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DIAGNOSI DELLE ANEMIE EMOLITICHE:
CORSO TEORICO PRATICO
DIAGNOSI DELLE ANEMIE EMOLITICHE:
CORSO TEORICO PRATICO
La diagnosi molecolare nelle anemie emolitiche congenite
Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico
Paola Bianchi
1-2 Marzo 2018
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� Valore aggiunto della diagnosi molecolare
� Contributo delle nuove tecnologie di NGS
� Indicazioni delle indagini molecolari nelle singole patologie
� La nostra esperienza
Summary
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MUTAZIONI MISSENSE
c.48T>A p.Arg19Trp (R19W)
MUTAZIONI NONSENSE
Stop codon c.2152 C>T p.Arg718X (R718X)
Ins/Del frameshift c.639-644del p.Gly215GlyfsX5
Mutazioni di splicing c. 318 +1g>a
c.319 -1t>g
Caratterizzazione molecolare: tipo di mutazioni
VARIANTI IPOMORFICHE c.309+102 T>A
MUTAZIONI IN REGIONI REGOLATORIE
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Caratterizzazione molecolare: metodi di indagine
NEXT GENERATION SEQUENCING:NEXT GENERATION SEQUENCING:
TARGETED SEQUENCING PANELS TARGETED SEQUENCING PANELS
WHOLE EXOME SEQUENCING (WES)WHOLE EXOME SEQUENCING (WES)
CLINICAL EXOME SEQUENCING (CES)CLINICAL EXOME SEQUENCING (CES)
WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS) WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS)
SEQUENZIAMENTO MEDIANTE SANGER SEQUENZIAMENTO MEDIANTE SANGER
RICERCA RICERCA DIDI MUTAZIONI NOTEMUTAZIONI NOTE
??
Mutazioni frequenti
Studi familiari
Diagnosi prenatale
STUDI STUDI DIDI ESPRESSIONE: RQESPRESSIONE: RQ--PCR, PCR, dPCRdPCR
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DIFETTI DI MEMBRANA
• Differenti geni coinvolti
• La maggior parte delle mutazioni sono «private»
• Mutazioni localizzate in differenti posizioni di uno stesso gene possono
esitare in patologie differenti ( HS, HE, HSt, SAO)
Tutti questi fattori contribuiscono alla notevole eterogeneita’ fenotipica della
presentazione clinicaBianchi, Mohandas, 2017
“Consideration for molecular analysis is a case by case decision,
which is often the last option in a diagnostic plan for the
patient.
A general approach is that molecular analysis of membrane
protein genes for HS and HE does not add extra information
for the patient whose family is already known to have the
red cell disorder.”
A recessive mode of inheritance, and a case of suspected de novo
mutation or compound heterozygosity do warrant further
investigation using DNA sequencing.”
King et al, 2015
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Low expression αααα spectrin allels
(Sp αααα LEPRA)
Spαααα LEPRA + HS mutations
Severe HS phenotype
Coinheritance of spectrin mutations with low-expression polimorphic
alleles (i.e. SpαLEPRA) may worsen the clinical presentation and
explains in some cases intra-family variability.
RICERCA DI ALLELI A BASSA ESPRESSIONE SPETTRINA
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ELLISSOCITOSI EREDITARIA
� Hereditary pyropoikilocytosis (HPP)
- Severe hemolytic anemia – trasfusion dependency
- Altered morphology, heat lability
- Recent evidence implies that HPP is a severe form of HE
- Within a family, HE and HPP may both be present
Caused by:
coinheritance of a low-expression allele for α-spectrin
compound heterozygosity for two HE alleles
HE homozygosity.
Low expression α spectrin allels (Sp α Lely)
Alpha LELY in trans + HE Sp mutations
Hereditary Pyropoikilocytosis
αSp low HE Sp
HPP: αSp low /HESp
HEALTHY MILD HE
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Sequenziamento diretto mediante Sanger (ABI 310)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 181 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
LRPK gene (erythrocytic)
Genomic DNA
GPI gene (ubiquitous)
RNA RT PCR
One temperature
PCR amplification step
Direct sequencing
PK deficiencyExon 11
c. 1456T Arg486Trp
c. 1529A Arg 510 Gln30/40 % of mutated alleles
Frequent mutations
TPI deficiencyExon 3
c. 315C Glu104Asp
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DIFETTI ENZIMATICI
RBC ENZYME DEFECTS ESONI N. PAZIENTI
CARATTERIZZATI
AK1 NM_000476 7 3
CYB5R3 NM_000398 9 27
GPI NM_000175.3 18 12
NT5C3A NM_016489.12 10 19
PGK1 NM_000291.3 11 1
PKLR NM_000298.5 12 180
TPI1 NM_000365.5 7 7
IDENITIFICAZIONE CARENZA ENZIMATICA
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE
Dosaggio biochimico Caratterizzazione molecolare
Rapidita’ di risposta (2-10 gg) Puo’ discriminare tra eterozigote e omozigoti/doppi
eterozigoti
Economico (costo 6-40€) Non risente dell’interferenza da trasfusione
Disponibilita’ in differenti
centri
Non risente della reticolocitosi/contaminazione leucociti
/piastrine
Indicato nei neonati (piccole quantita’ di materiale
richiesto)
Effettuabile con campioni sottoposti a lunghe spedizioni
Permette una diagnosi prenatale
Nuove terapie? Terapia genica?
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
SEC23BSEC23B
Missense
Frameshift/stop
Splicing
Large deletion
Del 1aa, ins/del
Znf btrunk bsheet helical gelsolin
1 57 98 126 392 403 506 521 621 631 720 767
ANEMIA DISERITROPOIETICA CONGENITA TIPO II
Bianchi et al 2009
Schwartz, et al 2009
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Diagnosi molecolare di CDAII
Identificazione di casi atipici di CDAII
Basi patogenetiche della CDAII
Abbassamento dell’eta’ alla diagnosiCorrelazione genotipo-fenotipo
Pellegrin S, Haydn-Smith K, O’Neil L, Hawley BR, Heesom K, Fermo E,
Bianchi P, Toye AM In press, 2018
Nuove terapie?
Sec23A
Sec23B
Sec23A
Sec23B
CDAII
CDAII
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CDAN1 C15orf41 SEC23B KIF23 KLF
ANEMIE DISERITROPOIETICHE CONGENITE (CDA)
Heterogeneous group of hemolytic anemias characterized by ineffective erythropoiesis and by
distinct morphological abnormalities of erythroblasts in the bone marrow.
CDAN I C15orf41 SEC23B KIF23 KLF1
Heimpel H, 2003
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PIEZO1 SLC4A1 RhAG GLUT1
DIFETTI DELLA PERMEABILITADIFETTI DELLA PERMEABILITADIFETTI DELLA PERMEABILITADIFETTI DELLA PERMEABILITA’’’’ DI MEMBRANA DI MEMBRANA DI MEMBRANA DI MEMBRANA STOMATOCITOSI EREDITARIASTOMATOCITOSI EREDITARIASTOMATOCITOSI EREDITARIASTOMATOCITOSI EREDITARIA
KCNN4
Dehydrated
Stomatocytosis
Overhydrated
Stomatocytosis
Cryohydrocytosis SAO, Sphero-stomatocytosis
ABCB6
Familial
pseudoiperkaliemia
Overhydrated stomatocytosis Dehydrated stomatocytosis
Badens &Guizouran, 2016
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Evoluzione di sequenziatori per NGS
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Analisi biostatistica!
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Patogenica Benigna
PVS1 Very strong BA1 Stand alone
PS1-4 Strong BS1-4 Strong
PM1-6 Moderate BP 1-7 Supporting
PP1-5 Supporting
Criteri per classificare varianti patogenetiche
2015
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Richards et al , 2015
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Next generation sequencing genes panel
� Utile nello studio molecolare e nella diagnosi dei difetti della
membrana eritrocitaria
� Altre anemie emolitiche rare
� Particolarmente utile per chiarire le basi molecolari di pazienti
con forme atipiche
� Utile nei pazienti trasfusi
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Piattaforma NGS anemie emolitiche congenite
Pabinger, Brief bioinform 2013
1) Disegno della Piattaforma regione target 1 kb to 5 Mb
Agilent’s SureDesign tool
www.agilent.com/genomics/suredesign
2) Preparazione di un Kit
3) The HaloPlex HS Target Enrichment System amplifica
migliaia di regioni target nella stessa reazione
Il DNA digerito viene ibridizzato con sonde indicizzate
permettendo di analizzare contemporaneamente un
pool di differenti campioni
I campioni contengono anche delle sequenze «barcode»
che permettono di tracciare i singoli amplificati durante
il sequenziamento
Amplificazione mediante PCR
HaloPlex HSTarget Enrichment System Agilent
Sequenziamento: My seq Illumina
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RBC MEMBRANE DEFECTS
Gene Sequenza riferimento
ANK1 NM_000037.3
SPTA1 NM_003126.2
SPTB NM_000347.5
EPB41 NM_004437.3
EPB42 NM_000119.2
SLC4A1 NM_000342.3
ABCB6 NM_005689
PIEZO1 NM_001142864.2
RHAG NM_000324.2
KCNN4 NM_002250
RBC ENZYME DEFECTS
AK1 NM_000476
ALDOA NM_000034.3
BPGM NM_001293085
CYB5R3 NM_000398
ENO1 NM_001428.3
GPI NM_000175.3
GPX1 NM_000581.2
GCLC NM_001498.3
GCLM NM_001308253
GSR NM_000637
GSS NM_000178
G6PD NM_001042351.2
HK1 NM_033497
NT5C3A NM_016489.12
PFKM NM_000289.5
PFKL NM_001002021
PGK1 NM_000291.3
PGM1 NM_001172819
PKLR NM_000298.5
TPI1 NM_000365.5
CONGENIOTAL DYSERYTRHOPOIETIC ANEMIAS
CDAN1 NM_138477.2
C15orf41 NM_001130010.1
SEC23B NM_006363.4
KIF23 NM_138555.2
GATA1 NM_002049.3
KLF1 NM_006563.3
Amplicon Summary
Total Amplicons: 13974
Total Target Bases Analyzable: 357.443 kbp
Total Sequenceable Design Size: 603.046 kbp
Target Coverage: 99.68 %
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Fermo, Bianchi, unpublished 2018
Enzimopatie
2 casi LRPK
1 caso GPI
1 caso TPI1
1 caso CYB5R3
Difetti di membrana
7 casi PIEZO1
1 caso KCNN4
1 caso ABCG8
Chiarita l’eterogenita’
fenotipica in 3 famiglie HS/HE
CDAs
1 caso SEC23B
1 famiglia ALAS2
53 casi anemia emolitica congenita
40 famiglie
33 casi
no diagnosi dopo
indagini estese
12 casi
indagini non effettuabili
per trasfusioni recenti
spedizione dei campioni
7 casi
3 famiglie con
difetti di membrana
Piattaforma NGS anemie emolitiche congenite
•Identificato il difetto nel 40% dei pazienti unrelated
•8 mutazioni note; 15 nuove varianti
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n.a. n.a.
F11-817
SPTA1: L154F/wt
SLC4A1 : S510R/wt
EMA-binding: ↓↓
SDS-Page: spectrin ↓
F11- 816
SPTA1: L154F/wt
EMA-binding: Norm
SDS-Page: Norm
HS/HE HE
F13 -723* F13-776
Hb (g/dL) 13.5 12.3
Retic (abs n.) 176 183
MCV (fL) 108 97.3
Ferritin 817 181
Osm fragility ↓ ↓
Ema-binding ↓ ↓ n.a.
SDS-PAGE Bd3 38% ↓ Bd3 17 %↓
Transfusions Tx until spl No
Splenectomy Yes 6yr No
Other sympt. Priapism No
* Post splenectomy
F13-723
SLC4A1
Abnormal splicing
+ R490H
+ QPLLPQ186Q
n.a.F13-776
SLC4A1
+ R490H
n.a.HS
HS
Basi molecolari dei difetti di membrana
Fermo, Bianchi, unpublished 2018
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Whole Exome Sequencing:
identificazione di geni non noti associati alle anemie emolitiche
Exome Sequencing: sequenziamento delle regioni codificanti (esoni) dei geni di un
individuo.
-Whole Exome Sequencing (WES), che comprende tutti i 20.000 e passa geni del
genoma umano,
-Clinical Exome Sequencing (CES), che comprende tutti i geni fino ad ora noti per
essere associati a malattia (circa 6.000).
La regione codificante rappresenta soltanto l’1% di tutto il genoma, ma si stima
che fino all’85% di tutte le mutazioni patogene siano contenute in questa regione.
INDICATO PER MALATTIE MONOGENICHE
WES complete family
Father/mother/proband/
healthy brother (trios) Enrichment
Reads
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Presso: Genomnia s.r.l, CNAG Barcellona, Boston Childrens’ Hospital
Preparazione library: 3μg gDNA - SureSelect XT Target Enrichment system for
SOLiD 5500 Multiplexed Sequencing, (Agilent Technologies).
Capture esoni: SureSelect XT Human All Exon V5 kit (Agilent).
Sequenziamento: Agilent SureSelect AllExon V5
Life Technolgies SOLiD 5500xl Genetic Analysis Sequencer
Conferma mutazione identificata by Sanger sequencing (ABI PRISM 310 Genetic
Analyzer, Applied Biosystems) using Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit.
6 pazienti carenze enzimatiche ma no mutazioni nei geni specifici >analisi risultati
1 paziente con CDA atipica
1 famiglia 5 soggetti con anemia undiagnosed > Gardos
2 sorelle gemelle no genitori con cda atipica > no risultati
1 famiglia 4 soggetti con anemia undiagnosed > CDA Atipica
1 famiglia 4 soggetti con anemia undiagnosed > no risultati
Esperienza WES
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PARP4/vPARP
Poly (ADP-ribose) polymerase family
1) Famiglia di enzimi coinvolti nell’omeostasi cellular, trascrizione
del DNA, regolazione ciclo cellular, riparazione DNA
2) PARP4 (vault protein) drug resistance, trasporti nucleo-
citoplasma, regolazione signaling cellulare.
3) Tumori da difetti di riparazione del DNA (BRCA tumors) sono
sensibili agli inibit.ori di PARP, risultando in instabilita’
genomica e cell death
Ash Toye
Bristol University
Knockdown
Functional studies
Vijay Sankaran
Boston childrens Hospital
WES / Knockdown
Bery Paw
Harvard Inst. Medicine
Zebrafish model
No storia famigliare per difetti di membrana/ anemie emoliticheDiagnosi di HSSDS-PAGE: Deglicosilazione banda 3 > Diagnosi CDAIINO mutazioni in SEC23B > Diagnosi CDAII atipica
WES
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BM Morphology
Erythroid hyperplasia (myeloid: erythroid ratio = 0.6) with binuclearity,
megaloblastic changes, occasional cytoplasmic bridging between cells at
different stage of maturation
Bianchi et al, ASH 2015
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*
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Electron microscopy
Bianchi et al, ASH 2015
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PARP4 Is Necessary for Human Erythroid Cell Growth, Does Not Have Major Effect on Erythroid Specification, and increase apoptosis
Day 14 of differentiation
Day 14 of differentiation
Bianchi et al, ASH 2015
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Morpholino-Mediated Knockdown of PARP4 Zebrafish Orthologue Causes a Mild Anemia
48 h.p.f.
Bianchi et al, ASH 2015
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Il vecchio e il nuovo….
Studio molecolare 1-2 settimane
281.46 €
Dosaggio enzimatico
4 h
8.26 €
Ngs platforms / exome seq2- 4 settimane + analisi validazione dati
Diagnosi
Informazioni
cliniche
Evidenze
funzionali
Caratterizzazione
molecolare