detección indirecta de portadores

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Deteccin indirecta de portadoresde fibrosis qustica en dos familiaschilenas mediante anlisis depolimorfismos en el ADN asociadosfuertemente al gen CFTR

Nora Riveros Ka, Juan Ros Hb.

Indirect cystic fibrosis carrierdetection in two Chilean families byanalysis of DNA polymorphismsclosely linked to the CFTR gene

Background: Molecular genetic analysis is the only method thatallows accurate detection of Cystic Fibrosis (CF) carriers. Nevertheless, its application is restrictedto those families in which the affected child holds known mutations. Since most Chilean CFpatients already studied are heterozygous and carry a mutation not yet characterized, directidentification of carriers is limited. Linkage analysis of Restriction Fragment LengthPolymorphisms (RFLP), using DNA markers closely linked to the CFTR gene, is a useful tool for thedetection of carriers in families in which the patient carries an unknown mutation. Aim: Toemphasize the usefulness of KM19 and MetH markers for RFLP analysis in extended genealogiesin order to identify carriers of unknown mutations. Material and Methods: Selection of threefamilies, in which a sibling of an index case, identified as F-508/unknown mutation, could notbe identified as heterozygous carrier or a normal homozygous. Haplotypic characterization forKM19 and MetH markers was performed by PCR amplification of genomic DNA followed by allelespecific restriction enzymatic digestion. Results: The siblings of two families were identified ascarriers and the sibling of the third family was identified as normal. Conclusions: KM19 andMetH haplotypic analysis provided a rapid method for carrier detection in the families understudy. The analysis may be used as a supplement to direct genetic diagnosis and be helpful ingenetic counseling (Rev Md Chile 2005; 133: 648-54).(Key Words: Cystic fibrosis; Genetic diseases, inborn; Polymorphism, genetic)

Recibido el 12 de marzo, 2004. Aceptado en versin corregida el 30 de marzo, 2005.Programa de Biologa Celular y Molecular. ICBM. Facultad de Medicina de la Universidadde Chile, Santiago de Chile.aQumico Farmacutico, Doctor en Ciencias con mencin en Biologa.bBioqumico.

Correspondencia a: Dra. Nora Riveros K. Programa de Bio-loga Celular y Molecular. ICBM. Facultad de Medicina,Universidad de Chile. Independencia 1027. Santiago Chile.Fax: 7355580. E mail: [email protected].

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I N V E S T I G A C I N

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La fibrosis qustica (FQ) es una enfermedadletal, de herencia autosmica recesiva, cuyaincidencia en la poblacin chilena se estima en 1de cada 4.000 nacidos vivos. Considerando que elpromedio de sobrevida de los enfermos en nues-tro pas es de 12 aos, se calcula que actualmentedebieran existir en Chile aproximadamente 400nios vivos afectados de FQ.

La medicin de electrolitos en el sudor auncuando constituye una excelente herramienta dediagnstico que debe aplicarse siempre ante lasospecha de un caso de FQ, no es siempreconcluyente. Hay pacientes, con sintomatologaaltamente sugerente de la enfermedad, que pre-sentan una concentracin de cloruro normal olimtrofe, en cuyo caso slo el anlisis genticomolecular permite confirmar un diagnstico clni-co dudoso1,2.

El gen alterado en la FQ codifica la protenaCFTR, reguladora del transporte epitelial de cloru-ro. Se han descrito ms de 900 mutacionesdiferentes a lo largo del gen, al menos un cientode ellas asociadas a la expresin clnica de laenfermedad. Las mutaciones se presentan confrecuencia variable segn el origen tnico de lapoblacin, la ms comn, presente en 70% de losalelos FQ en pacientes caucsicos, consiste en ladelecin de 3 pares de bases y se traduce en laprdida de una fenilalanina en la posicin 508 dela protena CFTR (F-508). Los enfermos restantespresentan diferentes mutaciones, cuya frecuenciaindividual no supera al 3%3,4. De esto se despren-de que el diagnstico molecular de rutina, me-diante el anlisis de cada una de las mutacionesasociadas a la enfermedad, resulta impracticablesin la identificacin previa de las mutaciones mscomunes en la poblacin en que se aplica.

El uso de kits comerciales, disponibles ennuestro pas, permite el anlisis simultneo devarias mutaciones. Sin embargo, la tasa de detec-cin depende de cun frecuentes sean estasmutaciones en la poblacin. Es as como el usodel panel recomendado por The American Collegeof Medical Genetics, que comprende las 25 muta-ciones ms comunes en la poblacin caucsica,permite un nivel de deteccin promedio inferior a60% de los alelos mutados en la poblacinhispanoamericana5. Por lo tanto, un resultadonegativo en este anlisis, no permite descartar lapresencia de FQ. Es posible en estos casos,

aunque su costo es elevado, recurrir al servicio deempresas que cuentan con laboratorios especiali-zados en el extranjero y que ofrecen el anlisis detodas las mutaciones que figuran en The CysticFibrosis Mutation Data Base.

En el primer estudio realizado en pacienteschilenos, mediante el anlisis de 9 mutaciones,descritas entre las ms frecuentes en la poblacinhispana, caracterizamos 40% de los alelos muta-dos1. Cincuenta por ciento de los 24 pacientesresultaron heterocigotos F-508/mutacin noidentificada. En un estudio posterior, en el que seanalizan 20 mutaciones, se caracteriz a 66% delos alelos mutados, determinndose que 44% delos pacientes corresponden a heterocigotos F-508/mutacin no identificada (n=25)6.

La presencia mayoritaria de individuos FQheterocigotos, en que slo se ha caracterizado lamutacin presente en uno de sus alelos, imposibi-lita la aplicacin del anlisis molecular directopara la deteccin de portadores. Dada la gravedadde esta enfermedad, y el alto costo que representael tratamiento y cuidado de un nio con FQ, laidentificacin de portadores a partir del ncleofamiliar de individuos afectados, reviste granimportancia.

El estudio de regiones cromosmicas adyacen-tes al gen CFTR ha permitido identificar variospolimorfismos en el largo de fragmentos derestriccin (RFLP), fuertemente ligados a estegen7-9. El anlisis de la segregacin de los alelosde marcadores polimrficos, a travs de genealo-gas extendidas, permite caracterizar haplotiposde esta regin cromosmica y la deteccin indi-recta de portadores en aquellas familias en que elenfermo es heterocigoto para una mutacin des-conocida10-15.

En este trabajo se muestra la aplicacin de estetipo de anlisis en familias seleccionadas a partirde un caso ndice afectado con FQ, cuyo genotipoha sido caracterizado como heterocigoto F-508/mutacin no identificada. La caracterizacin ha-plotpica se realiz mediante el uso de endonu-cleasas de restriccin que cortan en secuenciasespecficas del ADN y que permiten la discrimina-cin de dos formas allicas segn est o nopresente el sitio de reconocimiento de la enzima.Los marcadores polimrficos analizados fueronMetH y KM19, localizados en los loci MET yD7S23, respectivamente, ro arriba del gen CFTR.

ANLISIS DE POLIMORFISMOS EN ADN ASOCIADOS AL GEN CFTR - N Riveros et al

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KM19 se localiza 125 kb ro arriba del promotordel gen CFTR y aproximadamente a 225 kb de F-508 y el locus MET se ubica alrededor de 1450 kbdel extremo 3 de CFTR7,9.

MATERIAL Y MTODO

En una muestra de familias pesquisadas a partir decasos ndices afectados de FQ, incluidas en dosestudios publicados anteriormente1,16, se seleccio-naron 3 de ellas, en que un hermano del casondice, caracterizado como F-508/mutacin des-conocida, no poda ser tipificado como portador uhomocigoto normal.

Mtodo. La obtencin de ADN genmico y latipificacin de la mutacin F-508 se realiz deacuerdo a lo descrito por Ros y col16. Para lacaracterizacin de los polimorfismos, se amplifica-ron regiones de los loci MET y D7S23, quecontienen sitios polimrficos para las enzimasMspI (MetH) y PstI (KM19), respectivamente10,17

(Figura 1). La amplificacin se realiz mediante latcnica de PCR usando los siguientes partidores:

KM19:5'- ATTCTGTCCAGGAAACTTTGTGTTTTGTCA-35'- GTCTAAAGGGTATCAGTCCAAAAATGAAT-3'

MetH:5'- CATCCAATGTAGGAGAGCCTTAGTC-3'5'- CCATTTTTGTGTCTTCTAGTCTAAGG-3'

Las condiciones de la PCR fueron: un cicloinicial de 5 min a 95, 35 ciclos de 1 min a 95, 1min a 50 y 1 min a 72, para terminar con 1 ciclode 10 min a 72. Los fragmentos amplificados seincubaron durante la noche con 2 U de enzima/gde ADN. El producto de la digestin se analizmediante electroforesis en geles de agarosa al 2%a 90 V por 2 h. El patrn de migracin electrofor-tica de los fragmentos de restriccin se visualiz aluv, previa tincin del gel con bromuro de etidio.

RESULTADOS

Los marcadores KM19 y MetH se expresan deforma mendeliana codominante, lo que permitediscriminar, sin duda, el genotipo del individuo enese locus, el haplotipo de cada cromosoma paren-

Figura 1. Anlisis de polimorfismos mediante PCR y digestin enzimtica. Se designa con el signo (+) al aleloque presenta la secuencia reconocida por la enzima de restriccin y con (-) al alelo que no la presenta. A.Caracterizacin para el marcador KM19: se amplific un fragmento de 550 pb, la digestin del productoamplificado origina fragmentos de 330 y 220 pb en presencia del sitio polimrfico reconocido por la enzimaPstI. Carriles: 1 homocigoto (+/+); 2 heterocigoto (+/-); 3 homocigoto (-/-). B. Caracterizacin para MetH: elproducto de amplificacin, de 223 pb al ser digerido con MspI origina fragmentos de 118 y 105 pb enpresencia del sitio polimrfico, y conserva su tamao en ausencia de ste. Carriles: 1 homozigoto (-/-); 2heterozigoto (+/-); 3 homozigoto (+/+).

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tal se determin usando el individuo afectadopara establecer la fase. Puesto que la FQ es unaentidad autosmica recesiva, se establece comoaxioma que los afectados presentan sus dos alelosCFTR mutados, uno de ellos caracterizado con ladelecin F-508 y el otro portador de una muta-cin no identificada y que ambos padres sonportadores de un alelo mutado. De acuerdo connumerosos antecedentes bibliogrficos que as loindican, se asume adems que no ha habidorecombinacin gnica entre los marcadores y elgen CFTR9-15. Ambos marcadores muestran fuertedesequilibrio de ligamiento con el gen CFTR.

Familia 1. El probando es una nia de 7 aos, contest del sudor de 86,6 mEq/L y sintomatologapulmonar. Su padre es portador de la mutacinF-508 y su madre de una mutacin no caracteri-zada. Se desea determinar si su hermano, de 8aos, fenotpicamente normal, que no presenta lamutacin F-508, ha heredado de su madre elalelo normal o el mutado (Figura 2).

Para construir las fases haplotpicas, se parte delhaplotipo de la nia afectada, heterozigota para la

mutacin F-508 y portadora de una mutacindesconocida, quien es (-/+) para el sitio de reconoci-miento PstI en la regin KM19. Ya que la madre esPstI (-/-), necesariamente la mutacin F-508 seencuentra en fase de acoplamiento con PstI (+)proveniente de su padre, cuyo genotipo es (-/+) enKM19. La determinacin del haplotipo en el padre nopermite por s sola establecer la calidad de portadordel hermano de la afectada, por cuanto en la madreno puede establecerse la fase entre el alelo mutadosobre CFTR, debido a su condicin de homocigotonegativo para PstI. Al tipificar el locus MetH, sedetermina que el padre es MspI (-/+). Como la niaenferma es MspI (-/+), el alelo MspI (-) del padrenecesariamente debe estar en fase de acoplamientocon F-508 y KM19 (+).

La paciente hereda el alelo MetH (-) de supadre y MetH (+) de su madre, en quien estehaplotipo se encuentra en fase de acoplamientocon KM19 (-) y una mutacin desconocida en elgen CFTR. El hermano de la afectada es (+/+) paraMetH y (-/-) para KM19 y no es portador F-508,por lo tanto, ha heredado de su padre el aleloMetH (+), asociado con el gen CFTR normal y de

Figura 2. Familia 1: Anlisis de polimorfismos para los marcadores MetH y KM19, mediante PCR y digestinenzimtica, en una familia cuya hija, caso ndice, ha sido caracterizada como heterozigoto F-508/mutacindesconocida. Las fases haplotpicas del hermano de la afectada, permiten diagnosticarle como portador de unamutacin desconocida en CFTR. En la genealoga los smbolos llenos denotan al individuo afectado, lossmbolos con inserto corresponden a portadores y los smbolos abiertos a no portadores. En el ngulo inferiorderecho se indica la posicin de los marcadores polimrficos con relacin a CFTR. Las fases haplotpicas de losmarcadores se indican para cada individuo: (+) alelo reconocido por enzima de restriccin; (-) alelo que nopresenta el sitio polimrfico; () F-508; (0) mutacin desconocida; (N) alelo normal.

N

NO

O NN

N

NNN

M e t H ( M s p I )K M I 9 ( P s t I )C F T R


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su madre el MetH (+) en fase con una mutacindesconocida. De este modo las fases haplotpicasdel hermano de la afectada, permiten diagnosti-carle como portador de una mutacin en el genCFTR, heredada de su madre, sin necesidad deidentificar previamente de cul mutacin se trata.

Familia 2. El probando es un nio de 6 aos contest del sudor de 116 mEq/L, con sintomatologapulmonar y digestiva. Su madre y su abuelamaterna son portadoras de la mutacin F-508 ysu padre de una mutacin no identificada Sedesea determinar si la hermana de 13 aos,fenotpicamente normal, ha heredado de su padreel alelo mutado (Figura 3).

El nio afectado, heterocigoto para la mutacinF-508 y una mutacin no determinada, es PstI (-/+).Puesto que la madre es PstI (+/+) y portadora de F-508, esta mutacin debe estar en fase de acoplamien-to con PstI (+). El padre, PstI (-/+), es portador de unamutacin no identificada, la que de acuerdo alhaplotipo del nio debe estar en fase de acoplamien-to con PstI (-). La hermana que es (-/+) para PstI yque no es portadora F-508 hereda el alelo PstI (+)asociado al gen normal de su madre y el PstI (-),asociado a la mutacin desconocida, de su padre. Elanlisis practicado permite caracterizarla sin ambige-dad como portadora de FQ. Puede establecerse queel alelo Pst (+) asociado a la mutacin F-508

proviene de su abuela materna. La tipificacin para elmarcador MetH corrobora el resultado obtenido paraKM19.

Familia 3. El probando es un nio de 6 aos contest del sudor de 102 mEq/L, y sintomatologapulmonar. Su padre y su abuela paterna sonportadores F-508. La madre es portadora de unamutacin no identificada. Se desea determinar lacondicin de la hermana, de 11 aos, fenotpica-mente normal, que no presenta la mutacin F-508.(Figura 4). El haplotipo del nio afectado, heterozi-goto para la mutacin F-508 y portador de unamutacin desconocida es (+/+) para PstI. Ya que elpadre es PstI (-/+), la mutacin F-508 se encuentranecesariamente en fase de acoplamiento con PstI(+). Su madre es PstI (-/+), por lo que la mutacindesconocida est en fase de acoplamiento con Pst(+). Por lo tanto, la nia, quien presenta Pst (-/-),posee ambos alelos normales. La caracterizacin delos RFLP para el marcador MetH, confirma su calidadde no portadora.

DISCUSIN

El anlisis de haplotipos en genealogas extendi-das, basado en los marcadores MetH y KM19ligados estrechamente con el gen CFTR, practica-

Figura 3. Familia 2: Anlisis de polimorfismos para los marcadores MetH y KM19, en una familia cuyo hijo,caso ndice, ha sido caracterizado como heterozigoto F-508/mutacin desconocida. Las fases haplotpicas desu hermana, permiten establecer su carcter de portadora de una mutacin desconocida. Los smbolos y elmtodo usado se indican en la Figura 2.

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do a 3 familias, en que el enfermo es heterocigotopara una mutacin no caracterizada, permitiestablecer en sus hermanos, fenotpicamente sa-nos, el carcter de portadores (familias 1 y 2) oindividuos normales (familia 3). La inferencia de lacalidad de portador, de acuerdo al haplotipodeterminado, est dada por la baja fraccin derecombinacin para ambos marcadores, amplia-mente documentada en la literatura7-18.

Dado el alto porcentaje de heterocigotos afecta-dos por una mutacin desconocida, entre lospacientes chilenos1,6, debido al gran nmero demutaciones descritas en el gen CFTR y al alto costoque significara el anlisis de cada una de ellas, laaplicacin de este tipo de anlisis constituye unabuena alternativa para la deteccin de portadores.

Si bien el uso de un nmero limitado demarcadores no siempre permite establecer la fasehaplotpica para la mutacin dentro de una familia,la inclusin de marcadores intragnicos, como mi-crosatlites localizados en regiones intrnicas u otrosms cercanos a la mutacin causal, disminuyen laposibilidad de recombinacin entre ambas regionesy el riesgo de falsos positivos o falsos negativos19,20.

El anlisis de polimorfismos se ha usadoextensamente en diagnstico prenatal, lo quereviste enorme importancia en familias de altoriesgo, ya que posibilita el inicio de un tratamien-to precoz de la enfermedad, contribuyendo a unmejor pronstico y calidad de vida para el recinnacido5. Por otra parte, la asesora gentica quepueda brindarse a parejas de individuos portado-res, permite a ellos asumir una paternidad respon-sable y estar atentos a la aparicin de sntomassugerentes de la enfermedad en sus hijos. Estatcnica tambin puede ser utilizada para el diag-nstico de individuos con antecedentes familiaresy sintomatologa sugerente de FQ, aun cuando sedesconozcan las mutaciones especficas que afec-tan a ambos alelos en el integrante de la familiadiagnosticado con la enfermedad.

Este trabajo constituye un ejemplo particularde una tcnica de diagnstico indirecto de granpotencialidad, aplicable a cualquier patologa ori-ginada por mutaciones genticas si se conoce laposicin del gen a nivel cromosomal y se cuentacon marcadores moleculares colindantes con losque segregue en desequilibrio de ligamiento.

Figura 4. Familia 3: Anlisis de polimorfismos para los marcadores MetH y KM19, en una familia cuyo hijo, caso ndice,ha sido caracterizado como heterocigoto F-508/mutacin desconocida. Las fases haplotpicas de su hermanaestablecen su calidad de no portadora. La simbologa y el mtodo usado corresponden a los de la Figura 2.


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Agradecimientos:Agradecemos al Dr. Mauricio Arcos Burgos, MdicoCirujano, PhD Ciencias Biomdicas, por su contribu-cin en la obtencin e interpretacin de resultados.

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detección indirecta de portadores

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