diagnostico microbiologico de la enfermedad de … · real-time pcr in faecal samples of triatoma...

DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS

Juan Carlos Rodríguez DíazS. MicrobiologíaHospital General Universitario de AlicanteE-mail: [email protected]

Datos generales

• Se llama tripanosomiasis americana

• Producida por Trypanosoma cruzi

• Transmitida por un insecto hemíptero hematófago

(triatomino)

• Varios reservorios mamíferos además del hombre

Datos generales

Prevalencia

• 12-14 millones de personas infectadas, desde Méjico a Argentina (15 países)

Prevalencia

• La enfermedad de Chagas era un problema de América latina pero los cambios poblacionales de los últimos años hace que se convierta en un problema de salud global:

• En 15 países europeos excluyendo España, en 2005, el 2.9% de los 483,074 inmigrantes legales provenientes de América Latina estaban infectados

• En 2008, España recibió a 1,678,711 inmigrantes de Latinoamérica de los que el 5.2% estaban potencialmente infectados y 17,390 desarrollarán enfermedad.

• 24-92 neonatos pueden haber desarrollado infección congénita en 2007 en España

Schmunis GA et al. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Trop. 2010;115:14-21

Transmisión

• Picadura del insecto

• Exposición en mucosas

• Transfusiones de sangre

• Transferencia a través de la placenta

• Ingestión del parásito en la comida

Métodos diagnósticos

• Visualización de los tripomastigotes con Giemsa en la sangre periférica (buffy coat)

• En fase aguda se observan fácilmente

• En fase crónica no se observan salvo en reactivaciones febriles

L.S. García. Diagnostic Medical Parasitology. ASM 1993


• Visualización de los amastigotes en nódulos linfáticos con Giemsa

• Puede confundirse con amastigotes de Leishmania



• Cultivo en medio NNN (Novy, MacNeal, Nicolle)

• Puede confundirse con Leismania

• Incubación a 25ºC durante 30 días



• Xenodiagnóstico• Tras poner en contacto muestras del paciente con vectores se

detecta la presencia del parásito en sus heces

• Microscopía

• PCR

Parasit Vectors. 2012;5:59. doi: 10.1186/1756-3305-5-59. Real-Time PCR in faecal samples of Triatoma infestans obtained by xenodiagnosis: proposal for an exogenous internal control. Bravo N, et al.


• Detección de anticuerpos mediante métodos serológicos

• Reacciones cruzadas con otros parásitos como Leishmania

• Necesidad de confirmar en resultados por dos pruebas serológicas diferentes


Métodos diagnósticos• Detección de anticuerpos mediante métodos serológicos

• INMUNOCROMATOGRAFIA• Rápida

• Fácil de hacer, incluso en la consulta del clínico

• Importantes problemas de sensibilidad y especificidad

• ENZIMOINMUNOENSAYO

• Automatizable

• Útil en cribados de muchas muestras

• Permite diferenciar IgG e IgM

• INMUNOFLUORESCENCIA• Útil como técnica confirmatoria

• Se requiere personal experimentado

• Permite cuantificar los títulos de forma precisa

• Permite diferenciar IgG e IgM

• HEMAGLUTINACION• Permite cuantificar de manera precisa



• INMUNOCROMATOGRAFIA



• ENZIMOINMUNOENSAYO



• INMUNOFLUORESCENCIA



• HEMAGLUTINACION


• Detección del DNA del parásito (Reacción en cadena de la polimerasa, PCR)

• Permite detectar la presencia de muy pocos microorganismos en la muestra

• Permite cuantificar el número de microorganismos (real time PCR)

• Puede hacerse en sangre o en tejidos

• Detección del DNA del parásito (Reacción en cadena de la polimerasa, PCR)

• Permite detectar la presencia de muy pocos microorganismos en la muestra

• Permite cuantificar el número de microorganismos (real time PCR)

• Puede hacerse en sangre o en tejidos

J Heart Lung Transplant. 2011;30:799-804. Usefulness ofqualitative polymerase chain reaction for Trypanosoma cruzi DNAin endomyocardial biopsy specimens of chagasic heart transplant

Métodos diagnósticos en neonatos

• Los anticuerpos de la madre atraviesan la placenta

• Todos los niños de madres infectadas presentan positivas las pruebas serológicas al nacer, aunque no estén infectados

• Estas pruebas se negativizan al cabo de varios meses (6-12) si el niño no está infectado

• En neonatos de madres infectadas tiene mucha utilidad la detección del genoma del parásito mediante PCR porque permite confirmar la infección

• Casi el 100% de los neonatos infectados se curan si se tratan rápidamente

Métodos inmunológicos versus microbiología molecular

• Ambas técnicas son complementarias

• Los métodos inmunológicos detectan la respuesta inmune del huésped

• En casos de primoinfección pueden ser negativos

• Más útiles en procesos crónicos

• Difícil interpretación en neonatos

* La IgG de la madre atraviesa la placenta

* El sistema inmune inmaduro del neonato puede no producir IgM

• Los métodos de microbiología molecular detectan la presencia del genoma del parásito

* Útiles en procesos agudos o reactivaciones febriles

Enferm Infecc Microbiol Clin. 2012 pii: S0213-005X(12)00282-0. Comparison between immunological and molecular techniques for the diagnosis of Chagas disease.Ferrer E, et al.

Consensos y revisiones

• Joaquim Gascón et al. Diagnosis, Management, and Treatment of Chronic Chagas’ Heart Disease in Areas Where Trypanosoma cruzi Infection Is Not Endemic. Rev Esp Cardiol 2007;60:285-93

• Maria Jesús Pinazo. Diagnosis, management and treatment of chronic Chagas’ gastrointestinal disease in areas where Trypanosoma cruzi infection is not endemic. Gastroenterol Hepatol.2010;33:191–20

• Murcia L, Carrilero B, Saura D, Iborra MA, Segovia M Diagnosis and treatment of Chagas disease. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2013;31 Suppl 1:26-34..

HACIA DONDE VAMOS

Desarrollo de nuevas pruebas confirmatorias

• Hay reacciones cruzadas entre parásitos por lo que se necesita confirmar los resultados positivos

• Utilización de dos pruebas

• Es importante conocer la sensibilidad y especificidad de las mismas

• Los antígenos utilizados como diana es un dato clave

• Western Blot: Estudia la producción de anticuerpos frente a antígenos específicos del parásito

Am J Trop Med Hyg. 2012;86:412-6. Identification of a Western blot pattern for the specific diagnosis of Trypanosoma cruzi infection in human sera. Riera C, et al.

Control serológico de la respuesta al tratamiento

• ¿Sirven los estudios serológicos para controlar la eficacia de los tratamientos?

• La negativización del estudio serológico a largo plazo se ha asociado a respuesta al tratamiento

• Disminuciones de la cantidad de anticuerpo o negativizaciones de los mismos se asocia de forma rápida a la respuesta al tratamiento

PLoS Negl Trop Dis. 2011;5:e1314. Doi: 10.1371. Impact of aetiological treatment on conventional and multiplex serology in chronic Chagas disease. Viotti R, et al.


• ¿Sirven los estudios serológicos para controlar la eficacia de los tratamientos?

• Cuestión polémica

• Hace faltan estudios a largo plazo para establecer los criterios

• Un abordaje es la búsqueda de antígenos específicos asociados a la respuesta

• Diagn Microbiol Infect Dis 2013: S0732-8893. Use of an enzyme-linked immunosorbent assay that utilizes the Tc13Tul antigen of Trypanosoma cruzi to monitor patients after treatment with benznidazole. Santamaría AL, el al


• Detección de la presencia del genoma del parásito en sangre y orina

• Se está evaluando en modelos animales

• Hace faltan estudios a largo plazo para establecer los criterios

• Puede ser útil en neonatos e inmunodeprimidos

• PLoS One. 2013;8:e58480. Detection of soluble antigen and DNA of Trypanosoma cruzi in urine is independent of renal injury in the guinea pig model. Castro-Sesquen YE, el al


• Se correlaciona el nivel de anticuerpos con la presencia del parásito en sangre

• Se deben hacer estudios cuantitativos con técnicas validadas y con controles de calidad externos e internos

• Estudios en paralelo de todas las muestras del paciente correctamente conservadas a lo largo del tiempo

Transfusion. 2012. doi: 10.1111/j.1537-2995.2012.03902.Antibody levels correlate with detection of Trypanosoma cruzi DNA by sensitive polymerase chain reaction assays in seropositive blood donors and possible resolution of infection over time. Sabino EC, et al. .

Control genético de la respuesta al tratamiento

• Se deben utilizar sistemas validados y estandarizados

• Método de extracción del DNA

• Gen parasitario amplificado

• Método de detección y control interno de amplificación

• Controles de calidad externos e internos

Acta Trop. 2013;125:23-31. doi: 10.1016/j.actatropica.2012.08.020. Towards the establishment of a consensus real-time qPCR to monitor Trypanosoma cruzi parasitemia in patients with chronic Chagas disease cardiomyopathy: a substudy from the BENEFIT trial. Moreira OC, et al.

Detección de mecanismos de resistencia a fármacos

• Caracterización de los mecanismos moleculares de resistencia

• Sistemas de entrada del fármaco en el parásito

• Estudio de librerías de RNA para conocer las proteínas que interaccionan con los fármacos

Parasitology. 2013:1-14. Genetic dissection of drug resistance in trypanosomes. Alsford S, et al.

Detección de genes de virulencia mediante secuenciación masiva del genoma

• La secuenciación masiva permite actualmente conocer todo el genoma de un parásito de manera rápida y económica

• Caracterizar la cepa causante de cada proceso infeccioso (medicina individualizada)

• Estudiar la presencia de genes de virulencia, patogenicidad y resistencia antibiótica

• PLoS One. 2013;8:e58967. Differential distribution of genes encoding the virulence factor trans-sialidase along Trypanosoma cruzi Discrete typing units. Burgos JM, et al.

Control de brotes alimentarios• La transmisión oral es un fenómeno emergente

• Puede llegar a poblaciones no endémicas por la globalización del comercio de alimentos

• Es importante controlar y caracterizar los brotes

• El desarrollo de técnicas moleculares de epidemiología molecular del parásito es clave en este propósito

PLoS Negl Trop Dis. 2013;7:e2041. Molecular epidemiology of human oral Chagas disease outbreaks in Colombia. Ramírez

JD, Montilla M, Cucunubá ZM, Floréz AC, Zambrano P, Guhl F.

Cuantificación del número de parásitos

• La cuantificación del número de parásitos puede realizarse mediante real time PCR (PCR a tiempo real o PCR cuantitativa)

• Puede realizarse en diferentes muestras: sangre, biopsias, etc

• Puede ser muy útil a la hora de:

• Control de tratamiento

• Riesgo de transmisión en infección congénita

• Predicción de riesgo de enfermedad crónica

PLoS Negl Trop Dis. 2013;7:e2000. Analytical performance of a multiplex Real-Time PCR assay using TaqMan probes for quantification of Trypanosoma cruzi satellite DNA in blood samples. Duffy T, et al.

Caracterización de la interacción parásito-huésped

• Las nuevas herramientas genéticas permiten caracterizar la interacción entre patógeno y huésped

• Las técnicas más útiles son:

• Microarrays

• Secuenciación masivade enfermedad crónica

• PLoS One. 2012;7:e50748. Diagnostic peptide discovery: prioritization of pathogen diagnostic markers using multiple features. Carmona SJ, et al. .

Caracterización de la interacción parásito-huésped

diagnostico microbiologico de la enfermedad de … · real-time pcr in faecal samples of triatoma...

Documents