DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSIS CANINAMEDIANTE LA TÉCNICA DE REACCIÓNEN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):UN PROCEDIMIENTO SIMPLE PARA USOEN LA CLÍNICA.

P. Zaragoza", I. Martin-Burriel-, R. Osta-,M. Gascón-

RESUMEN.

Para detectar la presencia de Leishmania ssp, endistintas muestras clínicas de perros sospechosos depadecer esta enfermedad, se ha utilizado la técnicaPCR, amplificando para ello un fragmento del genSSU rRNA, repetido más de 100 veces en el genomadel parásito. El método se ha optimizado parautilizarlo como método de rutina en la clínica.El procesado de las muestras es rápido y simple. Eldiagnóstico se ha realizado por presencia/ausenciadel parásito, utilizando para ello muestras de sangre,médula ósea y ganglio linfático principalmente. En elcaso de existir el parásito en el huésped se visualizauna banda nítida de un tamaño de 603 bp y en elcaso de que el parásito esté ausente, no se detecta lapresencia de esta banda. Los mejores resultados seobtuvieron cuando la muestra de partida fue médula oganglio linfático. El método presenta la ventajaadicional de detectar portadores asintomáticos,incluidos los titulas de IFI dudosos. La técnica PCR sepresenta como test de diagnóstico rutinario, siendomás rápida, eficaz y económica que los métodos dediagnóstico clásicos.

Palabras clave:.

INTRODUCCIÓN.Las enfermedades endémicas son un riesgo parala calidad de vida y significan un riesgo de morbi-lidad, debilidad y mortalidad para la población.La salud de la población es un factor muy impor-tante a tener en cuenta en un país y por supues-to región, pues produce un fuerte impacto tanto

lLaboratotio de Genética Bioquímica y GruposSanguíneos.Facultad de Veterinaria.50013 Zaragoza.2Departamento de Patología Animal.Facultad de Veterinaria.50013 Zaragoza.

ABSTRACT.

The technique PCR has been used in arder to detectthe presence of Leishmania ssp in different clinicexamples of dogs that might suffer from this illness.The technique was performed by amplifying afragment of the gene SSU rRNA, that is repeatedmore than a hundred times in the parasítc's genome.This method has been optimized to use it as a routinemethod in the clinic since the processing of thespecimen is quick and simple.The diagnostic was carried out by checking thepresence/absence of the parasite using, mainly, bloodsamples, bone marrow and lymphatic gland. In thecase that the parasite existed in the host, a clear bandwith a dimension of 603 bp can be visualized. On thecontrary, if the parasite is absent no clear band canbe visualized.The best results were obtained when the usedsamples were lymphatic gland or bone marrow. Thismethod shows the additional benefit of detecting theasymptomatic carriers, including the doubtful IFI.The PCR technique shows to be a faster, moreefficient and more economic diagnosis than theclassic methods.

Key words:

económico como social. Las enfermedades endé-micas disminuyen la calidad de vida de una zona,siendo por tanto, muy importante poder diagnos-ticar de forma precoz estas enfermedades y loca-lizar a sus portadores.Los protozoos del genero Leishmania son ungrupo de parásitos de morfología similar que cau-san enfermedades en el hombre y en el perro,

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Diagnóstico de leishmaniosis canina mediante la técnica de reacción en cadena de la pclimerasa (peR): Un procedimiento simple para uso en la clínica. P. Zaragoza et a/.Clínica Veterinaria de Pequeños Animales (Avepa) Vol. 20, n" L, 2000.

siendo esta última una zoonosis que produce lamuerte en los individuos en los que no se realizaun diagnóstico claro y temprano, Concretamente, .la leishmaniosis es una enfermedad endémica enAragón y de amplio interés en la actualidad yaque está considerada por la OMS como indicado-ra de SIDAEsta enfermedad es de difícil diagnóstico ya quepueden existir pocos parásitos, incluso en indivi-duos con aparente clínica y además su localiza-ción suele ser bastante errática y en forma de gra-nulomas no visibles a simple vista,Las técnicas clásicas de diagnóstico de leishma-niosis canina se han basado principalmente en laobservación microscópica del parásito en exten-siones de aspirado de nódulo linfático y médulaósea y en métodos serológicos como IFI ( Inmu-nofluorescencia Indirecta) (prueba de referenciade la OMS), El desarrollo de la técnica de PCRpara la detección de distintos parásitos (Mathis yDeplazes, 1995) ha proporcionado una herra-mienta rápida y eficaz para el diagnóstico de estaenfermedad, Osman y cols. (1997) evaluaron laeficacia de esta técnica frente a métodos clásicospara la detección de leishmanias en personas quesufrían la enfermedad y en pacientes sospechososde padecerla, encontrando una mayor sensibilidadde la PCR frente a la microscopía,La PCR es una técnica sensible y específica parael diagnóstico de varias infecciones, considerán-dose además altamente eficaz si los cebadores uti-lizados para el diagnóstico acotan una zona delgenoma del parásito, que corresponde a secuen-cias de más de una copia por célula, En el caso dela leishmania, estas zonas pueden estar en el kine-toplasto (pequeños círculos de DNA),en los que seincluyen genes muchas veces repetidos,De las secuencias pertenecientes a este grupo degenes multicopia, podemos indicar según labibliografía consultada, una serie de secuenciascandidatas: SSUrRNA y 18SrRNA Estas zonasson bien conocidas ya que han sido secuenciadaspara más de 100 especies incluyendo Leishma-nia donovani, Trypanosoma brucei, Trypanoso-ma cruzi, Crithidia [asciculata.Conocer una zona candidata que nos permitadiferenciar con claridad al parásito, del hospeda-dor y del vector, permitirá proponer un nuevométodo de diagnóstico. La comparación de lassecuencias antes indicadas entre humano y perro(hospedador), artrópodos (vector) y Kinetoplasto(parásito), las hacen idóneas para su posible utili-zación (Eys y cols., 1995).

El uso de la PCR como método de diagnóstico,permite descartar, en zonas endémicas, individuosque, aún con titulación de anticuerpos aparente,no sean ya portadores del agente. Esto lógica-mente, solo es posible con el diagnóstico directodel agente causal y en la actualidad el método másrápido, económico, sensible y eficaz es la PCR.Por todas estas razones el presente artículo pre-tende demostrar la eficacia de la genética mole-cular como herramienta de diagnóstico y asípoder reemplazar otras técnicas hoy utilizadas y,desde nuestro punto, de vista menos fiables.

MATERIAL Y MÉTODOS.

Obtención de muestras y grupos de animales.A partir de animales afectados de leishmaniosis,procedentes principalmente de perros sospecho-sos de ser portadores de leishmania que acuden ala Consulta de Medicina Interna de Pequeños Ani-males (SMIPA) de la Facultad de Veterinaria deZaragoza, se han obtenido las siguientes mues-tras:- Aspirado de ganglio linfático (25 a 100 mIdisueltos en 100 ]JITE pH8).- Aspirado de médula ósea (25 a 100 ]JIdisuel-tos en 250 mI TE pH8).- Sangre, basta con 500 ]JI.Entre las muestras recibidas en nuestro servicio,se eligieron animales afectados de leishmaniosiscorrespondientes a los siguientes grupos:1. Animales asintomáticos, con títuto de IFIdudoso (1/60 ó menor) (20 perros).2. Una camada de cinco cachorros, hijos de unaperra portadora de leishmania, todos positivosserológicamente (IFIpositiva a diluciones mayoresde 1/160).3. Animales tratados de leishmania, en este casose realizaron controles a los 3 meses y al año pos-tratamiento (10 casos).4. Animales con cuadros clínicos inespecificos,inclusive no compatibles con el cuadro clásico deleishmaniosis, donde se descarta leishmania den-tro de un protocolo más amplio. Concretamenteen este grupo se incluyen dos casos con sólo sín-tomas de colitis crónica, sin responder, evidente-mente, a ningún tratamiento y sin encontrar otracausa después de realizar todo el protocolo diag-nóstico, y con títulos IFI dudosos para Leishmania(positivo a dilución 1/60).Otro grupo lo constituiría el de los animales cla-ramente positivos por IFIy por visualización direc-

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ta de leishmania en aspirados de médula ósea; enestos casos el clínico utiliza menos la PCR, ya quelas otras técnicas son más asequibles para su clí-nica. Evidentemente en estos casos, los quehemos recibido en nuestro servicio para contras-tar las dos técnicas, siempre hubo correlación dela IFI, visualización directa y resultados de la PCR.En los grupos descritos más arriba, las muestrasfueron remitidas por que no se observaron formasde leishmanias en los aspirados de médula ósea.

Obtención de DNA a partir de sangre, exuda-do de ganglio linfático y médula ósea.El ONA se extrae mediante una técnica rápida (4horas), basada en la digestión con proteinasa K yel detergente Tritón X-lOO. El proceso es elsiguiente:1º. Disolución de 200 ul de muestra en un mI.de NE (CINa: 0,585 gr; EDTA: 3,725 gr; hasta 11de H20; pH: 7.5).2º. Agitar y centrifugar a 13.000 rpm duranteun minuto y retirar el sobrenadante (repetir tresveces). El precipitado obtenido se agita enérgica-mente.3º. Añadir al precipitado 400 mi de una solu-ción que contiene Proteinasa K (2x10-3 gr/ml.)4º. Mantener a 62 "C durante 1h. 30 m.5º. Añadir un volumen de Fenal-Cloroformoisoamílico. Agitar y centrifugar a 13.000 r.p.m.durante 10 m.6º. Recoger la fase acuosa y añadir un 10% deAcNA 3M y 2 volúmenes de etanol absoluto.Mantener a -70 "C durante 5 m.7º. Centrifugar a 13.000 r.p.m. durante 5 m. ytras retirar el sobrenadante, lavar con etanol al70%, centrifugando un minuto.8º. Secar la muestra (normalmente con SpeedVac), y restaurar en distintas cantidades de TE(1,208 gr. de Tris ClH, 0,372 gr. EDTA en 11deH20, Ph 8).9º. Conservar congelado a -30 oc.Búsqueda de secuencias de los distintos genescandidatos en las bases de datos.Para la búsqueda de las posibles secuencias deONA, que permitan su utilización para el diag-nóstico de Leishmaniosis canina, se ha comenza-do el estudio de aquellas que presentan un mayorgrado de homología entre las distintas especies deLeishmania.El estudio se realizó en las bases de datos EMBy Gen Bank, cuya dirección en internet es:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.

Diseño de los primers.A partir de las secuencias obtenidas en las basesde datos, y la información obtenida en la biblio-grafía (Mathis y Deplazes, 1995), se eligió laamplificación de una zona del gen que codifica lasubunidad pequeña del RNAr (SSUrRN). Los pri-mers elegidos fueron:Pr22l: GGT TCC TTT CCT GAT TIA CGPr332: GGC CGG TAA AGG CCG AAT AG

Amplificación del DNA con los primers dise-ñados.La reacción de amplificación fue llevada a cabomediante un termociclador 9600 Perkin Elmer. Elvolumen de la muestra empleado fue de 15 mI.Como parámetros más importantes se buscaránlas condiciones de tiempo y temperatura que nospermita la obtención de bandas nítidas e intensas.Se utilizaron 35 ciclos para realizar la amplifica-ción:

94 °C__5'

94 °C__l'60 °C__l'72 °C__l'

35 ciclos

72 °C__lO'4 °C_ hasta recoger la muestra

Análisis de los fragmentos amplificados.A partir de un volumen de 15 mi de productoamplificado se realizó electroforesis horizontal engel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de eti-dio, para la visualización posterior con UVAde losfragmentos obtenidos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.Para detectar la presencia de Leishmania spp,en distintas muestras clínicas de perros sospecho-sos de padecer esta enfermedad, se ha utilizado latécnica PCR, amplificando para ello un fragmen-to del gen SSU rRNA, repetido más de 100 vecesen el genoma del parásito (Uliana y cols. 1991;Van Eys y cols., 1992). Concretamente el frag-mento obtenido en el caso de detectar la presen-cia del parásito en el huésped, fué de un tamañode 603 bp (véase Fig. 1).Es necesario indicar que paralelamente y parasaber si el fragmento amplificado de 603bp, se

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4- 603 bp

123 4 5 6 7Fig. 1. Dianóstico por peR de Leishmaniosis canina. Detección de pro-ductos amplificados después de una electroforesis horizontal en gel de agarosay tinción con Bromuro de etidio. El fragmento de 603 bp. corresponde al ONAamplificado de Leishmania. Línea 1: marcador de talla: BRL 1Kb. Línea 2:Control interno positivo (animal enfermo). Línea 3: Muestra 1 (positiva a Leish-mania). Línea 4: Muestra 2 (negativa a Leishmania). Línea 5: Muestra 3 (posi-tiva a Leishmania). Línea 6: Control interno negativo (animal sano). Línea 7:Muestra sin ONA.

corresponde realmente con fragmentos de Leish-mania, se realizó digestión del mismo con distin-tas enzimas de restricción, analizando los distintosmodelos obtenidos y comparándolos con labibliografía existente. Concretamente cuando sedigiere con la enzima de restricción Hae3, el frag-mento de 603bp se digiere en 6 fragmentos detallas: 281bp, 24bp, 211bp, 4bp, 71bp y 13bp.Logicamente en un gel de agarosa solamente losfragmentos más grandes se pueden visualizar(véase Fig. 2). Tras comprobar que la banda obte-nida corresponde específicamente a Leishmania ypara evitar falsos positivos, en cada diagnóstico seincluyó el análisis de un animal sano y un controlnegativo (muestra sin ONA), así como un controlpositivo de amplificación (animal enfermo). Entodas la muestras negativas (ausencia del parásito)se realizó la comprobación de existencia de ONA,como método de contro!.La menor sensibilidad de la técnica 'se observócuando la muestra es sangre periférica, tal vez porel limitado tiempo de permanencia del parásito ensangre. Ello nos indica que esta muestra no esadecuada para el diagnóstico, esta observación esválida para todos los grupos.En todos los casos en los que' se utilizó comomaterial biológico médula ósea y siempre que elanálisis microscópico fue positivo, el diagnósticopor PCR también lo fue. Igualmente, en más deun 95% de los casos de animales sospechosos depadecer la enfermedad, así cómo en animales tra-tados previamente frente a leishmaniosis, el diag-nóstico por PCR determinó la presencia del pará-sito, a pesar de que el bajo grado de parasitosishabía impedido la visualización de Leishmanias,

~71bp

1 2 3 4 5

Fig. 2. Prueba de que el fragmento de 603 bp. coresponte con el genSSU rRNA de Leishmania. Patrones de restricción obtenidos con la enzimaHae 3, tras la amplificación de fragmento de 603 bp del gen SSU rRNA deLeishmania. Línea 1: marcador de talla: BRL 1Kb. Línea 2: fragmento ampli-ficado sin digerir (talla: 603 bp). Línea 3,4 y 5: Amplificación digerida con Hae(fragmentos de 281 bp, 211 bp y 71 bp).

en el caso de frotis medular. Esta circunstancia esfrecuente encontrarla en el grupo C, animales tra-tados, en los que tras el tratamiento, si el clínicose deja llevar por los resultados de la IFIy la visua-lización directa de leishmania en muestras demédula ósea, puede dar al animal como curado,al encontrar títulos bajos y no observar Leishma-nias en la médula, varios de los casos analizadosde este grupo presentaron esta circunstancia y encambio dieron positivos en el PCR de muestrasmedulares. No obstante, hemos encontrado ani-males tratados que llegan a ser PCR negativosunos meses después del tratamiento: ¿Curados óportadores asintomáticos? ¿Depende del protoco-lo utilizado?¿Está en relación con la respuestainmunitaria de cada animal y en función del esta-día evolutivo de la enfermedad en el momento deiniciar el tratamiento? ¿Puede ocurrir que en zonasendémicas el animal se reinfeste? Estas son pre-guntas cuya respuesta no es fácil, la opinión delos clínicos está dividida y que requiere el segui-miento a largo plazo de un mayor número decasos. De los 10 casos estudiados 7 dieron nega-tivos por PCR a los 3 meses, y en 4 de estos 7casos la PCR volvió a ser positiva al año de habersuprimido el tratamiento.En muestras con títulos serológicos de 1/60(grupo A) se obtuvieron diagnósticos positivos porPCR (8 animales) y también negativos (12 anima-les). Los casos que incluimos en este grupo fueronaquellos casos en los que la ausencia de síntomaspodía inclinar al clínico hacia la negatividad, óbien al propietario se le había ofrecido el iniciarun protocolo de tratamiento en base a una posi-ble positividad. En ambos supuestos se decidió en

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todos los casos contrastar con la PCR para ase-gurar el diagnóstico. Otra alternativa sería esperarun periodo de tiempo y volver a repetir la serolo-gía; no sugerimos esta opción pues en nuestrasapreciaciones personales hemos visto como enalgunos casos, en el periodo de espera, cuadrosviscerales sin síntomas dérmicos han avanzado losuficiente como para sugerir la eutanasia del ani-mal (por desarrollo principalmente de insuficien-cias renales graves). Tanto en un supuesto comoen otro, la PCR resuelve las dudas en cuestión dehoras evitando errores lamentables.En el grupo S, los cachorros tenían título scro-lógico alto, pero fueron descartados de padecer laenfermedad tras el diagnóstico por PCR, que fuenegativo en todos ellos. Este resultado es debidoa la presencia de anticuerpos provenientes de lamadre en el cachorro, sin existir el agente etioló-gico en los mismos. La combinación de IFI - PCRen este caso diferencia si el animal es portador delagente etiológico y tiene anticuerpos ó, como enlos cachorros estudiados, hay anticuerpos pero noagente etiológico.Se esta realizando en este momento el estudiode la especificidad y sensibilidad de la técnica PCRcomparada con el resto de métodos de diagnósti-co, utilizados de forma habitual. Para ello se pro-

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cesarán los sueros por Inmunofluorescencia Indi-recta (IFI)y Aglutinación Directa (AD) y una vezanalizadas las biopsias de nódulo linfático y médu-la ósea, además de la sangre, se analizará estadís-ticamente la concordancia de los resultados decada una de estas pruebas con los resultados de laPCR.

CONCLUSIÓN FINAL.Por la simplicidad, economía, tiempo, rapidez,sensibilidad de la técnica, se propone como méto-do de diagnóstico de leishmaniosis canina, elmétodo PCR a partir de exudado de ganglio lin-fático o biopsia de médula ósea, sin descartar elposible uso de otras muestras como piel hastaahora no analizadas. Las muestras de sangre peri-férica no son adecuadas para este tipo de test.Hemos presentado diferentes supuestos en losque la inclusión de la PCR en el diagnóstico deleishmaniasis permite al clínico ganar tiempo parainstaurar un tratamiento más precoz, hacer elseguimiento del animal antes, durante y despuésdel mismo, y evitar en otros casos errores diag-nósticos, y así, situaciones embarazosas.

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