development of immunological test kit for the detection of porcine · 2019-08-01 ·...

บทความวจย

วารสารวทยาศาสตรบรพา ปท 23 (ฉบบท 3) กนยายน – ธนวาคม พ.ศ. 2561 1655

การพฒนาวธวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวยอนภาคนาโนเหลกออกไซด Development of a Method for Antioxidant Activity Analysis

Using Iron Oxide Nanoparticles

พชราภรณ ทองสข และ ยภาพร สมนอย* Pacharaporn Thongsuk and Yupaporn Sameenoi*

ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา Department of Chemistry, Faculty of Science, Burapha University

Received : 15 May 2018 Accepted : 23 October 2018

Published online : 20 November 2018

บทคดยอ งานวจยนเปนครงแรกทไดพฒนาอนภาคนาโนเหลกออกไซดในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระ หลกการการ

วเคราะหอาศยความสามารถในการดกจบอนมลอสระทเกดจากปฏกรยาของอนภาคนาโนเหลกออกไซดและไฮโดรเจนเปอรออกไซด ซงโดยปกตแลวท าปฏกรยากบเตตระเมทลเบนซดนท าใหเกดการเปลยนแปลงส ในสภาวะทมสารตานอนมลอสระ อนมลอสระจะถกดกจบจงท าใหสของเตตระเมทลเบนซดนลดลงซงจะแปรผนตรงกบปรมาณฤทธตานอนมลอสระ เรมตนศกษาสภาวะทเหมาะสม ไดแก ความเขมขนของอนภาคนาโนเหลกออกไซด และเวลาในการเกดปฏกรยา จากนนน าสภาวะทเหมาะสมมาวเคราะหฤทธตานอนมลอสระของสารตานอนมลอสระมาตรฐานแกลลกเพอศกษาคาทางการวเคราะหและปฏกรยาของวธวเคราะหทพฒนาขน พบวาใหกราฟมาตรฐานเปนเสนตรงในชวงความเขมขน 0.2 – 0.8 mM ขดจ ากดการตรวจวด 0.2 mM และมความสามารถการท าซ าทความเขมขน 0.2, 0.5 and 0.6 mM ทมรอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพนธอยในชวง 6.6 - 16.1 % (n = 5) หลงจากนนท าการเปรยบเทยบวธทพฒนาขนกบวธดพพเอชดงเดม โดยวเคราะหฤทธตานอนมลอสระในตวอยางน าผลไมทงหมด 7 ชนด พบวาใหคาสอดคลองกนแสดงใหเหนวาวธทพฒนาขนมแนวโนมใชเปนทางเลอกในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระในตวอยางจรงได

ค าส าคญ : อนภาคนาโนเหลกออกไซด, สารตานอนมลอสระ, สมบตเสมอนเอนไซมเปอรออกซเดส *Corresponding author. E-mail : [email protected]



Abstract This work presents an iron oxide nanoparticles (Fe3O4 NPs) for antioxidant activity analysis for the first

time. The analysis of antioxidant activity is based on quenching ability of the antioxidant to the reactive oxygen species produced from the reaction of Fe3O4 NPs and H2O2 which are normally react with 3,3’,5,5’tetramethylbenzidine (TMB) resulting in color change. In the presence of antioxidant, the reactive oxygen species are captured resulting in lower degree of color intensity of TMB which is proportional to the antioxidant activity. Firstly, Fe3O4 NPs concentration and reaction time were optimized. Using optimal condition, gallic acid, used as an antioxidant standard, was analyzed using the developed method to study the analytical performance and antioxidant behavior. The linearity was in the concentration range of 0.2-0.8 mM with a limit of detection of 0.2 mM. The reproducibility from the analysis of GA at concentrations of 0.2, 0.5 and 0.6 mM was observed with the relative standard deviation (% RSD) in the range of 6.6 - 16.1 % (n = 5). Finally, the developed method was validated against the traditional DPPH assay from antioxidant activity analysis of 7 fruit samples. The results showed that the antioxidant activity obtained from the two methods were well correlated indicating that the developed method is promising to be an alternative method for antioxidant activity analysis in real samples.

Keywords : iron oxide nanoparticles, antioxidants, peroxidase-like activity

บทน า

อนมลอสระ (free radicals) หมายถง สารทมอเลกตรอนโดดเดยว (unpaired electron) ในอะตอมหรอโมเลกล โดยสวนมากจะพบไดในกระบวนการเผาผลาญอาหาร หรอจากกระบวนการเมแทบอลซม (metabolism) ตางๆ ของเซลล (Karolina et al., 2016) นอกจากนปจจยจากสงแวดลอมภายนอก ไดแก โอโซน (ozone) รงสยว (UV- ray) ควนบหร และควนจากทอไอเสยรถยนต เปนตน (Scott et al., 2004) มกเกดโปร-ออกซแดนต (pro-oxidant) ขนไดตลอดเวลา ซงโปรออกซแดนตทส าคญคอ สารประกอบออกซเจนวองไวสง (reactive oxygen species, ROS) โดยมการเคลอนยายอเลกตรอนออกจากโมเลกลของออกซเจน ท าใหอเลกตรอนในโมเลกลออกซเจนไมสมดลกลายเปนอนมลอสระ มความวองไวในการเขาท าปฏกรยามาก และสามารถดงอเลกตรอนจากโมเลกลอนมาแทนทอเลกตรอนทขาดหายไปเพอใหตวเองเกดความสมดลหรอเสถยร (Halliwell, 1999) นอกจากนอนมลอสระสามารถท าลายสารชวโมเลกลทกประเภท ทงในเซลลและสวนประกอบของเซลลสงมชวต ท าใหเกดความเสยหายแกโมเลกลทไดรบผลกระทบ กอใหเกดเปนสารพษทท าลายเนอเยอ หรอเกดการกลายพนธของดเอนเอในเซลล จงท าใหเกดโรคตางๆ ไดแก โรคหวใจวาย โรคมะเรง โรคผวหนง และโรคหลอดเลอดแขง เปนตน (Halliwell, 1999) ซงอนมลอสระเหลานสามารถถกก าจดดวยสารทเรยกวา สารตานอนมลอสระ (antioxidants) (Pham-Huy, He, & Pham-Huy, 2008)

สารตานอนมลอสระ (antioxidants) เปนสารทสามารถปองกนหรอชะลอการเกดปฏกรยาออกซเดชนของอนมลอสระได โดยใหอเลกตรอนแกอนมลอสระกลายเปนสารทมความเสถยร (Mahantesh et al., 2012) ซงสารตานอนมลอสระเหลานมกลไกการท างานตานอนมลอสระหลายแบบ ไดแก การดกจบอนมลอสระ (radical scavenging) การจบกบโลหะทสามารถ



เรงปฏกรยาออกซเดชน (metal chelation) การยบยงการท างานของออกซเจนทขาดอเลกตรอน (singlet oxygen quenching) การหยดปฏกรยาการสรางอนมลอสระ (chain-breaking) การเสรมฤทธ (synergism) และการยบยงการท างานของเอนไซม (enzyme inhibition) ท เรงปฏกรยาอนมลอสระ เปนตน (Sies, 1992) สารตานอนมลอสระสวนใหญสามารถพบไดใน ผกผลไม (Hamid, Aiyelaagbe, Usman, Ameen, & Lawal, 2010)

ตวอยางวธดงเดมในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระเชงปรมาณ ไดแก การวเคราะหความสามารถในการรดวซเฟอรรกของสารตานอนมลอสระ (ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) assay) (Babu, Gurumurthy, Borra, & Cherian, 2013) การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวยวธดพพเอช (diphenylpicryhydrazyl (DPPH) radical scavenging assay) (Que et al., 2006) และว ธการฟอกสอนม ลอ ส ระ เอบ ท เอส (ABTS radical cation decolorization assay) (Thaipong, Boonprakob, Crosby, Cisneros-Zevallos, & Byrne, 2006) แมวาวธเหลานมการใชวดฤทธตานอนมลอสระอยางแพรหลาย อยางไรกตามยงมขอดอยอยบาง เชน วธ DPPH และ ABTS เปนการวดฤทธตานอนมลอสระผานกลไกการดกจบอนมลอสระสงเคราะห ไดแก DPPH และ ABTS+ ซงอนมลอสระดงกลาว ไมสามารถพบไดทวไปในธรรมชาต จงไมสามารถสอความสามารถในการตานอนมลอสระอยางแทจรงของตวอยางในการดกจบอนมลอสระทพบไดในธรรมชาต เชน HO หรอ O

2 เปนตน งานวจยน ไดพฒนาวธใหมในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระโดยใชอนภาคนาโนเหลกออกไซด (Fe3O4

Nanoparticles, NPs) เพอเปนอกหนงทางเลอกในการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระผานกลไกการดกจบอนมลอสระทเกดขนในธรรมชาตไดแก HO หรอ O

2 โดย Fe3O4 NPs เปนอนภาคนาโนแมเหลกทมขนาดอยในชวง 1-100 นาโนเมตร (Burda, Chen, Narayanan, & El-Sayed, 2005) ในปจจบนไดรบความสนใจในการน ามาประยกตใชในงานดานตาง ๆ เชน ดานการแพทย ดานเทคโนโลยชวภาพ และไบโอเซนเซอร (Mauter, & Elimelech, 2008) เนองจากมสมบตแมเหลก และเมอไมนานมานอนภาคดงกลาวยงถกคนพบวามสมบตเสมอนเอนไซมเปอรออกซเดส (peroxidase-like activity) คอ สามารถเรงปฏกรยาระหวางไฮโดรเจนเปอรออกไซด (Hydrogen peroxide, H2O2 ) กบซบสเตรตได (Gao et al., 2007) ซงซบสเตรตทใชกนทวไป ไดแก 2,2 -azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) o-phenylenediamine (OPD) 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) และ diazo-aminobenzene (DAB) เปนตน โดยกลไกการเรงปฏกรยาออกซเดชนของ H2O2 ดวย Fe3O4 NPs ไดมการเสนอไวดงแสดงในภาพท 1 กลาวคอในอนภาคนาโนเหลกออกไซดจะประกอบไปดวยมเฟอรรสไอออน (ferrous ion, Fe2+) และเฟอรรกไอออน (ferric ion, Fe3+) ซงไอออนทงสองนท าปฏกรยากบ H2O2 ไดผลตภณฑเปนอนมลอสระ (free radicals) ไดแก hydroxyl radical (OH•) (Chen et al., 2012; Wang et al., 2010 ) ซงอนมลเหลานจะไปท าปฏกรยากบซบสเตรต ท าใหซบสเตรตเกดการเปลยนแปลงสได เมออนมลอสระมจ านวนมาก จะท าใหความเขมสของ ซบสเตรตเพมขน ในงานวจยนอาศยกลไกดงกลาวในการตรวจวดฤทธตานอนมลอสระในการดกจบอนมลอสระ โดยในภาวะ ทมสารตานอนมลอสระ hydroxyl radical (OH•)จะถกดกจบดวยสารตานอนมลอสระ ท าใหมปรมาณอนมลอสระทจะไป ออกซไดซซบสเตรตลดลง และความเขมสของซบสเตรตจงลดลงดวยซงสามารถตรวจวดไดดวยเครองวดคาการดดกลนแสง จะเหนวาวธทพฒนาขนสามารถตรวจวดฤทธตานอนมลอสระผานกลไกการดกจบอนมลอสระทมอยในธรรมชาตดวยเครองมอทมอยโดยทวไปในหองปฏบตการได



ภาพท 1 ขนตอนการเกดปฏกรยาส าหรบการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระโดยใช Fe3O4 NPs

วธด าเนนการวจย สารเคมและอปกรณ สา ร เค ม ท ใ ช ใน งาน ว จ ย น ไ ด แ ก 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Gallic acid (GA) 3, 3, 5, 5 –

Tetramethylbenzidine (TMB) จาก Sigma Aldrich, USA Hydrogen peroxide 30% w/v (H2O2) จาก Merck, Germany สารละลายอนภาคนาโนเหลกออกไซด (iron oxide nanopowder water dispersion 15-20 nm, 20% w/v in water) จาก US Research Nanomaterials, INC, USA ซงน ามาเจอจางใหไดสารละลายเขมขน 5% w/v ดวยน าปราศจากไอออน เครองมอ สเปกโทรโฟโตมเตอรรน Analytik Jena Specord 210

การเตรยมสารละลายตวอยางผลไม การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระนใชผลไม 7 ชนด ไดแก แอปเปลชมพ แอปเปลแดง แตงโม แกวมงกร (เนอขาว)

องนแดง ฝรงสาล และนอยหนา น ามาสกดโดยดดแปลงจากวธของ Scalfi et al. (2000) น าผลไมเหลานมาลางท าความสะอาดและน ามาปอกเปลอก (ยกเวน แอปเปลชมพ แอปเปลแดง องนแดง และฝรงสาล) จากนนปนดวยเครองปนผลไมใหละเอยด โดยไมเตมตวท าละลายหรอน า น าตวอยางท ปนโดยละเอยดมาชง 50 กรม ท าการเหวยงดวยเครองเหวยง (centrifuge) 20 นาท น ามากรองเพอแยกสารละลายออกเกบไว สวนทเปนตะกอนน ามาเตมน ากลนปราศจากไอออน 600 ไมโครลตรตอไมโครทวป แลวน าไปเหวยงอกครง น าสารละลายทไดไปผสมกบสารละลายสวนแรก น าสวนทเปนตะกอนมาเตมเมทานอล 600 ไมโครลตรตอไมโครทวป และเหวยงซ าอก 20 นาท แยกเอาสารละลายสวนใสไปรวมกบทสกดไดในตอนตน น าสวนสกดทไดไปทดสอบดวยวธทพฒนาขนและวธมาตรฐานดพพเอช โดยสามารถเกบสวนสกดทไดไวทอณหภม 4 •C เปนเวลาไมเกน 1 เดอน

การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวยอนภาคนาโนเหลกออกไซด ปฏกรยาระหวาง Fe3O4 NPs และ H2O2 สามารถเกดไดดในสภาวะกรดเพอใหไดผลตภณฑเปนอนมลอสระ (Gao et al., 2007) ดงนนในงานวจยนจะไดท าการควบคม pH ของปฏกรยาท pH 3.7 ท าการวเคราะหโดย เตรยมสารละลาย Fe3O4 NPs ความเขมขน 400 µg/mL จากสารละลายเขมขน Fe3O4 NPs 5% (w/v) โดยปเปตสารละลายมา 16 µL แลวปรบปรมาตรดวยน าใหไดปรมาตร 2000 µL จะไดสารละลาย Fe3O4 NPs ความเขมขน 400 µg/mL จากนนผสม Fe3O4 NPs 400 µg/mL 20 µL ส า รล ะ ล าย เต ต ระ เม ท ล เบ น ซ ด น ( 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB) 20 mM 20 µL และ



สารละลายอะซเตทบฟเฟอร pH 3.7 ปรมาตร 1170 µL จากนนเตมสารละลายมาตรฐาน GA ทความเขมขนตางๆ (0-800 µM) หรอสวนสกดตวอยาง ปรมาตร 50 µL และสารละลาย H2O2 10 mM 20 µL จากนนวดคาการดดกลนแสงภายหลงจากตง ปฏก รยาท งไว เปนเวลา 8 และ 10 นาท ตามล าดบ ดวยเค รองมอสเปกโทรโฟโตม เตอร ทความยาวคลน 654 nm รายงานฤทธตานอนมลอสระของตวอยางในหนวยสมมลกรดแกลลก (gallic acid equivalent, mmol GA / g fruit) และน าคาทไดไปเปรยบเทยบกบการตรวจวดดวยวธดงเดม

การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวยวธดพพเอช วเคราะหฤทธตานอนมลอสระดวยวธดพพเอชแบบดงเดมโดยอางองจากรายงานกอนหนาน (Brand-Williams et al.,1995) น าสารละลายมาตรฐาน GA ทความเขมขนตางๆ (0- 2 mM) หรอสวนสกดตวอยางปรมาตร 10 µL ผสมกบสารละลาย DPPH ความเขมขน 2 mM ป รมาตร 100 µL และเมทานอล 3000 µL จากนนวดคาการดดกลนแสง ภายหลงจากต งป ฏ ก รย า เป น เวลา 30 นาท ด วย เค รองม อส เปก โทรโฟ โตม เตอ ร ท ค วามยาวคล น 515 nm รายงานฤทธตานอนมลอสระของตวอยางในหนวยสมมลกรดแกลลก ( gallic acid equivalent, mmol GA / g fruit) เพอน าไปเปรยบเทยบกบคาทวเคราะหไดจากวธทพฒนาขน ผลการวจยและวจารณผล

การศกษาสภาวะทเหมาะสม เรมตนไดท าการศกษาสภาวะทเหมาะสมของวธทพฒนาขน โดยศกษาปจจยตางๆทมผลตอการเรงปฏกรยาของ

Fe3O4 NPs ไดแก ความเขมขน Fe3O4 NPs และเวลาในการเกดปฏกรยา ในการศกษาเบองตนขนตอนนจะไมมการเตมสารตานอนมลอสระลงในปฏกรยาการวเคราะหและใช TMB เปนซบสเตรตเปลยนแปลงส

ศกษาผลของความเขมขนเรมตนของ Fe3O4 NPs ทมตอการเรงปฏกรยาการเกดออกซเดชนของ H2O2 ในการเกด HO• ซงม TMB เปนซบสเตรตทท าใหเกดการเปลยนแปลงสจากใสไมมสเปนสฟา พบวา เมอความเขมขนของ Fe3O4 NPs มากขน จะท าใหสญญาณความเขมสของ TMB เพมขน และพบวาสญญาณความเขมสของสญญาณพนหลง (background) ทเปนสารละลาย Fe3O4 NPs ผสมกบรเอเจนทอนๆในสภาวะทไมม H2O2 มคาเพมขนเชนกน (ภาพแทรก) ภายหลงจากการ หกลบกบสญญาณของพนหลงจะไดความสมพนธ ดงภาพท 2B กลาวคอ ทความเขมขนของ Fe3O4 NPs 400 µg/mL ใหสญญาณทสงทสดในการตรวจวดดวยปฏกรยาทพฒนาขน จงเลอกใชความเขมขนดงกลาวในการศกษาขนตอไป



ภาพท 2 (A) สเปกตรมการตรวจวดในปฏกรยาทม Fe3O4 NPs ความเขมขนตาง ๆ 20 µL ผสมกบ TMB 20 mM 20 µL,

สารละลายบพเฟอร pH 3.7 1,170 µL และ H2O2 10 mM 20 µL ตงปฏกรยาเปนเวลา 30 นาท และรปแทรกเปน สเปกตรมของ สารละลายควบคมของ Fe3O4 NPs ความเขมขนตาง ๆ 20 µL รเอเจนทอนๆยกเวน H2O2 ซงเปน สญญาณพนหลง (B) กราฟแสดงความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงลบสญญาณพนหลงทความยาวคลน

654 นาโนเมตร กบความเขมขน Fe3O4 NPs ท 50 – 500 µg/mL (n = 3) การศกษาผลของเวลาในการเกดปฏกรยาตอสญญาณในการตรวจวดดวยปฏกรยาทพฒนาขนพบวา ในชวงเวลาทศกษาคอ 0-120 นาท เมอเวลาในการเกดปฏกรยาเพมขน สญญาณความเขมสของ TMB เพมขนเปนแนวโนมเสนตรง (ภาพท 3) เนองจากเกดการเรงปฏกรยาอยางตอเนองของ Fe3O4 NPs ในภาวะทม H2O2 ซงเปนซบสเตรตอยางไมจ ากด ดงนนในการใชปฏกรยาดงกลาวในการตรวจวดฤทธตานอนมลอสระจะไดใชวธทางจลนพลศาสตรในการวเคราะห (kinetic method of analysis) ดวยวธการวเคราะหแบบก าหนดเวลาสองจด (two-point fixed-time method) (Pardue, 1977)

(B) (A)



ภาพท 3 (A) สเปกตรมของการเกดปฏกรยาทเวลาตาง ๆ โดยมสภาวะการทดลอง:Fe3O4 NPs 400 µg/mL 20 µL, TMB 20 mM 20 µL, สารละลายบพเฟอร pH 3.7 1,170 µL และ H2O2 10 mM 20 µL (B) กราฟแสดง ความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 654 นาโนเมตรกบเวลา (นาท) ตาง ๆ (n = 3)

ศกษาการตรวจวดสารตานอนมลอสระมาตรฐาน ทดสอบประสทธภาพของวธทพฒนาขนโดยใชแกลลก (GA) เปนสารมาตรฐาน ซงใชสภาวะทเหมาะสมทไดศกษาไว

ขางตน ท าการตดตามคาการดดกลนแสงทก 1 นาท ของปฏกรยาทดสอบทมการเตมสารตานอนมลอสระความเขมขนแตกตางกน ไดผลการทดลองดงภาพท4A พบวา เมอไมมการเตมสารตานอนมลอสระ (ตวควบคม, control) การเกดปฏกรยาออกซเดชนของ H2O2 จะถกเรงปฏกรยาดวย Fe3O4 NPs ในภาวะทมออกซเจน ไดผลตภณฑเปน OH• ซงจะไปออกซไดสซบ สเตรต TMB เปลยนจากใสไมมสเปนสฟา โดยจะเหนการเพมขนของคาการดดกลนแสงมแนวโนมทเปนเสนตรงในชวงเวลาทศกษา ในกรณทมสารตานอนมลอสระ GA พบวาความชนของกราฟมคาลดลงเมอเทยบกบตวควบคมและมความชนลดลงเรอยๆเมอความเขมขนของ GA มคาเพมขน (ภาพท 4A) ทงนเนองจากสารตานอนมลอสระเขาจบกบ HO•ท าใหปรมาณ OH• นอยลง ดงอตราการเปลยนแปลงสญญาณของ TMB จงลดลงซงจะแปรผนตรงกบความเขมขนของสารตานอนมลอสระ GA ซงขอมลดงกลาวท าใหสามารถน าไปหาปรมาณของ GA ได โดยการพลอตความแตกตางของคาการดดกลนแสงในชวงเวลาทอยในชวงการเปลยนแปลงทเปนเสนตรงของกราฟภาพ 4A ในงานวจยนไดเลอกใชความแตกตางของคาการดดกลนแสงท นาทท 8 และ 10 มาท าการวเคราะห gallic acid ทความเขมขนตางๆแลวสรางกราฟมาตรฐาน เนองจากเปนชวงทใหชวงความเปนเสนตรงกวางและความไวในการวเคราะหสง จากกราฟพบวาใหชวงความเปนเสนตรงทความเขมขน GA เทากบ 0.2- 0.8 mM (ภาพท 4B) มขดจ ากดการตรวจวด เทากบ 0.2 mM มความสามารถในการท าซ าในชวงความเขมขนทอยในกราฟมาตรฐานจากการวดซ า 8 ครง ใน GA ทความเขมขน 0.2 0.5 และ 0.6 mM ซงมคารอยละสวนเบยงเบนมาตรฐานสมพนธ อยท 6.6 13.4 และ 16.1 % ตามล าดบ จากผลการทดลองดงกลาวชใหเหนวาวธวเคราะหทพฒนาขนสามารถใชวเคราะห GA

(A) (B)



ไดด (AOAC International, 1998) ซงจะไดมการศกษาการตรวจวดสารตานอนมลอสระตวอนๆตอไปเพอยนยนความสามารถของวธในการตรวจวดสารตานอนมลอสระไดอยางหลากหลายชนด

ภาพท 4 (A) กราฟแสดงความสมพนธระหวางคาการดดกลนแสงและเวลาทความเขมขนตางๆของ GA (B) กราฟแสดง ความสมพนธระหวางความแตกตางของคาการดดกลนแสงทนาทท 8 และ 10 กบความเขมขนของ GA (n=3) สภาวะการทดลอง:Fe3O4 NPs 400 µg/mL 20 µL, TMB 20 mM 20 µL, สารละลายบพเฟอร pH 3.7 1,170 µL และ H2O2 10 mM 20 µL และ GA ทความเขมขนตางๆ 50 µL

การศกษากลไกของปฏกรยาของวธวเคราะหฤทธตานอนมลอสระทพฒนาขน ศกษากลไกของปฏกรยาของวธวเคราะหทพฒนาขนในการตรวจวดสารตานอนมลอสระมาตรฐาน GA โดยศกษา

จากสเปกตรมของการตรวจวดดวยเครองมอสเปกโทรโฟโตมเตอร ในการตรวจวด GA ความเขมขน 1 mM จากภาพท 5A แสดงใหเหนวาความยาวคลนทใหคาการดดกลนแสงสงสดของ GA เทากบ 270 นาโนเมตร และพบวาคาการดดกลนแสงมคาคงทเมอท าการวดซ าเปนจ านวน 3 ครง ทกๆ 3 นาท จนถง 30 นาท เมอน า Fe3O4 NPs ท าปฏกรยากบ GA จะเหนไดวา เมอเวลาผานไปคาการดดกลนแสงของ GA ไมมการลดลงอยางชดเจน แสดงใหเหนวา GA ไมท าปฏกรยากบ Fe3O4 NPs จงไมมการสลายตว ดงภาพท 5B ตอมาน า GA ท าปฏกรยากบ H2O2 ไดผลการทดลองคลายภาพท 5B คอไมเหนการลดลงของสญญาณของ GA แสดงวาไมมการท าปฏกรยาระหวาง GA กบ H2O2 (ภาพท 5C) ในทางตรงกนขาม ในระบบทมทง H2O2 และ Fe3O4 NPs ในสารละลาย GA จะพบวาคาการดดกลนแสงของ GA ลดลงเมอเวลาผานไป แสดงใหเหนถงการสลายตวของ GA ซงเกดจาก GA ไปท าปฏกรยากบผลตภณฑ (OH• ) ทเกดขนระหวาง Fe3O4 NPs กบ H2O2 (ภาพท 5D) (Badhani, Sharma, & Kakkar, 2015) ผลการทดลองนเปนการยนยน กลไกการเขาจบกบอนมลอสระทเกดจาก Fe3O4 NPs กบ H2O2 ของสารตานอนมลอสระซงแสดงใหเหนวาปฏกรยาของวธวเคราะหทพฒนาขนสามารถตรวจวดฤทธตานอนมลอสระของสารตวอยางไดจรง

(A) (B)



ภาพท 5 สเปกตรมของการตรวจวดสารละลายชนดตางๆทมการสแกนสเปกตรมทกๆ 3 นาท เปนเวลา 30 นาท : (A) GA ทความเขมขน 1 mM (B) Fe3O4 NPs + GA (C) GA + H2O2 และ (D) Fe3O4 NPs + GA + H2O2

การวเคราะหฤทธตานอนมลอสระในตวอยางน าผลไมสกด ศกษาประสทธภาพการใชงานในการตรวจวดฤทธตานอนมลอสระในตวอยางจรงของวธทพฒนาขนโดยการวเคราะหตวอยางน าผลไมเทยบกบวธวเคราะหฤทธตานอนมลอสระดพพเอช โดยใชตวอยางน าผลไมสกดทงหมด 7 ชนด แสดงฤทธตานอนมลอสระของตวอยางน าผลไมทไดจากทงสองวธในคาสมมลกรดแกลลก (gallic acid equivalent (GAE)) มหนวย mmol GA / g fruit ซงหมายถงความสามารถในการตานอนมลอสระเทยบเทา mmol gallic acid ตอหนงกรมของผลไม (วธการค านวณแสดงในเอกสารเพมเตม) ไดท าการเปรยบเทยบระหวางวธทพฒนาขน และวธดพพเอชดงเดม โดยน าคาจากการทดลองทไดไปเปรยบเทยบคาทางสถตโดยใชสมประสทธสหสมพนธแบบสเปยรแมน พบวาวธทพฒนาขนและวธดพพเอชดงเดม ใหผลการวเคราะหฤทธตานอนมลอสระทมความสมพนธกนดอยางมนยส าคญทระดบความเชอมนท 95% (ภาพท 6) โดยมคาสมประสทธสหสมพนธแบบสเปยรแมน (rs) เทากบ 0.9643 ซงมคามากกวาคาวกฤต (P=0.05, n=7 คาวกฤต rs=0.786) ซงความสอดคลองกนดงกลาวแสดงใหเหนวาวธทพฒนาขนมความเหมาะสมเปนวธทางเลอกหนงในการน าไปวเคราะหฤทธตานอนมลอสระในตวอยางไดดเทยบเทากบวธดงเดม (Thaipong, Boonprakob, Crosby, Cisneros-Zevallos, & Byrne, 2006; Dudonné, Vitrac, Coutiere, Woillez, & Me rillon, 2009; Floegel, Kim, Chung, Koo, & Chun, 2011)

(B) (A)

(C) (D)



ภาพท 6 กราฟแสดงความสมพนธระหวางฤทธตานอนมลอสระของตวอยางผลไมทวเคราะหดวยวธทพฒนาขน และวธดพพเอชดงเดม สรปผลการวจย

งานวจยนเสนอวธตรวจวดฤทธตานอนมลอสระทางเลอกใหมโดยใช Fe3O4 NPs เปนตวเรงปฏกรยาการเกดอนมลอสระทสามารถพบไดตามธรรมชาตพบวาสามารถตรวจวดฤทธตานอนมลอสระไดอยางมประสทธภาพ สอดคลองกบวธดงเดมดวยการทดลองทใชสภาวะทเหมาะสมทไดท าการศกษา วธวเคราะหทพฒนาขนสามารถวเคราะหสารตานอนมลอสระมาตรฐานกรดแกลลกไดในระดบความเขมขนไมโครโมลาร ทมคาความสามารถในการท าซ าอยในชวง 6.6 - 16.1 % และไดศกษาปฏกรยาของวธวเคราะหทพฒนาขนเพอยนยนวาสามารถตรวจวดสารตานอนมลอสระไดจรง การประยกตใชวธดงกลาวในการวเคราะหสารตานอนมลอสระในตวอยางผลไมทงหมด 7 ชนด จะเหนวาวธทไดพฒนาขนสามารถวเคราะหฤทธตานอนมลอสระไดดเทยบเทากบวธดงเดม ในขนตอนถดไปจะไดมการศกษาการตรวจวดสารตานอนมลอสระมาตรฐานชนดอนๆ และน าวธดงกลาวไปตรวจวดฤทธตานอนมลอสระในตวอยางอนๆดวย

กตตกรรมประกาศ ขอขอบคณทนสนบสนนการวจยจากศนยความเปนเลศดานนวตกรรมทางเคม ภาควชาเคม คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา เอกสารอางอง AOAC International (1998). AOAC Peer-Verified Methods Program, Manual on Policies and Procedures.

Rockville, MD, USA. Babu, D., Gurumurthy, P., Borra, S. K., & Cherian, K. M. (2013). Antioxidant and free radical scavenging activity of

triphala determined by using different in vitro models. Journal of Medicinal Plants Research, 7(39), 2898-2905.



Badhani, B., Sharma, N., & Kakkar, R. (2015). Gallic acid: a versatile antioxidant with promising therapeutic and industrial applications. Rsc Advances, 5(35), 27540-27557.

Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., & Berset, C. L. W. T. (1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. LWT-Food science and Technology, 28(1), 25-30.

Burda, C., Chen, X., Narayanan, R., & El-Sayed, M. A. (2005). Chemistry and properties of nanocrystals of different shapes. Chemical Reviews, 105(4), 1025-1102.

Chen, Z., Yin, J. J., Zhou, Y. T., Zhang, Y., Song, L., Song, M., Hut, S., & Gu, N. (2012). Dual enzyme-like activities of iron oxide nanoparticles and their implication for diminishing cytotoxicity. Acs Nano, 6(5), 4001-4012.

Committee, A. P. V. M. A. (1998). AOAC Peer Verified Methods Program–Manual on Policies and Procedures. AOAC International, Gaithersburg, USA, 1-35.

Dudonné, S., Vitrac, X., Coutiere, P., Woillez, M., & Me rillon, J. M. (2009). Comparative study of antioxidant properties and total phenolic content of 30 plant extracts of industrial interest using DPPH, ABTS, FRAP, SOD, and ORAC assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(5), 1768-1774.

Floegel, A., Kim, D. O., Chung, S. J., Koo, S. I., & Chun, O. K. (2011). Comparison of ABTS/DPPH assays to measure antioxidant capacity in popular antioxidant-rich US foods. Journal of Food Composition and Analysis, 24(7), 1043-1048.

Gao, L., Zhuang, J., Nie, L., Zhang, J., Zhang, Y., Gu, N., Wang, T., Feng, J., Yang, D., Perrett, S., & Yan, X. (2007). Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles. Nature nanotechnology, 2(9), 577.

Halliwell, B. (1999). Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning). Free Radical Research, 31(4), 261-272.

Hamid, A. A., Aiyelaagbe, O. O., Usman, L. A., Ameen, O. M., & Lawal, A. (2010). Antioxidants: Its medicinal and pharmacological applications. African Journal of pure and applied Chemistry, 4(8), 142-151.

Mahantesh, S. P., Gangawane, A. K., & Patil, C. S. (2012). Free radicals, antioxidants, diseases and phytomedicines in human health: Future prospects. World Research Journal of Medicinal & Aromatic Plants, 1(1), 6-10.

Mauter, M. S., & Elimelech, M. (2008). Environmental applications of carbon-based nanomaterials. Environmental Science & Technology, 42(16), 5843-5859.

Pardue, H. L. (1977). A comprehensive classification of kinetic methods of analysis used in clinical chemistry. Clinical Chemistry, 23(12), 2189-2201.

Pham-Huy, L. A., He, H., & Pham-Huy, C. (2008). Free radicals, antioxidants in disease and health. International Journal of Biomedical Science: IJBS, 4(2), 89.



Que, F., Mao, L. C., & Zheng, X. J. (2007). In vitro and vivo antioxidant activities of daylily flowers and the involvement of phenolic compounds. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 16(S1), 196-203.

Scalfi, L., Fogliano, V., Pentangelo, A., Graziani, G., Giordano, I., & Ritieni, A. (2000). Antioxidant activity and general fruit characteristics in different ecotypes of Corbarini small tomatoes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(4), 1363-1366.

Scott, D. A., Poston, R. N., Wilson, R. F., Coward, P. Y., & Palmer, R. M. (2005). The influence of vitamin C on systemic markers of endothelial and inflammatory cell activation in smokers and non-smokers. Inflammation Research, 54(3), 138-144.

Sies, H., Stahl, W., & Sundquist, A. R. (1992). Antioxidant functions of vitamins. Annals of the New York Academy of Sciences, 669(1), 7-20.

Thaipong, K., Boonprakob, U., Crosby, K., Cisneros-Zevallos, L., & Byrne, D. H. (2006). Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts. Journal of Food Composition and Analysis, 19(6-7), 669-675.

Wang, N., Zhu, L., Wang, D., Wang, M., Lin, Z., & Tang, H. (2010). Sono-assisted preparation of highly-efficient peroxidase-like Fe3O4 magnetic nanoparticles for catalytic removal of organic pollutants with H2O2. Ultrasonics Sonochemistry, 17(3), 526-533

Wojtunik-Kulesza, K. A., Oniszczuk, A., Oniszczuk, T., & Waksmundzka-Hajnos, M. (2016). The influence of common free radicals and antioxidants on development of Alzheimer’s Disease. Biomedicine & Pharmacotherapy, 78, 39-49.

development of immunological test kit for the detection of porcine · 2019-08-01 ·...

Documents