20, 1321-4.

Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S. & Goldman, R. D. 2000. Nuclear lamins A and B1: different pathways of assembly during nuclear envelope formation in living cells. J Cell Biol, 151, 1155-68.

Page 237: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

228

Moldovan, G. L., Pfander, B. & Jentsch, S. 2007. PCNA, the maestro of the replication fork. Cell, 129, 665-79.

Monier, K., Mouradian, S. & Sullivan, K. F. 2007. DNA methylation promotes Aurora-B-driven phosphorylation of histone H3 in chromosomal subdomains. J Cell Sci, 120, 101-14.

Moore, L. D., Le, T. & Fan, G. 2013. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacology, 38, 23-38.

Morison, I. M., Ramsay, J. P. & Spencer, H. G. 2005. A census of mammalian imprinting. Trends Genet, 21, 457-65.

Mortusewicz, O., Ame, J. C., Schreiber, V. & Leonhardt, H. 2007. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res, 35, 7665-75.

Mortusewicz, O., Schermelleh, L., Walter, J., Cardoso, M. C. & Leonhardt, H. 2005. Recruitment of DNA methyltransferase I to DNA repair sites. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 8905-9.

Moscou, M. J. & Bogdanove, A. J. 2009. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science, 326, 1501.

Mousli, M., Hopfner, R., Abbady, A. Q., Monte, D., Jeanblanc, M., Oudet, P., Louis, B. & Bronner, C. 2003. ICBP90 belongs to a new family of proteins with an expression that is deregulated in cancer cells. Br J Cancer, 89, 120-7.

Mueller, F., Morisaki, T., Mazza, D. & Mcnally, J. G. 2012. Minimizing the impact of photoswitching of fluorescent proteins on FRAP analysis. Biophys J, 102, 1656-65.

Mueller, F., Wach, P. & Mcnally, J. G. 2008. Evidence for a common mode of transcription factor interaction with chromatin as revealed by improved quantitative fluorescence recovery after photobleaching. Biophys J, 94, 3323-39.

Muller, K. P., Erdel, F., Caudron-Herger, M., Marth, C., Fodor, B. D., Richter, M., Scaranaro, M., Beaudouin, J., Wachsmuth, M. & Rippe, K. 2009. Multiscale analysis of dynamics and interactions of heterochromatin protein 1 by fluorescence fluctuation microscopy. Biophys J, 97, 2876-85.

Nan, X., Ng, H. H., Johnson, C. A., Laherty, C. D., Turner, B. M., Eisenman, R. N. & Bird, A. 1998. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature, 393, 386-9.

Neumann, B., Walter, T., Heriche, J. K., Bulkescher, J., Erfle, H., Conrad, C., Rogers, P., Poser, I., Held, M., Liebel, U., Cetin, C., Sieckmann, F., Pau, G., Kabbe, R., Wunsche, A., Satagopam, V., Schmitz, M. H., Chapuis, C., Gerlich, D. W., Schneider, R., Eils, R., Huber, W., Peters, J. M., Hyman, A. A., Durbin, R., Pepperkok, R. & Ellenberg, J. 2010. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature, 464, 721-7.

Nishiyama, A., Yamaguchi, L., Sharif, J., Johmura, Y., Kawamura, T., Nakanishi, K., Shimamura, S., Arita, K., Kodama, T., Ishikawa, F., Koseki, H. & Nakanishi, M. 2013. Uhrf1-dependent H3K23 ubiquitylation couples maintenance DNA methylation and replication. Nature.

Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A. & Li, E. 1999. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell, 99, 247-57.

Okuwaki, M. & Verreault, A. 2004. Maintenance DNA methylation of nucleosome core particles. J Biol Chem, 279, 2904-12.

Padeken, J. & Heun, P. 2013. Centromeres in nuclear architecture. Cell Cycle, 12. Papait, R., Pistore, C., Negri, D., Pecoraro, D., Cantarini, L. & Bonapace, I. M. 2007. Np95 is implicated

in pericentromeric heterochromatin replication and in major satellite silencing. Mol Biol Cell, 18, 1098-106.

Park, Y. J. & Luger, K. 2008. Histone chaperones in nucleosome eviction and histone exchange. Curr Opin Struct Biol, 18, 282-9.

Pastor, W. A., Aravind, L. & Rao, A. 2013. TETonic shift: biological roles of TET proteins in DNA demethylation and transcription. Nat Rev Mol Cell Biol, 14, 341-56.

Peng, D. F., Kanai, Y., Sawada, M., Ushijima, S., Hiraoka, N., Kosuge, T. & Hirohashi, S. 2005. Increased DNA methyltransferase 1 (DNMT1) protein expression in precancerous conditions and ductal carcinomas of the pancreas. Cancer Sci, 96, 403-8.

Page 238: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

229

Peters, A. H., O'carroll, D., Scherthan, H., Mechtler, K., Sauer, S., Schofer, C., Weipoltshammer, K., Pagani, M., Lachner, M., Kohlmaier, A., Opravil, S., Doyle, M., Sibilia, M. & Jenuwein, T. 2001. Loss of the Suv39h histone methyltransferases impairs mammalian heterochromatin and genome stability. Cell, 107, 323-37.

Phair, R. D., Gorski, S. A. & Misteli, T. 2004a. Measurement of dynamic protein binding to chromatin in vivo, using photobleaching microscopy. Methods Enzymol, 375, 393-414.

Phair, R. D. & Misteli, T. 2000. High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus. Nature, 404, 604-9.

Phair, R. D., Scaffidi, P., Elbi, C., Vecerova, J., Dey, A., Ozato, K., Brown, D. T., Hager, G., Bustin, M. & Misteli, T. 2004b. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol, 24, 6393-402.

Pichler, G., Wolf, P., Schmidt, C. S., Meilinger, D., Schneider, K., Frauer, C., Fellinger, K., Rottach, A. & Leonhardt, H. 2011. Cooperative DNA and histone binding by Uhrf2 links the two major repressive epigenetic pathways. J Cell Biochem, 112, 2585-93.

Politz, J. C., Scalzo, D. & Groudine, M. 2013. Something silent this way forms: the functional organization of the repressive nuclear compartment. Annu Rev Cell Dev Biol, 29, 241-70.

Portela, A. & Esteller, M. 2010. Epigenetic modifications and human disease. Nat Biotechnol, 28, 1057-68.

Probst, A. V. & Almouzni, G. 2011. Heterochromatin establishment in the context of genome-wide epigenetic reprogramming. Trends Genet, 27, 177-85.

Qin, W. 2011. Studies of interacting proteins controlling DNA methyltransferase 1. PhD thesis, Ludwig-Maximilians-Universität.

Qureshi, I. A. & Mehler, M. F. 2010. Epigenetic mechanisms underlying human epileptic disorders and the process of epileptogenesis. Neurobiol Dis, 39, 53-60.

Rajakumara, E., Wang, Z., Ma, H., Hu, L., Chen, H., Lin, Y., Guo, R., Wu, F., Li, H., Lan, F., Shi, Y. G., Xu, Y., Patel, D. J. & Shi, Y. 2011. PHD finger recognition of unmodified histone H3R2 links UHRF1 to regulation of euchromatic gene expression. Mol Cell, 43, 275-84.

Ramsahoye, B. H., Biniszkiewicz, D., Lyko, F., Clark, V., Bird, A. P. & Jaenisch, R. 2000. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5237-42.

Rathousky, J., Zukalova, M., Kooyman, P. J. & Zukal, A. 2004. Synthesis and characterization of colloidal MCM-41. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 241, 81-86.

Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E. & Singh, H. 2008. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature, 452, 243-7.

Rhind, N. 2006. DNA replication timing: random thoughts about origin firing. Nat Cell Biol, 8, 1313-6. Richardson, B. 2003. Impact of aging on DNA methylation. Ageing Research Reviews, 2, 245-261. Robertson, K. D., Uzvolgyi, E., Liang, G., Talmadge, C., Sumegi, J., Gonzales, F. A. & Jones, P. A. 1999.

The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic Acids Res, 27, 2291-8.

Romer, T., Leonhardt, H. & Rothbauer, U. 2011. Engineering antibodies and proteins for molecular in vivo imaging. Curr Opin Biotechnol, 22, 882-7.

Rothbart, S. B., Dickson, B. M., Ong, M. S., Krajewski, K., Houliston, S., Kireev, D. B., Arrowsmith, C. H. & Strahl, B. D. 2013. Multivalent histone engagement by the linked tandem Tudor and PHD domains of UHRF1 is required for the epigenetic inheritance of DNA methylation. Genes Dev, 27, 1288-98.

Rothbart, S. B., Krajewski, K., Nady, N., Tempel, W., Xue, S., Badeaux, A. I., Barsyte-Lovejoy, D., Martinez, J. Y., Bedford, M. T., Fuchs, S. M., Arrowsmith, C. H. & Strahl, B. D. 2012. Association of UHRF1 with methylated H3K9 directs the maintenance of DNA methylation. Nat Struct Mol Biol, 19, 1155-60.

Rottach, A., Frauer, C., Pichler, G., Bonapace, I. M., Spada, F. & Leonhardt, H. 2010. The multi-domain protein Np95 connects DNA methylation and histone modification. Nucleic Acids Res, 38, 1796-804.

Page 239: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

230

Rouleau, J., Macleod, A. R. & Szyf, M. 1995. Regulation of the DNA methyltransferase by the Ras-AP-1 signaling pathway. J Biol Chem, 270, 1595-601.

Rountree, M. R., Bachman, K. E. & Baylin, S. B. 2000. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat Genet, 25, 269-77.

Russo, V. E. A., Martienssen, R. A. & Riggs, A. D. 1996. Epigenetic Mechanisms of Gene Regulation, Woodbury, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Saito, Y., Kanai, Y., Nakagawa, T., Sakamoto, M., Saito, H., Ishii, H. & Hirohashi, S. 2003. Increased protein expression of DNA methyltransferase (DNMT) 1 is significantly correlated with the malignant potential and poor prognosis of human hepatocellular carcinomas. Int J Cancer, 105, 527-32.

Saxton, M. J. 2001. Anomalous subdiffusion in fluorescence photobleaching recovery: a Monte Carlo study. Biophys J, 81, 2226-40.

Schaefer, M. & Lyko, F. 2010. Solving the Dnmt2 enigma. Chromosoma, 119, 35-40. Schermelleh, L., Haemmer, A., Spada, F., Rosing, N., Meilinger, D., Rothbauer, U., Cardoso, M. C. &

Leonhardt, H. 2007. Dynamics of Dnmt1 interaction with the replication machinery and its role in postreplicative maintenance of DNA methylation. Nucleic Acids Res, 35, 4301-12.

Schermelleh, L., Heintzmann, R. & Leonhardt, H. 2010. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol, 190, 165-75.

Schermelleh, L., Spada, F., Easwaran, H. P., Zolghadr, K., Margot, J. B., Cardoso, M. C. & Leonhardt, H. 2005. Trapped in action: direct visualization of DNA methyltransferase activity in living cells. Nat Methods, 2, 751-6.

Schlossbauer, A., Sauer, A. M., Cauda, V., Schmidt, A., Engelke, H., Rothbauer, U., Zolghadr, K., Leonhardt, H., Brauchle, C. & Bein, T. 2012. Cascaded photoinduced drug delivery to cells from multifunctional core-shell mesoporous silica. Adv Healthc Mater, 1, 316-20.

Schmiedeberg, L., Weisshart, K., Diekmann, S., Meyer Zu Hoerste, G. & Hemmerich, P. 2004. High- and low-mobility populations of HP1 in heterochromatin of mammalian cells. Mol Biol Cell, 15, 2819-33.

Schneider, K., Fuchs, C., Dobay, A., Rottach, A., Qin, W., Wolf, P., Alvarez-Castro, J. M., Nalaskowski, M. M., Kremmer, E., Schmid, V., Leonhardt, H. & Schermelleh, L. 2013. Dissection of cell cycle-dependent dynamics of Dnmt1 by FRAP and diffusion-coupled modeling. Nucleic Acids Res, 41, 4860-76.

Schwille, P., Meyer-Almes, F. J. & Rigler, R. 1997. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophys J, 72, 1878-86.

Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W. & Reik, W. 2013. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 368, 20110330.

Shao, L., Kner, P., Rego, E. H. & Gustafsson, M. G. 2011. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat Methods, 8, 1044-6.

Sharif, J., Muto, M., Takebayashi, S., Suetake, I., Iwamatsu, A., Endo, T. A., Shinga, J., Mizutani-Koseki, Y., Toyoda, T., Okamura, K., Tajima, S., Mitsuya, K., Okano, M. & Koseki, H. 2007. The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by recruiting Dnmt1 to methylated DNA. Nature, 450, 908-12.

Shen, L., Wu, H., Diep, D., Yamaguchi, S., D'alessio, A. C., Fung, H. L., Zhang, K. & Zhang, Y. 2013. Genome-wide analysis reveals TET- and TDG-dependent 5-methylcytosine oxidation dynamics. Cell, 153, 692-706.

Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. M., Pazin, M. J., Davie, J. R. & Peterson, C. L. 2006. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science, 311, 844-7.

Siebrasse, J. P., Grunwald, D. & Kubitscheck, U. 2007. Single-molecule tracking in eukaryotic cell nuclei. Anal Bioanal Chem, 387, 41-4.

Slowing, Ii, Vivero-Escoto, J. L., Wu, C. W. & Lin, V. S. 2008. Mesoporous silica nanoparticles as controlled release drug delivery and gene transfection carriers. Adv Drug Deliv Rev, 60, 1278-88.

Page 240: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

231

Smith, Z. D. & Meissner, A. 2013. DNA methylation: roles in mammalian development. Nat Rev Genet, 14, 204-20.

Sokolov, I. M. 2012. Models of anomalous diffusion in crowded environments. Soft Matter, 8, 9043. Somanathan, S., Suchyna, T. M., Siegel, A. J. & Berezney, R. 2001. Targeting of PCNA to sites of DNA

replication in the mammalian cell nucleus. J Cell Biochem, 81, 56-67. Song, J., Rechkoblit, O., Bestor, T. H. & Patel, D. J. 2011. Structure of DNMT1-DNA complex reveals a

role for autoinhibition in maintenance DNA methylation. Science, 331, 1036-40. Spector, D. L. 2001. Nuclear domains. J Cell Sci, 114, 2891-3. Sporbert, A., Gahl, A., Ankerhold, R., Leonhardt, H. & Cardoso, M. C. 2002. DNA polymerase clamp

shows little turnover at established replication sites but sequential de novo assembly at adjacent origin clusters. Mol Cell, 10, 1355-65.

Sprague, B. L. & Mcnally, J. G. 2005. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Trends Cell Biol, 15, 84-91.

Sprague, B. L., Muller, F., Pego, R. L., Bungay, P. M., Stavreva, D. A. & Mcnally, J. G. 2006. Analysis of binding at a single spatially localized cluster of binding sites by fluorescence recovery after photobleaching. Biophys J, 91, 1169-91.

Sprague, B. L., Pego, R. L., Stavreva, D. A. & Mcnally, J. G. 2004. Analysis of binding reactions by fluorescence recovery after photobleaching. Biophys J, 86, 3473-95.

Spruijt, C. G., Gnerlich, F., Smits, A. H., Pfaffeneder, T., Jansen, P. W., Bauer, C., Munzel, M., Wagner, M., Muller, M., Khan, F., Eberl, H. C., Mensinga, A., Brinkman, A. B., Lephikov, K., Muller, U., Walter, J., Boelens, R., Van Ingen, H., Leonhardt, H., Carell, T. & Vermeulen, M. 2013. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell, 152, 1146-59.

Stasevich, T. J., Mueller, F., Brown, D. T. & Mcnally, J. G. 2010. Dissecting the binding mechanism of the linker histone in live cells: an integrated FRAP analysis. EMBO J, 29, 1225-34.

Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Iyer, L. M., Liu, D. R., Aravind, L. & Rao, A. 2009. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science, 324, 930-5.

Takeshita, K., Suetake, I., Yamashita, E., Suga, M., Narita, H., Nakagawa, A. & Tajima, S. 2011. Structural insight into maintenance methylation by mouse DNA methyltransferase 1 (Dnmt1). Proc Natl Acad Sci U S A, 108, 9055-9.

Thanisch, K., Schneider, K., Morbitzer, R., Solovei, I., Lahaye, T., Bultmann, S. & Leonhardt, H. 2013. Targeting and tracing of specific DNA sequences with dTALEs in living cells. Nucleic Acids Res.

Trembecka, D. O., Kuzak, M. & Dobrucki, J. W. 2010. Conditions for using FRAP as a quantitative technique--influence of the bleaching protocol. Cytometry A, 77, 366-70.

Trojer, P. & Reinberg, D. 2007. Facultative heterochromatin: is there a distinctive molecular signature? Mol Cell, 28, 1-13.

Tuorto, F., Liebers, R., Musch, T., Schaefer, M., Hofmann, S., Kellner, S., Frye, M., Helm, M., Stoecklin, G. & Lyko, F. 2012. RNA cytosine methylation by Dnmt2 and NSun2 promotes tRNA stability and protein synthesis. Nat Struct Mol Biol, 19, 900-5.

Uemura, T., Kubo, E., Kanari, Y., Ikemura, T., Tatsumi, K. & Muto, M. 2000. Temporal and spatial localization of novel nuclear protein NP95 in mitotic and meiotic cells. Cell Struct Funct, 25, 149-59.

Unoki, M., Brunet, J. & Mousli, M. 2009. Drug discovery targeting epigenetic codes: the great potential of UHRF1, which links DNA methylation and histone modifications, as a drug target in cancers and toxoplasmosis. Biochem Pharmacol, 78, 1279-88.

Van Attikum, H. & Gasser, S. M. 2005. The histone code at DNA breaks: a guide to repair? Nat Rev Mol Cell Biol, 6, 757-65.

Van Royen, M. E., Farla, P., Mattern, K. A., Geverts, B., Trapman, J. & Houtsmuller, A. B. 2009. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) to Study Nuclear Protein Dynamics in Living Cells. Methods Mol Biol, 464, 363-85.

Vickaryous, M. K. & Hall, B. K. 2006. Human cell type diversity, evolution, development, and classification with special reference to cells derived from the neural crest. Biol Rev Camb Philos Soc, 81, 425-55.

Page 241: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

232

Vogel, M. C., Papadopoulos, T., Muller-Hermelink, H. K., Drahovsky, D. & Pfeifer, G. P. 1988. Intracellular distribution of DNA methyltransferase during the cell cycle. FEBS Lett, 236, 9-13.

Vomastek, T., Iwanicki, M. P., Burack, W. R., Tiwari, D., Kumar, D., Parsons, J. T., Weber, M. J. & Nandicoori, V. K. 2008. Extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2) phosphorylation sites and docking domain on the nuclear pore complex protein Tpr cooperatively regulate ERK2-Tpr interaction. Mol Cell Biol, 28, 6954-66.

Wachsmuth, M., Waldeck, W. & Langowski, J. 2000. Anomalous diffusion of fluorescent probes inside living cell nuclei investigated by spatially-resolved fluorescence correlation spectroscopy. J Mol Biol, 298, 677-89.

Wang, C., Shen, J., Yang, Z., Chen, P., Zhao, B., Hu, W., Lan, W., Tong, X., Wu, H., Li, G. & Cao, C. 2011. Structural basis for site-specific reading of unmodified R2 of histone H3 tail by UHRF1 PHD finger. Cell Res, 21, 1379-82.

Winkelmann, J., Lin, L., Schormair, B., Kornum, B. R., Faraco, J., Plazzi, G., Melberg, A., Cornelio, F., Urban, A. E., Pizza, F., Poli, F., Grubert, F., Wieland, T., Graf, E., Hallmayer, J., Strom, T. M. & Mignot, E. 2012. Mutations in DNMT1 cause autosomal dominant cerebellar ataxia, deafness and narcolepsy. Hum Mol Genet, 21, 2205-10.

Xie, S., Jakoncic, J. & Qian, C. 2012. UHRF1 double tudor domain and the adjacent PHD finger act together to recognize K9me3-containing histone H3 tail. J Mol Biol, 415, 318-28.

Xiong, R., Deschout, H., Demeester, J., De Smedt, S. C. & Braeckmans, K. 2014. Rectangle FRAP for Measuring Diffusion with a Laser Scanning Microscope. Methods Mol Biol, 1076, 433-41.

Xu, K., Babcock, H. P. & Zhuang, X. 2012. Dual-objective STORM reveals three-dimensional filament organization in the actin cytoskeleton. Nat Methods, 9, 185-8.

Xu, S. & Powers, M. A. 2013. In vivo analysis of human nucleoporin repeat domain interactions. Mol Biol Cell, 24, 1222-31.

Yang, X., Noushmehr, H., Han, H., Andreu-Vieyra, C., Liang, G. & Jones, P. A. 2012. Gene reactivation by 5-aza-2'-deoxycytidine-induced demethylation requires SRCAP-mediated H2A.Z insertion to establish nucleosome depleted regions. PLoS Genet, 8, e1002604.

Zemach, A., Mcdaniel, I. E., Silva, P. & Zilberman, D. 2010. Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation. Science, 328, 916-9.

Zentner, G. E. & Henikoff, S. 2013. Regulation of nucleosome dynamics by histone modifications. Nat Struct Mol Biol, 20, 259-66.

Zhang, Z., Wippo, C. J., Wal, M., Ward, E., Korber, P. & Pugh, B. F. 2011. A packing mechanism for nucleosome organization reconstituted across a eukaryotic genome. Science, 332, 977-80.

Zilberman, D., Coleman-Derr, D., Ballinger, T. & Henikoff, S. 2008. Histone H2A.Z and DNA methylation are mutually antagonistic chromatin marks. Nature, 456, 125-9.

Ziller, M. J., Muller, F., Liao, J., Zhang, Y., Gu, H., Bock, C., Boyle, P., Epstein, C. B., Bernstein, B. E., Lengauer, T., Gnirke, A. & Meissner, A. 2011. Genomic distribution and inter-sample variation of non-CpG methylation across human cell types. PLoS Genet, 7, e1002389.

Page 242: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

233

4.2 Abbreviations

3D-SIM: three-dimensional space structured illumination microscopy

5caC: 5-carboxcytosin

5fC: 5-formylcytosin

5hmC: 5-hydroxymethylcytosin

5hmU: 5-hydroxyuracil

5mC: 5-methylcytosin

Ac: acetylation

ADCA-DN: autosomal dominant cerebellar ataxia, deafness and narcolepsy

AID: activation induced cytidine deaminase

APOBEC: apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like

BAH: bromo adjacent homology

BBD: bar body deficient

BER: base excision repair

BrdU: bromodeoxyuridine

CpG: cytosine-phosphatidyl-guanine

Da: dalton

Df : diffusion coefficient

DMAP1: Dnmt1-associated protein 1

Dnmt: DNA methyltransferase

dTALE: designer transcription activator-like effector

EdU: ethynyldeoxyuridine

ER: endoplasmic reticulum

ERAD: ER-associated degradation

ERK2: extracellular signal-regulated kinase

ESC: embryonic stem cell

Fab: fragment antigen-binding

FCCS: fluorescence cross correlation spectroscopy

FCS: fluorescence correlation spectroscopy

FLIM: fluorescence lifetime imaging microscopy

FLIP: fluorescence loss in photobleaching

FRAP: fluorescence recovery after photobleaching

FRET: Förster resonance energy transfer

GFP: green fluorescent protein

HDAC: histone deacetylase

HSAN1: hereditary sensory and autonomic neuropathy type 1

Page 243: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

234

koff : dissociation rate

kon: association rate

MBD: methyl-CpG-binding domain

MBP: methyl-CpG-binding protein

MC: mobility class

Me: methylation

MF: mobile fraction

ms: major satellite

NIPA: nuclear interaction partner of anaplastic lymphoma kinase

NLS: nuclear localization signal

NuA4: nucleosomal acetyltransferase of H4

p400: E1A-binding protein p400

PALM: photoactivated localization microscopy

PBD: PCNA binding domain

PBHD: polybromo homology domain

PCNA: proliferating cell nuclear antigen

PHD: plant homeodomain

PZF: polydactyl zinc finger

RFC: replication factor C

RFP: red fluorescent protein

RICS: raster scan image correlation spectroscopy

RING: really interesting new gene

ROI: region of interest

RVD: repeat-variable-diresidue

s: second

SAM: S-adenosyl-L-methionine

SET: Suv39, Enhancer-of-zeste, Trithorax

SPR: surface plasmon resonance

SPT: single particle tracking

SRA: SET and RING associated

SRCAP: Snf2-Related CREBBP activator protein

STED: stimulated emission depletion

STORM: direct stochastic optical reconstruction microscopy

Suv: suppressor of Variegation

t1/2: half time recovery

TDG: thymine-DNA glycosylase

Page 244: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

235

Tet: ten-eleven- translocation

Tip60: Tat-interactive protein 60

TIRF: total internal reflection fluorescence

TPR: translated promoter region

Tres: mean residence time

TS: targeting sequence

TTD: tandem tudor domain

Ub: ubiquitination

Ubc9: ubiquitin carrier protein

Ubl: ubiquitin-like

Uhrf: ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains

wt: wild type

ZnF: zinc finger

Page 245: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

236

4.3 List of publications

1. Pichler G, Wolf P, Schmidt CS, Meilinger D, Schneider K, Frauer C, Fellinger K , Rottach A and

Leonhardt H (2011). Cooperative DNA and histone binding by Uhrf2 links the two major

repressive epigenetic pathways. J. Cell Biochem., 112, 2585-93.

2. Cardoso MC, Schneider K, Martin RM and Leonhardt H (2012). Structure, function and

dynamics of nuclear subcompartments. Curr Opin Cell Biol., 24, 79-85.

3. Lebold T, Schlossbauer A, Schneider K, Schermelleh L, Leonhardt H, Bein T and Bräuchle C

(2012). Controlling the mobility of oligonucleotides in the nanochannels of Mesoporous Silica.

Adv Funct Mater, 22, 106-112.

4. Bönisch C, Schneider K, Pünzeler S, Wiedemann SM, Bielmeier C, Bocola M, Eberl HC, Kuegel

W, Neumann J, Kremmer E, Leonhardt H, Mann M, Michaelis J, Schermelleh L and Hake SB

(2012). H2A.Z.2.2 is an alternatively spliced histone H2A.Z variant that causes severe

nucleosome destabilization. Nucleic Acids Res., 40, 5951-64.

5. Schneider K*, Fuchs C*, Dobay A, Rottach A, Qin W, Wolf P, Álvarez-Castro J, Nalaskowski M,

Kremmer E, Schmid V, Leonhardt H and Schermelleh L (2013). Dissection of cell cycle-

dependent dynamics of Dnmt1 by FRAP and diffusion-coupled modeling. Nucleic Acids Res.,

41, 4860-4876. * Joint first authors

6. Thanisch K, Schneider K, Morbitzer R, Solovei I, Lahaye T, Bultmann S, and Leonhardt H (2013).

Targeting and tracing of specific DNA sequences with dTALEs in living cells. Nucleic Acids Res.

7. Feilke M, Schneider K and Schmid V. Bayesian simultaneous analysis of a series of FRAP

images. Under review at Stat Appl Genet Mol Biol.

8. Kulinski M*, Schneider K*, Illert AL, Lemeer S, Kuster B, Leonhardt H and Duyster J. Cyclin B1

degrading F-box protein NIPA is localized to the nuclear pore complex. Manuscript in

preparation. * Joint first authors

Page 246: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

237

4.4 Contributions

Declaration of contributions to "Dissection of cell cycle-dependent dynamics of Dnmt1 by FRAP and

diffusion-coupled modeling”

This project was conceived by Heinrich Leonhardt, Lothar Schermelleh and Akos Dobay. I performed

all biological experiments, except the experiments resulting in the data presented in supplementary

figure 1 and 10. Together with Christiane Fuchs, Lothar Schermelleh, Volker Schmid and Akos Dobay, I

refined the FRAP evaluation and the mathematical model. Furthermore, I evaluated the FRAP data.

Christiane Fuchs developed the mathematical model as well as the corresponding model choice

criteria, wrote the software and estimated the model parameters. I wrote the first draft of the

manuscript, except the method sections “Mathematical Model”, “Model choice”, “Parameter

estimation” and “Numerics” (supplementary methods), which were written by Christiane Fuchs. In

addition, I finalized the manuscript together with Lothar Schermelleh, Christiane Fuchs and Heinrich

Leonhardt and prepared the figures together with Lothar Schermelleh.

Declaration of contributions to "Cooperative DNA and Histone Binding by Uhrf2 Links the Two Major

Repressive Epigenetic Pathways”

For this project, I established the strategy to perform and evaluate the FRAP experiments and

automatized the latter. Then, I carried out and evaluated the FRAP experiments together with Patricia

Wolf. Furthermore, I helped assemble the Figure 3C and the corresponding results and method

sections. Together with Patricia Wolf, I acquired and processed the images for the cover picture.

Declaration of contributions to "H2A.Z.2.2 is an alternatively spliced histone H2A.Z variant that causes

severe nucleosome destabilization”

Together with Lothar Schermelleh, I established the strategy to perform and evaluate the FRAP

experiments with a very long observation time. In addition, I created the tools for the automated FRAP

evaluation. Christina Bielmeier and I performed and evaluated the FRAP experiments. The curve fitting

strategy was established by Jürgen Neumann, assisted by Lothar Schermelleh and me. Fitting of the

curves was carried out by Jürgen Neumann and I further organized the results. With the help of Lothar

Schermelleh, I assembled the Figure 3B-D and supplementary figure S3A-C, E. In the end, I proofread

the manuscript.

Declaration of contributions to "Structure, function and dynamics of nuclear subcompartments”

I prepared figure 2, assisted Heinrich Leonhardt with literature research and proofread the

manuscript.

Page 247: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

238

Declaration of contributions to “Cyclin B1 degrading F-box protein NIPA is localized to the nuclear pore

complex”

I conceived and developed this project together with Michal Kulinski and performed and evaluated all

microscopy related experiments (FRAP, FLIP, long-term imaging, immunofluorescence, confocal

spinning disc microscopy and 3D-SIM). Moreover, I prepared and wrote the corresponding figures and

method sections, respectively. The first draft of the manuscript was written by Michal Kulinski and

complemented by me.

Declaration of contributions to “Targeting and tracing of specific DNA sequences with dTALEs in living

cells”

I carried out the initial experiments and developed the strategy to perform and evaluate the FRAP and

FLIP experiments. Further FRAP, FLIP and long-term imaging experiments were performed by

Katharina Thanisch and me. Moreover, I evaluated the FRAP and FLIP experiments and created figure

3, supplementary figure 4 and the supplementary movie. I wrote the first draft of the results part

“Analysis of in vivo protein dynamics reveals a strong but dynamic association of the GFP-msTALE with

CCs”, the method sections “Live cell microscopy, fluorescence loss in photobleaching and quantitative

fluorescence recovery after photobleaching analysis” and proofread the manuscript.

Declaration of contributions to "Controlling The Mobility Of Oligonucleotides In The Nanochannels Of

Mesoporous Silica”

I evaluated the FRAP data using a protocol that was developed together with Lothar Schermelleh,

organized the data and assisted Akos Dobay in the application of the kinetic model. Furthermore, I

proofread the manuscript.

Declaration of contributions to “Bayesian simultaneous analysis of multiple FRAP images with mixed-

effect priors”

I provided the data that has been also used to a large extend in Schneider et al., 2013 “Dissection of

cell cycle-dependent dynamics of Dnmt1 by FRAP and diffusion-coupled modeling”. Furthermore, I

commented on the manuscript and proofread it.

Page 248: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

239

4.5 Declaration

Page 249: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

240

4.6 Acknowledgment

This work would not have been possible without the great support of many persons to whom I want to

address my gratitude here:

First of all, I would like to thank my doctor father and supervisor Prof. Dr. Heinrich Leonhardt. I am

very grateful for the unique opportunity to conduct my PhD thesis in your group. Thanks for many

fruitful discussions about ongoing projects as well as future plans, for the appreciation of my work and

for constant support throughout the entire period of my PhD. The time in your lab not only influenced

my scientific, but also my personal development.

Many thanks also to Dr. Lothar Schermelleh, who supervised me in a large part of my PhD. Thank you

for your support, for always motivating and encouraging me and for introducing me to the world of

microscopy and image analysis. Special thanks for the numerous scientific discussions, always leading

to new ideas and approaches.

I would like to thank all collaboration partners. I am very grateful for the opportunity to make a

contribution to wonderful collaborations and to work with excellent scientists. Thank you for the great

atmosphere and for everything I have learned from you. A special thank you goes to the people, I

worked closely with: Dr. Christiane Fuchs (great thanks for your hard work), Dr. Michal Kulinski, Dr.

Clemens Bönisch, Antonia Jack, Dr. Sandra Hake, Dr. Timo Lebold, Dr. Robert Morbitzer, Martina

Feilke and Prof. Volker Schmid.

I am grateful to the external members of my thesis advisory committee, Dr. Sandra Hake and Prof.

Jens Michaelis, for the interest in my work, the motivating discussions and valuable feedback during

the meetings.

I thank Dr. Hans-Jörg Schäffer, Dr. Ingrid Wolf and Maxi Reif from the IMPRS coordination office for

the financial support and the great time I had during all the IMPRS seminars, soft skill workshops and

retreats. I am grateful to be part of such a wonderful PhD program. Thanks also to my IMPRS

colleagues, who are a great support. I would like to thank the IDK-NBT for the financial support and

the organization of the interesting lectures and workshops. Special thanks to Marilena Pinto, Dr.

Marie-Christine Blüm and Dr. Susanne Henning.

A very big thank you goes to all members of the Leonhardt group for the very friendly and supportive

atmosphere. A special thank you goes to Katharina, Patricia, Andrea, Garwin, Sebastian, Irina,

Weihua, Christine, Christina (Bielmeier), Danny and Karin for the joint efforts on scientific projects.

Anja and Susanne, thank you for helping me patiently with all the big, small and tiny problems and for

organizing the lab and very enjoyable events. I would like to thank the “microscopy team” including

Andreas, Jürgen, Yolanda, Barbara, Daniel, Hartmann, Sebastian, Irina for great discussions, great

Page 250: Dissecting the Dynamics of DNA Methyltransferase 1 and Related Nuclear Proteins in Living Cells

Annex

241

support and for everything I have learned from you. Thanks to Anna, Julia, Anke and Veronica for your

interest and your great commitment to the projects. I thank Weihua, Daniel, Wen, Nan, Katharina,

Patricia, Mengxi and Elisabeth for the great atmosphere in both offices.

Ein besonderer Dank geht an meine Familie. Besonders an meine Eltern, die mich immer unterstützt

und ermutigt haben. Ohne Euch wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

Am Ende möchte ich noch meinem Freund Ulli danken. Vielen Dank, dass du an meiner Seite bist.

Danke für deine Unterstützung und Motivation, aber auch dafür, dass du mir immer wieder klar

machst wie wichtig das Leben neben der Arbeit ist.