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DETERMINACIÓN in vitro DE LA PARTICIPACIÓN DE LA PROTEÍNA HIPOTÉTICA
SAUSA300_0063 EN LA ACTIVACIÓN DEL OPERÓN arc PRESENTE EN EL
ELEMENTO MÓVIL PARA EL CATABOLISMO DE LA ARGININA (ACME) EN EL
CLON PANDÉMICO USA300.
ZAYDA LORENA CORREDOR ROZO
UNIVERSIDAD EL BOSQUE
FACULTAD DE MEDICINA
BOGOTÁ D.C, COLOMBIA
AGOSTO, 2015
DETERMINACIÓN in vitro DE LA PARTICIPACIÓN DE LA PROTEÍNA HIPOTÉTICA
SAUSA300_0063 EN LA ACTIVACIÓN DEL OPERÓN arc PRESENTE EN EL
ELEMENTO MÓVIL PARA EL CATABOLISMO DE LA ARGININA (ACME) EN EL
CLON PANDÉMICO USA300.
ZAYDA LORENA CORREDOR ROZO
TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARA OPTAR AL TÍTULO DE:
MAGÍSTER EN CIENCIAS BÁSICAS BIOMÉDICAS
DIRECTOR (A):
JAVIER ANTONIO ESCOBAR PÉREZ M.Sc, Ph.D.(C)
CODIRECTOR:
RICAURTE ALEJANDRO MÁRQUEZ ORTIZ Ph.D.(C)
GRUPO DE INVESTIGACIÓN:
LABORATORIO DE GENETICA MOLECULAR BACTERIANA LGMB
UNIVERSIDAD EL BOSQUE
FACULTAD DE MEDICINA
BOGOTÁ D.C, COLOMBIA
AGOSTO, 2015
NOTA DE SALVEDAD DE RESPONSABILIDAD INSTITUCIONAL:
“La Universidad El Bosque, no se hace responsable de los conceptos emitidos por los
investigadores en su trabajo, solo velará por el rigor científico, metodológico y ético del mismo en
aras de la búsqueda de la verdad y la justicia”
AGRADECIMIENTOS
› Al laboratorio de Genética Molecular Bacteriana: Javier Escobar como mi tutor, por darme
la oportunidad de iniciar continuar mi formación académica, además de brindarme su
conocimiento, confianza y paciencia para la realización de este proyecto. A Betsy, Ma.
Victoria y Alejandro por su compañía, apoyo y enseñanzas.
› A la Dra. Jacqueline Chaparro por brindarme más que cariño, sus aportes y conocimientos
en este proceso de formación.
› Dra. Myriam Velandia por sus atenciones, ayuda, conocimiento y cariño brindándome
consejos para crecer como persona.
› A mis amigas María Angélica, Claudia y Liliana, por su ejemplo, constancia, apoyo
incondicional, experiencia y consejos, por estar siempre conmigo en los buenos y malos
momentos.
› A Marce por todo su apoyo, colaboración y compañía logística.
› A mi familia incondicional y a mi esposo muchas gracias por toda su paciencia, por
comprenderme, apoyarme y darme fuerza en momentos difíciles.
› Gracias a todas aquellas personas que compartieron conmigo sus enseñanzas y
conocimiento.
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE TABLAS ........................................................................................................................... 1
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 5
JUSTIFICACIÓN. .............................................................................................................................. 7
1. MARCO TEÓRICO..................................................................................................................... 9
1.1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS ......................................................................................................... 9
1.2 RESISTENCIA A LOS Β-LACTÁMICOS EN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y SU EPIDEMIOLOGIA ...... 9
1.3 CLON USA300 DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ......................................................................... 10
1.4 ELEMENTO GENÉTICO MÓVIL PARA EL CATABOLISMO DE LA ARGININA (ACME) ................. 11
1.5 REGULACIÓN DEL ELEMENTO GENÉTICO MÓVIL PARA EL CATABOLISMO DE LA ARGININA
(ACME)......................................................................................................................................... 14
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 17
2.1 OBJETIVO PRINCIPAL ............................................................................................................... 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................................... 17
3. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 18
3.1 CEPAS BACTERIANAS, PLÁSMIDOS, Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO. .................................. 18
3.2 PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE SAUSA300_0063 DEL
OPERÓN ARCACME DEL CLON USA300. .......................................................................................... 18
3.2.1 Extracción de ADN genómico .......................................................................................... 18
3.2.2 Amplificación y purificación del gen sausa300_0063 .................................................... 20
3.2.3 Clonación del gen sausa300_0063 en el vector pGEM-T Easy y transformación en
E. coli TOP10. ........................................................................................................................... 20
3.2.4 Obtención del plásmido pETCT-63 y transformación en E. coli TOP10 y transformación
en E. coli TOP10. ................................................................................................................................... 21
3.2.5 Plásmido pET-CT63 y transformación en E. coli BL21 (DE3) …...…………………….23
3.2.6 Expresión de la proteína recombinante SAUSA300_0063 a partir de pET-CT63 en E.
coli BL21 (DE3) con pG-KJE8 . ............................................................................................... 23
3.2.7 Expresión y purificación de la proteína recombinante SAUSA300_0063 en el plásmido
pET303/CT-His en E.coli BL21 (DE3). ..................................................................................... 24
3.2.8 Detección por Western Blot de la proteína recombinante SAUSA300_0063 obtenida
por electroelución. .................................................................................................................... 25
3.3 DETERMINACIÓN DE LA UNIÓN IN VITRO DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE SAUSA300_0063
AL PROMOTOR DEL OPERÓN ARCACME DEL CLON USA300. ........................................................... 26
3.3.1 Síntesis de la sonda con biotina y sin biotina de la secuencia promotora del operón
arcACME y del gen gyrB. .............................................................................................................. 26
3.3.2 Unión in vitro de la proteína recombinante SAUSA300_0063 a la región promotora
del operón arcACME. ................................................................................................................... 27
3.3.3 Entrecruzamiento o “Cross-linking” de la proteína recombinante SAUSA300_0063
con la sonda biotinilada ............................................................................................................ 27
3.4 EVALUACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN DE LOS GENES SAUSA300_0063 Y ARCC DEL OPERÓN
ARCACME Y DEL OPERÓN ARCCONS EN EL CLON PANDÉMICO USA300 EN CONDICIONES DE
ANAEROBIOSIS, SIN GLUCOSA Y EN PRESENCIA O NO DE ARGININA .............................................. 28
3.4.1 Extracción de ARN por el método de TRIzol. .................................................................. 28
3.4.2 PCR en tiempo real de la transcripción de los genes sausa300_0063 y arcCACME ,
arcCcons y arcR en condiciones anaerobias en presencia o no de arginina. ............................. 28
4. RESULTADOS ......................................................................................................................... 30
4.1 PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE SAUSA300_0063 DEL
OPERÓN ARCACME DEL CLON USA300. ................................................................................... 30
4.1.1 Amplificación del gen sausa300_0063 y su clonación en pGEM-T................................. 30
4.1.2 Clonación del gen sausa300_0063 en pET303/CT-His y transformación en E. coli
TOP10 y BL21(DE3). ................................................................................................................ 30
4.1.3 Expresión y purificación de la proteína recombinante SAUSA300_0063 en
pET303/CT-His. ........................................................................................................................ 33
4.2 DETERMINACIÓN DE LA UNIÓN IN VITRO DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE SAUSA300_0063
AL PROMOTOR DEL OPERÓN ARCACME DEL CLON USA300. ........................................................... 34
4.2.1 Síntesis de la sonda para la secuencia promotora del operón arcACME y del gen gyrB. ... 34
4.2.2 Unión in vitro de la proteína recombinante SAUSA300_0063 a la región promotora
del operón arcACME .................................................................................................................... 36
4.2.3. Entrecruzamiento de la proteína recombinante SAUSA300_0063 purificada con
la sonda de marcada. ................................................................................................................ 39
4.3 EVALUACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN DE LOS GENES SAUSA300_0063 Y ARCC DEL OPERÓN
ARCACME Y DEL OPERÓN ARCCONS EN EL CLON PANDÉMICO USA300 EN CONDICIONES DE
ANAEROBIOSIS, SIN GLUCOSA Y EN PRESENCIA O NO DE ARGININA .............................................. 40
5. DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 43
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................................ 46
7. BIBLIOGRAFÍA. ...................................................................................................................... 47
8. ANEXOS ................................................................................................................................... 52
ANEXO 1 ...................................................................................................................................... 52
ANEXO 2 ...................................................................................................................................... 53
1
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos empleados en el estudio. ................................................... 19
Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados en el estudio. Primers para PCR, PCR en tiempo real
y síntesis de sondas para los ensayos de retardamiento en gel. ........................................................ 21
2
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de las estructuras genéticas de los diferentes tipos de ACME. .......................... 12
Figura 2. Vía Arginina Deiminasa para la degradación de la arginina. .......................................... 13
Figura 3. Organización de los operones arccon, arcACME y su localización en el genoma de USA300.
........................................................................................................................................................... 14
Figura 4. Regulación de la transcripción del operón Lac. ................................................................ 15
Figura 5. Alineamiento de las secuencias del promotor arc en el clon USA300. ............................. 15
Figura 6. Esquema de los dominios conservados en las proteínas arcR y SAUSA300_0063 en
el clon USA300 .................................................................................................................................. 16
Figura 7. Clonación del gen SAUSA300_0063 en pGEM-T y transformación en E. coli TOP10. ... 31
Figura 8. Obtención del plásmido pETCT-63 y transformación en E. coli TOP10 y BL21(DE3) .... 32
Figura 9. Expresión de la proteína recombinante SAUSA300_0063 en la fracción soluble
inducido con IPTG. ............................................................................................................................ 34
Figura 10. Evaluación de la solubilidad de la proteína recombinante SAUSA300_0063 en los
dos vectores de expresión .................................................................................................................. 35
Figura 11. Purificación y detección de la proteína recombinante SAUSA300_0063 por
electroelución ..................................................................................................................................... 35
Figura 12. Síntesis y detección de la sonda del operón arcACME en el clon USA300 ........................ 37
Figura 13. Unión in vitro del extracto total de proteínas del clon USA300 y la proteína
recombinante electroeluida con la región promotora del operón arcACME. ....................................... 38
Figura 14. Unión in vitro de la proteína recombinante electroeluida con la región promotora
del operón arcACME con competidor específico y no especifico .......................................................... 38
Figura 15. Entrecruzamiento con UV de la proteína recombinante electroeluida SAUSA300_0063
con la sonda GP460-461b ................................................................................................................. 39
Figura 16. Estructura del operón arcACME en el clon USA300 ........................................................... 40
Figura 17. Niveles de expresión relativa de los genes de los genes SAUSA300_0063 y arcCACME,
arcCcons y arcR en anaerobiosis.. .................................................................................................... 41
Figura 18. Comparación de los niveles de expresión relativa en el clon USA300 y la cepa
NCTC8325 en crecimiento anaerobio ............................................................................................... 42
3
DETERMINACIÓN in vitro DE LA PARTICIPACIÓN DE LA PROTEÍNA HIPOTÉTICA
SAUSA300_0063 EN LA ACTIVACIÓN DEL OPERÓN arc PRESENTE EN EL
ELEMENTO MÓVIL PARA EL CATABOLISMO DE LA ARGININA (ACME) EN EL
CLON PANDÉMICO USA300.
Introducción: En las últimas dos décadas se ha reportado la emergencia y rápida diseminación del
Staphylococcus aureus resistente a meticilina clon USA300 con una amplia distribución y
patogenicidad, causando al ser humano infecciones no solo en el hospital sino en la comunidad. El
elemento genético móvil para el catabolismo de la arginina (ACME) fue identificado
exclusivamente en este clon y dentro de este elemento se encuentra un operón arc que tiene la
misma función catabólica de ACME suministrando ATP en condiciones anaerobias y que en
ambientes ácidos aumenta el pH del medio favoreciendo la capacidad para colonizar. Estudios
previos en nuestro laboratorio mostraron que una sobreexpresión del operón arcACME en el clon
USA300 es dada posiblemente por el gen sausa300_0063 inserto dentro de este operón que codifica
para un regulador transcripcional.
Objetivo: Determinar la participación de la proteína hipotética SAUSA300_0063 en la activación
del operón arc presente en ACME en el clon pandémico USA300.
Materiales y Métodos: Mediante el sistema de expresión pET303/CT-His en BL21 (DE3) se
produjo la proteína recombinante SAUSA300_0063 del operón arcACME la cual se purificó mediante
electroelución. Se determinó la unión in vitro de la proteína recombinante SAUSA300_0063 a la
secuencia promotora del operón arcACME mediante ensayos de retardamiento en gel y por PCR en
tiempo real se analizó la transcripción relativa de los genes sausa300_0063, arcCACME, arcCcons y
arcR en condiciones de anaerobiosis en presencia o ausencia de arginina.
Resultados: La evidencia experimental mostró que la proteína SAUSA300_0063 establece su
unión en el promotor del operón arcACME sugiriendo una aproximación acerca de su función como
regulador transcripcional perteneciente a la familia de proteínas CRP/FNR. Adicionalmente se
observó una relación directa en el aumento de la transcripción de los genes sausa300_0063 y arcC
del operón arcACME indicando la posible participación de la proteína SAUSA300_0063 en la auto-
activación del operón arcACME, dada a esta nueva estructura del operón facilitando su regulación.
Conclusión: La proteína SAUSA300_0063 participa en la activación del operón arcACME a través
de la unión a su región promotora y ésta activación es mayor que la encontrada en el operón arc
constitutivo. Estos resultados sugieren que el cambio estructural encontrado en el operón arcACME
facilita la participación de la proteína SAUSA300_0063 en la auto-activación de este operón ya que
dada a esta nueva estructura se podría regular en modo cis considerándose un sistema altamente
ventajoso.
Palabas claves: Clon USA300, ACME, Operón arc, Proteína hipotética SAUSA300_0063,
Activador transcripcional.
4
DETERMINATION in vitro PROTEIN PARTICIPATION IN THE ACTIVATION
HYPOTHETICAL SAUSA300_0063 OPERON arc PRESENT IN THE MOBILE ELEMENT
FOR CATABOLISM OF ARGININE (ACME) IN CLONE USA300 PANDEMIC
Introduction: In the last two decades has reported the emergence and rapid spread of methicillin-
resistant Staphylococcus aureus USA300 clone with a wide distribution and pathogenicity, causing
human infections not only in the hospital but in the community. The mobile genetic element for
catabolism of arginine (ACME) was identified only in this clone and inside this element is one arc
operon having the same catabolic function ACME providing ATP under anaerobic conditions and
in acidic environments increases pH medium favoring the ability to colonize. Previous studies in
our laboratory showed that overexpression arcACME operon in clone USA300 is possibly given by
the insert sausa300_0063 within this operon gene encoding a transcriptional regulator.
Objective: Determine the participation SAUSA300_0063 hypothetical protein in the activation of
arcACME operon in the USA300 clone pandemic.
Materials and Methods: Using the system pET303 / CT-His expression in BL21 (DE3)
recombinant protein produced SAUSA300_0063 arcACME operon which was purified by
electroelution. In vitro binding of recombinant protein SAUSA300_0063 to the promoter sequence
of the arcACME operon determined by assays retarding gel and real-time PCR the relative
transcription sausa300_0063, arcCACME, arcCcons and arcR genes it was analyzed in anaerobiosis in
presence or absence of arginine.
Results: Experimental evidence showed that establishes its binding protein SAUSA300_0063 in
arcACME operon promoter suggesting an approach about its function as a transcriptional regulator
belonging to the family of proteins CRP / FNR. Additionally a direct relationship in the increased
transcription of sausa300_0063 genes and arcC operon arcACME indicating the possible participation
SAUSA300_0063 protein self-activation arcACME operon given to this new structure operon
facilitating regulation.
Conclusion: SAUSA300_0063 protein participes in the activation arcACME operon across binding to
its promoter region and this activation is greater than that found in the constituent arc operon. These
results suggest that the structural change in the arcACME operon found facilitates participation
SAUSA300_0063 self-protein in the activation of this operon and given to this new structure could
be regulated in cis mode considered a highly advantageous system.
Keywords: Clone USA300, ACME, Operon arc, SAUSA300_0063 hypothetical protein,
transcriptional activator.
5
INTRODUCCIÓN
Staphylococcus aureus es un microorganismo de gran importancia médica ya que es uno de
los principales agentes causantes de infecciones tanto en pacientes hospitalizados como en personas
sanas en la comunidad [1] . Estas infecciones pueden ser leves en piel y tejidos blandos como
abscesos y celulitis, hasta graves como neumonías y bacteremias. Este patógeno tiene una gran
capacidad de adquirir elementos genéticos móviles, los cuales pueden transportar mecanismos de
resistencia a los antibióticos y factores de virulencia, lo cual dificulta enormemente el tratamiento
de sus infecciones [2].
USA300 es un clon de Staphylococcus aureus que posee resistencia a los antibióticos, alta
capacidad de virulencia y diseminación el cual ha sido asociado con enfermedades invasivas, [3].
La secuenciación del genoma del clon USA300 permitió identificar por primera vez en S. aureus un
elemento móvil que contiene un operón arc relacionado con el catabolismo de la arginina, este
elemento fue denominado como ACME (Arginine Catabolism Mobile Element) [3]. Varios estudios
han demostrado que la presencia de ACME aumenta la capacidad del clon USA300 de contrarrestar
las barreras físicas e inmunológicas de la piel a través de la disminución del pH por medio de la
producción de amonio y resistencia a poliaminas, posiblemente por las actividades funcionales de
algunos genes [4, 5]. Adicionalmente ACME proporciona una mayor capacidad de obtención de
ATP en condiciones de anaerobiosis que otras cepas de S aureus, favoreciendo la capacidad
adaptativa y permanencia del patógeno en el huésped [6]. En condiciones de estrés como la
ausencia de oxígeno, este clon garantiza su crecimiento por la fermentación de la glucosa o
mediante el uso del nitrato como aceptor alternativo de electrones, pero cuando no está disponible
ni la glucosa ni el nitrato, la arginina puede servir como única fuente de energía debido a la
presencia del operón arc que codifica para la ruta del catabolismo de la Arginina deiminasa (ADI)
dentro de ACME [6] .
Aunque S. aureus posee un operón arc constitutivo (arccons), el operón arc encontrado en ACME
(arcACME) no mantiene la misma organización de los genes en comparación con el constitutivo, pero
si mantiene los principales genes estructurales arcABDC [7, 8] con un rango de identidad entre el
45,9% y 81,3% y de similaridad entre 63,1% y 89,9%. Adicionalmente dos genes reguladores, argR
que codifica para una proteína reguladora transcripcional de la familia ArgR/AhrC y que actúa
como un represor del operón arc, interactuando específicamente en su región promotora, y arcR que
pertenece a la familia de proteínas CRP/FNR (proteína receptora de AMPc / proteína activadora de
6
la expresión de fumarato y de la enzima nitrato reductasa) [9-13]. Este regulador arcR se une de
manera específica y reversible a la secuencia TGTGA-N6-TCACA que se encuentra en la región
promotora ubicada corriente arriba del operón arccons [6, 14], este gen está codificado en la hebra
sentido (al igual que el grupo de genes arccons ABDC) a 98 pares de bases (pb) corriente abajo del
operón arc y se encuentra bajo una regulación independiente. El operón arcACME posee los genes
arcABDC y argR, pero a diferencia del arccons no tiene el gen arcR [3], pero tiene un marco abierto
de lectura (ORF) insertado en la región central. Este ORF es denominado como gen
SAUSA300_0063 y codifica para una proteína hipotética que pertenece a la familia de Proteínas
Receptoras de AMPc–CRP (al igual que la proteína ArcR), indicando que cumple una función
género/especie específica, pero presenta una baja identidad (40%) y similaridad (65%) con arcR del
operón arccons. [11, 14, 15]. Adicionalmente, el análisis in sílico también ha permitido identificar la
secuencia TGTGA-N6-TCACA dentro de la región promotora del operón arcACME. Estos resultados
nos permiten sugerir que la proteína hipotética SAUSA300_0063 es un regulador transcripcional del
operón arcACME y que por su localización puede ejercer una regulación en cis, lo cual podría
conllevar a una autoactivación de este operón permitiéndole al clon USA300 una mayor capacidad
de degradar arginina y obtener ATP en condiciones anaeróbicas y aumentar la producción de
amonio para la homeostasis del pH en un proceso infeccioso.
7
JUSTIFICACIÓN.
En los últimos años, la emergencia y rápida diseminación de los aislamientos de
Staphylococcus aureus resistentes a meticilina con genotipo comunitario (SARM-GC) han
desencadenado una amenaza que ha alcanzado proporciones epidémicas, cambiando el paradigma
de la percepción y el tratamiento de las infecciones por este patógeno [16, 17]. Algunos estudios
han demostrado que las mayores implicaciones causadas por SARM-GC son las limitadas opciones
de tratamiento y control [18], lo que conlleva al aumento de la morbilidad o mortalidad, siendo esta
aproximadamente dos veces superior en comparación con el Staphylococcus aureus sensible a
meticilina (SASM) [19, 20]. El impacto clínico de SARM-GC ha sido asociado con una mayor
duración de estados febriles, hospitalizaciones prolongadas, mayor incidencia de tuberculosis
pulmonar, miositis, osteomielitis y sépsis estafilocócica [21]. La estadía hospitalaria post-operatoria
y la dificultad para el inicio de una terapia apropiada se ven directamente asociadas con el impacto
económico. Rubin y colaboradores estiman como la mortalidad y los costos están directamente
relacionados, ya que el tratamiento de una infección por SARM-GC puede costar entre 6 % a 10 %
más que una infección SASM, indicando que esta diferencia no es solo por la virulencia del
patógeno sino por el aumento en el costo de los antibióticos [22]. Así mismo los altos costos que
demandan las infecciones sitio quirúrgicas causadas por SARM-GC, son responsables de
aproximadamente $ 1,6 mil millones de dólares en gastos hospitalarios anuales en Estados Unidos
[23]. El impacto de las enfermedades infecciosas en el desarrollo social son muy importantes no
solo por que enmarcan los costos directos de la asistencia sanitaria sino porque pueden desorientar
la expectativa de vida del paciente, proporcionando tensión emocional que agrava su capacidad
funcional y por ende la pérdida de productividad debido a una muerte prematura o una enfermedad
crónica [24].
El clon USA300 ha sido el más prevalente en infecciones aisladas de SARM-GC en Norte América
tanto en adultos como en niños sin factores de riesgo [25], ha causado brotes epidémicos de
infecciones de la piel y tejidos blandos en individuos sanos en 21 estados de EUA, Canadá y Europa
[1]. La secuenciación de su genoma completo, ha permitido identificar algunos posibles factores
asociados con su alta virulencia, sin embargo, la totalidad de estos factores no han logrado descifrar
la patogénesis de la infección causada por este clon [26]. Es probable que la adquisición del operón
arcACME y en especial el ORF que codifica para una proteína hipotética SAUSA300_0063 la cual
posee homología con reguladores transcripcionales, sea una estrategia energéticamente favorable
8
mediante la autoactivación de la ruta del catabolismo de la arginina para obtención de energía en
ausencia de glucosa o nitrato, facilitando la supervivencia de la bacteria confiriéndole mayor
virulencia y capacidad para colonizar y producir infecciones en la piel [3, 6, 27, 28].
A pesar de la importancia que tiene ACME en las infecciones causadas por USA300, no existe
información sobre nuevos mecanismos de regulación para comprender la biología básica de sus
procesos patogénicos, por tal razón es importante identificar factores genéticos implicados en su
virulencia, capacidad adaptativa y permanencia del patógeno en el hospedero para poder generar
blancos terapéuticos e implementar nuevas estrategias de erradicación y control de este clon
asociado a la comunidad.
9
1. MARCO TEÓRICO
1.1 Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus es un microorganismo Gram positivo, aerobio y anaerobio facultativo,
patógeno oportunista que hace parte del microbioma humano y tiene la capacidad de generar
infecciones, no solo en pacientes hospitalizados sino también en personas aparentemente sanas
colonizando de forma asintomática alrededor de un tercio de la población. Este microorganismo
afecta principalmente el epitelio causando infecciones leves como granos, forúnculos, impétigo,
foliculitis, abscesos; moderadamente graves como pérdida de piel, endocarditis, síndrome de shock
tóxico; e infecciones crónicas como osteomielitis, endocarditis, meningitis y fascitis necrotizante
que requieren la adaptación exitosa del patógeno en el huésped humano [6, 29, 30]. Su éxito como
patógeno está asociado a genes de virulencia y patogenicidad que le confieren la adquisición de
nutrientes, proteínas de unión a fibrinógeno, fibronectina, colágeno, coagulasa y evasión de la
respuesta inmune como las enterotoxinas estafilocócicas (SEs), la toxina del síndrome de choque
tóxico (TSST), proteína A, lipasas, polisacáridos capsulares, toxinas y hemolisinas [31, 32].
1.2 Resistencia a los β-lactámicos en Staphylococcus aureus y su epidemiologia
Naturalmente S. aureus es susceptible a los antibióticos, sin embargo, tiene una extraordinaria
capacidad para adquirir mecanismos de resistencia a ellos. Por ejemplo, en 1961 emergieron
aislamientos de S. aureus con resistencia a la mayoría de antibióticos beta-lactámicos, los cuales
fueron denominados como SARM (Staphylococcus aureus resistentes a meticilina). Este tipo de
aislamientos tuvieron su origen a partir de aislamientos de Staphylococcus aureus que adquirieron
un elemento genético móvil denominado casete estafilocócico cromosomal mec (SCCmec) el cual
porta el gen mecA o sus homólogos mecB o mecC [33, 34]. Estos genes codifican para una PBP
(Penicillin Binding Protein ) llamada PBP2´, la cual tiene baja afinidad por los antibióticos beta-
lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenems y monobactámicos) permitiendo que continúe
la síntesis de la pared bacteriana [34]. Inicialmente, estos aislamientos afectaban principalmente a
pacientes hospitalizados por lo cual se denominaron como SARM con genotipo hospitalario
(SARM-GH). Sin embargo, desde 1990 se ha reportado el surgimiento de aislamientos SARM
causando infecciones en personas “sanas” de la comunidad [35]. Estos aislamientos son
genéticamente diferentes a los de ámbito hospitalario y para diferenciarlos de estos son
denominados como SARM con genotipo comunitario (SARM-GC). Varios estudios han
demostrado que los SARM-GC, aunque poseen menos mecanismos de resistencia a los antibióticos,
10
son más patogénicos que los SARM-GH por la adquisición y/o sobreexpresión de algunos factores
de virulencia como la leucoccidina Panton Valentine (PVL) y las modulinas [35, 36]. En los últimos
años los SARM-GC además de causar infecciones en la comunidad están causando infecciones en
pacientes hospitalizados desplazando a los SARM-GH [37, 38], lo cual demuestra su éxito genético.
Estudios poblacionales en Estado Unidos mostraron el impacto de los aislamientos que circulan
principalmente en el medio hospitalario (SARM-GH) registrándose una incidencia anual de 28,4
infecciones por 100.000 habitantes, de las cuales el 50% son de adquisición hospitalaria por causa
fundamental de infecciones de localización quirúrgica; una emergencia que también se observó en
Europa, especialmente en la vertiente mediterránea [39]. A mediados de los 90´s la aparición y
diseminación de SARM-GC fue reportado en diferentes grupos sociales, destacándose las
infecciones asociadas a poblaciones de adultos y pediátricos [40]. Estos aislamientos se caracterizan
porque son positivos para SARM en las primeras horas de ingreso hospitalario, no presentan
antecedentes de hospitalización y tampoco factores de riesgo para infecciones por este patógeno
[41]. Se ha encontrado que el 70 y 80% de las infecciones por SARM-GC se manifiestan en la piel
y tejidos blandos incluyendo infecciones piógenas como abscesos y celulitis (aunque algunas de
ellas pueden llegar a producir infecciones más graves como choque tóxico, neumonías, miositis y
bacteremias) [2, 34, 42]. Algunos estudios han sugerido que SARM-GC es más virulento por su
mayor capacidad de colonización, crecimiento y diseminación, así como mayor producción de
factores de virulencia que los aislamientos SARM-GH [43, 44] .
1.3 Clon USA300 de Staphylococcus aureus
A nivel mundial se reconocen por lo menos 6 clones principales SARM, entre los cuales se destaca
el clon USA300, asociado inicialmente con actividades grupales en poblaciones urbanas y étnicas
[35, 45], pero actualmente afectando a diversos grupos poblacionales. Este clon fue identificado por
primera vez en Estados Unidos con un tipo de secuencia 8 (ST8) siendo uno de los clones iniciales
SARM-GC, asociado con enfermedades invasivas, incluyendo septicemia grave, neumonía y
fascitis necrosantes [3]. USA300 fue de gran interés para el Centro de Control y Prevención de
Enfermedades (CDC) en el año 2000 por la generación de dos brotes en la comunidad. A la fecha se
han reportado infecciones ocasionadas por este clon en países como Australia, Austria, Dinamarca,
Alemania, Italia, Japón, Suiza, y Hawái. En Colombia y varios países de Latinoamérica se ha
reportado la diseminación de aislamientos SARM-GC relacionados genéticamente con USA300
11
[35, 46-48]. Esto muestra el extraordinario éxito genético de este clon despertando un afán para la
búsqueda de los factores genéticos que puedan estar aumentando su capacidad de infección.
Las causas de la dominancia de este clon no son claras, aunque la evolución de la virulencia y
patogenicidad de los clones de S. aureus con frecuencia se analizan en términos de adquisición,
pérdida o intercambio de elementos genéticos móviles de modo horizontal entre microorganismos
como Staphylococcus epidermidis [49, 50]. Esta habilidad de ser portador y/o aceptor de
información genética puede atribuirle a una bacteria ventajas selectivas incrementando su fortaleza
fisiológica mediante la adquisición de fragmentos de ADN que codifican factores de virulencia y de
resistencia, así como enzimas que median su transferencia e integración en el nuevo ADN del
huésped [1, 28, 51]. Algunos estudios epidemiológicos han indicado que la variabilidad de
infecciones invasivas asociadas al clon ha incrementado el interés en conocer no solo mecanismos
asociados a la virulencia y patogenicidad sino también a los factores de susceptibilidad del huésped
[52-54]. Sin embargo algunos autores plantean que el éxito de S.aureus es debido a los factores
patogénicos que posee divididos en tres grupos principales, primero genes de asociación celular
los cuales incluyen adhesinas de la superficie microbiana y polisacáridos de la cápsula, segundo
secreción de toxinas exoproteinas como citolisinas y proteasas extracelulares y tercero genes de
regulación en respuesta a las condiciones de stress ambiental [55].
1.4 Elemento genético móvil para el catabolismo de la arginina (ACME)
La capacidad de S. aureus para adaptarse a cambios en la concentración de oxígeno implica la
existencia de sistemas que regulan la transición de un crecimiento aerobio a anaerobio mediante
fermentación de la glucosa o por el uso del nitrato como aceptor de electrones, sin embargo en
ausencia de estos factores la arginina puede servir de fuente de energía, pero además favoreciendo
la patogénesis [6, 30]. Algunos autores plantean que esta habilidad anaerobia ha estado
estrechamente relacionado con el reciente éxito genético del clon USA300 quien posee de manera
exclusiva en su genoma un Elemento Genético Móvil para el Catabolismo de la Arginina
denominado ACME de aproximadamente 31Kb ubicado corriente abajo de SCCmec [49]. En este
elemento genético se han identificado dos operones de mayor relevancia: el operón Opp que
codifica para una permeasa putativa designada como Opp-3 para diferenciarlo de los operones
constitutivos Opp-1, Opp -2 y Opp -4 y el operón arcACME que participa en la vía Arginina
Deiminasa (ADI). Actualmente se han descrito tres tipos de ACME, el tipo I contiene los operones
12
arc y Opp-3 como en el clon USA300, el tipo II presenta el operón arc pero no Opp-3 y el tipo III
contiene Opp-3 sin el operón arc (Figura 1) [50, 56-59].
Figura 1. Esquema de las estructuras genéticas de los diferentes tipos de ACME. Tipo I
(Staphylococcus aureus), Tipo II (Staphylococcus epidermidis), Modificada de Shore AC, 2011
[58]. Actualmente no se encuentra un esquema referenciado para ACME tipo III.
La vía ADI está constituida por el operón arc que contiene cuatro enzimas principales (Figura 2 y
Figura 3): el gen arcA, que codifica para la enzima arginina deiminasa (ADI) (EC 3.5.3.6)
perteneciente a la familia de hidrolasas, y que actúa sobre enlaces carbono-nitrógeno,
específicamente en amidinas. Esta enzima cataliza la conversión de arginina a citrulina y amonio.
arcB que codifica la ornitina carbamoiltransferasa (OTC) (EC 2.1.3.3) perteneciente a la familia de
transferasas, cataliza la reacción de citrulina en ornitina y carbamoil fosfato. arcC que codifica una
carbamato quinasa (CK), perteneciente a la familia de transferasas de grupos fosfato, transformando
el carbamoil fosfato en CO2 y NH3 y arcD que codifica una proteína hidrofóbica ubicada en la
membrana plasmática como antiporter arginina-ornitina. Estas enzimas están involucradas en la
conversión de la Arginina en ornitina, amonio y CO2 con la producción de 1 mol de ATP por mol
de arginina consumida siendo la fuente de energía en ausencia de glucosa o nitrato [3, 6, 27, 28] [9].
13
Esta ruta metabólica se encuentra ampliamente distribuida entre organismos procariotas de modo
constitutivo en el genoma, y en algunos está involucrada como mecanismo de protección en
ambientes ácidos, ya que la acumulación de amonio eleva el pH del medio favoreciendo la
capacidad de colonización y virulencia en infecciones en la piel [3, 11, 28].
Figura 2. Vía Arginina Deiminasa para la degradación de la arginina. ADI, Arginina deiminasa.
OTC, ornitina carbamoiltransferasa. CK, carbamato quinasa. Modificado de Araque [60].
En el clon USA300, el operón arc está duplicado, encontrándose de modo constitutivo (arccons) y
también adquirido (arcACME) postulándose este último como uno de los posibles factores que han
contribuido al aumento de la capacidad que tiene este clon para crecer y sobrevivir en el huésped,
aportándole ventajas selectivas como el incremento de su fortaleza fisiológica (capacidad de
invasión intracelular, crecimiento, supervivencia en condiciones anaerobias, con bajo pH,
patogenicidad) y dando lugar a su amplia diseminación y dominancia [61] [3, 5, 28, 62-64].
Algunos operones bacterianos poseen promotores que no pueden interactuar eficientemente con la
RNA polimerasa ya que requieren proteínas activadoras para el inicio de la transcripción. Las
proteínas más conocidos en el control de la expresión génica bajo ciertas condiciones de estrés
ambiental son la proteína CRP (Proteína receptora de AMP cíclico) y la proteína FNR (Fumarato
nitrato reductasa), quienes están implicadas en la expresión de enzimas para el metabolismo de
azúcares y en la expresión de genes regulados por el oxígeno [65, 66]. Los niveles de AMPc están
14
inversamente relacionados con la concentración de glucosa, de esta forma en ausencia de azucares
el complejo CRP-AMPc contribuye como un efector o regulador positivo en la transcripción de los
genes favoreciendo la unión de la RNA polimerasa (Figura 4) [65].
Figura 3. Organización de los operones arccon, arcACME y su localización en el genoma de USA300.
A. operón arc constitutivo, B. operón arc ubicado en ACME. Regulador de la biosíntesis de
arginina (argR), Arginina deiminasa (arcA), ornitina carbamoiltransferasa (arcB), antiporter de
arginina-ornitina (arcD), carbamato quinasa (arcC), proteína reguladora transcripcional de la
familia ArgR/AhrC, proteína reguladora transcripcional de la familia CRP/FNR (arcR) y proteína
hipotética SAUSA300_0063 de la familia CRP/FNR (ORF). Modificado de Diep y colaboradores
[3] y Makhlin y colaboradores [6].
El promotor del operón arcACME presentan una secuencia palindrómica conservada TGTGA-N6-
TCACA específica para moléculas reguladoras pertenecientes a la familia de proteínas CRP y FNR
con identidad y similaridad del 44% con el promotor del operón arccons (Figura 5) [6].
1.5 Regulación del Elemento genético móvil para el catabolismo de la arginina (ACME)
Los factores de transcripción de unión al ADN, juegan un papel importante en procesos de
represión o activación de los genes en respuesta a condiciones ambientales y fisiológicos [15]. La
regulación de los operones arccons y arcACME está mediada por los genes argR de la familia de
15
Figura 4. Regulación de la transcripción del operón Lac. Complejo CRP-cAMP y RNA polimerasa
para la transcripción. Mathews y colaboradores [65].
Figura 5. Alineamiento de las secuencias del promotor arc en el clon USA300. La ubicación de las
estructuras conservadas entre los promotores de arccons y arcACME se observan señaladas con color
verde. Número de acceso de la secuencia en el GenBank NC_007793.1.
Proteínas ArgR/AhrC actuando como un represor transcripcional en la activación de los genes
implicados en la biosíntesis y el transporte de la arginina [67, 68]. Adicionalmente en el operón
arccons se ha identificado el gen arcR, el cual codifica una proteína perteneciente a la familia tipo
CRP/FNR que son reguladores transcripcionales que se activan en condiciones de estrés ambiental
como deficiencia de oxígeno, supervivencia fase estacionaria, metabolismo anaeróbico
(fermentación, desnitrificación, fijación de nitrógeno, halorespiración), catabolismo de la arginina,
oxidación de CO, así mismo participa en procesos de Quorum Sensing, biosíntesis del flagelo y en
la degradación de compuestos aromáticos [6, 12, 13, 69].
Sitio Unión Crp/Fnr -35 -10 Sitio Unión Ribosoma (RBS)
16
Makhlin y colaboradores establecieron como la proteína reguladora ArcR se une a la secuencia
palindrómica conservada (TGTGA-N6-TCACA) localizada corriente arriba del operón arccons y
posiblemente activa su transcripción [6, 70]. El gen arcR se encuentra localizado corriente abajo del
operón bajo una regulación independiente. En contraste, el operón arcACME presenta algunas
diferencias con el operón arccons (figura 3) como la organización de los genes ADBC, variaciones en
las secuencias de las proteínas producidas, los rangos de identidad y similaridad, no contiene un gen
arcR corriente abajo del operón y la presencia de un ORF en la mitad de los genes arcD y arcB.
Análisis in silico realizados en nuestro laboratorio han encontrado que este ORF codifica para la
proteína hipotética SAUSA300_0063 , que consta de 229 aminoácidos y posiblemente pertenece a la
familia de proteínas CRP/FNR, ya que conserva los dominios CRP, CAP_ED dominio efector de la
familia de factores de transcripción CAP (proteína receptora de AMPc) y de unión a dominios FNR
y hélice-vuelta-hélice (HTH) característico de dominios de unión a secuencias específicas de ADN
[11, 14, 15] (Figura 6). Estos dominios también se encuentran en la proteína ArcR codificada por el
gen arcR en el operón arccons. Sin embargo, existe una identidad del 40% y una similaridad del 65%
entre estas dos proteínas.
Figura 6. Esquema de los dominios conservados en las proteínas arcR y SAUSA300_0063 en el
clon USA300. Número de acceso de la secuencia en el GenBank NC_007793.1.
arcR
SAUSA300_0063
Aminoácidos
Aminoácidos
17
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo principal
Determinación in vitro de la participación de la proteína hipotética SAUSA300_0063 en la
activación del operón arc presente en el elemento móvil para el catabolismo de la arginina (ACME)
en el clon pandémico USA300.
2.2 Objetivos específicos
1. Producir y purificar la proteína recombinante SAUSA300_0063 del operón arcACME del
clon USA300.
2. Establecer la unión in vitro de la proteína recombinante SAUSA300_0063 al promotor del
operón arcACME del clon USA300.
3. Evaluar la transcripción de los genes SAUSA300_0063 y arcC del operón arcACME y del
operón arccons en el clon pandémico USA300 en condiciones de anaerobiosis, sin glucosa y
en presencia o ausencia de arginina
18
3. METODOLOGÍA
3.1 Cepas bacterianas, plásmidos, y condiciones de crecimiento
Las principales características de las cepas y plásmidos empleados en el estudio están descritas en la
Tabla 1. Las cepas de S. aureus se sembraron en agar Infusión Cerebro Corazón (BHI) a 37 °C
durante 24 horas, luego una o dos colonias se resembraron a 37°C con agitación a 200 rpm en caldo
BHI y/o caldo Luria Bertani (LB) suplementado con ampicilina (100µg/ml) según se requirió en
cada ensayo. Las cepas de E. coli TOP10 recombinantes (con el plásmido pGEM-T) se incubaron a
37°C por 2 horas a 150rpm en caldo súper óptimo con represión catabólica SOC para aumentar la
eficacia de la transformación y luego para la selección de las células transformadas se sembraron
homogéneamente en cajas de Petri con medio LB suplementado con ampicilina (100µg/ml),
isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (2mM) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
galactopiranósido (X-Gal) (1mg). Para el crecimiento en condiciones de anaerobiosis, las cepas de
S. aureus se sembraron en caldo Tripticasa Soya (TSB) a 37°C sin agitación por 20 horas utilizando
el estuche comercial GENbag microaer (BioMérieux®) y empleando resazurina como indicador
anaeróbico (Oxoid®).
3.2 Producción y purificación de la proteína recombinante SAUSA300_0063 del operón arcACME
del clon USA300
3.2.1 Extracción de ADN genómico
La extracción de ADN genómico se realizó utilizando un protocolo estandarizado previamente en
el Laboratorio de Genética Molecular Bacteriana (LGMB) basado en el método de extracción
con Fenol-Cloroformo y precipitación con etanol. Brevemente, se partió de una siembra por
agotamiento del clon USA300 en agar BHI incubado a 37°C por 24 horas, luego 1 colonia fue
resuspendida en 5 ml de caldo BHI e incubada a 37°C por toda la noche sin agitación hasta
alcanzar una densidad óptica (OD600nm) entre 0,6 y 0,8. Posteriormente, esta suspensión
bacteriana se centrifugó a 3500 rpm por 7 minutos, el sobrenadante fue descartado y el botón
fue resuspendido con 100µl de solución de lisis (Tris HCL 50 mM, EDTA 10 mM,
Lisostafina 10μg/mL, SDS 1,25%, Sacarosa 7%) a 37°C por 45 minutos (lisis de la pared
bacteriana). Luego se adicionó una solución de fenol-cloroformo (1:1), se agitó fuerte, se
19
centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos y posteriormente el sobrenadante se transfirió a un
nuevo tubo. Para la precipitación del ADN se adicionó 400μL de etanol absoluto frio (-20°C), se
mezcló suavemente por inversión 4 veces y se dejo a -80°C durante 30 minutos. Luego se
centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos, se eliminó el etanol por inversión dejándo el tubo
bocabajo durante 2 horas. Finalmente se resuspendió el botón en H2O destilada desionizada estéril y
se almacenó a -20°C. La cuantificación y pureza del ADN se determinó mediante la relación de
la absorbancia a 260nm y 280nm en el equipo NanoDrop® ND-1000.
Tabla 1. Cepas Bacterianas y plásmidos empleados en el estudio.
Cepas bacterianas Características Referencia
S. aureus USA300
Mec+, ACME+, ORF+, arcCACME+, arcCcons+, arcR+,
gyrB+
[3], LGMB
S. aureus NCTC8325
Mec-, ACME-,ORF-, arcCACME-, arcCcons+, arcR+, gyrB+
LGMB
E. coli TOP10
F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74
nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16
rpsL(StrR) endA1 λ-
LGMB
E. coli BL21(DE3)
F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB
-) λ(DE3 [lacI lacUV5-
T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])
Invitrogen
Plásmidos Características Referencia
pGEM-T Easy
Vector linealizado con EcoRV y adición de una T en los
extremos 3'.
[6],
Promega
pET303/CT-His
Vector de expresión, regulado por T7 con una etiqueta de
6 Histidinas en el extremo C-terminal, resistente a ampR
Invitrogen
pG-KJE8
Vector de expresión para chaperonas, araBp (dnaK-dnaJ-
grpE) trpp (groES-groEL), resistentes a cloR
BM
pGEM-T63
pGEM-T Easy con el gen SAUSA300_0063
LGMB
pET-CT63
pET303/CT-His con el gen SAUSA300_0063
LGMB
LGMB: perteneciente al Laboratorio de Genética Molecular Bacteriana, Universidad El Bosque.
BM: perteneciente al Laboratorio de Biología Molecular y Parasitología, Universidad El Bosque.
20
3.2.2 Amplificación y purificación del gen SAUSA300_0063
Como se mencionó anteriormente, el gen SAUSA300_0063 tiene un tamaño total de 690pb, y
codifica una proteína de 229 aminoácidos. Debido a su pequeño tamaño, se produjo una proteína
recombinante completa de este gen, para esto, una pareja de primers específicos fueron diseñados a
partir de la secuencia del genoma del clon USA300_FPR3757 (NC_007793.1) descargada de la
base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Tabla 2).
Para facilitar el proceso de purificación de la proteína recombinante y direccionar la clonación del
fragmento, el primer 63as fue diseñado sin incluir la secuencia para el codón de parada y permitir la
inclusión de la secuencia codificante para las 6 histidinas. Adicionalmente, a los primers se le
adicionaron secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción XbaI y NsiI en su
extremo 5’ para su clonación en el plásmido pET303/CT-His (Tabla 2). Debido al bajo porcentaje
de G y C de los primers (ocasionado por el bajo porcentaje de G y C del genoma de S. aureus,
32,8%), fue necesario determinar con exactitud la mejor temperatura de complementariedad (Tm)
usando 45, 50, 56 y 59°C. Finalmente, la amplificación del gen SAUSA300_0063 se realizó por
medio del siguiente programa: denaturación a 95°C por 5 minutos, seguido de 30 ciclos
conformados por un paso de denaturación a 95°C por 20 segundos, seguido por un paso a 60°C por
30 segundos y una extensión a 72°C por 2 minutos; finalmente con un paso de extensión a 72°C por
7 minutos. Los productos amplificados con la ADN polimerasa DreamTaq (Thermo Scientific)
fueron visualizados por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%, teñidos con solución de
bromuro de etidio 0.1 % y fotografiados en un documentador de geles. La banda obtenida con los
extremos de reconocimiento a las enzimas de restricción (714pb) se purificó a partir del gel
mediante el estuche comercial QIAkit Gel Extraction (Qiagen).
3.2.3 Clonación del gen SAUSA300_0063 en el vector pGEM-T Easy y transformación en
E. coli TOP10
La clonación del gen SAUSA300_0063 en el vector se realizó de acuerdo a las condiciones del
fabricante (Promega), así: 100ng del fragmento de ADN purificado fue mezclado con 50ng del
vector pGEM-T, 3 unidades de T4 ADN Ligasa y 1X de buffer de ligación. La reacción se mezcló
por pipeteo y luego se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. Como control del proceso de
ligación se utilizó un fragmento del gen luciferasa (luc), el cual es proporcionado por el estuche
comercial. Las bacterias competentes E. coli TOP10 se transformaron con el vector recombinante
pGEM-T63 con el gen SAUSA300_0063 para facilitar la propagación del vector. El proceso se
realizó de la siguiente manera: 2µl de la reacción de ligación se mezclaron con 1 × 108 bacterias
competentes E. coli TOP10 en 50µl y para el control negativo se agregó 2 μL de la mezcla de
21
ligación sin ADN con 2 × 108 bacterias competentes E. coli TOP10. Los tubos se mezclaron por
inversión y se incubaron en hielo por 20 minutos, posteriormente se realizó un choque térmico de
50 segundos a 42°C sin agitar e inmediatamente se incubo nuevamente en hielo por 2 minutos. A
las mezclas de transformación se añadieron 450μl a temperatura ambiente de caldo súper óptimo
con represión catabólica SOC (utilizado para aumentar la eficacia de transformación de células
competentes, Hanahan en 1983) y se incubaron a 37°C por 2 horas en agitación a 150rpm, luego,
100µl de esta suspensión de células transformadas se sembraron homogéneamente utilizando asa de
Drigalsky en cajas de Petri con medio LB suplementado con ampicilina (100µg/ml), IPTG (2mM),
X-Gal (1mg) y se incubaron a 37 °C por toda la noche. Las cepas transformadas con el plásmido
(colonias blancas) pGEM-T63 se sembraron en cajas de Petri con medio LB suplementado con
ampicilina (100ug/ml), se incubaron a 37 °C por toda la noche y fueron confirmadas por medio de
PCR utilizando los primers SP6, T7, 63s y 63as (Tabla 2). La colonia recombinante confirmada se
sembró en 3mL de caldo LB suplementado con ampicilina (100µg/ml) e incubada a 37°C por 16
horas en agitación constante (150rpm). El plásmido pGEM-T63 fue extraído por medio del
estuche comercial Wizard®Plus Minipreps DNA Purification System (Promega), se cuantificó y
por PCR se evaluó la presencia del gen SAUSA300_0063 con las diferentes combinaciones de los
primers descritos en la Tabla 2. Las cepas transformadas con el gen fueron conservadas a -80°C en
caldo LB suplementado con ampicilina (100µg/ml) con 40% de glicerol.
3.2.4 Obtención del plásmido pETCT-63 y transformación en E. coli TOP10
Para la clonación del gen en el vector de expresión pET303/CT-His, el plásmido pGEM-T63
obtenido previamente y el vector de expresión fueron sometidos a una doble digestión con las
enzimas de restricción NseI, a 37°C por 2 horas, y XbaI a 37°C por 5 horas. La restricción de los
productos fue visualizada en gel de agarosa al 1,5%. La banda obtenida correspondiente al gen
SAUSA300_0063 fue purificada a partir del gel mediante el estuche comercial QIAkit Gel
Extraction (Qiagen), se cuantificó en el equipo NanoDrop® y se realizó una electroforesis en
agarosa para su confirmación. La clonación en el vector de expresión se realizó de acuerdo a las
recomendaciones del fabricante (Champion™ pET302/NT-His, pET303/CT-His, Invitrogen).
22
Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados en el estudio. Primers para PCR, PCR en tiempo real y
síntesis de sondas para los ensayos de retardamiento en gel.
Primers *Secuencia 5’ 3´ Descripción
63s
atgcattctagaGTTATGTATGAAGAAAAT
Amplificación del gen SAUSA300_0063
para clonación y confirmación de la
clonación en pGEM-T Easy y
pET303/CT-His.
atgcat: Secuencia para la enzima NsiI.
tctaga: Secuencia para la enzima XbaI
63as
TCGTGCatgcatTTTTTTTATAATCCAAT
SP6 CTATAGTGTCACCTAAAT
Promotor SP6 con sitio de inicio de la
trascripción en pGEM-T Easy.
T7s TAATACGACTCACTATAGGG
Promotor T7 sentido con sitio de inicio
de la trascripción en pGEM-T Easy y
pET303/CT-His.
T7as
TAGTTATTGCTCAGCGGTGG
Promotor T7 antisentido con sitio de
terminación de la trascripción en
pET303/CT-His.
GP460b
GTACAAAATACATATTCATAC
Producción de la sonda marcada con
biotina de la región promotora del
operón arcACME. con el sitio de unión a
proteinas CRP/FNR
GP461b
AGCGTTTTATAATGTGAATGT
GP460
GTACAAAATACATATTCATAC
Producción de la sonda de la región
promotora del operón arcACME
GP461 AGCGTTTTATAATGTGAATGT
gyrB
CAAATGATCACAGCATTTGGTACAG
CGGCATCAGTCATAATGACGAT
Amplificación fragmento del gen gyrB
para PCR en tiempo real y diseño sonda
como competidor no especifico para el
retardamiento en gel.
63TR GAATCTTCTAATATTACTGGTGAC
GTAAAGTTAATATTTTACAATCTG
Amplificación fragmento del gen
SAUSA300_0063 para PCR en
tiempo real.
arcR TR
TGTGTACAGCATTAACCGAT
TTTACTTGTTAATGCCATGT
Amplificación fragmento del gen arcR
para PCR en tiempo real.
arcC cons
TCACCGCGCGTATTGTC Amplificación fragmento del gen
arcC cons para PCR en tiempo
real.
TGCGATTGATTTCAGTTTCCA
arcCACME TTTAAATTATGCGGCGGAAC Amplificación fragmento del gen arcC
ACME para PCR en tiempo real. GAAAGCAGAATCATCGCTTGC
*La especificidad de los primers fue corroborada por medio del programa BLAST (Basic Local Aligment Search Tool).
23
Brevemente, la ligación del gen purificado en el vector se realizó con una relación 1:1 inserto:
plásmido, utilizando la enzima T4 ADN Ligase (Invitrogen) a temperatura ambiente por 1 hora.
Para la transformación, 10 μl de la mezcla anterior fueron adicionados a 1x108 células competentes
E. coli TOP10 resuspendidas en 50μl. Como control de la reacción de transformación se utilizó el
plásmido pET303/CT-Rac Kinase suministrado por el estuche y como control negativo medio LB
sin ADN ligado. Los tubos fueron mezclados por inversión y se incubaron por 30 minutos en hielo
sin agitación, luego se colocaron a 42°C durante 40 segundos sin agitación e inmediatamente se
incubó en hielo por 2 minutos (choque térmico). A las mezclas de transformación se añadieron
250μl de medio LB y se incubaron a 37°C por 2 horas en agitación (200rpm). Las células
transformadas se sembraron homogéneamente en cajas de Petri con medio LB suplementado con
ampicilina (100ug/ml) y se incubaron a 37 °C por toda la noche. Para la confirmación de la
transformación, a las colonias crecidas se le realizó extracción de ADN por el método de ebullición
o de Holmes y Quigley [71] y se evaluó la presencia y direccionalidad del gen SAUSA300_0063
con las diferentes combinaciones de primers descritos en la Tabla 2. Para confirmar la fidelidad de
la secuencia del gen SAUSA300_0063 clonado se realizó una secuenciación (MACROGEN) en
ambos sentidos utilizando los primers T7s - T7as. Las colonias transformadas con el gen
direccionado fueron conservadas a -80°C en caldo LB suplementado con ampicilina (100ug/ml) y
40% de glicerol.
3.2.5 Plásmido pET-CT63 y transformación en E. coli BL21 (DE3)
El plásmido pET-CT63 fue purificado con el estuche Wizard®Plus Minipreps DNA Purification
System (Promega) y transformado en las cepas E. coli BL21 (DE3) utilizando el estuche comercial
Champion™ pET302/NT-His, pET303/CT-His (Invitrogen) con las mismas condiciones
mencionadas en la transformación anterior. Para confirmar la transformación, a las colonias se le
realizó extracción de plásmido y por PCR utilizando diferentes combinaciones de primers se
confirmó la presencia del gen SAUSA300_0063 (Tabla 2). Las cepas transformadas con el gen
direccionado fueron conservadas a -80°C en caldo LB suplementado con ampicilina (100µg/ml) y
40% de glicerol.
3.2.6 Expresión de la proteína recombinante SAUSA300_0063 a partir de pET-CT63 en E.
coli BL21 (DE3) con pG-KJE8
La trasformación de las cepas de E. coli BL21(DE3) con el plásmido pET-CT63 y con pG-KJE8
(Tabla 1) se realizó como se mencionó anteriormente para las cepas competentes BL21(DE3) y la
24
inducción de acuerdo al manual Chaperone Plasmid Set (Takara). Para ello se tomó una colonia
E.coli BL21(DE3) positiva para el gen SAUSA300_0063 , pET303/CT-His y pG-KJE8 y se
resembró en caldo LB suplementado con ampicilina (100 μg/ml), cloranfenicol (50 μg/ml) y se
incubó a 37°C en agitación (200 rpm) durante toda la noche. Luego cada cultivo se diluyó en
relación 1:50 con caldo LB, y para las cepas BL21 (DE3) con pG-KJE8, el caldo se suplementó
con arabinosa (1mg/ml) y tetraciclina (10ng/ml) (agentes inductores de la expresión de las
chaperonas). Los cultivos se incubaron hasta alcanzar una densidad óptica (OD600) entre 0,6 y 0,8.
Se adicionó IPTG en concentración 1mM y se incubó por 16 horas a 37°C. Se tomaron alícuotas de
1 ml previo a la inducción (tiempo 0) y post inducción a las 2 horas y toda la noche. Se
centrifugaron a 2500 rpm por 5 minutos, los botones se solubilizaron en buffer Laemmli 6X, se
sometieron a ebullición por 5 min a 94°C, se centrifugaron 1 min a 14000 rpm y las fases solubles e
insolubles se sometieron a separación por electroforesis vertical (SDS-PAGE) con un gel separador
al 15% y el concentrador al 5% de poliacrilamida. Se compararon los extractos en los diferentes
tiempos de inducción como en fracción soluble e insoluble y se empleó como marcador de peso
Molecular Weight Marker (SIGMA). El corrido electroforético se realizó en Buffer Tris-Glicina y
SDS a 100V por 70 min y la tinción del gel se realizó con azul de Coomassie al 0,25%.
3.2.7 Expresión y purificación de la proteína recombinante SAUSA300_0063 en el plásmido
pET303/CT-His en E.coli BL21 (DE3)
La cepa E.coli BL21 (DE3) recombinante con el plásmido pET-CT63 se sembró por agotamiento
en cajas de Petri con medio LB suplementado con ampicilina (100µg/ml) a 37 °C durante 24 horas.
Luego, se inoculó una colonia en 5ml caldo LB suplementado con ampicilina (100µg/ml) a 37°C
con agitación a 150 rpm por toda la noche. Como control, este proceso se realizó con las cepas
E.coli BL21(DE3) sin pET-CT63 y cepa E.coli BL21(DE3) con pET-CT63. A partir de este
cultivo, se realizó una dilución 1:10 (sln bacteriana: LB con Ampicilina) y se incubó a 37°C por 2
horas a 200rpm hasta alcanzar una densidad óptica (OD600nm) entre 0,6 y 0,8. Se tomaron 2
alícuotas de 1mL previo a la inducción (tiempo 0), una se centrifugó a 10000g durante 10 min a 4°C
y se guardaron a -20°C conservándose el extracto centrifugado separado del botón. Conservada la
muestra del tiempo 0, se indujo la expresión de la proteína recombinante añadiendo diferentes
concentraciones (0,1mM, 0,5mM y 1 mM) de IPTG. Post inducción se tomaron dos alícuotas de
1mL de muestra a diferentes tiempos (1h, 2h, 4h, 6h y toda la noche), una se centrifugó a 10000 g
durante 10 min a 4°C conservándose por separado el sobrenadante del botón y posteriormente los
tubos se guardaron a -20°C.
25
La evaluación de la expresión de la proteína recombinante SAUSA300_0063 se realizó de dos
formas. Primero, a partir de 10µl del extracto no centrifugado con buffer Laemmli 1X [72], SDS
1% y H2O se sometió a ebullición por 10 min a 95°C-100°C, se centrifugó 1 min a 14000 rpm y la
fase soluble se sembró en un SDS-PAGE. Se empleó como marcador de peso el Molecular Weight
Marker (SIGMA), el corrido electroforético se realizó en Buffer Tris base, Glicina y SDS a 100V
por 1 hora y 10 minutos. La tinción del gel se realizó con azul de Coomassie. Se compararon las
expresiones en los diferentes tiempos y a diferentes concentraciones de IPTG. Segundo, se evaluó
la expresión de la proteína recombinante en la fracción soluble e insoluble. En el caso de los
precipitados, éstos se resuspendieron en lisostafina (50mg/ml), lisozima (1mg/ml) e inhibidor de
proteasas (AEBS 23mM, EDTA 100mM, Bestatin 2mM, Pepstatin A 0,3mM y E-64 0,3mM)
(Sigma) y se incubaron a 37°C por 1 hora y luego en hielo por 20 minutos. Los extractos se
resuspendieron en buffer Tris HCl 0,1 mM, pH 6,8 y se lisaron por sonicación en hielo por 2
minutos con pulsos de 30s con descansos de 15s. Se centrifugaron a 10.000 rpm por 10 minutos. El
sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo. Los extractos se sembraron en un SDS-PAGE y la
tinción del gel se realizó con azul de Coomassie.
Debido a que la proteína recombinante no fue posible obtenerla de manera soluble su purificación
se realizó por medio de electroelución, de la siguiente manera [73]: 100µl del extracto proteico
insoluble (27mg/ml), se sembraron en un gel de poliacrilamida al 15% a escala preparativa, para
identificar la posición de la proteína recombinante se cortaron 2 carriles de los dos extremos
laterales del gel, se tiñeron con azul de Coomassie por 2 horas, se decoloraron y se pusieron junto
al gel como indicadores. Se separó la banda correspondiente a la proteína recombinante, se cortó en
trozos y se transfirió a una bolsa de diálisis SnakeSkin™ Dialysis 10K (Thermo Scientific), se
adicionó 500µl buffer TBE 0,5X y se puso en una cámara de electroforesis horizontal con Buffer
TBE 0,5X a 100V por 2 horas. La solución purificada en la bolsa de diálisis se transfirió a un nuevo
tubo, se cuantificó y se confirmó por SDS-PAGE.
3.2.8 Detección por Western Blot de la proteína recombinante SAUSA300_0063 obtenida
por electroelución
La identificación de la proteína recombinante SAUSA300_0063 se realizó por medio de Western
blot de la siguiente manera: Primero se realizó la separación de la proteína en un gel de
poliacrilamida al 15% y luego se transfirió a una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF)
0,2µm (Thermo Scientific) a 200mA por 2 horas. Posteriormente, para la confirmación de la
26
transferencia, se tiñó la membrana con Rojo de Ponceau 0,5% por 1 a 2 min; una vez identificada la
proteína, se eliminó el colorante con H2O y se inició el proceso de bloqueo de la membrana con
leche descremada al 5% en buffer TBST (tris-HCl pH 7,5 10mM, NaCl 150mM, tween-20 0,1%)
con agitación suave por 4 horas, se retiró la solución de bloqueo, se añadió a la membrana el
anticuerpo primario monoclonal Anti His 1:1000 (Abcam) y se incubó por 1 hora a temperatura
ambiente con agitación suave. La membrana fue lavada 3 veces con buffer TBST en agitación suave
por 10 minutos. Luego, se añadió el anticuerpo secundario Anti mou se IgG-HRP 1:1000
(Amersham) acoplado a peroxidasa y se incubó por 30min a temperatura ambiente con agitación
suave, después de este tiempo, la membrana fue transferida a otro recipiente y se realizaron 3
lavados de 10 min con buffer TBST en agitación suave. El revelado se hizo mediante una solución
de peróxido de hidrogeno 50% y diaminobencidina 1% (DAB).
3.3 Determinación de la unión in vitro de la proteína recombinante SAUSA300_0063 al
promotor del operón arcACME del clon USA300
3.3.1 Síntesis de la sonda con biotina y sin biotina de la secuencia promotora del operón
arcACME y del gen gyrB
A partir del genoma del clon USA300_FPR3757 (NC_007793.1) se diseñaron primers específicos
para la amplificación de un fragmento de la región promotora del operón arcACME de 129pb (Figura
3A) (Tabla 2). Las sondas se sintetizaron por medio de PCR convencional utilizando un programa
de 30 ciclos con una denaturación a 95°C por 20 segundos, temperatura de hibridación de los
primers a 50°C por 1 minuto y una extensión a 72°C por 3 minutos. Para la síntesis de la sonda del
gen gyrB (91pb) se realizó un programa de 30 ciclos con una con una denaturación a 95°C por 20
segundos, temperatura de hibridación de los primers a 53°C por 30s y una extensión a 72°C por 2
minutos. Los productos amplificados fueron visualizados en gel de agarosa al 1,5%, teñidos con
solución de bromuro de etidio 0.1 % y observados en un documentador de geles. Las sondas se
marcaron por medio de la incorporación de dUTP biotinilado durante la reacción de amplificación
en la PCR y la confirmación del marcaje se realizó con el estuche comercial Chemiluminescent
Nucleic Acid Detection Module (Thermo Scientific).
27
3.3.2 Unión in vitro de la proteína recombinante SAUSA300_0063 a la región promotora
del operón arcACME
La unión de la proteína recombinante SAUSA300_0063 a la región promotora del operón arcACME
se determinó por medio del retardamiento en gel de las sondas diseñadas en el apartado anterior.
Para ello, las reacciones se realizaron a un volumen final de 25µl utilizando 61,2pmol (previa
estandarización de la cantidad óptima) de sonda biotinilada y diferentes cantidades de la proteína
recombinante SAUSA300_0063 (0,25µg, 0,75µg y 1µg) y de extracto total de proteínas del clon
USA300 (0,06mg, 0,3mg y 0,6mg). Las mezclas fueron incubadas a 37°C por 30 minutos y luego
fueron separadas en un gel de poliacrilamida al 6% en condiciones no denaturantes, las muestras se
sembraron con buffer de carga 6X (Promega) y el corrido electroforético se realizó con buffer TBE
0,5X a 100V por 70 minutos a temperatura ambiente. El gel se transfirió a una membrana de nylon
Hybond-N membrane (Amersham) a 200mA por 2 horas. El proceso de detección se realizó con
estreptavidina-peroxidasa y luminol utilizando el estuche comercial Chemiluminescent Nucleic
Acid Detection Module (Thermo Scientific) y el revelado de la película se realizó de acuerdo a las
indicaciones del fabricante (Kodac).
Adicionalmente se determinó la especificidad de la unión de la proteína recombinante a la sonda por
medio de ensayos de retardamiento en gel utilizando competidores específicos (sonda no
biotinilada) y no específicos (fragmento de ADN del gen gyrB). En el primer caso, las reacciones se
realizaron a un volumen final de 25µl con 61,2pmol de sonda biotinilada, 0.75µg de extracto de la
proteína recombinante y diferentes cantidades de sonda no biotinilada (69pmol, 138pmol, 207pmol
y 276pmol). En el segundo caso, las reacciones se realizaron a un volumen final de 25µl con
61,2pmol de sonda biotinilada, 0.75µg de extracto de la proteína recombinante y diferentes
cantidades del competidor no especifico (36,7pmol y 73,4pmol). Inicialmente, la proteína
recombinante fue incubada con el competidor (específico o no específico) a 37°C por 15 minutos y
luego se adicionó la sonda biotinilada para seguir con la incubación por 30 minutos. La separación
se realizó como se mencionó anteriormente.
3.3.3 Entrecruzamiento o “Cross-linking” de la proteína recombinante SAUSA300_0063
con la sonda biotinilada
El entrecruzamiento de la proteína recombinante SAUSA300_0063 electroeluida con la sonda
biotiniliada se realizó en un volumen final de 25µl utilizando 61,2pmol de sonda con 0,25ug de
28
proteína recombinante, luego fueron expuestos a luz ultravioleta por 10 minutos. Luego la mezcla
fue sometida a una separación por SDS-PAGE por duplicado, uno de los geles fue transferido a una
membrana de PVDF y la proteína fue identificada por western blot y el otro gel fue transferido a
una membrana de nylon y la sonda fue detectada por quimioluminscencia; estos dos ensayos fueron
realizados bajo las condiciones mencionadas anteriormente.
3.4 Evaluación de la transcripción de los genes sausa300_0063 y arcC del operón arcACME y del
operón arccons en el clon pandémico USA300 en condiciones de anaerobiosis, sin glucosa y en
presencia o no de arginina
3.4.1 Extracción de ARN por el método de TRIzol
La extracción de ARN se realizó de acuerdo al protocolo estandarizado en el LGMB. A partir
del crecimiento de una colonia en agar BHI se hizo una resiembra en 5 ml de caldo TSB y se
incubó a 37°C sin agitación por toda la noche hasta alcanzar una densidad óptica (DO600nm)
entre 0,6 y 0,8. Posteriormente se realizó una dilución 1:200 en TSB no suplementado con
arginina y TSB suplementado con arginina (50mM) ajustando el pH a 7,2 con HCl. El montaje se
realizó en tubos de 15ml y para generar la condición anaeróbica se usó el estuche comercial
GENbag microaer (BioMérieux®) con resazurina como indicador anaeróbico (Oxoid®). Los tubos
se incubaron a 37°C por 20 horas sin agitación, luego de este tiempo se centrifugaron a 3500rpm
durante 7 minutos, se descartó el sobrenadante y se procedió a la lisis bacteriana con una
solución de lisozima (10μg/μl) incubando a 37°C por 45 minutos. Posteriormente, el ARN
total fue extraído con TRIzol® (Invitrogen) siguiendo las condiciones del fabricante y tratado
con DNAsa 1U/μL (Promega). La cuantificación del RNA se realizó mediante la relación de
la absorbancia a 260nm y 280nm en el equipo NanoDrop®ND-1000.
3.4.2 PCR en tiempo real de la transcripción de los genes SAUSA300_0063 y arcCACME
arcCcons y arcR en condiciones anaerobias en presencia o no de arginina
A partir del ARN obtenido se realizó la síntesis de ADNc por medio de transcriptasa reversa (M-
MLV RT 200 U/µl) usando un oligonucleótido de hexámeros aleatorios. Este se empleó como
29
plantilla para la determinación de la continuidad del operón arcACME por PCR utilizando
combinaciones de primers desde arcD hasta arcC (2184pb) y desde arcD hasta SAUSA300_0063
(608pb) (Tabla2) (Figura 16). La amplificación se realizó por medio del siguiente programa:
denaturación a 94°C por 3 minutos, seguido de 30 ciclos conformados por un paso de denaturación
a 94°C por 1 minuto, seguido por temperatura de hibridación de los primers a 53°C por 1 minuto y
una extensión a 72°C por 3 minutos; finalmente con un paso de extensión a 72°C por 10 minutos.
Los productos amplificados fueron visualizados por electroforesis en un gel de agarosa al 1%,
teñidos con solución de bromuro de etidio 0.1 % y fotografiados en un documentador de geles.
Adicionalmente con el ADNc del clon USA300 se confirmó la amplificación de los primers
diseñados para PCR en tiempo real realizando una PCR convencional para los genes
SAUSA300_0063 (142pb), arcR (158pb), arcC cons (169pb), arcC ACME (190pb) y gyrB (91pb)
(figura A2). Se usó un programa de 30 ciclos con una con una denaturación a 95°C por 20
segundos, temperatura de hibridación de los primers del gen SAUSA300_0063 a 50°C y para los
otros genes a 53°C por 30s con una extensión a 72°C por 2 minutos. Los productos amplificados
fueron visualizados en gel de agarosa al 1,7%, teñidos con solución de bromuro de etidio 0.1 % y
observados en un documentador de geles.
Para la PCR en tiempo real se usaron primers específicos (Tabla 2) y Platinum® SYBR® green
qPCR SuperMix-UDG (invitrogen) como agente intercalante. Se realizaron ensayos por duplicado
de PCR en tiempo real con el clon USA300 y la cepa NCTC8325 evaluando la transcripción de los
genes SAUSA300_0063 y arcCACME, arcCcons, arcR y gyrB en caldo TSB con un pH de 7,2, TSB
suplementado con arginina (50mM) con un pH de 9,2 y TSB suplementado con arginina (50mM)
ajustado con HCl a un pH de 7,1. La cuantificación relativa de los genes SAUSA300_0063 , arcR,
arcCcons, y arcCACME fue determinada por el cambio en la expresión de los transcritos en unidades
relativas definidas como "número de veces" con respecto al gen constitutivo gyrB [74] y fue
calculada acorde al método de Schefe [75].
Se utilizaron como controles los crecimientos del caldo TSB suplementado con arginina y HCl
respecto a la expresión definida por el crecimiento en TSB, considerándose como control basal los
valores de los transcritos de la cepa NCTC8325 correspondiente a los genes arcR y arcCcons. El
ensayo de PCR en tiempo real se llevó a cabo en el termociclador iQ5 (BioRad).
30
4. RESULTADOS
4.1 Producción y purificación de la proteína recombinante SAUSA300_0063 del operón
arcACME del clon USA300
4.1.1 Amplificación del gen sausa300_0063 y su clonación en pGEM-T
Después de un proceso de estandarización de la PCR, al utilizar los primers 63s y 63as (tabla 2) se
obtuvo la amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 714pb correspondiente al
gen sausa300_0063, con una temperatura óptima de hibridación de los primers de 59°C (Figura 7a).
Este producto fue purificado a partir del gel, clonado en el vector pGEM-T y transformado por
choque térmico en la cepa E. coli TOP10. La selección de las colonias transformantes se realizó por
su resistencia a ampicilina y mediante el sistema “blue/white screening”. La clonación y
direccionalidad del gen se confirmó por medio de una extracción de plásmido de las colonias
transformantes y PCR; al utilizar las combinaciones de primers 1, 3 y 4 (figura7b) se obtuvieron
productos de amplificación de 893pb, 790pb y 714pb; respectivamente (figura 7c) confirmando la
inserción del gen de interés en el plásmido pGEM-T.
4.1.2 Clonación del gen sausa300_0063 en pET303/CT-His y transformación en E. coli
TOP10 y BL21(DE3)
Después de la clonación del gen en pGEM-T, se procedió a su liberación y clonación dentro del
vector de expresión pET303/CT-His, como se describió en materiales y métodos. En la figura 8a se
muestra la liberación del gen SAUSA300_0063 del plásmido pGEM-T63 después de la restricción
con las enzimas XbaI y NsiI. Luego se realizó la ligación del gen SAUSA300_0063 liberado en el
plásmido pET303/CT-His y transformado en las cepas E. coli TOP10. Las colonias transformantes
se seleccionaron por su resistencia a ampicilina y por PCR. La clonación y direccionalidad del gen
en el pET303/CT-His se determinó por PCR. De las 4 combinaciones de primers empleadas, la
única combinación que no produjo amplificación de ADN fue la 2, lo cual muestra que el gen está
en la dirección correcta (hebra sentido) para su expresión (figura 8c). Este plásmido recombinante
fue extraído y luego transformado en la cepa E. coli BL21 (DE3) utilizando las mismas condiciones
descritas anteriormente. La secuenciación del gen dentro del plásmido recombinante no mostró
mutaciones respecto al gen SAUSA300_0063 de USA300 de referencia (figura A1).
31
Figura 7. Clonación del gen sausa300_0063 en pGEM-T y transformación en E. coli TOP10. a.
Amplificación del gen sausa300_0063 del clon USA300 utilizando 4 temperaturas de hibridación
diferentes de los primers. b. Esquema del plásmido pGEM-T con la posición de las diferentes
combinaciones de primers utilizadas para su confirmación. c. Confirmación de la clonación y
direccionalidad del gen sausa300_0063 en el plásmido pGEM-T en E.coli TOP10 utilizando las
diferentes combinaciones de primers, 1: T7s- SP6 (893pb), 2: T7s- 63s (no amplificación), 3: T7s-
63as (790pb) y 4: 63s - 63as (714pb). CR: Control reactivos (sin DNA). MP: Marcador de Peso
Molecular de 100 y 50 pb (O'RangeRuler DNA Ladder, Thermo Scientific). Electroforesis en gel de
agarosa al 1,5% con tinción de bromuro de etidio.
Combinación Combinación
c.
- 50
- 200
- 500
- 1000
MP CR 2 CR 3 CR 4 MP
2
.
3
.
4
.
Primers
pb.
-500
-100
-1000
Primers 1
.
. CR 1 MP pb.
a.
pb °C
USA300
-500
-100
-1000
45 50 56 59 CR MP
Combinación b.
SAU
SA3
00
_00
63
Primers
1.
893pb
3.
790pb
4.
714pb
2.
32
Figura 8. Obtención del plásmido pETCT-63 y transformación en E. coli TOP10 y BL21(DE3). a.
Restricción enzimática del pGEM-T recombinante y liberación del gen SAUSA300_0063 (701pb).
b. Esquema del plásmido pET303/CT-His y posición de las combinaciones de los primers. 1, T7s-
T7as (plásmido no recombinante 187pb; plásmido recombinante 887pb). 2, T7s - 63s (no
amplificación). 3, T7s - 63as (783pb). 4, 63s - 63as (701pb). c. confirmación de la clonación del gen
SAUSA300_0063 en el plásmido pET303/CT-His. Carriles 1 y 2, E. coli TOP10 con el plásmido
pET303/CT-His no recombinante y su réplica. Carriles 3 y 4 E.coli TOP10 con el plásmido
pET303/CT-His recombinante y su réplica. Carriles 5 y 6 Cepa E. coli BL21(DE3) con el plásmido
pET303/CT-His recombinante y su réplica. V, Vacio. CR, Control reactivos. MP, Marcador de
Peso Molecular de 100 pb (O'RangeRuler DNA Ladder, Thermo Scientific). Electroforesis en gel
de agarosa al 1,7% con tinción de bromuro de etidio.
- SAUSA300_0063
-pGEM-T
MP
50-
200-
500 -
1000 -
pb
NseI /XbaI
a. Combinación
Primers b.
SAUSA300_0063
2. 1. 887pb
3. 783pb
4. 701p
b
c.
pb.
1 2 3 4 5 6 CR MP 1 2 3 4 5 6 CR V 1 2 3 4 5 6 CR MP 1 2 3 4 5 6 CR MP
pb.
-100
-500
-1000
100-
500-
1000 -
E.coli BL21 DE
4. 3. 2. 1. Primers
E.coli top10 + + + + + + +
+ + + + +
+ + + + + +
+ + + + + +
Combinación
Colonias
33
4.1.3 Expresión y purificación de la proteína recombinante SAUSA300_0063 en
pET303/CT-His
Con el fin de expresar la proteína SAUSA300_0063 de S. aureus en E. coli, se realizaron ensayos
de estandarización de la inducción de la proteína recombinante en BL21(DE3) visualizados
mediante SDS-PAGE, a partir de fracciones solubles de extractos totales teniendo en cuenta el
tiempo y la concentración de IPTG. Una banda aproximadamente de 27kDa (según el programa
Compute pI/Mw, ExPASy) se observó desde la primera hora de la inducción bajo concentraciones
de IPTG de 0,1mM, 0,5mM y 1mM, alcanzando una mayor expresión a las 4 horas, 6 horas y
durante toda la noche en comparación con los controles (Figura 9).
A partir de estos resultados se decidió evaluar la solubilidad de la proteína bajo condiciones no
denaturantes, a una concentración de IPTG de 0,5mM y diferentes tiempos. Para ello, las bacterias
fueran lisadas por sonicación y sometidas a centrifugación, los extractos de proteínas totales fueron
divididos como proteínas solubles (sobrenadante) e insolubles (botón). La producción de la proteína
recombinante se evaluó por medio de un SDS-page. Como se muestra en la figura 10a, la proteína
recombinante solo se detectó en las fracciones insolubles en los diferentes tiempos evaluados. Para
mejorar la solubilidad de la proteína, el plásmido pET-CT63 se transformó en la cepa E. coli
BL21(DE3) junto con el plásmido pG-KJE8, el cual expresa chaperonas moleculares que facilitan el
plegamiento de proteínas. Los extractos de proteínas totales obtenidos de las bacterias
transformantes fueron divididos como se mencionó anteriormente. Sin embargo, la expresión de la
proteína recombinante SAUSA300_0063 se encontró solamente en las fracciones insolubles (Figura
10b).
Debido a que no fue posible obtener la proteína recombinante SAUSA300_0063 de forma soluble
se decidió purificarla por electroelución a partir de un PAGE bajo condiciones no denaturantes, para
esto, se realizó la expresión de la proteína en pET303/CT-His durante toda la noche. La confirmación
de la purificación de la proteína se realizó mediante SDS-PAGE y western Blot utilizando un anticuerpo
específico contra el tag de Histidinas para reconocimiento de la proteína recombinante, observándose
una única señal en los extractos electroeluidos (figura 11).
34
Figura 9. Expresión de la proteína recombinante SAUSA300_0063 en la fracción soluble inducido
con IPTG. 1, E.coli BL21(DE3) sin plásmido pET303/CT-His recombinante no Inducido. 2, E.coli
BL21(DE3) con plásmido pET303/CT-His recombinante no Inducido. MP, Marcador de peso de 29
a 200 KDa. NI, No Inducido. TN, Toda la noche
4.2 Determinación de la unión in vitro de la proteína recombinante SAUSA300_0063 al
promotor del operón arcACME del clon USA300
4.2.1 Síntesis de la sonda para la secuencia promotora del operón arcACME y del gen gyrB
Un fragmento de 123pb de la secuencia intergénica del operón arcACME se amplificó utilizando los
primers GP460 y GP461 (tabla 2), este fragmento alberga los elementos promotores -10 y -35,
-27 kDa
kDa
29-
45-
66-
200-
IPTG 1 mM NI
Tiempo MP 1 2 1h 2h 4h 6h TN
200-
kDa
29-
45-
66-
-27 kDa
IPTG 0,5 mM NI
MP Tiempo 1 2 1h 2h 4h 6h TN MP 1 2 1h 2h 4h 6h TN kDa
200-
29-
45-
66-
-27 kDa
IPTG 0,1 mM NI
Tiempo
35
Figura 10. Evaluación de la solubilidad de la proteína recombinante SAUSA300_0063 en los dos
vectores de expresión. a. Plásmido pET303/CT-His. Carril 1, E.coli BL21(DE3). Carril 2 E.coli
BL21(DE3) con el plásmido pET303/CT-His recombinante No Inducido. FI, Fracción de proteínas
Insolubles. FS, Fracción de proteínas solubles. NI, No Inducido. MP, Marcador de peso de 29 a 200
kDa y de 14,2 a 66 kDa. b. Plásmido pET303/CT-His -pG-KJE8. Carril 1, E.coli BL21(DE3) con
el plásmido pG-KJE8. Carril 2, E.coli BL21(DE3) con el plásmido pG-KJE8 y pET303/CT-His
recombinante. Carril 3, E.coli BL21(DE3) con el plásmido pG-KJE8 Inducido y pET303/CT-His
recombinante. Tet-Arab, tetraciclina y arabinosa. EX, Extracto total de proteínas. FI, Fracción de
proteínas Insolubles. FS, Fracción de proteínas solubles. MP, Marcador de peso de 29 a 200 KDa.
Figura 11. Purificación y detección de la proteína recombinante SAUSA300_0063 por
electroelución. a. SDS-PAGE: proteína recombinante SAUSA300_0063 por electroelución
( ̴27kDa). E.coli BL21(DE3) con el plásmido pET303/CT-His recombinante No Inducido con
IPTG. E.coli BL21(DE3). b. Western Blot con Anti 6X His: Carril C, fragmento de la cabeza de
la miosina B de P. falciparum (control positivo anti-His). Proteína recombinante SAUSA300_0063
por electroelución. E.coli BL21(DE3) con el plásmido pET303/CT-His recombinante No Inducido
con IPTG. E.coli BL21(DE3). MP, Marcador de peso de 29 a 200 KDa.
kDa
-27 kDa
97- 116- 200-
29-
45-
66-
b.
1 2 3
Tiempo
MP EX FI FS EX FI FS
Tet- Arab
IPTG 1mM +
- + +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
-
-
-
-
0h 2h TN
-14
-20
-24
-29
-45
-66
kDa kDa
29-
45-
66-
FI FS FI FS FI FS FI FS FI FS MP FI FS MP
a. NI
TN 2h 3h 4h
IPTG 0,5 mM
Tiempo 1
2
-29
-45
-66
a.
pET303/CT-His
E.coli BL21 DE3
Electroelución
+ - + - - +
kDa MP
27kDa-
E.coli BL21 DE3
pET303/CT-
His
27kDa-
b.
C
Electroelución
-19
+ - + - - +
kDa
36
el sitio de unión ribosomal (RBS) y una secuencia potencial de unión a proteínas CRP/FNR
[6](Figura 12a). Este fragmento se marcó con dUTP conjugado con biotina, lo cual permitió su
detección por quimioluminiscencia, como se muestra en la figura 12b y 12c. Adicionalmente se
sintetizó y marcó un fragmento de 91pb del gen gyrB, el cual se usó como competidor no
especifico.
4.2.2 Unión in vitro de la proteína recombinante SAUSA300_0063 a la región promotora
del operón arcACME
Para determinar si la proteína recombinante SAUSA300_0063 se une a la región promotora del
operón arcACME, se realizó un ensayo de retardamiento en gel. Para ello, primero se evaluó un
extracto total de proteínas del clon USA300 y se usaron cantidades de 0,06mg, 0,3mg y 0,6mg
incubadas cada una con 61,2pmol de la sonda marcada (10µl). Se observó en las tres cantidades de
proteína evaluadas un retardamiento marcado en la movilidad indicando la formación de un
complejo proteína-sonda comparado con la movilidad de la sonda sin proteína (figura 13a).
Para determinar la especificidad de la unión se realizaron ensayos de retardamiento con un
competidor específico (sonda sin marcar) (138pmol). En la figura 13a se observa que cuando el
competidor se adicionó produjo la pérdida de la señal retardada y la recuperación de la señal de la
sonda marcada. Luego, estos experimentos se realizaron con la proteína recombinante
SAUSA300_0063 purificada; 61,2pmol de la sonda marcada fueron incubados con 0,25ug, 0,75ug
y 1ug de proteína y la aparición de una nueva señal fue encontrada (Figura 13b), aunque la
separación de las señales no es tan definida como la encontrada con los extractos de proteínas
totales, sugieren un retardamiento (en comparación con la señal de la sonda sola) formándose un
complejo proteína recombinante SAUSA300_0063 y sonda del operón arcACME.
Con el fin de evaluar la especificidad de la unión de la proteína recombinante SAUSA300_0063
con la sonda se realizaron ensayos de competición con competidores específicos y no específicos.
Como se muestra en la figura 14, cuando se adicionó el competidor específico (sonda sin marcar)
hubo una desaparición de la señal retardada; hecho que no sucedió cuando el competidor no
especifico (sonda de gyrB) se adicionó (Figura 14b).
37
Figura 12. Síntesis y detección de la sonda del operón arcACME en el clon USA300. a. Esquema de
la región intergénica del operón arcACME con las posiciones de los promotores, los primers
empleados para la amplificación de la sonda (color gris) y el sitio potencial de unión para proteínas
CRP/FNR, basado de Makhlin 2007. Número de acceso de la secuencia en el GenBank
NC_007793.1. b. Amplificación de una región del promotor del operón arcACME. Los primers
GP460b y GP 461b fueron empleados para el diseño de la sonda la cual se marcó con biotina
(123pb). MP: Marcador de Peso Molecular de 100 pb (O'RangeRuler DNA Ladder, Thermo
Scientific). Electroforesis en gel de agarosa al 1,5% con tinción de bromuro de etidio. c.
Confirmación del marcaje de la sonda por quimioluminiscencia utilizando estreptavidina-
peroxidasa y luminol. CR, Control de reactivos.
c.
Sonda GP460b-461b
b.
a.
-35
38
Figura 13. Unión in vitro del extracto total de proteínas del clon USA300 y la proteína
recombinante electroeluida con la región promotora del operón arcACME. a. Retardamiento en gel
con diferentes cantidades del extracto de proteínas con la sonda GP460-461b y ensayo con
competidor específico GP460-461. b. Retardamiento en gel con diferentes cantidades de proteína
recombinante electroeluida SAUSA300_0063 con la sonda GP460-461b.
Figura 14. Unión in vitro de la proteína recombinante electroeluida con la región promotora del
operón arcACME con competidor específico y no especifico. a. Retardamiento en gel con la proteína
recombinante electroeluida SAUSA300_0063 (0,75µg) con la sonda GP460-461b (61,2pmol) y
competidor específico GP460-461. b. Retardamiento en gel con la proteína recombinante
electroeluida SAUSA300_0063 (0,75µg) con la sonda GP460-461b (61,2pmol) y competidor no
específico gyrB sin biotina.
a.
Sonda
USA300-GP460-461b Complejo
Sonda GP460-461b
Competidor Especifico + - - - -
Proteína USA300
(mg.) 0,06 0,3 0,6 - 0,06
b. GP460-461b Sonda
Prot. Recomb
(ug.) -- 0,25 0,75 1
Sonda
Prot. Recomb-GP460-461b Complejo
a.
Sonda
Prot.recomb-GP460-461
Complejo
Proteína Recombinante
Competidor especifico - + - Sonda GP460-461b + + +
b. Proteína Recombinante
Sonda
Prot.recomb-GP460-461
Complejo
Sonda GP460-461b
Competidor no especifico - +
+
- + +
39
4.2.3. Entrecruzamiento de la proteína recombinante SAUSA300_0063 purificada con la
sonda de marcada
Para confirmar la unión de la proteína recombinante SAUSA300_0063 con la sonda de la región
promotora del operón arcACME se realizó un experimento de entrecruzamiento proteína-sonda por
medio de luz ultravioleta. Después de los procesos de separación y detección una única señal se
encontró en el western blot y tres señales en la quimioluminscencia, de las cuales dos pueden estar
relacionadas con configuraciones secundarias de la sonda y una tuvo una co-localización con la
señal obtenida en el western blot (Figura 15). Estos resultados sugieren que si existe una unión
proteína-sonda. Aunque se esperaba encontrar esta misma señal en el extracto de proteínas totales,
no fue detectada posiblemente por la baja concentración que puede tener la proteína
SAUSA300_0063 nativa en el extracto o por el bloqueo en el entrecruzamiento que puede generar
todas las proteínas de la bacteria.
Figura 15. Entrecruzamiento con UV de la proteína recombinante electroeluida SAUSA300_0063
con la sonda GP460-461b. Western blot con Anti 6X His y quimioluminiscencia detectado con
estreptavidina-peroxidasa y luminol.
Western Anti His
Quimioluminiscencia
Proteína Recombinante SAUSA300_0063
+ +
Sonda GP460-461b
+ + + + + +
Proteína USA300
+ +
Proteína
Recombinante
SAUSA300_0063
Sonda
GP460-461b
40
4.3 Evaluación de la transcripción de los genes sausa300_0063 y arcC del operón arcACME y del
operón arccons en el clon pandémico USA300 en condiciones de anaerobiosis, sin glucosa y en
presencia o no de arginina
Como primer paso, se evaluó si el gen sausa300_0063 era trascrito en una sola molécula de ARN
con los demás genes del operón arcACME por medio de PCR a partir de ADNc. Al utilizar la pareja
de primers arcD – arcC (figura 16a) se obtuvo un fragmento de aproximadamente 2200pb
(esperado de 2184pb) (Figura 16b) y cuando se utilizaron los primers arcD - sausa300_0063, un
fragmento de aproximadamente 600pb (esperado de 608pb) (Figura 16b).
Figura 16. Estructura del operón arcACME en el clon USA300. a. Esquema del operón arcACME y
posición de los primers para evaluación de la co-transcripción de los genes en el operón. 1, GP214-
GP216 Segmento color rojo. 2, GP214-GP215 Segmento color verde. b. amplificación del producto
entre algunos genes del operón arcACME en anaerobiosis a partir de ADNc del clon USA300. Carril:
1 desde arcD hasta arcC (2184pb) y carril 2 desde arcD hasta sausa300_0063 (608pb). argR,
Regulador de la biosíntesis de arginina. arcA, Arginina deiminasa. arcD, Antiporter de arginina-
ornitina. ORF, Proteína hipotética SAUSA300_0063 de la familia CRP/FNR. arcB, Ornitina
carbamoiltransferasa. arcC, Carbamato quinasa. CR, Control reactivos. MP, Marcador de Peso
Molecular de 100 pb (O'RangeRuler DNA Ladder, Thermo Scientific). Electroforesis en gel de
agarosa al 1 % con tinción de bromuro de etidio.
Con el fin de determinar si las diferentes condiciones afectaban a las cepas, primero se realizó una
RT-PCR semi-cuantitativa en electroforesis en gel de agarosa del gen gyrB (housekeeping) a partir
de RNA del clon USA300 y la cepa NCTC8325, observándose baja amplificación del gen
constitutivo cuando las cepas crecieron en TSB suplementado con arginina (50mM) con un pH de
9,2, respecto a la cepa en crecimiento sin arginina. Este resultado muestra que la suplementación del
medio con arginina aumenta tanto el pH produciendo alteraciones metabólicas en el
2184 pb
608pb
1.
2.
SAUSA300_0063
a.
CR 1 2 MP
-500
-1000
-1500
-2000
-2500
Pb
b.
-100
41
microorganismo. Por esta razón se decidió ajustar el pH hasta 7,1 con HCl, encontrándose una
amplificación específica del gen gyrB.
De acuerdo a lo anterior se evaluaron los niveles de expresión relativa de los genes
SAUSA300_0063 y arcCACME, arcCcons y arcR en anaerobiosis en TSB con HCl (figura 17),
mostrando un aumento en la expresión de arcR (20,35) y arcCcons (14,43) en el clon USA300 siendo
respectivamente 18 y 7 veces mayor que el control (Figura 18a). En el clon USA300 respecto a los
genes de los reguladores transcripcionales se observó un aumento de 83 veces del gen
SAUSA300_0063 (103.77) en comparación con el gen arcR (20,35) (Figura 18b). también en este
clon se observa un aumento en la transcripción del gen arcCACME (90,38) de 75 veces mayor
respecto al gen arcCcons (14,43) y su relación con la expresión del regulador SAUSA300_0063 es
de 13 veces menor (figura 18c y d).
Figura 17. Niveles de expresión relativa de los genes SAUSA300_0063 y arcCACME, arcCcons y
arcR en anaerobiosis. Crecimiento del clon USA300 y la cepa NCTC8325 durante 20 horas (fase
estacionaria).
103,77
90,38
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Exp
resi
ón
re
lati
va r
esp
ect
o a
gyr
BN
úm
ero
de
ve
ces
USA300
SAUSA300_0063
arcC ACME
NCTC8325
0 0
42
Figura 18. Comparación de los niveles de expresión relativa en el clon USA300 y la cepa
NCTC8325 en crecimiento anaerobio, fase estacionaria (20 horas) y en TSB con arginina. a.
Cambio en los niveles de expresión de los genes arcR y arcCcons. b. Cambio en los niveles de
expresión de los genes SAUSA300_0063 y arcR. c. Cambio en los niveles de expresión de los genes
arcCACME y arcCcons. d. Cambio en los niveles de expresión de los genes SAUSA300_0063 y
arcCACME.
20,35
14,43
2,10
7,29
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Exp
resi
ón
re
lati
va r
esp
ect
o a
gyr
BN
úm
ero
de
ve
ces
USA300
arcR
arcC CONS
NCTC8325
a.
90,38
14,43
7,29
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
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USA300
arcC ACME
arcC CONS
NCTC8325
0
c.
103,77
90,38
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110E
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Nú
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USA300
SAUSA300_0063
arcC ACME
NCTC8325
0 0
d.
103,77
20,35
2,10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Exp
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ón
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va r
esp
ect
o a
gyr
BN
úm
ero
de
ve
ces
USA300
SAUSA300_0063
arcR
NCTC8325
0
b.
43
5. DISCUSION
Dentro de las rutas metabólicas para la degradación de arginina la más conocida es la arginina
deiminasa (ADI). Esta ruta ha sido identificada en eucariotas (Saccharomyces cerevisiae,
Neurospora spp y Chlamydomonas sp) y ampliamente distribuida entre procariotas especialmente
anaerobios facultativos (Streptococcus faecalis, Bacillus spp, Staphylococcus spp, entre otros) como
un mecanismo para obtención de energía[6, 76, 77]. Varios estudios sugieren que la patogénesis de
S. aureus es mediada por las variaciones del oxígeno en el medio, facilitando la capacidad en la
regulación de factores de virulencia y la habilidad de colonizar en ambientes hostiles [30]. Sin
embargo, aún no es claro cómo influye la ruta de ADI en el contexto de la colonización y la
infección por el clon USA300 [78]. Algunos análisis filogenéticos han revelado que en la mayoría
de las rutas metabólicas, la estructura de los genes generalmente se conservan tanto en el orden
como en su composición, dado a la transferencia horizontal de genes, desempeñando un papel
importante en los procesos evolutivos y adaptativos, lo cual ha sugerido que el éxito del clon
USA300 es en parte debido a la adquisición en su genoma de una segunda copia de la vía ADI en el
elemento genético ACME, el cual es estructuralmente diferente al constitutivo pero idéntico al del
patógeno colonizador Staphylococcus epidermidis (del cual se sugiere lo adquirió) [79, 80].
La ruta metabólica arginina deiminasa en general se encuentra regulada por los genes argR como
represor y arcR como activador y de acuerdo al análisis “in sílico” de ACME [14] entre el gen
sausa300_0063 y el regulador arcR de S.epidermidis ATCC 12228 (número de acceso en el
GenBank NC_004461.1), presentan un porcentaje de identidad y similaridad del 99,6%, lo que
indica que este gen es un regulador del clon USA300 homólogo a factores de transcripción de tipo
CRP/FNR en S. pyogenes, la proteína ArcR de B.licheniformis, AhrC de B. subtilis y Flp de
S.gordonii, bajo sistemas de regulación anaerobia [7, 13, 78]. Makhlin y colaboradores [6] plantean
que las proteínas reguladoras pertenecientes a la familia de proteínas CRP actúan uniéndose a
secuencias específicas en las regiones promotoras, así como el regulador arcR constitutivo de
S.aureus NCTC8325, lo cual fue coherente con nuestro resultado de retardamiento en gel, donde se
observó un retardamiento en la movilidad electroforética de la sonda de la región promotora del
operón arcACME que tenía la secuencia consenso TTGTGA-N6-TCACA de unión a CRP/FNR
debido a la unión de la proteína recombinante SAUSA300_0063 y el ensayo de entrecruzamiento
el cual nos sugiere también una unión del complejo proteína-ADN con la co-localización de las
señales de la quimioluminiscencia y el western blot correspondiente a la sonda biotinilada y la
proteína recombinante.
44
Mediante PCR convencional con ADNc del clon USA300 se observó la amplificación de un
producto continuo entre los genes arcD arcC y entre arcD SAUSA300_0063 mostrando la
ausencia de inserciones entre las secuencias que puedan sugerir posibles regiones promotoras, lo
cual nos indicó que la coexpresión de los genes en este operón se da en un solo transcrito y así
mismo apoyó nuestra hipótesis acerca de la participación de La proteína SAUSA300_0063 en la
activación del operón arc de ACME, ya que dada a esta nueva estructura del operón ADI se podría
facilitar su regulación en modo cis siendo un mecanismo cooperativo y ventajoso para la capacidad
adaptativa y permanencia del clon como agente infeccioso.
De acuerdo a las características observadas en este operón ADI en ACME nos permitió sugerir que
la proteína SAUSA300_0063 al ser perteneciente a la familia CRP, puede tener la habilidad de
activar la RNA polimerasa y facilitar la transcripción de los genes que estén bajo su regulación.
Para su evaluación fue importante tener en cuenta las condiciones ambientales apropiadas ya que la
ruta metabólica ADI se activa bajo anaerobiosis y cuando la glucosa es remplazada por otra fuente
de energía [6]. Por tal motivo se evaluó la transcripción relativa de los genes SAUSA300_0063 y
arcCACME, arcCcons y arcR en condiciones anaerobias en fase estacionaria (20 horas) en presencia o
no de arginina. Es importante resaltar que en los ensayos de crecimiento bacteriano la arginina tuvo
un impacto negativo debido al pH alcalino, posiblemente afectando el metabolismo celular
reduciendo la transcripción de genes constitutivos, por tal razón se evaluó en condiciones
anaerobias el impacto de la arginina equilibrando su pH con HCl.
En el estudio se observó un aumento en la expresión de arcR y arcCcons en el clon USA300 siendo
respectivamente 18 y 7 veces mayor que su control sin arginina. En el clon USA300 respecto a los
genes de los reguladores transcripcionales se observó un aumento de 83 veces del gen
SAUSA300_0063 en comparación con el gen arcR. También en este clon se observó un aumento en
la transcripción del gen arcCACME de 75 veces mayor respecto al gen arcCcons y su relación con la
expresión del regulador SAUSA300_0063 es 13 veces menor. Esto nos sugiere que bajo condiciones
anaerobias el regulador transcripcional SAUSA300_0063 puede participar de forma directa y
continua en la activación de la transcripción del operón arcACME y posiblemente también ayuda de
un modo más pasivo en la transcripción del operón arccons ya que éste se observa 7 veces mayor que
su expresión basal. Es probable que se presente una participación cooperativa del regulador
SAUSA300_063 con otros promotores, puesto que se ha demostrado que el regulador transcripcional
arcR constitutivo tiene la capacidad de unirse a regiones que contienen la secuencia consenso de
45
unión para CRP/FNR como los promotores de los genes ADH1 (alcohol deshidrogenasa), srrAB
(respuesta respiratoria estafilocócica) y LukM (Leucotoxina)[6].
Una de las características evolutivas de los procariotas es su plasticidad genómica y la movilidad
horizontal de material genético, sin embargo a pesar que existan operones que se conservan en un
mayor nivel de organización y que se co-transcriben como una unidad (uber-operones), se pueden
dar rupturas en dichas estructuras que permitan una reorganización modificando en ocasiones su
función y regulación [81, 82]. Un ejemplo de ello es el operón rpo en E.coli, el cual contiene
adicionalmente tres genes implicados en la traducción, la replicación del ADN y la transcripción, lo
cual le permite a la bacteria una regulación simultánea y coordinada de su metabolismo. El conocer
acerca de la función y organización de los operones ha permitido iniciar estrategias en comprender
los procesos involucrados en la patogénesis bacteriana y más aun en S. aureus del cual aun la
información es limitada; por tal razón de acuerdo a los resultados obtenidos la reorganización del
operón arcACME y la inclusión del regulador SAUSA300_0063 permite un aprovechamiento más
rápido de la arginina y una mejor respuesta frente a condiciones ambientales adversas (acidez,
poliaminas, entre otros) a través de la autoactivación del operón. Entender el funcionamiento de
nuevas estructuras genéticas podría ayudar en la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos y el
desarrollo de antibacterianos [83].
A partir de la secuenciación genómica y evaluación de perfiles transcripcionales de S.aureus se ha
sugerido que este patógeno utiliza múltiples mecanismos de defensa para contrarrestar el estrés
ambiental, dentro de los cuales se ha determinado como uno de los principales la vía de ADI la cual
es crucial para la resistencia al estrés ácido de la piel (pH 4.2 hasta 5.9) o en un proceso infeccioso
(pH 6.2 a 7.3) [84]. No se ha logrado descifrar la causa de la patogénesis en el clon USA300, sin
embargo, comparándolo con S. epidermidis, por la adquisición de dos copias de ADI es muy
probable que le permita compensar y favorecer su colonización [78]. Por ello varios autores afirman
que la adquisición del elemento genético ACME es una estrategia muy favorable facilitando la
supervivencia de la bacteria[3, 4, 6, 51, 80].
46
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Este trabajo permitió encontrar, de modo experimental, las aproximaciones in sílico acerca de la
participación y función de la proteína SAUSA300_0063 como regulador transcripcional
perteneciente a la familia de proteínas CRP/FNR en el operón arcACME en el clon USA300.
Adicionalmente, mediante la transcripción relativa de los genes SAUSA300_0063 , arcR y arcC del
operón arcACME y del operón arccons se observó una relación directa en el aumento de la
transcripción de los genes sausa300_0063 y arcC del operón arcACME, lo cual apoyó nuestra
hipótesis acerca de la participación de la proteína SAUSA300_0063 en la auto-activación del
operón arc de ACME, ya que dada a esta nueva estructura del operón ADI se podría facilitar su
regulación en modo cis considerándose altamente ventajoso bajo condiciones de anaerobiosis, lo
cual podrían ayudar en el desarrollo de antibióticos y antibacterianos.
Se propone realizar ensayos de retardamiento en gel que permitan confirmar la participación
cooperativa de la proteína reguladora SAUSA300_0063 con otras regiones promotoras, con el fin
de confirmar la capacidad de unirse a regiones que contienen la secuencia consenso de unión para
CRP/FNR y evaluar su actividad en la regulación de la transcripción génica.
Se recomienda iniciar estudios “in vivo” sobre el impacto que tiene la posible autoactivación del
operón sobre el aumento de la capacidad adaptativa y permanencia del clon USA300 con el fin de
generar información útil que permita a mediano plazo identificar nuevos posibles blancos
terapéuticos o adyuvantes en el tratamiento de las infecciones causadas por este microorganismo.
Es importante seguir profundizando en el conocimiento del rol de esta proteína en la biología básica
del clon USA300 a través de otras técnicas moleculares como “knockout y knockdown”, para
entender sus procesos metabólicos y el impacto que tiene la adquisición de genes en los
mecanismos de defensa del huésped.
47
7. BIBLIOGRAFÍA.
1. Bustos Martínez JA, Hamdan Partida A, and G.C. M, Staphylococcus aureus: la
reemergencia de un patógeno en la comunidad. Rev Biomed, 2006. 17
p. 287-305.
2. Murray P. Baron E, J.J., Pfaller M, Yolken R., , Manual of clinical microbiology. . 8 ed.
Vol. 1. 2003, Washington.
3. Diep, B.A., et al., Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-
acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet, 2006. 367(9512): p. 731-9.
4. Thurlow, L.R., et al., Functional modularity of the arginine catabolic mobile element
contributes to the success of USA300 methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Cell
Host Microbe, 2013. 13(1): p. 100-7.
5. Alonzo, F., 3rd and V.J. Torres, A lesson in survival: S. aureus versus the skin. Cell Host
Microbe, 2013. 13(1): p. 3-5.
6. Makhlin, J., et al., Staphylococcus aureus ArcR controls expression of the arginine
deiminase operon. J Bacteriol, 2007. 189(16): p. 5976-86.
7. Zeng, L., Y. Dong, and R.A. Burne, Characterization of cis-acting sites controlling
arginine deiminase gene expression in Streptococcus gordonii. J Bacteriol, 2006. 188(3): p.
941-9.
8. Zuniga, M., G. Perez, and F. Gonzalez-Candelas, Evolution of arginine deiminase (ADI)
pathway genes. Mol Phylogenet Evol, 2002. 25(3): p. 429-44.
9. Griswold, A., et al., Characterization of the arginine deiminase operon of Streptococcus
rattus FA-1. Appl Environ Microbiol, 2004. 70(3): p. 1321-7.
10. Fulde, M., et al., ArgR is an essential local transcriptional regulator of the arcABC operon
in Streptococcus suis and is crucial for biological fitness in an acidic environment.
Microbiology, 2011. 157(Pt 2): p. 572-82.
11. Tonon, T., J.P. Bourdineaud, and A. Lonvaud-Funel, The arcABC gene cluster encoding the
arginine deiminase pathway of Oenococcus oeni, and arginine induction of a CRP-like
gene. Res Microbiol, 2001. 152(7): p. 653-61.
12. Akhter, Y., S. Tundup, and S.E. Hasnain, Novel biochemical properties of a CRP/FNR
family transcription factor from Mycobacterium tuberculosis. Int J Med Microbiol, 2007.
297(6): p. 451-7.
13. Gruening, P., et al., Structure, regulation, and putative function of the arginine deiminase
system of Streptococcus suis. J Bacteriol, 2006. 188(2): p. 361-9.
14. Portillo, B.C., Determinación de la Presencia y Transcripción de Factores de Virulencia en
Aislamientos Colombianos de Staphylococcus Aureus Resistente a Meticilina Adquirido en
la Comunidad 2009, Universidad el Bosque: Bogotá.
15. Ibarra, J.A., et al., Global analysis of transcriptional regulators in Staphylococcus aureus.
BMC Genomics, 2013. 14: p. 126.
16. Miller, L.G. and B.A. Diep, Clinical practice: colonization, fomites, and virulence:
rethinking the pathogenesis of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus
aureus infection. Clin Infect Dis, 2008. 46(5): p. 752-60.
17. Wijaya, L., L.Y. Hsu, and A. Kurup, Community-associated methicillin-resistant
Staphylococcus aureus: overview and local situation. Ann Acad Med Singapore, 2006.
35(7): p. 479-86.
18. Gordon, R.J. and F.D. Lowy, Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
infection. Clin Infect Dis, 2008. 46 Suppl 5: p. S350-9.
48
19. Gordon R J., F.D.L., Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus
aureus Infection. CID, 2008. 46(Suppl 5): p. 350-359.
20. Aires de Sousa, M. and H. Lencastre, Bridges from hospitals to the laboratory: genetic
portraits of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones. FEMS Immunology and Medical
Microbiology, 2004. 40: p. 101-111.
21. Creech, C.B., 2nd, T.R. Talbot, and W. Schaffner, Community-associated methicillin-
resistant Staphylococcus aureus: the way to the wound is through the nose. J Infect Dis,
2006. 193(2): p. 169-71.
22. Rubin, R.J., et al., The economic impact of Staphylococcus aureus infection in New York
City hospitals. Emerg Infect Dis, 1999. 5(1): p. 9-17.
23. Engemann, J.J., et al., Adverse clinical and economic outcomes attributable to methicillin
resistance among patients with Staphylococcus aureus surgical site infection. Clin Infect
Dis, 2003. 36(5): p. 592-8.
24. Ruiz, V.A. and S.M. Guillén, Tratado SEIMC de enfermedades infecciosas y microbiología
clínica. 2006: Editorial Médica Panamericana.
25. Mediavilla, J.R., et al., Global epidemiology of community-associated methicillin resistant
Staphylococcus aureus (CA-MRSA). Curr Opin Microbiol, 2012. 15(5): p. 588-95.
26. Kobayashi, S.D., et al., Comparative analysis of USA300 virulence determinants in a rabbit
model of skin and soft tissue infection. J Infect Dis, 2011. 204(6): p. 937-41.
27. Degnan, B.A., et al., Characterization of an isogenic mutant of Streptococcus pyogenes
Manfredo lacking the ability to make streptococcal acid glycoprotein. Infect Immun, 2000.
68(5): p. 2441-8.
28. Pannaraj, P.S., et al., Infective pyomyositis and myositis in children in the era of
community-acquired, methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clin Infect Dis,
2006. 43(8): p. 953-60.
29. Lowy, F.D., Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med, 1998. 339(8): p. 520-32.
30. Masalha, M., et al., Analysis of transcription of the Staphylococcus aureus aerobic class Ib
and anaerobic class III ribonucleotide reductase genes in response to oxygen. J Bacteriol,
2001. 183(24): p. 7260-72.
31. Omoe, K., et al., Biological properties of staphylococcal enterotoxin-like toxin type R.
Infect Immun, 2004. 72(6): p. 3664-7.
32. Yamaguchi, T., et al., Identification of the Staphylococcus aureus etd pathogenicity island
which encodes a novel exfoliative toxin, ETD, and EDIN-B. Infect Immun, 2002. 70(10): p.
5835-45.
33. Otter, J.A. and G.L. French, Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus
aureus: the case for a genotypic definition. J Hosp Infect, 2012. 81(3): p. 143-8.
34. Yamamoto T, H.W., Takano T, Nishiyama A., Genetic nature and virulence of community-
associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus BioMedicine 2013. 3(1): p. 2-18.
35. Mediavilla, J.R., et al., Global epidemiology of community-associated methicillin resistant
Staphylococcus aureus (CA-MRSA). Curr Opin Microbiol. 15(5): p. 588-95.
36. Deleo, F.R., et al., Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.
Lancet. 375(9725): p. 1557-68.
37. Chambers, H.F., The changing epidemiology of Staphylococcus aureus? Emerg Infect Dis,
2001. 7(2): p. 178-82.
38. Fey, P.D., et al., Comparative molecular analysis of community- or hospital-acquired
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 2003. 47(1): p.
196-203.
39. Berga, A.P., Infecciones producidas por Staphylococcus aureus. 2009: Marge Books.
49
40. Seybold, U., et al., Emergence of community-associated methicillin-resistant
Staphylococcus aureus USA300 genotype as a major cause of health care-associated blood
stream infections. Clin Infect Dis, 2006. 42(5): p. 647-56.
41. Yamamoto, T., et al., Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus:
community transmission, pathogenesis, and drug resistance. J Infect Chemother, 2010.
16(4): p. 225-54.
42. Kurlenda, J. and M. Grinholc, Alternative therapies in Staphylococcus aureus diseases.
Acta Biochim Pol, 2012. 59(2): p. 171-84.
43. de Lencastre, H., D. Oliveira, and A. Tomasz, Antibiotic resistant Staphylococcus aureus: a
paradigm of adaptive power. Curr Opin Microbiol, 2007. 10(5): p. 428-35.
44. Voyich, J.M., et al., Is Panton-Valentine leukocidin the major virulence determinant in
community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease? J Infect Dis,
2006. 194(12): p. 1761-70.
45. Shukla, S.K., Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus and its
emerging virulence. Clin Med Res, 2005. 3(2): p. 57-60.
46. Tenover, F.C. and R.V. Goering, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain
USA300: origin and epidemiology. J Antimicrob Chemother, 2009. 64(3): p. 441-6.
47. Ma, X.X., et al., Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus,
Uruguay. Emerg Infect Dis, 2005. 11(6): p. 973-6.
48. Rodriguez-Noriega, E., et al., Evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
clones in Latin America. Int J Infect Dis. 14(7): p. e560-6.
49. Otto, M., Community-associated MRSA: what makes them special? Int J Med Microbiol,
2013. 303(6-7): p. 324-30.
50. Miragaia, M., et al., Genetic diversity of arginine catabolic mobile element in
Staphylococcus epidermidis. PLoS One, 2009. 4(11): p. e7722.
51. Malachowa, N. and F.R. DeLeo, Mobile genetic elements of Staphylococcus aureus. Cell
Mol Life Sci, 2010. 67(18): p. 3057-71.
52. Voyich, J.M., et al., Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid
destruction by human neutrophils. J Immunol, 2005. 175(6): p. 3907-19.
53. Wu, K., et al., Assessment of virulence diversity of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus strains with a Drosophila melanogaster infection model. BMC Microbiol, 2012. 12:
p. 274.
54. Parker, D. and A. Prince, Immunopathogenesis of Staphylococcus aureus pulmonary
infection. Semin Immunopathol, 2012. 34(2): p. 281-97.
55. Sifri, C.D., et al., Caenorhabditis elegans as a model host for Staphylococcus aureus
pathogenesis. Infect Immun, 2003. 71(4): p. 2208-17.
56. Barbier, F., et al., High prevalence of the arginine catabolic mobile element in carriage
isolates of methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother,
2011. 66(1): p. 29-36.
57. Onishi, M., et al., Prevalence and genetic diversity of arginine catabolic mobile element
(ACME) in clinical isolates of coagulase-negative staphylococci: Identification of ACME
type I variants in Staphylococcus epidermidis. Infect Genet Evol, 2013.
58. Shore, A.C., et al., Characterization of a novel arginine catabolic mobile element (ACME)
and staphylococcal chromosomal cassette mec composite island with significant homology
to Staphylococcus epidermidis ACME type II in methicillin-resistant Staphylococcus aureus
genotype ST22-MRSA-IV. Antimicrob Agents Chemother, 2011. 55(5): p. 1896-905.
59. Sabat, A.J., et al., Novel organization of the arginine catabolic mobile element and
staphylococcal cassette chromosome mec composite island and its horizontal transfer
between distinct Staphylococcus aureus genotypes. Antimicrob Agents Chemother, 2013.
57(11): p. 5774-7.
50
60. Araque Granados, M.I., Estudio bioquímico y molecular de la producción de precursores
de carbamato de etilo por bacteria lácticas asociadas al proceso de vinificación, in
Bioquímica y Biotecnologia. 2010, Universitat Rovira i Virgili.: Tarragona. p. 261.
61. Diep, B.A., et al., The arginine catabolic mobile element and staphylococcal chromosomal
cassette mec linkage: convergence of virulence and resistance in the USA300 clone of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Infect Dis, 2008. 197(11): p. 1523-30.
62. Ito, T., Y. Katayama, and K. Hiramatsu, Cloning and nucleotide sequence determination of
the entire mec DNA of pre-methicillin-resistant Staphylococcus aureus N315. Antimicrob
Agents Chemother, 1999. 43(6): p. 1449-58.
63. Preston, G.M., B. Haubold, and P.B. Rainey, Bacterial genomics and adaptation to life on
plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr Opin Microbiol,
1998. 1(5): p. 589-97.
64. Fuchs, S., et al., Anaerobic gene expression in Staphylococcus aureus. J Bacteriol, 2007.
189(11): p. 4275-89.
65. Mathews, C.K., et al., Bioquímica. 2002: Pearson Educación.
66. Matsui, M., M. Tomita, and A. Kanai, Comprehensive computational analysis of bacterial
CRP/FNR superfamily and its target motifs reveals stepwise evolution of transcriptional
networks. Genome Biol Evol, 2013. 5(2): p. 267-82.
67. Makarova, K.S., A.A. Mironov, and M.S. Gelfand, Conservation of the binding site for the
arginine repressor in all bacterial lineages. Genome Biol, 2001. 2(4): p. RESEARCH0013.
68. Caldara, M., D. Charlier, and R. Cunin, The arginine regulon of Escherichia coli: whole-
system transcriptome analysis discovers new genes and provides an integrated view of
arginine regulation. Microbiology, 2006. 152(Pt 11): p. 3343-54.
69. Levy, C., et al., Molecular basis of halorespiration control by CprK, a CRP-FNR type
transcriptional regulator. Mol Microbiol, 2008. 70(1): p. 151-67.
70. Sawers, G., et al., Transcriptional activation by FNR and CRP: reciprocity of binding-site
recognition. Mol Microbiol, 1997. 23(4): p. 835-45.
71. Holmes, D.S. and M. Quigley, A rapid boiling method for the preparation of bacterial
plasmids. Anal Biochem, 1981. 114(1): p. 193-7.
72. Sambrook, J. and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2001: Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
73. Strålfors, P. and P. Belfrage, Electrophoretic elution of proteins from polyacrylamide gel
slices. Analytical Biochemistry, 1983. 128(1): p. 7-10.
74. Voyich JM, O.M., Mathema B, Braughton KR, Whitney AR, Welty D, , et al., Is Panton-
Valentine leukocidin the major virulence determinant in community-associated methicillin-
resistant Staphylococcus aureus disease? J Infect Dis, 2006. 194(12): p. 1761-70.
75. Schefe, J.H., et al., Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts and the
novel "gene expression's CT difference" formula. J Mol Med (Berl), 2006. 84(11): p. 901-
10.
76. Cunin, R., et al., Biosynthesis and metabolism of arginine in bacteria. Microbiol Rev, 1986.
50(3): p. 314-52.
77. Ouzounis, C.A. and N.C. Kyrpides, On the evolution of arginases and related enzymes. J
Mol Evol, 1994. 39(1): p. 101-4.
78. Lindgren, J.K., et al., Arginine deiminase in Staphylococcus epidermidis functions to
augment biofilm maturation through pH homeostasis. J Bacteriol, 2014. 196(12): p. 2277-
89.
79. Hazkani-Covo, E. and D. Graur, Evolutionary conservation of bacterial operons: does
transcriptional connectivity matter? Genetica, 2005. 124(2-3): p. 145-66.
80. Planet, P.J., et al., Emergence of the epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus
strain USA300 coincides with horizontal transfer of the arginine catabolic mobile element
and speG-mediated adaptations for survival on skin. MBio, 2013. 4(6): p. e00889-13.
51
81. Lathe, W.C., III, B. Snel, and P. Bork, Gene context conservation of a higher order than
operons. Trends in Biochemical Sciences. 25(10): p. 474-479.
82. Price, M.N., et al., Operon Formation is Driven by Co-Regulation and Not by Horizontal
Gene Transfer. 2005.
83. Wang, L., et al., Genome-wide operon prediction in Staphylococcus aureus. Nucleic Acids
Res, 2004. 32(12): p. 3689-702.
84. Cotter, P.D. and C. Hill, Surviving the acid test: responses of gram-positive bacteria to low
pH. Microbiol Mol Biol Rev, 2003. 67(3): p. 429-53, table of contents.
52
8. ANEXOS
ANEXO 1. Secuenciación del gen SAUSA300_0063 clonado dentro del plásmido pET303/CT-His.
Figura A1. Secuencia nucleotídica y traducción a aminoácidos del gen sausa300_0063
clonado dentro del plásmido pET303/CT-His. Las posiciones de los primers empleados para
de la identificación de la orientación del gen se observan con negrilla con sus respectivos
sitios de reconocimiento para las enzimas XbaI y NsiI. El promotor T7 corriente arriba y
corriente abajo de la secuencia se observan resaltadas en amarillo y en azul respectivamente,
el operador lac (LacO) subrayado en negro, el sitio de unión ribosomal (RBS) señalado en
verde, el codón de inicio Met para el gen sausa300_0063 indicado con un circulo y resaltado
en morado la secuencia para el tag de 6 Histidinas.
aaaatagaaaatattatatatcaa
K I E N I I Y Q
gataaaagaaattggattataaaaaaa
D K R N W I I K K
CATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTG
H L E H H H H H H stop D
CCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA
6 his Tag
PROMOTOR T7
TERMINAL
CATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTG
H L E H H H H H H stop D
CCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA
6 his Tag
PROMOTOR T7
TERMINAL
CCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGTAATAATTTTGTTTAACTTTAAGA
AGGAGGTCTAGAgttatgtatgaagaaaat…//… attggattataaaaaaaATGCATCTAGAATG
V M Y E E N L D Y K K N A S R M
PROMOTOR T7
SENTIDO
Lac O
RBS XbaI PRIMER SENTIDO PRIMER ANTISENTIDO NsiI
CATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTG
H L E H H H H H H stop D
CCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA
6 his Tag
PROMOTOR T7
TERMINAL
M H L E H H H
H H
atgactgttcaattaataagtaatttatctggactt
M T V Q L I S N L S G L
aacagaaaaactactggtgaaataatcagagaatta
N R K T T G E I I R E L
caattagcatcatacttaaatattcctgttagtattgttagaccttataaagaggattta
Q L A S Y L N I P V S I V R P Y K E D L
acactttatcaa
T L Y Q
tataaaaaaggacaagtcatatatcattcaactgatcaaataaaattt
Y K K G Q V I Y H S T D Q I K F
gtatactttttagtaaatggttgt
V Y F L V N G C
attttacatgaatcttctaatattactggtgacaat
I L H E S S N I T G D N
tatttaagattaagtaaagacgaaaatatatttcca
Y L R L S K D E N I F P
atgaacttcatatttaatgaaacc
M N F I F N E T
cctgcaccatatgaaatatgtacagctttgacagattgtaaaatatta
P A P Y E I C T A L T D C K I L
5´. . .
CCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGTAATAATTTTGTTTAACTTTAAGA
AGGAGGTCTAGAgttatgtatgaagaaaat…//… attggattataaaaaaaATGCATCTAGAATG
V M Y E E N L D Y K K N A S R M
PROMOTOR T7
SENTIDO
Lac O
RBS XbaI PRIMER SENTIDO PRIMER ANTISENTIDO NsiI Primer Sentido
atgtatgaagaaaatatttatattaaaaattcagaatatgaatttgataataatcttaaa
M Y E E N I Y I K N S E Y E F D N N L K
CCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGTAATAATTTTGTTTAACTTTAAGA
AGGAGGTCTAGAgttatgtatgaagaaaat…//… attggattataaaaaaaATGCATCTAGAATG
V M Y E E N L D Y K K N A S R M
PROMOTOR T7
SENTIDO
Lac O
RBS XbaI PRIMER SENTIDO PRIMER ANTISENTIDO NsiI
actttaccgaaa
T L P K
gatttacttgagtatttatgtagaaagcataatgaaatatttgaaagtctcttcaagaaa
D L L E Y L C R K H N E I F E S L F K K
cttaatgagactattcaatttcaagtagaatatattatggcgttaagagctaattcagct
L N E T I Q F Q V E Y I M A L R A N S A
aaagaaagaatt
K E R I
. . . 3´
CATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTG
H L E H H H H H H stop D
CCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA
6 his Tag
PROMOTOR T7
TERMINAL
CATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTG
H L E H H H H H H stop D
CCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA
6 his Tag
PROMOTOR T7
TERMINAL
CATCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTG
H L E H H H H H H stop D
CCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAA
6 his Tag
PROMOTOR T7
TERMINAL
gaaagaatactacaaattttatgcctttcaattggggatgataatgga
E R I L Q I L C L S I G D D N G
Primer Antisentido
gaattctatgaattaaaacaaatt
E F Y E L K Q I
H
T7 TERMINAL
53
ANEXO 2. Amplificación de los genes para PCR en tiempo real.
Figura A2. Amplificación de los genes para PCR en tiempo real. a. Electroforesis de los
productos amplificados por PCR a partir de ADNc de los genes sausa300_0063 (142pb),
arcR (158pb), arcCcons (169pb), arcCACME (190pb) y gyrB (91pb). MP: Marcador de Peso
Molecular de 50 pb. Electroforesis en gel de agarosa al 1,7% con tinción de bromuro de
etidio.
pb
- 50
- 200
- 50
0
-50pb
-200pb
-500pb
MP
-50pb
-200pb
-500pb
MP