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DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
MAESTRÍA EN CIENCIAS FARMACÉUTICAS
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:
DISEÑO Y DESARROLLO DE FORMAS FARMACÉUTICAS PRODUCTOS BIOLÓGICOS
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN:
“DETERMINACIÓN DEL EFECTO ANTIMICÓTICO DE KETOCONAZOL
INCORPORADO EN CRISTALES LÍQUIDOS LIOTRÓPICOS EN C. albicans”
COMUNICACIÓN IDÓNEA DE RESULTADOS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS FARMACÉUTICAS.
PRESENTA
IBI. Alfonso Santiago Téllez. 2121801476
Julio 2014.
Comité Tutoral
Dra. Laura Estela Castrillón Rivera.
Dr. Carlos Tomás Quirino Barreda.
M en C. Alejandro Palma Ramos.
2
DETERMINACIÓN DEL EFECTO ANTIMICÓTICO DE KETOCONAZOL INCORPORADO EN CRISTALES
LÍQUIDOS LIOTRÓPICOS EN C. albicans
COMITÉ TUTORAL
Dra. Laura Estela Castrillón Rivera. __________________________
Dr. Carlos Tomás Quirino Barreda. __________________________
M en C. Alejandro Palma Ramos ____________________________
IBI. Alfonso Santiago Téllez 2121801476. ___________________________
3
DETERMINACIÓN DEL EFECTO ANTIMICÓTICO DE KETOCONAZOL INCORPORADO EN CRISTALES
LÍQUIDOS LIOTRÓPICOS EN C. albicans
JURADO
PRESIDENTE: Dra. Elizabeth Piñón Segundo. -------------------------------------------
VOCAL: Dra. María Eugenia Castro Mussot. --------------------------------------------
SECRETARIO: Dra. Laura E Castrillón Rivera. -------------------------------------------
4
RESUMEN
El uso de los cristales líquidos liotrópicos en formulaciones farmacéuticas como sistemas de entrega de fármacos es un campo amplio de investigación, sobre todo en sistemas a escala nanométrica. En este trabajo se muestra el uso potencial como antimicótico de un sistema nanométrico de entrega de fármacos o nanosistema líquido cristalino liotrópico (NSLCL) conteniendo Ketoconazol (KTZ). En general, los sistemas nanométricos cargados con uno o más principios activos buscan imitar o modificar procesos biológicos y pueden brindar soluciones a algunos problemas asociados con la solubilidad, biodisponibilidad, inmunocompatibilidad y citotoxicidad de muchos fármacos. Se incorporó KTZ en un NSLCL por la similitud de esta mesofase con algunas de las estructuras de la piel, sitio en donde son comunes las micosis y en la que por su natural propiedad de barrera, la difusión y permanencia de los antimicóticos se ve limitada, requiriéndose una terapia concomitante oral y tópica. El NSLCL cargado con el principio activo fue elaborado como una dispersión de tensoactivos en agua, utilizando ultrasonicación.
Se determinó el efecto antimicótico del KTZ incorporado en el NSLCL sobre levaduras de C. albicans de la cepa de referencia ATCC 10231, habiéndose comparado esta actividad con el efecto que presentaron muestras del fármaco disuelto en una base lipófila y en una solución metanol-agua. Para el estudio comparativo se realizaron previamente cinéticas de crecimiento de la levadura en caldo dextrosa Sabouraud, utilizando una técnica turbimétrica para determinar la concentración de UFC/ml. Se realizaron ensayos Kirby-Bauer y de vaciado en placa con los diferentes vehículos conteniendo KTZ para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) del KTZ y los resultados también se contrastaron con los obtenidos de alícuotas de concentración equivalente, extraídas de formas farmacéuticas comerciales. Para determinar el tamaño de partícula y la morfología del NSLCL, así como comprobar que el KTZ se encontraba dentro de la nanoestructura se utilizó difractometría láser y microscopía electrónica de transmisión (MET), respectivamente.
Los resultados mostraron la formación de una nanoestructura hexosómica que contuvo KTZ en su interior (NSLCL-KTZ), habiendo demostrado tener una mayor potencia antimicótica contra C. albicans, con una CMI de 24 µg/ml, comparada con los 40 μg/ml del KTZ disuelto en metanol-agua y de las formas farmacéuticas comerciales.
5
AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES
Agradezco a:
La Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco y
concretamente a la Coordinación y profesores del programa de
Maestría en Ciencias Farmacéuticas
El Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por la
beca 423193/269893, para la realización de mis estudios de
posgrado.
La Secretaría de Ciencia, Tecnología e Innovación (SECITI) por el
apoyo recibido mediante el proyecto de la División de CBS:
Obtención y evaluación de nanomedicinas para resolver problemas
de micosis mucocutáneas y prevención de fotodermatosis y cáncer
en piel, convenio ICYTDF/153/2013, clave 34611138; para disponer
de recursos materiales adicionales para el proyecto de Maestría, así
como la presentación de avances en el V Congresso Ibero-
Americano de Ciências Farmacéuticas e VIII Conferência Nacional
de EducaçàoFarmacéutica. Brasilia, BRASIL. Junio de 2013.
La Ing. Patricia Castillo del Laboratorio Central de Microscopía
Electrónica de la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad
Iztapalapa, y al M. en C. Jorge Sepúlveda del Laboratorio de
Microscopia Electrónica del Edificio de la Ciencia y Tecnología
Ambiental de esa misma Unidad, así como al Dr. Fernando García,
del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional
Autónoma de México, por el apoyo recibido para la obtención de las
distintas imágenes de los sistemas nanoestructurados en estudio.
6
AGRADECIMIENTOS
La presente Tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente,
participaron varias personas leyendo, opinando, corrigiendo, teniéndome
paciencia, dando ánimo, acompañando en los momentos de crisis y en los
momentos de felicidad.
Agradezco a mi comité tutoral; la Dra. Laura Castrillón, al M en C Alejandro
palma y al Dr. Tomás Quirino por haber confiado en mí, por la paciencia y la
dirección de este trabajo así como el apoyo, los consejos y el ánimo en todo el
proceso de elaboración de esta Tesis.
A la Ing. Adriana Avalos Hernández (Ally), quien me acompañó en la aventura
que significó la maestría y que, de manera incondicional me brindó su apoyo y
entendió mis malos momentos.
Gracias también a mis queridos amigos y compañeros, que me apoyaron y me
permitieron entrar en su vida durante estos años de convivir dentro y fuera del
salón de clase.
A toda mi familia por comprender las largas ausencias, que a pesar de la
distancia siempre estuvo atenta para saber cómo iba mi proceso.
A los QFB. José de Jesús Juárez y Juan Ramírez del Laboratorio de Farmacia
Molecular y Liberación Controlada de la UAM-Xochimilco, por todo el apoyo. Y
a todas las personas que de alguna forma han influido en mi vida académica.
Y gracias a la vida por la oportunidad de concluir este viaje y por el horizonte
que abre.
Gracias a todos.
7
Dedicato a tutti quelli che stanno aspettando.
Forti e degni.
8
INDICE Pag.
Abreviaturas. 12
Reactivos. 13
Índice tablas. 14
Índice de imágenes. 15
Índice de gráficas. 16
Índice de figuras. 17
Introducción. 18
Marco teórico.
1.1 Micosis. 21
1.1.2 Clasificación de las micosis. 22
1.1.3 Epidemiología. 23
1.2 Hongos. 24
1.3 Candidiasis. 25
1.4 Candida. 26
1.4.1 Patogénesis de C. albicans. 28
1.5 Antimicóticos. 30
1.5.1 Azoles. 32
1.6 Ketoconazol. 33
1.6.1 Farmacocinética del Ketoconazol. 34
2. Estrategias para el tratamiento de las micosis: nanotecnología. 35
2.1 Nanoacarreadores. 37
2.2 Tipos de Nanoacarreadores de interés tópico y/o transdérmico. 39
2.2.1 Nanopartículas poliméricas. 39
2.2.2 Nanopartículas inorgánicas. 40
2.2.3 Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS). 40
9
2.2.4 Complejos nanométricos de ciclodextrinas. 41
2.2.5 Niosomas. 42
2.2.6 Nanoemulsiones. 42
2.2.7 Dendrímeros. 43
2.2.8 Liposomas. 43
3. Cristales líquidos liotrópicos. 45
Planteamiento del problema. 49
Hipótesis y Objetivos. 51
Metodología.
1. Reproducción y caracterización de un NSLCL conteniendo Ketoconazol 54
1.1 Reproducción del NSLCL. 54
1.2 Determinación del tamaño de partícula. 55
1.3 Microscopía electrónica de transmisión (MET). 55
1.3.1 Análisis elemental. 55
1.3.2 Morfología. 57
2. Evaluación del efecto antimicótico del KTZ incorporado en un NSLCL y
comparación contra KTZ en solución y en base lipófila. 57
2.1 Sensibilidad de la cepa C albicans ATCC10231 al Ketoconazol. 58
2.2 Determinación de la CMI de Ketoconazola en solución. 58
2.3 Determinación de la CMI por vaciado en placa de Ketoconazol en solución. 58
2.4 Determinación de la CMI de Ketoconazol en base lipófila y
NSLCL. 59
3. Desarrollo de un método de cuantificación de levaduras por turbimetría Mediante la adaptación del nefelómetro de McFarland. 60
4. Determinación mediante el método de microdilución en caldo de la CMI en Candida albicans del NSLCL conteniendo Ketoconazol y comparación contra la CMI de Ketoconazol en solución. 62
10
5. Comparación del efecto inhibitorio del Ketoconazol incorporado en NSLCL con el de formas farmacéuticas comerciales. 63 5.1 Determinación del efecto antimicótico de formas farmacéuticas comerciales
con Ketoconazol por el método Kirby-Bauer. 63
5.2 Determinación del efecto antimicótico de formas farmacéuticas
comerciales con Ketoconazol por el método de microdilución en caldo. 63
6. Determinación por microscopía electrónica de transmisión (MET) el efecto de
NSLCL/KTZ sobre la morfología de las levaduras de C. albicans. 64
Resultados
1. Reproducción y caracterización de un NSLCL conteniendo Ketoconazol 67
1.1 Reproducción del NSLCL. 67
1.2 Determinación del tamaño de partícula. 68
1.3 Microscopía electrónica de transmisión (MET). 69
1.3.1 Análisis elemental. 69
1.3.2 Morfología. 71
2. Evaluación del efecto antimicótico del KTZ incorporado en un NSLCL y
comparación contra KTZ en solución y en base lipófila. 72
2.1 Sensibilidad de la cepa C albicans ATCC10231 al Ketoconazol. 71
2.2 Determinación de la CMI de Ketoconazola en solución. 73 2.3 Determinación de la CMI por vaciado en placa de Ketoconazol en solución. 74
2.4 Determinación de la CMI Ketoconazol en base lipófila
y NSLCL. 76
3. Desarrollo un método de cuantificación de levaduras por turbimetría mediante la la adaptación del nefelómetro de McFarland. 78
11
4. Determinación mediante el método de microdilución en caldo de la CMI en Candida albicans del NSLCL conteniendo Ketoconazol y comparación contra la CMI de Ketoconazol en solución. 81
5. Comparación del efecto inhibitorio del Ketoconazol incorporado en NSLCL con el de formas farmacéuticas comerciales. 87 5.1 Determinación del efecto antimicótico de formas farmacéuticas comerciales
con Ketoconazol por el método Kirby-Bauer. 87
5.2 Determinación del efecto antimicótico de formas farmacéuticas
comerciales con Ketoconazol por el método de microdilución en caldo. 89
6. Determinación por microscopía electrónica de transmisión (MET) el efecto de
NSLCL/KTZ sobre la morfología de las levaduras de C. albicans. 93
Discusión. 94
Conclusiones. 98
Perspectivas del proyecto. 99
Bibliografía. 100
Anexos 107
12
Abreviaturas
KTZ Ketoconazol.
NS Nano sistema.
CLL Cristal Líquido Liotrópico.
NSLCL Nano sistema líquido cristalino liotrópico.
SB Medio de cultivo Dextrosa Sabouraud.
ml Mililitro.
UFC/ml Unidades formadoras de colonias por mililitro.
CMI Concentración mínima inhibitoria.
abs Absorbancia.
nm Nanómetro
µg Microgramo.
mg Miligramo.
h Hora.
MET Microscopía electrónica de transmisión.
DLS Difractometría de luz láser.
rpm Revoluciones por minuto.
°C Grados Celsius.
kV Kilovolts.
Ø Diámetro.
13
Reactivos
a. Ketoconazol: Ketoconazol calidad farmacéutica, distribuido por Química
LUFRA, S. A.
b. Agua desmineralizada (AGUAM, UAM-Xochimilco).
c. Nizoral® tabletas, Janssen-Cilag, S.A. de C.V.Lote TGE180, Febrero
2013.
d. Nizoral® suspensión, Janssen-Cilag, S.A. de C.V. Lote THE 053, Junio 2013.
e. Glicéridos de lauroil macrogol-32 (Gelucire® 44-14, Gattefossé;
Químicos Lyontec, S. de R.L. de C.V.).
f. Glicéridos de estearoil macrogol-32 (Gelucire® 50-13, Gattefossé;
Químicos Lyontec, S. de R.L. de C.V.).
g. Monolinoleato de glicerilo (Maisine® 35-1, Gattefossé; Químicos
Lyontec, S. de R.L. de C.V.).
h. Monooleato de glicerilo (Peceol®, Gattefossé; Químicos Lyontec, S. de
R.L. de C.V.).
i. Poloxámero 407 (Pluronic® F127; Sigma-Aldrich Química, S. de R.L. de
C.V.).
j. Propilenglicol monolaureato (Lauroglycol® 90, Gattefossé; Químicos
Lyontec, S. de R.L. de C.V.).
14
Índice de tablas
Pag
Tabla 1. Clasificación de las micosis según la OMS. 23
Tabla 2. Clasificación general de los fármacos antifúngicos. 30
Tabla 3. Número de muestras y concentración de Ketoconazol. 54
Tabla 4. Concentraciones de Ketoconazola (KTZ) en agar dextrosa Sabouraud. 59
Tabla 5. Porcentaje de agar en el medio de cultivo. 60
Tabla 6. Concentraciones de Ketoconazola analizadas en cinéticas de crecimiento. 62
Tabla 7. Concentraciones de Ketoconazol c, d comparadas en cinéticas de crecimiento. 64
Tabla 8. Tratamientos para microscopía electrónica de transmisión. 65
Tabla 9. Tamaño de partícula NSLCL. 68
Tabla 10. Prueba de sensibilidad a Ketoconazol. 73
Tabla 11. Resumen de resultados del ensayo Kirby-Bauer KTZ en solución. 74
Tabla 12. Resultados del ensayo de inhibición de C. albicans en cilindro/placa. 75
Tabla 13. Resultados de la prueba Kirby-Bauer de NSLCL. 77
Tabla 14. Halos de inhibición del ensayo cilindro/placa base lipófila y NSLCL. 78
Tabla 15. Nefelómetro con levaduras de C. albicans ATCC10231. 80
Tabla 16. Tabla de valores de concentración de levaduras en presencia de KTZ. 82
Tabla 17. Diámetros de áreas de inhibición de medicamentos comercialesc,d. 88
15
Índice de imágenes
Pág.
Imagen 1. Microfotografías de cristales líquidos liotrópicos. 47
Imagen 2. Reporte de análisis de tamaño de partícula DLS. 56
Imagen 3. Lotes de NSLCL en proceso de diálisis. 67
Imagen 4. NSLCL cargado con KTZ disuelto en medio de cultivo SB. 67
Imagen 5. Microfotografía NSLCL/ acetato de uranilo. 71
Imagen 6. Microfotografía MET en portaobjetos criogénico. 72
Imagen 7. Fotografía sensibilidad de C. albicans ATCC10231 a Ketoconazol. 73
Imagen 8. Resultado del ensayo Kirby-Bauer con KTZ en solución. 74
Imagen 9. Ensayo de inhibición por vaciado en placa. 75
Imagen 10 Comparación del efecto inhibitorio del NSLCL y discos de Referencia 76
Imagen 11 Ensayo cilindro/placa con agar al 1.2% NSLCL sobre C. albicans. 77
Imagen 12. Cuenta estándar de levaduras de C. albicans. 79
Imagen 13. Ensayo Kirby-Bauer tabletas con Ketoconazol 200 mg. 87
Imagen 14. Ensayo Kirby-Bauer suspensión oral con Ketoconazol 2%. 88
Imagen 15. Microfotografías de levaduras de C. albicans en presencia de diferentes
concentraciones de Ketoconazol en NSLCL. 93
16
Índice de gráficas
pág.
Gráfica 1. Curva tipo que relaciona la turbidez (absorción) con UFC/ml de levaduras de C. albicans ATCC102. 80
Gráfica 2. Curva de crecimiento de Candida albicans ATCC 10231. 81
Gráfica 3. Cinéticas de inhibición de KTZ sobre levaduras de C.albicans. 83
Gráfica 4. Cinética de de inhibición del KTZ en NSLCL a diferentes concentraciones. 84
Gráfica 5. Cinética de de inhibición del KTZ en NSLCL fase exponencial. 85
Gráfica 6. Cinética de inhibición NSLCL en C.albicans de diferentes lotes. 86
Gráfica 7. Efecto inhibitorio de Nizoral tabletas en el crecimiento de C. albicans. 90
Gráfica 8. Efecto inhibitorio de Nizoral suspensión oral en el crecimiento de C.albicans. 91
Gráfica 9. Efecto inhibitorio de KTZ incorporado en diferentes vehículos
en el crecimiento de C.albicans. 92
17
Índice de figuras
Pag
Figura 1. Cronología de la aparición de algunos antimicóticos. 31
Figura 2. Ruta de síntesis del ergosterol en la célula fúngica. 34
Figura 3. Estructura química del Ketoconazol. 34
Figura 4. Diagrama de flujo de la elaboración de la curva patrón con el
nefelómetro McFarland. 58
Figura 5. Difractogramas de NSLCL. 69
Figura 6. Espectro de masas para Ketoconazola 70
Figura 7. Espectro de masas del lote N1 de NSLCL-KTZ. 70
18
Introducción
La creciente incidencia de las infecciones causadas por hongos se ve
reflejada en un mayor empleo de antifúngicos sistémicos. La importancia de las
micosis también se puede observar en las grandes cifras de ventas y aunque
en México no hay cifras concretas disponibles, en países como España por
ejemplo, entre junio de 2011 y mayo de 2012 se vendieron en las farmacias
españolas un total de 19.5 millones unidades de antimicóticos [6].
Las micosis en piel y uñas es uno de los problemas de salud pública, a los que
se enfrentan tanto individuos que no procuran una adecuada higiene o se
exponen a la exposición por hongos en sitios de alta concurrencia y humedad,
como son las piscinas y baños de balnearios, como los pacientes inmuno
suprimidos, entre éstos, los pacientes con VIH-SIDA y los diabéticos.
La farmacoterapia antimicótica actual para piel y uñas, particularmente en
casos recurrentes o crónicos, requiere de la administración simultánea de dosis
orales y tópicas, no estando exenta de problemas de seguridad y toxicidad
asociados a la farmacocinética y metabolismo de la dosis sistémica del
fármaco, a los que se añaden los relativos a fenómenos de resistencia
microbiana. Esto mantiene vigente la necesidad de profundizar en el desarrollo
de nuevos antimicóticos, así como en la de disponer de mejores sistemas de
entrega de fármacos que aporten ventajas apreciables respecto a los ya
existentes, eludiendo o modificando la propiedad de barrera natural de la piel,
para optimizar la difusión y/o permanencia de los antimicóticos en el sitio de
acción.
Bajo este contexto, en el Laboratorio de Farmacia Molecular y Liberación
Controlada de la UAM-Xochimilco, se planteó obtener un nanosistema líquido
cristalino liotrópico (NSLCL) con capacidad de carga y transporte de KTZ, para
su posterior difusión y permanencia en el estrato córneo y las primeras capas
de la piel. Lo anterior teniendo como base la similitud de las mesofases líquido
cristalinas cubosómicas y hexosómicas con algunas de las estructuras de la
piel en donde son comunes las micosis.
19
La preparación del NSLCL cargado con KTZ (NSLCL-KTZ) consistió en la
dispersión de una mezcla de tenso-activos y KTZ en agua, utilizándose
ultrasonido de alta intensidad para conseguir la talla nanométrica,
aprovechando el fenómeno de cavitación [85].
En este proyecto se determinó la concentración mínima inhibitoria (MIC), del
KTZ incorporado en el NSLCL sobre levaduras de la cepa de referencia C.
albicans ATCC1023 comparándola con la CMI del KTZ incorporado en una
base lipófila, en una solución metanol-agua y en alícuotas equivalentes de dos
formas farmacéuticas comerciales (tabletas y suspensión). Estos ensayos se
realizaron en el Laboratorio de Inmunología de la UAMX.
Se utilizaron las técnicas: Kirby-Bauer, vaciado en placa y cilindro-placa,
evaluándose la cinética de crecimiento de la cepa de referencia en medio
líquido, cuando crece en presencia de KTZ incorporado en el NSLCL-KTZ, en
solución, y con las alícuotas equivalentes de las dos formas farmacéuticas
comerciales utilizadas para fines comparativos en este estudio.
Para medir la concentración de levaduras en el medio de cultivo, se utilizó una
técnica por espectrofotometría estandarizada para levaduras, con este ensayo
se determinó y comparó el efecto antimicótico del KTZ incorporado en los
diferentes vehículos.
Se realizaron estudios de distribución de tamaño de partícula por difractometría
láser y de la morfología y presencia del KTZ en las nanopartículas líquido
cristalinas, por MET.
Las técnicas microbiológicas utilizadas sobre levaduras de C. albicans
condujeron a la observación de que cuando el KTZ se encuentra dentro de los
nanocristales líquidos liotrópicos, existe un aumento en el efecto antimicótico
que hace concluir que el uso de dichos nanoacarreadores como sistema de
entrega de fármacos, es una alternativa que puede reducir los efectos adversos
del KTZ cuando éste es utilizado con una farmacoterapia conjunta vía oral y
tópica.
20
Marco teórico
21
1. Marco teórico
1.1 Micosis
Una micosis es una enfermedad causada por hongos microscópicos,
habitualmente en la piel. En ésta, así como en la boca, el intestino y los
órganos sexuales, los hongos y levaduras conviven normalmente y de forma
natural con otros microorganismos. Cuando hay una proliferación exagerada de
los hongos se produce la micosis.
Las enfermedades micóticas en el hombre fueron descritas desde el siglo XVII,
pero el estudio de las micosis cedió ante el creciente interés por las infecciones
bacterianas. Un siglo después, al disponer la humanidad de medios para
controlar los anteriores procesos infecciosos, las micosis resurgieron como
agentes de especial importancia clínica. A este aumento contribuyeron los
avances que permiten la supervivencia de pacientes debilitados y que alteran
con algún propósito el ambiente inmunológico del individuo; además, el que en
las últimas décadas se haya presentado la pandemia del SIDA. Todo lo anterior
ha incrementado la incidencia y severidad de las micosis [1].
La capacidad de los hongos para producir enfermedad es puramente accidental
y no está ligada a la necesidad de mantener la especie, salvo en los casos de
los dermatofitos en los cuales la adaptación a los humanos ha sido completa.
La localización de las micosis en el organismo humano refleja capacidades de
variada naturaleza; así los dermatofitos atacan la piel porque poseen enzimas
capaces de digerir la queratina. Los hongos que causan micosis subcutáneas
tienen restricciones de penetración al tejido y por ello deben tener acceso al
sitio de infección por implantación traumática; los agentes causales de las
micosis sistémicas son saprófitos del medio externo en donde crecen como
mohos, pero al encontrarse en los tejidos, se vuelven termotolerantes,
colonizan el órgano blanco y se diseminan ampliamente [1,2].
22
1.1.2 Clasificación de las micosis
Las micosis han sido clasificadas por la Organización Mundial de la Salud
(OMS) según su el lugar de infección en el cuerpo humano. En la tabla 1 se
resume la clasificación de las micosis según esta organización y también se
muestran algunos agentes infecciosos y las patologías que producen; en este
sentido, las micosis se han dividido en cuatro categorías según el sitio en que
se localizan [3,4].
Las micosis superficiales son infecciones por diferentes especies de hongos
que se localizan en el epitelio o capa más externa de las mucosas, piel y uñas.
La piel es el órgano más extenso del cuerpo y su principal función es proteger
contra cambios de temperatura, lesiones e infecciones. Las características de
la piel (grosor, textura, presencia de pelo) no son uniformes en todo el cuerpo.
Muchos de los hongos se encuentran en el suelo o en animales como perros, y
son principalmente los dermatofitos, la causa de tiñas o infecciones en la piel,
pelo y uñas [2].
Micosis subcutáneas se presentan mayormente en regiones tropicales y
subtropicales donde las personas caminan descalzas pueden producirse
infecciones por hongos saprófitos de las plantas, los musgos o el suelo. La
penetración de estos hongos a través de los cortes y abrasiones de la piel da
lugar a la formación de una lesión primaria localizada. En la esporotricosis
puede verse afectado también el sistema linfático, pero la diseminación
hemática es rara [5].
Las micosis sistémicas agrupan todas aquellas afecciones cuyo agente
etiológico es capaz de diseminarse por vía linfohemática en algún momento de
su evolución. Son graves, incluso potencialmente mortales. En las micosis
oportunistas cualquier órgano puede resultar afectado. Son poco frecuentes en
personas con un sistema inmunitario normal. Al tratarse de microorganismos
oportunistas, es fácil que estas patologías las padezcan pacientes muy
debilitados que tengan alterados sus mecanismos de defensa frente a las
infecciones (pacientes en tratamiento con quimioterapia, enfermos de VIH-
SIDA) [6].
23
Tabla 1. Clasificación de las micosis según la OMS.
Fuente: Tomado y modificado de [3,4]. Las micosis han sido clasificadas en cuatro clases según su sitio de infección. La tabla muestra las características de las micosis así como las patologías y agentes causales de algunas micosis.
1.1.3 Epidemiología
Las dermatofitosis son micosis superficiales muy frecuentes en México.
Actualmente constituyen del 70 al 80% de todas las micosis y tienen una
frecuencia del 5% en la consulta dermatológica [7].
Aunque la demanda de atención médica no es tan grande como su prevalencia,
las dermatofitosis son frecuentes en adultos. En el Instituto Mexicano del
Seguro Social (IMSS) cada año se registran unas 507,849 consultas en
medicina familiar, 9,745 en urgencias y 19, 404 en especialidad [2]. La
importancia de las micosis superficiales es su alta prevalencia, ya que una gran
cantidad de la población adulta las padece en sus diferentes variedades. La
tiña corporis se presenta más frecuentemente en climas tropicales húmedos
calientes. Trichophyton rubrum es el agente infeccioso más común en el mundo
y es la causa de 47% de los casos de tiña corporis y el Microsporum canis es la
tercera causa asociada al 14% de esta tiña.
24
Por otra parte, T. tonsurans es el agente más común de tiña capitis. Ésta es
causada tanto por especies del género Trichophyton como por el Microsporum
es la dermatofitosis más común en niños a nivel mundial. Las dermatofitosis no
se asocian a mortalidad importante, pero pueden afectar la calidad de vida. En
general, ambos sexos y todas las edades son afectados por igual. Por ejemplo,
la onicomicosis es la primera causa de enfermedad ungueal ya que
corresponde del 18 al 40% de todas las onicopatías. Su prevalencia mundial se
estima de 1 a 11%, mientras que en México es la segunda dermatofitosis
después de la tiña pedis [2,8].
Otras micosis de gran importancia son las que afectan la mucosa vaginal. La
micosis vaginal afecta al 70-75% de las mujeres al menos una vez en la vida, y
la mitad de ellas sufre la infección más de una vez. Esta condición se da más
frecuentemente en mujeres jóvenes. La Candida (sobre todo, albicans) es la
causa más común de infección micótica vaginal. La candidiasis urogenital
tiene una incidencia de aproximadamente 300 mil casos nuevos cada año y
ocupa el 13º lugar de los padecimientos en México en todas las unidades de
salud pública [8].
1.2 Hongos
El término hongo (del latín, fungus, seta), incluye una gran variedad de
tipos celulares con diferentes formas, simples y complejos, móviles o inmóviles,
parásitos, simbiontes o saprófitos, microscópicos o macroscópicos. Son
organismos eucariontes, heterótrofos, poseen una pared rígida generalmente
de quitina. Los hongos presentan una morfología muy variada. La única célula
o el conjunto de células que los constituyen se denominan talo. En la
naturaleza pueden encontrarse formas simples como las levaduras, formas
filamentosas multinucleadas o formas macroscópicas más complejas [9]. La
mayoría de las especies crece por la continua extensión y bifurcación de
estructuras como las ramas de los árboles. Los hongos crecen como células
únicas, levaduras, o como colonias multicelulares filamentosas, mohos y setas
[10].
La diferenciación en los hongos se refiere a la serie de eventos regulados que
conducen al cambio de un estado a otro en un organismo. Estos cambios
pueden ser morfológicos, fisiológicos o ambos. Algunas especies de hongos
25
crecen sólo como mohos y otras únicamente como levaduras. Sin embargo,
muchas especies pueden crecer de una u otra forma, dependiendo de las
condiciones ambientales. Esta capacidad se conoce como dimorfismo. Esto es
importante clínicamente, porque la mayoría de los hongos patógenos en el
hombre son dimórficos [10].
La germinación de esporas, el dimorfismo y la producción de metabolitos
secundarios son ejemplos de diferenciación. Se dice que un hongo es
pleomórfico cuando posee la capacidad de presentarse en dos o más formas.
El dimorfismo micelio-levadura es un tipo especial de pleomorfismo que tienen
algunos hongos patógenos. Estos pueden cambiar de forma miceliar o
levaduriforme y viceversa en respuesta a un único factor, a diferentes factores
o bien a factores combinados. El mecanismo bioquímico que justifica el
fenómeno para un hongo no necesariamente es aplicable para otro [9, 11].
1.3 Candidiasis
La candidiasis es una micosis causada por diversas especies de levaduras del
género Candida. Cualquier tejido puede ser afectado por lo que se presentan
diversos cuadros clínicos, cada uno de ellos asociado directamente al estado
inmunológico del paciente. Las candidiasis de mucosas y piel son las más
frecuentes, mientras que las sistémicas son de evolución aguda o crónica y
generalmente severas.
Las candidiasis superficiales son frecuentes, de fácil tratamiento y no atentan
contra la vida del paciente, en tanto que las sistémicas de evolución aguda o
crónica son generalmente graves. La distribución geográfica de esta micosis es
universal y más de 70 % de ellas son producidas por C. albicans. Los casos de
candidiasis sistémica están relacionados a pacientes con severas deficiencias
en su sistema inmune. C. krusei y C. glabrata son habitualmente resistentes a
los compuestos azólicos y su hallazgo como agentes infecciosos involucrados
en enfermedades sistémicas intrahospitalarias ha aumentado en los últimos
años [12].
Los casos registrados de candidiasis muestran que el sexo es indistinto, a
excepción de la candidiasis urogenital que tiene mayor incidencia en el sexo
26
femenino. La edad y raza de las personas son factores que, según la clínica, no
influyen en la presentación de la micosis, la cual realmente dependerá del
factor de inmunocompromiso asociado; sin embargo, por lo que respecta a la
ocupación aunque no es un factor de importancia, se considera que algunas
actividades de las personas pueden favorecer la infección.
En México, la candidiasis urogenital es una entidad nosológica que afecta
principalmente al sexo femenino. En 2009 tuvo un índice mujer-hombre de 31.5
y se enfocó en el grupo etario de 25 a 44 años. Presentó una tasa de incidencia
por cien mil habitantes a nivel nacional de 269.1, y las entidades más afectadas
por este padecimiento fueron Nayarit con 504.3 casos por cien mil habitantes,
seguido de Veracruz (503.8) y Zacatecas (483.5); la menos afectada fue el DF
con una tasa anual de incidencia de 98.3 por cien mil habitantes [11, 12].
Por otro lado, la candidiasis urogenital es el décimo tercer padecimiento en el
país según estadísticas de los servicios de salud pública. Los agentes
patógenos de la candidiasis son levaduras (el estado anamorfo) del
género Candida pertenecientes al Phylum Ascomycotina. Muchas especies se
han aislado de vegetales, suelo, agua, aire, alimentos y algunas de ellas
forman parte de la biota normal de la piel y membranas mucosas (boca, vagina,
vías respiratorias altas, tracto gastrointestinal) de mamíferos. Este género
incluye aproximadamente 150 especies identificadas. Aunque se han reportado
más de 17 especies patógenas, el 90% de las infecciones se atribuyen a: C.
albicans, C. krusei, C. glabrata, C. parasilopsis, C. tropicalis [13].
1.4 Candida
Candida albicans es un hongo patógeno oportunista de humanos que en
individuos inmunocompetentes forma parte de la flora normal de las mucosas
del organismo. Sin embargo, en condiciones de inmunosupresión temporal o
permanente puede causar infecciones sistémicas que ponen en riesgo la vida
de los pacientes [14].
Candida spp. son levaduras mitospóricas alargadas o ligeramente redondas de
2 a 6 µm [15, 16] que se reproducen por gemación (blastoconidios). A
27
excepción de C. glabrata, el resto de las especies asociadas a candidiasis
pueden formar seudomicelios; C.albicans y C.dubliniensis además son
formadoras de hifas. Las especies de Candida son organismos eucariontes,
levaduriformes, unicelulares, asexuales, aerobios, heterótrofos; son muy
versátiles debido a su dualidad para sobrevivir como comensales en varios
sitios anatómicos (tracto gastrointestinal, genitourinario y regiones
mucocutáneas), y por su capacidad oportunista para volverse patógenas,
causando desde infecciones cutáneas leves hasta infecciones sistémicas
fatales, debidas estas últimas a la presencia de factores de riesgo en
el hospedero [17].
La pared celular de C. albicans está compuesta por una capa interna de β-
glucanas y quitina y una externa de manoproteínas. Estas últimas son
proteínas que están modificadas, ya sea con glicolípidos en el extremo C-
terminal y/o con oligosacáridos [18].
C. albicans es un hongo polimórfico debido a que puede presentar morfología
levaduriforme o bien, crecer como hongo filamentoso formando hifas
verdaderas. Algunas hifas, denominadas seudohifas, presentan constricciones
a intervalos regulares, como si se tratara de una cadena formada por células
con forma de salchicha que se unieran por sus extremos, y se forman cuando
las células de levaduras y su progenie de adhieren entre sí y forman estas
cadenas. Se considera un comensal oportunista que existe como parte de la
microbiota del área mucocutánea, gastrointestinal y genitourinaria en el ser
humano sano, y coloniza las membranas mucosas en el 30 a 60 % de las
personas. Bajo ciertas condiciones y en el hospedero susceptible, es capaz de
causar infecciones superficiales y sistémicas, siendo el principal hongo
patógeno del ser humano [19].
28
1.4.1 Patogénesis de C. albicans
Como ya se mencionó, la Candida albicans es una levadura común, comensal
en animales y humanos y es el principal patógeno oportunista de los mismos,
siendo causante de la candidiasis en huéspedes inmunodeprimidos. Este
hongo coloniza superficies mucocutáneas de las cavidades oral y vaginal, así
como del aparato gastrointestinal. La naturaleza y la medida del deterioro de
las defensas del huésped influyen en la manifestación y severidad de la
infección. Con frecuencia, Candida spp. se encuentra presente en las mucosas
normales, pero cuando se hace invasiva produce diversas lesiones agudas o
crónicas, localizadas o ampliamente diseminadas [20].
Los hongos C. albicans y los dermatofitos tienen características especiales que
les confieren la capacidad de infectar tejido queratinizado. C. albicans es un
comensal que en algunas circunstancias y en el hospedero susceptible es
capaz de causar infecciones superficiales o sistémicas. Los factores de
virulencia de este patógeno oportunista incluyen: su capacidad de adherencia a
células del hospedero, la secreción de enzimas degradativas, su cambio de
morfología y la formación de biopelículas. La vaginitis por Candida spp, es
frecuente en la mujer y se caracteriza por ardor, comezón, flujo e inflamación
de la vagina. Otra infección ginecológica causada por C. albicans es la
peritonitis pélvica. [21]
La candidiasis sistémica es una micosis oportunista causada por diversas
especies del género Candida spp, su nivel de profundidad o agresividad no
depende tanto del agente etiológico en sí, sino del factor de riesgo con el que
se asocie. La candidiasis invasiva es una de las causas más frecuentes de
morbilidad y mortalidad infecciosa en recién nacidos, principalmente en
neonatos de muy bajo peso al nacer. Los tres principales factores de riesgo del
huésped son: administración prolongada de antibióticos de amplio espectro,
prematurez extrema con edad gestacional de 28 semanas o menos, e inserción
de catéteres venosos centrales. Candida tiene fuerte afinidad por órganos
específicos como riñones, ojos, corazón y sistema nervioso central y C.
albicans es el tercer microorganismo más frecuentemente aislado en neonatos
[22].
29
La Candida spp es importante en la patología de la población mexicana. En un
estudio se encontró que 7.8 % de 1303 levaduras fueron C. albicans [23]. Por
otra parte, en una muestra de población mexicana, 60% de 234 pacientes
tuvieron cultivos positivos para C. albicans y 40% para Candida spp (Centro de
atención primaria: centro de salud José Castro Villagrana México DF) [21]. La
importancia de las candidiasis en México también se puede observar a través
de diversos estudios, por ejemplo un estudio de tipo observacional transversal
realizado de junio de 1999 a mayo de 2000, con pacientes del Hospital
Regional General Ignacio Zaragoza; donde de 108 pacientes, se analizaron y
procesaron una muestra de 268 especímenes para estudio micológico, el cual
incluyó examen directo, frotis, cultivos y micro cultivos en medios específicos
además de pruebas bioquímicas. El resultado fue que se obtuvieron 183
aislamientos de levaduras y 66 de hongos filamentosos y se diagnosticaron 45
micosis, que en su mayoría correspondieron a candidiasis pulmonar (32 casos).
Las especies de Candida más frecuentes asociadas a patología fueron C.
albicans y C. parapsilosis [24].
Incluso en las micosis superficiales, Candida es uno de los principales
agentes patógenos en población mexicana, después de los hongos
dermatofitos, según lo demuestra un estudio realizado en el hospital general
“Manuel Gea González” de la Ciudad de México, donde en una muestra de
pacientes menores de 18 años se encontró un 27.7 % de los casos [25].
También se observó un incremento en las tasas de infección por 1000 egresos
de 1999 a 2004. Se encontraron 45 casos de infecciosos causados por
Candida sp, con una mortalidad de 35.5%. No se identificó la especie en 18
pacientes, C. albicans en 16 casos, y otras Candidas no albicans en 24%. Con
el advenimiento de mejores tratamientos y una mayor supervivencia en los
pacientes críticamente enfermos, las infecciones por gérmenes oportunistas
como C. albicans, son cada vez más frecuentes. Se ha observado una tasa
creciente de infección de 0.10 eventos por 100 egresos en 1999 a 0.47 en 2004
y una tasa por 1000 días de estancia de 0.12 y 0.65 respectivamente [26].
30
1.5 Antimicóticos
El concepto de agente antifúngico o antimicótico engloba cualquier sustancia
capaz de producir una alteración tal de las estructuras de una célula fúngica
que consiga inhibir su desarrollo, alterando su viabilidad o su capacidad de
supervivencia, bien directa o indirectamente, lo que facilita el funcionamiento de
los sistemas de defensa del huésped.
Debido a que los hongos comprenden cinco clases ampliamente diferentes de
flora primitiva, con variaciones extremas en su fisiología y bioquímica celulares,
los agentes antimicóticos, si bien incluyen una amplia variedad de sustancias
químicas, su espectro antimicótico es bastante estrecho. Los antimicóticos que
se consideran de amplio espectro por lo general son tóxicos e irritantes, como
cabría de esperar por la no selectividad; adicionalmente, muchos de ellos
tienen una absorción limitada a través de la epidermis y no obstante tienen que
ser empleados en preparados dermatológicos[27].
Básicamente, los antimicóticos se dividen en fungicidas y fungistáticos, los
primeros son fármacos capaces de matar a los microorganismos y los
segundos inhiben el crecimiento y proliferación del hongo. Otra forma de
clasificar a los antimicóticos es por su origen: de síntesis química o los que son
producidos por otros microorganismos. Los antifúngicos sintéticos se agrupan
en azoles (imidazoles y triazoles), alilaminas, tiocarbamatos y morfolinas, entre
otros grupos. En la tabla 2 se enlistan algunos de ellos [28].
Los antimicóticos producidos por microorganismos, suelen ser metabolitos
secundarios de éstos, fundamentándose la actividad antimicótica en su
capacidad de inhibir procesos metabólicos primarios esenciales de los hongos.
No todos los agentes antimicóticos son fungicidas, muchos son sólo
fungistáticos y algunos fármacos antimicóticos tópicos deben su eficacia a una
acción queratolítica que produce un esfacelo del estrato córneo que se retira
junto con los hongos que contiene [29].
Evitar la proliferación de enfermedades fúngicas sigue siendo una ardua tarea
para el siglo XXI, es por ello que continúa el desarrollo de nuevos antifúngicos
cada vez más potentes, como se muestra en la figura 1. En la síntesis de estos
31
fármacos es muy importante tener en cuenta la relación de su estructura-
actividad, pues sobre esta base es que se podrá garantizar la muerte del hongo
sin provocar graves daños al organismo hospedero. Debido a la similitud de
algunas rutas metabólicas entre las células mamíferas y las fúngicas, es que
resulta un problema diseñar la molécula antifúngica, pues ésta debe ser
selectiva de la célula patógena y no de la célula humana sana [30].
Tabla 2. Clasificación general de los fármacos antifúngicos.
Se denominan antibióticos a los fármacos obtenidos de microorganismos. En esta tabla se muestran las principales clases de antifúngicos, debiéndose aclara que en la actualidad hay fármacos que ya no pueden ser incluidos en un
grupo específico.
Figura 1. Cronología de la aparición de algunos antimicóticos.
Se muestra la fecha aproximada en que se dan a conocer los antimicóticos, la evolución no ha terminado. A partir del año 2000 aparecen nuevos tipos de antifúngicos derivados de proteínas.
32
La creciente incidencia de las infecciones causadas por hongos se ve reflejada
en un mayor empleo de antifúngicos sistémicos. Los problemas de seguridad y
toxicidad, a los que se añaden los relativos a fenómenos de resistencia
(intrínseca, primaria o secundaria), mantienen vigente la necesidad de
profundizar en el desarrollo de nuevos antifúngicos que aporten ventajas
apreciables respecto a los ya existentes. Entre las dificultades para encontrar
un nuevo antifúngico destaca el hecho de que tanto el hongo como las células
del huésped infectadas son eucariotas, con características bioquímicas
similares, por lo que la posibilidad de provocar efectos no deseados sobre el
huésped es mayor. Además, la gran diversidad de especies fúngicas con
múltiples dianas diferentes e inestabilidad genética tampoco facilita la
búsqueda de nuevos antifúngicos. Por otra parte, la falta de correlación entre
los resultados de actividad antifúngica in vitro y la evolución de los pacientes,
observada hasta la fecha, y el costo elevado del desarrollo de estos nuevos
antifúngicos, son dificultades añadidas que obstaculizan la búsqueda de
nuevas sustancias [31].
1.5.1 Azoles.
Uno de los grupos de fármacos antimicóticos obtenidos por síntesis son los
azoles. Estos inhiben a la citocromo P-450-3-A de la célula fúngica, a través de
la inactivación de la enzima C-14-α-dimetilasa, con lo cual se interrumpe la
síntesis del ergosterol en la membrana celular del hongo. La figura 2 muestra la
ruta metabólica del ergosterol en el hongo. Como se puede observar, debido a
la falta de ergosterol se comienzan a acumular esteroles tóxicos intermedios,
aumenta la permeabilidad de la membrana y se interrumpe el crecimiento del
hongo [30].
33
Figura 2. Ruta de síntesis del ergosterol en la célula fúngica y etapa en que actúa el Ketoconazol como agente antimicótico.
El Ketoconazol al igual que otros azoles, interrumpe la síntesis de ergosterol al unirse a la enzima 14-α esterol desmetilasa. 1.6 Ketoconazol El Ketoconazol (KTZ) es un agente antifúngico del tipo imidazol. En la figura
3 se puede ver la estructura química del KTZ. Como otros imidazoles, tiene 5
estructuras del anillo que contienen 2 átomos de nitrógeno. La formulación oral
está disponible en EE.UU. desde 1981. El KTZ es el único miembro de la clase
de los imidazoles que se emplea actualmente para el tratamiento de
infecciones sistémicas. Este antifúngico es un compuesto lipofílico, propiedad
que le permite encontrarse en concentraciones altas en los tejidos grasos,
aunque sus concentraciones en el fluido cerebroespinal son pobres en
presencia de inflamación. Su solubilidad y su absorción oral son óptimas al pH
ácido gástrico.
El KTZ es afín a las membranas celulares de mamífero y por ello induce a la
toxicidad. Se usó muy ampliamente antes del desarrollo de nuevas moléculas
menos tóxicas y más eficaces (compuestos del triazol como fluconazol e
itraconazol, que tienen una afinidad mayor a las membranas celulares fúngicas
KETOCONAZOL
34
que el KTZ), por lo que su utilización en estos últimos años se ha limitado y
constituye un fármaco de segunda línea [30].
Como se observa en la figura 2, el KTZ pudiera unirse con sitios activos de la
enzima C-14-α-dimetilasa a través asociaciones de Van der Walls (grupo
CH3 del fármaco y CH3 de la enzima), al intervenir en esta etapa de la síntesis
del ergosterol en la membrana del hongo, se afecta la estructura y viabilidad de
la membrana de éste, pero también puede afectar de manera similar a las
membranas celulares del hospedero. De ahí su toxicidad [30]
Figura 3. Estructura química del Ketoconazol
La estructura del Ketoconazol.La flecha muestra un anillo imidazol con dos
átomos de nitrógeno y dos dobles enlaces.
1.6.1 Farmacocinética del Ketoconazol
El KTZ se absorbe bien cuando se administra por vía oral. Una dosis de 2 g
con la comida produce un nivel plasmático máximo de 3.5 μg/ml, pero se han
reportado niveles de hasta 50 μg/ml. Se une a proteínas en un 95 %. La
principal vía de eliminación está dada por el metabolismo hepático y la
secreción biliar de los metabolitos; la secreción renal es inferior al 4%. La
circulación enterohepática complica la farmacocinética. La vida media es de 1.4
a 3.3 horas [29].
Los derivados azólicos más recientes (bis-triazólicos) como el itraconazol, el
fluconazol, poseen diferentes facetas farmacocinéticas, farmacodinámicas y
terapéuticas que las diferencian de los antimicóticos precursores,
específicamente con el KTZ, que no obstante es el fármaco antimicótico azólico
de mayor administración a nivel mundial [30].
35
Los pacientes con onicomicosis han recibido KTZ en dosis de 200-400 mg/día
durante 4-6 meses en casos de micosis de las uñas de las manos y durante 8-
18 meses en micosis de las uñas de los pies. Las tasas de curación son
comparables con las de la griseofulvina, pero un riesgo de 1:10,000 de
hepatotoxicidad restringe el uso del KTZ. En las indicaciones que vienen
dentro de los envases se señala que casi todos los casos notificados de
hepatotoxicidad (61.3% de ellos) ocurrieron en pacientes que recibían un
tratamiento para la onicomicosis [32].
Puesto que los azoles son capaces de desencadenar disfunción hepática, es
recomendable determinar cuáles son las cifras iníciales de las enzimas
hepáticas y repetir las pruebas a intervalos regulares. Además de lo anterior,
las interacciones farmacológicas constituyen un problema considerable con
cada uno de los antimicóticos del grupo de los azoles, los cuales inhiben el
sistema enzimático hepático P-450 que metaboliza a los fármacos. Cuando la
actividad de este sistema es impedida, es posible que las concentraciones
sanguíneas de otros fármacos procesados por este sistema aumenten
rápidamente. Para librar estas dificultades desde hace algunos años se ha
investigado sobre el uso de la nanotecnología para el desarrollo de sistemas de
entrega de fármacos que disminuyan las reacciones adversas del KTZ y otros
antifúngicos [32].
2. Estrategias para el tratamiento de las micosis: nanotecnología.
La medicina demanda nuevas soluciones y respuestas a las enfermedades
actuales. Para ello, se necesitan nuevas herramientas y tecnologías. La
nanomedicina es el empleo de la nanotecnología para conseguir avances
médicos. El término nanotecnología se refiere a un amplio rango de proyectos
de escala nanométrica (entre 0,1-100 nm), la nanomedicina comprende la
aplicación de estos conceptos y herramientas a las ciencias médicas. [33,34].
Cuando un fármaco o molécula biológicamente activa se administra en una
forma convencional (comprimido, inyectable, etc.), el principio activo suele ser
liberado rápidamente al medio biológico y su comportamiento en el organismo
36
es completamente dependiente de su estructura química y propiedades
fisicoquímicas como solubilidad y coeficiente de reparto (log P). Estas
propiedades condicionan su eventual absorción a través de las membranas y
su distribución en el organismo. Al distribuirse las moléculas de fármaco en el
organismo, son capaces de llegar al tejido enfermo pero, al mismo tiempo,
alcanzan regiones o tejidos sanos, induciendo efectos secundarios o
indeseables. Por el contrario, cuando la molécula activa se administra bajo la
forma de nanopartículas simples o estructuradas (nanosomas), son las
propiedades físicas y físicoquímicas de éstas (tamaño y propiedades de
superficie), las que condicionan la distribución de la nanoestructura y del
fármaco en el organismo, así como su concentración en el lugar de acción. Una
vez alcanzada la región enferma, las nanopartículas transportadoras de
fármaco deben controlar la liberación de su contenido. El hecho de poder
concentrar el fármaco en su lugar de acción o de absorción ofrece la posibilidad
de minimizar los efectos secundarios y aumentar el índice terapéutico de la
molécula en cuestión [35].
En este sentido, la investigación en liberación de fármacos y tratamientos con
nanomateriales intenta avanzar hacia un nuevo nivel tecnológico no alcanzado
hasta ahora, y los resultados de la investigación innovadora pretenden
satisfacer muchos y prolongados desafíos en la industria farmacéutica,
cosmecéutica y nutracéutica, entre otras.
La búsqueda para resolver los temas de solubilidad, biodisponibilidad,
estabilidad química y mejoría sobre los posibles efectos secundarios de los
tratamientos farmacológicos es perseguida con energía y de manera
prometedora por los actuales avances en investigación. Dentro de la
nanomedicina se puede observar una gran cantidad de estudios sobre distintos
materiales o compuestos, así como de diferentes nanopartículas o
nanoestructuras transportadoras de fármacos, donde se diferencian entre
muchas otras, las nanopartículas poliméricas, los liposomas o las micelas
poliméricas. Este tipo de nanopartículas fue descrita por primera vez por
Speiser y colaboradores en los años 70’s [34].
37
La nanomedicina suele utilizar sistemas complejos de escala nanométrica
formados por al menos dos componentes, uno de los cuales es el principio
activo o molécula biológicamente activa y, el segundo, es el propio sistema
nanoparticulado que permite una función especial relacionada con el
diagnóstico, tratamiento, o prevención de una enfermedad. Las nanopartículas
incluyen componentes activos u objetos en el intervalo comprendido desde un
nanómetro hasta varios cientos de nanómetros, ejemplo de ello, por ser de las
estructuras más antiguas y con mayor número de estudios, están los liposomas
que pueden facilitar la liberación de fármacos hidrofóbicos y ahora, por su
tamaño, los nanoliposomas [36].
Por lo tanto, las formas farmacéuticas basadas en la nanotecnología pueden
proporcionar mejores métodos de diagnóstico médico y de tratamiento.
Adicionalmente, la respuesta biológica a los nanomateriales de ingeniería y a
sus subproductos debe ser cuidadosamente estudiada antes de poner en
práctica algunos de los abordajes basados en la nanotecnología discutidos
anteriormente. Actualmente, la mayoría de la investigación en este campo se
centra en la biocompatibilidad y toxicidad de varios nanomateriales [37].
2.1 Nanoacarreadores
A mediados o finales de 1970 el concepto de conjugado polímero-fármaco o
"Nano-terapéutica", surgió de forma independiente en varios lugares alrededor
el mundo. Desde finales de los años 80 del siglo XX hasta la actualidad, tres
tecnologías clave fueron los principales factores que estimularon esta inmensa
actividad y éxito clínico de la Nanomedicina, la primera fue el concepto de
"PEGilación", que se refiere al conjugado polietilen-glicol fármaco o
nanoacarreador de fármacos; el segundo es el concepto de "objetivo
focalizado" del nanoacarreador o transportador de fármacos, mediante la
conjugación de la membrana celular con anticuerpos del receptor, péptidos o
pequeños ligandos unidos al soporte polimérico. El tercero fue el
descubrimiento de la "permeabilidad mejorada y el efecto de retención (EPR) "
por Hiroshi Maeda en Kumamoto, Japón, según el cual los nanoacarreadores
38
se internan dentro de tumores sólidos debido a la vasculatura del tumor. Esto
se denominó vectorización “pasiva” en contraste con un enfoque activo [38].
La encapsulación de fármacos en nanovehículos tiene dos propósitos: proteger
al cuerpo contra la toxicidad del fármaco, y proteger al fármaco contra el
sistema de defensa del organimso. Otro beneficio de los nanovehículos es su
perfil farmacocinético mejorado en comparación con la administración de
fármacos con sistemas convencionales. Los fármacos provenientes de formas
farmacéuticas convencionales se distribuyen uniformemente a lo largo el
cuerpo, resultando en un gran volumen de distribución (Vd). Este perfil de
distribución requiere el uso de altas dosis del fármaco [39].
El uso de nanovehículos (“nanocarriers” o nano acarreadores de fármacos)
podría proporcionar oportunidades casi ilimitadas en el desarrollo de sistemas
de liberación de fármacos altamente especializados y eficientes. Tales
sistemas multifuncionales de entrega de fármacos permiten la interacción
coordinada con el individuo para permitir el suministro de agentes
farmacológicos en un lugar, un espacio de tiempo y con un patrón de liberación
requerido. Aunque este enfoque ha emergido recientemente, muestra un futuro
prometedor. Actualmente se utilizan nanovehículos farmacéuticos tales como
liposomas, micelas, nanoemulsiones, nanopartículas poliméricas y muchos
otros, los cuales muestran una amplia variedad de propiedades útiles, tales
como el aumento en el tiempo de residencia en la sangre, lo que permite su
acumulación en áreas patológicas con vasculatura comprometida; vectorización
específica a ciertos sitios de la enfermedad debido a varios ligandos unidos a la
superficie de los nanovehículos; penetración intracelular mejorada con la ayuda
de diversas moléculas unidas a su superficie; propiedades de contraste debido
a la carga del soporte con diversos materiales de contraste que permiten la
visualización directa en el paciente; estímulos-sensibilidad que permite la
liberación del fármaco bajo ciertas condiciones fisiológicas u otros
factores[40,41].
39
2.2 Tipos de nanoacarreadores de interés tópico y/o transdérmico.
Las nanopartículas y nanoacarreadores de interés farmacéutico pueden
clasificarse de una forma amplia como poliméricas (sintéticas y naturales),
inorgánicas, nanopartículas lipídicas sólidas y otras más. Una característica
común de las nanopartículas es su comportamiento coloidal en fluidos
biológicos y no biológicos; su tamaño suele ser no mayor a los 500 nm, y en
ellas los agentes terapéuticos de distinto origen (de síntesis química, extracción
natural o de biotecnología), pueden estar atrapados (matrices), encapsulados o
químicamente ligados a su superficie. Los nanoacarreadores se caracterizan
por su alta estabilidad y su capacidad de incorporar un amplio espectro de
fármacos, y de modificar la farmacocinética del principio activo, que permite
prolongar, controlar o vectorizar su entrega [42].
Debido a la amplia variedad de sistemas nanotransportadores que existen para
los fármacos, a continuación sólo se hará mención de algunos que se
relacionan con los sistemas y objetivos del presente trabajo de investigación.
2.2.1 Nanopartículas poliméricas
Las nanopartículas poliméricas se formulan usando ya sea polímeros
naturales o sintéticos con un alto nivel de biocompatibilidad para reducir la
citotoxicidad y maximizar la compatibilidad con los tejidos. El únicos polímeros
sintéticos que han sido aprobados por la FDA de Estados Unidos para el uso
humano son: poli-D, L- ácido láctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), poli (ácido
láctico-co- ácido glicólico) (PLGA), poli-e-caprolactona (PCL), y poli (metil
metacrilato) (PMMA) [43].
Las nanopartículas poliméricas, se preparan principalmente mediante el uso de
emulsiones o procesos de precipitación. Su tamaño depende del método de
fabricación y van desde 10 a hasta varios cientos de nanómetros. El
constituyente polimérico de estas nanopartículas no son necesariamente
anfifílicos como en las micelas, y por lo tanto la formación de estas
nanopartículas no es causado por auto-ensamblaje, pero requiere un proceso
activo para su formación. Las moléculas de un fármaco son atrapadas ya sea
físicamente o químicamente en el núcleo hidrófobo de estas nanopartículas. La
40
naturaleza sólida de las nanopartículas poliméricas, les confieren gran
estabilidad y permite la liberación controlada de los fármacos; que puede ser
por difusión o a través de la degradación de la matriz polimérica. Además,
pueden incluirse en estos nanovehículos elementos sensibles a determinados
estímulos y así controlar el tiempo y lugar de la liberación del fármaco. La
liberación desde estos nanocarriers es activada por una señal externa o por
cambios en el microentorno local de dentro del cuerpo [44,45,46].
2.2.2 Nanopartículas inorgánicas
Las nanopartículas inorgánicas son mucho menores que las nanopartículas
poliméricas con tamaños comúnmente menores de 20 nm. Éstas se preparan a
través de la modificación de la superficie de óxidos inorgánicos, y estas
modificaciones son importantes para proporcionar diversidad en el tamaño,
forma, solubilidad, estabilidad a largo plazo, y la fijación selectiva de grupos
funcionales [47]. El concepto de la utilización de nanopartículas de oro
multivalentes para inhibir la fusión del VIH se introdujo por primera vez hace
varios años. En 2008 se emplearon partículas de oro modificadas con ácido
mercaptobenzoico como un sistema a escala nanométrica para la elaboración
de una terapia multivalente. Después de la conjugación de estas
nanopartículas con SDC- 1721 (un fragmento del potente inhibidor del VIH
TAK-779), la fusión del VIH se inhibió de manera significativa, mientras que la l
SCC-1721 no incorporada en nanopartículas no mostró efecto inhibidor. Otra
estrategia basada en el uso de nanopartículas de plata como candidatos a
antivirales ha sido propuesta recientemente [48].
2.2.3 Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS)
Entre las nanopartículas que se han estudiado con potencial de ser
consideradas como vehículos para mejorar la administración de fármacos por
vía tópica se encuentras las NLS [49]. Éstas suelen ser partículas esféricas de
talla nanométrica, elaboradas a partir de lípidos sólidos y emulsionantes. Entre
sus numerosas posibilidades de uso y ventajas, se incluye la posibilidad de
modificar la liberación de los fármacos contenidos en ellas (sostenida /
controlada), así como la vectorización de éstos y un aumento en la estabilidad
41
del fármaco. También poseen la capacidad de incorporar una amplia variedad
de principios activos y poseen amplia biocompatibilidad [50].
Las NLS se pueden fabricar a escala comercial con mayor facilidad que los
liposomas; así por ejemplo, las NSL portadoras de polilisina-heparina han sido
evaluadas para la liberación del antibiótico hidrófobo Tenofovir en la mucosa
vaginal. Estas NSL resultaron ser no citotóxicas para células vaginales durante
48 h y fueron capaces de mejorar la captación celular del antibiótico hidrófobo
[51,52,53].
2.2.4 Complejos nanométricos de ciclodextrinas
Para la farmacoterapéutica antimicrobiana de las mucosas, la formación de
complejos con ciclodextrinas se ha propuesto como un medio para aumentar la
biodisponibilidad del principio activo a través de la inclusión de fármacos poco
solubles en complejos de ciclodextrina [54]. La incorporación de clotrimazol en
un complejo con b-ciclodextrina en un gel vaginal mucoadhesivo, termosensible
compuesto de Pluronic® F127, Carbopol® 934, e hidroetilcelulosa, dieron como
resultado la liberación controlada del fármaco incorporado, mostrando actividad
antimicótica durante un período de tiempo más largo [55]. También se evaluó
una formulación de itraconazol incorporado en hidroxipropil-b-ciclodextrina que
mejoró considerablemente la solubilidad de los fármacos, generando un
sistema mucoadhesivo en presencia de otros ingredientes. La formulación de
una crema vaginal a base de ciclodextrina e itraconazol resultó ser segura y
bien tolerada, y retenida en la cavidad vaginal durante un largo período de
tiempo.
El aumento en la solubilidad de la anfotericina B se confirmó después de su
inclusión en complejos de hidroxipropil-c-ciclodextrina, mientras que la
termosensibilidad y dependencia del pH de la formulación del gel aseguró la
liberación constante del fármaco en el entorno ácido. Las ciclodextrinas
también se estudiaron como nanovehículos para incorporar agentes anti-VIH
como el UC781, un antiviral muy potente con escasa solubilidad en agua, el
cual al incorporarse en diferentes ciclodextrinas, mejoró su potencia inhibitoria
antiviral [56,57].
42
2.2.5 Niosomas
Los niosomas son vesículas no fosfolípidicas, hechas con compuestos
tensoactivos no iónicos tales como mono y dialquil éteres de poliglicerilo o
polioxietilen-glicoles. Su morfología es similar a la de los liposomas, pero sus
estructuras son distintas. También han sido investigados como vehículos para
la administración sostenida y selectiva de fármacos por vía tópica. Así, la
incorporación de clotrimazol en un gel niosomal ha mostrado una liberación
prolongada del fármaco y una actividad antifúngica adecuada. Además, los
niosomas han demostrado ser nanoacarreadores prometedores para la
aplicación tópica del tenofovir disoproxil fumarato contra el VIH; en este sentido
se ha observado la liberación prolongada del fármaco desde niosomas
incorporados en un gel, y no hay signos de irritación de la mucosa vaginal de
ratas [58,59,60].
2.2.6 Nanoemulsiones
La estabilidad a largo plazo, facilidad de preparación y alta solubilización de
fármacos hacen de las nanoemulsiones un vehículo atractivo para la liberación
mejorada de fármacos lipófilos [61]. Aunque a menudo se describen como
microemulsiones en la literatura, parece más apropiado referirse a estos
sistemas como nanoemulsiones porque el tamaño de partícula es típicamente
menor a 200 nm. Varios estudios han evaluado las características de
nanoemulsiones destinadas al transporte de agentes antimicrobianos. La
naturaleza líquida indeseable de la formulación ha sido superada por la adición
de diferentes polímeros y agentes gelificantes. El resultante gel-microemulsión
(GM) se ha estudiado en el contexto de la entrega de anticonceptivos [62]. Las
nanoemulsiones han demostrado ser más eficaces que el gel disponible en el
mercado de nonoxinol-9. Además, la aplicación intravaginal repetida de GMs
con espermicidas ha demostrado ser segura y no causar ninguna toxicidad
local, sistémica o reproductiva. Por otra parte, la actividad antifúngica y la
retención en el moco vaginal de una formulación en nanoemulsión demostró
tener un desempeño superior a un producto comercial que contiene clotrimazol
[63,64].
43
2.2.7 Dendrímeros
Los dendrímeros son una otra clase de nanoestructuras híperamificadas
construidas mediante la adición gradual y repetida de subunidades o
ramificados a un núcleo reactivo [65]. Los dendrímeros pueden ser de tres
tipos: (i) superficie multicapas, (ii) capa que rodea un núcleo, y (iii) un núcleo al
que se adhieren las dendritas [66]. Sus propiedades dependen principalmente
de los grupos funcionales presentar en las superficies. A pesar de la cuidadosa
selección de funcional grupos, es posible desarrollar una amplia variedad de
estructuras hechas a medida con amplio potencial de servir como nuevos
nanoacarreadores farmacéuticos. Una de las líneas más prometedoras de
investigación con dendrímeros es su potencial como transportadores de
antibióticos. La mayoría de las estructuras de dendrímeros se basan en poli
(amidoamina, PAMAM) o poli (propilen-imina, PPI) [67].
Están disponibles datos muy limitados sobre el uso de dendrímeros en el
tratamiento de candidiasis. Algunos ensayos encontraron que la actividad
antifúngica de macromoléculas dendríticas solubles en agua cargadas con
nistatina, KTZ o clotrimazol en ensayos in vitro, son igual o comparativamente
más potentes. La inclusión de lípidos en los dendrímeros, dando origen a
lipopéptidos dendriméricos, resultó en un aumento de la actividad antifúngica,
expresado de una manera multimodal y dosis dependiente [68,69].
2.2.8 Liposomas
Los liposomas son estructuras esféricas y cerradas, compuestas de una o
varias bicapas lipídicas concéntricas que rodean un núcleo acuoso. La primera
observación de que los fosfolípidos en sistemas acuosos pueden formar
estructuras bicapa cerradas fue descrita en 1965. Dependiendo de la estructura
de la membrana se dividen en unilamelares o liposomas multilamelares. La
distribución de tamaño de partícula, número de laminillas y las fases acuosas
interiores / exteriores, son propiedades que dictan sus características de
estabilidad y de interacción [70].
Los liposomas pueden transportar fármacos hidrófilos en su núcleo acuoso o
fármacos hidrófobos dentro de la membrana lipídica. Los nanoliposomas son
44
los nanoacarreadores más antiguos con respecto a su uso clínico. Un ejemplo
es el Doxil® o doxorubicina liposomal inyectable, aprobada en los EE.UU. en
1995 contra sarcoma de Kaposi refractario. [70].
Los liposomas se han estudiado durante más de 40 años en muchas terapias
diferentes, debido a su capacidad para transportar una amplia variedad de
fármacos, así como por su versatilidad estructural y su compatibilidad
fisiológica [71]. La modificación de su superficie con polietilenglicol (PEG) u
otros polímeros les proporciona propiedades de ocultamiento o de circulación
largas. El potencial de los liposomas en el tratamiento tópico de la vaginitis fue
reportado originalmente en 1999 [72].
Los tres fármacos comúnmente usados en el tratamiento de infecciones
vaginales (clotrimazol, metronidazol, y cloranfenicol) se incorporaron en
liposomas convencionales de lecitina y se probó la estabilidad in vitro a los
valores de pH vaginales correspondientes a las etapas de la pre y post
menopausia, así como para la estabilidad in situ en presencia de mucosa
vaginal de vaca [73,74].
En dicho estudio, para mejorar la estabilidad liposomal y la aplicabilidad
general de la formulación, los liposomas fueron incorporados en hidrogeles de
Carbopol® bioadhesivos. En cuanto a la liberación in vitro, los estudios
realizados en un simulador de fluido vaginal mostraron un patrón de liberación
prolongada de los tres fármacos a partir de su respectivo hidrogel con
liposomas. La liberación sostenida de clotrimazol de liposomas destinados a la
terapia vaginal fue publicada en 2005 [73,74]. Por otra parte, el mismo grupo de
investigación confirmó la actividad antifúngica del nanosistema como
adecuada, así como la ausencia de cambios visibles en la morfología de los
tejidos expuestos. Otro de los estos enfoques para mejorar la capacidad de los
liposomas de penetrar a través de la mucosa ha sido el desarrollar liposomas
deformables (elásticos). Las vesículas elásticas son conocidas por penetrar
más profundo en la piel que los liposomas convencionales [75,76].
45
3. Cristales líquidos liotrópicos
Entre los sistemas coloidales de interés farmacéutico también destacan por su
estado mesofásico, las dispersiones de cristales líquidos, las cuales pueden ser
consideradas como nanoemulsiones (dispersiones de líquido en líquido) o
como suspensiones (dispersiones de sólido en líquido), ya que la fase dispersa
y la dispersante resultan en un fluido ordenado y nanoestructurado. Las
dispersiones de cristales líquidos son cruciales en muchos procesos,
fenómenos y productos tales como la recuperación mejorada de petróleo,
fabricación de jabones y detergentes, en la estabilización de emulsiones,
cosméticos y formas farmacéuticas [77].
Los cristales líquidos (CL) constituyen un cuarto estado de agregación de la
materia (mesofase o fase intermedia), que comparten con los líquidos su
fluidez y con los sólidos cristalinos el orden de largo alcance. Por su origen u
obtención, los CL se clasifican en termotrópicos y liotrópicos. Estos últimos se
encuentran en formulaciones farmacéuticas y cosméticas, así como en los
sistemas biológicos [78].
Las primeras observaciones de un CL fueron realizadas hace más de un siglo
por el botánico y químico austriaco Friedrich Reinitzer estudiando sustancias
derivadas del colesterol. Desde entonces, los cristales líquidos son materia de
innumerables trabajos tanto teóricos como experimentales, debido a que son
materiales extremadamente interesantes por sus aplicaciones tecnológicas,
ópticas y biológicas. Dependiendo de la estructura molecular, estos
compuestos pasan a través de distintas fases antes de llegar al estado de
líquido isotrópico.
Los CL termotrópicos están constituidos por moléculas anisotrópicas, las
cuales se organizan en diferentes configuraciones dependiendo de la presión y
principalmente de la temperatura. Por otro lado, los CL liotrópicos son formados
por mezclas de moléculas anfifílicas (moléculas con una parte hidrofóbica y
otra hidrofíca) y un disolvente, el cual es generalmente agua. Las unidades
básicas de estos últimos son las micelas, cuyas estructuras son esferas,
46
bastones o discos. Las fases que los constituyen dependen de la presión, pero
principalmente de la temperatura y de la concentración de las sustancias que
los componen [79].
Los cristales líquidos liotrópicos (CLL) se presentan en un cierto rango de
temperatura cuando algunas sustancias se dispersan en un líquido. Para una
temperatura fija, este tipo de CL aparece en un intervalo de concentración. El
nombre deriva del latín lyo, que significa desleír. Los sistemas liotrópicos más
comunes están constituidos por dispersiones de tensoactivos en agua.
Los tensoactivos en disoluciones acuosas pueden formar disoluciones
micelares y estructuras líquido-cristalinas liotrópicas resultantes de las
interacciones existentes entre las unidades estructurales o agregados
micelares que existen en su seno. El conocimiento de las estructuras y el
comportamiento reológico de dichas fases micelares y liotrópicas es muy
importante, tanto desde el punto de vista fundamental como del aplicado,
debido a su amplio grado de utilidad en diversos sectores de la industria [80].
También pueden formar parte de las fases liotrópicas otras sustancias
anfifílicas, tales como alcoholes y ácidos grasos, aminas y esteroles, cuyas
moléculas se mantienen unidas a las del tensoactivo por fuerzas
intermoleculares de van der Waals y uniones por puente de hidrógeno. Este
tipo de fases líquido cristalinas aparece en sistemas biológicos, en los que las
sustancias dispersas son fosfolípidos, colesterol y sales biliares [81].
Debido a sus altas viscosidades y capacidad para disolver tanto fármacos
hidrosolubles como liposolubles, los (CLL) resultan adecuados como sistemas
de liberación sostenida de principios activos. Las sustancias liposolubles se
alojan entre las cadenas hidrocarbonadas y las hidrosolubles en la zona polar.
Los copolímeros en bloques de poli(óxido de etileno) y poli(óxido de propileno)
son utilizados también en estas estructuras como sistemas de liberación
controlada. Uno de los copolímeros usados con este fin es el Poloxámero 407,
que tiene una fórmula media: OE100OP70OE100, donde OE y OP significan,
respectivamente, una unidad de óxido de etileno y de óxido de propileno.
47
A temperatura ambiente, los sistemas formados por Poloxámero 407 y agua
presentan dos fases líquido-cristalinas liotrópicas: la cúbica micelar normal (18
a 64 % de copolímero) y la hexagonal normal (66 a 75 % de copolímero). Otro
tensoactivo no iónico usado en estos sistemas de liberación controlada es el
alcohol oleílico con 10 moles de óxido de etileno (Oleth-10)4. Los sistemas
formados por este tensoactivo y agua presentan las fases liotrópicas hexagonal
normal (33 a 63 % de tensoactivo) y laminar (67 a 83 % de tensoactivo) [82].
En 2012, en un trabajo conjunto entre el Laboratorio de Farmacia Molecular y
Liberación Controlada del Departamento de Sistemas Biológicos de la UAM-
Xochimilco y laboratorios de investigación de los Departamentos de Ciencias
Naturales y de Procesos y Tecnología de la UAM-Cuajimalpa, se estudiaron
diferentes formulaciones de tensoactivos y agua para obtener CLL empleando
sonicación; estos sistemas dispersos se caracterizaron por técnicas
instrumentales para conocer su estructuración. Uno de los sistemas que
resultó de interés, mostró una configuración hexagonal, tal como se ve en la
imagen 1 obtenida por MET [83]. A estas estructuras se les incorporó KTZ
como principio activo poco soluble, pero posteriores ensayos sobre el sistema
demostraron una estabilidad limitada.
Imagen 1. Microfotografías de CLL
Fotografías obtenidas por MET, se utilizó mediode contraste. Se aprecian estructuras hexagonales que forman los cristales líquidos liotrópicos [80].
48
Los problemas de coalescencia de los CLL hexosómicos con KTZ se redujeron
con el uso de un agente estabilizante, como lo demostró un trabajo realizado
en 2013 en el citado laboratorio [84]. Así, con el uso de un diseño de
experimentos Simplex de tres componentes, se determinó la proporción de
tres sustancias tensoactivas con las que se logra obtener sistemas
nanoestructurados líquido cristalinos de mayor estabilidad, así como el límite
de carga de KTZ en CLL. La máxima cantidad de Ketoconazol que se puede
incorporar en el sistema líquido cristalino liotrópico (CLL-KTZ) es de 150 mg/ 50
g de formulación.
Con esta base, se propuso dar continuidad al estudio de dicho sistema CLL-
KTZ, evaluando su potencial actividad antimicótica frente a Candida albicans,
comparándola a su vez contra muestras comerciales de carga equivalente de
principio activo.
49
Planteamiento
del problema
50
Ante el constante aumento de las micosis cutáneas en el humano, así como el
alto costo de investigación de nuevos fármacos antifúngicos, una estrategia
alterna es el empleo de antimicóticos genéricos como el KTZ en forma de
nuevos sistemas de entrega de fármacos cuya consigna es incrementar su
eficacia terapéutica, reducir los efectos adversos derivados de su
administración sistémica y la dosis requerida para obtener el efecto en piel,
uñas y mucosas. Una manera de conseguir lo anterior es incrementando la
permeabilidad en piel de dicho activo y los sistemas nanométricos son una
alternativa.
Una de las nuevas opciones nanotecnológicas para sistemas tópicos y
transdérmicos de liberación de fármacos la constituyen los sistemas líquido
cristalinos, en particular los CL hexosómicos y cubosómicos, por su similitud en
composición y estructura con las membranas biológicas y de componentes de
los estratos de la piel.
Para el caso específico del KTZ y el interés en optimizar su actividad
antimicótica en piel y uñas, mediante la incorporación de KTZ en un NSLCL, se
requiere de una primera demostración de que con éste se obtiene una CMI
sobre un microorganismo causante de la patología, que sea menor que
cualquier otro producto comercializado a la fecha.
51
Hipótesis y
Objetivos
52
Hipótesis
El KTZ incorporado en un NSLCL aumenta su potencia antimicótica en cultivos
de C. albicans, comparado con el KTZ en solución o en base lipófila.
Objetivo general
Determinar la actividad antimicótica del KTZ contenido en cristales líquidos
liotrópicos para Candida albicans, en un modelo in vitro, determinando la
concentración mínima inhibitoria y compararla con dos formulaciones: en
solución y en base lipófila.
Objetivos particulares
1. Reproducir y caracterizar un sistema líquido cristalino conteniendo KTZ.
2. Evaluar el efecto antimicótico del KTZ incorporado en un NSLCL y
compararlo vs KTZ en solución y en base lipófila.
3. Desarrollar un método de cuantificación de levaduras por turbimetría
mediante el uso del nefelómetro de McFarland.
4. Determinar con el método de microdilución en caldo, la CMI en Candida
albicans del NSLCL conteniendo KTZ y compararla con la CMI de KTZ en
solución.
5. Comparar el efecto inhibitorio del KTZ incorporado en NSLCL con el de
formas farmacéuticas comerciales.
6. Determinar con MET el efecto del NSLCL +KTZ sobre la morfología de las
levaduras de C. albicans.
53
Metodología
54
1. Reproducción y caracterización de un NSLCL conteniendo Ketoconazol.
1.1 Reproducción del NSLCL.
Para reproducir el NSLCL se utilizaron 0.8833 g de monooleato de glicerilo,
0.8833g de Poloxamero (407), 0.8833g de Propilenglicol monolaureato, 47.35 g
de agua y diferentes cantidades de KTZ. Para obtener un lote de 50 g. La tabla
3 muestra las proporciones utilizadas para elaborar los 8 lotes o muestras que
se estudiaron. Se puede ver que el KTZ varía en un rango de 0 a 3 mg de
KTZ /ml.
Tabla 3. Número de muestras y concentración de Ketoconazol.
Lote Masa de KTZ
g
Poloxámero
g
Monooleato
g
Monolaureato
g
[KTZ]
mg/g
NS1 150 0.8833 0.8833 0.8833 3
NS2 150 0.8833 0.8833 0.8833 3
NS3 150 0.8833 0.8833 0.8833 3
NS4 0 0.8833 0.8833 0.8833 0
NS5 0 0.8833 0.8833 0.8833 0
NS6 50 0.8833 0.8833 0.8833 1
NS7 100 0.8833 0.8833 0.8833 2
NS8 150 0.8833 0.8833 0.8833 3
Se muestran las ocho formulaciones que se estudiaron con la cantidad de Ketoconazol incorporado en el nanosistema líquido cristalino liotrópico. Todos los demás componentes permanecen constantes. No se muestra la masa de agua, por ser constante (47.35 g).
Para elaborar las formulaciones, se pesó cada componente, los tres
tensoactivos se calentaron juntos a 55°C, el agua se calentó a 60°C, y una
vez alcanzada esta temperatura, se mezclan. (El KTZ se disolvió en la mezcla
de tensoactivos). La mezcla de tensoactivos y KTZ se incorporan al agua
caliente mantenida en agitación. Una vez mezclados se lleva a cabo la
55
sonicación (8 minutos a una amplitud del 70%). Terminado el tiempo de
sonicación, cada formulación se sometió a diálisis (en membranas “Spectra 6”
MWCO 1000) por cuarenta y ocho horas, utilizando como medio de diálisis
metanol al 20%. Las membranas de diálisis fueron preparadas según las
especificaciones del fabricante. Terminado el tiempo de diálisis, la formulación
se esterilizó por medio de filtración con la ayuda de filtros Millipore® con poro
de 0.22 μm. Todos los materiales que se utilizaron fueron esterilizados antes de
usarse.
1.2 Determinación del tamaño de partícula.
Es una de las características más importantes de un sistema nanométrico. El
tamaño medio y la distribución de tamaño de partícula se determinaron
utilizando un analizador de partícula marca HORIBA analyzer LA-950, se
colocaron 10 ml de muestra en la celda del equipo y se realizó la lectura. El
equipo genera un reporte como el de la imagen 2, en el cual se pueden leer la
distribución del tamaño en un histograma, así como la media la moda y otros
datos de interés de cada formulación analizada.
1.3 Microscopía electrónica de transmisión
1.3.1Análisis elemental.
Las muestras se analizaron en un microscopio electrónico de transmisión
acoplado a espectrómetro de masas. Se utilizó el espectrómetro de masas para
realizar un análisis elemental de las muestras y verificar que el KTZ
incorporado en el nanosistema se encuentre presente. Para lograrlo se siguió
el Si contenido en el KTZ, por ser un átomo más grande que los componentes
del KTZ. Se utilizó un portaobjetos criogénico, las muestras se congelaron y se
cortaron con un ultramicrotomo de congelación
56
Imagen 2. Reporte de análisis de tamaño de partícula DLS
Reporte del análisis de tamaño de partícula por difracción de luz láser. La sección A muestra las medidas de tendencia central. La sección B la polidispersión y la sección C la tabla de la dispersión de tamaños de partícula
A
B
C
57
para obtener secciones muy delgadas. La microscopia electrónica de alta
resolución se realizó en el microscopio electrónico de emisión de campo JEOL
2100F operado a 200kV de el Laboratorio de Microscopia Electrónica del
Laboratorio Central del la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad
Iztapalapa.
1.3.2 Morfología.
Para observar la morfología del NSLCL se utilizó la técnica de contraste con
acetato de uranilo al 1% en agua [86] Se depositó con micropipeta una gota de
muestra sobre un soporte de carbono, se dejó reposar por un minuto, se
eliminó el exceso de muestra con papel secante, se cubre con una gota de
solución de acetato de uranilo al 1%. Se dejó secar por un minuto y el exceso
se elimina con papel secante y se dejó secar un minuto más, se colocó en la
bayoneta de MET, se armó el equipo, y se generó vacío. Se observó la muestra
con sistema óptico para seleccionar la sección a analizar. Con este proceso se
analizaron las diferentes muestras NSLCL.
2. Evaluación del efecto antimicótico del KTZ incorporado en un NSLCL y
comparación contra KTZ en solución y en base lipófila.
Inoculo
Para todos los ensayos en donde se utilizó inoculo, éste se preparo de la
siguiente manera: se preparó 100 ml de medio de cultivo caldo Dextrosa SB
marca Bioxon® según las instrucciones del fabricante. En ambiente estéril, con
una asa microbiológica, se tomó una muestra de una cepa de Candida albicans
ATCC 10231 cultivada en agar Dextrosa SB, se inoculó el medio de cultivo y se
incubó durante 36 h a 37°C, me midió su densidad óptica en un
espectrofotómetro en celda de cuarzo a una longitud de onda de 450 nm para
determinar la concentración de levaduras.
58
2.1 Sensibilidad de la cepa C albicans ATCC10231 al Ketoconazol.
Para evaluar la sensibilidad de la cepa de referencia se utilizó la técnica
Kirby-Bauer. Se utilizó como referencia discos comerciales de la marca Bio-
rad® de 50 μg de Ketoconazol. Se sembró en superficie 0.5 ml del cultivo de
Candida albicans, y se extendió con una varilla de vidrio en placas de agar
dextrosa Sabouraud. Se colocaron los discos de referencia y se incubaron a
37°C por 24 h. se midieron los halos de inhibición del crecimiento de la
levadura con al ayuda de un vernier.
2.2 Determinación de la CMI de Ketoconazola en solución.
Se utilizó la técnica Kirby-Bauer, utilizándose discos de 0.5 cm de diámetro
hechos de papel Whatman (41) impregnados con solución de KTZ. Las
concentraciones estudiadas fueron 50, 100, 250, 500, 1500 y 2000 µg/ml. El
KTZ se disolvió en metanol al 80%. Se inocularon placas de agar Dextrosa SB
las cuales fueron inoculadas mediante la técnica de siembra en superficie, se
colocaron los discos cargados con 300 microlitros de la solución de KTZ. Se
incubaron por 24 h a 37°C y se midieron los halos de inhibición del crecimiento
de la levadura.
2.3 Determinación de la CMI por vaciado en placa de Ketoconazol en
solución.
Para el ensayo se prepararon medios de cultivo agar dextrosa Sabouraud en
los cuales de agregó KTZ disuelto en metanol al 80%, se vació el medio con
KTZ en cajas de Petri, se dejaron solidificar y se inocularon por extensión en
superficie con suspensión de levaduras de C. albicans, se incubaron a 37°C
por 24 horas, se observó en crecimiento microbiano. Las concentraciones
analizadas se muestran en la tabla 4, en donde se indica la concentración final
de KTZ en el medio de cultivo.
59
Tabla 4. Concentraciones de Ketoconazola en agar dextrosa Sabouraud
Concentración de
KTZ en el medio
µg/ml
Concentración de
KTZ en el medio
µg/ml
Concentración de
KTZ en el medio
µg/ml
Concentración de
KTZ en el medio
µg/ml
0 70 350 900
5 80 400 1000
10 90 450 1500
20 100 500 2000
30 150 550 2500
40 200 600 3000
50 250 700 3500
60 300 800 -------- Concentraciones de KTZ
a en Agar dextrosa Sabouraud, el fármaco se disolvió previamente en metanol al
80%.
2.4 Determinación de la CMI Ketoconazol en base lipófila y NSLCL.
Para determinar la CMI del KTZ incorporado en el NSLCL se utilizaron las
técnicas de Kirby-Bauer y la de cilindro placa. Para realizar la primera se
inocularon por extensión placas de agar SB con levaduras de C. albicans y se
impregnaron con 300 µl de cada una de las ocho muestras de cristales líquidos
en discos de papel Whatman #1 de 0,5 cm de diámetros, se colocaron en la
superficie de la placa, se colocaron discos de referencia marca Bio-Rad® de
50 µg de KTZ. Se incubaron a 37°C por 36 horas y se midieron los halos en
donde no hay crecimiento microbiano.
La técnica de cilindro/placa se utilizó para determinar la CMI del KTZ disuelto
en una base lipófila (laureato) y en el NSLCL. Para lo cual se inocularon placas
de agar SB con levaduras disueltas en el medio de cultivo, se les perforaron
pozos, en cada pozo se colocaron 300 µl de muestra, se incubaron por 36
horas a 37°C, y se midieron los halos de inhibición del crecimiento. En la tabla
5 se muestran los diferentes porcentajes de agar en el medio de cultivo y las
concentraciones de KTZ en las diferentes muestras, se disminuyó el porcentaje
60
de agar en el medio de cultivo SB con la finalidad de disminuir los problemas
de difusión del KTZ.
Tabla 5. Porcentaje de agar en el medio de cultivo
% de agar en el medio
Base lipófila
NSLCL
Concentración KTZa
µg/ml
Concentración KTZa
µg/ml
1.5 20 1
30 2
40 3
1.3 20 1
30 2
40 3
1.2 20 1
30 2
40 3
Se probaron tres diferentes porcentajes de agar en el medio de cultivo SB con la finalidad de reducir la resistencia a difundir de las muestras. Ambos sistemas se probaron colocando 300 µl en cada pozo.
3 Desarrollo del método de cuantificación de levaduras por turbimetría mediante la adaptación del nefelómetro de McFarland.
Se prepararon los nueve tubos del nefelómetro de McFarland, con cloruro de
bario al 1%, y cantidades crecientes de ácido sulfúrico al 1%, para formar
precipitados de sulfato de Bario.
Se inoculó un cultivo de 500 ml de en caldo SB, con levaduras de C. albicans,
se incubó por 48 horas a 37°C. La suspensión de levaduras se centrifugó a
7000 rpm por 60 minutos. Se desechó el sobrenadante, las levaduras fueron
61
resuspendidas en solución salina estéril para obtener una suspensión muy
concentrada de levaduras. Se añadieron alícuotas de la suspensión de
levaduras a tubos con solución salina hasta que se logró igualar la densidad
óptica de cada uno de los tubos del nefelómetro con levaduras de C. albicans,
la densidad óptica se midió a 540 nm. A cada uno de los nueve tubos con
levaduras se les realizaron cuatro diluciones sucesivas (10°, 10¹, 10², 10³, 104),
se tomaron 500 μl de cada dilución de cada tubo, y se inocularon por triplicado
placas de agar SB. Se incubaron por 36 horas a 37°C. Se realizó el conteo en
placa. La figura 4 muestra este proceso. Se determinó la relación entre
densidad óptica y concentración de levaduras, se elaboró la curva patrón de
concentraciones de levaduras.
Figura 4. Diagrama de flujo de la elaboración de curva patrón con nefelómetro McFarland.
Se utilizó el fundamento de la nefelometría para realizar una curva patrón de concentración de levaduras de Candida albicans ATCC 10231. La cuenta estándar o conteo en placa se realizó por triplicado.
62
4. Determinación mediante el método de microdilución en caldo de la CMI en Candida albicans del NSLCL conteniendo Ketoconazol y comparación contra la CMI de Ketoconazol en solución.
Para determinar la CMI del KTZ incorporado en el NSLCL y la comparación
con el KTZ disuelto en metanol al 80%, se realizaron cinéticas de crecimiento
de C. albicans en medio de cultivo líquido (caldo), se inoculó con 0.5 ml de la
suspensión de levaduras un matraz con 250 ml de caldo Sabouraud al que se
le adicionó Ketoconazol incorporado en NSLCL. En la tabla 6 se muestran las
concentraciones de KTZ analizadas en ambos vehículos. Se incubó a 37°C y
durante cada cuatro horas desde el tiempo cero hasta 130 horas se tomó una
muestra de 2 ml de la suspensión de levaduras, se midió su densidad óptica y
se transformó la absorbancia (abs) medida a UFC/ml utilizando el nefelómetro,
las muestras se leyeron en un espectrofotómetro UV/Vis marca HP a una
longitud de onda de 540 nm.
Tabla 6. Concentraciones de Ketoconazola analizadas en cinéticas decrecimiento.
Ketoconazola en solución μg/ml
Ketoconazola incorporado en SNLCL
μg/ml
0 0
10 4
30 8
40 12
50 24
---- 36
Con las cinéticas de crecimiento de C. albicans se determinó la CMI del KTZ incorporado en NSLCL y
disuelto en metanol al 80%.
63
5. Comparación del efecto inhibitorio del Ketoconazol incorporado en NSLCL con el de formas farmacéuticas comerciales.
5.1 Determinación del efecto antimicótico de formas farmacéuticas
comerciales con Ketoconazol por el método Kirby-Bauer.
Se determinó el efecto antimicótico de dos formas farmacéuticas comerciales
que contienen KTZ; tabletas 200 mg y suspensión oral al 2%. Para lo cual se
extrajo el KTZ de la forma farmacéutica con metanol al 85%.
Se molió en un mortero una tableta de 200 mg, se disolvió en metanol, se filtro
en papel filtro Whatman #1 y se aforó a 100 ml. Se esterilizó por filtración con
filtros Millipore® 0.22 µm. Se inocularon por extensión placas de agar SB, se
colocaron en la superficie de la placa discos de papel Whatman impregnados
con 300 µl de la solución de KTZ. Se incubaron a 37°C por 36 horas. Se
midieron los halos de inhibición.
Para probar la suspensión oral al 2%, se tomó una muestra de 10 ml de
suspensión, se diluyó con 40 ml de metanol al 80%, se agitó por 10 minutos.
Esta mezcla se centrifugó por 30 minutos a 5000 rpm. Se recuperó el
sobrenadante, se filtró y se aforó a 50 ml con metanol al 80%. Se esterilizó la
solución por filtración mediante filtro Millipore® 0.22 µm. Se inocularon por
extensión placas de agar SB con Candida albicans, se colocaron en la
superficie de la placa discos de papel Whatman impregnados con 300 µl de la
solución de KTZ. Se incubaron a 37°C por 36 horas. Se midieron los halos de
inhibición.
5.2 Determinación del efecto antimicótico de formas farmacéuticas
comerciales con Ketoconazol por el método de microdilución en caldo.
Para comparar el efecto inhibitorio o antifúngico del NSLCL con KTZ y
compararlo con formas farmacéuticas comerciales de KTZ, se realizaron
cinéticas de crecimiento de levaduras C. albicans en medio de cultivo líquido
(caldo). Se inoculó con 0.5 ml un matraz con 250 ml de caldo SB al que se le
64
adicionó KTZ disuelto en metanol al 80% previamente extraído de los
excipientes de las formas farmacéuticas: Tabletas Nizoral de 200 mg y
Suspensión Nizoral al 2% , la tabla 7 muestra las concentraciones de KTZ
analizadas en dos formas farmacéuticas. Se incubó a 37°C. Se tomó una
muestra de 2 ml de la suspensión de levaduras, se midió la densidad óptica y
se transformó la absorbancia (abs) medida a concentración de UFC/ml. Las
muestras se leyeron en un espectrofotómetro UV/Vis marca HP a una longitud
de onda de 540 nm. Se muestreó cada cuatro horas y se siguió la cinética
desde el tiempo 0 hasta 130 horas.
Tabla 7. Concentraciones de Ketoconazol c, d
comparadas en cinéticas decrecimiento.
Nizoral Tabletas
μg/ml Nizoral Suspensión
μg/ml
20 20
30 30
40 40
Las cinéticas de crecimiento de C. albicans ayudaron para comparar el efecto antimicótico de las formas farmacéuticas comerciales y el NSLCL contra el crecimiento normal de la levadura en el medio de
cultivo SB. c
tabletas Nizoral de 200mg. d
suspensión oral Nizoral al 2%.
6. Determinación por microscopía electrónica de transmisión el efecto de NSLCL con KTZ sobre la morfología de las levaduras de C. albicans.
Para determinar el efecto que el KTZ incorporado en NSLCL tiene sobre la
morfología de las levaduras de C. albicans. Se inocularon con 0.5 ml de la
suspensión de levaduras reactores de 250 ml de medio de cultivo caldo SB, a
los cuales se le adicionaron diferentes cantidades de KTZ incorporado en
NSLCL, la tabla 8 muestra las concentraciones de KTZ que se prepararon para
ser analizadas en el microscopio electrónico de transmisión. Los reactores
65
inoculados y con NSLCL fueron incubados a 37°C durante 36 h. Terminado el
tiempo de incubación, se separaron las levaduras del medio de cultivo por
centrifugación. Se centrifugó cada muestra a 7000 rpm durante una hora. Se
desechó el sobrenadante, las levaduras se colocaron en viales de vidrio, se
congelaron a -70°C en un ultracongelador REVCO, se liofilizaron hasta
sequedad. Se sellaron los viales para conservar la esterilidad, se enviaron al
laboratorio de microscopia electrónica. Para observar las muestras en el MET,
cada una de las muestras fue molida en un mortero de ágata, se colocaron en
un vial con alcohol isopropílico, se dispersaron sobre una rejilla de cobre
cubierta de carbono (200 mesh). Se observaron en un microscopio electrónico
emisión de campo de alta resolución marca JEOL 2100F a 200 kV.
Tabla 8. Tratamientos para microscopia electrónica de transmisión.
Muestra Tratamiento Concentración
KTZa
μg/ml
Lote NSLCL
N1 Levaduras ------- -----
N2 Levaduras + 1 ml NSLCL 0 NS5
N3 Levaduras + 1 ml NSLCL 4 NS6
N4 Levaduras + 1 ml NSLCL 8 NS7
N5 Levaduras + 1 ml NSLCL 12 NS8
Se muestran los diferentes tratamientos que se les aplicó a los cultivos de C. albicans. Todas las muestras se cultivaron y trataron al mismo tiempo, y bajo las mismas condiciones.
66
Resultados
67
1. Reproducción y caracterización de un sistema líquido cristalino conteniendo Ketoconazol.
1.1 Reproducción del NSLCL.
Utilizando las proporciones de la tabla 3 se elaboraron 8 lotes, los cuales presentaron uniformidad en su aspecto físico, tal como se observa en la imagen 3 en donde no se aprecian diferencias visibles entre los lotes y tampoco se observa la presencia de agregados, así mismo en la imagen 4 se puede observar que no hay precipitados en los matraces con medio de cultivo después de haber agregado diferentes cantidades de NSLCL.
Imagen 3. Lotes de NSLCL en proceso de diálisis.
De izquierda a derecha, lotes N1, N2, N3 en proceso de diálisis, no hay diferencias visibles en su aspecto físico, tampoco se observan sólidos o precipitados.
Las cinéticas de crecimiento de C. albicans pudieron realizarse debido a que
se logró disolver el NSLCL en el medio de cultivo.
Imagen 4. NSLCL cargado con KTZ disuelto en medio de cultivo SB.
Fotografía de medios de cultivo inoculados con C. albicans y con diferentes concentraciones de KTZ incorporado en NSLCL. El principio activo y el Nanoacarreador se disolvieron en el medio sin dificultad (2 ml de NSLCL + KTZ). De izquierda a derecha: lote N6, N8, N7 2 ml en SB.
68
1.2 Determinación del tamaño de partícula.
Usando el equipo HORIBA se determinó el tamaño de partícula de los lotes
elaborados del NSLCL con y sin KTZ incorporado en el. La figura 5 muestra
algunos de los difractogramas obtenidos, los difractogramas completos se
pueden consultar en el anexo 1. En estos difractogramas se pueden leer los
diferentes datos de interés del sistema como el tamaño de partícula y la
polidispersidad del la muestra. Con estos datos se elaboró la tabla 9 que
contiene las medias del tamaño de partícula de los lotes analizados. El
promedio general del tamaño de partícula del NSLCL se determinó en 80 nm.
Tabla 9. Tamaño de partícula NSLCL.
Lote
NSLCL
Ø
nm
NS1 81
NS2 85
NS3 80
NS4 83
NS5 73
NS6 82
NS7 74
NS8 85
80 ± 4
Se muestran los tamaños de partícula de cada lote de NSLCL, y promedio global y la desviación estándar.
69
Figura 5. Difractogramas de NSLCL.
Los difractogramas son la interpretación de los patrones de difracción de un haz de luz láser que pasa a través de una muestra. Los círculos muestran las medidas de tendencia central de los tamaños de partícula. La polidispersidad se representa con el histograma. La polidispersidad es el grado de variación o amplitud de una campana gausiana que representa la distribución de los tamaños de partícula de una muestra. Los difractogramas de las muestras analizadas pueden verse en el anexo.
1.3 Microscopía Electrónica de Transmisión
1.3.1 Análisis elemental
En primer lugar se analizó el KTZ puro, la figura 6 muestra el espectro de
masas del KTZ. Se identificó el pico característico del Silicio, una impureza
presente en la materia prima. La figura 7 es el espectro de masas del lote N1
del NSLCL con KTZ, se determinó que el Silicio se encuentra presente en la
muestra de NSLCL. El análisis elemental muestra que aunque mínima hay
presencia de Silicio dentro de la nanoestructura analizada.
70
Figura 6. Espectro de masas para Ketoconazola
Espectro de masas de Ketoconazol, la flecha marca el pico que muestra la presencia de Silicio
en la muestra.
Figura 7. Espectro de masas del lote N1 de NSLCL
El análisis elemental y el espectro de masas del lote N1 del NSLCL con KTZ, revela la presencia del Silicio perteneciente al KTZl
a La flecha marca el pico del Silicio.
71
1.3.2 Morfología.
La morfología del NSLCL se estudió con MET, la imagen 5 muestra las
estructuras que se forman en el sistema nano estructurado, se pueden ver
formas hexagonales o hexosomas, esta imagen se tomó a 80 kV y fue
contrastada con acetato de uranilo.
Imagen 5. Microfotografía NSLCL/ acetato de uranilo
Microfotografía obtenida por MET, la muestra fue tratada con acetato de uranilo. Acercamiento a 50000
X se puede ver que el sistema nanométrico se organiza en hexosomas. La muestra tiene incorporado
KTZ. La barra marca 55 nm.
La imagen 6 muestra la morfología a 200 kV sin contraste, aunque es un
acercamiento mayor, no se aprecia con claridad la estructura del NSLCL, ya
que la técnica utilizada en este microscopio fue desarrollada para sólidos,
mientras que el sistema analizado es un sistema líquido. La imagen 5 y la
imagen 6 fueron tomadas con microscopios y técnicas diferentes.
72
Imagen 6. Microfotografía MET en portaobjetos criogénico.
Microfotografía obtenida en microscopio electrónico de alta resolución y portaobjetos criogénico, lote N1 aunque el alcance del microscopio supera los 50000 aumentos, la técnica para observar líquidos no esta bien desarrollada. Se aprecia la estructura hexosómica del nano sistema.
2. Evaluación del efecto antimicótico del KTZ incorporado en un NSLCL y comparación contra KTZ en solución y en base lipófila.
2.1. Sensibilidad de la cepa de referencia C. albicans ATCC 10231 al Ketoconazol.
La prueba de sensibilidad al KTZ de la cepa de referencia C albicans
ATCC10231 con sensidiscos marca Bio-Rad® resultó positiva, por lo que en
las placas se pudieron medir halos de inhibición del crecimiento microbiano
como se muestra en la imagen 7. Las medidas de los halos de inhibición
fueron recogidas en la tabla 10.
73
Imagen 7. Fotografía sensibilidad de C albicans ATCC10231 a Ketoconazol
Levaduras crecidas en placas de agar SB, en cada placa se colocaron 2 discos de 50 μg marca Bio-Rad como referencia. Se aprecian los halos de inhibición causado por el antimicótico. La fecha señala un halo de inhibición mientras que el segmento de recta marca el diámetro de un halo de inhibición del crecimiento.
Tabla 10. Prueba de sensibilidad a Ketoconazol.
Muestra Halos de inhibición Ø mm
1 14 2 14.5
Se determinó la sensibilidad de la cepa de C albicans ATCC 10231 a Ketoconazol, se utilizaron discos comerciales de Ketoconazol con 50 μg de Ketoconazol de la marca Bio-Rad.
2.2 Determinación de la CMI del Ketoconazola en solución.
El primer ensayo para determinar la CMI del KTZ con el que se elaboraría el
NSLCL fue el método Kirby-Bauer, la imagen 8 es un ejemplo de los
resultados obtenidos por esta técnica, en este caso muestra las regiones de
nulo crecimiento microbiano (halos de inhibición). Una vez finalizado el tiempo
de incubación de las placas, se midieron los halos de inhibición de cada una de
las concentraciones, se calculó su media aritmética y con estos datos se
elaboró la tabla 11, en donde se resumen los resultados de la prueba, y se
señala como CMI 250 μg/ml.
74
Imagen 8. Resultado del ensayo Kirby-Bauer con
KTZ en solución.
El círculo muestra la zona de inhibición de crecimiento, la línea, el diámetro del halo de inhibición. En este caso se probó una concentración de 2000 μg/ml de KTZ
2.3 Determinación de la CMI por vaciado en placa de Ketoconazol en solución.
Para confirmar o descartar este resultado se procedió a realizar la
determinación de la CMI del KTZ pero ahora con la técnica de vaciado en
placa en donde el KTZ de encuentra disuelto en el agar SB. La imagen 9
muestra algunos resultados del ensayo.
Se observa una inhibición del crecimiento de levaduras de C. albicans hasta
1.5 mg KTZ/ml ya que en concentraciones mayores encontramos precipitación
del fármaco.
Concentración KTZ Diámetro mm (media)
50 μg/ml 0
100 μg/ml 0
250 μg/ml 26
500 μg/ml 30
1500 μg/ml 32
2000 μg/ml 38
Tabla 11. Resumen de resultados ensayo Kirby-Bauer KTZ en solución.
Se muestran las medias de los halos de inhibición de todas las concentraciones analizadas
75
Imagen 9. Ensayo de inhibición por vaciado en placa.
Se muestran algunas concentraciones de KTZ disuelto en el agar. Se observa un nulo crecimiento de levaduras de C. albicans a partir de 1.5 mg KTZ/mL. En concentraciones mayores se observa la precipitación del fármaco. En el anexo 6 se pueden ver más imágenes de este ensayo.
En el ensayo de vaciado en placa, se observó que a altas concentraciones el
KTZ tiende a precipitar, formando cristales, disminuyendo su efecto
antifúngico. La tabla 12 muestra los resultados de las concentraciones
probadas, en este caso no se buscan halos de inhibición, se considera positivo
cuando en la placa no hay crecimiento alguno de levaduras. Con este criterio
se determinó la CMI en 40 μg/ml.
Tabla 12. Resultados del ensayo de inhibición de C albicans en cilindro/placa. Concentración
KZT µg/ml
Crecimiento Concentración KTZ
µg/ml
Crecimiento Concentración KTZ
µg/ml
Crecimiento Concentración KTZ
µg/ml
Crecimiento
3000 - 600 - 200 - 40 -
2500 - 550 - 150 - 30 ++
2000 - 500 - 100 - 20 ++
1500 - 450 - 90 - 10 ++
1000 - 400 - 80 - 5 ++
900 - 350 - 70 - 0 ++
800 - 300 - 60 - --------
700 - 250 - 50 - --------
Se muestran todas las concentraciones de KZT analizadas por vaciado en placa. Se determina que la CMI es de 40 μg/ml. (- ausencia de crecimiento, ++ crecimiento).
76
2.4 Determinación de la CMI del Ketoconazol en base lipófila y NSLCL.
Los resultados del ensayo Kirby-Bauer se resumen en la tabla 13, en donde
se muestra que el NSLCL no difunde en la placa de agar. La imagen 10
muestra las placas de inhibición con disco de referencia marca Bio-Rad®,
mientras que no se presentan halos de inhibición en los discos impregnados
con el NSLCL, por lo cual se realizó la técnica cilindro/placa con reducción
del porcentaje de agar.
Imagen 10. Comparación del efecto inhibitorio del NSLCL y discos de referencia.
Se muestra el halo de inhibición del disco de referencia (50 g/ml Bio-rad) en el círculo, la flecha marca el disco impregnado con NSLCL, no se aprecia halo de inhibición.
77
Tabla 13. Resultados de la prueba Kirby-Bauer de NSLCL. Lote NSLCL Ø
mm
N1 0.0
N2 O.0
N3 0.0
N4 0.0
N5 0.0
N5 0.0
N7 0.0
N8 0.0
Se muestran los resultados del la prueba con KTZ incorporado en NSLCL en sensidiscos, los resultados sugieren que el sistema presenta dificultad para difundir en el agar.
La reducción del porcentaje de agar en el medio de cultivo, tuvo como finalidad
minimizar la dificultad de los sistemas a difundir. La imagen 11 muestra un
ejemplo de los resultados obtenidos con esta técnica, se aprecia el halo de
inhibición que se forma alrededor del pozo en el que se colocó la muestra a
analizar, se mide solo el área de inhibición de crecimiento de levaduras de C.
albicans.
Imagen 11. Ensayo cilindro/placa con agar al 1.2% NSLCL sobre C. albicans.
La imagen muestra los halos de inhibición provocados por NSLCL sobre levaduras de C. albicans, en este caso en una placa de agar SB con solo el 1.2% de agar en la formulación del medio. A) lote NS7 B) lote NS9.
78
En el ensayo cilindro/placa para el KTZ incorporado en NSLCL presenta halos
de inhibición en concentraciones de agar por debajo de 1.3%, y para el KTZ
disuelto en una base líquida lipófila que simula una formulación en crema, se
observa que el KTZ es incapaz de difundir en el agar a pesar de haberse
reducido la concentración de éste en el medio de cultivo. La tabla 14 muestra
los resultados de este ensayo.
Tabla 14. Halos de inhibición del ensayo cilindro/placa base lipófila y NSLCL.
Resultados del ensayo cilindro/placa. En donde se evaluaron diferentes concentraciones de
agar en el medio de cultivo, el Ketoconazol disuelto en la base lipófila no pudo difundir. El
NSLCL mostro un mejor comportamiento en medios con menor cantidad de agar.
3. Desarrollar un método de cuantificación de levaduras por turbimetría mediante el uso del nefelómetro de McFarland.
Se prepararon los nueve tubos del nefelómetro de McFarland. Se inoculó un
cultivo de 500 ml de en caldo SB, con levaduras de C. albicans, una vez
crecida se centrifugó y se resuspendió en solución salina estéril para obtener
una suspensión de levaduras que iguale la densidad óptica de cada uno de los
tubos del nefelómetro leídos a 540 nm. A cada uno de los nueve tubos con
levaduras se le realizaron cuatro diluciones (directo, 10¹, 10², 10³, 104), se
tomaron 500 μl de cada dilución, y se inocularon por triplicado placas de agar
79
SB. Se incubaron durante 36 horas a 37°C. Se realizó el conteo en placa. La
imagen 12 muestra uno de estos conteos.
Imagen 12. Cuenta estándar de levaduras de C. albicans.
Se muestra el conteo de UFC/ml en la dilución 10
-4.
La cuantificación de UFC se muestra en la tabla 15, en donde se puede
observar que el rango de UFC/ml va de 4.6 millones para la densidad óptica
del tubo 1 hasta 51.7 millones para el tubo 9 del nefelómetro, estas
concentraciones contrastan con las reportadas para nefelómetros realizados
con bacterias, pues en éstos las concentraciones sobrepasan los cientos de
millones de bacterias. Por este motivo se elaboró una curva con levaduras de
Candida albicans ATCC 10231 para ser usada como curva patrón e interpolar
los valores de absorbancia de cualquier cultivo en medio líquido.
En la gráfica 1 se muestra la curva patrón de levaduras de C. albicans, se
observa que el coeficiente de correlación (R2 ) tienen un valor de 0.976 por lo
que pude ser usada para los fines que fue desarrollada (determinar la
concentración de UFC/ml).
80
Tabla 15. Nefelómetro con levaduras de C. albicans ATCC10231.
Tubo
#
abs
McFarland
Abs
Levaduras
UFC/ml
(1X106)
1 0.5271 0.5163 4.6
2 0.9040 0.8898 6.7 3 1.0976 1.1219 7.4 4 1.5020 1.4729 10.9 5 1.6953 1.6926 20.5 6 1.9273 1.9239 24.0 7 2.0805 2.0791 34.4
8 2.1764 2.1707 40.6 9 2.2086 2.2505 51.6
Se determinaron las UFC/mL de levaduras a los mismos valores de absorbancia del nefelómetro de McFarland.
Gráfica 1. Curva patrón que relaciona la turbidez (absorción) con las UFC/ml de levaduras de C. albicans ATCC10231.
Gráfica de turbidez (absorción) contra UFC/ml de levaduras, obtenida por cuenta estándar.
81
4. Determinación mediante el método de microdilución en caldo de la CMI en Candida albicans del NSLCL conteniendo Ketoconazol y comparación contra la CMI de Ketoconazol en solución.
En la gráfica 2 se muestra la curva tipo o característica de la cepa ATCC
10231 de C.albicans, la gráfica se elaboró con el programa informático
SPSS®17.
Gráfica 2. Curva de crecimiento de Candida albicans ATCC 10231.
La gráfica muestra el crecimiento de la cepa de referencia. Se graficó UFC/ml contra tiempo en horas.
La curva de crecimiento fue elaborada con la media de cinco cinéticas
diferentes. La tabla 16 muestra los valores de absorbancia y concentración de
UFC/ml. Se siguió las cinéticas durante 120 h con muestreo cada dos horas.
En la tabla 16 se muestran también los valores de concentración de cinéticas
de crecimiento en presencia de diferentes concentraciones de KTZ disuelto en
metanol al 80%.
82
Tabla 16. Tabla de valores de concentración de levaduras en presencia de KTZ.
KTZ 10 μg/ml 20μg/ml 30μg/ml 40μg/ml 50μg/ml
tiempo UFC/ml DE UFC/ml DE UFC/ml DE UFC/ml DE UFC/ml DE
h 10⁶ 10⁶ 10⁶ 10⁶ 10⁶
0 0.03 0.01 0.02 0.00 0.05 0.02 0.05 0.00 0.04 0.00
15 1.62 0.19 0.92 0.20 0.19 0.07 0.06 0.11 0.15 0.00
18 2.18 0.18 1.29 0.17 0.36 0.02 0.18 0.10 0.15 0.01
21 2.63 0.06 1.57 0.11 0.39 0.05 0.14 0.05 0.17 0.01
24 2.99 0.09 1.95 0.11 0.48 0.09 0.16 0.06 0.16 0.01
39 4.00 0.10 3.20 0.12 1.38 0.28 0.12 0.06 0.17 0.00
42 4.13 0.05 3.35 0.11 1.42 0.32 0.11 0.05 0.18 0.01
45 4.23 0.23 3.55 0.14 1.64 0.33 0.17 0.11 0.18 0.00
48 4.50 0.00 4.00 0.00 1.72 0.31 0.13 0.00 0.17 0.00
64 4.67 0.06 4.20 0.00 2.37 0.28 0.13 0.03 0.18 0.00
120 4.87 0.06 4.57 0.20 3.10 0.16 0.13 0.10 0.16 0.01
Valores de la concentración de levaduras C. albicans ATCC 10231 (UFC/ml), en presencia de KTZ, se analizaron por triplicado, la tabla muestra la media y la desviación estándar.
Los valores de concentración de levaduras (UFC/ml) fueron determinadas
comparando los valores de absorbancia medidos con la curva patrón obtenida
con el nefelómetro.
La gráfica 3 muestra las curvas de inhibición del crecimiento de levaduras en
presencia de KTZ. Se adicionaron al medio de cultivo cinco diferentes
concentraciones de KTZ previamente disuelto en metanol. Estos datos se
usaron como datos de referencia del efecto inhibitorio del KTZ.
83
Gráfica 3. Cinéticas de inhibición de Ketoconazol sobre levaduras de C. albicans.
Se muestran las curvas de inhibición de KTZ, se analizaron cinco diferentes concentraciones de Ketoconazol disuelto en metanol al 80%, y se comparan con la curva de crecimiento patrón de la cepa ATCC 10231.
Para determinar el efecto antifúngico del Ketoconazol incorporado en el NSLCL
se llevaron a cabo las cinéticas de inhibición, la gráfica 4 y 5 muestran las
curvas de inhibición del KTZ incorporado en NSLCL en diferentes
concentraciones. Las diferentes concentraciones se lograron adicionando
diferentes cantidades en la formulación de un mismo lote de NSLCL en el
medio de cultivo.
La gráfica 6 muestra cinéticas de inhibición de NSLCL, en este caso se colocó
un mililitro de cada lote, esta vez los lotes contenían diferentes concentraciones
de KTZ, es decir se mantuvo constante la cantidad de NSLCL lo que varió fue
la concentración de KTZ en el lote.
0
2
4
6
8
10
12
0 20 40 60 80 100 120 140
UFC
/ml 1
X1
06
Tíiempo h
Curvas de Inhibición con Ketoconazol
Curva tipo
30µg/ml KTZ
40 µg/ml KTZ
10 µg/ml KTZ
20 µg/ml KTZ
50 µg/ml KTZ
Concentración de Ketoconazol
84
Gráfica 4. Cinética de de inhibición del KTZ en NSLCL a diferentes concentraciones.
La concentración 0 μg/ml se agregó 5ml de NSLCL testigo (NS4); La concentración 12 μg/ml, se agregó 1 ml de NSLCL (NS1); La concentración 24 μg/ml, se agregó 2 ml de NSLCL (NS1) La concentración 42 μg/ml, se agregó 3.5 ml de NSLCL (NS1).
0.00E+00
1.00E+06
2.00E+06
3.00E+06
4.00E+06
5.00E+06
6.00E+06
7.00E+06
8.00E+06
9.00E+06
1.00E+07
1.10E+07
0 50 100 150
UFC
/ml
Tiempo en h
Cinética de inhibición de KTZ incorporado en NSLCL
curva tipo C. albicans
NSLCL+KTZ 0µg/ml
NSLCL+KTZ 12µg/ml
NSLCL+KTZ 24µg/ml
NSLCL+KTZ 42µg/ml
KTZ Ref 30 µg/ml
KTZ Ref 40 µg/ml
85
Gráfica 5. Cinética de de inhibición del KTZ en NSLCL fase exponencial.
1.00
10.00
100.00
1,000.00
10,000.00
100,000.00
1,000,000.00
0 5 10 15 20 25
UFC
/ml
Tiempo en h
Cinética de inhibición de KTZ incorporado en NSLCL. Curva
tipo C. albicans
NSLCL+KTZ 0µg/ml
Cinética de inhibición de Ketoconazol incorporado en NSLCL en la fase exponencial del
crecimiento de C. albicans, la escala logarítmica permite observar la diferencia en las
pendientes, la cual representa la velocidad de crecimiento de la levadura, por lo que a menor
pendiente mayor efecto antimicótico. Pendiente NSLCL 0 =11000, NSLCL 12= 1800, NSLCL
24=1000, Referencia KTZ 40=4700.
86
Gráfica 6. Cinética de inhibición NSLCL sobre C albicans de diferentes lotes.
La concentración 0 μg/ml se agregó 5ml de NSLCL testigo (NS4), La concentración 4 μg/ml, se agregó 1 ml de NSLCL (NS6); La concentración 8 μg/ml, se agregó 1 ml de NSLCL (NS7); La concentración 12 μg/ml, se agregó 1 ml de NSLCL (NS8).
5.00E+03
2.01E+06
4.01E+06
6.01E+06
8.01E+06
1.00E+07
1.20E+07
0 20 40 60 80 100 120 140
UFC
/ml
Tíiempo en h
Cinética de inhibición de NSLCL+KTZ
Curva tipo C. albicans
NSLCL+KTZ 0µg/ml
NSLCL+KTZ 4µg/ml
NSLCL+KTZ 8µg/ml
NSLCL+KTZ 12µg/ml
KTZ Ref 30 µg/ml
KTZ Ref 40 µg/ml
87
5. Comparación del efecto inhibitorio del Ketoconazol incorporado en el NSLCL con el de formas farmacéuticas comerciales.
5.1 Determinación del efecto antimicótico de formas farmacéuticas comerciales con Ketoconazol por el método Kirby-Bauer
El efecto antimicótico de dos formas farmacéuticas comerciales conteniendo
Ketoconazol se muestra en la tabla 17, los medicamentos analizados fueron
Nizoralc tabletas de 200 mg y Nizorald suspensión oral al 2%, ambas del
laboratorio Jannsen-cilag. Los halos de inhibición de los medicamentos son
semejantes a los halos que presentan los discos de referencia Bio-Rad, tal
como se aprecia en las imagenes 13 y 14. La referencia es un disco con 50 μg
KTZ.
Imagen 13. Ensayo Kirby-Bauer tabletas con Ketoconazol 200 mg.
Fotografía del en ensayo Kirby-Bauer con tabletas Nizoral 200 mg de Ketoconazol. Se aprecian los halos de inhibición del crecimiento A) Disco Bio-Rad de referencia 50 µg. B) discos de KTZ tabletas.
A
B
B
88
Imagen 14. Ensayo Kirby-Bauer suspensión oral KTZ al 2%.
Fotografía del en ensayo Kirby-Bauer con suspensión Nizoral 2% de KTZ. Se aprecian los halos de inhibición del crecimiento A) Disco Bio-Rad de referencia 50 µg. B) discos de KTZl suspensión.
Tabla 17. Diámetros de áreas de inhibición de medicamentos comercialesc,d
NIZORAL® TABLETAS NIZORAL® SUSPENSIÓN ORAL
muestra Ø mm muestra Ø mm
Ref Bio-Rad 13 Ref Bio-Rad 13
1 14 1 16
2 13 2 15
3 13 3 18
4 11 4 18
5 14 5 17
6 13 6 14
Se muestran los diámetros de cada muestra analizada, el comportamiento es muy parecido al del disco de referencia, los medicamentos se disolvieron en metanol al 80% y solo se separaron de los excipientes insolubles en metanol-agua. C) Tabletas Nizoral 200 mg laboratorio Janssen-cilag. d) Nizoral Suspensión oral al 2% laboratorio Janssen- cilag.
A
B
B
89
5.2 Determinación del efecto antimicótico de formas farmacéuticas
comerciales con Ketoconazol por el método de microdilución en caldo
Las gráficas 7 y 8 muestran el efecto inhibitorio de las formas farmacéuticas
comerciales, la 7 de tabletas y la 8 de una suspensión oral, con estos
resultados podríamos comparar el efecto inhibitorio de las formas
farmacéuticas que contienen KTZ con el efecto encontrado con el KTZ disuelto
en metanol-agua incorporado al medio de cultivo. Se muestra un promedio de
tres ensayos. En la gráfica 9 se muestra la comparación del efecto inhibitorio
sobre levaduras de C.albicans del KTZ en los diferentes vehículos analizados
por la técnica de microdilución en caldo. Con esto se puede observar el
comportamiento del KTZ en las diferentes formas de incorporarlo al medio de
cultivo.
En la gráfica 9 hizo un acercamiento para que se observe el comportamiento
de las cinéticas, por lo que solo de muestra un fragmento de la gráfica de la
curva tipo de C. albicans.
90
Gráfica 7. Efecto inhibitorio de Nizoral tabletas sobre el crecimiento de C. albicans.
La gráfica muestra el efecto inhibitorio del KTZ en tabletas, se compara contra el KTZ disuelto
en metanol-agua las líneas puenteadas representan el KTZ de referencia.
0.00E+00
1.00E+06
2.00E+06
3.00E+06
4.00E+06
5.00E+06
6.00E+06
7.00E+06
8.00E+06
9.00E+06
1.00E+07
1.10E+07
0 50 100 150
UFC
/ml
Tiempo en h
Cinética de inhibicion KTZ en Tabletas.
curva tipo C.albicans
Tabletas KTZ 20µg/ml
Tabletas KTZ 30µg/ml
Tabletas KTZ 40µg/ml
KTZ Ref 10 µg/ml
KTZ Ref 20 µg/ml
KTZ Ref 30 µg/ml
KTZ Ref 40 µg/ml
91
Gráfica 8. Efecto inhibitorio de Nizoral suspensión oral sobre el crecimiento de C albicans.
La gráfica muestra el efecto inhibitorio del KTZ en Suspensión oral, se compara contra el KTZ disuelto en metanol-agua las líneas puenteadas representan el KTZ de referencia.
0.00E+00
2.00E+06
4.00E+06
6.00E+06
8.00E+06
1.00E+07
1.20E+07
0 50 100 150
UFC
/ml
Tiempo en h
Cinética de inhibición KTZ en suspensión oral
curva tipo C.albicans
Suspensión KTZ 20µg/ml
Suspensión KTZ 30µg/ml
SuspensiónKTZ 40µg/ml
KTZ Ref 10 µg/ml
KTZ Ref 20 µg/ml
KTZ Ref 30 µg/ml
KTZ Ref 40 µg/ml
92
Gráfica 9. Efecto inhibitorio KTZ incorporado en diferentes vehículos sobre el crecimiento de
C albicans.
La gráfica muestra la comparación del efecto inhibitorio del KTZ según el vehículo en el que se
incorpore, se contrasta el efecto de 4 vehículos, me observa que cuando esta incorporado en
el NSLCL presenta un mayor efecto antimicótico en las primeras 20 horas de incubación, es
decir durante la fase exponencial del crecimiento de C.albicans.
0.00E+00
5.00E+05
1.00E+06
1.50E+06
2.00E+06
2.50E+06
3.00E+06
3.50E+06
4.00E+06
0 50 100 150
UFC
/ml
Tiempo en h
Cinética de inhibición KTZ en diferentes vehiculos
curva tipo C.albicans
Suspensión KTZ 30µg/ml
SuspensiónKTZ 40µg/ml
KTZ Ref 30 µg/ml
KTZ Ref 40 µg/ml
Tabletas KTZ 30µg/ml
Tabletas KTZ 40µg/ml
NSLCL+ KTZ 24µg/ml
93
6. Determinación por microscopía electrónica de transmisión el efecto de NSLCL con KTZ sobre la morfología de las levaduras de C. albicans.
Las microfotografías obtenidas por MET del efecto del KTZ en NSLCL
muestran cambios morfológicos en las levaduras de C albicans. La imagen 15
muestra la morfología más representativa del efecto que causa el KTZ sobre
levaduras. En total se procesaron 5 diferentes muestras. Levaduras libres,
levaduras crecidas en presencia de NSLCL a concentraciones de 0, 4,8 y 12
μg/ml.
Imagen 15. Microfotografías de levaduras de C albicans en presencia de diferentes concentraciones de KTZ en NSLCL.
Las fotografías muestran el efecto del KTZ incorporado en NSLCL, se aprecia la deformación de
las levaduras por el efecto de este.
94
Discusión
Los resultados de la caracterización del sistema líquido cristalino liotrópico,
confirman que efectivamente estamos trabajando con un sistema nanométrico,
esto se puede afirmar gracias a los reportes de difractometría de luz láser o
determinación de tamaño de partícula que se realizó en el equipo HORIBA.
De estos análisis se determinó que el tamaño de partícula promedio es de 80
nanómetros, cabe mencionar que las diferentes medidas de tendencia central
como son media (81), moda (85), etc., tienen un comportamiento y un valor
similar al promedio, así mismo la polidispersidad que muestra el NSLCL es
compacta, es decir la amplitud o variación de los tamaños de partículas dentro
de cada uno de los lotes producidos es muy reducida. Por lo tanto, es correcto
afirmar que estamos trabajando con un sistema de dimensiones nanométricas
en el NSLCL. Por otro lado tenemos que el análisis elemental que se realizó
con la ayuda del espectrómetro de masas acoplado al microscopio electrónico
de transmisión, en donde se observó que el KTZ se encuentra incorporado en
el NSLCL. La dificultad de observar la estructura del mismo, nos llevó a marcar
al KTZ con un elemento que fuera más fácilmente observable en la MET, por
lo cual se optó por hacer el seguimiento de una de las impurezas que contenía
el KTZ, (impureza que viene de fábrica). Este elemento fue el SILICIO,
elemento cuyos átomos contienen mayor masa que los componentes del KTZ.
El Silicio se encontró en el KTZ desde el análisis elemental de la materia prima,
y al realizar el análisis de las nanoestructuras se encontró formando parte de
ellas, como se puede ver en los diferentes espectros de masas que se
realizaron, es decir en el Ketoconazol se encuentra presente Silicio, más no en
los componentes anfifílicos de los cristales líquidos, pero una vez más
encontramos Silicio en los cristales líquidos cuando se ha incorporado el KTZ
en su elaboración, por lo tanto, el Ketoconazol está formando parte de NSLCL.
Ahora bien en cuanto a la morfología, es importante saber qué tipo de
estructura se forma en el sistema nanométrico, para lo cual, se observaron las
muestras en MET a 80kV y al contrastarlas con acetato de uranilo, se
encontraron de forma hexosómica, forma que coincide con la literatura, pero
más allá de solo confirmar la morfología de las nano estructuras, la
trascendencia de estos resultados radica en la confirmación de que se puede
95
incorporar un fármaco en estas moléculas, en este caso Ketoconazol, y
además, se pone de manifiesto que la forma, la estabilidad y el tamaño de las
nanoestructuras se mantienen estables aun con el fármaco dentro de ellas.
Después en un intento por observar la estructura interna del NSLCL, se
analizaron las muestras en un microscopio electrónico de alta resolución, a
200kV, el acercamiento es mucho mayor a los 50000 aumentos, pero en este
caso las técnicas normales de observación no permitieron una buena
resolución, esto debido a que están diseñadas y probadas para materiales
sólidos, se esperaba poder ver la estructura interna pues en este tipo de
microscopios pueden observarse estructuras mucho más pequeñas como los
nanotúbulos de carbono por ejemplo, cuyo tamaño es menor a 10nm. Sin
embargo la naturaleza líquida de las muestras no permitió una óptima
preparación y observación. A pesar de no haber podido observar con claridad
la estructura interna de las nanopartículas si se pueden observar las
estructuras cristalinas.
Las pruebas de sensibilidad al KTZ y la determinación de CMI en placa de
agar SB demostraron dos situaciones; primero la cepa de referencia es
sensible a este fármaco y segundo que esta característica puede ser empleada
para observar concentraciones y difusión del fármaco. Por otro lado, la
necesidad de hacer otros tipos de pruebas como vaciado en placa y
cilindro/placa, nos lleva a afirmar que tanto el KTZ como los diferentes
vehículos en los que se incorpora, presentan serias dificultades para difundir
libremente en el agar, resultando en la necesidad de implementar otras
metodologías que permitieran observar el efecto antimicótico del KTZ. Esta
necesidad nos llevó a desarrollar y estandarizar una técnica basada en
nefelometría, ésta es muy usada en la cuantificación de bacterias, al día de hoy
la información sobre el uso y estandarización de ésta en cinéticas de
crecimiento o inhibición con levaduras de C albicans u otras levaduras es muy
escasa. Son varias las ventajas asociadas a la técnica como son: su precisión,
reproducibilidad, rapidez y sencillez, pues otrosmétodos disponibles como son
la cuenta estándar o conteo en cámara de NeuBauer, son lentos y presentan
una amplia variabilidad en los resultados, además requieren mucho tiempo
96
para llevarlas a cabo, en cambio la toma de muestra y su lectura en el
espectrofotómetro, es un método rápido y tiene una alta reproducibilidad.
Con esta técnica nos fue posible procesar una gran cantidad de muestras y
realizar varias cinéticas al mismo tiempo, por lo que es de gran ayuda para la
cuantificación de UFC en un cultivo líquido. Así mismo, como la muestra es
procesada en pocos minutos, esta técnica incluso puede ser utilizada para
desarrollar métodos semicuantitativos de antimicóticos por su acción inhibitoria.
Al analizar la potencia inhibitoria del KTZ, las cinéticas de crecimiento
mostraron que el KTZ en vehículos convencionales presenta un
comportamiento dosis dependiente, es decir claramente se observa que a
mayor dosis, mayor efecto inhibitorio, encontrándose como CMI 40 µg/ml, al
hacer la comparación de las concentraciones calculadas en las formas
farmacéuticas comerciales, se encontraron por este método concentraciones
muy parecidas, mostrando diferencias entre las referencias y los medicamentos
analizados que no son estadísticamente significativas (P>0.05). Hasta este
punto el comportamiento es como se esperaba. En cambio al probar el efecto
inhibitorio del KTZ incorporado dentro del NSLCL se observó un amplio
aumento en la actividad antimicótica de éste. Por otro lado el perfil de
inhibición del NSLCL a las diferentes concentraciones muestra una alta
uniformidad, es decir a pesar de haber aumentos en la concentración de KTZ
de 100 y 200% no se observa el marcado comportamiento dosis dependiente
que sí se observa en vehículos convencionales. Entonces se puede decir que
la liberación del KTZ se ve modificada. Este comportamiento fue reportado en
otros trabajos con nanopartículas transportadoras de fármacos, en donde se
reporta que sistemas líquidos cristalinos formados con poloxámero presentan
un patrón de liberación sostenida de fármacos (Cafeína) [78]. Cabe aclarar que
en esos trabajos se midió la liberación en celdas de Franz, y no se probó la
potencia del fármaco, en nuestro caso con los resultados que obtuvimos se
demuestran dos aspectos; primero, que el fármaco es capaz de liberarse del
interior de la nanoestructura, y segundo y más importante; se incrementa
sustancialmente la potencia del antifúngico cuando es incorporado en el
NSLCL comparando su efecto contra el fármaco en forma libre. Este aumento
no se debe a los componentes que forman las nanoestructuras, pues se
97
analizó el perfil de inhibición del NSLCL sin KTZ a una concentración cinco
veces mayor que la concentración del NSLCL con KTZ, este perfil no mostró un
alto efecto inhibitorio, no se acercó siquiera al que presenta la concentración de
10 µg KTZ/ml. Otra ventaja del NSLCL es su capacidad de fluir. Mientras que
por un lado se investigan y desarrollan liposomas flexibles o deformables que
incrementen la penetrabilidad en la piel y mucosas [71,72], un NSLCL por su
naturaleza, es un fluido, y tiene propiedades muy similares a los liposomas
flexibles. Sumado a esto la diferencia en el proceso de elaboración de NSLCL,
proporciona enormes ventajas sobre casi todos los nanos acarreadores, pues
no se necesitan fuertes solventes ni largos tiempo de formación como con los
liposomas y otras nanopartículas.
Por otro lado, la MET que se realizó sobre levaduras de C albicans, comprobó
que el efecto antifúngico que se observó fue debido al KTZ incorporado en el
NSLCL, pues en las fotografías se observa claramente el cambio morfológico
de las levaduras debido a la acción del KTZ ya que actúa sobre la síntesis del
ergosterol, la falta de éste provoca la inestabilidad de la membrana en la
levadura. Esta inestabilidad provoca deformaciones y afecta la viabilidad de las
levaduras. En células de C albicans cultivadas sin la presencia de KTZ no se ve
ningún cambio en su morfología, aunque si se haya colocado el testigo del
NSLCL.
En conclusión, se logró mejorar el efecto antimicótico del Ketoconazol al
incorporarlo dentro de un NSLCL, y éste proporciona grandes ventajas sobre
otros nanoacarreadores, al ser mucho más sencilla su elaboración, proporciona
la ventaja de la fluidez de su estructura y modifica el patrón de liberación de los
fármacos, todo esto con una alta penetración en piel y mucosas por su tamaño
nanométrico y por su carácter anfifílico, característica que le ayuda a su efecto
antifúngico sobre enfermedades mucocutáneas. Por lo que un NSLCL es una
buena opción como sistema acarreador de fármacos.
98
CONCLUSIONES
1. Se logró elaborar un sistema líquido cristalino e incorporar KTZ en él. La
caracterización del sistema confirmó que es un sistema en escala
nanométrica (NSLCL).
2. La evaluación del efecto antimicótico del KTZ en los diferentes sistemas
por medio del ensayo Kirby-Bauer mostró que es en disolución cuando
el KTZ tiene mayor efecto. Al mismo tiempo se demostró que hay
problemas de difusión en el agar con el NSLCL.
3. El método de cuantificación de levaduras utilizando el espectrofotómetro
desarrollado en este proyecto mostró ser eficaz para el seguimiento de
cinéticas de crecimiento microbiano, además proporciona resultados
rápidos y es sencillo de utilizar.
4. La CMI del KTZ incorporado en el NSLCL fue de 24 μg/ml, mientras que
la CMI del KTZ en solución fue de 40 µg/ml, ésta diferencia indica un
aumento en la potencia antimicótica del KTZ por la acción del NSLCL
como acarreador del fármaco.
5. Al comparar la CMI del KTZ incorporado en el NSLCL (24 μg/ml) con la
del KTZ incorporado en vehículos convencionales (formas farmacéuticas
comerciales: 40 µg/ml) se demostró que el uso del NSLCL aumenta la
potencia del fármaco.
6. La microscopía electrónica muestra la modificación de la morfología de
las levaduras de C. albicans por la acción del KTZ incorporado en
NSLCL el cual modifica la estabilidad de la membrana, lo que puede
afecta la estructura y funcionalidad de la pared celular del hongo.
99
Perspectivas del proyecto
Realizar estudios in vivo del NSLCL.
Estudiar la posibilidad de uso en otras vías de administración
Desarrollar una técnica para la visualización de las estructuras del
NSLCL interactuando con las levaduras.
Estudiar la cinética de liberación mediante celdas de Franz.
Determinar la acción individual de los componentes sobre C albicans.
Utilizar este sistema nanoestructurado con péptidos estimuladores del
sistema inmunológico.
Estudiar in vitro la actividad biológica sobre las formas filamentosas del
hongo (mohos).
100
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107
ANEXOS
108
Constancia de participación en el V Congresso Ibero-Americano de Ciências
Farmacéuticas e VIII Conferência Nacional de EducaçàoFarmacéutica. Brasilia,
BRASIL. Junio de 2013.
109
110
Reporte de análisis de tamaño de partícula DLS NSLCL N1
111
Reporte de análisis de tamaño de partícula DLS NSLCL N2
112
Reporte de análisis de tamaño de partícula DLS NSLCL N4
113
Reporte de análisis de tamaño de partícula DLS NSLCL N6
114
Reporte de análisis de tamaño de partícula DLS NSLCL N7
115
Reporte de análisis de tamaño de partícula DLS NSLCL N8
116
Dedicato a tutti quelli che stanno aspettando.
Forti e degni.