Crioprotectores

• Crioprotectores coligativos

previenen la deshidratación y

disminuyendo la cantidad de

agua absorbida por los cristales

de hielo.

• El DMSO es ligeramente tóxico.

• Atraviesa rápidamente las

membranas celulares

Dimetilsulfóxido (DMSO)

Crioprotectores.

• Aumentan la supervivencia de las

células cuando se agregan a la solución

crioprotectora.

• Modifican la viscosidad y la

temperatura de la transición de la

solución crioprotectora.

• La fuente puede ser autóloga.

Proteínas

Soluciones crioprotectoras

• Sustancia polimérica con cadenas de

diferentes pesos moleculares que no

penetra la célula de forma libre.

• Protege a la célula formando una capa

viscosa y hialina que retarda el

movimiento de agua.

Hidroxietilalmidón (HES)

Almacenamiento• Congeladores mecánicos.

– -120°C a -86°C.

• Congelador de nitrógeno líquido.

– -196°C a -142°C.

Velocidad de congelación

controlada.

• DMSO al 10 %.

• Concentración celular 50x106/ml.

• Velocidad inicial de -1°C/min.

• En -40°C incrementar a -10°C/min.

• En -80°C colocar en la fase gaseosa de

nitrógeno líquido hasta -146°C.

Velocidad de congelación no

controlada

• DMSO al 5 % con HES al 6 %.

• Concentración celular menor a 300000 mm3.

• Colocar en bolsas de almacenamiento en un

congelador mecánico a -80°C.

• En los -80°C incrementar a 10-16°C/min la

velocidad hasta -146°C.

• Almacenar en la fase gaseosa de nitrógeno

líquido.

Ventajas de la congelación no

controlada

• Menor costo.

• Menor tiempo técnico.

• El HES previene la lisis de granulocitos durante

el descongelamiento.

• Usando DMSO al 5% disminuyen las

reacciones tóxicas durante la infusión.

• Sencillo.

• Menos espacio en el congelador.

Protocolo B = –1°C/min Protocolo D = –1.8°C/min

Congelación

Congelación

Congelación

Descongelación

Descongelación

Control de calidad de la

criopreservación.

• Conteo (citometría) (tasas de recuperación de células

mononucleares, CD34+, eritrocitos y PMN).

• Prueba de viabilidad por exclusión de tinción

(con azul de trípano o yoduro de propidio).

• Cultivo de CFU-GM.

Valoración in vitro.

Citometría de Flujo

Citometría de flujo (CF)

Es una técnica multiparamétrica que permite estudiar propiedades físicas y biológicas de las células vivas en una suspensión fluida.

El citómetro es un aparato capaz de medir varios parámetros celulares a partir de una suspensión celular por medio de la interacción de las células con un haz de luz láser guiadas mediante un flujo

contínuo.

Parámetros celulares que pueden

estudiarse

Parámetros

estructurales

Parámetros

extracelulares

Parámetros

superficiales

Parámetros

citoplasmáticos

Parámetros

nucleares

Tamaño

Complejidad

citoplasmática

Proteinas de

superficie Proteinas secretadas

Interacción con

otras cél.

Contenido de

ADN

Proteinas

intracelulares

Actividad enzimática

Esquema del citómetro

Fluídos

Sistema óptico

Sistema electrónico

Láser488nm

FL2 PE

SSC

FSC

FL3 PerCP, Cy5

FL1 FITC

Detectores

Tipos de señales

���� Señales de dispersión

���� Señales de fluorescencia

Tipos de señalesSeñales de dispersión

LASER

Detector de FSC

Detector de SSC

Detector de FSC

Detector de SSC

Inmunomarcación

Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo

Tipos de señalesSeñales de fluorescencia

Bioq. Andrea Novoa - Laboratorio de Citometría de Flujo - Servicio de Hematología

LASER

Detector de SSC

Detector de FL2

Detector de FL3

Detector de FL1

Detector de FSC

Detector de SSC

Detector de FSC

Características de la CF

• Técnica sencilla y rápida

• Alta especificidad

• Multiparamétrica

���� FSC y SSC

���� FL1, FL2 y FL3 (un láser)

���� ó FL1, FL2, FL3 y FL4 (dos láseres)

Fluorocromos

• FITC en FL1 (Isotiocianato de fluoresceina)

• PE en FL2 ( Ficoeritrina)

• PerCP en FL3 (piridin clorofil proteina)

• APC en FL4 (aloficocianina)

Son moléculas químicas que absorben luz a una

determinada longitud de onda y emiten a otra

diferente.

Espectros de emisión

Procesamiento de la muestra

Marcación de superficieCélulas en suspensión + Acs.

Monoclonales*

Lisis con Cloruro de amonio

Resuspender

Adquisición de la muestra

Incubar 20’ en oscuridad

Centrifugar 5’ a 1800rpm

Distribución de las células de una muestra de sangre

normal

Complejidad citoplasmática

Tamaño celular

Distribución de las células de una

muestra de médula ósea normal

10 10 10 10 100 1 2 3 4

10277.008

CD45 PERCPCY5,5 ->

CD45 PerCP

SSC

Granulocitos

Eosinófilos

Precursores CD34+Céls. Rojas nucleadas

Monocitos

Linfocitos

Stem cell

GB

247.000mm3

CD 45 99.42 %

CD 34 1.05 %

GB

430.000mm3

CD 45 99.86 %

CD 34 0.02 %

Stem cell

GB

170.000mm3

CD 45 97.42 %

CD 34 0.25 %

GB

220.000mm3

CD 45 98.43 %

CD 34 1.05 %

• El recuento de células CD34+

es necesario para determinar

las dosis requeridas en los

transplantes de células

progenitoras

• La Citometría de Flujo provee

una metodología cuantitativa

rápida y reproducible para la

identificación y enumeración

de células CD34+

Trypan Blue

• El método de exclusión Trypan Blue es

ampliamente utilizado en laboratorios para la

determinación de viabilidad; solamente

penetra en células cuyas membranas

plasmáticas estén dañadas. Las membranas

de células viables no se tiñen con el colorante

pues son impermeables al mismo, y las células

teñidas y las no teñidas se visualizan con un

microscopio.

Trypan Blue

CULTIVO CELULAR

-Método Funcional

Recolección

+ IMDM

FICOLL

+ STEM

400 G 30`

GRD+Neutrof

STEM

IMDM

FICOLL

STEM

+ IMDM

IMDM

X 2

Resuspensión

Recuento

1x 106

AGAR

Suero Bovino

Fetal

Células

Medio Cultivo

2 LAVADOS

STEM + Mononucleares

Estufa 37º C Humidificada, CO2 al 5% durante 10 dias

Mezcla + FEC-G Mezcla sin FEC-GMezcla + FEC-G

Leer microscopio invertido

Microcolonias + 4 C / Colonias entre 40-50 C

Efectos asociados a la infusión

Efectos asociados a la infusión de

CPH.

• Los efectos colaterales de la infusión de CPH

se minimizan reduciendo el volumen total y

las células rojas infundidas.

• Los métodos al seleccionar mejor las celulas

disminuyen los efectos colaterales y mejoran

la velocidad de respuesta del injerto.

ehheh….

¿Qué hay de nuevo, viejo?

Gracias