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Determinazione dei batteri lattici nei prodotti lattiero caseari: metodi, terreni, tecniche
Angiolella LombardiVeneto Agricoltura
Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari
MontegrottoTerme, 6-7 dicembre 2012
12° Meeting responsabili e tecnici laboratorio settore lattiero caseario
Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di latti fermentati
� Acidificazione (fermentazione lattica)
� Produzione di acetaldeide
� Produzione di polisaccaridi
- Batteri lattici con caratteristiche probiotiche
2A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari
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Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di formaggi
• Acidificazione (fermentazione lattica)
• Produzione di enzimi che agiscono su:
� Proteine-peptidi-aminoacidi
� (lipidi)
� Altre componenti
(es. citrato)
Batteri lattici starter
Batteri lattici non starter
Maturazione prodotto, caratteristiche organolettiche -
nutrizionali
3A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari
Aspetti negativi legati allo sviluppo di batteri lattici nei formaggi
� Produzione di gas (batteri lattici eterofermentanti,
occhiatura eccessiva, gonfiori)
� Produzione di amine biogene (tiramina, istamina)
� Produzione di sapori anomali (peptidi amari)
� Acidificazione eccessiva-gessatura
4A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari
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BATTERI LATTICI Caratteristiche generali
� Batteri Gram positivi
� Ubiquitari
� Morfologia differente: bacilli/cocchi
� Non sporigeni
� Acido tolleranti e talvolta acidofili
� Temperatura ottimale di crescita: ampio range (termofili/ mesofili)
� Catalasi negativi (eccetto alcune specie genere Pediococcus )
� Molto esigenti nutrizionalmente
� Non patogeni (gruppo 1, tranne L. rhamnosus ed enterococchi che rientrano in gruppo 2)
� Anaerobi (aerotolleranti)
� Metabolismo fermentativo (omofermentanti, eterofermentanti)
5A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari
Principali generi/specie di batteri lattici settore lattiero-caseario
Microrganismo Morfologia Fermentazione Temperatura Applicazioni
Streptococcusthermophilus
Cocchi Omolattica Termofili Formaggi, lattifermentati
Lactococcuslactis
Cocchi Omolattica Mesofili Formaggi, burro
Enterococchi Cocchi Omolattica Mesofili, termodurici
Formaggi* (no QPS)
Pediococchi Cocchi a tetradi Omolattica Termofili
Vegetali fermentati, insaccati, maturazione formaggi
Leuconostoc Cocchi Eterolattica Mesofili Burro, vegetali fermentati, paste acide
Lactobacilli Bastoncini Omolattica
Eterolattica
Mesofili. termofili
Formaggi, lattiferm., insaccati, paste acide, vegetali
6A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari
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Perchè cercare i batteri lattici nei prodotti lattiero caseari?
A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 7
� Requisiti di prodotto (es S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus yogurt)
� Requisiti certificazioni ( es. Mozzarella STG)
� Controllo qualità colture starter (inclusi sieroinnesti/lattoinnesti)
� Monitoraggio probiotici (L. acidophilus, L. rhamnosus, L casei/paracasei, Bifidobacterium*)
� Conteggio LAB responsabili difetti (eseterofermentanti obbligati, enterococchi)
Conteggio batteri lattici – Metodi normati
A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 8
Microrganismo Metodo Campo applicazione
S. thermophilus ISO 7889-IDF117: 2003
Yogurt
Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus
ISO 7889-IDF117: 2003
Yogurt
Lactobacillusacidophilus
ISO 20128-IDF292: 2006
Latti fermentati e non fermentati, latte in polvere
Batteri lattici mesofilie termofili (diverse specie e generi)
ISO 27205-IDF149: 2010
Colture starter per prodotti fermentati a base di latte (no probiotici)
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Conteggio batteri lattici – Metodi normati
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Microrganismo Metodo Campo applicazione
Enterococchi CCFRA Met. 2.2.1:2007
Alimenti , inclusi prodotti lattiero caseari , mangimi
Bifidobatteri (NB non LAB)
ISO 29981-IDF220: 2010
Latti fermentati e non fermentati, latte in polvere, formulazioni per l’infanzia,colture starter
Leuconostoc (FIL149A:1997) Colture starter
Batteri lattici citrato fermentanti (Leuconostoc, Lc.lactiscit+)
ISO17792-IDF 180 : 2006
Colture starter e prodotti lattiero caseari in cui sono presenti lattici citrato ferm.
Streptococcus thermophilus
A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 10
Norma cod. ISO 7889 - IDF 117:2003
Norma titolo Yogurt - Enumeration of characteristic microorganisms – Colony count technique at 37°C
Conteggio di Streptococcus thermophilus
Mezzo di coltura M 17, pH 6.8 dopo sterilizzazione (consigliabile aggiungere il lattosio dopo sterilizzazione)
Inoculo inclusione
Atmosfera incubazione
aerobiosi
Incubazione 37+/-1°C x 48 h
Lettura colonie colonie lenticolari del diametro di 1-2 mm.
Conferma colorazione gram (+, forma coccica del diametro di 0.7-0.9 micron in coppia o a catena) e catalasi(neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232)
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Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
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Norma cod. ISO 7889 - IDF 117:2003
Norma titolo Yogurt- Enumeration of characteristic microorganisms – Colony count technique at 37°C
Conteggio di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
Mezzo di coltura MRS acid. pH 5.4 con acido acetico
Inoculo inclusione
Atmosfera incubazione
anaerobiosi
Incubazione 37+/-1°C x 72 h
Lettura colonie colonie lenticolari, spesso a forma laminare del diametro di 1-3 mm
Conferma colorazione gram (+, bastoncini, generalmente corti) e catalasi (neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232)
ISO 20128-IDF192:2006Milk Products – Enumeration of presumptive Lactobacillus
acidophilus on a selective medium-Colony count technique at 37°C
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Conteggio di Lactobacillus acidophilus
Mezzo di coltura MRS + Clindamycin + Ciprofloxacin
Inoculo spatolamento
Atmosfera incubazione anaerobiosi
Incubazione 37°C x 72 +/-3 h
Lettura colonie colonie piatte opache
grigio biancastre
bordi irregolari
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ISO 27205-IDF149:2010-Fermented milk Products – Bacterial starter cultures – standard of identity
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Specifica caratteristiche delle colture starter del settore lattierocaseario (batteri lattici, ma anche bifidobatteri e propionibatteri)
Microrganismo Metodo
L.delbrueckii subsp. bulgaricus
MRS acidificato come ISO 7889-IDF117:2003
L. acidophilus MRS+ Cli e Cipro come ISO 20128-IDF 292: 2006
S. thermophilus M17 pH6,8 come ISO 7889-IDF117: 2003
Lattococchi M17pH7,2, come da ISO 7889 incubato in aerobiosi a 30 °C per 72 ore
Colture miste S. thermophilus -lattococchi
S.thermophilus : M17pH6,8 45 °C aerobiosi 48 hLattococchi M17pH7,2 20 °C aerobiosi 5 g
CCFRA Method 2.7.1:2007Enumeration of presumptive Enterococcus
species:colony count technique
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Il metodo propone diversi mezzi per il conteggio degli enterococchinegli alimenti e nei mangimi: KF streptococcus agar, Kanamicina,-esculina-azide agar (KAA), Slanetz e Bartley agar (SB)
�KAA inoculo per spreading,�37 °C per 24 h ± 4 h
�Necessaria conferma
�Sodio azide e kanamicinaagenti selettivi
�Esculina agente differenziale
Colonie bianche o grigie circondate da un alone nero da confermare
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ISO 29981-IDF220:2010 Milk Products-Enumeration of presumptive bifidobacteria-Colony count technique at 37 °C
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�TOS-MUP propionato agar + agenti selettivi (litio-mupirocina) egalatto-oligosaccaridi (TOS)
� Inoculo per inclusione, incubazione 37 ° C per 72 h in anerobiosi
Litio e mupirocina inibisconocrescita S. thermophilus, L.delbrueckii subsp. bulgaricus, L.acidophilus, L. casei, L.rhamnosus, Lactococcus lactis,
Galatto-oligosaccaridi (TOS)favoriscono sviluppo deibifidobatteri
Colonie bianche piccole da confermare
FIL-IDF 149A. 1997. Levains lactiques de cultures de bactéries lactiques. Norme de composition
Leuconostoc
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�MSE Agar (Mayeux, Sandine, Elliker),
� Inoculo per spreading, incubazione a 22 °C per 4-5 g in aerobiosi
.
L. mesenteroides dextranicum forma colonie mucose, gelatinose, altri Leuconostoc formano colonie piccole incolori
Sodio azide del terrenoinibisce batteri Gram - elattococchi
Saccarosio favorisceformazione destrani.
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ISO17792-IDF180:2006Milk, milk products and mesophilic starter cultures –Enumeration of citrate fermenting bacteria.Colony
count technique at 25 °C
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Microrganismi interessati:
� Lactococcus lactis subsp. lactis cit +
� Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, cremoris, dextranicum
� Leuconostoc lactis
Terreno di Nickels eLeesment, contenente citratoe calcio lattato, incubato a 25°C in aerobiosi per 72 h. Dopoincubazione viene aggiunto X-gal, ulteriore incubazione per24 ore
Citrato fermentanti presentano alone attorno alla colonia
Lactococcus colonie bianche
Leuconostoc colonie blu
Altri batteri lattici
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L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L.plantarumNSLAB formaggi Latti fermentati, probiotici
MRS agar + vancomicina ( 10 µg/ml)
Incubazione 30 °C , anaerobiosi, 72 h.
In questo terreno possono sviluppare
anche pediococchi e Leuconostoc
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Batteri lattici eterofermentanti
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�Terreno HHD consente differenziare batteri lattici omo edeterofermentanti in base alla differente acidificazione delfruttosio presente in bassa concentrazione in questo mezzo.
�Dopo incubazione 30 °C per 72 h i batteri omofermentanticrescono con colonie blu-verdi, mentre quelli eterofermentanti concolonie incolori (non acidificano e quindi non determinano il viraggiodel verde bromocresolo)
�In alternativa per il conteggio degli eterofermentanti:
MRS; verifica produzione gas in un numero rappresentativo dicolonie
Leuconostoc: MSE 22°C per 4-5 g
Metodi di controllo sieroinnesti-Criticità
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-2-8 x 108 ufc/ml-dominanza L. helveticus (80-85%), presenza di diversibiotipi-L. delbrueckii subsp. bulgaricus e subsp. lactis-L. fermentum (eterofermentante)-Talora presenza di S. thermophilus
Caratteristiche
sieroinnesti
�MRS acidificato?�MRS + casaminoacids?�Agar siero?
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Metodi controllo lattoinnesti naturali-criticità
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Microrganismo Metodo Campo applicazione
Terreno
S. thermophilus ISO 7889-IDF 117: 2003
Yogurt M17 agar, aerobiosi a 37 °C per 48 ore
Colture miste S. thermophilus -lattococchi
ISO 27205 - IDF 149:2003
Colture starter termofile
S.thermophilus : M17
pH6,8 45 °C aerobiosi 48 h
Risultati molto variabili in funzione di:
�Brand commerciale terreno�Modalità di aggiunta del lattosio �Temperatura di incubazione�Aggiunta di ulteriori “ingredienti” (latte peptonizzato)
E i probiotici?
A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 22
Es latte fermentato contenente S. thermophilus, L.bulgaricus, L. acidophilus, Bifidobacterium lactisS. thermophilus ISO 7889-IDF 117: 2003
B. lactis ISO 29981- IDF 220: 2010
L. acidophilus ISO 20128-IDF 292: 2006
L. delbrueckii subsp. bulgaricus ?�ISO 7889-IDF 117: 2003 non consente conta differenziale
L. bulgaricus-L. acidophilus�Semina per spreading e differenziazione morfologia colonie?
�Conferma colonie mediante ISO 9232: 2003-IDF 146?
�Conferma mediante PCR?
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Conclusioni
A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 23
� Sono disponibili diversi metodi per il conteggio dibatteri lattici.
� Tuttavia, data la complessità di questo gruppomicrobico e la presenza in uno stesso alimento di piùgeneri/specie permangono delle criticità
� Adattamento del metodo in funzione del prodotto
� Necessità di confronti interlaboratori su matrici reali
� Sviluppo di metodi che consentano di individuaregruppi di batteri lattici con attività potenzialmentenegative (es. proteolitici,, eterofermentantiobbligati)?