Identifikasi Kemurnian Jus Jeruk dengan Metode Denaturing Gradient Gel

Elektroforesis (DGGE)

Oleh :WIJAYA SANTOSO

J2C007050

JURUSAN KIMIAFAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANGMEI, 2012

Sumber diambil dari Adulteration Identification of Citrus Juice by DenaturingGradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Department of Horticulture, National Taiwan University, 1, Sec. 4, Roosevelt Rd., Taipei City 106, Taiwan, R.O.C.(Received: January 20, 2005; Accepted: November 14, 2005)

Latar Belakang

• Jus jeruk termasuk termasuk jus dengan produksi besar di dunia.

• Ekspor konsentrat jus jeruk tahun 2002 = US $ 6,2 miliar dan

output terus meningkat sebesar 50% dari tahun 2000 - 2002.

(menurut FAO)

• Pemalsuan seringkali terjadi dan turut menimbulkan masalah

kesehatan pada konsumen.

• Metode pemalsuan untuk meniru profil jus jeruk murni, antara

lain:

• penambahan air

• penggunaan bahan berkualitas rendah

• pulp wash

• Pewarna

• aditif lainnya baik

Metode pendeteksi kemurnian jus yang telah dikembangkan:

•HPLC

•elektroforesis kapiler

•spektroskopi massa pirolisis

Latar Belakang

Tidak Efisien, karena analisis terhadap

komponen tunggal jus memakan waktu

Teknik DGGE, dapat menganalisis secara sekaligus beberapa sampel yang ingin

diuji kemurniannya.

Bagaimana DGGE bekerja?

Denaturing Gradient Gel Elektroforesis (DGGE) memisahkan amplifikasi PCR dengan panjang yang sama dengan komposisi nukleotida yang berbeda pada gel gradien denaturing.

Perbedaan antara DGGE dan identifikasi DNA biasa:-DGGE menggunakan gel poliakrilamida yang mampu memperangkap DNA dengan ukuran lebih kecil, dibanding dengan agarosa biasa.-Pada DGGE, identifikasi didasarkan pada hasil PCR potongan DNA dengan panjang untaian yang sama. Hasil akan tampak dalam gradien pita hasil PCR.

Jenis sistem DGGE:DGGE tegak lurusDGGE paralel,

Pembeda antara keduanya:arah gradien denaturant dan

elektroforesis

METODOLOGI

Metodologi

Terbagi atas:1. Material tanaman dan ekstraksi DNA2. Amplifikasi dan Sequencing 3. Oligonukleotida Primer dan Kondisi PCR4. Denaturing Elektroforesis Gel Gradient

1. Material tanaman dan ekstraksi DNA

Genotip jeruk yang digunakan:

Sumber : Pusat Sumber Daya Nasional Tanaman Genetik Taiwan

Untuk sekuensing, total DNA diisolasi dari daun muda. Untuk DGGE, DNA diekstraksi dari jus jeruk sesuai metode.

golongan jeruk (Citrus sinensis (L.) Osbeck):

• Liucheng• Nanas• Valencia• Hamlin• Parson • Navel

golongan jeruk mandarin (Citrus reticulata Blanco):

• Ponkan• Tankan• Pembibitan Satsuma• Murcoot.

2. Amplifikasi dan Sequencing

cpDNA dari genotipe diamplifikasi menggunakan sepasang primer universal.

Komposisi bahan untuk proses PCR (total volume 25 uL): 200 ng dari template DNA 10 × penyangga 6,25 pmoles / satuan 0,1 mM dNTP 0,5 Satuan DynaZyme

Parameter amplifikasi reaksi: 1 siklus (3 menit) pada 96 ° C 30 siklus (1 detik) pada 96 ° C 10 detik pada 54 ° C 20 detik pada 72 ° C Siklus akhir (10 menit) pada 72 ° C.

Sequencer digenerasi menggunakan automated sequencer ABI.

3. Oligonukleotida Primer dan Kondisi PCR

Primer dipasok oleh Mission Biotech Co. Ltd. (Taiwan).Pengenceran Primer

konsentrasi akhir = 100 umol / L disimpan pada -20 ° C hingga digunakan

Pasangan primer (B49317 dan A50272) digunakan untuk memperkuat cpDNA.

Pasangan primer kedua trnL3/trnF3 (terancang khusus DGGE) untuk memperkuat pembedaan fragmen antara jeruk biasa dan jeruk mandarin.

Parameter reaksi amplifikasi adalah: 1 siklus selama 3 menit pada 96 ° C 35 siklus selama 1 detik pada 96 ° C 10 detik pada 52 ° C 20 detik pada 72 ° C siklus akhir 10 menit pada 72 ° C

4. Denaturing Elektroforesis Gel Gradient

Penuangan 15 ~ 35% denaturant diantara pelat kaca

Pengaturan jarak teflon spacer (0,75 mm)Pengaturan lebar sampel sumur 8 mmPengaliran gel pada DCodeTM Universal Mutation

Detection System (Bio-Rad, USA)Perendaman dalam larutan penyangga (20 mM

natrium asetat, 1 mM EDTA, 40 mM Tris-asetat, pH 7,4)

Pertahanan kondisi pada suhu 60 oCelektroforesis selama 3 jam pada 150 VPewarnaan dan pencetakan gel dengan etidium bromida

Gel poliakrilamida 10% (25 ml)

Hasil

HASIL

Pasangan primer trnL3/trnF3 (Tabel 1) telah dirancang untuk memperkuat fragmen 384 pb dari semua jeruk mandarin dan sampel.

Untuk memastikan spesifitas primer, sampel jeruk tersebut, jagung dan tebu diuji dengan PCR•terbukti tidak ada produk PCR selain jeruk yang terdeteksi (Gambar 3).•Jagung dan tebu digunakan untuk memastikan DNA masing-masing tidak mengganggu hasil penelitian.•Hasil ini menunjukkan bahwa pasangan primer trnL3/trnF3 hanya berlaku khusus jeruk dan dapat memperkuat variabel pada semua sample jeruk.

DGGE dijalankan secara tegak lurus, untuk mengoptimalkan kondisi elektroforesis

Gambar 4 menunjukkan tegak lurusnya DGGE dengan gradien denaturing mulai dari 0 hingga 100%. Kisaran yang optimal untuk memisahkan jeruk biasa dan jeruk mandarin adalah antara 15 dan 35%.

Kisaran ini diaplikasikan pada DGGE paralel untuk mengidentifikasi dan jeruk mandarin.

Fragmen DNA jeruk mandarin dan terletak di lokasi yang berbeda pada denaturing gradient gel paralel dengan perbedaan 6-bp antara jeruk dan mandarin.

Larutan DNA jeruk dicampur dengan larutan DNA mandarin pada rasio berbeda untuk menjalankan DGGE paralel

Dua pola pita yang muncul: tipe heteroduplex dan homoduplex

Jenis pita molekul heteroduplex teramati ketika ada lebih dari satu DNA pada PCR yang sama. Heteroduplex memiliki ketidakcocokan dalam DNA untai ganda yang menyebabkan distorsi, memiliki efek destabilisasi dan menyebabkan DNA terdenaturasi pada konsentrasi denaturan rendah.

Migrasi pita heteroduplex lebih lambat dibanding pita homoduplex karena ukurannya lebih besar dibanding molekul homoduplex.

Rasio peningkatan konsentrasi DNA mandarin hingga jeruk biasa disesuaikan dengan peningkatan dalam molekul heteroduplex. Konsentrasi molekul heteroduplex memuncak ketika terdapat 25% DNA jeruk dalam larutan (Gambar 6).

Gambar ini menunjukkan hasil DGGE paralel untuk larutan DNA jeruk yang dicampur dengan larutan DNA jeruk lainnya pada persentase yang berbeda.

Semua sampel menunjukkan pola pita hanya muncul pada homoduplex.

jenis pita dari molekul heteroduplex hanya muncul ketika urutan DNA dari sampel berbeda.

KESIMPULANStudi ini menunjukkan bahwa trnL intron dari

kloroplas DNA merupakan penanda yang berguna untuk membedakan jenis jeruk (khususnya jeruk mandarin). Dalam studi ini, pasangan primer dirancang dalam urutan variabel, dan hasil studi ditentukan oleh penampakan pola pita.

Dengan penambahan gradien denaturing pada elektroforesis gel, produk PCR dengan ukuran fragmen yang sama dan urutan DNA yang berbeda dapat diidentifikasi dalam satu kali elektroforesis.

Metode ini efektif dalam pendeteksian kemurnian pada produk pangan olahan jeruk.

Terima Kasih