direktor: professor dr. med. h. k. müller-hermelink · 2013-12-09 · positive und negative...
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Aus dem Institut für Pathologie
der Universität Würzburg
Direktor: Professor Dr. med. H. K. Müller-Hermelink
Apoptosemessungen
bei Thymompatienten mit und ohne Myasthenia Gravis
Inaugural - Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der
Medizinischen Fakultät
der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg
vorgelegt von
Tobias Preisshofen
aus Ravensburg
Würzburg, Mai 2005
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Referent : Prof. Dr. med. Marx
Koreferent : Prof. Dr. med. Rieckmann
Dekan : Prof. Dr. med. Ertl
Tag der mündlichen Prüfung :
Der Promovend ist Arzt
Meinen Eltern Heidi und Lutz gewidmet,
als Dank für die Ermöglichung meines Studiums
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung _________________________________________________________ 1
1.1 Vorwort _____________________________________________________ 1
1.2 Fragestellungen und Zielsetzung der Arbeit _______________________ 6
2 Material und Methoden ______________________________________________ 7
2.1 Patientendaten und Gewebe ____________________________________ 7
2.2 Arbeitsgeräte und Hilfsmittel ___________________________________ 8
2.3 Lösungen ____________________________________________________ 9
2.4 Antikörper und Enzyme ______________________________________ 10
3 Methoden_________________________________________________________ 11
3.1 Thymus- und Thymomzellen___________________________________ 11
3.1.1 Isolation von Lymphozyten aus Frischgewebe __________________ 11
3.1.2 Zellzahlbestimmung in der Neubauerzählkammer________________ 11
3.1.3 Einfrieren _______________________________________________ 12
3.1.4 Auftauen ________________________________________________ 12
3.1.5 FACS-Färbung ___________________________________________ 13
3.1.6 Fixation_________________________________________________ 13
3.1.7 TUNEL-Färbung _________________________________________ 14
3.2 FACS-Analysen______________________________________________ 16
3.2.1 Antikörperprofil __________________________________________ 18
3.2.2 Auswertung der Messdaten _________________________________ 18
3.3 Immunhistologie und Immunfluoreszenz_________________________ 21
3.3.1 Bilderfassungssystem ______________________________________ 21
3.3.2 Bildanalyse ______________________________________________ 22
3.3.3 Statistische Auswertung der Daten____________________________ 22
4 Ergebnisse ________________________________________________________ 23
4.1 Stabilität des Phänotyps_______________________________________ 23
4.1.1 Optimierung der Auftaumethode _____________________________ 23
4.1.2 Veränderung der Subpopulationen nach dem Auftauen____________ 25
4.1.3 Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Subpopulationen _ 26
4.2 Unterschiede der einzelnen Reifungsstadien von Thymomen ________ 29
4.3 FACS-Apoptosemessungen ____________________________________ 31
4.4 Auswertung anhand der Farbdifferenzmethode ___________________ 37
4.5 TUNEL und DAPI-Immunfluoreszenz an Paraffinschnitten_________ 42
5 Diskussion ________________________________________________________ 43
5.1 Diskussion der Methodik ______________________________________ 43
5.1.1 Durchflusszytometrische TUNEL-Methode bei Thymozyten _______ 44
5.1.2 Immunhistochemische TUNEL-Methode bei Paraffinschnitten _____ 47
5.2 Untersuchung apoptotischer Thymozyten ________________________ 47
5.2.1 Diskussion der Reifungsstadien ______________________________ 48
5.3 Diskussion der Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der
Farbdifferenz-Methode zur Apoptose _________________________________ 49
6 Zusammenfassung _________________________________________________ 50
7 Anhang __________________________________________________________ 51
7.1 Eigene Publikationen _________________________________________ 51
7.2 Abbildungsverzeichnis ________________________________________ 52
7.3 Tabellenverzeichnis __________________________________________ 53
7.4 Literaturnachweis____________________________________________ 54
Abkürzungsverzeichnis
CD cluster of differentiation
DAPI 4',6-Diamidin-2-phenyl-indol
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DP doppelt positive (CD4+CD8+) Thymozyten
FACS fluorescence activated cellsorter
FCS fötales Kälberserum
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL 1,2,3 Fluoreszenz 1,2,3
FSC forward scatter
HP Humanplasma
MG Myasthenia gravis
MHC major histocompatibility complex
NM Nanometer
PBS phophate buffered saline
PE Phycoerythrin
RE Recent Thymic Emigrants
RPMI Rosewell-Park-Memorial-Institute Medium
RT Raumtemperatur
SP single positive (CD4+CD8- oder CD4-CD8+)Thymozyten
SSC side scatter
TE Thymic Emigrants
TdT terminale deoxynukleotidyl Transferase
TRI Tricolor
TUNEL Terminale Desoxynukleotidyltransferase mediated dUTP Nick End Label
1
1 Einleitung
1.1 Vorwort
Das Immunsystem des Menschen ist für die Abwehr gegen Bakterien, Viren und andere
Eindringlinge verantwortlich. Es werden hierfür die allgemeine (angeborene) und die
spezifische (erworbene) Immunantwort unterschieden.
Die allgemeine Immunantwort besteht aus phagozytierenden Zellen (Makrophagen,
Monozyten, Neutrophile), inflammatorischen Zellen (Mastzellen, Basophile,
Eosinophile), und den natürlichen Killerzellen.
Die spezifische (erworbene oder adaptive) Immunantwort wird über die Proliferation
von Antigen-spezifischen B-und T-Lymphozyten vermittelt, wobei Ihnen das Antigen
durch sogenannte spezialisierte Antigen präsentierende Zellen angeboten wird. Die B-
Zellen werden nach Ihrer Differenzierung in verschiedene Subpopulationen unterteilt
(Memoryzellen, Plasmazellen). Die Plasmazellen sezernieren antigenspezifische
Antikörper, wodurch infizierte Zellen oder Mikroorganismen zerstört werden können.
Bei den T-Lymphozyten werden als Hauptgruppen die zytotoxischen CD8+ T-Zellen
und die CD4+ T-Zellen unterschieden.
Die CD8+ T-Zellen erkennen Körperzellen , die mit Viren infiziert sind und töten diese
ab, die CD4+ Zellen werden in Abhängigkeit von den Zytokinen, welche sie
ausschütten, in TH1, TH2 und regulatorische T-Zellen eingeteilt (Janeway, Travers et
al. 2002).
Ein zentrales Element für die Entwicklung von T-Lymphozyten stellt der Thymus dar.
Alle Immunzellen des menschlichen Körpers entwickeln sich aus einer pluripotenten
Stammzelle in der fetalen Leber oder im Knochenmark. Die B-Zellen verbleiben bis zur
Ausreifung im Knochenmark, während die T-Zellen ihre endgültige Reife im Thymus
erlangen. (Delves and Roitt 2000).
Im Laufe der T-Zell-Reifung im Thymus durchlaufen die T-Zellen verschiedene
Entwicklungsstadien, worin sie sich durch Expression bestimmter T-Zell-
2
Oberflächenmarker unterscheiden lassen (Vanhecke, Leclercq et al. 1995). Abbildung 1
zeigt die Ausprägung der verschiedenen CD-Antigene der T-Zellen und die damit
verbundene Zugehörigkeit zu einer Subpopulation.
In der Thymusdrüse lernen die Lymphozyten körpereigene von körperfremden
Antigenen zu unterscheiden. Dieser Vorgang erfolgt über zwei Schritte, die sogenannte
positive und negative Selektion.
Bei der positiven Selektion werden T-Zellen, die mit Ihrem T-Zellrezeptor körpereigene
Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC) erkennen, selektioniert (Selbst-MHC-
Restriktion). Somit wird in diesem ersten Schritt sichergestellt, dass alle reifen T-Zellen
auf Fremdantigene antworten können, die von Selbst-MHC-Molekülen auf
antigenpräsentierenden Zellen vorgezeigt werden. Ca. 95 % der Thymozyten überstehen
diese positive Selektion nicht und sterben im Thymus ab (Surh and Sprent 1994; Delves
and Roitt 2000).
Als nächster Schritt folgt die negative Selektion, wobei hier diejenigen Lymphozyten,
deren Rezeptoren eine zu hohe Affinität gegen körpereigene Peptide aufweisen, zerstört
werden. In diesem zweiten Schritt werden somit autoreaktive T-Zellen eliminiert, und
der Körper wird vor Angriffen durch das eigene Abwehrsystem bewahrt. Störungen in
dem System der positiven und negativen Selektion können somit entweder zu einem
Immundefektsyndrom mit inadäquater Immunantwort oder zu einer
Autoimmunkrankheit führen.
3
Negative Selektion
PositiveSelektion
DP-Immature
CD4+CD8+CD3-CD69-CD1a+CD27-CD45RA-
SP-Immature
CD4+CD8-CD3-CD69-CD1a+CD27-CD45RA-
DP-post-Selektion
CD4+CD8+CD3+CD69+CD1a+CD27-CD45RA-
SP-Mature
CD4+CD8-CD3+CD69+CD1a-CD27+CD45RA-
SP-thymic emigrant
CD4+CD8-CD3+CD69+CD1a-CD27+CD45RA+CD45RA+
DP-prä-Selektion
CD4+CD8+CD3+CD69-CD1a+CD27-CD45RA-
Cortico-medulläreGrenzzone
Cortex
Medulla
Abbildung 1: Reifungstadien der Thymozyten in der menschlichen Thymusdrüse
In den einzelnen Entwicklungsstadien der humanen Thymusdrüse exprimieren dieThymozyten jeweils spezifischen Oberflächenmarker (CD). Die einfach positivenZellen (SP-Immature) entwickeln im Cortex der Thymusdrüse zunächst denOberflächenmarker CD8 (DP=doppelt positive Zellen). Nach der Positiven Selektionwird unter den doppelt positiven Zellen (CD4+,CD8+) zusätzlich derOberflächenmarker CD69 exprimiert (DP-post-Selektion). Nach der NegativenSelektion werden die einfach positiven Thymozyten (SP-Mature) durch dasVorhandensein von CD45RA unterschieden und sie verlassen als SP-thymic emigrantdie Medulla des menschlichen ThymusSP: einfach positive Zellen (CD4 +), DP: doppelt positive Zellen (CD4+CD8+)(Darstellung verändert nach (Vanhecke, Leclercq et al. 1995))
4
Ein klassisches Beispiel einer solchen Autoimmunkrankheit stellt die Myasthenia gravis
(MG) dar. Dieser Krankheitsbegriff wurde 1895 von Jolly et al. geprägt und ist mit dem
wesentlichen Merkmal einer raschen Ermüdbarkeit beschrieben worden. In zahlreichen
Untersuchungen konnten in den Seren der Patienten Autoantikörper gegen den
Acetylcholinrezeptor an der neuromuskulären Endplatte der quergestreiften Muskulatur
nachgewiesen werden (Lindstrom, Shelton et al. 1988). Klinisch zeigt sich die MG als
schwere generalisierte Muskelschwäche, die vor allem durch Beteiligung der
Atemmuskulatur zu bedrohlichen Zuständen führen kann.
Die Antikörperproduktion bei der MG ist ein T-Zell-abhängiger Prozess (Hohlfeld,
Kalies et al. 1986), der wiederum insbesondere durch TH2-Zellen (T-Helferzellen)
vermittelt wird (Marx, Wilisch et al. 1997).
Bei der Mehrheit der Patienten mit MG (80-90%) geht die Krankheit mit pathologischen
Thymusveränderungen einher, wobei die Art der Veränderungen mit klinischen und
epidemiologischen Befunden assoziiert wird und eine äthiologische Bedeutung für diese
Erkrankung besitzt (Marx, Wilisch et al. 1997). In Tabelle 1 werden folgende
Thymusveränderungen unterschieden :
Pathologische
Veränderungen
Häufigkeit innerhalb der
MG-Patienten in %Geschlecht / Alter
Rückbildung des
Thymus
(Atrophie)
10-20 %Überwiegend Männer
> 40 Jahre
Entzündlich
veränderter Thymus
(Thymitis)
70-80 %Überwiegend Frauen
bis 40 Jahre
Epithelialer
Thymustumor
(Thymom)
Ca. 10 %Keine Geschlechtsprävalenz
30 70 Jahre
Tabelle 1: Thymusveränderungen bei Myasthenia gravis (MG) (Vincent 2002).
5
Bei ca. 10% aller Patienten mit einer Myasthenia Gravis ist das Auftreten dieser
Krankheit die Folge einer paraneoplastischen Manifestation von epithelialen Tumoren
des Thymus (Thymome) (Müller-Hermelink, Engel et al. 2004). Thymome sind die
einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen produzieren können;
diese Fähigkeit ist sehr wahrscheinlich auch ursächlich für die sehr häufig mit
Thymomen assoziierten Autoimmunphänome.
Tabelle 2 zeigt die histopathologische Einteilung von Thymomen nach der
Klassifikation der Welt-Gesundheits-Organisation (WHO) (Müller-Hermelink, Engel et
al. 2004)
WHO-Typ Ältere, durch die WHO-Klassifikation abgelöste Synonyme
A Medulläres Thymom
AB Gemischtes Thymom
B1 Prädominantes kortikales Thymom
B2 Kortikales Thymom
B3 Gut differenziertes thymisches Karzinom
Thymuskarzinome Plattenepithelkarzinome
Lymphoepitheliom-ähnliche Karzinome
Sarkomatoide Karzinome
etc.
Tabelle 2: WHO-Klassifikation und Einteilung der Thymome nach WHO 2004
Bei der histopathologischen Einteilung können Thymome der WHO-Typen A, AB, und
B1-3 als organotypische den nicht-organotypischen thymischen Karzinomen
gegenübergestellt werden. Nur bei den organotypischen Thymomen sind wesentliche
Eigenschaften des Thymus einschließlich der Fähigkeit zur T-Zell-Reifung erhalten.
Praktisch alle Thymompatienten mit einer paraneoplastischen Myasthenia Gravis
besitzen zudem nachweisbare Autoantikörper gegen Acetylcholinrezeptoren..
In Abhängigkeit von den untersuchten Patientenkollektiven sind einige
Thymomsubtypen in bis zu 65 % der Fälle mit einer MG assoziiert (Okumura, Ohta et
6
al. 2002; Strobel, Bauer et al. 2004). Alle Myasthenie-assoziierten Thymome weisen als
Gemeinsamkeit die Fähigkeit einer vollständigen T-Zell-Reifung in der Thymusdrüse
auf und sind des weiteren in der Lage, die terminal reifen naiven T-Zellen in das
periphere Blut zu exportieren (Hoffacker, Schultz et al. 2000; Buckley, Douek et al.
2001; Strobel, Helmreich et al. 2002).
Ströbel et al. (2002) konnten in 22 Thymomen nachweisen, dass bei MG(-) Patienten im
Vergleich zu MG(+) Patienten die Anzahl terminal reifer thymic emigrant
CD45RA+CD4+ T-Zellen sowohl im Tumor als auch im peripheren Blut der Patienten
deutlich vermindert waren.
1.2 Fragestellungen und Zielsetzung der Arbeit
Vor dem Hintergrund, dass reife naive CD4+ T-Zellen in Thymomen mit großer
Wahrscheinlichkeit an der Pathogenese der paraneoplastischen Myasthenia gravis
beteiligt sind, wurden für diese Arbeit Apoptosemessungen der einzelnen
Reifungsstadien der T-Zellen bei Thymompatienten mit MG und ohne MG
durchgeführt. Basierend auf den Ergebnissen von Ströbel et al. 2002 (Strobel,
Helmreich et al. 2002) soll in dieser Arbeit zunächst untersucht werden, in welchem
Reifungsstadium die Entwicklung der CD4 T-Zellen bei Thymompatienten ohne MG
gestört ist und ob MG(-) Thymome eine höhere Apoptoserate der T-Lymphozyten
aufweisen als MG(+) Thymome. Da diese Störung in den späten T-Zell-Reifungsstadien
zu vermuten ist, soll durch diese Untersuchungen die Frage beantwortet werden, ob die
Myasthenia Gravis (MG) möglicherweise durch eine Störung der negativen Selektion
verursacht wird. Durch die Apoptosemessungen soll weiterhin geklärt werden, ob der
Verlust der terminalen Reifungsstufen in MG(-) Thymomen die Folge einer erhöhten
Apoptoserate oder Folge eines vorzeitigen release unreifer T-Zellen in das periphere
Blut im Sinne einer Schrankenstörung darstellt. Für die nachfolgenden Untersuchungen
bei der Durchflusszytometrie wurden Lymphozyten aus Thymomgewebe mit und ohne
MG miteinander verglichen. Aufgrund der Seltenheit dieser speziellen
Untersuchungsgruppen konnte trotz der damit verbundenen technischen Probleme nur
tiefgefrorenes Zellmaterial verwendet werden.
7
2 Material und Methoden
2.1 Patientendaten und Gewebe
Tabelle 3 zeigt eine Zusammenstellung der Patientendaten, deren T-Zellen für die
Untersuchungen herangezogen wurden. Die Diagnose der MG beruhte auf klinischen
Befunden, der Feststellung eines Dekrements bei einer Serienstimulation von 3 Hz
elektromyographischen Untersuchungen, sowie auf der Bestimmung der Konzentration
von Autoantikörpern gegen den nikotinischen Acetycholinrezeptor der motorischen
Endplatte mittels eines Radioimmuno-Assays (Nenninger, Schultz et al. 1998). Die
Thymome wurden entsprechend der WHO-Klassifikation eingeteilt (Müller-Hermelink,
Engel et al. 2004). Es wurden ausschließlich Patientenfälle ohne Vorbehandlung mit
Steroiden oder Immunsuppressiva verwendet.
Pat.No Case No MG Alter Geschl. Diagnose1 97/11704 Ja 33 m Thymitis
2 97/4494 Ja 18 m Thymitis
3 99/16725 Ja 20 w Thymitis
4 02/21795 Ja 24 w Thymitis
5 98/5633 Ja 36 m AB
6 00/28318 Ja 43 m AB
7 97/9669 Ja 57 w AB
8 00/25907 Ja 58 w B2
9 00/20223 Ja 50 w B2
10 99/3983 Ja 70 w B2
11 00/22717 Ja 74 w B2
12 99/13575 Ja 39 w B2
13 99/21994 Ja 65 m B2
14 01/4054 Nein 50 m AB
15 00/1495 Nein 53 w AB
16 00/1495 Nein 67 m AB
17 01/5447; H1492/01 Nein 58 m B2
18 98/5186 Nein 69 w B2
19 97/20308 Nein 68 w B2
20 00/3045; E00/16857 Nein 51 m B2
21 97/6335 Nein 83 w B2
Die Diagnose der Thymome (AB, B2) richtet sich nach der WHO-Klassifikation 2004m = männlich, w = weiblichTabelle 3: Klinische Daten der untersuchten Thymom- und Thymitispatienten mit
und ohne Myasthenia Gravis (MG)
8
2.2 Arbeitsgeräte und Hilfsmittel
Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden nachfolgende
Arbeitsgeräte verwendet :
Aquabidest-Anlage Milli-Q Plus PF Millipore
Eismaschine Scotman AF-10 Genheimer, Hettstadt
FACScan (488nm, Argonlaser) Becton Dickinson
Lichtmikroskop 201529 Wilovert
Lichtmikroskop Axioplan Zeiss, Oberkochen
Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Jena
Lichtmikroskop 201529 Wilovert
Pipettensatz Eppendorf
Farbkamera NIKON, DXM 1200
Sterilbank Lamin Air Heraeus
Vakuumpumpe VP 100 Two Stage Savant, Farmingdale, NY, USA
Vortex Model g-560E Bender & Hobein AG
Waage Satorius, Göttingen
Wasserbad Kottermann, Labortechnik, Uetze-Hänigsen
Zentrifuge Omnifuge 2.0 RS Heraeus, Sepatech, Osterode
Tabelle 4: Verwendete Arbeitsgeräte
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2.3 Lösungen
Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden nachfolgende
Substanzen und Lösungen verwendet :
Tabelle 5: Verwendete Lösungen
CytofixTM 4% Paraformaldehyd
Einfriermedium 80 % (v/v) FCS, 20 % (v/v) DMSO
FACS-Puffer 0,5 % (w/v) BSA und 0,01 % Natriumazid in PBS gelöst
PBS (10x) 72,0 g/l NaCl, 14,8 g/l Na2HPO4, 4,3 g/l KH2PO4
Perm/WashTM
bufferSaponin, FBS
TdT Terminale desoxynukleotidyl Transferase
TRIS-Puffer Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Trypanblau-Lösung 5g/l Trypanblau, 9g/l NaCl gelöst in H2O
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2.4 Antikörper und Enzyme
In der nachfolgenden Tabelle 6 sind die verwendeten Antikörper und Enzyme für die
durchflusszytometrischen Untersuchungen dargestellt.
Antikörper Konjugat Spezies Verdünnung Bezugsquelle
Maus IgG 1 FITC Isotyp 1:100 Sigma
Maus IgG 1 PE Isotyp 1:200 Sigma
Maus IgG 1 TRI Isotyp 1:100 Sigma
Maus IgG 2a unkonjugiert Isotyp 1:200 Sigma
Goat-anti-mouse TRI - 1:50 Sigma
CD 3 PE Maus anti Human 1:50 Dako
CD 3 TRI Maus anti Human 1:100 Dako
CD 4 PE Maus anti Human 1:25 Sigma
CD 4 TRI Maus anti Human 1:50 Sigma
CD 8 PE Maus anti Human 1:100 Dako
CD 8 TRI Maus anti Human 1:100 DAKO
CD 27 unkonjugiert Maus anti Human 1:12,5 Sigma
CD 45 RA PE Maus anti Human 1:50 Dianova
CD 69 PE Maus anti Human 1:50 BD
TUNEL FITC DNA-Markierung 50µl Roche
DAPI - - -Eigene
Herstellung
Tabelle 6: Verwendete Antikörper und Enzyme
Farbstoffe: FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, TRI = Tricolor,DAPI = 4',6-Diamidin-2-phenyl-indol, CD = Oberflächenmarker,DNA: Desoxyribonukleinsäure, IgG: Immunglobulin G
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3 Methoden
3.1 Thymus- und Thymomzellen
Das Thymus und Thymommaterial wurde uns aus den Universitätskliniken Würzburg,
Mainz und Regensburg in nativem Zustand zugesandt (in steriler 0,9% NaCl-Lösung
und auf Eis gekühlt).
3.1.1 Isolation von Lymphozyten aus Frischgewebe
Das native Thymomgewebe wurde von makroskopisch sichtbarem Fettgewebe und
Blutgefässen befreit und in kleine Stückchen geschnitten. Anschließend wurden diese
unter Zuhilfenahme eines Spritzenkolbens durch ein Stahlsieb gepresst, und die daraus
resultierende Zellsuspension durch eine Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation
aufgereinigt. Etwa 0-15 ml Ficoll-Lösung (RT) wurden in ein Falcon-Röhrchen
pippetiert und mit der maximal doppelten Menge einer Zellsuspension vorsichtig
überschichtet und zentrifugiert (20 Minuten bei 1480 U/min, 20°C). Danach konnten die
mononukleären Zellen (Thymozyten) als trüber Interphasering abpipettiert werden. Die
Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen (10min 1480 U/min), in RPMI + 3 % HP
(Humanplasma) aufgenommen und auf Eis gestellt.
3.1.2 Zellzahlbestimmung in der Neubauerzählkammer
Zur Bestimmung der Zellzahl wurden 10µl der Zellsuspension mit 90µl Trypanblau
gemischt und in die Neubauerzählkammer pipettiert. Nach dem mikroskopischen
Auszählen von 4 Großquadranten konnte der Zelltiter der Thymozyten anhand
folgender Formel ermittelt werden :
12
Der so ermittelte Wert stellt die Anzahl der Zellen pro Milliliter dar.
3.1.3 Einfrieren
Die Thymuszellen wurden in RPMI + 5 % FCS auf Eis gekühlt und mit einem
eisgekühlten Einfriermedium (80 % FCS + 20 % DMSO) 1:1 verdünnt. Danach wurden
die Zellen mit verschiedenen Zellkonzentrationen von 2 x 106 bis 1 x 108 Zellen/ml in 2
ml Kryoröhrchen bei 80° C eingefroren. Nach 36 h wurden die Röhrchen in flüssigen
Stickstoff überführt.
3.1.4 Auftauen
Die Zellen wurden aus dem Stickstofftank genommen und im Wasserbad bei 37° C für
ca. 2 Minuten aufgetaut. Danach wurde die Zellsuspension sofort vorsichtig in 10 ml
ebenfalls auf 37° C vorgewärmtes PBS versetzt und 5 Minuten bei 1480 U/min
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet mit einer Pipette und 10ml
vorgewärmtem PBS behutsam resuspendiert. Die relativ starke Verklumpung, die auf
den Auftauvorgang lysierter Zellen zurückzuführen ist, wurde abpipettiert, da es sich
um ein nicht auflösbares Aggregat zerstörter Zellen und Epithelzelldetritus handelte.
Dieser Vorgang wurde zweimal durchgeführt, so dass nach nochmaligem
Zentrifugieren, Absaugen und Resuspendieren die Zellzahl im 1 ml PBS mit Hilfe der
Neubauerzählkammer (siehe Abschnitt 3.1.2) nur 5 - 10 %, bezogen auf die Zahl der
eingefrorenen Thymozyten, betrug. Die Anzahl der Lymphozyten konnte durch einige
Modifikationen optimiert werden (siehe 4.1.1).
(Zahl der gezählten Zellen) x 105 = Konzentration der Zellen pro Milliliter (ml)4
13
3.1.5 FACS-Färbung
Für die jeweiligen Färbungen der Oberflächenmarker wurden 1x105 bis 2x105 Zellen in
einem Volumen von 100 µl FACS- Puffer aufgenommen und mit 10µl der speziellen
Antikörperverdünnung vermischt und für 15 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubiert.
Anschließend wurden nicht gebundene Antikörper durch einen Waschschritt entfernt.
Dazu wurden 2ml FACS Puffer zu jedem Ansatz pipettiert, gevortext, und für 5
Minuten bei 1500 U/min und 4 °C zentrifugiert. Nach vorsichtigem Absaugen des
Überstandes war das Sediment für den nächsten Färbevorgang bereit. Als
Negativkontrollen wurden die entsprechenden Zellen mit den Isotypen der verwendeten
Antikörper gefärbt.
Da bei den Färbevorgängen der erste mit FITC-konjugierte Kanal durch die später
folgende TUNEL-Färbung benötigt wurde, wurde mit denjenigen direkt konjugierten
Antikörpern begonnen, die PE bzw. TRI-konjugiert waren. Die Antikörper wurden bei
den Mehrfachfärbungen im selben Arbeitsschritt zu den Zellen hinzugefügt.
Bei den Ansätzen, bei welchen ein unkonjugierter Antikörper zum Einsatz kam, wurden
die Proben als erstes mit diesem konjugiert (CD 27). Danach wurde ein gegen den
ersten gerichteten farbkonjugierter Antikörper (Goat-anti-Maus TRI konjugiert) der
Probe zugegeben, und wiederum 15 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubiert. Danach
wurde den Proben mit unkonjugiertem Antikörper ein Maus-IgG-Antikörper als Blocker
hinzugegeben. Nach nochmaliger Inkubation von 15 Minuten im Dunkeln auf Eis,
folgte ein Waschschritt mit 2ml FACS Puffer, sowie die Färbung mit den restlichen
direktfärbenden Antikörpern (siehe oben).
3.1.6 Fixation
Nach dem letzten Waschschritt wurden zu jeder Probe jeweils 200 µl Cytofix pipettiert
und 20 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Das CytofixTM diente der Fixierung und
der Stabilisierung der Zellmembran der Thymozyten für die nächsten
Inkubationsschritte (siehe 3.1.7).
14
Um das für die Zellen toxische Cytofix zu entfernen wurden die verschiedenen Proben
mit jeweils 2ml Perm/WashTMbuffer (Detergens) gewaschen (1480 U/min, 4°C) und der
Überstand mit einer Pipette abgesaugt. Dieser Vorgang wurde zweimal sorgfältig
durchgeführt, um sicherzugehen, dass das CytofixTM gründlich entfernt wurde.
3.1.7 TUNEL-Färbung
Das In Situ Cell Death Detektion Kit Fluorescein von Roche beinhaltet mehrere caps
mit einer 50 µl Enzym-Lösung, die zum einen die TdT (Terminalen desoxynukleotidyl
Transferase) und zum anderen die 550 µl Lösung mit markierten FITC gekoppelten
Nukleotiden enthält. Die bei 25 °C aufbewahrten Lösungen werden vor jeder
Versuchsreihe neu aufgetaut. Von der 550 µl Markierungslösung werden 450 µl
abpipettiert und mit der 50 µl TdT-Lösung gemischt. Die restlichen 100 µl der
Markierungslösung dienten den Negativkontrollen, die bei jeder Versuchsreihe zweimal
mitgeführt wurden.
Die bereits gefärbten und fixierten, in jeweils 100 µl Perm/WashTMbuffer befindlichen
Zellen wurden nun mit 50 µl der jetzt neugemischten Lösung (TdT + markierte
Nukleotide) pipettiert und für 30 Minuten bei 37 °C im Brutschrank inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen wiederum zweimal mit Perm/WashTMbuffer
gewaschen (siehe oben) und in 100-200 µl FACS-Puffer überführt.
Die für jede Versuchsreihe mitgeführte Positivkontrolle wurde ebenso mit CytofixTM
behandelt und zusätzlich mit 10 µl DNAse versetzt und 20 Minuten
inkubiert.Unmittelbar danach schloss sich die Analyse der Thymozyten mit Hilfe des
FACScanTM an. Die einzelnen Zellen der Proben 1-6, sowie die Positiv-, und
Negativkontrollen (siehe Versuchsprotokoll) befanden sich in einem Volumen von 50-
200 µl FACS Puffer.
15
Abbildung 2: Prinzip der TUNEL-Färbung
Das freie 3`OH-Ende der DNA-Fragmente (nicks) wird mit FITC-markiertenNukleotiden (dUTP) in Anwesenheit der terminalen Desoxyribonukleotidyltransferase(TdT) gekennzeichnet
TdT
Fluorescein markierte dUTP
DNA-Fragment ( nicks )
16
3.2 FACS-Analysen
In FACS-Röhrchen verteilt wurden die einzelnen Proben mit dem FACScanTM der
Firma Becton und Dickinson aufgezeichnet. Dieses Gerät ist mit einem Argon-Laser
(488 nm, 15 mW) ausgestattet und arbeitet mit der Lysis 2 -Software. Um die
einzelnen Fluoreszenzen auf dem Monitor übersichtlich darzustellen, wurden insgesamt
7 verschiedene Diagramme als Dot plot (FSC-SSC, FL-1-FL-2, FL-1-FL-3, FL-2-FL-3)
und als Histogramm (FL-1, FL-2, FL-3) gewählt. Die Aufnahmegeräteeinstellung des
zweiten und dritten Fluoreszenzkanals erfolgte wie bei einer normalen
Antikörperfärbung. Vor dem Einlesen der Proben wurde mit Hilfe der Isotypen und
Kompensationsproben (siehe Versuchsprotokoll, Tabelle 4) anhand der Histogramme
ein sogenannter Nullabgleich durchgeführt, so dass im Histogramm der jeweiligen
Färbung die Thymozyten im Bereich von 101 der logarhythmischen Skala abgebildet
waren.
Für den ersten Fluoreszenzkanal wurden zuerst die Kontrollproben (1 Positiv-Kontrolle
und 2 Negativ-Kontrollen) eingelesen, anhand derer bei der Auswertung mit PC-Lysis-
2TM die Marker gesetzt wurden.
Danach wurden bei langsamer Durchflussgeschwindigkeit alle events aufgenommen,
bis etwa 20 000 Zellen gezählt wurden. Um bei der Messung die größeren
Zellfragmente und Verunreinigungen auszuschließen, wurde als Schwelle (Threshold)
ein Wert von 60 eingestellt. Ein Gate wurde bei den Messungen nicht verwendet.
17
Proben 1.Antikörper 2. Antikörper 3.Antikörper
Negativkontrolle - - -
Isotyp Ig-G1-FITC IgG-1-PE IgG1-TRI
Isotyp IgG-2a-unkonjugiert - G.a.M.-TRI
Kompensation CD3-FITC - -
Kompensation - CD3-PE -
Kompensation - - CD3-TRI
Probe 1 TUNEL CD4-PE CD8-TRI
Probe 2 TUNEL CD4-PE CD3-TRI
Probe 3 TUNEL CD69-PE CD3-TRI
Probe 4 TUNEL CD4-PE
CD27 unkonjugiert
+ G.a.M
+ Blocker
Probe 5 TUNEL CD8-PE
CD27 unkonjugiert
+ G.a.M
+ Blocker
Probe 6 TUNEL CD45-RA CD4-TRI
Probe 7 TUNEL CD45-RA CD8-TRI
Positiv-Kontrolle TUNEL + 10µl DNAse -
Negativ-Kontrolle TUNEL - -
Negativ-Kontrolle TUNEL - -
Farbstoffe: FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin, TRI = Tricolor,G.a.M.: Goat-anti Maus, CD: Oberflächenmarker, DNAse: Enzym zur DNA Spaltung
Tabelle 7: Versuchsprotokoll für TUNEL-Apoptosemessung
18
3.2.1 Antikörperprofil
Die verwendeten Antikörper dienen der Erfassung der verschiedenen Reifestadien von
Thymozyten. Zur Überprüfung dieser Reifestadien wurden Antikörper gegen folgende
Antigene verwendet
CD4 (Vanhecke, Verhasselt et al. 1995)
CD8 (Vanhecke, Verhasselt et al. 1995)
CD3 (Vanhecke, Leclercq et al. 1995)
CD45 RA (Vanhecke, Leclercq et al. 1995)
CD27 (Camerini, Walz et al. 1991; Vanhecke, Leclercq et al. 1995)
CD69 (Vanhecke, Leclercq et al. 1995)
3.2.2 Auswertung der Messdaten
Die Messdaten der Antikörpermessungen und der Apoptosemessungen wurden unter
Zuhilfenahme eines PCs mit PC-LysisTM Software Version1.1 ausgewertet. Zuerst
wurde ein Dot plot Fenster der FL3 (y-Achse) und FL2 (x-Achse) dargestellt und darin
4 verschiedene Gates entsprechend den jeweiligen Färbungen bestimmt (siehe
Abbildung 3). Um die Apoptose mittels TUNEL im ersten Fluoreszenzkanal bestimmen
zu können, war es notwendig, in jedem Histogramm einen definierten Marker (M1) für
jedes Gate (R1-R4) zu setzen, ab welchem die Zellen als apoptotisch zu bezeichnen
sind.
Um diesen Marker für Fluoreszenz 1 möglichst objektiv zu bestimmen, wurde hierbei
als Markerbeginn der Schnittpunkt der Negativkontrollen mit der Positivkontrolle
gewählt. Jetzt wurden Fluoreszenz 1 aus den Gates R1-R4 zur besseren Übersicht in
Histogrammen dargestellt, in welchen die Marker für Apoptose (M1) schon definiert
waren.
19
Abbildung 3: Contour blot einer CD45 (FL-2) und CD8 (FL-3) Färbung
Nachdem die Thymozyten anhand des Versuchsprotokolls markiert wurden, konnten siein einem Contourblot entsprechend Ihrer Färbung im Fluoreszenzkanal (FL-3-FL-2)dargestellt werden. Die der Färbung entsprechend gesetzten Gates R1, R2, R3 und R4beinhalten alle darin enthaltenen Zellen. Die Thymozyten stammen von einemcortikalen Thymom mit Myasthenia Gravis (MG) (00/20223)R1 = doppelt negative Zellen (CD45-, CD8-)R2 = einfach positive Zellen (CD45-, CD8+)R3 = doppelt positive Zellen (CD45+, CD8+)R4 = einfach positive Zellen (CD45+, CD8-)
20
Abbildung 4: Histogramm bei Aufnahme der Apoptosefärbung mit TUNELDer Marker wurde am Schnittpunkt der Positivkontrolle mit der Negativkontrolle gesetzt.
Abbildung 5: Darstellung der Apoptoseauswertung anhand vonHistogrammenDarstellung einer TUNEL-Färbung in FL-1. Die Histogramme zeigeneine TUNEL-Färbung in FL1 mit definierten Gates R1-R4, die anhandeines Dotplots von FL2/FL3 gesetzt wurden. Der definierte Marker(M1) wurde anhand des Schnittpunktes der Positivkontrolle (sieheAbbildung 4) mit der Negativkontrolle gesetzt.
21
3.3 Immunhistologie und Immunfluoreszenz
Gemäß der Gebrauchsanleitung des In Situ Cell Death Detektion Kit Fluorescein von
Roche wurde anhand von Paraffinschnitten eine TUNEL-Färbung durchgeführt. Diese
Schnitte wurden danach mit einem Mikroskop einer digitalen Farbkamera
aufgenommen und ausgewertet (siehe 3.3.1)
Zusätzlich wurde bei manchen Paraffinschnitten noch eine Zellkernfärbung mit einer
DAPI-Lösung (4',6-Diamidin-2-phenyl-indol) durchgeführt. Dazu wurden die Schnitte
nach der Fixation durch Formaldehyd (10 Minuten bei RT) und Permeabilisation mit
0,2 % Triton X-100 in PBS(10 Minuten bei RT) mit 50µl einer DAPI-Färbelösung
überschichtet und 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach folgte
direkt die TUNEL-Färbung und die gefärbten Schnitte wurden danach mit einem
konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) bei einer Wellenlänge von 515-565 nm
aufgenommen. Bei der Analyse der Bilder (siehe 3.3.2) konnte somit anhand der
Überschneidung der TUNEL-Färbung mit der Zellkernfärbung bestimmt werden,
welche Lymphozyten Apoptose aufweisen.
3.3.1 Bilderfassungssystem
Die mit TUNEL-gefärbten corticalen Thymompräparate wurden in einem Mikroskop
(Axioplan, Zeiss, Oberkochen) mit einer digitalen Farbkamera (Nikon, DXM 1200)
erfasst und im Computer auf CD-ROMS gespeichert. Dem Betrachter waren jedoch
zum Zeitpunkt der Untersuchung Einzelheiten der Präparate (MG(+), MG(-), Thymom
oder Thymitis) nicht bekannt.
Jeder der drei Farbkanäle (rot, grün, blau) hatte einen Dynamikbereich von acht bit
(Wertebereich 0-255). Als Objektiv diente ein Ultrafluar (10x) mit einer numerischen
Apertur (NA) von 0,2 und ein Kondensor mit einer maximalen NA von 0,63. Zur
Beleuchtung wurde eine Halogenlampe (100 Watt) mit variabler Spannung verwendet.
22
Die digitalisierten Bildszenen hatten eine Größe von 2048 x 2560 Bildpunkten und in
jeder Bildszene wurde eine Fläche von 1,295 mm2 auf dem Objektträger erfasst.
3.3.2 Bildanalyse
Die zur Analyse der Bilder notwendigen Algorhythmen waren in FORTRAN
programmiert. Die gescannten Bildszenen wurden auf der Workstation mit Hilfe einer
Farbanalyse auf die verschiedenen Komponenten im gefärbten Schnitt untersucht. Die
angewendete Farbdifferenz-Methode zur Zellsegmentierung wurde für die
verschiedenen Arten von Farben entwickelt und hier in angepasster Form für die
TUNEL-Färbung der Thymompräparate benutzt. Als erstes wurden die hellsten Stellen
im Präparat ermittelt und dienten als Referenz (Weißpunkt) für die weiteren
Farbanalysen. Alle Bildpunkte, die sich nur wenig von dem Weißpunkt unterschieden,
gehörten zu Fettzellen oder waren zell- und gewebefreie Gebiete.
Die Braunfärbung der Apoptosezellen unterschieden sich folglich in den drei
Farbkanälen von dem umgebenen Gewebe, wobei ein Bildpunkt nur dann zu einer
Apoptosezelle gehörte, wenn der Wert im Rotkanal um einen definierten Betrag (15-20)
höher lag, als der im Grünkanal, und der Blauanteil eine ermittelte Schwelle nicht
überschritt (Devijer). Anhand dieser vorgegebenen Definitionen wurden die
apoptotischen Zellen bezogen auf nicht-gefärbte ( blaue ) Thymozytenzellkerne
prozentual berechnet.
3.3.3 Statistische Auswertung der Daten
Alle einzelnen statistischen Signifikanzen wurden mit Hilfe des Man-Whitney-U -Test
(p < 0.05 falls nicht anders angegeben) und Chi-Square ermittelt. Die
Signifikanzenanalysen wurden mit dem Computerprogramm SPSS (Version 2000,
SPSS Inc., Chicago) geprüft.
23
4 Ergebnisse
4.1 Stabilität des Phänotyps
Für die FACS-Untersuchungen konnte aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit und der
Seltenheit der Erkrankung ausschließlich in flüssigem Stickstoff asserviertes Material
herangezogen werden. Dieses Material stammt aus einer Sammlung, die über Jahre
hinweg aufgebaut wurde. Bei dieser Sammlung gehörte es zur Routinediagnostik, dass
Lymphozyten von jedem Frischmaterial (Thymom und Thymitis) anhand eines
Standardprotokolls gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert wurden. Anhand von
Auswertungen dieser Standardprotokolle konnten somit die Messergebnisse zwischen
Frischgewebe und aufgetautem Gewebe bezüglich der Stabilität des Phänotyps
verglichen werden.
Es sollte geklärt werden, ob sich der Immunphänotyp der aufgetauten Zellen in Bezug
auf die Oberflächenmarker der einzelnen Reifungsstadien in irgendeiner Weise von
Frischmaterial unterscheidet. Um diesen Sachverhalt zu klären, werden die dazu
notwendigen Experimente und Ergebnisse geschildert.
4.1.1 Optimierung der Auftaumethode
Die standardisierte Einfriermethode der Thymozytensuspensionen in Kryoröhrchen
erfolgte immer in einer Zellzahlkonzentration von 2x106-1x108 Zellen /ml. Bei Beginn
einer jeden Versuchsreihe wurden die Lymphozyten aus dem Stickstofftank
herausgeholt und in einem Wasserbad bei 37 °C schnell erwärmt. Sobald sich der Inhalt
verflüssigte (ca. 50 Sekunden), wurden die Thymozyten in ein 15 ml Falconröhrchen
pipettiert, welches mit 15 ml eisgekühltem FACS-Puffer gefüllt war. Das Ziel dieser
Auftaumethode war es, das auf die Zellen toxisch wirkende DMSO möglichst schnell zu
verdünnen. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesaugt und das pellet
wieder mit 15 ml eisgekühltem FACS-Puffer vorsichtig resuspendiert.
Während dieses Vorganges konnte regelmäßig eine starke Verklumpung beobachtet
werden, die auf eine Verklebung der Thymozyten mit der DNA von abgestorbenen und
24
lysierten Zellen zurückzuführen ist. Diese Zellaggregate wurden daraufhin abpipettiert,
nach nochmaligem Zentrifugieren in 1 - 1,5 ml FACS-Puffer aufgenommen und die
Zellzahl in der Neubauerzählkammer ermittelt (siehe 3.1.2).
Die Zellausbeute, bezogen auf die Anzahl der anfangs eingefrorenen Thymozyten
betrug im Durchschnitt nur 1-10% der ursprünglich eingefrorenen Zellpopulation. Da
für die optimale Durchführung der Versuchsreihe eine Zellzahl von 2x105 Zellen je
einzelne Probe notwendig war, musste diese Auftaumethode modifiziert und optimiert
werden, um einen derart großen Verlust von Zellen so gering wie möglich zu halten.
Im Verlauf der Versuchsreihen stellte sich heraus, dass die Einflussgrößen Temperatur
des FACS-Puffers und Art des Auftaumediums eine große Rolle spielen im Bezug auf
die Zellausbeute und Verklumpung der Lymphozyten. Bei einigen Versuchsreihen
wurden jeweils zwei identische Proben des gleichen Ursprungsgewebe unter
verschiedenen Auftaubedingungen aufgetaut, wodurch sich hinsichtlich der
Zellausbeute deutliche Unterschiede aufzeigten.
Es resultierte eine enorme Erhöhung der Zellausbeute, sobald die Mediumtemperatur
von 4 °C auf 36 °C gesteigert wurde, unabhängig davon, welches Medium benutzt
wurde. Eine weitere Steigerung der Zellzahl erbrachte die Erhöhung des prozentualen
Anteils des FCS im FACS-Puffer. Als optimales Auftaumedium erwies sich im
Parallelversuch zur herkömmlichen Methode die Verwendung von RPMI mit 10 % FCS
als Auftaumedium. Demzufolge wurde für die folgenden Experimente das
Auftauverfahren zu Gunsten der modifizierten Methode geändert. Die Kryoröhrchen
wurden somit nach dem Übergang in die flüssige Phase in einem 15 ml Falconröhrchen
mit im Wasserbad auf 36 °C vorgewärmten RPMI + 10 % FCS aufgenommen und mit
einer Pipette vorsichtig vermischt und zentrifugiert. Nach dem Absaugen des
Überstandes und dem Resuspendieren mit ebenfalls auf 37 °C vorgewärmtem Medium
waren immer noch kleinere Zellklümpchen zu erkennen, die danach sofort entfernt
wurden, um eine weitere Aggregation von Lymphozyten zu vermeiden. Das weitere
Vorgehen entsprach dem zuvor beschriebenen Prozess mit Zentrifugieren, Absaugen
und Zählen in der Neubauerzählkammer.
Durch diese Optimierung konnte bei allen Gewebetypen eine Steigerung der
durchschnittlichen Zellausbeute bis um den Faktor 10 gegenüber der herkömmlichen
Methode erreicht werden.
25
4.1.2 Veränderung der Subpopulationen nach dem Auftauen
Um Veränderungen in den Subpopulationen von aufgetauten Zellen im Vergleich zu
Nativzellen erkennen zu können, wurden durchflusszytometrische Messungen an frisch
aus dem Gewebe isolierten Thymozyten durchgeführt, und mit denjenigen nach dem
Auftauen aus demselben Ursprungsgewebe verglichen. Hierzu wurden die
Standardfärbungen CD4, CD8, CD45, und CD69 im FACScan analysiert und im
Dotplot und Histogramm miteinander verglichen. Hier konnte gezeigt werden, dass sich
die einzelnen Subpopulationen sowohl im nativen Zustand, als auch nach dem
Auftauvorgang gut darstellen ließen und dass das eingefrorene Material durchaus ein
gleiches Färbeverhalten in den einzelnen Subpopulationen aufweist. Somit ergeben sich
durch die Prozedur des Einfrierens und anschließenden Auftauens zumindest keine
schwerwiegenden Veränderungen in Bezug auf die quantitative Zusammensetzung der
untersuchten Zellpopulationen.
Folgende Patientenproben wurden jeweils im Nativzustand und nach dem Auftauen
hinsichtlich Ihrer Anfärbbarkeit untersucht
Pat.No Typ MG
97/4494 Thymitis Ja
00/1495 AB Nein
98/5186 B2 Nein
00/16857 B2 Nein
99/21994 B2 Ja
99/13575 B2 Ja
Tabelle 8: Untersuchte Patientendaten mit und ohne Myasthenia Gravis (MG)
26
Abbildung 6: Dotplotdarstellung von Thymozyten
Auswirkungen des Einfrier- und Auftauvorganges von Thymozyten in Bezug auf dieDarstellung der Oberflächenmarker CD4, CD8 und CD27. Im Vergleich dazu nativeThymozyten aus demselben Ursprungsgewebe bei Myasthenia Gravis (MG).
4.1.3 Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Subpopulationen
Aufgrund der Versuchsanordnung und der darin verwendeten intrazellulären DNA-
Markierung durch das TUNEL-Reagenz mussten die Proben 1-7 (siehe
Versuchsprotokoll 3.2) nach der Oberflächenmarkierung zuerst mit CytofixTM fixiert
und anschließend mit Perm/WashTM-buffer permeabilisiert werden. Wegen einer
Zerstörung der Oberflächenstruktur durch das Paraformaldehyd und infolgedessen einer
Veränderung des Färbeverhaltens der Lymphozyten wurden zu Beginn der
Versuchsreihen Parallelproben mitgeführt, die ohne CytofixTM behandelt wurden. Nach
CD8-TRI CD8-TRI
CD4-PECD4-PE
CD4-PECD4-PE
CD27-TRICD27-TRI
27
der Analyse im FACScan® wurden die Zellen in einem Dotplot-Diagramm miteinander
verglichen. Bei der Durchflusszytometrie stehen als Maß für die Größe der Parameter
forward scatter (FSC) und für die Granularität der Parameter side scatter (SSC) zur
Verfügung. Die Thymozyten stellen sich in einem Diagramm, bei welchem FSC gegen
SSC aufgetragen wird, als zwei Populationen dar: eine Population mit geringer
Zellgröße und eine mit größeren Zellen bei etwa gleicher Granularität (siehe
Abbildung). Hier ist bei fast allen Proben zu erkennen, dass durch die Behandlung mit
CytofixTM und Perm/WashTM-buffer eine Vergrößerung der Thymozytenpopulation mit
geringer Zellgröße und etwa gleicher Granularität stattfindet (siehe Abbildung 7).
Zur Quantifizierung dieser Population wurde im Dotplot-Diagramm der nicht fixierten
Zellen ein definiertes Gate R3 gesetzt. Die mit CytofixTM behandelten Zellen wurden
nun in dem gleichen Diagramm mit vorher festgelegtem Gate R3 dargestellt und die
darin enthaltenen Zellen prozentual miteinander verglichen. Bei allen 10 untersuchten
Patientenproben entsprach die prozentuale Zunahme dieser Subpopulation, bei welcher
es sich wahrscheinlich um lysierte Zellen und Zelldetritus handelt, einem Betrag < 5 %
bezogen auf alle aufgenommenen Zellen.
28
Abbildung 7: Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Größe(FSC) und Granularität (SSC) der ThymozytenA-C: Thymozyten ohne Behandlung mit CytofixTM und
Perm/WashTM
A1-C1: Thymozyten nach 20 Minuten Inkubation in CytofixTM undanschließendem zweimaligem Waschen mitPerm/WashTMbuffer
R3: Definiertes Gate mit prozentual dargestellter Vermehrung indiesem Gate bezogen auf die Gesamtzahl der Zellen
29
4.2 Unterschiede der einzelnen Reifungsstadien von Thymomen
Bei den Untersuchungen bezüglich der speziellen T-Zellreifung von Thymozyten
konnte gezeigt werden, dass es hinsichtlich der einzelnen Reifungsstadien deutliche
Unterschiede innerhalb der MG(+) und MG(-) Thymome gibt. Im Vergleich mit den
MG(+) Thymomen kommt es bei allen MG(-) Thymomen zu einem quantitativen
Zellverlust innerhalb der Subpopulation der CD4+CD45RA+ Zellen (Strobel,
Helmreich et al. 2002; Strobel, Preisshofen et al. 2003). Zusätzlich konnten auch noch
unterschiedliche Reifungsstörungen in den einzelnen Thymom-Subtypen nachgewiesen
werden. So kommt es bei den Typ AB Thymomen offenbar während der positiven
Selektion (Acquisition von CD69) zu einem deutlichen quantitativen Zellverlust,
während die T-Zell-Reifung bei den corticalen Thymomen im Vergleich zu
Normalthymi keine signifikanten Veränderungen aufwies (Abb. 8). Interessanterweise
zeigten MG(-) Typ B einen besonders deutlichen Verlust von CD27+ (CD45RA+/-) T-
Zellen (Vanhecke, Verhasselt et al. 1997).
30
CD4im DP 1
CD3-
DP 2
CD3+
DP 3
CD69+
CD4m
CD27+
RE
CD45RA+
PositiveSel.
NegativeSel.
0
10
20
30
40
Thymus
%
AB MG(+) AB MG(-) B MG(+) B MG(-)
Abbildung 8 : Vergleich der Reifungsdaten von Thymozyten bei Normalthymus
sowie WHO Typ AB und B Thymomen
Diese Reifungsdaten lassen einen deutlichen Unterschied der prozentualen Anzahl derverschiedenen Zellpopulationen nach der positiven Selektion zwischen Thymomen mitund ohne Myasthenia Gravis (MG) erkennen. Vor allem bei den MG(-) kortikalenThymomen B MG(-) sind die Subpopulationen CD4 mature (CD4m, gelb) und RecentEmigrants (RE, grün) mit dem dafür spezifischen Oberflächenmarker CD27 undCD45RA deutlich vermindert. (Darstellung verändert nach Ströbel, Preisshofen et al.2003)
31
4.3 FACS-Apoptosemessungen
Die unterschiedlichen Reifungsstörungen der einzelnen Thymomsubtypen und der
damit verbundene Verlust von Lymphozyten in den letzten Reifungsstadien geht von
einer erhöhten Apoptoseaktivität im Laufe der T-Zellreifung im Thymus aus.
Um dem Hauptziel dieser Arbeit, der immunphänotypischen Charakterisierung der
Thymozyten und Bestimmung ihrer Apoptoseaktivität in den einzelnen Reifungstadien
näher zu kommen, musste eine Methode gefunden werden, die Apoptoserate jeder
Subpopulation quantitativ zu bestimmen. Mit Hilfe der zur Verfügung stehenden
Durchflusszytometrie bestand die Möglichkeit, drei Oberflächenantigene der
Lymphozyten zu detektieren, und sie je nach der Ausprägung der Antigene einem
Stadium zuzuordnen (Abbildung 9).
Abbildung 9: Oberflächenantigene der Lymphozyten in verschiedenen Stadien
Im Verlauf der Thymozytenreifung kommt es zur Ausbildung von spezifischenOberflächenmarkern, die für das jeweilige Entwicklungsstadium charakteristisch sindund anhand derer eine Einteilung in verschiedene Reifungsstadien erfolgen kann. Dieeinzelnen Oberflächenmarker (CD) sind entweder positiv (+) oder negativ (-).CD4im: unreife (immature) CD4+ Zellen,DPim: unreife (immature) CD4+ CD8+ ZellenDPpräSel: doppelt positive Zellen vor der positiven SelektionDPpostSel: doppelt positive Zellen nach der positiven SelektionSPm: reife (mature)CD4+ ZellenRE: Recent emigrants
CD4im DPim DPpräSel DPpostSel SPm RE
8- 8+ 8+ 8+ 4+/8- 4+/8-
3- 3- 3+ 3+ 3+ 3+
69- 69- 69- 69+ 69+ 69+
1a+ 1a+ 1a+ 1a+ 1+/- 1a-
27- 27- 27- 27- 27+ 27+
45RA- 45RA- 45RA- 45RA- 45RA- 45RA+
32
Nachdem die nach dem Versuchsprotokoll gefärbten Zellen mit Hilfe des FACScan®
analysiert wurden, konnten bei der Auswertung der Daten die TUNEL-Färbung auf FL-
1 in einem Histogramm, sowie die beiden anderen Antikörperfärbungen auf FL-2 und
FL-3 in einem Dotplot-Fenster dargestellt werden.
In den jeweiligen Dot-plot Diagrammen wurden daraufhin 4 Regionen von R1-4
entsprechend der jeweiligen Färbung definiert, und die jeweils darin auftretende
TUNEL-FITC-Färbung in einem Histogramm der FL-1 aufgezeigt. Anhand der bei
jedem Versuch mitgeführten Positiv- und Negativkontrollen für die TUNEL-Färbung
wurde der Punkt festgelegt, ab welchem die Thymozyten als apoptotisch zu betrachten
sind. Dieser Punkt definierte den Beginn des Markers und wurde für alle Proben einer
jeweiligen Versuchsreihe festgelegt. In der Statistik konnte danach der prozentuale
Anteil der apoptotischen Zellen der einzelnen Regionen einer jeden Färbung bestimmt
werden. Danach konnte für jede einzelne Subpopulation der Thymozyten eine Aussage
über den prozentualen Anteil TUNEL-positiver Zellen gemacht werden (Tabelle 9).
Unter den 20 untersuchten Fällen fanden sich 3 Fälle mit Thymitis, 8 MG(-)Thymome
und 9 MG(+)Thymome. Abbildung 10 zeigt eine Zusammenfassung aller untersuchten
Thymome und Thymitiden. Bei allen MG(-) Thymomen war im Vergleich zu MG(+)
Thymomen eine signifikant (p< 0.5) erhöhte Anzahl TUNEL-positiver Zellen in der
Population der CD4+CD27+CD45RA- Zellen nachweisbar.
Um daraufhin noch genauere Angaben zu bekommen, wurden die einzelnen Thymome
nach ihrer histogenetischen Einteilung untersucht und miteinander verglichen. Es sollte
geklärt werden, inwiefern sich das Apoptoseverhalten bei gemischten und cortikalen
Thymomen untereinander unterscheidet. Bei cortikalen Thymomen konnte wiederum
eine deutlich signifikante Erhöhung der TUNEL-positiven Zellen in den
Subpopulationen der CD4+CD27CD45+ und CD4+CD27+CD45- Thymozyten bei
MG(+) Thymomen im Vergleich zu MG(-) Thymomen dargestellt werden (Abbildung
11).
33
Tabelle 9: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver (apoptotischer) Zellen in
verschiedenen Thymozytenreifungsstufen bei Thymomen mit und ohne assoziierte
Myasthenia gravis
Anhand der durchflusszytometrisch analysierten Dotplot-Färbungen wurde dieApoptoserate für die unterschiedlichen Zellpopulationen ermittelt. Dargestellt ist derprozentuale Anteil apoptotischer Zellen bezogen auf die jeweiligeThymoztenpopulation.WHO: histologischer Thymom-Subtyp nach WHO-Klassifikation, MG: Myastheniagravis; CD4im: unreife (CD3-4+8-) CD4+ Zellen, DPim: unreife doppelt positive (CD3-4+8+) Zellen, DP: doppelt positive (CD3+4+8+) Zellen, CD4m: reife(CD3+4+CD27+CD45RA-) CD4+ Zellen, CD4RE/CD8RE: CD4+/CD8+ RecentEmigrants (CD4 oder CD8+, CD27+CD45RA+), k.A.: keine Angaben möglich.
WHO MG CD4im DPim DP CD4m CD4RE CD8m CD8RE
1 Thymitis Ja 0 0 0 0 0 0 0,92 Thymitis Ja 0 0 1,0 0 1,5 0 0,43 Thymitis Ja 0,6 0 1,0 1,0 0,4 1,5 0,84 AB Ja 1,2 0 1,0 0,2 0,1 k.A. 0,15 AB Ja 0,2 0 0,4 0,7 3,7 0 2,66 AB Ja 1,5 0 1,1 0 4,0 0 7,27 AB Nein 3,8 0 1,3 0 1,9 0 4,18 AB Nein 2,3 k.A. 3,3 0,7 1,3 0,4 2,19 AB Nein 0,2 0 2,2 2,4 1,5 2,7 1,110 B2 Ja 3,9 0,5 2,8 0,8 1,4 0 2,511 B2 Ja 0,1 0 1,0 0 2,7 0 2,012 B2 Ja 0 0 0 0 0 0 013 B2 Ja 0,4 0 0,3 0 5,4 0,6 3,914 B2 Ja 0 0 0 0 0 0 0,315 B2 Ja 0 0 0,3 0,2 0 0,1 0,216 B2 Nein 0,8 0,5 1,6 0,6 2,5 0 2,517 B2 Nein 0,2 0 1,2 0,3 0,1 2,2 0,118 B2 Nein 2,0 0,3 1,8 1,3 1,8 0,1 2,919 B2 Nein 4,3 0,5 9,7 4,8 5,1 0 9,420 B2 Nein 0 0 0,6 0,2 0 0,6 0,2
34
CD4im
DPim
CD4m
CD4RE
CD8m
CD8RE
0
1
2
3
4
5
6
7
% T
UN
EL
-po
siti
ver
Zel
len
in d
er je
wei
ligen
Su
bp
op
ula
tio
n
Thymitis MG(+) MG(-)Thymome
P < 0.5
Abbildung 10: Darstellung der TUNEL-Befunde bei allen untersuchten MG(+)
und MG(-) Thymomen im Vergleich zu nicht-neoplastischen Thymi mit
Entzündung (Thymitis).
Beim Vergleich der Thymome mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) erkennt man einedeutlich erhöhte Apoptoserate (p < 0.05, grün) der CD4(+)mature Population (CD4m).Der prozentuale Anteil der TUNEL-positiven Zellen ist bei den MG(-)-Thymomengegenüber den MG(+)-Thymomen in allen Subpopulation erhöht. Im = immature, m =mature, RE = Recent Emigrants, DP = doppelt positive Zellen (CD4+, CD8+)
P < 0.05
35
0
2
4
6
8
B MG+B MG-
% T
UN
EL
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Zel
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in d
er je
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ligen
Su
bp
op
ula
tio
n
CD8RECD4im DPim CD4m CD4RE CD8m
P < 0.5
Abbildung 11: Prozentualer Anteil Tunel positiver Zellen in den einzelnen
Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ B Thymomen.
Hier zeigt sich eine signifikante (p < 0.05) Erhöhung apoptotischer Zellen in denSubpopulationen CD4mature und CD4RE bei MG(-) Thymomen im Vergleich zuMG(+) Thymomen.B = corticale Thymome WHO Typ B, im = immature, m = mature, RE = RecentEmigrants, MG: Myasthenia Gravis, CD: Oberflächenmarker
Weiterhin wurden auch die gemischten Thymome (WHO-Typ AB) auf etwaige
Unterschiede bezüglich der Apoptose untersucht. Hier konnte man im Gegensatz zu den
cortikalen Thymomen keine statistisch signifikanten Unterschiede erkennen. Wie in der
Abbildung 12 dargestellt, konnte man aber auch hier eine Erhöhung der apoptotischen
Thymozyten bei der Subpopulation der DPim und CD4RE bei MG(-) im Vergleich zu
MG(+) erkennen.
P < 0.05
36
CD4im DPim CD4m CD4RE CD8m CD8RE
0
2
4
6
8AB MG+AB MG-
% T
UN
EL
-po
siti
ver
Zel
len
in d
er je
wei
ligen
Su
bp
op
ula
tio
n
Abbildung 12: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen
Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ AB Thymomen
Keine signifikante Erhöhung, jedoch besteht die Tendenz einer vermehrten Anzahlapoptotischer Thymozyten bei MG(-)-Thymomen (blau). Reifungsdaten bei DPim undCD4RE bei MG(+) Thymomen konnten nicht eindeutig eruiert werden.MG: Myasthenia Gravis, AB = gemischte Thymome, im = immature, m = mature, RE =Recent Emigrants, CD: Oberflächenmarker
Aus diesen mit Hilfe des FACScan® untersuchten Thymozyten wird anhand der obigen
Ergebnisse deutlich, dass es bei den MG(-) Thymomen in den letzten beiden
Reifungsstadien zu einer erhöhten Anzahl TUNEL-positiver Zellen kommt, was einer
erhöhten Apoptoserate entspricht. Zusätzlich konnte auch noch aufgezeigt werden, dass
bei den corticalen MG(-) und MG(+)Thymomen ein deutlicherer Unterschied
hinsichtlich des Apoptoseverhaltens gegeben ist als bei den gemischten Thymomen.
37
Diese Befunde korrelierten sehr gut mit den quantitativen Messungen bezüglich der T-
Zell-Reifung in Thymomen (s. Abb. 8).
4.4 Auswertung anhand der Farbdifferenzmethode
Die Paraffinschnitte wurden gemäß des Protokolls gefärbt und im Dunkeln aufbewahrt,
um sie vor Lichteinstrahlung zu schützen. Die einzelnen Präparate wurden in jeweils
derselben Art und Weise untersucht. Zuerst wurden die Objektträger in einem
verdunkelten Raum unter dem Mikroskop inspiziert und danach wurden die Bildszenen
einmal vertikal von oben bis unten und einmal horizontal von rechts nach links eines
jeden Präparates aufgenommen. Da in Typ AB Thymomen die lymphozytenreichen
Areale sehr heterogen verteilt sind und somit eine standardisierte Aufnahmesequenz bei
diesen Tumoren nicht möglich ist, wurden für diesen Teil der Studie ausschließlich Typ
B Thymome verwendet. Bei den Typ B Thymomen wurden insgesamt 23,7 Bildszenen
aufgenommen, wobei jedes Bild eine Präparatfläche von 1.295 mm² darstellt. Damit
wurde also in jedem der Präparate eine Gesamtfläche von 3,07 cm² aufgenommen und
anschließend mit der Farbdifferenz-Methode zur Zellsegmentierung analysiert und
ausgewertet. Mit dieser Methode wurden an insgesamt 6 corticalen Thymompräparaten
und drei Thymitiskontrollen eine TUNEL-Färbung durchgeführt. Es wurde nach
Möglichkeit darauf geachtet, dass die Patientenproben denen der
durchflusszytometrisch untersuchten Proben entsprachen, damit die Auswertungen
miteinander verglichen werden konnten.
38
Abbildung 13: Thymitis-Paraffinschnitt, H.E-Färbung mit TUNEL-Färbung
Apoptotische Zellen sind bei einem Thymitis-Paraffinschnitt im Vergleich zu Thymom-Paraffinschnitten deutlich reduziert und in diesem Präparat nicht vorhanden
39
Bei den einzelnen mikroskopischen Analysen stellte sich schon zu Beginn der
Untersuchungen heraus, dass die TUNEL-positiven Zellen bei den Thymomen deutlich
vermehrt vorkamen. Im Gegensatz dazu waren diese TUNEL gefärbten Zellen bei den
Thymitiden nur in einer sehr geringen Anzahl vorhanden. Bezüglich der
Aussagefähigkeit hinsichtlich des Apoptoseverhaltens jeder einzelnen Zelle wurde
folgender Gesamtwert als Vergleichsparameter gewählt:
Mit diesem Wert war es möglich, die TUNEL-positiven Zellen der einzelnen
Bildszenen eines jeden Präparates objektiv auszurechnen und den daraus resultierenden
durchschnittlichen Gesamtwert der einzelnen Präparate untereinander zu vergleichen.
Das Ergebnis dieser Untersuchung ist in Abbildung 14 graphisch dargestellt. Die
Graphik zeigt, dass die Anzahl der markierten Lymphozytenkerne pro Gewebefläche
bei den MG (-)-Fällen größer ist als bei den MG(+)-Fällen (p<0.05). Im Vergleich zu
den Thymitisfällen ist bei den Thymomem insgesamt eine deutlich vermehrte
Anfärbbarkeit der Zellkerne mit dem TUNEL-Reagenz zu erkennen. Die daraus
resultierende Signifikanz ergibt einen Wert von p<0.001.
Insgesamt zeigen die Resultate der gefärbten Paraffinschnitte, dass es Unterschiede bei
der Anfärbbarkeit der einzelnen Thymozyten mit dem TUNEL-Reagenz gibt. Anhand
dieser Untersuchungen kann man die Vermutung aufstellen, dass bei den Thymomen,
die nicht mit einer paraneoplastischen MG assoziiert sind, eine vermehrte apoptotische
Aktivität der Lymphozyten vorhanden ist.Somit korreliert dieses Ergebnis auch mit den
Ergebnissen der durchflusszytometrisch analysierten Thymozyten (siehe 4.2).
Gesamtwert = Anzahl der markierten Lymphozytenkerne x 105
aufgenommene Gewebefläche
40
0
100
200
p < 0.05
MG-3 Fälle, n = 70 HPF
MG+3 Fälle, n = 74 HPF
TU
NE
L(+
) Z
ellk
ern
e x
105
/ Gew
ebef
läch
e
Thymitis3 Fälle, n = 30 HPF
P < 0,001
Abbildung 14:Vergleich von Tunel-Färbungen an Paraffinschnitten von Thymitis
und Thymomen mit und ohne Myasthenia Gravis (MG)
Insgesamt wurden 9 Fälle mit Hilfe der Farbanalyse im gefärbten Schnitt untersucht.Signifikante Erhöhung (p < 0.05) der TUNEL-positiven Zellkerne bei MG(-) imVergleich zu MG(+), sowie im Vergleich der Thymome mit Thymitis (p < 0.001).HPF = High Power Field
41
Abbildung 15: TUNEL-Färbung an Paraffinschnitt, No. 28804, Thymom MG (-)
Die schwarzen Pfeile markieren die TUNEL-positiven (braunen)Lymphozytenzellkerne an einem H.E.-gefärbten Paraffinschnitt einesThymompräparates ohne Myasthenia Gravis (MG)
42
4.5 TUNEL und DAPI-Immunfluoreszenz an Paraffinschnitten
Ein großer Vorteil der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie ist eine hohe Auflösung der
optischen Schnitte von Gewebearten ohne eine allzu komplizierte Gewebeaufbereitung.
Ziel dieser Methode war eine weitere qualitativ hochwertigere Darstellung von
apoptotisch veränderten Zellen bei Paraffinschnitten von Thymomen und Thymitiden.
Dazu wurde eine Zellkernfärbung mit DAPI durchgeführt, wodurch die einzelnen
Lymphozyten per se schon zu identifizieren waren. Danach wurden die Zellen mit dem
TUNEL-Farbstoff inkubiert und direkt mit dem Fluoreszenzmikroskop analysiert.
Zwischen den einzelnen Arbeitsschritten wurden die Schnitte im Dunkeln aufbewahrt,
so dass der Farbstoff nicht ausbleichen konnte. Um die apoptotischen Thymozyten
letztendlich bestimmen zu können, sollten die einzelnen Zellkerne eine Blaufärbung
(DAPI) aufweisen und zusätzlich noch mit dem FITC-gekoppelten TUNEL-Reagenz
(grün) markiert sein.
Abbildung 16: DAPI-Immunfluoreszenzfärbungen und TUNEL-Färbungen eines
Paraffinschnittes, Thymom mit Myasthenia Gravis (MG+)
Die mit dem grauen Pfeil markierten grünen Zellkerne sind TUNEL-positiv undgleichzeitig DAPI-positiv und können daher als apoptotisch bezeichnet werden.
43
5 Diskussion
Basierend auf der Tatsache, dass im peripheren Blut von Patienten ohne MG eine
signifikant verminderte Anzahl naiver CD4+-Zellen gefunden wurde (Hoffacker,
Schultz et al. 2000; Buckley, Douek et al. 2001) besteht eine Assoziation zwischen dem
Auftreten einer paraneoplastischen MG und der Effizienz von Thymomen, naive CD4+
T-Zellen zu produzieren und zu exportieren (Strobel, Helmreich et al. 2002).
Vor diesem Hintergrund sollte die vorliegende Arbeit klären, ob es hinsichtlich der
Apoptoserate zwischen MG(-) und MG(+) Thymomen einen quantitativen Unterschied
gibt und in welchem Reifungstadium dieser programmierte Zelltod vonstatten geht. Da
es sich bei den Thymomen um äußerst seltenene Krankheitsbilder handelt, waren die
durchflusszytometrischen Untersuchungen von vorneherein auf die Verwendung
eingefrorener, archivierter Thymozyten beschränkt. Um die Ergebnisse und die
Spezifität der FACS-Analysen noch besser beurteilen zu können, wurden mit Hilfe der
Immunhistologie und Immunfluoreszenz noch weitere Untersuchungen an
Paraffinschnitten durchgeführt.
Aufgrund der Komplexität der Versuchsanordnung und der Schwierigkeit einer
Apoptosemessung werden nachfolgend die einzelnen Methoden diskutiert.
5.1 Diskussion der Methodik
Einen Schwerpunkt der Diskussion über die Methodik stellt sicherlich die Art der
Untersuchung und das Material selber dar. Bei der Verwendung von eingefrorenem
Material lag die Zellausbeute nach dem Auftauvorgang zwischen 5-10 % der
ursprünglichen Menge. Aufgrund dieses hohen Verlustanteils musste eine große Menge
an eingefrorenen Thymozyten zur Verfügung stehen, um diese Ausfälle zu
kompensieren. Durch einige Modifikationen bei dem Auftauvorgang konnte letztendlich
die Zellausbeute an Thymozyten gesteigert werden, so dass sich keine Schwierigkeiten
mit der archivierten Materialmenge ergaben.
44
5.1.1 Durchflusszytometrische TUNEL-Methode bei Thymozyten
Die Art des Nachweises apoptotischer Zellen wird kontrovers diskutiert. Die TUNEL-
Färbung ist eine der am häufigsten verwendeten und spezifischsten Nachweismethoden
für apoptotische Zellen (Kelly, Sandoval et al. 2003; Prochazkova, Kylarova et al.
2003). In Kombination mit der Durchflusszytometrie können sowohl quantitative als
auch qualitative Aussagen über den programmierten Zelltod gemacht werden
(Afanasyev, Korol et al. 1993), jedoch muss die jeweilige Nachweismethode spezifische
Anforderungen erfüllen.
Um Lymphozyten, die sich im Stadium des programmierten Zelltodes befinden,
nachzuweisen, müssen Apoptose-spezifische Eigenschaften und Merkmale dieser Zellen
nachgewiesen werden. Diese Merkmale dienen vor allem dazu, eine Differenzierung
gegenüber denjenigen Zellen zu erreichen, die durch den Vorgang der Nekrose
zugrunde gegangen sind. Bei allen Nachweismethoden ist diese Unterscheidung ein
wichtiges Kriterium hinsichtlich der Validität der einzelnen Methoden.
Bei der Apoptose oder dem programmierten Zelltod aktiviert die Zelle ein internes
Zerstörungsprogramm mit charakteristischem Abbau der Kern-DNA, der Degeneration
und Kondensation von Zellkernen, sowie einer Phagozytose der Zellreste
(Darzynkiewicz, Bruno et al. 1992). Zu Beginn schrumpfen die Zellen aufgrund von
Wasserverlust und isoosmotischem Verlust von Ionen im Zytoplasma (Bortner and
Cidlowski 2000), die Kern-DNA wird währenddessen in hoch-und niedermolekulare
Fragmente ( nicks ) gespalten (Savill and Fadok 2000).
Im Gegensatz dazu ist die Nekrose ein nicht-programmierter Zelltod aufgrund von
chemischen oder physikalischen Schädigungen. Dieser Vorgang ist gekennzeichnet
durch den Verlust der Membranintegrität und das Anschwellen von Zytoplasma und
Mitochondrien. Dies ist auf die Unfähigkeit zur Aufrechterhaltung der Ionen-Hämostase
zurückzuführen. Schließlich kommt es zur völligen Lyse der Zelle und die
zytoplasmatischen Inhalte werden freigesetzt. Die DNA wird nach Lyse der Zellen nach
dem Zufallsprinzip in Stücke verschiedener Größe abgebaut (Wyllie, Kerr et al. 1980)
und im Gegensatz zur Apoptose entstehen hierbei große Mengen an Zelltrümmern, die
von Phagozyten beseitigt werden müssen.
45
Für den Nachweis eines programmierten Zelltodes wird deshalb genau dieser spezielle
Vorgang der Fragmentation bei der Apoptosemessung ausgenutzt und die dabei
entstehenden apoptotic bodies können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen
werden (Walker and Quirke 2001). Die Schwierigkeit des Nachweises besteht jedoch in
der exakten Quantifizierung, die für die Aussage bezüglich der Apoptoserate
unabdingbar ist.
Bei der TUNEL-Methode werden die 3´-Enden von den DNA-Fragmenten, die in
apoptotischen Zellen entstehen (sogenannte nicks ) durch die Reaktion der terminalen
Desoxynukleotidyltransferase (TdT) mit Fluorescein markiertem Uridin (dUTP)
markiert. Anschließend können diese markierten Zellen entweder mit der
Fluoreszenzmikroskopie oder mit der Durchflußzytometrie analysiert werden. Bei der in
dieser Arbeit verwendeten Methode besteht der Vorteil, dass durch die Verwendung von
direkt FITC-gekoppelten Nukleotiden der Zwischenschritt einer Enzym-gekoppelten
Substratumwandlung entfällt.
Mit Hilfe dieser Methode ist es gelungen, einen spezifischen Nachweis in Bezug auf die
Quantität für apoptotische Zellen zu etablieren (Kelly, Sandoval et al. 2003). Somit
kann aufgrund von diesen unterschiedlichen intrazellulären Vorgängen bei der Nekrose
und Apoptose eine TUNEL-Färbung durchaus als eine spezifische Art des Apoptose-
Nachsweises betrachtet werden (Negoescu, Guillermet et al. 1998; Lawry 2004). Um
das bei dieser Arbeit verwendete TUNEL-Reagenz für die intrazelluläre DNA-
Markierung anwenden zu können, mussten die aufgetauten Zellen zuerst fixiert und
anschließend permeabilisiert werden. Dieser Vorgang war notwendig, um sowohl die
inneren als auch die äußeren Zellmembranen für die Antikörper durchlässig zu machen.
Bei der Fixation (CytofixTM) wurden die Zellen durch das darin enthaltene
Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit einem Detergens (Perm/Wash bufferTM)
permeabilisiert. Die Markierung der Oberflächenmarker, und damit die Zuordnung zu
den einzelnen Reifestadien wurde jedoch aufgrund des Permeabilisationsvorganges vor
einer jeden TUNEL-Färbung durchgeführt, weil hierbei eine gewisse Zerstörung der
äußeren Zellmembran stattfindet. Da die spätere Auswertung der TUNEL-Färbung
darüber Auskunft geben sollte, in welchem Stadium der Thymozytenentwicklung die
höchste Apoptoserate stattfindet, wurde auf die Oberflächenmarkierung mittels
Antikörper großen Wert gelegt. Deshalb wurde, wie in 4.1.3 beschrieben, ein
46
durchflusszytometrischer Vergleich derselben Proben zuerst vor und nach der
Fixation/Permeabilisation durchgeführt. Somit konnte man den Einfluss dieser
Detergenzien auf die bereits mit Antikörpern markierten Zellen direkt erkennen.
Anhand der Darstellung der Zellen im Dot plot Diagramm ist bezüglich der Grösse und
Granularität der Zellen eine leichte Verschiebung zugunsten der Zellen mit geringer
Zellgröße und gleicher Granularität zu beobachten. Es zeigten sich aber keine
Unterschiede hinsichtlich der Anfärbbarkeit und Darstellung der Subpopulationen bei
fixierten/permeabilisierten Zellen gegenüber nativen Thymozyten, so dass der Einfluss
darauf vernachlässigt werden konnte.
Eine weitere Schwierigkeit bei der Anwendung dieser zytometrischen TUNEL-Methode
bestand darin, dass durch die DNA-Markierung mit dem direkt FITC-gekoppelten
dUTP der Fluoreszenzkanal 1 belegt war. Da aber für die Durchflusszytometrie nur ein
3-Farben FACS-Analysegerät zur Verfügung stand, waren für die übrigen
Oberflächenantigen-Bestimmungen noch zwei Kanäle bereit (FL-2 und FL-3).
Um jede einzelne Subpopulation der Thymozyten auf Ihre Apoptoserate untersuchen zu
können, wurde deshalb im Vorfeld der Untersuchungen eruiert, ob mit Hilfe einer
Depletion durch Trennsäulen die CD4+ T-Zellen von den CD4- T-Zellen getrennt
werden könnten. Die Ergebnisse der CD4/CD8 Depletion an sich waren sehr gut, jedoch
ergaben sich durch deren Zuhilfenahme weitere Schwierigkeiten. Zum einen kam es zu
einer weiteren Verminderung der absoluten Zellzahl, zum anderen litt darunter die
Qualität hinsichtlich der Apoptosemessung. Die Inkubationszeit der fixierten
Thymozyten belief sich auf mehrere Stunden, und Untersuchungen hinsichtlich des
Anfärbeverhaltens behandelter Zellen konnten zeigen, dass bei Zellen, die länger als 2
Stunden fixiert waren, verfälschte Ergebnisse bei der Apoptose-Messung herauskamen
(Tateyama, Tada et al. 1998). Eine weitere Alternative bestand in der Verwendung eines
fluoreszenzaktivierten Zellsorters. Jedoch erwies sich diese Methode aus technischen
und logistischen Gründen als nicht durchführbar. Somit blieben für die Fortsetzung der
TUNEL-Methode nur die Fluoreszenzkanäle FL-2 und FL-3 übrig, an welchen das
Versuchsprotokoll so gestaltet wurde, dass man jede einzelne Subpopulation in den Dot
plot Diagrammen darstellen und die quantitative Apoptoserate anhand der
dazugehörigen Histogramme analysieren und errechnen konnte.
47
5.1.2 Immunhistochemische TUNEL-Methode bei Paraffinschnitten
Die immunhistochemische TUNEL-Färbung von Gewebeschnitten ist eine weit
verbreitete und validierte Methode für den Nachweis apoptotischer Zellen. Im
Gegensatz zur Durchflusszytometrie können bei dieser Untersuchung die TUNEL-
markierten Zellen zusätzlich noch lichtmikroskopisch auf ihre morphologischen
Eigenschaften hin untersucht werden. Mit Hilfe von computerunterstützten
Bildanalysen können anschliessend die einzelnen Bildserien anhand der typisch
apoptotischen Zellmorphologie ausgewertet werden.
Bei Untersuchungen von Prostatakarzinomen wurde ein Vergleich von
immunhistochemischen Apoptosemarkern (Caspase 3 und Cytokeratin 18) und der
TUNEL-Methode durchgeführt. Hier konnte gezeigt werden, dass bei der Entdeckung
und Quantifizierung von apoptotischen Zellen eine gute Korrelation zwischen Caspase 3
Markern und der TUNEL-Färbung besteht (Duan, Garner et al. 2003).
Trotzdem muss der Nachweis apoptotischer Zellen an Schnittpräparaten kritisch
analysiert werden, da die Sensitivität doch erheblich variieren kann (Labat-Moleur,
Guillermet et al. 1998). Als zusätzliches Kriterium wurde deshalb die optisch
erkennbare Zellmorphologie und die DAPI-Zellkernfärbung verwendet, anhand derer
lichtmikroskopisch bzw. fluoreszenzmikroskopisch weitere Hinweise für eine
apoptotische Zelle zu erkennen waren.
5.2 Untersuchung apoptotischer Thymozyten
Nachdem die technischen Fragen, also die Aussagefähigkeit und die Anwendbarkeit der
TUNEL-Methode zur Darstellung und Quantifizierung apoptotischer Zellen, im ersten
Teil dieser Arbeit geklärt worden ist, konnte sich der Hauptteil der Doktorarbeit mit der
Fragestellung auseinandersetzen, ob bei MG(-) Thymomen eine höhere Apoptoserate zu
verzeichnen ist , als bei den MG (+) Thymomen und, falls dies der Fall sein sollte, in
welchem Stadium der T-Zellreifung dieser vermehrte Zelltod stattfindet.
48
5.2.1 Diskussion der Reifungsstadien
Die Zusammensetzung der T-Zell-Populationen in Thymomen und Kontrollthymi wies
signifikante Unterschiede auf. Hinsichtlich der T-Zellpopulation ist der Anteil an
unreifen Thymozyten in Thymomen größer, der Anteil reifer T-Zellen geringer, als in
nicht-neoplastischen Thymi (Nenninger, Schultz et al. 1998).
Im Gegensatz zu den gut untersuchten frühen Reifungsstadien der Thymozytenreifung
(Berg and Kang 2001; Hogquist 2001; MacDonald, Radtke et al. 2001) sind die
Mechanismen der späten Phase der Thymopoese weniger genau untersucht und
charakterisiert. Die entscheidende und äußerst wichtige Rolle der negativen Selektion
im Hinblick auf die Prävention von Autoimmunkrankheiten ist ein immunologisches
Paradigma welches anhand vieler wissenschaftlicher Modelle erörtert wurde (Laufer,
DeKoning et al. 1996; Laufer, Fan et al. 1999; Naquet, Naspetti et al. 1999; Rubin and
Kretz-Rommel 2001).
In Übereinstimmung mit einer Reihe von früheren Untersuchungen zur
Thymozytenreifung (Strobel, Helmreich et al. 2001; Strobel, Helmreich et al. 2002;
Strobel, Preisshofen et al. 2003) konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden, dass
unmittelbar vor und nach dem Erwerb von CD27 ein wichtiger negativer
Selektionsprozess hinsichtlich der Entwicklung von reifen naiven CD4+ T-Zellen
stattfindet. CD27 ist ein glykosyliertes Typ-1 Membranprotein und gehört zu der
Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNFR) Superfamilie, zu der u.a. auch Fas/APO-1
(CD95) und CD40 zählen. Der Ligand von CD27 auf dem Thymusepithel ist CD70.
Diese Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle in Zellwachstum und differenzierung,
aber auch bei der Apoptose (Sugita, Hirose et al. 1992; Hintzen, Lens et al. 1995). Die
Aktivierung von CD27 z.B. durch Phytohämagglutinin oder agonistische anti-CD3
Antikörper resultiert in der Proliferation von T-Zellen. Daneben besitzt jedoch auch
CD27 pro-apoptotische Wirkungen (Prasad, Ao et al. 1997).
49
5.3 Diskussion der Ergebnisse der Durchflusszytometrie und der Farbdifferenz-
Methode zur Apoptose
MG(-) und MG(+) Thymome sind gute Anschauungsmodelle für die Erklärung des
Mechanismus, der einerseits den Ablauf der Thymopoese reguliert, und andererseits die
Autoimmunität und damit das Aufreten der paraneoplastischen MG unter normalen
Bedingungen verhindert. Auch unter Berücksichtigung der jeweils limitierten
Aussagekraft beider Methoden, Analyse in situ und per FACS, kamen beide
Untersuchungsabschnitte zu einem vergleichbaren Ergebnis. Es konnte gezeigt werden,
dass die Apoptoserate bei MG(-) Thymomen signifikant über der in MG(+) Thymomen
liegt. In Übereinstimmung mit einer schon früher beschriebenen ineffizienten
Thymopoiese (Strobel, Helmreich et al. 2001) lag die Apoptoserate bei allen
Thymomen über der von Kontrollthymi. Die FACS-Daten zur Stadien-bezogenen
Apoptose korrelierten sehr gut mit der Beobachtung, dass speziell die späten
Reifungsstadien (gekennzeichnet durch den Erwerb von CD27) in Thymomen reduziert
waren.
In Übereinstimmung mit früheren Untersuchungen zur Anzahl reifer naiver T-Zellen im
peripheren Blut von MG(+) und MG(-) Thymompatienten darf also als gesichert gelten,
dass der Verlust terminaler Reifungsstadien in MG(-) Thymomen auf eine gesteigerte
T-Zell-Apoptose im Tumor und nicht auf eine Schrankenstörung mit Ausschwemmung
unreifer Vorstufen in das periphere Blut zurückzuführen ist. Nicht geklärt werden
konnte die Frage, ob dieser Verlust Ausdruck einer aktiven Deletion autoreaktiver T-
Zellen oder eines Neglectes durch Fehlen eines Überlebens- oder Reifungssignales
(z.B. auch CD27) war. Die Klärung dieser interessanten Frage in zukünftigen
Untersuchungen könnte zu genaueren Rückschlüssen über die noch weithin ungeklärten
Toleranzmechnismen der terminalen T-Zell-Reifung in einem humanen System führen.
Demzufolge sind weitere Untersuchungen hinsichtlich der Thymozyten in terminalen
Reifungstadien notwendig, um eine weitere Aufklärung bezüglich des Auftretens von
Myasthenia Gravis bei Thymomen zu ermöglichen.
50
6 Zusammenfassung
Die Myasthenia gravis (MG) ist eine der am besten untersuchten
Autoimmunerkrankungen des Menschen. Bei etwa 10 % der Patienten mit MG liegt
dem Auftreten der Erkrankung ein Thymom zugrunde. Die Thymozytenreifung in
Thymomen ist quantitativ in dem Sinne gestört, dass anteilig mehr unreife Stadien und
weniger reife CD4+ T-Zellen gebildet werden als im Normalthymus, jedoch sind in
MG-assoziierten Thymomen alle Reifungsstadien der T-Zellentwicklung nachweisbar.
Aus früheren Untersuchungen war bekannt, dass Thymome ohne MG einen Defekt der
terminalen Reifung von CD4+ Thymozyten aufweisen. In der hier vorliegenden Arbeit
sollte geklärt werden, ob MG(+) und MG(-) Thymome einen Unterschied bezüglich der
Apoptoserate intratumoröser T-Zellen aufweisen.
Die Untersuchung ergab, dass Thymozyten in MG(-) Thymomen eine signifikant
höhere Apoptoserate aufweisen als in MG(+) Thymomen. In guter Übereinstimmung
mit Messungen zur intratumorösen T-Zell-Reifung fanden sich im FACS-analytischen
Teil der Studie die größten Unterschiede bezüglich der Apoptoserate in den CD27+
CD45RA- und CD27+CD45RA+ terminalen Reifungsstadien. Ob der Verlust der
terminalen Reifungsstadien in MG(-) Thymomen Ausdruck eines gesteigerten
protektiven Mechanismus im Sinne einer vermehrten negativen Selektion oder
Ausdruck eines Reifungsdefektes durch Verlust eines Überlebenssignals war, konnte im
Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Ein möglicher Kandidat für ein solches
fehlendes Überlebenssignal ist der Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor CD27
beziehungsweise sein Ligand CD70.
51
7 Anhang
7.1 Eigene Publikationen
Teile dieser Arbeit wurden publiziert in:
Pathomechanisms of paraneoplastic myasthenia gravis.
Ströbel P, Preisshofen T, Helmreich M, Müller-Hermelink HK, Marx A., Clin
Dev Immunol. 2003 Mar;10(1):7-12.
Weiterhin wurden Teile der hier verwendeten Methoden auch bei einer anderen
Fragestellung angewendet und publiziert:
Apoptosis and proliferation in lungs of ventilated and oxygen-
treated preterm infants
May M, Strobel P, Preisshofen T, Seidenspinner S, Marx A, Speer CP. Eur
Respir J. 2004 Jan;23(1):113-21.
52
7.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 : Reifungstadien der Thymozyten 3
Abbildung 2 : Prinzip der TUNEL-Färbung 15
Abbildung 3 : Contour blot einer CD45 (FL-2) und CD8 (FL-3) Färbung 19
Abbildung 4 : Histogramm bei Aufnahme der Apoptosefärbung mit TUNEL 20
Abbildung 5 : Darstellung der Apoptoseauswertung anhand von Histogrammen 20
Abbildung 6 : Dotplot-Darstellungen von Thymozyten 26
Abbildung 7 : Einfluss der Fixation und Permeabilisation auf die Größe und
Granularität der Thymozyten 28
Abbildung 8 :Vergleich der Reifungsdaten von Thymozyten bei Normalthymus
sowie WHO Typ AB und B Thymomen 30
Abbildung 9: Oberflächenantigene der Lymphozyten in verschiedenen Stadien 31
Abbildung 10: Graphische Darstellung der TUNEL-Befunde bei allen
untersuchten MG(+) und MG(-) Thymomen im Vergleich zu nicht-
neoplastischen Thymi mit Entzündung (Thymitis) 34
Abbildung 11: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen
Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ B Thymomen 35
Abbildung 12: Prozentualer Anteil TUNEL-positiver Zellen in den einzelnen
Reifungsstadien bei MG(+) und MG(-) Typ AB Thymomen 36
Abbildung 13: Thymitis-Paraffinschnitt, H.E-Färbung mit TUNEL-Färbung 38
Abbildung 14: Vergleich von TUNEL-Färbungen an Paraffinschnitten von
Thymitis und Thymomen mit und ohne Masthenia Gravis (MG) 40
Abbildung 15: TUNEL-Färbung an Paraffinschnitt, No.28804, Thymom MG(-) 43
Abbildung 16: DAPI-Immunfluoreszenzfärbungen und TUNEL-Färbungen eines
Paraffinschnittes, Thymom mit Myasthenia Gravis (MG+) 42
53
7.3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Thymusveränderungen bei Myasthenia Gravis (MG) 4
Tabelle 2: WHO-Klassifikation und Einteilung der Thymome nach
WHO 2004 (Vincent 2002) 5
Tabelle 3: Klinische Daten der untersuchten Thymom- und Thymitispatienten
mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) 7
Tabelle 4: Verwendete Arbeitsgeräte 8
Tabelle 5: Verwendete Lösungen 9
Tabelle 6: Verwendete Antikörper und Enzyme 10
Tabelle 7:Versuchsprotokoll für TUNEL-Apoptosemessung 17
Tabelle 8: Untersuchte Patientendaten mit und ohne Myasthenia Gravis (MG) 25
Tabelle 9:Auswertung der durchflusszytometrisch bestimmten
Apoptoserate mittels TUNEL-Färbung 33
54
7.4 Literaturnachweis
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Danksagung
Diese Arbeit entstand am Institut für Pathologie der Universität Würzburg unter der
Leitung von Herrn Professor Dr. H.-K. Müller-Hermelink. Ihm sei für die Bereitstellung
der technischen Hilfsmittel und des Arbeitsplatzes gedankt.
Des weiteren möchte ich mich ganz herzlich bei Herrn Professor Dr. A. Marx für die
wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit bedanken.
Mein ganz spezieller Dank gebührt meinem Betreuer Dr. Philipp Ströbel, der mir in
schwierigen Situationen immer mit Rat und Tat zur Seite stand und mich in jeglicher
Hinsicht bei dem Zustandekommen dieser Promotion unterstützt hat.
Bei Frau Andrea Homburger möchte ich mich ganz herzlich für die Einarbeitung in die
große Welt der Durchflusszytometrie bedanken, sowie für die zahlreichen FACS-
Färbungen mit diversen Ausflügen nach Ulm bei Nichtfunktionieren des Zellsorters !
Außerdem möchte ich mich noch bei Herrn H. Harms für die nette Betreuung und die
Hilfestellungen bezüglich der Bilderfassung und Bildanalysen der histologischen
Präparate bedanken.
Allen Mitarbeitern des Pathologischen Institutes sei für die gute Zusammenarbeit
gedankt.
Zum Schluss möchte ich mich noch bei meiner Familie und meiner Frau für die
vielfältige Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit sowie beim Korrekturlesen
bedanken.
Lebenslauf
Persönliche DatenName : Tobias Robert Georg PreißhofenGeburtsdatum : 24.09.1976Geburtsort : Friedrichshafen
Ausbildung1996 : Abschluss: Allgemeine Fachhochschulreife1996 : Rettungshelferausbildung, Deutsches Rotes Kreuz Ravensburg1997 : Rettungssanitäter-Ausbildung, Rotes Kreuz Ravensburg
Hochschulausbildung05/1998 : Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Humanmedizin03/2000 : Ärztliche Vorprüfung03/2001 : Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung03/2003 : Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung06/2004 : Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Praktika06/2000 - 07/2000 : Orthopädie, Elisabethenkrankenhaus Ravensburg08/2001 - 09/2001 : Pathologie, Julius-Maximilians-Universität Würzburg03/2002 - 04/2002 : Pädiatrie, Kantonsspital Münsterlingen, Schweiz08/2002 - 09/2002 : Allgemeinmedizin, Dr. med. L. Preisshofen, Ravensburg04/2003 - 08/2003 : Innere Medizin, Kantonsspital Aarau, Schweiz08/2003 - 12/2003 : Chirurgie, Whangarei-Area-Hospital, Neuseeland12/2003 - 04/2004 : Orthopädie, Schulthess Klinik Zürich, Schweiz06/2004 - 07/2004: Erwerb der Zusatzbezeichnung Sportmedizin, Akademie Damp
seit 10/04 tätig als Assistenzarzt Abteilung Chirurgie des Krankenhauses 14Nothelfer,Weingarten
Promotion06/01-5/05 Apoptosemessung in verschiedenen Stadien der
Thymozytenentwicklung im menschlichen Thymus undThymomen an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg,unter der Leitung von Prof. Dr. A. Marx
PublikationenMay M., Strobel P., Preisshofen T., Seidenspinner S., Marx A., Speer CPApoptosis and proliferation in lungs of ventilated and oxygen-treated preterm infants.Eur. Respir. J. 2004 Jan; 23 (1):113-21
Strobel P., Preisshofen T., Helmreich M., Mueller-Hermelink HK., Marx A.Pathomechanism of paraneoplastik myasthenia gravisClin Dev Immunolog. 2003 March;10(1):7-12
Ravensburg, Mai 2005