diagnóstico molecular aplicado a doenças animais www

Diagnóstico Molecular aplicado a doenças animais

www.ldmvet.com.br

Campus de Botucatu

Prof. Dr. João Pessoa Araújo Junior

Departamento de Microbiologia e Imunologia

Laboratório de Virologia / Diagnóstico Molecular

e-mail: [email protected]

http://www.ldmvet.com.br/

Teste Laboratorial desejado:

Produz resultados confiáveis e

precisos em um curto período de

tempo e que tenham utilidade clínica

com bom custo x benefício.

15SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS

threshold

Copyright ©2005 American Physiological Society

Valasek, M. A. et al. Advan. Physiol. Edu. 29: 151-159 2005;

doi:10.1152/advan.00019.2005

Fig. 5. Real-time PCR hardware

15SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS

threshold

PCR tradicional; Nested-PCR;

RT-PCR (transcrição reversa)

qPCR (real time) ou

RT-qPCR (transcrição reversa)

Técnicas mais empregadas no diagnóstico

Abismos na logística do

diagnóstico laboratorial

Para diagnosticar INFECÇÃO

INFECÇÃO X DOENÇA

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines

for Terrestrial Animals 2011 - OIE

Chapter

.1.4/5.

Principles of validation of diagnostic assays for

infectious diseases (NB: Version adopted in May, 2009)

• Para discriminar entre infecção e imunidade materna.

• Em estágios finais de programas de controle ou erradicação

• Para discriminar cepas vacinais das de campo

Doença de Aujeszky (Herpesviridae)

www. allategeszsegugy.pfizer.hu

Quando fazer um diagnóstico laboratorial

Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2011 - OIE

• Para epidemiologia molecular e análises de evolução dos vírus, bactérias,

protozoários e fungos.

SEQUENCIAMENTO



• Para diagnóstico rápido e seguro em situações de risco.



• Para determinar a carga ou a excreção viral (ex.porcine circovirus type 2 infections).

9 15SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS

threshold

qPCR ou RT-qPCR



• Monitoramento rápido de animais com sinais clínicos.



Ehrlichia e Anaplasma

Nested PCR

1316 1316 bpbpfHf5fHf5fHf5fHf5

rHf6rHf6rHf6rHf6

675 675 bpbp

H.H.felisfelis--f1f1H.H.felisfelis--f1f1

H.H.felisfelis--r2r2H.H.felisfelis--r2r2

qPCR para Ehrlichia canis ou Ehrlichia sp

Primer R E.sp

Primer F E.sp Primer F E.canis

Análises realizadas desde 2004

Babesia canis

• Monitoramento rápido de animais com sinais clínicos.



Cinomose (Canine distemper)

Família: Paramyxoviridae (RNAss -)

Transcrição reversa in vitro

Primers

Passo 1: Anexação dos primers ao

RNA alvo

Passo 2: Transcrição reversa

Síntese do cDNA

Amplificação cDNA por PCR

• Detecção de mutantes resitentes a drogas, etc.

• Para demonstrar estado “livre de infecção” em animais vivos

• Análises de produtos de origem animal.



Febre aftosa

Validando uma PCR

Pré- análise

Padronização

Pós-análise

Pré- análise

Escolha e análise dos primers. (Primer

Blast, OligoAnalyser)

Definição dos reagentes e

equipamentos

Pré- análise

Definição da logística de análise

Estrutura Laboratorial

Lab. Nested PCR

Lab. Extração RNA

Lab. Extração DNA

Lab. Amplificação/qPCR

Lab. Amplificação - Nested

Lab. Eletroforese e preparo de

amostras amplificadas para

clonagem e sequenciamento

Lab. Biosegurança

Lab. Sequenciamento DNA

Fluxo de trabalho


Lab. Extração RNA e

Pré-PCR


Lab. Extração DNA


Lab. Amplificação (PCR e qPCR),

sorologia e Cultivo celular e viral


Lab. Nested, Hibridização e

“pulse field”


Lab. Amplificação do Nested


Lab. Eletroforese e

fotodocumentação”


Lab. Biosegurança P2+

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Laboratório de Diagnóstico Molecular

Desde setembro de 2002 Cães:

Ehrlichia canis

Anaplasma plattys

Ehrlichia sp

Babesia canis

Leptospira sp

Brucela sp

Adenovírus tipo 1 e 2

Parvovirus

Gatos:

Vírus da Imunodeficiência

Vírus da Leucemia

Micoplasmas

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