diagnostika - beckmancoulter.cz 2014-25.pdf · v České republice prodávat a podporovat...

Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 25 - 2014

diagnostikain vitro

Vysokorychlostní buněčný sorter MoFlo Astrios EQ

Počítání dendritických buněk pomocí automatického buněčného analyzátoru Vi-Cell

Význam stanovení vitaminu D v rutinní praxi

Rozšiřujeme menu testů řady AU – souprava TP Latex pro screening syfilis

Projekt riešenia a realizácie technologického vybavenia klinických laboratórií Fakultnej nemocnice s poliklinikou F. D. Roosevelta, Banská Bystrica

Movember ve Frýdku Místku

Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 25 - 2014

diagnostikain vitro

32

Vážení čtenáři,

dostává se vám do rukou další číslo časopisu IVD. Toto informační médium nám slouží jako jeden z prostředků vzájemné komunikace mezi odbornou veřejností a společností Beckman Coulter. Jeho prostřednictvím se vám sna-žíme již několik let přinášet novinky o naší firmě, o lidech, kteří v ní pracují, a současně zveřejňovat vaše názory na naši činnost. V In Vitro Diagnostice neinzerujeme pouze naše produkty, ale snažíme se, aby to byla zároveň vzdělávací platformou. Pravidelně vás zde informujeme o nových poznatcích vědy a vý-zkumu a především o jejich aplikaci v praxi. V editorialech často reagujeme na aktuální dění ve sféře zdravotnictví, vědy a výzkumu a zejména se zajímáme o vliv dané situace na naše odvětví.

V dnešním úvodníku bych se rád pozastavil nad situací, s níž se v současné době společ-nost Beckman Coulter Česká republika s.r.o. potýká. Naneštěstí se nejedná o jev až tak výjimečný. Koncern Beckman Coulter Inc. před více než dvěma lety oznámil akvizici (nákup) společnosti IRIS Inc. Ta se krom jiného již tradičně zabývá vývojem, výrobou a prode-jem zdravotnických prostředků pro močovou analýzu – analyzátorů, reagencií, dalšího spotřebního materiálu a softwaru. IRIS byla na základě distributorské smlouvy zastupována na území naší republiky českou distributorskou

firmou. Platnost dohody, na jejímž základě byla založena kooperace s tímto distributo-rem a výrobcem, dnem 31. 12. 2013 skončila. Produkty firmy IRIS, která je dnes nedílnou součástí koncernu Beckman Coulter Inc., bude v České republice prodávat a podporovat spo-lečnost Beckman Coulter Česká republika s.r.o., o čemž byl původní dodavatel produktů IRIS obeznámen již začátkem roku 2013.

Naše společnost přesně v souladu s podmín-kami distributorské smlouvy a s ohledem na potřeby uživatelů systémů IRIS o této sku-tečnosti informovala trh na konci roku 2013. Všichni klienti, uživatelé či potenciální zájemci o produkty IRIS obdrželi oznámení o převzetí prodeje a produktové podpory naší firmou. V rámci zabezpečení takové činnosti Beckman Coulter Česká republika s.r.o. splnil celou řadu legislativních požadavků, aby tak postupoval přesně v souladu se zákonem o zdravotnic-kých prostředcích, jakož i v souladu s právními předpisy Evropské unie. Těmito předpisy je povinen řídit se každý, kdo nabízí a poskytuje služby ve zdravotnictví mající přímý dopad na zdravotní stav pacienta. Přes veškerou naši snahu vyhnout se nepříjemné situaci, jež by měla nežádoucí vliv na uživatele systémů IRIS, jsme svědky toho, že po 1. 1. 2014 bývalý dis-tributor nejedná dle výše zmiňovaného zákona.

Společnost Beckman Coulter Česká repub-lika s.r.o. při svém podnikání vždy dodržovala veškeré právní a etické normy. Jejím středem zájmu je prospěch pacienta a potřeby zákaz-níka. Budeme tak činit i v tomto případě. Rádi poskytneme všem uživatelům systémů pro močovou analýzu IRIS legislativní a regula-torní poradenskou a konzultační službu. Pokud máte o tuto pomoc zájem, vyžádejte si ji, pro-sím, na telefonických či e-mailových kontak-tech uvedených na našich webových stránkách www.beckman.cz.

V dnešní době není snadné zorientovat se v tom, co je nezbytné, aby byl zabezpečen sou-lad s legislativními požadavky. Výklad různých pojmů, jako je například používání zdravot-nického prostředku „ve shodě a v návaznosti na výrobce“, si dost často vyžaduje odborníka erudovaného v této problematice. Naše spo-lečnost takovými experty disponuje a jsou vám zcela k dispozici pro účely uvedené regulatorní podpory. Pevně věřím, že nám všem leží na srdci především práva a prospěch pacienta.

Přeji vám, abyste také v tomto vydání našeho časopisu nalezli články a informace, které vás zaujmou či jakkoliv obohatí.

ŠTĚPÁN TINTĚRA

OBSAH

Časopis vydává a distribuujeBeckman Coulter Česká republika s.r.o., Radiová 1, 102 27 Praha 10,www.beckman.czČasopis připravujíIng. Kateřina KožanáIng. Eva KrálováIng. Hana KrátkáMgr. Pavel KružíkIng. Kateřina Sikorová, Ph.D.Ing. Petr SuchanMgr. Patrik ŠafRNDr. Jozef Smolka

Do časopisu přispěliRNDr. Štěpán TintěraMgr. Pavel KružíkIng. Roman VlčekRNDr. Martin Polčík, CSc.Bc. Jaroslav Šebek, Dis.Iveta Bottová, Ph.D.Ing. Petr BoudalMgr. Ing. Tereza TietzeIng. Mgr. Ivana MičíkováProf. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. FN Plzeň a LF v Plzni, UK v PrazeMUDr. Radka Fuchsová FN Plzeň a LF v Plzni, UK v PrazePharmDr. Radek Kučera, Ph.D. FN Plzeň, Beckman Coulter Česká republika s.r.o.MUDr. Inka Třešková, Ph.D. FN PlzeňIng. Hana KrátkáIng. Vratislav Novák, Ph.D.Mgr. Helena BazovskáMgr. Jozefína BernátováIng. Eva KrálováMgr. František VičarIng. Kateřina KožanáIvan Šarkan - autor křížovkyIng. Stanislav Čermák - autor tajenky

Grafik Jiří Adámek

Náklad čísla 2000 výtisků

Editorial: IRIS je součástí Beckman CoulterŠ. Tintěra

Stanovení životnosti buněk průtokovou cytometriíP. Kružík

Nová CE IVD verze soupravy PerFix-nc pro současné značení intracelulárních a povrchových znakůP. Kružík

Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometriiP. Kružík

DuracloneR. Vlček, P. Kružík

Kaluza G R.Vlček

Vysokorychlostní buněčný sorter MoFlo Astrios EQR. Vlček

Srovnání Coulterova principu a dynamického rozptylu světlaM. Polčík

Kryobiologie - kryoprezervace a viabilita buněkJ. Šebek

VALIDAČNÍ STUDIE - Počítání dendritických buněk pomocí automatického buněčného analyzátoru Vi-CellI. Bottová

Automatická hematologická linka Beckman Coulter UniCel DxHP. Boudal

Vitamin D – novinka v portfoliuT. Tietze, I. Mičíková

Význam stanovení vitaminu D v rutinní praxiO. Topolčan, R. Fuchsová, R. Kučera Maligní melanom I. Třešková

Nádory plic a stanovení MonoTotal® IRMA/ELISAH. Krátká

Rozšiřujeme menu testů řady AU – souprava TP Latex pro screening syfilisV. Novák Projekt riešenia a realizácie technologického vybavenia klinických laboratórií Fakultnej nemocnice s poliklinikou F. D. Roosevelta, Banská BystricaH. Bazovská

Stretnutie užívateľov koagulačných systémov Instrumentation Laboratory, 3. – 4. októbra 2013, Nový SmokovecJ. Bernátová

XVII. celostátní konference DNA diagnostiky, 28. – 29. listopadu 2013, Dolní Morava E. Králová

Movember 2013 - slovem i ve fotografiíchT. Tietze, I. Mičíková, F. Vičar

vizitka: Ing. Petra KabeleováI. Mičíková

Křížovka

Kde se můžeme setkat

2

5

5

6

8

910

14

17

20

24

26

2729

30

32

33

34

35

36

3739 40

IRIS je součástí Beckman Coulter

Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 25 - 2014 5www.beckman.cz

Originál je pouze jedenIris® je součástí Beckman Coulter

v kombinaci s FITC/GFP + PE není nutná.

Emisní fluorescenční vlnová délka je vyšší než 665 nm. Optimálními emisními filtry jsou 695LP, 715LP nebo 780LP. Pro excitaci lze pou-žít lasery 488 nm, 568 nm a 633 nm nebo op-timálně 647 nm. Narozdíl od propidium jodidu není DRAQ7 excitován UV laserem.

Značení pomocí 7-AAD, DRAQ7 nebo DAPI umožňuje stanovit životnost buněk s volbou pro modrý, červený nebo fialový laser v kom-binaci se značením povrchových znaků buněk monoklonální protilátkami.

7-aminoaktinomycin D (7-AAD) se vmeze-řuje mezi po sobě jdoucí cytosinové (C) a gua-ninové (G) báze dvojitého řetězce DNA. 7-AAD je optimální např. pro značení živých kmeno-vých buněk v kombinaci s CD45-FITC a CD34--PE.

DRAQ7™ je fluorescenční barvivo DNA, kte-ré značí POUZE jádra mrtvých, nebo permea-bilizovaných buněk. Může být kombinováno s dalšími fluorochromy, zejména s GFP a FITC, a PE konjugovanými protilátkami. Kompenzace

Stanovení životnosti buněk průtokovou cytometrií

Obj. číslo Popis

DRAQ7™ Far-Red Fluorescent Live-Cell Impermeant DNA Dye B25595 1 ml, ready-to-use, 200 testů

DAPI UV/violet excitable DNA Dye B30437 1 ml, ready-to-use, 200 testů

7-AAD Viability Dye A07704 3 ml, ready-to-use, 150 testů

488 nm 638 nm 405 nm

FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC AF700*

APC AF750*

Pacific Blue*

Krome Orange

CD19 CD56 CD20 CD38 CD4 CD8 CD3 DAPI CD45

488 nm 638 nm 405 nm


APC AF750*

Pacific Blue*

Krome Orange

HLA-DR CD56 CD20 CD38 CD4 CD8 DRAQ7 CD3 CD19 CD45

DAPI pro fialový laser je ideální pro mnoha-barevné analýzy s použitím monoklonálních protilátek.

Všechny reagencie jsou určeny k přímému použití.

Příklad použití DRAQ7 v mnohabarevném panelu:

Příklad použití DAPI v mnohabarevném panelu:

Nová CE IVD verze soupravy PerFix-nc pro současné značení intracelulárních a povrchových znakůReagencie PerFix-nc (no centrifugation) je ur-čena pro cytometrické analýzy intracelulárních epitopů, nebo kombinované značení povrcho-vých a intracelulárních znaků, včetně fixace, permeabilizace leukocytů periferní krve nebo kostní dřeně a lýzy erytrocytů bez nutnosti centrifugace.Počet kroků přípravy vzorků je výrazně zredu-kován. Celkový čas manuální manipulace je tak kratší než 15 minut. Souhrnná doba přípravy včetně inkubací je 45 min. Tento postup je nej-rychlejší přípravou vzorků pro intracelulární značení bez centrifugace.

Značení více povrchových a intracelulárních znaků se provádí současně během permeabi-lizace.Buňky si po permebilizaci uchovávají své optic-ké vlastnosti. Je tak možné gatovat jednotlivé populace leukocytů. Reagencie je velmi šetr-ná k fluorochromům, včetně ECD, PC5.5, APC, APC-Alexa 700, APC-Alexa 750, Pacific Blue,

Krome Orange a dalším. Je optimální pro pou-žití v mnohabarevných analýzách.Typickým příkladem v hematologii je použití různých kombinací znaků MPO-FITC, CD79a--PE, CD3-ECD, CD14-Pacific Blue a CD45-Kro-me Orange.Pro některé znaky je možné přidat jako posled-ní krok v postupu promytí v centrifuze.

Obj. číslo Název Počet testů

B31167 PerFix-nc Kit (no centrifuge assay kit) 75

B31168 PerFix-nc Kit (no centrifuge assay kit) 150

Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA 25 - 2014 76

Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii

Popis Fluorochrom Obj. číslo Klon

Phospho-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) Alexa Fluor® 488 B23137 E10

CD294 FITC B40020 BM16

CD197 (CCR7) PE B30632 G043H7

Phospho-Stat5 (Tyr694) PE B23139 C71E5

CD79a PC5.5 B42018 HM47

CD279 PC5.5 B36123 PD1.3

CD80 PC7 B30644 MAB104

CD86 PC7 B30648 HA5.2B7

CD206 PC7 B36120 3.29B1.10

CD274 (PD-L1) PC7 A78884 PD-L1

CD335 (NKp46) PC7 B38703 BAB281

CD85j APC B30645 HP-F1

IgD APC B30651 IA6-2

CD127 APC B42026 R34.34

CD134 APC B30629 Ber-ACT35

CD274 (PD-L1) APC B36126 PDL1.3.1

CD278 APC B36127 ISA-3

CD11c APC-Alexa Fluor® 700 B43304 BU15

CD30 APC-Alexa Fluor® 700 B42017 HRS4

CD36 APC-Alexa Fluor® 700 B46022 FA6.152

CD80 APC-Alexa Fluor® 750 B30643 MAB104

CD86 APC-Alexa Fluor® 750 B30646 Thy1/310

CD90 APC-Alexa Fluor® 750 B37789 Thy1/310

CD161 APC-Alexa Fluor® 750 B30630 191B8

CD36 Pacific BlueTM B43302 FA6.152

CD44 Pacific BlueTM B37789 J.173

CD138 Pacific BlueTM B37788 B-A38

CD206 Pacific BlueTM B36119 3.29B1.10

Phospho-S6 Ribosomal Protein Pacific BlueTM B23136 D57.2.2E

FoxP3 Alexa Fluor® 647 B30650 259D

Nové monoklonální protilátky jsou určeny jak pro základní cytometry se 488nm laserem, tak pro systémy vybavené červeným (633 – 640nm), žlutým 561nm a fialovým 405nm laserem.

www.beckmancoulterreagents.com

Obě molekuly jsou exprimovány na povrchu antigen prezentujících buněk, především B-lymfocytů a dendritických buněk. Váží se na molekuly CD28 a CD152 (CTLA-4) exprimovaných na povrchu aktivovaných a aktivačních T-lymfocytů.

Návrh panelu s použitím CD80 a CD86 pro stanovení myeloidních dendritických buněk:

488 nm 638 nm 405 nm


APC AF750*

Pacific Blue*

Krome Orange

HLA-DR CD86 CD16 CD11c CD85k CD80 CD14 CD33 CD206 CD45

Obě molekuly doplňují spektrum znaků určených pro stanovení B-lymfocytů:

CD80 a CD86

FITC PE ECD PC5 PC5.5 PC7 APC APC -A700

APC -A750

Pacific Blue

Krome Orange

CD5 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●CD10 ● ● ● ● ● ● ● ● ●CD11c ● ● ● ● ●CD19 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●CD20 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●CD21 ● ● ●CD22 ● ● ● ● ● ● ● ● ●CD23 ● ● ● ● ● ● ●CD24 ● ● ● ● ● ● ●CD25 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●CD27 ● ● ● ● ● ● ● ●CD38 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●CD43 ● ● ●CD45 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●CD56 ● ● ● ● ● ● ●CD79a ● ● ●CD79b ● ● ●CD80 ● ● ● ● ●CD81 ● ● ● ●CD86 ● ● ● ●CD103 ● ●CD138 ● ● ● ● ●FMC7 ● ●IgM ● ● ● ●IgD ● ● ●

kappa ●lambda ●

PAVEL KRUŽÍKe-mail: [email protected]


V loňském roce získala společ-nost Beckman Coulter firmu Reametrix, která vlastní oje-

dinělou a patentovanou technologii pro koutování protilátek pro průto-kovou cytometrii na dno cytometric-kých zkumavek ve vysušeném stavu (nikoliv lyofilizovaném) a to včetně konjugovaných fluorochromů. Tato technologie je nabízena pod ob-chodním názvem DURACLONE a je nyní k dispozici v rámci koncernu Beck-man Coulter.

Uvedená unikátní technologie umožňuje namíchání koktejlů v podstatě jakýchkoliv konjugátů protilátek s jakýmikoliv fluo-rochromy zahrnujícími i citlivé tandemové fluorochromy PC5.5, PC7, APC-AlexaFluor 700, APC-AlexaFluor 750 apod. a jejich následné vysušení na dno cytometrické zkumavky kla-sického formátu 12 x 75 mm. Takto připravený a vysušený koktejl vykazuje mimořádnou sta-bilitu při běžné laboratorní teplotě. Je testován dokonce také v extrémních podmínkách při teplotě 60°C bez jakékoliv ztráty funkčnosti protilátky i fluorochromu. Odpadá tak nutnost skladování mnoha lahviček v lednici, což ocení zejména laboratoře využívající mnohobarevné experimenty.

Při použití zkumavek DURACLONE se znač-ně zjednodušuje proces přípravy vzorku. Do zkumavky, na jejímž dně je příslušný vysušený koktejl protilátek, se přidá vzorek (krev). Tato zkumavka se pak nechá 20 minut inkubovat. Následně se vzorek zlyzuje běžnými komerč-ními lyzačními činidly a tím je připraven pro měření. Výsledky jsou velmi reprodukovatelné,

neboť příprava ze své podstaty vylučuje mož-nost chyby pipetování, nestability protilátky/fluorochromu apod.

Beckman Coulter nabízí tyto soupravy jako CDS (Custom Design Service) i jako komerční hotové IVD-CE soupravy. V případě CDS si zá-kazník může dle svých požadavků nechat pří-mo u naší společnosti namíchat vlastní koktejl protilátek označených preferovanými fluo-rochromy a následně si jej nechat nakoutovat na dno zkumavek. Volit lze z 2 až 10 barevných koktejlů. Tato služba je dostupná také pro teku-té formáty koktejlů. Z CE-IVD certifikovaných souprav je k dispozici pro evropský trh zejména souprava pro stanovení HLA B27 antigenu.

Souprava DuraClone HLA B27 Reagent Kit (objednací číslo B36862, 50 testů) je určena pro průtokové cytometry FACScan™ a FACSCa-libur™ (výrobce BD). Obsahuje ve zkumavce dvě

monoklonální protilátky proti HLA B27 antige-nu (ABCm3 a FD705), monoklonální protilát-ku proti HLA B7 (BB7.1), CD3-PE-Dyomics649 a kalibrační partikule. Monoklonální protilátka FD705 se přednostně váže na HLA B7 antigen, čímž snižuje zkříženou reaktivitu. Specificita soupravy je 96 %.

Pro bližší informace navštivte stránky www.duraclone.com, nebo nás kontaktujte.

ROMAN VLČEKe-mail: [email protected]

PAVEL KRUŽÍKe-mail: [email protected]

Od ledna tohoto roku je k dispozici nový akviziční software pro průtokový cytometr Gallios – Kaluza G.

Tento software byl vyvinut pro maximální zefektivnění práce ve výzkumné laboratoři. Vyniká v jednoduchosti obsluhy i zaškolení. Kaluza G přímo spolupracuje s analyzačním software Kaluza v 1.3, do níž přímo přenáší naměřená data.

Nový software rovněž obsahuje zcela ojedi-nělou funkci – SIMULATOR. Ta umožňuje post- akviziční načítání (simulaci) měření z již ulo-ženého FCS souboru, přičemž lze měnit nejen kompenzace, ale také napětí na jednotlivých fotonásobičích. To bylo do současnosti možné

pouze v průběhu vlastního měření vzorku. Jed-ná se tak o zcela jistě revoluční a velmi vítanou funkcionalitu.

Průtokový cytometr Gallios je standardně vy-baven modrým 488nm a červeným 638nm la-serem. Lze jej navíc dovybavit fialovým 405nm a žlutým 561nm laserem. Může být rovněž vy-baven až 10 fotonásobiči pro fluorescence.

� 6 color, 2 laser (488nm Blue & 638nm Red) (5 + 1)

� 8 color, 2 laser (488nm Blue & 638nm Red) (5 + 3)

� 10 color, 3 laser (488nm Blue, 638nm Red & 405nm Violet) (5 + 3 + 2)

Duraclone Kaluza G� 10 color, 4 laser

(488nm Blue & 561nm Yellow [co-linear], 638nm Red, 405nm Violet) (5 + 3 + 2)

Zároveň, díky vylepšené optice pro přímý rozptyl (Forward Scatter) umožňuje měření mikropartikulí již od 0,3 µm.


Software ukládá data jako FCS soubory verze 3.1

++

Take dry unitizeddried-downreagent tube

Add bloodsample

Vortex &incubate

Add lysissolution &incubate

Acquire &analyze by flowcytometry


V prosinci minulého roku uvedla naše společnost na trh novou ge-

neraci vysokorychlostního buněčného sorteru – MoFlo Astrios EQ. Ta nava-zuje na uzavřený koncept předchozí generace MoFlo Astrios a přináší navíc celou řadu vylepšení pro jednoduchou, automatizovanou a přitom velmi spe-cializovanou cytometrickou analýzu a sortování buněčných populací.

MoFlo Astrios EQ je 6cestný jet-in-air sorter, který při zachování všech výhod systému jet--in-air, tedy zejména vysoké viability buněk, ověřené, stabilní fluidiky a na trhu nejrychlejší elektroniky, umožňuje sortovat buněčné popu-lace až při rychlosti 70 000 buněk/sekundu při zachování čistoty všech sortovaných popula-cí přes 99 %. Tyto parametry jsou validovány a výrobcem garantovány.

Systém lze vybavit až 7 nezávislými (7 pinho-lový systém) lasery od 355 nm až po 642 nm, což minimalizuje potřebu interlaserové kom-penzace Každý laser má pak své detekční hnízdo (POD), celkem tedy až s 49 detektory, přičemž systém umožňuje současně používat až 32 parametrů během experimentu.

Optické lavice jsou uživatelsky definovatelné (filtry) standardně optimalizované pro násle-dující fluorochromy:

� 355nm laser – PI, Hoechst (Red and Blue), DAPI

� 405nm laser – SSC, Cascade Blue*, Pacific Blue*, Cascade Yellow*

� 488nm laser – SSC, FITC, PE, ECD (PE-Texas Red*), PE-Cy5/PerCP, PE-Cy5.5, PE-Cy7

� 532nm laser – SSC, PE, PE-Alexa* 610, PE-Alexa 647, PE-Cy5.5, PE-Alexa 700

� 561nm laser – SSC, mCherry, DSRed,

mPlum, HCRed� 592nm laser – SSC, Texas Red, APC, APC-

-Cy7, Alexa 647, Alexa 700, Alexa 750� 642nm laser – SSC, APC, APC-Cy7, Ale-

xa 647, Alexa 700, Alexa 750

Cascade Blue, Pacific Blue, Cascade Yellow, PE-Texas-Red a Alexa Fluor jsou registrované obchodní značky firmy Molecular Probes, Inc.

Zapomeňte na zažitou představu, že je jet-in-air buněčný sorter náročný na obsluhu a vyžaduje od operátora mimořádné, pokročilé znalosti a zkušenosti. Buněčný sorter MoFlo Astrios EQ disponuje zcela automatizovanými procedurami včetně:

- programovatelného automatického zapnutí a předehřátí systému na konkrétní zvolený čas

- automatického alignmentu laserů

- automatizované QC procedury

- v neposlední řadě zcela automatickým na-stavením a udržováním zpoždění kapek

(drop delay) a to bez nutnosti použití ja-kýchkoliv kalibračních partikulí (systém In-telliSort II).

Systém IntelliSort II nastaví automaticky optimální drop delay pro dané podmínky ex-perimentu. Pomocí analýzy obrazu udržuje úpravou parametrů (amplituda, frekvence) podmínky stabilní v čase.

Při dlouhých sortovacích experimentech obecně hrozí nebezpečí ucpání trysky, což vět-šinou vede k nekorigovatelným změnám sorto-vacích podmínek. Různé systémy různých vý-robců poté na tyto nové podmínky reagují různě, nebo nereagují vůbec. MoFlo Astrios EQ pomocí systému IntelliSort II vyhodnotí situaci během velmi krátkého časového úseku (v řádu mikro-sekund) a v případě nekorigovatelnosti změn pa-rametrů ukončí ihned proudění vzorku a nosné tekutiny a vydá příkaz propojenému systému Sort Rescue, který fyzicky odstraní zkumavky nebo destičky, do nichž se frakce sortují, a tím zabrání jakékoliv jejich kontaminaci.

Zde právě obsluha ocení systém IntelliSort II sorteru MoFlo Astrios EQ. Ten pro znovunasta- vení drop delay žádné kalibrační partikule nepotřebuje. Vlastní nastavení tak probíhá za zcela sterilních podmínek. Tyto vlastnosti jsou výhodou zejména pro laboratoře, jež potřebují zajistit dlouhodobě stabilní podmínky expe-rimentu s minimální náročností nastavovaní systému.

Pokud navíc probíhá experiment za steril-ních či aseptických podmínek, je vždy nutné ucpání trysky odstranit buď použitím někte-rého čistícího algoritmu software sorteru, nebo, není-li to dostatečné, fyzickým vyjmutím a sonifikováním sortovací trysky. Pro zajištění pokračování sterilního sortu je pak třeba zno-vu sterilizovat fluidní dráhu a znovu nastavit drop delay. V případě systémů, které jsou sice schopny automaticky nastavit drop delay, ale potřebují k tomu jakékoliv kalibrační partikule, jež samozřejmě nejsou sterilní, musí obsluha po jejich použití znovu sterilizovat systém. V případě sorteru MoFlo Astrios EQ vybave-ného systémem IntelliSort II je nastaven nový drop delay bez nutnosti použití partikulí, čímž je zcela eliminováno riziko zanesení kontami-nace. Problém tak odpadá a práce operátorem je tím výrazně usnadněna.

Většina laboratoří sortujících své populace buněk pak samozřejmě vyžaduje minimalizaci ztrát těchto vzácných populací tzv. hard abor-ty (buňky jsou v takovém případě odvedeny do odpadu, tedy ztraceny pro další analýzy), které jsou dány pomalou elektronikou systémů s 16, resp. 18bitovým zpracováním dat a vzor-kovací frekvencí na úrovni jednotek či desítek MHz. Při vyšších rychlostech sortování jedno-duše nejsou schopny zachytit všechny události v daném časovém rámci.

Systém MoFlo Astrios EQ vybavený 100MHz vzorkovací frekvencí a 32 bitovým zpracová-ním dat s rozlišením přes 4 miliardy kanálů ve škále je nevýkonnějším buněčným sorterem na trhu. Minimalizuje jakékoliv ztráty buněk dané hard aborty při zachování unikátního rozlišení všech analyzovaných populací.

6cestné sortování může probíhat třemi růz-nými technikami:

1) Purity – kdy je dosaženo maximální čistoty vysortované frakce (sortuje se jakákoliv ka-pička obsahující jen buňky našeho zájmu)

2) Enrich - kdy není prioritou maximální čis-tota frakce, ale maximální zisk buněk, které nás zajímají (je sortována každá kapička ob-sahující buňky našeho zájmu i za cenu pří-měsi jiné buňky)

3) Single cell Mode – kdy se do dané frakce sortují pouze kapičky obsahující právě jed-nu buňku, která je předmětem zájmu

Zcela unikátní vlastností systému MoFlo As-trios EQ je tzv. MIX MODE sorting. Jedná se o uživatelsky volitelnou techniku sortování pro každý sortovací proud samostatně v rámci jed-noho sortovacího experimentu. To vede k mi-nimalizaci ztrát vzácných populací buněk. Na-hoře je uveden názorný příklad výhody tohoto uspořádání, kdy jsou sbírány veškeré frakce včetně abortů, díky čemuž jsou všechny k dis-pozici pro případnou reanalýzu, nikoliv tedy znehodnoceny odvedením do odpadu.

Sortování může probíhat z nejširší škály zkumavek na trhu – od 0,5ml až po 50ml, což usnadní práci obsluze a zcela eliminuje nut-nost alikvotace vstupního vzorku.

Výstupním formátem sortovacích frakcí pak může být jak jakákoliv zkumavka o objemu 0,5 – 50 ml, tak podložní mikroskopické sklíč-ko, 96-, 384- či 1536jamkové destičky nebo jakýkoliv uživatelsky definovatelný formát.

Samozřejmostí je možnost chlazení vzor-ku i sortovaných frakcí v širokém rozmezí od -2 do 40°C.

Vezmeme-li v úvahu také nejširší spektrum velikostí sortovacích trysek, počínají od 50 µm a končící u 400 µm, je zřejmé, že pokrývá apli-

Vysokorychlostníbuněčný sorterMoFlo Astrios EQ

kace pro prakticky libovolnou velikost buněk či

partikulí, které chceme sortovat.

MoFlo Astrios EQ má nově modifikovanou

detekci přímého rozptylu světla (Forward Scat-

ter). Díky uživatelsky výměnným filtrům umož-

ňuje unikátní detekci mikročástic již od 0,2 µm

včetně až do 30 µm a to v jedné zobrazené

škále. Uživatel tak může zároveň analyzovat

a sortovat například mikropartikule odvozené

od krevních destiček a granulocyty.

Celý systém lze volitelně uzavřít do BioSafety boxu Class II (BSL2), který splňuje standardy European Standard (EN 12469:2000) a ISAC. Biosafety box navíc není pouze pasívní schrán-kou zajišťující ochranu personálu či vzorku, ale je zároveň aktivně propojen a komunikuje se softwarem sorteru MoFlo Astrios EQ. V pří-padě jakékoliv nestability v proudění vzduchu BioSafety boxem reaguje ukončením sortování, a tak zajišťuje maximální ochranu personálu při práci s vysoce infekčním materiálem.

Pro více informací navštivte stránky: www.astrioseq.com


488-FSC2-Log ND=0

0.3 um

0.2 umNoise

Co

un

ts

30 um1 um

Maximize safety without compromising workflow.

Sorting made simpler.

For Research Use Only. Not to be used in diagnostic procedures. Class I laser product.MoFlo Astrios is a trademark of Beckman Coulter, Inc. Beckman Coulter and the stylized logo are trademarks of Beckman Coulter, Inc. and are registered with the USPTO.

EQ

* 7 pinholes* až 7 nezávislých laserů od 355 po 642nm* akviziční rychlost 100 000 buněk/sekundu* měření až 32 parametrů současně* sortování validováno až do 70 000 buněk/sekundu* automatické nastavení a udržování drop delay bezpoužití partikulí (IntelliSort II)

* 6 cestné sortování třemi různými technikami* sortování na sklíčka, do 6 - až 1536 - well plates* 32 bitové zpracování dat* více než 4 miliardy zobrazených kanálů na škále* možnost do umístění BioSafety boxu Class II* zcela automatický start up* zcela automatický QC proces* rozlišení ForwardScatter 0,2 až 30 um v jedné škále

ZVYŠTE VÝKON A KAPACITU VE VAŠÍ DIAGNOSTICKÉ LABORATOŘI

99 000 Kč

VÝKYVNÝ ROTOR S ADAPTÉRY PRO ODBĚROVÉ ZKUMAVKY

www.beckman.cz/diagnostika/centrifugy

Beckman Coulter Česká republika s.r.o.Murmanská 1475/4, Praha 10, tel.: 272 017 999e-mail: [email protected]

VČETNĚ ROTORU A 4+4 KS ADAPTÉRŮ ZA

Nabídka platí do 20. 12. 2014

bez

DP

H

ADAPTÉRY PRO STOJÁNKY

Z ANALYZÁTORŮDxC a DxI

PŮDORYS JEN 50x64 cm (šxh)

4x35 ks ø13 mm4x25 ks ø16 mm

4 700 rpm4 643 g (rcf)

NOVÁ stolní centrifuga

ALLEGRA X-5


V této zprávě srovnáváme dvě rozdílné metody charakterizace

submikronových objektů – lipozomů – pomocí přístrojů společnosti Beck-man Coulter. Porovnáváme nejnověj-ší Multisizer 4e (MS4e), pracující na Coulterově principu, a Delsa Max Core (DM Core), který využívá dynamický rozptyl světla (DLS).

Lipozomy jsou tuková tělíska o průměru od 50 nm do 5 µm. Mají širokou škálu využití, např. v textilním a kosmetickém průmyslu, v medicíně a biologii. Jednu z potenciálně vý-znamných aplikací představuje cílený přenos léků v těle. V biologickém výzkumu se dají po-užít jako modelový systém ke studiu vlastností buněčných membrán. Údaje o jejich velikosti a počtu, tedy koncentrace, jsou téměř vždy jedním ze základních parametrů, který je po-třeba znát.

Informace o velikosti objektů v submikronové oblasti lze získat buď měřením jednotlivých částic, nebo jejich souborů. Metody založené na analýze souboru částic jsou např. sedimen-tace, prosévání nebo rozptyl světla (dynamický i statický). Studovat individuální objekty dovo-luje např. elektronová a optická mikroskopie nebo Coulterův princip. Sedimentace a prosé-vání mají malé rozlišení a jsou časově nároč-né. Dynamický rozptyl světla (DLS) poskytuje rychlé informace o velikosti a polydisperzitě částic, ne však o jejich koncentraci. Zobrazo-vací metody ukazují velikost a tvar objektů, ale pouze z omezeného a ne vždy reprezentativní-ho souboru. Coulterův princip podává informa-ce o koncentraci částic nebo buněk a poslouží jako nezávislá verifikace dat z DLS.

Měření

� Delsa Max CoreZkoumané lipozomy byly získány od firmy

Librede. Měření proběhla do tří týdnů od je-jich produkce. Lipozomy byly tvořeny lipidem DPhPC rozptýleném v pufru, jenž byl tvořen 15 0mM NaCl, 5 mM CaCl2 a 10 mM HEPES při pH = 8. Počáteční koncentrace byla 0,8 mg/ml. K měření byl použit přístroj Delsa Max Core

(obr. 1). Lipozomy byly rozředěny v poměru 1:100 v DI vodě. Vzorek o objemu 20 µl byl napipetován do plastikové jednorázové kyvety umístěné do přístroje. Pět měření se skládalo ze tří pětisekundových skenů při teplotě cely 25°C. Ve všech měřeních byl součet čtverců (SOS) menší než 10, což odpovídá čistému vzorku bez kontaminace a bublin. Hodnota polydisperzity a průměru ukazuje na monomo-

dální vzorek. To také potvrzuje regularizační analýza (obr. 2.).

� Multisizer 4ePůvodní vzorek lipozomů s koncentrací

0,8 mg/ml byl použit k měření na Multisi-zeru 4e (obr. 3) s aperturou 10 µm. 5 µl pů-vodního roztoku bylo rozptýleno v 19,995 ml Isotonu II (ředění 1:4000). Použitá apertura

dovoluje analyzovat objekty v rozmezí 0,2 až 6 µm se 400 měřícími kanály. Aperturou pro-šlo celkově 10 µl kapaliny při každém z deseti skenů (obr. 4).

Multisizer 4e má největší dynamický rozsah mezi přístroji využívajícími Coulterův princip (od 200 nm do 1600 mikronů). Měření se pro-vádí v elektrolytu, který je vhodný pro většinu biologických vzorků. Analyzuje celý vzorek, částici po částici, s vysokou citlivostí. Při pou-žití maximálního počtu měřených kanálů (400) lze dosáhnout nejmenšího kroku ve škále veli-kostí až 0,1 nm (!).

Výsledkem popsaných měření je koncent-race 1,513 ± 0,144 * 1010 lipozomů/ml, což v původním vzorku odpovídá koncentraci 6,052 ± 0,574 * 1013 lipozomů/ml. Srovnání s DLS je znázorněno v tabulce 1.

Distribuce velikostí lipozomů změřená pomo-cí Delsa Max Core dává stejnou hodnotu střed-ního průměru jako u MS4e. Relativně větší příspěvek částic větších poloměrů v distribuční funkci je dán tím, že rozptyl světla na nich je silnější než na malých částicích.

Vysoká shoda výsledků dvou různých metod měření velikostí nanočástic ukazuje jedineč-nou možnost měření absolutních koncentrací nanočástic pomocí MS4e. Současně potvrzuje správnost měření na těchto přístrojích.

Srovnání Coulterovaprincipu a dynamickéhorozptylu světla

Přístroj Technologie Průměr Medián Polydisperzita

Delsa Max Core DLS 320,2 ± 19,8 nm 42,0±8,2 nm

MS4e Coulterův princip 343 ± 174 nm 292 nm

MARTIN POLČÍKe-mail: [email protected]

Tabulka 1: Srovnání měření velikosti lipozomů na MS4e a DM Core

Obr. 1: Delsa Max Core

Obr. 2

Obr. 3: Multisizer 4e

Obr. 4

Magnet

MagnetMagnet

www.beckman.cz

Izolace a purifi kace nukleových kyselin

imobilizace nukleové kyseliny

odstranění kontaminací

a promytí

eluce nukleových

kyselin

Agencourt SPRI®


Do vědní disciplíny označované jako kryobi-logie, jejímž předmětem zkoumání je účinek nízkých teplot na biologické systémy, spadá také problematika lyofilizace/kryokonzervace buněk potažmo tkání. Ta vychází z jednodu-chého funkčního vztahu, kdy snižování teploty indukuje v přímé úměrnosti pokles metabolic-kých pochodů v živé hmotě. Při úplné stagnaci jakýchkoliv molekulárních struktur pak do-cílíme dokonalého zakonzervování. Přibližně od roku 1950 studovali tento soubor jevů (nezávisle na sobě) James Ephraim Lovelock a John Christopher Polge. Podařilo se jim zjistit příčinu poškození buněk vlivem nízkých teplot pod bodem mrazu. Uvedené úskalí následně dokázali překonat. Prostřednictvím chemic-kých látek, obecně nazývaných kryoprotek-tiva a, v případě lyofilizace, lyoprotektiva, se podařilo na buněčných modelech poškození vlivem mrazu minimalizovat. Prokázali tak, že je možné kryoprezervovat buňky a součas-ně jim po ukončení stáze zachovat viabilitu. Díky jejich úsilí byla na začátku šedesátých let minulého století kryobiologie vědeckou veřej-ností přijata.

Během kryostáze běžně skladujeme biologic-ký materiál při teplotách alespoň -80°C. Pokud je chladícím médiem kapalný dusík, konečná teplota dosáhne až -196°C. Tekuté hélium se využívá sporadicky.

Poškození buněk mrazemHlavní úskalí zamrazování buněk, eventuálně

tkání o velikosti několika milimetrů, tkví v tom, že intracelulární i extracelulární voda při tep-lotách pod bodem mrazu vytváří mikrokrystaly, které rostou z tzv. nukleačních center a zvět-šují svůj objem. Hexagonální led vznikající za běžného tlaku má navíc tendenci rekrystalizo-vat za vzniku větších útvarů. Protože krystaly narušují integritu fosfolipidových membrán, poškozují buněčné kompartmenty. Vznik mi- krokrystalů vede rovněž ke zvýšené koncentra-ci minerálů, jež při změně skupenského stavu vody z ledu vypadávají do prozatím nezmrzlé kapaliny. Pokud zpracováváme buněčnou suspenzi, potýkáme se zároveň s faktem, že postupně narůstající mikrokrystaly vytlačují buňky do prozatím nezmrzlé kapaliny, kde se nakupí a mohou zfúzovat. Označujeme to ter-mínem cell packing effect.

V případě pomalého zamrazování se zmi-

ňované mikrokrystaly utvářejí přednostně v extracelulárním prostředí s typickým uspo-řádáním, což označujeme jako dendritickou krystalovou deformaci. Od místa chlazení ka-palinou postupně prorůstají podlouhlé relativ-ně velké krystaly, mezi nimiž jsou dendritické kanály. Zde se buňky v průběhu kryoprezervace soustředí. Avšak pod vlivem hyperosmolární kapaliny ztrácejí vodu a svrašťují se, dokud zbylá voda nezmrzne. Proces označujeme ja-ko efekt krystalizace vody (obr. 1). Bohužel opačný postup, kdy zvolíme rychlé navození kryostáze, problém neřeší. Mikrokrystaly v tomto případě vznikají především intracelu-lárně. Sice dosahují menší velikosti, nicméně mají tendenci rekrystalizovat ve větší útvary. Hyperosmolalita pak nastává uvnitř buněk (obr. 2). Výsledkem je efekt roztoku (z anglic- kého termínu solution effect), kdy nastává rozvrat nitrobuněčného pH a paradoxní zrych-lení metabolismu, protože ztráta vody zvyšuje koncentraci látek participujících na bioche-mických reakcích. Následně se zvyšuje influx vody do intracelulárního prostředí do doby, než buňka nebo okolní tekutina kompletně zmrzne. Stres na celulární struktury indukova-ný ledovými krystaly bohužel nedokáže vyřešit ani metoda lyofilizace, která je založena na

principu sublimace. V případě buněk ji může-me uplatnit jen při kryoprezervaci prokaryot. Podstata sublimace vychází z fyzikálněchemic-kých vlastností vody, kdy zmrazení v materiálu indukuje vznik ledových krystalů a následné snížení tlaku navodí sublimaci vody z pevného skupenství na plynné.

Mnohem více se lyofilizace osvědčila pro dlouhodobou konzervaci biologického mate- riálu na úrovni molekul, jež vykazují termolabil-ní charakter. Proto se od roku 1930 začala pou-žívat ve větší míře, aby bylo možné stabilizovat penicilin jakožto beta-laktamové antibioti- kum pro parenterální aplikaci.

KryoprotektivaVýše popsané technologické postupy poma-

lého i rychlého zamrazení (včetně lyofilizace), které vyvolávají vznik ledových krystalů, buňky během kryoprezervace mechanicky poškozují a posléze znemožňují jejich přežití po vrácení teploty do fyziologického normálu. K potlačení tohoto problému používáme tzv. kryoprotek-tiva, ve zkratce CPA (z anglického termínu cryoprotective agent), jež se vyznačují nižším bodem tuhnutí. Poněvadž nahrazují část intra-celulární vody a stávají se také součástí mimo-buněčného prostředí, redukují mikrokrystaly

KRYOBIOLOGIEKryoprezervace a viabilita buněk

Obrázek 1: Efekt krystalizace vody


ký led, nýbrž mráz extrémně zvýší viskozitu, a médium tak zesklovatí. Nevznikají tedy krystaly, které by zvenčí poškozovaly buněčný povrch. Z pohledu buněčného stresu se nejvíce uplatňuje efekt roztoku, protože intracelulárně vzniká velké množství mikrokrystalů, což do-provází nerovnováha v osmolalitě. Proces na přijatelnou úroveň potlačíme, když použijeme vyšší koncentrace penetrujících kryoprotek-tivních látek, než tomu bylo u kontrolovaného mrazení. Pro vitrifikaci jsou vhodné buňky ne-obsahující větší množství vody.

Rekonstituce buněk a měření viabilityPo ukončení kryoprezervace rozmrazujeme

buňky rychle v řádu několika minut. Účelem není pouze obnovení fyziologické teploty, ale také náhrada penetrujícího kryoprotektiva jakožto toxické látky zpět za vodu, a to co nejrychleji. Po vyjmutí z chladícího média se biologický materiál podrobí ohřevu v lázni při 37°C. Jakmile rozmrzne, je zapotřebí buňky přemístit do kultivačního média, eventuelně izotonického roztoku s fosfátovým pufrem a HEPES. Nastane diluce kryoprotektiv i jejich vyplavení z intracelulárního prostředí. Aby buňky nebyly osmoticky poškozeny, měl by ob-jem vyměněného protektiva za vodu probíhat rovnoměrně.

Úspěšnost zamrazení a opětovného rozmra-zení lze ověřit stanovením viability, kdy se určí procentuální zastoupení vitálních buněk vůči odumřelým. K měření můžeme použít ana-lyzátor buněk Vi-Cell® XR. Princip stanovení vychází z vlastnosti cytoplazmatické membrá-ny živých buněk. Narozdíl od mrtvých nepro-pouští do svých kompartmentů barvivo, kterým je v tomto případě trypanová modř. Rozdíly v barvitelnosti snímá kamera v okamžiku, kdy buněčná suspenze prochází plochou průtoko-vou kyvetou. Rozpětí částic vhodných k měření se pohybuje v rozmezí 2 – 70 µm. Software přístroje po digitálním zpracování obrazu ne-vyhodnocuje jen data týkající se viability, ale dovoluje měřit rovněž koncentraci, velikost či distribuci velikosti buněčné populace.

Literatura

1. BROCKBANK, Kelvin, COVAULT, James, TAYLOR,

Michael.

Cryopreservation guide.

USA: Thermo Fisher Scientific Inc., 2007, 24 s.

ISBN -; PF-LECS-CRYOGUIDE-0707.

Dostupné z: www.thermo.com/cold.

2. DAY, John, STACEY, Glyn.

Cryopreservation and freeze-Drying protocols.

2. vyd.

New Jersey: Humana Press Inc., 2007,

347 s. ISBN 978-1-58829-377-0.

3. KRUŽÍK, Pavel, MOOS, Jiří, VLČEK, Roman.

Analyzátory buněk a částic. In vitro diagnostika:

Informační magazín Beckman Coulter.

Praha 10: Beckman Coulter Česká republika,

2006, č. 3, s. 4 – 5.

4. RYAN, John.

General guide for cryogenically storing animal

cell cultures: Technical bulletin.

USA: Corning Inc., 2004, 9 s. Life science. ISBN -;

3/04-TC-306.

Dostupné z: www.corning.com/lifescience.

5. THERMO FISHER SCIENTIFIC INC.

Thermo scientific nalgene and nunc cryopre-

servation guide.

USA: Thermo Fisher Scientific Inc., 2009, 9 s.

ISBN -; BRLSPCRYOPRES-1209.

Dostupné z: www.thermo.com/cold.

BC. JAROSLAV ŠEBEK, DIS.AESKULAB K.S.,NEPOMUCKÁ 159A, 326 00 PLZEŇe-mail: [email protected]

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

0 10

20

30

40

50

teplo

ta (

°C )

Protokol zamrazení suspenze (objemu 1-3 ml)

čas (minuty)

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

0 20 40 60 80 100 120 140 160

čas (minuty)

Protokol zamrazení suspenze (objemu do 1 ml)

teplo

ta (

°C )

vyrůstající z tzv. nukleačních center. Dále brání osmotickému stresu nebo posunu pH. Podle mechanismu účinku rozeznáváme ochranná média penetrující a nepenetrující.

z Kryoprotektiva penetrující, neboli intrace-lulární, pronikají díky své nízké molekulové hmotnosti po koncentračním gradientu do buněk, kde nahrazují vodu. Nejpoužívanější je ethylenglykol a dimethylsulfoxid (DMSO), přičemž velmi účinná bývá jejich kombina-ce v poměru 1:1. Nevýhodou je toxicita, což platí především u dimethylsulfoxidu. Proto volíme takový postup práce, aby expozice buněk nebyla zbytečně zdlouhavá.

z Kryoprotektiva nepenetrující zůstávají v extracelulárním prostředí, což korespon-duje s faktem, že jsou minimálně cytotoxic- ká. Mají vyšší molekulovou hmotnost. Sacharidový základ jim propůjčuje osmo-tickou aktivitu, která napomáhá vytahovat vodu z buněk. Příkladem nepenetrujících

protektiv mohou být sacharóza, trechalóza, dextran. Nejúčinnější však je hydroxyethy-lový škrob.

Četné studie poukazují na prospěšnost kom-binovaných médií obsahujících jak penetrují-cí, tak nepenetrující složku. Intracelulárním kryoprotektivům sice připisujeme zásadní význam, nicméně mohou poškozovat buňky. Proto ke snížení jejich negativního dopa-du používáme například hydroxyethylenový škrob. Augmentační působení nepenetrujících látek tak napomáhá snižovat toxicitu ethy-lenglykolu nebo dimethylsulfoxidu. Tabulka uvádí optimální složení ochranného média, teplotu uskladnění podle typu a koncentrace zamrazeného materiálu. K dalším doplňkům kryomédií náleží purifikované bílkoviny ve smyslu albuminu, eventuelně oligopeptidů a pufrovací látky. Často se kombinuje fosfáto-vý pufr s tzv. HEPES, který má chemický název N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N-(2-ethansul-

fyziologická buňka

biologicky aktivní látky(ionty, enzymy, organely)

akumulace biologickyaktivních látek

ledovékrystaly

Typ organismu Koncentrace Kryoprotektivum (%) Teplota (°C)

živočišné buňky 106 – 107/ml DMSO nebo glycerol 5 – 10nepenetrující médium 1-5 -150

buněčné hybridomy 107/ml DMSO 5 – 10 sérum 20 -150

kmenové buňky 105 – 106/ml DMSO 5 – 10sérum 20 – 90 -150

bakterie 107/ml glycerol 10 -60

buňky infikované viry 105/ml DMSO 7sérum 10 -150

nukleové kyseliny není potřeba upravovat není potřeba kryoprotektivum -80

fonová kyselina). Chemicky se jedná o orga-nickou molekulu. Vhodně zvolené kryomédium společně s postupem chlazení nám zvyšuje úspěšnost zamrazování. Můžeme dosáhnout viability buněk, jež činní 80 – 90 % z původní buněčné populace. Uvedené číslo životaschop-ných buněk je nejvíce ovlivněno teplotním přechodem z -20°C na -40°C, což pokládáme za nejkritičtější fázi úvodu do kryostáze.

Metody kryoprezervaceBěhem kontrolovaného mrazení, jež poklá-

dáme za nejšetrnější postup, teplota klesá po-zvolna přibližně v řádu jednoho stupně celsia za minutu. Celková doba úvodu do kryostáze by ve většině případů měla trvat 80 – 100 mi-nut. Buňky nejvíce poškozuje efekt krystalizace vody, kdy led v médiu zvenčí narušuje buněčné struktury. Následný vzestup osmolality z nich poté nadměrně vytahuje vodu do extracelu-lárního prostředí. Proto nepenetrující protek-tiva sehrávají důležitější roli než u rychlého mrazení. Navíc se zde výrazněji uplatňuje cell packing effect. Existuje mnoho osvědčených protokolů řízeného zamrazování zvolených dle typu buněk, přičemž se vzájemně liší ča-sovou náročností i rychlostí poklesu teploty. Ovšem je nutné použít speciální programova-telné mrazicí boxy s aktivní regulací, jejichž chladicí kapalinou bývá kapalný dusík. Dva grafy ukazují průběh korespondující s množ- stvím zamrazovaného materiálu.

Pro rychlé mrazení častěji používáme termín vitrifikace. Při ní buněčnou suspenzi přibliž-ně o chladničkové teplotě vystavíme účinku tekutého dusíku. V případě použití kapalného dusíku jako chladicího média teplota zprud-ka poklesne až na -196°C. Kryomédium při těchto fyzikálních podmínkách podléhá právě vitrifikaci, kdy se nevytváří klasický krystalic-

Obrázek 2: Efekt roztoku

Tabulka: Příklady zamrazovaných materiálů

Test byl proveden pomocí částic pro kontrolu koncentrace (1 x 106/ml) pracovníky č. 1 a 2 třikrát za stejných provozních podmínek na obou zařízeních. Pro každého pracovníka byl vypočítán průměr ze tří počtů a jejich směrodatná odchylka SD pro obě zařízení, čímž byla získána hodnota CV% v rámci jednoho pracovníka. Pro získání hodnoty CV% mezi pracovníky byl vypočítán průměrný počet částic spočítaných dvěma pracovníky a jeho směrodatná odchylka (Prac. 1 – Prac. 2). Počet částic získaných na analyzátoru Vi-Cell byl srovnatelný s počtem částic z Bürkerovy počítací komůrky. Variační koeficient (CV) je definován jako poměr směrodatné odchylky k průměru. Prac. = pracovník, CV = variační koeficient, SD = směrodatná odchylka.


a pomocí Bürkerovy komůrky nebyl žádný vý-znamný rozdíl. Automatický analyzátor počtu buněk Vi-Cell byl potvrzen jakožto správná a vhodná metoda počítání dendritických buněk.

VÝSLEDKY

Hodnocení správnosti měření u analy-zátoru Vi-Cell

Správnost automatické počítací metody u analyzátoru Vi-Cell byla určena pomocí výpočtu variačního koeficientu CV% v rámci jednoho pracovníka a mezi pracovníky (ana-lyzátor Vi-Cell oproti Bürkerově komůrce). Správnost analyzátoru Vi-Cell byla testována za použití kontrolní suspenze částic o známé koncentraci (1 x 106/ml). Koncentraci částic stanovili dva pracovníci třikrát za stejných provozních podmínek. Pro hodnocení správ-nosti stanovení počtu byly výsledky získané na automatickém analyzátoru Vi-Cell porovnány s výsledky získanými pomocí Bürkerovy ko-můrky. Variační koeficient mezi jednotlivými stanoveními počtu, ale ani mezi pracovníky, nepřekročil u žádné z použitých počítacích metod 5 %. Konečná koncentrace kontrolních částic stanovená manuální a automatic-kou počítací metodou byla srovnatelná a ve

správném rozmezí 0,9 x 106/ml – 1,1 x 106/ml (1 x 106/ml ± 10 %), jak požaduje příručka pro kontrolu koncentrace (obrázek č. 1).

Hodnocení přesného stanovení průměru a cirkularity pro optimální nastavení analyzátoru Vi-Cell pro analýzu vakcíny DCVAC

Vakcína DCVAC/PCa obsahuje několik bu-něčných populací, ale především dendritické buňky a lymfocyty. Protože zobrazovací sys-tém analyzátoru Vi-Cell analyzuje různé typy buněk na základě jejich velikosti a cirkularity, byly tyto parametry stanoveny u dendritických buněk a lymfocytů, aby bylo možné nastavit analyzátor Vi-Cell na správné rozpoznávání dendritických buněk a vyloučení lymfocytů. Ke stanovení obou parametrů byl použit mikro-skop NIKON Eclipse při 20násobném zvětšení (stejném jako u mikroskopu Vi-Cell) a zobra-zovací software NIS Elements BR.

Cirkularita buněk byla analyzována u 5 šar-ží vakcíny DCVAC/PCa (2 kontrolních a 3 od subjektů klinické studie), přičemž u každé bylo měřeno 20 dendritických buněk a 10 lymfocy-tů a pro každou z nich byla vypočítána prů-měrná hodnota (obrázek 2A). Byla porovnána cirkularita u každého typu buněk. Mezi den-

dritickými buňkami a lymfocyty nebyly zjištěny významné rozdíly (P = 0,6560; párový t-test). Tyto typy buněk tudíž není možné rozlišovat na základě jejich cirkularity.

Průměr buněk byl analyzován u 19 šar-ží vakcíny DCVAC/PCa (6 kontrolních šarží a 13 šarží od subjektů klinické studie), přičemž u každé bylo měřeno 20 dendritických buněk a 10 lymfocytů (obrázek 2B). Průměry obou buněčných populací byly porovnány s cílem stanovit rozmezí velikosti, které by umožnilo odlišit dendritické buňky od lymfocytů tak, aby při počítání na analyzátoru Vi-Cell bylo možné lymfocyty vyloučit. Bylo zjištěno, že charakte-ristické rozmezí velikosti činí u dendritických buněk 11 – 30 µm a u lymfocytů 5 – 12,5 µm, což vede k částečnému překryvu u dolní meze pro populaci dendritických buněk. Nicméně procentuální velikost tohoto překryvu není vysoká (4 %).

Validace počítání buněk za použití au-tomatického analyzátoru Vi-Cell

Protože rozlišení obou populací na základě velikosti buněk nebylo úplně jednoznačné, byly jakožto možné parametry pro nastavení analyzátoru Vi-Cell na počítání dendritic-kých buněk testovány 2 velikostní parametry:

Obrázek 2: Stanovení cirkularity a průměru buněk u vakcíny DCVAC/PCa

SOUHRN

Populace dendritických buněk (DB) je klí-čovou funkční složkou konečného produktu vakcíny DCVAC/PCa. Správný počet dendri-tických buněk a jejich dostatečná životnost jsou jedním z kritérií kontroly jakosti při uvolňování konečného produktu. Počet funkč-ních dendritických buněk se v současné době určuje pod mikroskopem metodou manuálního počítání za využití Bürkerovy komůrky a bar-vení trypanovou modří pro vyloučení mrtvých buněk. Analyzátor Vi-Cell je automatizovaný hemocytometr, který využívá vylučovací pro-tokol barvení trypanovou modří. Poskytuje údaje o koncentraci buněk a jejich viabilitě. Analyzátor Vi-Cell byl v této studii vyhodno-cen jako metoda vhodná pro kontrolu jakosti z hlediska počtu a životnosti dendritických buněk.

Test správnosti analyzátoru Vi-Cell pro po-čítání buněk byl proveden pomocí kontrolních částic o známé koncentraci, a to třikrát za stejných provozních podmínek. Ve vakcíně DCVAC/PCa byly pomocí mikroskopu NIKON Eclipse stanoveny průměr a cirkularita den-dritických buněk a lymfocytů, aby bylo možné analyzátor správně nastavit na rozpoznávání dendritických buněk a vyloučení lymfocytů. Bylo stanoveno rozmezí velikosti pro dendri-tické buňky tak, aby byly vyloučeny lymfocyty a analyzovány celkové počty dendritických buněk, počty funkčních dendritických buněk a viabilita dendritických buněk. Tyto údaje byly porovnány s počty získanými pomocí Bürkerovy komůrky. Mezi počtem dendritic-kých buněk získaných na analyzátoru Vi-Cell

VALIDAČNÍ STUDIE

Počítání dendritických buněk pomocí automa- tického buněčného analyzátoru Vi-Cell

ANALYZÁTOR Vi-CELL Počet částic [x106] CV% v rámci jednoho pracovníka

Průměr prac. 1 1,03 1,68


Průměr prac. 1-2 1,02 2,89

SD prac. 1-2 0,005

CV% mezi prac. 1-2 0,46

BURKER Počet částic [x106] CV% v rámci jednoho pracovníka



Průměr prac. 1-2 1,01 3,78

SD prac. 1-2 0,028

CV% mezi prac. 1-2 2,81

Obrázek 1: Test správnosti

Lymphocytes

DCA B

Test byl proveden pomocí částic pro kontrolu koncentrace (1 x 106/ml) pracovníky č. 1 a 2 třikrát za stejných provozních podmínek na obou zařízeních. Pro každého pracov-níka byl vypočítán průměr ze tří počtů a jejich směrodatná odchylka SD pro obě zařízení, čímž byla získána hodnota CV% v rámci jednoho pracovníka. Pro získání hodnoty CV% mezi pracovníky byl vypočítán průměrný počet částic spočítaných dvěma pracovníky a jeho smě-rodatná odchylka (Prac. 1 – Prac. 2). Počet částic získaných na analyzátoru Vi-Cell byl srov-natelný s počtem částic z Bürkerovy počítací komůrky. Variační koeficient (CV) je definován jako poměr směrodatné odchylky k průměru. Prac. = pracovník, CV = variační koeficient, SD = směrodatná odchylka.

Ke stanovení obou parametrů byl použit mikroskop NIKON Eclipse při 20násobném zvětšení a zobrazovací software NIS Elements BR. A) Cirkularita byla stanovena u 5 šarží vakcíny DCVAC/PCa, u nichž bylo měřeno 20 dendritických buněk (šedé body) a 10 lymfocytů (černé čtverečky); pro každou šarži byl vypočítán průměr. B) Byl stanoven průměr dendritických buněk a lymfocytů a na základě těchto údajů bylo pro analyzátor Vi-Cell určeno kritérium velikosti dendritických buněk: 11,5 – 30 µm a 12 – 30 µm. P = subjekt klinické studie DCVAC/PCa, KON = kontrolní DCVAC/PCa, DC = dendritické buňky, LEU = lymfocyty.


11,5 – 30 µm a 12 – 30 µm. Pro oba určené velikostní parametry byly na analyzáto-ru Vi-Cell a paralelně s počítáním pomocí Bürkerovy komůrky stanoveny celkové počty dendritických buněk, počty funkčních dendri-tických buněk a viabilita dendritických buněk u 20 šarží vakcíny DCVAC/PCa (5 kontrolních a 15 od subjektů klinické studie). Hodnoty získané na analyzátoru Vi-Cell byly porovnány s hodnotami z Bürkerovy počítací komůrky za použití párového t-testu (hladina významnosti

α = 0,05), aby bylo zjištěno, který velikost-ní parametr je vhodnější pro rozpoznávání dendritických buněk na analyzátoru Vi-Cell, tj. ten, který neposkytuje významné rozdíly oproti počítání pomocí Bürkerovy komůrky. Ukázalo se, že mezi počty dendritických buněk (celkem a funkčních) na analyzátoru Vi-Cell a v Bürkerově komůrce neexistuje významný rozdíl (obrázek 3). Pro nastavení analyzátoru Vi-Cell na rozpoznávání dendritických buněk byly vhodné oba navržené velikostní parame-

try, nicméně při rozmezí 11,5 – 30 µm se ana-lyzátor lišil oproti Bürkerově počítací komůrce méně významně než při rozmezí 12 – 30 µm (obrázek 3A, 3B). Navíc při vynesení rozdílu mezi párem měření (hodnota analyzátoru Vi-Cell - hodnota z Bürkerovy komůrky) oproti jejich průměru (hodnota analyzátoru Vi-Cell + hodnota z Bürkerovy komůrky/2) byly rozdíly v případě rozmezí 11,5 – 30 µm menší a více soustředěné kolem nuly než u roz-mezí 12 – 30 µm. To potvrzuje, že rozmezí 11,5 – 30 µm je jako velikostní parametr pro analyzátor Vi-Cell pro počítání dendritických buněk vhodnější (obrázek 4). Hodnoty viability dendritických buněk (%) stanovené analyzá-torem Vi-Cell se významně lišily od hodnot získaných pomocí Bürkerovy počítací komůrky (obrázek 3C). To s největší pravděpodobností souvisí se skutečností, že každou z metod byl analyzován jiný počet buněk. Systém Vi-Cell spočítal na každé stanovení počtu přibližně 1000 buněk, zatímco v Bürkerově komůrce to bylo přibližně 100 buněk, což naznačuje, že automatická metoda je při stanovení procen-tuálního podílu přesnější.

ZÁVĚRY

Automatický analyzátor počtu buněk Vi-Cell byl potvrzen jakožto metoda, která je správná a vhodná pro počítání dendritických buněk a která je srovnatelná s aktuálně používanou metodou kontroly jakosti pomocí Bürkerovy komůrky. Mezi hodnotami počtu dendritických buněk získanými na analyzátoru Vi-Cell a pro-střednictvím Bürkerovy komůrky nebyl žádný významný rozdíl. Dále se ukázalo, že jako nastavovaný parametr velikosti dendritických buněk u analyzátoru Vi-Cell je vhodné veli-kostní rozmezí 11,5 – 30 µm.

DODATKY

Referenční příručka k analyzátoru životnosti buněk Vi-CELL XR

IVETA BOTTOVÁ, PH.D.

SOTIO, A.S., JANKOVCOVA 1518/2, 170 00 PRAHA 7

e-mail: [email protected]

Obrázek 4: Diagram v osách XY

Obrázek 3: Počet a viabilita dendritických buněk

A

B

C

Alikvoty vakcíny DCVAC/PCa z 20 šarží byly rozmrazeny podle standardního operačního postupu SOP 11-KON. Poté byly změřeny počty a viabilita buněk paralelně pomocí Bürkerovy komůrky (SOP 16-KON) a analyzátoru Vi-Cell. Jako možné parametry nastavení analyzátoru Vi-Cell na rozpozná-vání dendritických buněk byla testována 2 rozmezí velikosti: 11,5 – 30 µm a 12 – 30 µm. Pomocí analyzátoru Vi-Cell i prostřednictvím Bürkerovy počítací komůrky byly získány celkové počty dendritických buněk v každém alikvotu (A), počty životných dendritických buněk v každém alikvotu (B) a viabilita dendritických buněk v každém alikvotu (C) vakcíny DCVAC/PCa. Získané hodnoty byly porovnány v párovém t-testu s hladinou význam-nosti α = 0,05.P = subjekt klinické studie DCVAC/PCa, k = kontrolní DCVAC/PCa, DC = dendritické buňky.

Pro oba parametry velikostního rozmezí 11,5 – 30 µm a 12 – 30 µm byl vynesen rozdíl mezi párovými měřeními (hodnota analyzátoru Vi-Cell - hodnota z Bürkerovy komůrky) oproti jejich průměru (hodnota analyzátoru Vi-Cell + hodnota z Bürkerovy komůrky/2). Byla analyzována úro-veň rozdílu a jeho poloha vzhledem k nule. V případě rozmezí 11,5 – 30 µm byly rozdíly menší a více soustředěné kolem nuly.


Dnešní hematologické laboratoře čelí stále intenzivnějšímu tlaku na zvýšení produktivity, zkrácení doby zpracování vzorku a snížení cel-kových nákladů na svůj provoz. Systémy řady UniCel DxH jsou určeny především k vyřešení těchto problémů a k transformaci vašeho pra-coviště na moderní, spolehlivou a hospodárnou analytickou jednotku. Analyzátory Beckman Coulter DxH vynikají kvalitou výsledků, robust-ní a odolnou konstrukcí, spolehlivou výkon-ností a mají revoluční a flexibilní modulární koncepci. Podle požadavků na provoz, výkon-nost (tj. rozložení vzorků v čase) a nároků na zálohování a speciální testy (Body Fluid, trom-bokoncentráty ze separátoru apod.) je možné nakonfigurovat hematologickou linku přesně pro konkrétní laboratoř. Nejběžnější dostupné konfigurace jsou znázorněny na připojených obrázcích.

Automatická hematologická linka Beck-man Coulter DxH2401 představuje kompletní řešení rutinního i statimového hematologické-ho provozu, včetně automaticky připravených a obarvených panoptických nátěrů pro manu-ální diferencování.

Volitelnou součástí hematologické linky může být i 5barevný průtokový cytometr pro automatickou analýzu vysoce patologických diferenciálů pomocí standardizovaných mono-klonálních protilátek. Tato patentovaná tech-nologie CytoDiff® nabízí zcela nový pohled na automatizovaný diferenciál leukocytů. Identi-fikuje celkem 16 dalších buněčných subpopu-lací leukocytů, včetně počtů T4/8, B, NK lymfo-cytů, typizace blastů aj.

Základní charakteristiku systémů řady Unicel DxH lze shrnout do následujících bodů: � Technologie Coulter, zlatý standard hema-

tologických analyzátorů, dodá správný vý-sledek hned napoprvé.

� Modulární řazení jednotlivých funkčních bloků do linky podle potřeb a kapacity labo-ratoře. Linku je možné kdykoliv dále rozšířit a doplnit.

� Samostatně stojící bloky, včetně podstavců – zásobníků na reagencie.

� Tři identické analyzátory DxH800 spojené v lince nabízí v provozní špičce max. pro-pustnost více než 300 krevních obrazů/hod.

� Analyzátory se navzájem automaticky inte-ligentně zálohují, to znamená, že při poruše (opravě, technologické odstávce, měření statimových nebo speciálních vzorků apod.) linka rozdělí práci mezi zbývající funkční analyzátory.

� Patentovaný magnetický posun kazet se vzorky vylučuje jakékoliv problémy s po-hyblivými díly – zablokování, zranění ob-sluhy atd.

� Oboustranná komunikace s LIS s pří-mým řízením módu měření KO, KO + Diff, KO + Diff + Reti. Linka automaticky rozdě-luje práci mezi analyzátory podle zatížení a optimalizuje ji pro nejkratší možný TAT.

� Flow Cytometric Digital Morphology sys-tém pro diferencování zpracovává 10 x více informací o buněčných subpopulacích než dosud užívaný VCS systém.

� Jednocestný aspirační systém pro zjedno-dušení kalibrace.

� Automatický kazetový podavač s kontinuál-ním a šetrným (non-stres) mícháním vzorků otáčením dnem vzhůru podle SLP pro libo-volné typy uzavřených náběrovek s mož-ností jejich libovolné kombinace v jedné kazetě.

� Vestavěná čtečka čárového kódu v podavači. � Ruční čtečka čárových kódů pro manuální

a statimové vzorky. � Pětipopulační diferenciál (včetně frakce ne-

zralých granulocytů % i #) měřený několika navzájem nezávislými fyzikálními metoda-mi technologií MultiAngle VCS.

� Pětipopulační diferenciál (včetně frakce ne-zralých granulocytů % i #) měřený na na-tivních leukocytech bez barvení nebo jejich selektivní lýzy technologií VCS.

� Pětipopulační diferenciál (včetně frakce ne-zralých granulocytů % i #) s popisem a tří-děním blastů, nezralých granulocytů atd.

� Software s možností vzdálené servisní sprá-vy ProService.

� Přímé měření počtu retikulocytů. � Přímé a ekonomicky výhodné měření počtu

normoblastů bez nutnosti použití dalších reagencií.

� Měření tělních tekutin, výpotků aj. � Automatická korekce WBC o interferují-

cí buňky (NRBC, agreg. PLT, RBC fragment apod.).

� Volba módu měření oboustrannou komuni-kací s LIS. Vypínání diferenciálu s úsporou reagencií.

� Kompletní monitorování reagencií. � Přímé načítání reagencií a kontrolních ma-

teriálů 2D čárovým kódem. � Jednotný systém kontroly kvality pro všech-

ny analyzátory – linka se chová jako jeden přístroj pro LIS, QC i kalibraci.

� Intelligent Quality Monitoring (IQM) pro automatické sledování QC v reálném čase během rutinního provozu.

� Speciální statimový vstup pro statim vzorky, speciální vzorky (Body Fluid – tělní tekuti-ny, laváže, kostní dřeň atd.) a pediatrické vzorky.

� Software s možností vzdálené obsluhy. � 2-D digitální barcody pro bezpečný přenos

většího počtu informací. � Jednoduchá výměna reagencií bez nutnosti

přerušení provozu. � Automatické opakování vzorku podle uživa-

telsky definovatelných kritérií. � Možnost současného založení až 60 kazet,

tj. 300 vzorků. � Nepřetržitá činnost 24 hod denně bez pře-

stávek na čištění. Jednotlivé analyzátory se podle okamžitého provozního zatížení linky automaticky střídají v ShutDown.

� Linearita/měřicí rozsah: - WBC 0,00 – 400 000/800 000

- RBC 0,00 – 8,5 mil

- HGB 0,00 – 25,5 g/dL

- PLT 0,00 – 3/5 mil

- NRBC 0,00 – 600/100 WBC

- Retic 0,00 – 30 000 %

Nedílnou součástí hematologické linky Uni-Cel DxH je nátěrový a barvicí automat Beck-man Coulter DxH SMS. Tento automat v sobě sdružuje dva navzájem nezávislé funkční bloky – nátěrovou jednotku a barvicí jednotku. Zho-tovení nátěru (nátěrů) je řízeno inteligentním software linky na základě uživatelsky defino-vatelných kritérií (typ patologie, počet mono-cytů, počet trombocytů, agregáty PLT, blasty, posun doleva, diagnóza, oddělení apod.). Jako kritérium pro nátěr je tedy možné použít na-prosto libovolná data vzorku, počínaje nejrůz-nějšími patologiemi, abnormalitami a suspekt-ními hláškami, až po například oddělení nebo jméno lékaře. Jednotlivá kritéria mohou mít rovněž různou prioritu. Můžeme tak jednoduše požadovat nátěr u všech pacientů hematolo-gické ambulance, nebo také třeba jen u těch pacientů, jejichž diferenciál se za poslední mě-síc změnil nebo nebyl delší dobu vyšetřen.

Další součástí linky může být také digitální mikroskopická stanice HemaCam nebo Cella-Vision pro automatizovanou digitalizaci a vy-hodnocování obarvených panoptických nátěrů.

Základní charakteristiku Beckman Coulter DxH SMS lze shrnout do následujících bodů: � Automatický nátěr na standardní sklíčka. � Příprava nátěru standardní metodou roz-

těru hranou sklíčka (wedge-pull) v souladu s WHO CLSI H20.

� Nastavení akcelerace, rychlosti a úhlu roz-tíracího sklíčka v závislosti na viskozitě a přilnavosti vzorku. Pro zhotovení nátěru nejsou potřebné výsledky měření krevního obrazu. Viskozita a přilnavost vzorku je mě-řena přímo v nátěrové jednotce při aspiraci krve pro nátěr – patentované Hemasphere Technology.

� Možnost použití libovolně uživatelsky na-stavitelných barvicích protokolů.

� Automatické obarvení nátěrů standardními postupy a barvivy (Giemsa/Grunwald).

� Možnost barvení manuálně připravených nátěrů, kostních dření aj.

� Možnost uživatelského naprogramování více druhů barvení (Wright apod.).

� Aspirace pouze 90 µL. � Možnost zhotovení až 4 nátěrů z jedné aspi-

race vzorku. � Možnost zhotovení až 12 nátěrů z jednoho

vzorku (3 aspirace). � Aspirace vzorku z uzavřených náběrovek

v kazetách a ručně z libovolných (i otevře-ných a atypických) náběrovek.

� Samostatný modul kompatibilní také se stávajícím vybavením každé laboratoře.

� Uživatelsky nastavitelné parametry nátěru (tvar, délka, tloušťka apod.).

� Potisk každého sklíčka identifikačním štít-

Automatická hematologická linka Beckman Coulter UniCel DxH

kem s čarovým kódem a uživatelsky nasta-vitelným popisem.

� Režimy provozu: nátěr a barvení, jenom ná-těr, jenom barvení.

� Režim statimových vzorků (automatické předřazení vzorků pro nátěr a okamžité barvení).

� Režim statimového barvení. � Rychlost 140 nátěrů/hod. � Oboustranná komunikace s LIS. � Grafické ovládání a kontrola systému –

zobrazení stavu jednotlivých vzorků v reál-ném čase.

Automatická hematologická linka Beckman Coulter UniCel DxH v jakékoliv konfiguraci je tou správnou volbou pro každou laboratoř, která hledá jistotu kvalitních výsledků, jedno-duchou bezpečnou obsluhu a výhodnou eko-nomiku provozu. Tradice nás zavazuje, vždyť Coultery vám věrně slouží již téměř 60 let.

PETR BOUDALe-mail: [email protected]


V poslední době se stále mluví o nedo-statku vitaminu D

napříč celou populací. Jed-ním z hlavních důvodů je obava před slunečním zá-řením jako jednou z příčin

rakoviny kůže (o její nejagresivnější formě, maligním melanomu, si v této souvislosti můžete přečíst v jednom z následujících článků).

V letošním roce proto naše společnost přichází na trh se soupravou na stanovení Vitaminu D. Ačkoliv se toto stanovení již nějakou dobu objevuje v nabídce řady konkurenčních firem, souprava Beckman Coulter má několik zajíma-vých a unikátních vlastností:

� v literatuře doporučovaná standardizace na NIST-Ghent ID-LSMS/MS Reference Method Procedure (RMP)

� ekvimolární stanovení 25(OH) vitami-nu D2 a 25(OH) vitaminu D3

� unikátní tmavý reagenční pack chránící protilátky před světlem

� široký dynamický rozsah 2,00 – 210 ng/mL (5,0 – 525 nmol/L)

Pro další informace se, prosím, obraťte na níže uvedené kontakty.

ÚvodVitaminu D je v posledních pěti letech vě-

nována mimořádná pozornost. Nepochybně vysoká frekvence nedostatku vitaminu D v běžné populaci a jeho stále stoupající vý-znam v prevenci celé řady civilizačních one-mocnění je výzvou pro laboratorní pracovníky, aby se touto problematikou aktivně zabývali. V následujícím článku jsme si položili otázku, zda má pozornost věnovaná vitaminu D raci-onální podklad, a pokud ano, tak kdy máme v rutinní praxi stanovení vitaminu D provádět. Laboratoře by se měly rovněž snažit aktivně spolupracovat s klinickými pracovišti při epi-demiologickém monitorování, především pak při monitoraci pro volbu optimální suplemen-tace vitaminem D.

Charakteristika vitaminu DVitamin D je chemickou strukturou sekoste-

roid a funkcí hormon. Člověk si tvoří vitamin D přeměnou 7-dehydrocholesterolu (7-DHC) v kůži, na kterou působí sluneční záření. Množství touto cestou vzniklého vitaminu D3 (kalciferolu) závisí na řadě proměnných. Jsou to jednak parametry charakterizující efekt slunečního záření: zeměpisná šířka a s tím úzce související úhel dopadu slunečního záře-

ní, roční období, denní doba a délka expozice slunečnímu záření. Dále jsou to parametry charakterizující vnímavost lidského individua ke slunečnímu záření: obsah 7-DHC v kůži, pigmentace kůže, věk, chránění pokožky před vlivem slunečního záření (opalovací krémy, krytí povrchu těla oblečením).

Druhým nejčastějším zdrojem vitaminu D u člověka je potrava. V tomto případě se však jedná o vitamin D2 (ergosterol), který je pouze rostlinného původu, včetně vitaminu D obsaženého v rybách. U ryb jde sice o určitou produkci vitaminu v jejich kůži, avšak většina vitaminu D se dostává do rybího těla z fyto-planktonu. Metabolizmus vitaminu D2 a D3 je v organizmu obdobný, proto, hovoříme-li o "vitaminu D" bez bližší specifikace, myslíme většinou obě formy.

Obě podoby vitaminu D nejsou biologicky aktivní. Aktivní forma vzniká hydroxylací v po-loze 25 v játrech (25-OH-vitamin D). Následně se v ledvinách a celé řadě dalších cílových tkání vytváří působením alfa hydroxylázy 1,25-dihydroxyvitamin D (kalcitriol), který je nositelem biologické funkce vitaminu D.

V krvi je transportován vitamin D svým va-zebným proteinem (vitamin D binding protein, DBP), malá část pak albuminem a lipoproteiny.

DBP je tvořen v játrech a je příbuzný albuminu a alfa-fetoproteinu. Biologický poločas vita-minu D je 2,5 – 3 dny. Jeho denní produkce činí okolo 10 mg/kg. Jednotlivé metabolity vitaminu D se výrazně liší svojí afinitou k DBP. Místem účinku biologicky aktivní formy vita-minu D (kalcitriolu) je jádro, kde se kalcitriol váže na specifický jaderný receptor (vitamin D receptor, VDR).

Stanovování vitaminu DNejvětší výpovědní hodnotu o zásobování or-

ganizmu má 25-OH-vitamin D. Výhodou je, že zohledňuje jak endogenní vitamin D vytvořený v kůži, tak i jeho exogenní formu získanou po-travou. Poprvé byl stanoven 25-OH-vitamin D v 70. letech minulého století. Na konci 70. let se objevily první metody založené na chroma-tografických postupech. V roce 1985 byla vy-vinuta první radioimunoanalytická (RIA) meto-da zahrnující specifickou protilátku. Jako první byla uznána FDA pro klinickou diagnostiku nutriční deficience vitaminu D. Postupně byly vyvíjeny metody s detekční koncovkou enzy-movou (EIA) nebo chemiluminiscenční (CLIA). Pokroky v tandemové hmotnostní spektromet-rii umožnily v roce 2004 zavedení rutinní me-todiky stanovení založené na principu kapa-linové chromatografie s detekcí tandemovou

Vitamin D – novinka v portfoliu

Význam stanovení vitaminu D v rutinní praxi

hmotnostní spektrometrií LC-MS/MS. Velkou výhodou stanovení 25-OH-vitaminu D je jeho vysoká stabilita v séru a plazmě. Po dobu dvou dnů může být krev skladována při teplotě 24oC a ani při opakovaném zamražení a rozmražení séra nedochází k degradaci vitaminu D. Při skladování při teplotě -20oC nedochází ke zne-hodnocení materiálu ani po 10 letech.

Základním a velice palčivým problémem je srovnatelnost výsledků mezi jednotlivými metodami. Tento fakt snad může být překonán pomocí již existujícího referenčního materiálu s označením SRM 972 od amerického National Institute of Standards and Technology (NIST). Výsledky stanovení 25-OH-vitaminu D jsou v soustavě SI uváděny v nmol/L. V literatuře se setkáváme rovněž s hmotnostními jednot-kami µg/L nebo ng/mL. Převodní koeficient pro 25-OH-vitamin D je nmol/L x 0,40 = µg/L; nebo naopak výsledek v µg/L x 2,5 = nmol/L.

Epidemiologická dataDvě skutečnosti měly velký vliv na rozvoj po-

znání a především na pochopení mimořádného významu vitaminu D pro organizmus. Jednak to bylo zavedení nových metod a tím prová-dění rozsáhlých populačních studií a dále pak skutečnost, že vitamin D souvisí se vznikem více než 500 genů. Svým účinkem přes jaderný receptor, který se nachází ve většině tkání těla, tak má nesporně významné systémové účinky.

V minulosti platila rovnice: nedostatek vita-minu D = křivice. Jestli chceme zabránit jejímu vzniku, musíme vitamin D podávat v koje-neckém a dětském věku, tedy v době, kdy se vyvíjí kosterní soustava. O úloze vitaminu D v dospělosti se uvažovalo minimálně. Mnohem později se pak začala hledat souvislost mezi vitaminem D a poruchami kostního metabo-lizmu. Souběžně probíhaly studie, jež hledaly souvislost mezi slunečním zářením a epidemi-ologií civilizačních chorob, především nádo-

rových a kardiovaskulárních. V tomto směru jsou známy především práce dvou významných amerických autorů Granta a Garlanda, kteří např. srovnávali výskyt nádorových onemoc-nění u aljašských a mexických indiánů. Byl prokázán vztah vitaminu D ke kardiovaskulár-ním chorobám, neurologickým onemocněním a především k nádorům. Této problematice je věnována samostatná část článku.

Koncem loňského roku byla publikována velmi zajímavá epidemiologická data ze Švýcarska. Pozoruhodná jsou zejména proto, že výchozí parametry studované populace by se mohly velmi přibližovat populaci naší. Z in-formací zmiňovaných v úvodu totiž vyplývá, že status 25-OH-vitaminu D mezi jedinci výrazně ovlivňuje zeměpisná šířka, míra slunečního svitu, etnické složení populace, BMI, stravova-cí návyky, zastoupení mořských ryb v jídelníč-ku, pigmentace kůže, znečištění ovzduší apod. Cílem této studie bylo posoudit status zásobe-ní vitaminem D u 1 309 osob dospělého oby-vatelstva Švýcarska a porovnat ho s výsledky získanými v předchozích sledováních z let 1988 – 1989 a 2005 – 2006. Současně autoři vyhodnotili subjekty podle jednotlivých oblastí (německy, francouzsky a italsky mluvící), roč-ního období, pohlaví, BMI, stravovacích ná-vyků, suplementace, pohybové aktivity, počtu hodin slunečního svitu, kouření a dalších pa-rametrů. Účinnost slunečního záření je v naší zeměpisné šířce adekvátní pouze asi od května do září. Z výsledků vyplývá, že průměrné ad-justované hladiny činí v průběhu roku u do-spělé populace Švýcarska 57,7 nmol/L. Rozdíl mezi hladinami v letních a zimních měsících byl 72,4 ku 42,9 nmo/L. Současně je alarmující frekvence insuficience a deficitu v průběhu jednotlivých období roku. Statisticky význam-ně nižší hladiny 25-OH-vitaminu D se vyskytly ve skupině s vyšším BMI, u pacientů bez suple-mentace, bez hormonální antikoncepce a bez

pravidelné pohybové aktivity. V porovnání s výsledky z minulých sledování se průměrné hladiny nelišily.

Významnou konfrontací názorů na problém „vitamin D“ byla také konference s názvem Witamina D – Minimum, maximum, opti-mum, která se konala na konci roku 2012 ve Varšavě. Zástupci jednotlivých evropských zemí zde prezentovali epidemiologická data o nedostatku vitaminu D v Evropě. Hlavním závěrem sjezdu byla výzva k zajištění dosta-tečných podkladů pro návrh plošného rozšíření a optimalizaci suplementace vitaminu D v celé populaci, která bude nepochybně vyžadovat monitoraci hladin vitaminu D v krvi.

Vitamin D jako rizikový faktor nádoro-vých onemocnění

Vitamin D má řadu fyziologických vlivů, které se mohou uplatnit při nádorovém procesu. Je to především jeho účinek proti angiogenezi, podpora buněčné apoptózy a podpora klasic-ké regulované diferenciace buněk. Není proto překvapením, že se při populačních studiích srovnávajících skupiny nemocných s nádo-rovým onemocněním se skupinou zdravé populace nacházejí rozdíly. Tyto odlišnosti se týkají především vysoké incidence snížené hladiny vitaminu D v krvi, což bylo prokázá-no prakticky u většiny nádorů. Prvním typem, u něhož byla doložena výrazná souvislost, byl kolorektální karcinom a dále pak karcinom prsu. Nejčastěji se vyskytující nízká hladina vi-taminu D byla prokázána u nádoru plic. Vztahu mezi hladinou vitaminu D a vznikem a progresí tumoru je věnována více než patnáctiletá po-zornost. Existují důkazy o tom, že substituce vitaminem D snižuje riziko výskytu nádorového onemocnění. Studie jsou však zatím většinou krátkodobé a uskutečněné na malých soubo-rech pacientů. Rovněž se výrazně liší v množ-ství podávaného vitaminu D. Většina autorů

PN Název

B24838 Access 25(OH) Vitamin D Total for Access 2, 2x50 tests Access 2

B24839 Access 25(OH) Vitamin D Total for Access 2 calibrators Access 2

A98856 Access 25(OH) Vitamin D Total for DxI, 2x50 tests DxI

A98857 Access 25(OH) Vitamin D Total for DxI, 2x50 tests calibrators DxI

TEREZA TIETZEe-mail: [email protected]

IVANA MIČÍKOVÁe-mail: [email protected]

Podklady pro objednání:


Maligní melanom je zhoubný ná-dor vycházející z melanocytů. Postihuje nejčastěji kůži, ale

může se objevit i na sliznicích či v oku. Je charakterizován schopností časné-ho metastazování krevní nebo lymfa-tickou cestou. Vzniká na zdravé kůži (de novo) či v preexistujícím pigmento-vém projevu.

EpidemiologieIncidence tohoto onemocnění celosvětově

výrazně roste. Někteří autoři dokonce hovo-ří o epidemii maligního melanomu. Postihuje stále mladší jedince. Průměrný věk v době sta-novení diagnózy činí 56 let. V České repub-lice je hlášeno zhruba 14 nových případů na 100 000 obyvatel ročně.

EtiologieNa vzniku maligního melanomu se podílí celá

řada faktorů. Jedná se o genetickou dispozi-ci, fototyp jedince či působení zevních fakto-rů. Zatím nebyl objeven žádný specifický gen. Rizikovou skupinou jsou jedinci s fototypem 1 a 2. Jediným prokázaným rizikovým činite-lem zevního prostředí je působení UV záření a to hlavně intermitentní působení slunečního záření, zejména spálení kůže v dětství a dospí-vání.

Typy maligního melanomuMelanom roste ve dvou fázích – horizontální

a vertikální. Rozlišujeme 4 základní typy ma-ligního melanomu:

1. Superficiálně se šířící maligní melanom – představuje 70 % všech melanomů

2. Nodulární melanom

3. Lentigo maligna melanom

4. Akrolentiginózní melanom – vyskytuje se na ploskách, dlaních či pod nehty

DiagnózaZákladem stanovení diagnózy maligního

melanomu je anamnestické a klinické vyšet-ření. Primárním pravidlem je pomůcka ABCDE: A (asymmetry; přítomnost asymetrie), B (bor-der; nepravidelné okraje), C (color; nehomo-genní barva), D (diameter; průměr > 5 mm), E (evolving; vývoj). Suspektní léze je vyšetřena dermatoskopicky. Definitivní diagnóza je sta-novena až na základě histologického vyšetření.Prognóza

Závisí na stádiu nemoci. Čím dříve se na one-mocnění přijde, tím lepší je prognóza. Vyjadřu-je se většinou % nemocných, kteří přežijí 5 let od stanovení primárního nádoru. Pro stádium 1 je to 99 %, naproti tomu u stádia 4 jde o pouhých 10 %. Existuje celá řada prognos-tických faktorů. Nejčastěji se používají násle-dující: tloušťka nádoru dle Breslowa udávaná

v milimetrech, postižení sentinelové lymfatické uzliny, ulcerace, regrese, mitotický index, tu-mor infiltrující lymfocyty.

LéčbaChirurgická léčba představuje základní lé-

čebnou modalitu. Časná diagnóza a časné chi-rurgické odstranění nádoru jsou jedinou mož-nou kurativní metodou. Optimální chirurgické okraje souvisí s tloušťkou tumoru. Pohybují se od 0,5 do 2 cm. Součástí chirurgické léčby je většinou také odstranění sentinelové lymfatic-ké uzliny a její histologické vyšetření. Na jeho výsledku závisí volby adjuvantní terapie. Při pozitivitě sentinelové lymfatické uzliny se do-plňuje disekce spádové lymfatické oblasti. Dal-šími léčebnými možnostmi jsou radioterapie, chemoterapie či imunoterapie. Maligní mela-nom je považován za nádor radiorezistentní. Tato modalita je volena jako paliativní léčba, převážně u kostních metastáz. Chemoterapie také představuje spíše paliativní adjuvantní léčbu u metastazujícího melanomu. Imuno-terapie (interferon alfa) je v současnosti nej-využívanější adjuvantní léčbou příznivě ovliv-ňující délku bezpříznakového období, zatím však podle dosavadních studií bez významného ovlivnění celkového přežití nemocných. Nové

se shoduje na tom, že dávka vitaminu D by se měla pohybovat mezi 1500 – 5000 IU denně.

Často diskutovanou otázkou je vitamin D a melanom. Tato diskuze je pochopitelná. Na jedné straně radíme chránit se před slunečním zářením, na straně druhé doporučujeme pre-ventivně zvyšovat hladinu vitaminu D v těle, jehož nejpřirozenějším zdrojem je právě slu-neční záření. I zde je jako vždy nutné nalézt optimální střední cestu. Jediným karcinomem, kde se frekvence incidence mění v závislosti na hladinách vitaminu D, jsou nádory prostaty – obdobně jako u jiných typů karcinomů zvyšuje nízká hladina vitaminu D výrazně frekvenci nádorového onemocnění, avšak hodnoty nad 120 nmoL/L opět paradoxně, stejně jako u níz-kých hladin, zvyšují výskyt karcinomu. Často se hovoří o tzv. „U efektu“. Pravděpodobně to souvisí se specifickou situací, kdy jsou v nádo-rové tkáni přítomny VDR receptory. Současně se také ukazuje, že deficit vitaminu D může negativně ovlivňovat efekt účinnosti chemote-rapie, např. u nádorů plic. Bylo prokázáno, že úpravou nízké hladiny vitaminu D došlo k ná-růstu efektu chemoterapie až na trojnásobek.

Současný stav saturace vitaminem D v České republice

V České republice existuje pouze omezený počet prací, které by ukazovaly populační hod-noty. Přesto je z tohoto omezeného počtu pu-blikací zřejmé, že frekvence nízkých sérových hladin je v obyvatelstvu značně vysoká, a to mezi 40 – 60 % populace. Otázku adekvátní suplementace je však potřeba diskutovat nejen teoreticky, ale hlavně na podkladě detailní plošné saturace vitaminem D. Zde je jak pro laboratorní, tak klinické pracovníky otevřené široké pole působnosti.

Referenční hodnoty a interpretace výsledků

V rutinní praxi je důležité vybrat vhodné referenční rozmezí. Obvykle se určuje naměře-ním hodnot ve zdravé populaci a vypočtením 95% intervalu u gaussovského rozložení. Je ale jasné, že tuto metodiku u analytu, jakým je vitamin D, nelze vůbec použít. Jeho hladiny kolísají v závislosti na ročním období. Již ve studiích, kde byla kromě běžné populace změ-řena také hladina vitaminu D u zaměstnanců pobřežní hlídky (hladiny 2,5krát vyšší), se ukázalo, že dnešní „zdraví“ jedinci trpí ve sku-tečnosti nedostatkem vitaminu D, a není proto vhodné ji považovat paušálně za referenční. Vlivem našeho životního stylu jsou celkově v populaci hladiny vitaminu D neadekvátní fyziologickým požadavkům cílových tkání. Na

základě stále probíhajících studií je nedostatek vitaminu D potvrzován jako rizikový faktor pro mnohá onemocnění. Je tedy nutné stanovovat optimální hladiny vitaminu D spíše na základě těchto dat, nežli prostřednictvím populačních studií. Podobně je tomu např. u hladiny cho-lesterolu, která je rovněž určena arbitrárně na základě důkazů o nejoptimálnější hladině. Vztah hladin vitaminu D k poškození organi-zmu či k chorobným stavům uvádí tabulka 1.

Vhodnost suplementaceObecně mezi uznávané rizikové skupiny, jež

je potřeba monitorovat a přednostně suple-mentovat, patří: novorozenci, děti, těhotné ženy, staré osoby, obézní osoby, osoby v dlou-hodobé ústavní péči, osoby pracující v nočních směnách. Co se týče nemocných, v minulosti to byli především pacienti s osteoporózou a mal-absorbčním syndromem, v současné době se doporučuje suplementace vitaminem D u au-toimunitních onemocnění, při opakovaných zánětlivých onemocněních a u diabetu. Další skupinu představují nemocní s kardiovaskulár-ními a neurologickými poruchami. Vitamin D je dnes v USA také doporučován jako součást adjuvantní, ale i ostatní onkologické léčby.

Literatura1. Chiellini G., DeLuca H.F. The importance of ste-

reochemistry on the actions of vitamin D. Curr Top Med Chem. 2011;11(7):840-59.

2. Webb A.R., Kline L., Holick M.F. Influence of season and latitude on the cutaneous syn-thesis of vitamin D3: Exposure to winter sunlight in boston and edmonton will not promote vitamin D3 synthesis in human skin. J Clin Endocrinol Metab. 1988 Aug;67(2):373-8.

3. Armas L.A., Dowell S., Akhter M., Duthuluru S., Huerter C, Hollis B.W. et al. Ultraviolet-B ra-diation increases serum 25-hydroxyvitamin D levels: The effect of UVB dose and skin color. J Am Acad Dermatol. 2007 Oct;57(4):588-93.

4. Chen T.C., Chimeh F., Lu Z., Mathieu J., Person K.S., Zhang A. et al. Factors that influen-ce the cutaneous synthesis and dietary sources of vitamin D. Arch Biochem Biophys. 2007 Apr 15;460(2):213-7.

5. Webb A.R., DeCosta B.R., Holick M.F.. Sunlight regulates the cutaneous production of vita-min D3 by causing its photodegradation. J Clin Endocrinol Metab. 1989 May;68(5):882-7.

6. Bikle D.D. Vitamin D: An ancient hormone. Exp Dermatol. 2011 Jan;20(1):7-13.

7. Christakos S., Ajibade D.V., Dhawan P.,

Fechner A.J., Mady L.J. Vitamin D: Metabolism. Rheum Dis Clin North Am. 2012 Feb;38(1):1,11, vii.

8. Spustova V., Dzurik R. Vitamin D: Synthesis, metabolism, regulation, and an assessment of its deficiency in patients with chronic renal disease. Vnitr Lek. 2004 Jul;50(7):537-43.

9. Kawakami M., Blum C.B., Ramakrishnan R., Dell R.B., Goodman D.S. Turnover of the plasma binding protein for vitamin D and its metaboli-tes in normal human subjects. J Clin Endocrinol Metab. 1981 Dec;53(6):1110-6.

10. Adams J.S., Hewison M. Update in vitamin D. J Clin Endocrinol Metab. 2010 Feb;95(2):471-8.

11. Wallace A.M., Gibson S., de la Hunty A., Lamberg-Allardt C., Ashwell M. Measurement of 25-hydroxyvitamin D in the clinical la-boratory: Current procedures, performance characteristics and limitations. Steroids. 2010 Jul;75(7):477-88.

12. Lissner D., Mason R.S., Posen S. Stability of vi-tamin D metabolites in human blood serum and plasma. Clin Chem. 1981 May;27(5):773-4.

13. Cianferotti L., Marcocci C. Subclinical vitamin D deficiency. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2012 Aug;26(4):523-37.

14. Taylor A.V., Wise P.H. Vitamin D replace-ment in asians with diabetes may incre-ase insulin resistance. Postgrad Med J. 1998 Jun;74(872):365-6.

15. Avenell A., Cook J.A., MacLennan G.S., McPherson G.C., RECORD trial group. Vitamin D supplementation and type 2 diabetes: A substu-dy of a randomised placebo-controlled trial in older people (RECORD trial, ISRCTN 51647438). Age Ageing. 2009 Sep;38(5):606-9.

16. Guessous I., Dudler V., Glatz N., Theler J.M., Zoller O., Paccaud F. et al. Vitamin D levels and associated factors: A popu-lation-based study in switzerland. Swiss Med Wkly. 2012 Nov 26;142:0.

PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC.e-mail: [email protected]

MUDR. RADKA FUCHSOVÁe-mail: [email protected]

PHARMDR. RADEK KUČERA, PH.D.e-mail: [email protected]

CENTRÁLNÍ RADIOIZOTOPOVÁ LABORATOŘ, FN PLZEŇ A LF V PLZNI, UNIVERZITA KARLOVA V PRAZEDR. E. BENEŠE 13, 305 99 PLZEŇ

Status VD nmol/L ng/mL Riziko rozvoje křivice Svalová funkce Účinek na Ca-P

metabolismusÚčinek v peri-ferních tkáních

Riziko vzniku nádorů

těžký deficit pod 25 pod 10 ++ + + +++ +++

deficience 25 – 50 10 – 20 + + +- ++ ++

insuficience 50 – 75 20 – 30 - - - + ++

dostatek 75 – 250 30 – 100 - - - -

optimální hladina 100 40 - - - -

toxicita nad 400 nad 160 - - + +

Maligní melanom

možnosti představuje tzv. biologická léčba ovlivňující přímo pomocí protilátek metabo-lické buněčné dráhy: ipilimumab (anti-CTLA-4 protilátka) a vemurafenib (inhibitor B-raf kiná-zy). Oba preparáty dosáhly velmi povzbudivých výsledků v rámci klinických studií.

Všichni pacienti podléhají posléze dispenzár-ní péči v dermatologických ambulancích.

ZávěrMaligní melanom je nejzhoubnějším kožním

nádorem. Pokročilý maligní melanom stále patří k diagnózám s velmi vážnou prognózou a omezenými léčebnými možnostmi. Základem je včasná diagnóza, včasné chirurgické odstra-nění nádoru a dispenzace nemocného.

MUDR. INKA TŘEŠKOVÁ, PH.D.ODDĚLENÍ PLASTICKÉ CHIRURGIE, FN PLZEŇALEJ SVOBODY 60, 304 60 PLZEŇ e-mail: [email protected]

Spoluautor: Prof. MUDr. Ondřej Topol-čan, CSc., Laboratoř imunochemické dia-gnostiky, FN Plzeň

Tabulka 1: Hodnocení hladin vitaminu D


Karcinom plic patří celosvětově mezi nejvíce rozšířený typ rakovi-ny. Dle WHO statistik zabije více

lidí než rakovina střev, prsu a prostaty dohromady. V roce 2008 bylo globálně diagnostikováno 1,61 miliónů nových případů tohoto onemocnění. Místy nejvyššího výskytu je Evropa spolu se Severní Amerikou, naopak nejmenší obavy z této nemoci může mít popula-ce Afriky1 (viz obrázek č. 1).

Mezi 27 zeměmi Evropské unie byla nale-zena nejvyšší incidence u mužů v Maďarsku (115 případů na 100 000 obyvatel), v případě žen pak v Dánsku (51 případů na 100 000 oby-vatel). Naopak nejnižší výskyt u mužů najdeme ve Švédsku (27 případů na 100 000 obyvatel) a u žen na Kypru (7 případů na 100 000 oby-vatel). Bohužel rakovina plic je také onemoc-nění s vysokou mortalitou. Je odhadováno, že celosvětově je odpovědná za téměř 1/5 (18 %) všech úmrtí na rakovinu. V roce 2008 to bylo celkem 1,38 mil. úmrtí. Díky poměrně pozdní diagnostice je pětileté přežití na nízké úrov-ni. Pouze 7,8 % mužů a 9,3 % žen přežije pět a více let od diagnózy onemocnění. S lehkou nadsázkou se dá říci, že pravděpodobnost, zda onemocníme touto chorobou, máme z velké části ve vlastních rukou. Náš životní styl je tím hlavním určujícím faktorem. Nejrizikovějším činitelem je samozřejmě kouření. Dle statistik je 85 % karcinomů plic nalezeno právě u kuřá-ků. Bohužel i pasivní kouření není zanedbatel-né. Dalšími rizikovými faktory jsou přítomnost radonu, azbestu a celkové znečištění ovzduší. Samozřejmě rovněž genetické předpoklady zde hrají určitou roli.

Nádory plic lze rozdělit na dvě velké skupiny:

1. nemalobuněčný (NSCLC; non-small cell lung cancer)

2. malobuněčný (SCLC; small cell lung cancer)

Zhruba 80 – 85 % nádorů patří do skupi-ny NSCLC. Ty lze histologicky rozdělit na tři skupiny: karcinom squamózních buněk (SCC, squamous cell carcinoma), adenokarcinom a velkobuněčný typ karcinomu. SCLC tvoří tedy zbývajících 15 – 20 %. Oba hlavní typy NSCLC a SCLC se od sebe významně liší klinic-ky i histologicky. V důsledku toho tedy existují jiné přístupy k jejich léčbě. SCLC nádory ros-tou mnohem rychleji než NSCLC a téměř vždy propuknou v důsledku kouření. Hlavním způso-bem léčení SCLC je chemoterapie, která může být eventuálně kombinována s ozařováním. U NSCLC, zejména ve stádiích I a II, předsta-vuje hlavní volbu operační zákrok, jemuž může předcházet chemoterapie. Dalšími možnostmi jsou chemoterapie samostatně, nebo po zákro-ku, a ozařování. Včasná a dobrá diferenciální diagnostika je tedy velmi důležitá pro určení léčebného postupu. V případě karcinomu plic se pro primární a diferenciální diagnostiku po-užívají zejména zobrazovací techniky a histo-logická vyšetření.

Sledování hladiny tumorových markerů je pak využíváno k následné monitoraci zdravotního stavu pacientů, zejména k hodnocení účinku léčby a časné detekci relapsu onemocnění. Mezi nejčastěji používané markery patří cyto-keratin 19 fragment, CEA, TPA, SCC v případě NSCLC a NSE a ProGRP pro SCLC. Další možnou

volbou pro sledování osob s NSCLC je parame-tr MonoTotal od švédské firmy IDL. Souprava MonoTotal je založena na kvantitativním sta-novení fragmentů cytokeratinů 8, 18 a 19. Je vyráběna ve formátu IRMA a nyní nově i ve formátu ELISA.

Cytokeratiny jsou proteiny tvořící intermedi-ální filamenta, jež jsou hlavní součástí cytos-keletu buněk. Zodpovídají se za mechanickou pevnost buněk a hrají rovněž velmi důležitou roli v jejich dělení, pohybu a signalizaci. Cyto-keratiny se nacházejí zejména v epiteliálních buňkách. Je jich známo více než 20 druhů a je-jich molekulová hmotnost se pohybuje mezi 40 – 70 kDa. Dle izoelektrického bodu jsou klasifikovány do dvou hlavních skupin: na ky-selé (typ I) cytokeratiny 9 – 20 a na bazické (typ II) cytokeratiny 1 – 8. Exprese jednotlivých cytokeratinů je závislá na typu, stupni diferen-ciace a rychlosti růstu dané tkáně. Pro jedno-duchý typ epitelu jsou charakteristické cyto-keratiny 8, 18 a 19. Ty jsou také nejvíce hojné v případě malignit. Protože jsou cytokeratiny za fyziologických podmínek nerozpustné v séru a tkáňových tekutinách, stanovujeme jejich fragmenty, které jsou solubilní ve vodném pro-středí. Poločas rozpadu uvedených fragmentů je 10 – 24 hodin. Cytokeratiny jsou tedy dů-ležitým markerem v případě karcinomu epite-lárních buněk. Protože rychle reagují na změ-ny rychlosti růstu tumorů, mohou poskytnout časnou prognostickou informaci. Na základě jejich hladin lze hodnotit odpověď organizmu na zvolený typ terapie a mohou přispět k včas-né detekci progrese onemocnění. Nicméně, podobně jako další markery, nejsou orgánově specifické.

Souprava MonoTotal může být tedy dobrým pomocníkem při sledování pacientů s NSCLC. Hlavní charakteristiky a benefity parametru MonoTotal jsou shnuty níže:

� stanovuje hladinu cytokeratinů 8, 18 a 19 v séru

� je indikátorem aktivity tumorových buněk

� je dostupný v IRMA a ELISA formátu

� u NSCLC má velmi dobrou diagnostickou sensitivitu, která se pohybuje v závislosti na histologickém typu mezi 70 – 75 % (při 95% specificitě)

� může poskytnout informaci o úspěšnosti léčby

� během follow up může včas odhalit relaps onemocnění

Nyní ještě několik údajů ze studie2, do níž bylo zařazeno 93 nově diagnostikovaných pacientů

s NSCLC, kteří následně podstoupili radikální operační zákrok. Sérové koncentrace MonoTo-talu u těchto osob byly srovnány s 20 pacienty s benigním onemocněním plic. Předoperační hodnoty MonoTotalu byly významně vyšší u je-dinců s NSCLC než u srovnávací skupiny. Po provedení operace byli pacienti dále sledová-ní. Mediány koncentrací MonoTotalu byly opět jasně vyšší u těch s onemocněním v progresi (medián 141,8 U/L, rozsah 39,4 – 2632 U/L) nežli u pacientů v remisi (medián 63,7 U/L, rozsah 15 – 383,3 U/L).

Závěrem lze tedy konstatovat, že souprava MonoTotal je dobrým sérovým markerem, který může být ve spojení s dalšími klinickými a di-agnostickými nástroji použit pro monitorování pacientů s NCLC.

Naše společnost je dodavatelem RIA a ELISA

souprav vyráběných švédskou firmou IDL Bi-otech AB. Veškeré její produkty, jež na trzích v České republice a na Slovensku nabízíme, na-leznete v tabulce č. 1.

Literatura:

1. http://www.cancerresearchuk.org/cancer-info

2. Prazakova M., et al. The role of MonoTotal in the primary diagnosis, prognosis and follow- up of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Anticancer rwes.2011;31:3170-3112

HANA KRÁTKÁ

e-mail: [email protected]

Lung Cancer (C33-C34): 2008 Estim ates W orld Age-Standardised Incidence Rates per 100,000 Population, W orld Regions

W orld Region M ale Fem aleNorthern Am erica 48.5 35.8Central and Eastern Europe 56.5 9.7Eastern Asia 45.0 19.9W estern Europe 44.8 16.9Northern Europe 37.0 23.0Southern Europe 48.9 10.5Australia/New Zealand 32.4 19.9W orld 33.9 13.6South-Eastern Asia 29.6 11.9Caribbean 25.7 12.1Southern Africa 29.0 8.0W estern Asia 30.7 5.3South Am erica 20.4 8.4Central Am erica 12.8 5.5Northern Africa 14.9 2.2South-Central Asia 13.1 3.4Eastern Africa 4.1 1.4W estern Africa 3.1 1.2M iddle Africa 2.8 0.9

Please include the citation provided in our Frequently Asked Questions when reproducing this chart: http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/faqs/#How Prepared by Cancer Research UKOriginal data sources:Ferlay J, Shin HR, Bray F, Form an D, M athers C, Parkin DM GLOBOCAN 2008 v1.2, Cancer Incidence and M ortality W orldwide: IARC CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer, 2010. Available from : http://globocan.iarc.fr. Accessed M ay 2011.

Nádory plic a stanovení MonoTotal® IRMA/ELISA

Lung Cancer (C33-C34): 2008 Estimates World Age-Standardised Incidence Rates per 100,000 Population, World Regions

World Region Male FemaleNorthern America 48.5 35.8Central and Eastern Europe 56.5 9.7Eastern Asia 45.0 19.9Western Europe 44.8 16.9Northern Europe 37.0 23.0Southern Europe 48.9 10.5Australia/New Zealand 32.4 19.9World 33.9 13.6South-Eastern Asia 29.6 11.9Caribbean 25.7 12.1Southern Africa 29.0 8.0Western Asia 30.7 5.3South America 20.4 8.4Central America 12.8 5.5Northern Africa 14.9 2.2South-Central Asia 13.1 3.4Eastern Africa 4.1 1.4Western Africa 3.1 1.2Middle Africa 2.8 0.9

Please include the citation provided in our Frequently Asked Questions when reproducing this chart: http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/faqs/#How Prepared by Cancer Research UKOriginal data sources:Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM GLOBOCAN 2008 v1.2, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer, 2010. Available from: http://globocan.iarc.fr. Accessed May 2011.

Kat. číslo Název kitu Charakteristika Aplikace

10-31110-212

TPS® IRMATPS® ELISA

cytokeratin 18 fragment karcinomy prsu, prostaty, vaječníků,

gastrointestinální trakt

10-02810-027

MonoTotal® IRMAMonoTotal® ELISA

cytokeratin 8, 18, 19 fragment nemalobuněčný karcinom plic

10-02110-023

TPAcyk™ IRMATPAcyk™ ELISA

cytokeratin 8, 18 fragment epiteliální karcinomy obecně

10-02210-03010-038

UBC® IRMAUBC® ELISA

UBC® Rapid (point of care test)

cytokeratin 8, 18 fragment, stanovení v moči

karcinom močového měchýře

Obrázek č. 1: Celosvětová incidence rakoviny plic, odhady 20081

Tabulka č. 1: Produkty firmy IDL Biotech AB


V České republice patří syfilis mezi nemoci, které podléhají povinnému hlášení do Registru pohlavních nemocí. Ze zdravotnické statistiky, vydávanou Ústavem zdravotnických informací, a statistiky ČR vyplývá, že za rok 2012 bylo evi-dováno 696 případů tohoto onemocnění. Potě-šujícím faktem je, že výskyt má mírně klesající charakter. Oproti roku 2010 došlo k 32% pokle-su po přepočtu na obyvatele. Náhodný záchyt nemoci představoval 62 % z celkového počtu, avšak u žen přesáhl podíl náhodně zjištěných případů 81 % oproti 52 % u mužů.(1) Jinými slovy to znamená, že asi 431 případů by zů-stalo neodhaleno, kdyby neexistoval program cíleného vyhledávání. Indikace k vyšetření na syfilis tedy nestojí pouze na klinickém pode-zření, ale je i součástí obligátních vyšetřova-cích schémat (zákon č. 258/00 Sb., vyhláška č. 195/05 Sb.) u dárců krve, v rámci prenatální péče, u základního screeningu novorozenců, při předoperační přípravě a během hospitali-zace. (2)

Rychlou diagnostickou metodu in-vitro pro detekci protilátek proti bakterii Treponema pallidum (TP) v séru a plazmě nyní mají ve svém portfoliu i analyzátory řady AU, konkrét-ně AU680/AU480/AU5800. Ze starších typů je souprava nabízena pouze pro AU2700. Sou-prava vznikla ve spolupráci s firmou Sentinel Diagnostics, Beckman Coulter figuruje jako distributor.

Souprava Syphilis TP Latex patří mezi nepří-mé diagnostické metody, do kategorie trepo-nemových screeningových testů. Metoda je založena na principu aglutinace polystyren--latexových částic nesoucích specifické anti-geny Treponema pallidum (Nicholsův kmen). Spouštěcím podnětem aglutinace je navázání protilátky proti TP z pacientského vzorku.

Jako vzorek může být použito sérum nebo heparizovaná plazma (případně EDTA). Roz-hodovací kritérium pro pozitivní vzorek je ≥ 10 U. Souprava vykazuje velmi dobré para-metry související se stabilitou reagencie na palubě a stabilitou kalibrace. Citlivost a spe-cificita jsou rovněž výborné. Klíčové vlastnosti soupravy jsou přehledně shrnuty v přiložených tabulkách.

Literatura1. Pohlavní nemoci 2012. ÚZIS. Praha: Ústav zdra-

votnických informací a statistiky ČR, 2013. 1210-8634.

2. Woznicová, Vladana. Laboratorní diagnostika syfilis. Mikrobiologie online. [Online] 2007. http://www.medmicro.info/portal/syfilis/lvl3/pr01.html.

Vedenie FNsP F. D. Roosevelta v Ban-skej Bystrici v minulom roku oslovilo hlavných dodávatelov IVD s požiadav-kou na vypracovanie návrhu riešenia integrácie a konsolidácie centrálneho laboratórneho komplexu (ďalej CLK). Toto zadanie bolo pre nás výzvou a zároveň možnosťou stať sa súčasťou zmien a podiel ať sa na optimalizácii laboratórnych procesov.

Návrh mal primárne riešiť zvýšenie efektivity daného komplexu, zníženie personálnych ná-kladov, zníženie nákladov na reagencie, zvýše-nie výkonu, skrátenie celkového TAT pre jed-notlivé oddelenia, zjednodušenie toku vzorky a konsolidáciu, zvýšenie kvality a perspektívu pre ďalší rozvoj.

Pre komplexné posúdenie návrhu bolo po-trebné vypracovať požiadavky objednávatela:

� výkon a priepustnosť navrhovaných systé-mov

� parametre údržby – časová náročnosť� nároky na obsluhu v počte personálu� spotreba vody� priestorové a energetické požiadavky (plo-

cha, klimatizácia, energetická náročnosť atd.)

� typy odberového materiálu (rozmery pre skúmavky apod.)

� potenciál navrhovaného riešenia� referencie pracovísk s inštalovanou techno-

lógiou

Navrhnuté riešenieKoncept nášho riešenia umožnil inováciu

a reštrukturalizáciu bez nutnosti rozsiahlych úprav súčasnej prevádzky. Navrhnuté východis-ko logicky nadväzuje na vybudovaný koncept pracoviska využívajúci na príjme biologického materiálu predanalytickú linku AutoMate a na-inštalovanú technológiu (analyzátory rady AU,

DxI, prietoková cytometria, nefelometria, Data-Management systém, s napojením na LIS), trie-denie do stojančekov pre analyzátory, automa-tickú alikvotáciu, archiváciu vzoriek a údajov.

Konkrétne riešenie sme zamerali na výmenu AU2700 za AU5811 (zvýšenie kapacity) a dopl-nenie o inštaláciu 2 nových prístrojov DxH800 pre hematológiu a 2 nových analyzátorov ACL TOP pre hemokoaguláciu. Pripojenie všetkých analyzátorov našej spoločnosti do LISu sme realizovali prostredníctvom 3 staníc Remiso-lu 2000 Advance. Zabezpečili sme nastavenie validačných kritérií cez Remisol 2000 Advance a napojenie na dialkovú servisnú správu PRo-Service.

Charakteristika navrhnutej technológieLinka Automate je multiodborovo schopná

pokryť požiadavky všetkých odborov a typov materiálu. Systém je riadený SW Sorting Dri-ve napojeným na Remisol Advance. Poskytuje objednávky testov z LISu do triediacich prí-kazov presne podla zadania laboratórnych požiadaviek. Vďaka inteligentnému spracova-niu skúmaviek sa zvýšila kvalita a výkonnosť laboratória pri plnej kontrole všetkých proce-sov (možnosť až 6 nezávislých konfigurácií). Nová technológia umožní zameranie labora-tórneho personálu skôr na náročnejšie úlohy ako na rutinné spracovanie. Maximálne zvýši dosledovatelnosť vzoriek pomocou jednodu-chého zberu a exportu dát. Prehladné grafické zobrazenie komplexných štatistických dát pos- kytne detailné informácie o pracovnom vyťa-žení linky a požiadavkách na vzorky.

Predanalytická linka AutoMate je schopná vo viacerých kolách triediť, alikvotovať a archivo-vať skúmavky. Konfigurácia systému je volne editovatelná užívatelom. Umožňuje vkladať a triediť skúmavky priamo do konkrétnych sto-jančekov pre všetky typy analyzátorov na trhu, vrátane centrifugačných stojanov. Existujúca možnosť rozšírenia o modul pipetovania na mikrotitračné platničky je v tomto štádiu kon-solidácie na uvedenom pracovisku nevyužitá. Do procesu predanalytiky ostáva ešte zarade-nie pracoviska hemokoagulácie.

Rozšiřujeme menu testů řady AU – souprava TP Latex pro screening syfilis

VRATISLAV NOVÁKe-mail: [email protected]

Projekt riešenia a realizácie technologického vybavenia klinických laboratórií Fakultnej nemocnice s poliklinikou F. D. Roosevelta, Banská Bystrica

Inštalované analyzátory rady AU5800 a DxI800 sú momentálne najvýkonnejšie prí-stroje na trhu. Kapacita metód (on-board) umožňuje u obidvoch z nich pokryť maximum vyšetrení s dostatočnou kapacitou a poskytnúť včasnú odozvu v rutinnej prevádzke či režime STATIM. Analyzátor AU5811 je možné rozší-riť o ďalšie fotometrické moduly s výkonom 2000 fotometrických testov bez stavebných či iných úprav.

Zmenou pre personál bola inštalácia 2 hema-tologických prístrojov UniCel DxH 800 Coulter, systémov pre bunkovú analýzu. Tie dokonale splňajú požiadavky súčasnej “LEAN” labora-tórnej praxe. Poskytujú výsledky s maximálnou efektivitou, ktorá sa dosahuje za menšieho úsi-lia, menšieho množstva vložených prostriedkov a za kratší čas. Výsledok tak predstavuje pre laboratórium bezkonkurenčnú hodnotu.

Ďalšou významnou a najväčšou zmenou bola inštalácia hemostazeologických systémov ACL TOP 500 a 700 CTS od firmy Instrumentation Laboratory, ktorá predstavuje nový štandard pre analytickú výkonnosť a jednoduchosť pre-vádzky. V plnej miere splňa požiadavky nároč-ných hemostazeologických laboratórií vyžadu-júcich komplexné automatizované testovanie. Oba systémy ACL TOP 500 i 700 CTS ponúkajú vysokú produktivitu, pracujú výkonnejšie a po-hotovejšie. Časovo náročné výkony, ako sú údržba a QC, sú optimalizované.

Analyzátory Beckman Coulter, predanalytická linka AutoMate a analyzátory iných výrobcov sú/môžu byť napojené na systém REMISOL ADVANCE, ktorý komunikuje s LIS.

Významnou událosťou v prevádzke CLK bola zmena LIS na pracovisku biochémie a zároveň zjednotenie s LIS pracoviska hematológie. Na túto zmenu sa museli všetky zúčastnené strany dôkladne pripraviť. Výsledkom úsilia je funkč-nosť prevádzky CLK a kompatibilita s NIS.

Organizácia prevádzky CLKPríjem materiálu je zaistený potrubnou poš-

tou a donáškovou službou. Centrálny príjem je priestorovo delený aj tokom dát vzoriek rutin-

Vlastnosti soupravy

Typ metody Imunoturbidimetrie

Typ vzorku Sérum nebo plasma (Li-Heparin nebo EDTA)

Analytické rozmezí 4 – 80 U

Rozhodovací kritérium ≥ 10 U

LOD (Limit of Detection) 1,2 U

LOQ (Limit of Quantitation) 4,2 U

Prozone (Hookův efekt) > 7 500 U

Sensitivita 100%

Specificita 99,7%

Výjimečná efektivita

Barkódem označená ready-to-use reagencie

50denní stabilita reagencie na palubě

50denní stabilita kalibrace

Výsledek do 15 minut od vložení reagencie

Objednací informace

Syphilis TP Latex (1 x 200 testů) A53709

Syphilis TP Calibrator Set: 3 hladiny (2 x 3 x 1 ml) A53710

Syphilis TP Control Set: 2 hladiny (3 x 2 x 1 ml) A53711


ných vyšetrení od vyšetrení špecializovaných.Rutinné vyšetrenia sa vykonávajú v priesto-

roch centrálneho laboratória a v laboratóriách označených ako špeciálky, moče, RIA. Vačšina analýz týchto vyšetrení prebieha na 2 bioche-mických, 3 imunochemických, 2 hematologic-kých a 2 koagulačných analyzátoroch. Ostatné na glukometroch, analyzátoroch AB rovnováhy a ďalšom prístrojovom vybavení laboratória.

Špecializované vyšetrenia sú v priestoroch susediacich priamo s príjmom – v laboratóriách cytometria, cytochémia a mikroskopia, špeciál-na hemokoagulácia.

Na príjme sú vytriedené vzorky vyžadujúce centrifugáciu a vzorky plnej krvi pre priamy vklad do stojančekov pre prietokovú cyto-metriu, hematológiu (rutinné či špeciálne vyšetrenia). Stojančeky sú prenesené priamo

k analyzátorom. Vlastné triedenie môže byť uskutočnené pomocou predanalytickej lin-ky Automate1250. Vzorky po centrifugácii sa vložia do predanalytickej linky pre následné vytriedenie do generických stojančekov či sto-jančekov konkrétnych analyzátorov.

Po analýze sú všetky vzorky vrátené k linke AutoMate1250 a vytriedené pre archiváciu a následne uskladnené v chladničkách v pries-tore centrifugácie.

Na príjme uskutočňuje lekár validáciu výsled-kov pred ich distribúciou k lekárom.

ZhodnotenieHlavným prínosom vytvorenia CLK po úplnej

realizácii návrhu nášho riešenia je konsolidácia toku vzoriek, dosledovatelnosti materiálu a dát pre zjednodušenie procesov, zefektívnenie pre-vádzky. Implementácia projektu zabezpečí

zvýšenie kvality procesov a úsporu manuálnej práce.

Projekt konsolidácie, ktorý je v CLK naštarto-vaný, znamená pre našu spoločnosť možnosť pokračovať v nastavených procesoch a opti-malizácii činností.

Ďakujeme vedeniu FNsP a všetkým zúčast- neným pracovníkom CLK za prejavenú dôveru, ochotu a ústretovosť. Tešíme sa na ďalšiu spoluprácu s nimi a veríme, že onedlho prinesieme aj vám – našim verným čitatelom – ďalšie pozitívne a inšpiratívne informácie z tohto pracoviska.

HELENA BAZOVSKÁe-mail: [email protected]

Štvrtý ročník stretnutia užívatel ov koagulačných systémov spoločnos-

ti Instrumentation Laboratory sa konal v termíne 3. – 4. októbra 2013. Mies-tom tohto stretnutia bol hotel Atrium, ktorý sa nachádza na úpätí Slavkovs- kého štítu a je známy svojimi nádher-nými panoramatickými výhl admi do Podtatranskej kotliny a na vrcholy tatranských štítov.

Väčšia časť odborného programu bola zame-raná na hemostazeológiu, avšak na rozdiel od minulých ročníkov sme sa venovali aj témam z oblasti hematológie a kvality. Zretel sme kládli najmä na klinické a laboratórne aspek-ty vybraných chorobných jednotiek. Novinku, blok venovaný kvalite v hematologických labo-ratóriách, sme do programu zaradili na základe

pripomienok od účastníkov predošlých roční-kov. Portfólio spoločností Instrumentation La-boratory a Beckman Coulter prezentovali naši produktoví špecialisti.

Odborný program bol v dotazníkoch spo-kojnosti hodnotený na výbornú. Velmi pekne ďakujem všetkým, ktorí „priložili ruky k dielu“, pripravili hodnotné prednášky a aktívne sa za-pájali do diskusií.

Externí prednášatelia:

� MUDr. Denisa Jankovičová Klinika hematológie a transfuziológie, Nemocnica sv. Cyrila a Metoda, Univerzitná nemocnica Bratislava

� MUDr. Alexander Varga Ústav hematológie, Fakultná nemocnica Nové Zámky

Po čtyřech letech dostali kolegové z Olomouce v čele s Radkem Vrtě-

lem a Radkem Vodičkou opět příleži-tost zorganizovat tradiční setkání, jak sami říkají, „nadšenců, kteří zasvětili minimálně část svého života zkoumání organické makromolekuly, jež si s námi stejně dělá, co se jí zlíbí. Někdy umí být až nepříjemně stabilní a životaschop-ná, jindy se nám ztrácí před očima. A když už si domýšlivě myslíme, že ji máme přečtenou, tak se nám z toho většinou pravotočivě vykroutí“.

Setkání proběhlo ve dnech 28. – 29. listopadu 2013. Při výběru místa konání se tentokrát or-

Stretnutie užívateľov koagulačných systémov Instrumentation Laboratory3. – 4. októbra 2013, Nový Smokovec

XVII. celostátní konference DNA diagnostiky28. – 29. listopadu 2013, Dolní Morava

� MUDr. Janka Hulíková Centrum hemostázy a trombózy, HEMO MEDIKA, Košice

� MUDr. Ferdinand Sasváry, PhD. Hospitale s.r.o., Šahy

� MUDr. Miriam Mitníková Oddelenie laboratórnej medicíny, podoodelenie hematológie, Univerzitná nemocnica L. Pasteura Košice

� Mgr. Michaela Macichová Oddelenie laboratórnej medicíny, podoodelenie hematológie, Univerzitná nemocnica L. Pasteura Košice

� RNDr. Zdenka Šujanová Klinika hematológie a transfuziológie, Nemocnica sv. Cyrila a Metoda, Univerzitná nemocnica Bratislava

ganizátoři rozhodli pro netradiční krok. Po řadě let přesunuli konferenci z měst, jako je Brno, Olomouc a Praha, do hotelového komplexu Vista ve středisku Dolní Morava nacházejícího se v malebném prostředí masivu Kralického Sněžníku.

Akce byla pořádána již posedmnácté, tentokrá-te pod záštitou Společnosti lékařské genetiky ČLS JEP, Ústavu lékařské genetiky a fetální me-dicíny Lékařské fakulty UP a Fakultní nemocni-ce v Olomouci. Garanty akce pak byl děkan LF UP prof. MUDr. Milan Kolář, Ph.D. a ředitel FN Olomouc doc. MUDr. Roman Havlík, Ph.D.

Čestným hostem se stal prof. Brdička, jemuž byl na začátku konference, u příležitosti jeho

80. narozenin, předán diplom udělení čestné-ho členství v České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně.

Hlavním tématem konference byly nové tren-dy v DNA diagnostice, zejména zkušenosti z masivních sekvenačních technik, z hybridi-začních mikročipových analýz a bioinformatic-kého zpracování a vyhodnocování dat. Sešlo se zde přes 230 účastníků, kteří přispěli více než 60 odbornými prezentacemi. Možnost prezen-tovat své novinky získalo téměř 20 firem.

EVA KRÁLOVÁe-mail: [email protected]

� Mgr. Luděk Slavík, PhD. Hemato-onkologická klinika, Fakultní nemocnice Olomouc, Česká republika

� Mgr. Peter Bartek, PhD. Oddelenie hematológie a transfuziológie, Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava

� Doc. MUDr. Tomáš Lipšic, Csc Oddelenie hematológie a transfuziológie, Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava

� Dr. Edmondo Ferretti Instrumentation Laboratory, Miláno, Taliansko

Verím, že dominantou podujatia boli užitoč-ne a príjemne strávené chvíle v kruhu kolegov a priatelov. Teším sa na nasledujúci ročník!

JOZEFÍNA BERNÁTOVÁe-mail: [email protected]


Celosvětově se stal listopad měsí-cem boje proti rakovině prosta-ty. V rámci tzv. akce Movember

si muži nechávají narůst knírek, čímž ostatní upozorňují na rizika spojená s touto nemocí. Ale proč ten knír? Snaží se tak poukázat na důležitost preven-ce a časné diagnózy. Současně probíhá sbírka finančních prostředků, které se pak využijí právě při boji s touto zákeř-nou chorobou.

V loňském roce se uvedené listopadové udá-losti zúčastnila i společnost Beckman Coulter, a to prostřednictvím organizace „Muži proti rakovině“. Ve spolupráci s několika laboratoře-mi jsme umožnili 400 zájemcům otestovat si zdarma tzv. index zdravé prostaty phi. V tomto článku vás ve zkratce seznámíme s průběhem „našeho Movemberu“ ve dvou spolupracují-cích laboratořích. Těm jsme položili následující otázky:

1. Kolik jste v rámci této akce vyšetřili pacientů?

2. Předcházela vyšetření nějaká přípra-va nebo selekce zájemců?

3. Zúčastnili byste se této akce také příští rok?

Současně nabídneme i pohled kolegy, který se do celé akce osobně zapojil.

FN Plzeň, oddělení imunodiagnostiky – MUDr. Radka Fuchsová

1. Kolem 70.

2. Ano, pacienti prošli úvodním pohovorem, kde jsme se ptali na detaily spojené s pří-padnými obtížemi, léčbou a prodělanými zákroky. Již při tomto dialogu jsme některé zájemce vyloučili, protože by u nich nebyl výsledek vypovídající. V dalším stupni jsme vyšetřili PSA a teprve při zvýšeném výsledku následovalo testování phi indexu.

Mezi nebem a zemí

3. Přestože bylo za celou akcí hodně práce, určitě bychom se rádi znovu zapojili. Na-víc řada těch, kteří se zúčastnili, se zajímali o možnost nechat si příští rok ověřit případ-ný trend výsledků.

Krevní centrum Frýdek Místek – prim. MUDr. Boris Bubeník

1. 150.

2. Podle hodnoty PSA.

3. Určitě ano, ideální by bylo dostat toto vy-šetření do číselníku vyšetření proplacených pojišťovnou.

František Vičar

Tak trochu ze zvědavosti, tak trochu kvůli he-cování se s kamarády jsem se rozhodl zúčastnit se aktivně akce Movember. Znal jsem ji samo-zřejmě z médií z předchozích let, ale netušil jsem, co konkrétního se za ní skrývá. Proto jsem se zaregistroval na www.movember.com, a stal se tak na měsíc jedním z mnoha „kníra-čů“. Až na zmíněných stránkách jsem se dozvě-děl celou podstatu této celosvětové akce – jsou opravdu zajímavé, proto doporučuji jejich pro-hlídku. Už po týdnu jsem se stal terčem mnoha dotazů a vtipných komentářů, avšak vytrvale jsem využíval situaci k šíření osvěty a důleži-tosti preventivního vyšetření. Kupodivu větší odezvu jsem pociťoval od žen. Ty si uvědomo-valy, že musí svoje partnery k vyšetření PSA dotlačit. Nakonec i mě samotného k tomu přimě-la až tato akce. Bylo rovněž zajímavé potkávat další „knírače“, protože na většině z nich bylo patrné, že si nechali narůst knírek pouze na přechodnou dobu.

Díky tomu, že jsem se osobně zapojil, jsem zís-kal pocit, že má akce skutečně význam. Vtip-nou formou upozorňuje na „mužské“ choroby a navíc získává finanční prostředky na výzkum. Už teď se mi honí hlavou nápady, jak si v listo-padu upravím svůj knír a jak se ještě aktivněji zapojím do Movemberu 2014. Budu rád, když se ke mně přidá co nejvíce čtenářů našeho časopisu!

Movember 2013slovem i ve fotografiích

TEREZA TIETZEe-mail: [email protected]


FRANTIŠEK VIČARe-mail: [email protected]

Cestou necestou, polem ne-polem jely jsme s Ing. Petrou Kabeleovou z pražské la-

boratoře Prevedig na konferenci do Karlovy Studánky. Čekalo nás „krásných“ 350 km jízdy. A tak nebylo divu, že jsme probraly vše možné i nemožné a narazily přitom na pro mne velmi zajímavý sport. Tím je skákání padákem!

V kolika letech jsi s tímto druhem sportu začala a jak ses k němu vů-bec dostala?

Ve svých 14 letech jsem začala se základním výcvikem. Za rok jsem pak absolvovala svůj první seskok padákem, a to ještě na starém vojenském OVP-68. Vzhledem k tomu, že děvčat bylo v tomto sportovním odvětví re-lativně málo, a protože jsem prošla fyzickými testy, vybrali mě záhy do střediska vrcholo-vého sportu v Příbrami, kde jsem nakonec strávila nezapomenutelných 5 let v juniorské reprezentaci.

K parašutismu mě přivedl taťka, který měl za sebou – coby vojenský pilot – pár seskoků padákem, a také trochu náhoda. Dříve jsem závodně plavala, ale chtěla jsem zkusit něco nového. Jenže začít ve 14 letech jiný sport na slušné úrovni není tak jednoduché. Volba nakonec padla na letecké sporty. Chtěla jsem létat na větroni, proto jsem se začala rozhlížet po letišti, na němž bych absolvovala pilotní výcvik. Při cestě autem vzal naštěstí taťka mladého stopaře, který byl parašutista. A tím byl můj osud zpečetěn. Domluvili se, že si můžu přijít zatrénovat do tělocvičny a zkusit se připravit na seskoky v rámci základního vý-cviku. Mezi partou „paragánů“ se mi okamžitě zalíbilo. Úplně jsem tomuhle sportu propadla.

Podporovali tě rodiče? Nebáli se o tebe?

Rodiče mě samozřejmě podporovali, ale urči-tě se o mě báli, i když jsem si to tenkrát vůbec neuvědomovala. Dnes si nedovedu představit, že bych svoji dceru pustila v 15 letech na celý víkend z domu mezi partu dospělých chlapů a navíc s ní neměla žádné spojení. Tenkrát ještě nebyly mobily a já jezdila hodně často na celé víkendy na letiště mimo Prahu. O různých týdenních soustředěních ani nemluvě. Asi mi rodiče hodně věřili.

Je potřeba dobrá psychická a fyzic-ká kondice pro provozování tohoto sportu?

Dobrá kondice je důležitá pro každý sport. Když jsme neskákali, chodili jsme běhat, posi-

lovat, trénovali jsme akrobacii na trampolíně. Museli jsme si samozřejmě vést tréninkový deník, kam jsme si zapisovali, jak pracujeme na své fyzičce doma. Každý rok jsme pak ab-solvovali náročné fyzické testy. Kdo neprošel, mohl být z reprezentace vyřazen.

3938

Arta, Ilem,kakirit, Taam

hmla, opar

opalok

mrak

vytýčenýsmer

vrch v Nigérii

pomoc,záchrana(hovor.)

2akže

čínska droga

Botswana (MPZ)

zvratné zámeno

lantán (zn.)1

druh horniny,kataklazit (geol.)

vlastnilskutý

autostoppulz

písmeno gréckejabecedy

la, lalá

potom

šermiarska zbraň

písmovka

ostrovv Indonéziiisto

nech, po česky

drmancoval

kilopond (zn.)

Krupina (EČV)

trma-vrma

cestovný dokladvavrín (bás.)

Olympia(dom.)

herecUSA (Al…)

krik

indická tanečnica

kvalitné palivo

títo, po rusky

zaujato, s pred-sudkom

strednádámska móda

3aptien

turistickýautobus

tamto

4 5milovaná

nočný motýľ

udieraj

zelenépolicajné autoEuropean Pallet

Pool (skr.)

zápach(odbor.)

telocvičnénáradie

krátkovlnnáovca druh účesu

liatím naplniťpražský

elektrotechnickýpodnik

predlohahnedý

austrálskypštros

anóda,po esperantskykozľacia kožarádiotelefón

(skr.)nie tentobantamováhmotnosťsídlo v Gréckuzoologická

záhrada (skr.)dopolychrámautor:Ivan

Šarkan

eruka, Inami,lop, ska

kříženecvelblouda

oxid hlinatý(vz.)

tisíc tisíců

2obec v okreseDomažlice

teplem serozpouštělo

1turn over (zkr.)

protoplazma

jadernámina (zkr.)

3

závěsypřed jevištěm

prvníindický film

krutí lidé

jménozpěvačky LearSenior SupplyOfficer (zkr.)

darovalo

severské mužskéjméno

závěrečné slovokřesť. modliteb

obyvatel Itálie

písmeno řeckéabecedy

velký korýšs klepety žijící

ve vodě

jednotkaobjemuv Srbsku

skládací pře-chodné přístřeší

lovkyně perel

identifikačníčíslo (zkr.)

sídlo v Japonsku

kulečníková hůl

kolorit (kniž.)

KansallinenKokoomus

(zkr.)

velký kurovitýpták s lysýmčervenavým

krkem

prodlouženáboční zeď

sbor hudebníků

strkat

prodléval

jako (slovensky)

styl hudby

centimetr (zn.)

vražedný útok

systém vědec-kých principů

turecký důstojník

asijské kyslémléko

4

schopnost mluvit

kdo orá

savec podobnýslonu

sklon (angl.)

finská jednotkaobjemu

Sbor požárníochrany (zkr.)

užitkovárostlina

výklenekpro sochu

Iva (slovensky) francouzskýbásnik

válcovitá nádobas dvěma

kruhovými dnymodrý (angl.)krytý ochoz

s arkádami

prudce jedovatýalkaloid obsažený

v blínu

kdo kupuje,kupujícíomýtRemote Area

Nurse (zkr.)ementálské

sýrypodporapravoslavníknězi

autor:Ivan

Šarkankrůpěj

„Tak si, Lojzo, představ,“ vylévá si vzdělaný Pepa srdce u piva v hospodě vzdělanému kamarádovi, „že mi u doktora odebrali půl litru krve a z ní diagnostikovali tenisový loket, Alzheimera, močovéi žlučové kameny a hašteřivou manželku. Když jsem si šel koupit pušku, abych je zastřelil, …(Tajenka).“

„Tak si, Lojzo, predstav,“ vylieva si vzdelaný Jožko srdce pri pive v krčme vzdelanému kamarátovi, „že mi u doktora odobrali pol litra krvi a z nej diagnostikovali tenisový lakeť, Alzheimera, močovéi žlčové kamene a hašterivú manželku. Keď som si išiel kúpit pušku, aby som ich zastrelil, …(Tajnička).“

Arta, Ilem,kakirit, Taam

hmla, opar

opalok

mrak

vytýčenýsmer

vrch v Nigérii

pomoc,záchrana(hovor.)

2akže

čínska droga

Botswana (MPZ)

zvratné zámeno

lantán (zn.)1

druh horniny,kataklazit (geol.)

vlastnilskutý

autostoppulz

písmeno gréckejabecedy

la, lalá

potom

šermiarska zbraň

písmovka

ostrovv Indonéziiisto

nech, po česky

drmancoval

kilopond (zn.)

Krupina (EČV)

trma-vrma

cestovný dokladvavrín (bás.)

Olympia(dom.)

herecUSA (Al…)

krik

indická tanečnica

kvalitné palivo

títo, po rusky

zaujato, s pred-sudkom

strednádámska móda

3aptien

turistickýautobus

tamto

4 5milovaná

nočný motýľ

udieraj

zelenépolicajné autoEuropean Pallet

Pool (skr.)

zápach(odbor.)

telocvičnénáradie

krátkovlnnáovca druh účesu

liatím naplniťpražský

elektrotechnickýpodnik

predlohahnedý

austrálskypštros

anóda,po esperantskykozľacia kožarádiotelefón

(skr.)nie tentobantamováhmotnosťsídlo v Gréckuzoologická

záhrada (skr.)dopolychrámautor:Ivan

Šarkan

eruka, Inami,lop, ska

kříženecvelblouda

oxid hlinatý(vz.)

tisíc tisíců

2obec v okreseDomažlice

teplem serozpouštělo

1turn over (zkr.)

protoplazma

jadernámina (zkr.)

3

závěsypřed jevištěm

prvníindický film

krutí lidé

jménozpěvačky LearSenior SupplyOfficer (zkr.)

darovalo

severské mužskéjméno

závěrečné slovokřesť. modliteb

obyvatel Itálie

písmeno řeckéabecedy

velký korýšs klepety žijící

ve vodě

jednotkaobjemuv Srbsku

skládací pře-chodné přístřeší

lovkyně perel

identifikačníčíslo (zkr.)

sídlo v Japonsku

kulečníková hůl

kolorit (kniž.)

KansallinenKokoomus

(zkr.)

velký kurovitýpták s lysýmčervenavým

krkem

prodlouženáboční zeď

sbor hudebníků

strkat

prodléval

jako (slovensky)

styl hudby

centimetr (zn.)

vražedný útok

systém vědec-kých principů

turecký důstojník

asijské kyslémléko

4

schopnost mluvit

kdo orá

savec podobnýslonu

sklon (angl.)

finská jednotkaobjemu

Sbor požárníochrany (zkr.)

užitkovárostlina

výklenekpro sochu

Iva (slovensky) francouzskýbásnik

válcovitá nádobas dvěma

kruhovými dnymodrý (angl.)krytý ochoz

s arkádami

prudce jedovatýalkaloid obsažený

v blínu

kdo kupuje,kupujícíomýtRemote Area

Nurse (zkr.)ementálské

sýrypodporapravoslavníknězi

autor:Ivan

Šarkankrůpěj

„Tak si, Lojzo, představ,“ vylévá si vzdělaný Pepa srdce u piva v hospodě vzdělanému kamarádovi, „že mi u doktora odebrali půl litru krve a z ní diagnostikovali tenisový loket, Alzheimera, močovéi žlučové kameny a hašteřivou manželku. Když jsem si šel koupit pušku, abych je zastřelil, …(Tajenka).“

„Tak si, Lojzo, predstav,“ vylieva si vzdelaný Jožko srdce pri pive v krčme vzdelanému kamarátovi, „že mi u doktora odobrali pol litra krvi a z nej diagnostikovali tenisový lakeť, Alzheimera, močovéi žlčové kamene a hašterivú manželku. Keď som si išiel kúpit pušku, aby som ich zastrelil, …(Tajnička).“

KŘÍŽOVKA

Česk

á kř

ížov

kaSl

oven

ská

kríž

ovka

TAJENKA Z MINULÉHO ČÍSLA: "NĚCO DĚLAT S TOU SVOU ALERGIÍ NA DOKTORY"

„Tak si, Lojzo, představ,“ vylévá si vzdělaný Pepa srdce u piva v hospodě vzdělanému kamarádovi, „že mi u doktora odebrali půl litru krve a z ní diagnostikovali tenisový loket, Alzheimera, močové i žlučové kameny a hašteřivou manželku. Když jsem si šel koupit pušku, abych je zastřelil, …(Tajenka).“

„Tak si, Lojzo, predstav,“ vylieva si vzdelaný Jožko srdce pri pive v krčme vzdelanému kamarátovi, „že mi u doktora odobrali pol litra krvi a z nej diagnostikovali tenisový lakeť, Alzheimera, močové i žlčové kamene a hašterivú manželku. Keď som si išiel kúpit pušku, aby som ich zastrelil, …(Tajnička).“Je to finančně náročný koníček?

Pro nás to tehdy finančně náročný sport ne-byl, jen časově. Jako reprezentanti jsme měli vše hrazené. Ale dnes bude tato „zábava“ asi finančně náročná. Musíš si koupit hlavní i zá-ložní padák a ostatní potřebné vybavení, platit si jednotlivé seskoky a vše, co je se skákáním spojené. A navíc věnovat parašutismu o víken-dech dost času. Není to jako si vyjet na pár hodin na kolo.

Nese s sebou tento sport nějaká rizika? Byla jsi přítomna nějakému dramatickému okamžiku?

Pokud se dodržují nastavená pravidla, je ve srovnání s jízdou autem tenhle sport určitě bezpečný. Mně se například zrovna při výběru do reprezentace zastavily při seskoku stopky. Prováděla jsem povinné cviky za volného pá-du a stále jsem si myslela, že mám dost času. Bohužel až po delší chvíli jsem zjistila, že čas na stopkách se nemění. Byla jsem už dost níz-ko, rychle otevřela padák a dopadla hned do nedalekého pole. Všichni stáli vyděšení na sto-jánce a měli hrůzu v očích. Dostala jsem po-řádně vynadáno, že nemám pud sebezáchovy. Byla jsem přesvědčená, že jsem na výběru do „repre“ skončila. Ale asi se jim líbilo, jak jsem situaci vyřešila, protože pozvánka nakonec přišla.

Párkrát se mi také stalo, že se mi neotevřel hlavní padák. Většinou jsem totiž chodila z le-tadla až poslední, protože jsem byla nejlehčí a musela po přistání rychle zabalit, abych stih-la další výsadku. No a někdy se šňůry zašmodr- chaly a já byla nucená kontejner s padákem odhodit a otevřít záložní. Ale vždycky vše dobře dopadlo. Byli jsme na takovéto situace neustále proškolováni.

Byl to pro tebe adrenalin, nebo tě pád dolů nechával v klidu?

Adrenalin to určitě byl, hlavně pokud se řešily nějaké nestandardní situace, nebo se zkoušely dálkové přelety, okamžité otevření ve 3 000 m, seskoky v horách na sjezdovku nebo na fotba-lové hřiště a podobná zpestření.

Po skončení v reprezentaci a nástupu do zaměstnání mi skákání chybělo. Proto jsem si koupila svůj vlastní padák a začala se věnovat paraglidingu, což je adrenalin velký. Hlavně když létáš 2 hodiny kilometr nad lyžařským střediskem v Alpách nebo za silné termiky v Beskydech a musíš rychle reagovat na vzduš-né proudy a dění kolem sebe.

Jaké koníčky či sport provozuješ nyní?

Jezdíme s dětmi v zimě rádi lyžovat, v létě na kolo a na výlety. Ráda také chodím po horách a poslední 2 roky jsem začala zase víc běhat. Motivací mi bylo pár běžeckých závodů, na které jsem se s kamarádkami přihlásila. Ráda také relaxuju na chatě při zahradničení, nebo u dobré knížky. No a „koníček“, který mě nyní nejvíc vytěžuje, je vše, co se točí kolem base-ballu mých dvou synů.

Děkuji za zajímavý rozhovor a přeji, ať se ti moc daří a ať jsi stále tak akční!

ING. PETRA KABELEOVÁDIAGNOSTICKÉ CENTRUM, PREVEDIG S.R.O., WASHINGTONOVA 9, 112 49 PRAHA 1e-mail: [email protected]



Kde se můžeme setkatformou stánku (březen - červen 2014)

2014- 03-31

4. 4. 2014

Jarní hematologický den regionu Jižní Morava

a kraje Vysočina (Uherské Hradiště)

6. – 8. 4. 2014

XXXV. Imunoanalytické dny (Plzeň)

27. – 29. 4. 2014

Harrachohorky – konference laboratorní

hematologie (Harrachov)

22. – 24. 5. 2014

Slovensko-česká konferencia o hemostáze a trombóze 2014

(Martin)

27. – 29. 5. 2014

47. celostátní sjezd biochemických laborantů BIOLAB 2014

(Ostrava)

1. – 3. 6. 2014

VIII. Olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí,

XVIII. Konference ošetřovatelství a zdravotních laborantů,

7th Symposium on Advances in Molecular Hematology

(Olomouc)

diagnostika - beckmancoulter.cz 2014-25.pdf · v České republice prodávat a podporovat...

Documents