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DESARROLLO DE UN PROTOTIPO DE FORMULACIÓN CON HONGO S ENTOMOPATÓGENOS PARA EL MANEJO DE Demotispa neivai Bondar
(Coleoptera: Chrysomelidae)
LUIS CARLOS MARTÍNEZ CASTRILLÓN
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE AGRONOMÍA
ESCUELA DE POSGRADO MAESTRÍA EN CIENCIAS AGRARIAS, ÉNFASIS ENTOMOLOGÍA
BOGOTÁ, 2010
DESARROLLO DE UN PROTOTIPO DE FORMULACIÓN CON HONGO S ENTOMOPATÓGENOS PARA EL MANEJO DE Demotispa neivai Bondar
(Coleoptera: Chrysomelidae)
LUIS CARLOS MARTÍNEZ CASTRILLÓN
Tesis de Maestría para optar al título de Magíster en Ciencias Agrarias con énfasis en Entomología
Director AUGUSTO RAMÍREZ
M. Sc. Ciencias agrarias
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE AGRONOMÍA
ESCUELA DE POSGRADO MAESTRÍA EN CIENCIAS AGRARIAS, ÉNFASIS ENTOMOLOGÍA
BOGOTÁ, 2010
Nota de aceptación
________________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
Presidente del Jurado
________________________________________________ Jurado
________________________________________________ Jurado
________________________________________________ Jurado
Firmado a los ____ días del mes de ____________ de ______.
DEDICATORIA
A mi padre Emiro Nel Martínez, quien incansablemente me ha llevado tan lejos en
este camino y en mi vida profesional. Gracias.
AGRADECIMIENTOS
A todas aquellas personas que colaboraron en la ejecución de esta investigación
pudiera culminarse. Especialmente aquellos que participaron directamente del
proyecto: a Angélica Plata Rueda, investigadora asistente de CENIPALMA; a
Nilson Torres, tecnólogo del Campo Experimental La Vizcaína; a Rosa Cecilia
Aldana, Carolina Valencia y Edgar Benítez, investigadores de la Sección de
Entomología de CENIPALMA; al Dr. José Ignacio Sanz, Director ejecutivo
CENIPALMA; al Dr. Alexander Villanueva, gerente de Palmeras de Yarima S.A., y
al Dr. Tito Salcedo, gerente Palmas Oleaginosas Bucarelia S. A.
También deseo agradecer a las entidades que apoyaron con recursos financieros
y humanos durante el desarrollo de esta investigación: LA UNIVERSIDAD
NACIONAL DE COLOMBIA y la comunidad académica en general, que contó con
un espacio y recursos para el desarrollo de programas de investigación y
formación de personal científico a nivel de maestría; El Centro de Investigación en
Palma de Aceite CENIPALMA al fortalecer sus grupos de investigación, generando
un mayor conocimiento y permitiendo la continuidad del programa de manejo
integrado de plagas.
Finalmente, agradezco a las plantaciones de palma de aceite de la Zona central:
Campo Experimental La Vizcaína, Palmeras de Yarima, Oleaginosas Bucarelia,
Palmas Monterrey, ya que los resultados obtenidos serán la base para
implementar nuevas estrategias de control sobre uno de las plagas que más
daños ocasionan en la zona central y al disponer de un ambiente más limpio. Los
resultados del proyecto serán divulgados a través de artículos en revistas
indexadas, participación en congresos y por los medios electrónicos disponibles.
CONTENIDO
Pág.
INDICE DE TABLAS I
INDICE DE FIGURAS II
INDICE DE ANEXOS VI
GLOSARIO VII
PREFACIO VIII
RESUMEN IX
SUMMARY X
1. INTRODUCCIÓN 1
2. JUSTIFICACIÓN 4
3. OBJETIVOS 6
3.1. Objetivo general 6
3.2. Objetivos específicos 6
4. MARCO TEÓRICO 7
4.1. EL RASPADOR DEL FRUTO Demotispa neivai Bondar. 7
4.1.1. Ubicación taxonómica. 7
4.1.2. Morfología. 8
4.1.3. Ciclo de vida. 10
4.1.4. Daño en el cultivo de palma de aceite. 11
4.1.5. Medidas de control. 11
4.2. GENERALIDADES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS. 12
4.2.1. Clasificación de los hongos entomopatógenos. 13
4.2.2. Uso de hongos entomopatógenos en el cultivo de palma de aceite. 14
4.2.3. B. bassiana (Balsamo) Vuillemin como agente de control. 14
4.2.4. M. anisopliae (Metchnkoff) Sorokin como agente control. 15
4.2.5. Proceso infectivo de los hongos entomopatógenos en los insectos. 16
4.2.5.1. Adherencia de la conidia a la cutícula del insecto. 16
4.2.5.2. Germinación de la conidia. 17
4.2.5.3. Penetración al integumento del hospedero. 17
4.2.5.4. Penetración a través de cuerpos abiertos. 18
4.2.5.5. Crecimiento del hongo en el hemocele. 19
4.2.5.6. Producción de micotoxinas. 20
4.2.5.7. Muerte del insecto. 20
4.2.5.8. Dispersión de las conidias. 21
4.2.6. Importancia de la actividad enzimática de los hongos
entomopatógenos.
21
4.2.7. Factores que afectan la viabilidad de la conidias. 22
4.3. FORMULACIÓN DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS 23
4.3.1. Características básicas de una formulación comercial. 24
4.3.2. Formulaciones líquidas. 25
4.3.3. Formulaciones sólidas. 26
5. MATERIALES Y MÉTODOS 27
5.1. OBSERVACIONES PRELIMINARES 27
5.1.1. Ubicación del área de estudio. 27
5.1.2. Consecución del material biológico. 28
5.1.3. Observaciones de laboratorio y campo. 28
5.2. PATOGENICIDAD DE TRES AISLAMIENTOS DE HONGOS
ENTOMOPATÓGENOS SOBRE ADULTOS D. neivai.
29
5.2.1. Selección de hongos entomopatógenos. 29
5.2.2. Producción de conidias. 30
5.2.3. Preparación de los aislamientos por dilución seriada. 30
5.2.4. Determinación de las concentraciones letales CL50 y tiempo letal. 31
5.2.5. Análisis estadístico. 32
5.3. PRUEBAS DE ADHERENCIA E HIDROFOBICIDAD DE DOS
AISLAMIENTOS DE B. bassiana SOBRE ADULTOS DE D. neivai.
32
5.3.1. Pruebas de adherencia. 32
5.3.2. Pruebas de hidrofobicidad. 33
5.3.3. Análisis estadístico. 34
5.4. CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE VEHICULOS Y COADYUVANTES
PARA EL DISEÑO DE DIFERENTES PROTOTIPOS DE FORMULACIÓN
DE B. bassiana.
34
5.4.1. Producción artesanal del principio activo. 34
5.4.2. Caracterización física de los excipientes. 35
5.4.2.1. Tamaño de partícula. 36
5.4.2.2. Voluminosidad. 36
5.4.2.3. Fluidez. 37
5.4.2.4. Humectabilidad. 37
5.4.2.5. Humedad. 37
5.4.2.6. pH. 38
5.4.3. Análisis estadístico. 38
5.5. VIABILIDAD DE LAS CONIDIAS DE B. bassiana FRENTE A LA
EXPOSICIÓN A RAYOS ULTRAVIOLETA Y SU RESPUESTA A LA
ADICIÓN DE DOS PROTECTORES SOLARES.
39
5.5.1. Producción de conidias de B. bassiana. 39
5.5.2. Evaluación de los fotoprotectores. 39
5.5.3. Análisis estadísticos. 40
5.6. DESARROLLO Y SELECCIÓN DE DIVERSOS PROTOTIPOS DE
FORMULACIÓN PARA UN AISLAMIENTO DE B. bassiana EN EL
CONTROL DEL RASPADOR DEL FRUTO.
40
5.6.1. Selección de los prototipos de formulación para el hongo B025. 40
5.6.2. Pruebas fluidez. 41
5.6.3. Pruebas de voluminosidad. 41
5.6.4. Análisis estadístico. 42
5.7. EVALUACIÓN DE CUATRO PROTOTIPOS DE FORMULADOS DE B.
bassiana PARA EL CONTROL DE D. neivai EN CONDICIONES DE
42
LABORATORIO.
5.7.1. Preparación de los prototipos de formulación. 42
5.7.2. Producción de conidias. 43
5.7.3. Determinación de conidias en cada uno de los prototipos. 43
5.7.4. Preparación de los insectos para su inoculación. 44
5.7.5. Análisis estadístico. 44
5.8. EVALUACIÓN DE UN PROTOTIPO DE FORMULACIÓN DE B.
bassiana PARA EL CONTROL DEL D. neivai EN CONDICIONES
SEMICONTROLADAS DE CAMPO.
44
5.8.1. Producción de conidias y formulación. 45
5.8.2. Preparación de los tratamientos y captura de insectos. 45
5.8.3. Análisis estadístico. 45
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 46
6.1. PATOGENICIDAD DE TRES AISLAMIENTOS DE HONGOS
ENTOMOPATÓGENOS SOBRE ADULTOS D. neivai.
46
6.1.1. Obtención de aislamientos y síntomas de infección del insecto. 46
6.1.2. Concentración letal media. 47
6.1.3. Tiempo letal. 51
6.2. PRUEBAS DE ADHERENCIA E HIDROFOBICIDAD DE DOS
AISLAMIENTOS DE B. bassiana SOBRE ADULTOS DE D. neivai.
53
6.2.1. Hidrofobicidad de las conidias. 53
6.2.2. Adherencia de conidias. 54
6.3. CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE EXCIPIENTES PARA EL DISEÑO DE
DIFERENTES PROTOTIPOS DE FORMULACIÓN DE B. bassiana.
59
6.3.1. Humedad. 59
6.3.2. Humectabilidad. 60
6.3.3. pH. 60
6.3.4. Voluminosidad. 60
6.3.5. Fluidez. 60
6.3.6. Tamaño de partícula 61
6.4. VIABILIDAD DE CONIDIAS DE B. bassiana FRENTE A LA
EXPOSICIÓN A RAYOS ULTRAVIOLETA Y SU RESPUESTA A LA
ADICIÓN DE DOS PROTECTORES SOLARES.
62
6.5. DESARROLLO Y SELECCIÓN DE DIVERSOS PROTOTIPOS DE
FORMULACIÓN PARA UN AISLAMIENTO DE B. bassiana.
66
6.5.1. Fluidez. 66
6.5.2. Voluminosidad. 66
6.6. EVALUACIÓN DE CUATRO FORMULADOS DE B. bassiana PARA EL
CONTROL DE D. neivai EN CONDICIONES DE LABORATORIO.
68
6.6.1. Porcentaje de mortalidad en cada uno de los formulados. 68
6.6.2. Porcentaje de mortalidad de cada uno de los formulados sin la
adición del hongo entomopatógeno.
70
6.7. EVALUACIÓN DE UN PROTOTIPO DE FORMULACIÓN DE B.
bassiana PARA EL CONTROL DE D. neivai EN CONDICIONES
SEMICONTROLADAS DE CAMPO.
72
6.7.1. Porcentaje de mortalidad en cada uno de los tratamientos. 72
7. CONCLUSIONES 74
8. RECOMENDACIONES 76
BIBLIOGRAFÍA 77
ANEXOS 96
INDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Datos específicos de los aislamientos seleccionados para el
control del raspador del fruto de la palma de aceite D. neivai. Fuente:
Campo Experimental Palmar de La Vizcaína.
30
Tabla 2. Lista de excipientes con su respectivo código para la identificación
en cada una de las pruebas de caracterización física.
36
Tabla 3. Relación y mezclas de los diferentes diluentes para el desarrollo
de prototipos, descripción y codificación.
41
Tabla 4. Listado de prototipos de formulación para B. bassiana en el
control del raspador del fruto.
43
Tabla 5. Concentración de conidias de cada uno de los prototipos de
formulación evaluados.
44
Tabla 6. Probabilidad de mortalidad de insectos adultos de D. neivai de
acuerdo a la concentración letal media de cepas aisladas de B. bassiana y
M. anisopliae.
49
Tabla 7. Resumen de los datos de la caracterización física de los
excipientes evaluados para el diseño de un prototipo de formulación de
hongos entomopatógenos.
61
INDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Microfotografía electrónica de barrido SEM. Aspecto morfológico
del raspador del fruto D. neivai en estado adulto (Martínez y Valencia,
2008). Foto: Luis Carlos Martínez, 2007.
9
Figura 2. Captura y mantenimiento de colonias de adultos de D. neivai
sobre lotes comerciales de palma de aceite. Foto: Luis Carlos Martínez,
2007.
28
Figura 3. Producción de conidias de cada uno de los aislamientos
seleccionados para el control del raspador del fruto de la palma de aceite D.
neivai. Foto: Luis Carlos Martínez, 2007.
31
Figura 4. Producción artesanal hongos entomopatógenos: esporulación B.
bassiana a 15 días de siembra en medio líquido. Foto: Luis Carlos Martínez,
2007.
35
Figura 5. Línea de regresión entre los valores probitos o mortalidad Probit
por el logaritmo de las concentraciones de M. anisopliae (M003) sobre D.
neivai.
48
Figura 6. Línea de regresión entre los valores probitos o mortalidad Probit
por el logaritmo de las concentraciones de B. bassiana (B018) sobre D. 48
neivai.
Figura 7. Línea de regresión entre los valores probitos o mortalidad Probit
por el logaritmo de las concentraciones de B. bassiana (B025) sobre D.
neivai.
49
Figura 8. Esporulación de hongos entomopatógenos sobre D. neivai
después de periodos de incubación en cámaras húmedas. Aislamientos de
izquierda a derecha: M. anisopliae M003, B. bassina B018 y B025. Foto:
Luis Carlos Martínez, 2007.
51
Figura 9. Resultados del tiempo letal de los tres aislamientos de hongos
entomopatógenos evaluados sobre adultos de D. neivai.
52
Figura 10. Efecto en la disminución del número de conidias de los
aislamientos B025 y B018 para el control de D. neivai.
54
Figura 11. Adherencia de conidias de B. bassiana de los aislamientos
B025 y B018 en diferentes estructuras morfológicas del D. neivai.
55
Figura 12. Fotografía de las conidias de B. bassiana B025 adheridas en el
integumento del raspador del fruto D. neivai. Foto: Luis Carlos Martínez,
2007.
57
Figura 13. Fotografía de las conidias de B. bassiana adheridas en el
pronoto y escutelo del raspador del fruto D. neivai. Foto: Luis Carlos
Martínez, 2007.
57
Figura 14. Fotografía de las conidias de B. bassiana adheridas en el plato
genital masculino del raspador del fruto D. neivai. Fotos: Luis Carlos 58
Martínez, 2007.
Figura 15. Fotografía de las conidias de B. bassiana adheridas en la
cabeza del raspador del fruto D. neivai. Foto: Luis Carlos Martínez, 2007.
58
Figura 16. Fotografía de las conidias de B. bassiana adheridas en el
abdomen del raspador del fruto D. neivai. Fotos: Luis Carlos Martínez,
2007.
59
Figura 17. Análisis de los fotoprotectores. Porcentaje de conidias
germinadas durante las diferentes concentraciones y tiempos de
exposición a rayos ultravioleta de cada tratamiento.
64
Figura 18. Resultados prueba de fluidez, resumen de pruebas de
comparación Tukey en los prototipos desarrollados.
66
Figura 19. Resultados prueba de voluminosidad, resumen de pruebas de
comparación Tukey en los prototipos desarrollados.
67
Figura 20. Media de cada porcentaje mortalidad del raspador del fruto
obtenida en cada uno de los prototipos de formulados de B. bassiana.
Tratamiento T5 que corresponde al prototipo 4 FP 1 % (25:75) gel 10%;
tratamiento T4 Prototipo 3 FP 1 % (25:75) gel 5%; tratamiento T3 Prototipo
2 FP 1 % (25:75) alm 10% 89; tratamiento T2 Prototipo 1 FP 1 % (25:75)
alm 5%.
69
Figura 21. Sobrevivencia de adultos del raspador del fruto en días bajo
diferentes prototipos de formulados de B. bassiana.
70
Figura 22. Media de cada porcentaje mortalidad del raspador del fruto 71
obtenida en cada unos de los prototipos de formulados sin el hongo
entomopatógeno.
Figura 23. Datos de mortalidad del raspador del fruto obtenida en las
aplicaciones sobre racimos en lotes comerciales de palma de aceite
Oleaginosas Bucarelia S. A: T1, testigo; T2 hongo entomopatógeno sin
formular, T3 hongo entomopatógeno formulado.
73
INDICE DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Análisis estadístico: pruebas de fluidez Análisis de varianza,
diseño completamente al azar. 96
Anexo 2. Análisis estadístico: pruebas de voluminosidad. Análisis de
varianza, diseño completamente al azar.
97
Anexo 3. Análisis de varianza del porcentaje de mortalidad obtenida en
cada unos de los prototipos de formulados de B. bassiana. Diseño
completamente al azar.
98
Anexo 4. Análisis de varianza del porcentaje de mortalidad obtenida en
cada unos de los prototipos de formulados sin la adición del hongo
entomopatógeno. Diseño completamente al azar.
99
Anexo 5. Análisis de varianza del porcentaje de mortalidad obtenida en
cada unos de los tratamientos evaluados en Oleaginosas Bucarelia S. A.
Diseño completamente al azar.
100
GLOSARIO
ESCUTELO: esclerito situado dorsalmente bajo el pronoto y entre los élitros.
PROGNATA: cabeza con piezas bucales dirigidas hacia delante.
OJOS DICÓPTICOS: ojos bien separados.
ANTENÓMEROS: cada uno de los segmentos antenales.
SUTURA EPISTOMAL: sutura que divide el clípeo del labro.
ESCLERITO: cada una de las divisiones que forma el integumento del insecto.
PALPÓMEROS: segmentos de los palpos maxilares o labiales.
PROESTERNÓN: esternón situado en el protórax del insecto.
MESOESTERNÓN: esternón situado en el mesotórax del insecto.
METAFÉMUR: fémur de la pata posterior.
TARSÓMEROS: tarsos.
SEUDOTRÍMEROS: tarsos divididos en dos áreas completamente diferenciadas.
PREFACIO
Con el desarrollo de nuevos métodos del control de insectos, la agricultura ha
girado conceptualmente para que el manejo integrado de plagas se implemente
no solo como una herramienta más en los sistemas agrícolas sino también a que
sus métodos se conviertan exitosos, prácticos y de valor agregado. Las
diferencias en la producción de las distintas plantaciones de palma de aceite en el
país es producto de muchos factores bióticos y abióticos. Entre estos factores y
de mayor peso, es la presencia de poblaciones de insectos que se convierten en
plagas como es el caso del raspador del fruto de la palma de aceite Demotispa
neivai Bondar y requieren de investigación para llegar a su manejo sostenible.
Tengo por seguro que esta contribución sobre el control biológico de D. neivai con
un prototipo de formulación de hongos entomopatógenos alentará futuras
investigaciones de mayor envergadura y colaborará en el desarrollo técnico-
científico, con beneficio para el sector palmicultor. Esto generará un impacto en
la reducción de agroquímicos y de sus efectos contaminantes, así como en
establecer nuevos métodos que contribuyan a la sostenibilidad del cultivo, en
implementar un control alterno para la reducción de las poblaciones de insectos
plaga y favorecer el equilibrio natural del agrosistema de la palma de aceite. Se
trata aquí de promover el uso de enemigos naturales, con métodos y estrategias
tan antiguos como las especies que lo emplean en su depredación y parasitismo,
microorganismos o agentes infecciosos que producen enfermedades presentes
en los insectos, desde que las especies en su marco evolutivo existen.
El autor.
RESUMEN
Entre los factores que limita la producción en el cultivo de la palma de aceite se
encuentra el insecto Demotispa neivai Bondar, el cual ocasiona daños hasta de
un 100% en su superficie. Durante el desarrollo de un prototipo de formulación
con hongos entomopatógenos para el manejo de D. neivai fue necesario evaluar
la patogenicidad de tres aislamientos de hongos entomopatógenos en adultos del
insecto, utilizando como inóculo dos cepas de Beauveria bassiana (B018, B025),
y una de Metarhizium anisopliae (M003), procedentes del Banco de
Entomopatógenos de Cenipalma BEC. Se determinó la concentración letal media
CL50 y tiempo letal TL50 de cada aislamiento así la adherencia e hidrofobicidad; se
desarrollaron cuatro prototipos de formulados a partir de mezclas de diferentes
excipientes determinando la mortalidad durante 15 días de evaluación. De acuerdo
con los resultados, el aislamiento B025 presentó altos porcentajes de mortalidad
durante en las concentraciones más altas; Testigo: 0%; 101: 4%; 103: 8.66%; 105:
8.66%; 107; 12%, 109: 73.33%. El TL50 para B. bassiana B025 se alcanzó a los
11 días de evaluación. Los resultados de las pruebas de adherencia mostraron
que las conidias del aislamiento B025 sobre varias estructuras del integumento del
insecto fue mayor en el escutelo y abdomen; así como su capacidad hidrofóbica
en la fase acuosa. De formulados, el tratamiento T5 obtuvo una mortalidad del
94.16 %, seguida del T4 con un 90.83%; T3 con 89.16% y T2 alcanzó el 85% de
mortalidad sobre adultos del insecto. Los resultados permitieron concluir que B.
bassiana actúa efectivamente con la adición de un prototipo de formulación.
Palabras clave: Demotispa neivai, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae,
palma de aceite, formulación, control biológico.
SUMMARY
Among the factors limiting production in the cultivation of palm oil is the insect
Demotispa neivai Bondar, which causes damage up to 100% on its surface. During
the development of a prototype formulation with entomopathogenic fungi for
management of D. neivai was necessary to evaluate the pathogenicity of three
isolates of entomopathogenic fungi in insect adults, using as inoculum two strains
of Beauveria bassiana (B018, B025) and one of Metarhizium anisopliae (M003)
from the Bank of Entomopathogenic of Cenipalma BEC. We determined the LC50
median lethal concentration and lethal time of each strain LT50 and the adherence
and hydrophobicity, were developed four prototype made from mixtures of different
excipients determining mortality during 15 days of evaluation. According to the
results, the isolation B025 showed high rates of mortality in higher concentrations;
Witness: 0% 101 4% 103: 8.66% 105: 8.66% 107 12% 109: 73.33% . The LT50 for
B. B025 bassiana was reached at 11 days of evaluation. The results of adhesion
tests showed that the conidia of the insulation B025 on various structures of the
integument of the insect was greater in the scutellum and abdomen, as well as
hydrophobic capacity in the aqueous phase. De made, treatment T5 was a
mortality rate of 94.16%, followed by a 90.83% T4, T3 and T2 with 89.16% to 85%
mortality of adults of the insect. The results concluded that B. bassiana works
effectively with the addition of a prototype formulation.
Keywords: Demotispa neivai, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, palm
oil, formulation, biological control.
1. INTRODUCCIÓN
El Manejo Integrado de Plagas MIP viene impulsando en diversas maneras, la
utilización de métodos alternativos al uso de insecticidas, con la finalidad de
reducir los costos de producción y la contaminación ambiental (Altieri y Nicholls,
2000). El uso de Agentes de Control Biológico, ACB representa una alternativa
importante y compatible como estrategia de manejo de plagas. En el cultivo de
palma de aceite (Elaeis guineensis Jacquin) se ha difundido con cierta rapidez
porque facilita la evaluación y el manejo de ciertos insectos de importancia
económica. En muchas plantaciones la tendencia es reducir o eliminar el control
químico y adoptar prácticas ambientalmente más efectivas (Calvache, 1993). Por
ejemplo, el favorecimiento del control biológico (hongos entomopatógenos o
insectos depredadores, entre otros), la siembra de especies vegetales nectaríferas
que atraen insectos benéficos e incrementan el control natural de plagas y el
empleo de trampas con feromonas o atrayentes vegetales para la captura de
insectos adultos (Aldana et al., 2005).
El control biológico es una estrategia de gran importancia ecológica y
económicamente viable, ya que contribuye a la disminución del uso de productos
insecticidas altamente tóxicos al medio ambiente y a la reducción de costos de
producción a largo plazo (Uribe et al., 1997). La eficiencia de los ACB en el
manejo de plagas depende del conocimiento de la biología del hospedero, del
ambiente en el cual se aplican y de los mecanismos de interacción de estos con el
hospedero. El uso de hongos entomopatógenos se ha convertido en diferentes
plantaciones de palma de aceite en el país en un método efectivo y alternativo
(Valencia y Benítez, 2004). Los numerosos aislamientos de diversas especies de
hongos que afectan a insectos del cultivo de palma de aceite ofrecen amplias
posibilidades de uso en la regulación de sus poblaciones. En este sentido, es
necesario desarrollar un conocimiento regional sobre la patogenicidad de estos
que permita su selección e incorporación en programas de Manejo Integrado de
Plagas (Calvache, 1993).
Una de las plagas consideradas de mayor importancia económica en el cultivo de
palma de aceite es el raspador del fruto Demotispa neivai Bondar 1940. Su
importancia económica tiene que ver con el daño causado por el raspado que
hace en los frutos, las cuales toman una apariencia corchosa y grisácea e
impiden una buena valoración del grado de madurez del racimo, generando
pérdidas económicas en las diferentes plantaciones de palma de aceite de la Zona
Central Palmera. Sus pérdidas se estiman hasta un 7% sobre la tasa de
extracción de aceite en mesocarpio seco (Valencia y Benítez, 2004). Se han
encontrado insectos de D. neivai en estado de larva y adulto infectados por
hongos en condiciones de campo, especialmente de los géneros Beauveria,
Metarhizium e Hirsutella (Valencia y Benítez, 2004).
Para utilizar estos hongos entomopatógenos en programas de Manejo Integrado
de Plagas es necesario que se produzcan grandes cantidades de conidios, los
cuales deben mantener su capacidad infectiva por un período de tiempo
considerable. Esto implica una amplia investigación donde se involucran
disciplinas como la patología, ecología, entomología, genética, fisiología,
producción masiva, formulación y estrategias de aplicación (Butt et al., 2001).
Formular un hongo entomopatógeno consiste en colocar sus conidios en
determinados compuestos que mejoran su desempeño en el campo, facilitando su
manejo, aplicación y permita su almacenamiento en condiciones que disminuyen
el costo, con una pérdida mínima de las cualidades del producto (Batista et al.,
1998) Una buena formulación es la base para el éxito de un bioplaguicida de
origen microbiano; la posibilidad de obtener productos adecuados depende de las
propias características del microorganismo y su relación con los componentes
excipientes y el ambiente de almacenamiento (Tanzini et al., 2001).
Esta investigación se realizó a partir de la selección de aislamientos de hongos
entomopatógenos de los géneros Beauveria y Metarhizium que han sido
encontradas en campo y afectan diferentes insectos de importancia económica en
el cultivo de palma de aceite. Para lograrlo, fue necesario conocer la
patogenicidad de los aislamientos sobre D. neivai, la adherencia e hidrofobicidad
de los conidios a la cutícula del insecto y su capacidad de multiplicarse
masivamente. Los resultados permitieron la incorporación de esta estrategia de
control biológico pensando en un prototipo de formulación, mejorando la
capacidad patogénica del hongo entomopatógeno y permitiendo su aplicación
directa al insecto o a al racimo de palma con equipos de ultrabajo volumen,
utilizados comúnmente en plantaciones. Con los resultados de este proyecto se
fortaleció las capacidades regionales en la aplicación de nuevas alternativas de
control, permitiendo entregar a la comunidad del sector palmero un producto
bioinsecticida efectivo.
2. JUSTIFICACIÓN
Actualmente el cultivo de palma de aceite en Colombia ocupa el tercer lugar de
área sembrada en el país y el primer lugar en América Latina y el cuarto a nivel
mundial; se encuentra ubicado en los departamentos de Caquetá, Casanare,
Cundinamarca, Meta, Magdalena, Cesar, Santander, Norte de Santander y Nariño
principalmente que se agrupan en cuatro zonas palmeras (Norte, Central,
Occidental y Oriental), cubriendo un área total sembrada de 243.037 hectáreas
(Fedepalma, 2007). Se conocen unidades productivas con cifras entre 5 y 6
toneladas de aceite por ha/año, lo que supera promedios de países como Malasia
e Indonesia y Nigeria, en su orden, los tres productores mundiales de aceite de
palma de aceite, palmiste y otros subproductos. En cuanto a los rendimientos de
aceite/ha/año, Colombia tiene un promedio (ponderado por regiones) de 3.5
t/ha/año, cercano al de Malasia que es de 3.68 t/ha/año e Indonesia de 3.48
t/ha/año (Fedepalma, 2007).
Una de las plagas consideradas de mayor importancia económica en las
diferentes zonas palmeras es el insecto Demotispa neivai Bondar (Coleoptera:
Chrysomelidae: Cassidinae) conocido comúnmente como el raspador del fruto de
la palma de aceite (Martínez y Valencia, 2008). Se ha convertido en uno de los
principales fitófagos del cultivo y su importancia económica tiene que ver con el
daño causado por el raspado que hace en los frutos, las cuales toma una
apariencia corchosa y grisácea (Genty et al., 1978). Además, el daño causado por
el insecto impide una buena valoración del grado de madurez del racimo lo que
conduce a malas cosechas, generando pérdidas económicas en las diferentes
plantaciones de palma de aceite de la zona central palmera. Las pérdidas en
producción por el daño del insecto se estiman hasta un 7% sobre la tasa de
extracción de aceite en mesocarpio seco, lo que se traduce a un valor de
20.000.000 millones de pesos que dejan de obtener las plantas de beneficio
anualmente (Valencia y Benítez, 2004).
Dentro de los posibles controladores naturales para D. neivai se han reportado un
parasitoide micro himenóptero de la familia Eulophidae del género Tetrastichus
(Aldana et al., 2004); depredadores como Hololepta sp. (Coleoptera: Histeridae),
ninfas y adultos de Alcaeorrynchus grandis (Hemiptera: Pentatomidae) y algunos
géneros de hormigas (Hymenoptera: Formicidae) como Crematogaster,
Camponotus y Odontomachus (Aldana et al., 2003). Existen evidencias de
algunos especímenes de D. neivai que han sido infectados por hongos de los
géneros Beauveria y Metarhizium en condiciones de campo; por lo tanto, se han
realizado evaluaciones para establecer y aislar preliminarmente cada una de estas
cepas como una herramienta biológica eficaz en el manejo de estas poblaciones
de insectos plaga del cultivo de palma de aceite (Valencia y Benítez, 2004).
Debido a todo esto, y dada la importancia que el insecto ha adquirido en el
proceso productivo del cultivo de la palma de aceite se han enfocado estudios
para buscar ciertas estrategias que puedan ser utilizadas en su control. En esta
investigación se evaluaron los diferentes aislamientos de hongos
entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae previamente
seleccionados del Banco de Entomopatógenos del Centro de Investigación en
Palma de Aceite Cenipalma, para determinar el posible uso de estos
microorganismos como controladores biológicos y lograr una mayor eficiencia en
la reducción de las poblaciones de este insecto plaga. La finalidad de esta
investigación fue establecer un método alterno de control diferente al químico con
un prototipo de formulación, procurando no alterar la entomofauna benéfica
presente en el área de la corona de la palma, específicamente sobre los insectos
polinizadores.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Desarrollar un prototipo de formulación con hongos entomopatógenos para el
manejo del raspador del fruto de la palma de aceite Demotispa neivai Bondar
(Coleoptera: Chrysomelidae: Cassidinae).
3.2. Objetivos específicos
Determinar la concentración letal media CL50 y tiempo letal TL50 para cada uno de
los aislamientos más activos contra D. neivai.
Evaluar la adherencia e hidrofobicidad de las conidias de los hongos
entomopatógenos sobre la cutícula del D. neivai.
Caracterizar físicamente los diferentes vehículos y coadyuvantes para la
formulación del hongo entomopatógeno seleccionado.
Determinar el efecto de los fotoprotectores físicos solares y sus combinaciones
sobre las conidias del hongo entomopatógeno seleccionado.
Determinar los prototipos de formulación a desarrollar del hongo entomopatógeno
seleccionado en condiciones de laboratorio y semicontroladas en campo.
4. MARCO TEÓRICO
4.1. EL RASPADOR DEL FRUTO Demotispa neivai Bondar.
El raspador del fruto de la palma de aceite Elaeis guineensis Jacq corresponde a
la especie Demotispa neivai Bondar, un coleóptero de la familia Chrysomelidae de
la subfamilia Cassidinae, sus larvas son exófagas y al igual que los adultos roen
los frutos de la palma de aceite. Presenta una amplia distribución en el continente,
en especial en países donde existen plantaciones de palma de aceite como Costa
Rica, Guatemala, Panamá, Colombia, Venezuela, Brasil, Surinam y Ecuador.
Actualmente se encuentra reportado en todas las zonas palmeras del país siendo
la zona central la más afectada, sin tener registro alguno del daño en las otras
zonas (Martínez y Valencia, 2008).
4.1.1. Ubicación taxonómica. El raspador del fruto inicialmente fue reconocido
como un crisomélido de la subfamilia Hispinae, pero este taxón presenta confusión
en la agrupación de sus géneros debido a las múltiples propuestas filogenéticas
expuestas por varios taxónomos (Hincks, 1952). La subfamilia Hispinae está
emparentada con la subfamilia Cassidinae y sus características morfológicas son
semejantes como ocurre en el género Imatidium donde ha sido clasificado
contemporáneamente en ambas subfamilias presentado sinonimias entre muchas
de sus especies (Seeno y Wilcox, 1982). El insecto pertenece al filo Artrhopoda y
la clase Insecta. El orden es Coleoptera de la familia Chrysomelidae; subfamilia
Cassidinae, también conocidos como escarabajos tortugas (Staines, 2002). Se
ubica en la tribu Imatidiini y esta presenta diversos géneros como Aslamidium,
Calliaspis, Demotispa, Imatidium, Paraimatidium, Pseudostilpnaspis, Spaethaspis
y Stilpnaspis (Borowiec y Moragues, 2005). El género Demotispa comprende
alrededor de 40 especies en todo el mundo y presenta mayor abundancia de
especie en América; dos de ellas se reportan para Colombia (D. neivai Bondar y
D. elaeicola Aslam) como especies fitófagas en palmas de diferentes especies
(Martínez y Valencia, 2008).
4.1.2. Morfología. Los huevos presentan una coloración crema, son ovalados y
tienen una longitud promedio de 1.5 mm. Su número se reduce en la medida en
que el racimo crece (Cataño, 2003). Las larvas son exófagas, aplanadas, raspan
tejidos vegetales y presentan procesos torácicos con un furci apical (Medvedev y
Voronova, 1977). Son ovaladas, de color violeta pálida y sus patas son cortas, no
visibles dorsalmente. Las larvas están situadas sobre los frutos de los racimos
verdes. La pupa es de tipo exarata, localizadas en la superficie de los frutos
(Genty et al., 1978). El cuerpo de color rojizo-marrón o levemente amarillo-rojizo,
ovalado dorsalmente, aplanado y convexo lateralmente; cabeza pequeña, palpos
maxilares con segmentos casi iguales en longitud, bases de las antenas
separadas ampliamente por un quilla en la frente, ojos que resaltan levemente,
pronoto con márgenes laterales curvados, escutelo pentagonal y élitros ovales
cubriendo casi todo el abdomen (Figura 1); abdomen con cuatro esternitos
visibles (Martínez y Valencia, 2008).
Cabeza de tipo prognata; ojos dicópticos dirigidos fronto-lateralmente; vértex
corto y presencia de una quilla en la frente que separa las dos antenas; antena
largas, filiformes de 11 segmentos, del 1-6 antenómeros con coloración amarillo-
rojizo y del 7-11 antenómeros de color negro, cada antenómero separado por un
espacio plano; antenómero III más largo que los demás y antenómero XI casi
igual en longitud con respecto a los otros; clípeo y labro ovalados separados por
una sutura epistomal, mandíbulas fuertemente desarrolladas, situadas fronto-
lateralmente con respecto al foramen mágnum, palpo labial y palpo maxilar
visibles con palpómeros de igual longitud; gula larga y ensanchada (Martínez y
Valencia, 2008).
Figura 1. Microfotografía electrónica de barrido SEM. Aspecto morfológico del raspador del fruto D. neivai en estado adulto (Martínez y Valencia, 2008). Foto: L. C. Martínez, 2007.
El tórax presenta el pronoto más ancho que largo, de color rojizo y/o amarillo con
perforaciones en su margen lateral; escutelo pentagonal; élitros 4 veces mas
largo que el pronoto con forma semi-ovalados, convexos y con margen lateral
ampliamente expandida, presencia de punturas o perforaciones en los élitros
situadas en 10 filas, vistas desde su base hasta la parte caudal; proesternón y
mesoesternón estrechos; fémur aplanado, prefémur ancho es más corto en
relación al meso y metafémur; tibia aplanada, similar en tamaño a la mesotibia,
con muchas setas; presencia de tres tarsómeros de menor tamaño que la tibia, el
último con seudotrímeros, uñas bilobadas. El abdomen es semi-ovalado de color
café claro, visible 4 uroesternitos visibles ventralmente. Machos con placa genital
situada en la parte caudal y dirigida ventralmente y hembras con placa genital
dirigida hacia atrás (Martínez y Valencia, 2008).
El dimorfismo sexual de D. neivai es bien marcado. El largo del cuerpo de los
machos es de 5.4 mm en promedio siendo menor el de las hembras con 5.3 mm
aproximadamente. Las hembras presentan mayor longitud a lo ancho con un
promedio de 3.2 mm y los machos 2.7 mm. Las antenas presentan gran diferencia
en longitud. Los machos presentan antenas más largas con 2.34 mm en promedio
mientras que las hembras presentan un longitud de 2.04 mm. El escutelo es otra
estructura de mayor longitud en los machos con 1.43 mm mientras que en las
hembras presentan una longitud de 1.28 mm. Los machos tienen menor longitud
en las patas que son de 2.3 mm y 2.61 mm mientras que las hembras
ligeramente tienen una longitud de 2.37 mm y 2.85 mm (Martínez y Valencia,
2008).
4.1.3. Ciclo de vida. Las posturas son colocadas en su mayoría en el tercio
inferior de los racimos, rara vez en la parte superficial. Las hembras ovipositan en
la base de las espigas, exactamente en las brácteas de los frutos internos. El
estado de huevo dura entre 7 a 9 días aproximadamente (Cataño, 2003). La larva
permanece en la parte más profunda del racimo, en donde se alimentan de las
brácteas de los frutos internos y de la parte carnosa de la espata, en el área que
rodea el pedúnculo del racimo. Se ha encontrado que los estados inmaduros viven
en promedio entre 51 y 53 días. La larva dura 22.1 días y pasa por 5 instares: 1er
instar 3.5 días, 2do instar 4.0 días, 3er instar 4.7 días, 4to instar 4.6 días y 5to
instar 21.1 días a 28°C y con humedad relativa pr omedio del 80%(Cataño, 2003).
El estado de pupa dura 44.4 días aproximadamente. Los adultos llegan a los
racimos una vez se rompe la espata que los cubre e inician la oviposición en las
espigas más internas del nuevo racimo. Se ha podido establecer que en siembras
nuevas la actividad diaria del insecto se inicia entre las 16:00 y las 08:00 horas
del día siguiente, donde se puede observar a los adultos caminar, copular y
reproducirse sobre los frutos. Su mayor actividad es a las 19:30 horas. En horas
de la noche se les puede observar en los frutos externos de los racimos medianos
y grandes (Aldana et al., 2003).
4.1.4. Daño en el cultivo de palma de aceite. Se ha observado entre las 4:30 y
las 5:00 p.m. al insecto volando hacia palmas vecinas, por lo general, se dirigen a
éstas cuando las inflorescencias se encuentran en antesis. El daño en los frutos
se observa desde la primera semana de formación de los racimo. Los insectos,
tanto larvas como adultos, raspan los frutos verdes causándole un secamiento
artificial. El daño avanza hasta donde las brácteas cubren parcialmente los frutos
siendo éstas las que delimitan el área con o sin daño (Aldana et al., 2004). El
consumo de D. neivai es de forma fraccionada, raspan y descansan, no
necesariamente raspan en un solo fruto y pueden hacerlo en pequeñas
cantidades. El área consumida por un insecto una sola noche puede ser de 1.5 a
2 cm2 de superficie de fruto (Aldana et al., 2004). Evaluaciones preliminares
indican que estas raspaduras pueden ocasionar la reducción de hasta siete puntos
en la relación del porcentaje de aceite/mesocarpio de frutos externos del racimo,
cuando el daño es del 100% de la superficie del racimo (Valencia y Benítez, 2004).
4.1.5. Medidas de control. Se han evaluado diferentes alternativas en el control
microbiológico como el uso de hongos entomopatógenos de los géneros
Paecilomyces, Beauveria y Metarhizium; el uso del nematodo Steinernema
carpocapsae Weisner (Rhabditida: Steinermatidae) y de la bacteria Bacillus
thuringiensis (Bacteria: Bacillaceae) variedad tenebrionis (Cenipalma 1992). Un
producto a base de ácido ascórbico de origen natural extraído de jugos, pulpas y
semillas de cítricos en combinación con glicerina se ha utilizado sobre los racimos
de la palma siendo mucho más significativo en la reducción del daño con
respectos a los anteriores, aunque se desconocen los costos económicos y
ambientales que implican el uso de este producto (Martínez et al., 2008). Entre los
insectos depredadores de D. neivai se destacan depredadores como Hololepta
sp., Fabricius (Coleoptera: Histeridae) consumiendo larvas y pupas; varias
especies del género Chrysopa Leach (Neuroptera: Chrysopidae) ninfas de
Alcaeorrynchus grandis Dallas (Hemiptera: Pentatomidae) y algunas hormigas
(Hymenoptera: Formicidae) de los géneros Crematogaster, Camponotus y
Odontomachus (Aldana et al., 2003). Como parasitoides se han reportado avispas
del género Tetrastichus sp., Walker (Hymenoptera: Eulophidae) parasitando larvas
de último instar y pupas y algunos microhimenópteros de la familia Chalcididae
aún no reportados (Aldana et al., 2004). Se han encontrado insectos de D. neivai
en estado de larva y adulto infectados por hongos en condiciones de campo,
especialmente de los géneros Beauveria, Metarhizium e Hirsutella (Valencia y
Benítez, 2004).
4.2. GENERALIDADES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS.
El control biológico es una disciplina muy amplia basada en el principio natural en
que muchas especies de organismos se alimentan, viven y se reproducen sobre
otras, cuyas poblaciones son reguladas por las primeras en los diferentes
ecosistemas (Madrigal, 2001). Existe un grupo de organismos fungosos que son
patógenos obligados o facultativos de los insectos, conocidos como hongos
entomopatógenos. Su crecimiento y desarrollo está limitado principalmente por las
condiciones ambientales externas, en particular por la humedad, la radiación solar
y la temperatura, que determinan la adecuada esporulación y germinación de las
conidias (Tanada y Kaya, 1993). Los hongos son microorganismos eucariontes,
sin clorofila y pueden ser unicelulares o pluricelulares; son filamentosos y sus
paredes contienen quitina y/o celulosa; su reproducción es sexual o asexual (con
o sin conidias); las conidias se originan a partir de los conidióforos y se diseminan
por el viento, el agua y otros agentes (Kuno et al., 1982). Son considerados como
los patógenos más promisorios contra insectos, ya que pueden infectarlos
directamente a través de la penetración de la cutícula y poseen múltiples
mecanismos de acción que les confieren una alta capacidad para evitar que el
hospedero desarrolle resistencia (Hayek y Leger, 1994).
4.2.1. Clasificación de los hongos entomopatógenos. Los hongos
entomopatógenos infectan individuos en todos los órdenes de insectos, en su
mayoría al orden Hemiptera, Diptera, Coleoptera, Lepidoptera, Hymenoptera y
Orthoptera (Ferron, 1978). Los estados inmaduros (ninfas y larvas) son más a
menudo infectados por los hongos que en adultos, mientras que los estados de
huevo y pupa no son frecuentemente infectados. La mayoría de estos hongos son
patógenos obligados o facultativos que causan en el insecto enfermedades
denominadas micosis (Tanada y Kaya, 1993). Los hongos entomopatógenos se
encuentran clasificados taxonómicamente en el phylum Ascomycota, subphylum
Pezizomycotina de la clase Sordariomycetes, subclase Hipocreomycetidae
(Rehner y Buckley, 2005). Pertenecen al orden Hypocreales de la familia
Clavicipitaceae (Hawksworth et al., 1983) donde ejercen un papel muy importante
en la reducción natural de poblaciones de insectos y ácaros fitófagos en la
agricultura, silvicultura y otros agroecosistemas (Humber, 1989). La familia
Clavipitaceae presenta un elevado grado de adaptabilidad expresado por sus
características patológicas, biológicas, genéticas y ecológicas, manifestando su
gran variabilidad de formas y estructuras entre los diferentes géneros y especies
existentes (Humber, 1981). Se conocen más de 100 géneros y 700 especies,
entre los más importantes se destacan Beauveria, Metarhizium, Entomophthora,
Aschersonia, Fusarium, Hirsutella, Paecilomyces y Lecanicillium siendo estos los
de mayor importancia en el control biológico por la susceptibilidad en los insectos
plaga y por su fácil multiplicación (Monzón, 2001).
4.2.2. Uso de hongos entomopatógenos en cultivo de palma de aceite. Los
hongos capaces de causar enfermedades en insectos plaga son de gran
abundancia en Colombia y son considerados importantes reguladores de
poblaciones de plagas en forma natural (Rodríguez, 1992). A diferencias de las
bacterias y virus entomopatógenos, estos no requieren ser ingeridos para infectar
a su hospedero ya que su mecanismo de acción es la penetración directa a través
del integumento del insecto, además de poseer un amplio rango de hospederos y
de infectar diferentes estados de crecimiento y desarrollo (Ferron, 1978). En el
país, como resultado de diferentes investigaciones realizadas en insectos plaga de
la palma de aceite se han encontrado diversas especies de hongos como
Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin que afecta larvas de Stenoma
impressella Meyrick (Lepidoptera: Elachistidae), Loxotoma elegans Zeller
(Lepidoptera: Elachistidae), Opsiphanes cassina Felder (Lepidoptera:
Nymphalidae), Brassolis sophorae L. (Lepidoptera: Nymphalidae) y Anteotricha
sp. (Lepidoptera: Oecophoridae); B. brongniartii en larvas de L. elegans;
Beauveria poss., amorpha en larvas de L. elegans; Metarhizium anisopliae
(Metchnikoff) Sorokin en larvas de Sagalassa valida Walker (Lepidoptera:
Glyphipterigidae); Paecilomyces lilacinus (Thom) en larvas de Durrantia arcanella
Busck (Lepidoptera: Oecophoridae); Nomouraea rileyi a larvas de O. cassina;
Hirsutella thompsoni Fisher en adultos y estados inmaduros de Retracrus elaeis
(Acari: Tetranychidae) y Cordyceps sp., a larvas de Strategus aloeus L.
(Coleoptera: Scarabaeidae); (Calvache, 1993).
4.2.3. B. bassiana (Bálsamo) Vuillemin como agente de control. El género
Beauveria está compuesto por varias especies como B. bassiana, B. brongniartii,
B. tenella, B. amorpha, B. velata, sin embargo, las más frecuentemente estudiadas
son B. bassiana (Bálsamo) Vuillemin y B. brongniartii (De Lacroix) Siemszko. El
género se caracteriza por presentar un micelio blanco, conidióforos sencillos,
irregularmente agrupados; conidias hialinas, redondeadas u ovoides y unicelulares
(Bustillo, 2001, 1997). B. bassiana ha sido ampliamente usado para el control de
insectos plaga de importancia económica en todo el mundo con resultados
significativos (Ming-Guang y Jhonson, 1990). En Colombia, su uso ha sido
enfatizado para controlar insectos plaga como la broca del café Hypothenemus
hampei Ferrari (Coleoptera: Curculionidae) (Bustillo et al., 1991), el barrenador de
la caña de azúcar Diatraea saccharalis Fabricius (Lepidoptera: Pyralidae) (Alves
et. al., 2002), el gusano blanco de la papa Premnotrypes vorax Hustache
(Coleoptera: Curculionidae) (Torres, 1996), el gusano cachón de la yuca Erinnyis
ello L. (Lepidoptera: Sphingidae) (Belloti et al., 1992), el triatomino Rhodnius
prolixus Stal (Hemiptera: Reduviidae) (Fargues y Luz, 1998) y la mosca blanca de
los invernaderos Trialeurodes vaporariorum Westwood (Hemiptera: Aleyrodidae)
(Garza y Arredondo, 1993). La patogenicidad y la habilidad de B. bassiana para
sobreponerse a los mecanismos de defensa de sus hospedadores se debe en
gran parte a la producción de un depsipéptido cíclico conocido como beauvericina
que es de alto peso molecular y soluble en agua (Roberts, 1981).
4.2.4. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin como agente de control. El género
Metarhizium presenta conidias alargadas, de color verde, producidas en forma
aglomerada a partir de fiálides; las conidias son ramificadas en forma simple, en
pares o verticilos, están en forma alineada formando una capa esporógena. La
pared celular de este hongo ofrece propiedades lipofílicas puesto que su capa
bilipídica está compuesta especialmente por ácidos grasos poli insaturados que
contienen de 16 a 18 carbonos (Griffin, 1981). M. anisopliae presenta un
crecimiento micelial que puede ser flojo o firme, con una apariencia acolchonada y
con estructuras conidiales. Las conidias están frecuentemente unidas formando la
estructura conocida como sinemata. La formación de esta sinemata se debe
probablemente a una necesidad ecológica para habitar sobre el hospedero ya que
no es muy frecuente su presencia cuando el hongo se cultiva en medios artificiales
(Griffin, 1981). Ha sido encontrado afectando a ninfas de Cyrtonemus bergi
Froeschner (Hemiptera: Cydnidae) (Sánchez y Bellotti, 1997) sobre adultos de
Hypothenemus hampei (González et al., 1993); sobre colonias de Atta cephalotes
L. (Hymenoptera: Formicidae) (López et al., 1999); en larvas de Premnotrypes
vorax (Torres y Cotes, 1999), en Metamasius hemipterus L., y Cosmopolites
sordidus Germar (Coleoptera: Curculionidae); además, se ha utilizado en el control
de la langosta llanera Rhammatocerus schistocercoides Rehn (Orthoptera:
Acrididae) (Villamizar et al., 1996). M. anisopliae var. Major ha sido aislado de
larvas de S. valida en palmas de Tumaco, además se ha encontrado afectando
larvas de O. cassina en el municipio de Puerto Wilches (Calvache, 2002).
4.2.5. Proceso infectivo de los hongos entomopatóg enos en los insectos. El
proceso infectivo de un hongo entomopatógeno ocurre bajo condiciones de
humedad y temperatura favorables al patógeno, pero si éstas no se dan, el hongo
producirá estructuras no infectivas llamadas conidias de reposo o de resistencia,
con paredes gruesas y abundantes sustancias de reserva, con las que sobrevivirá
frente a condiciones adversas impuestas por el medio (Méndez et al., 2001).
Cuando las condiciones climáticas son adecuadas, las conidias germinan y
producen conidias infectivas, dando inicio nuevamente al ciclo biológico del hongo.
Las limitaciones de los avances científicos y estudios aplicados están relacionados
con las dificultades de crecimiento en medios de cultivo artificial y con las
diferencias de cada género o especie (Humber, 1981).
4.2.5.1. Adherencia de la conidia a la cutícula de l insecto. El primer contacto
que hace las conidias con la superficie del hospedero es la cutícula. Las
características físicas y químicas de la superficie de la cutícula del insecto y la
conidia son las responsables de esta unión. Algunas glicoproteínas pueden servir
como un receptor específico para las conidias (Tanada y Kaya, 1993).
4.2.5.2. Germinación de la conidia. Es el proceso mediante el cual una conidia
emite uno o varios pequeños tubos germinales que por crecimiento y alargamiento
dan origen a las hifas (Volcy y Pardo, 1994). La germinación de las conidias en
gran parte depende de la humedad ambiental y temperatura y en menor grado de
las condiciones de luz o de su balance nutricional (Tanada y Kaya, 1993). El nivel
de agua es determinante en el crecimiento del hongo y pequeñas diferencias en
los niveles de humedad relativa después de la aplicación de conidias, pueden
determinar de un modo u otro el éxito del hongo en el control de insectos plaga
(Guilliespie, 1988). El resultado de la germinación y la penetración no depende
necesariamente del porcentaje total de germinación sino del tiempo de su
duración, modo, agresividad del hongo, el tipo de conidia y la susceptibilidad del
hospedero (Samson et al., 1988; Aylor y Sanogo, 1997).
4.2.5.3. Penetración al integumento del hospedero. La penetración a la cutícula
del insecto por conidias germinadas, ocurre como resultado de una combinación
entre la degradación enzimática de la cutícula y la presión mecánica por el tubo
germinal (Guilliespie, 1988). El modo de penetración principalmente depende de
las propiedades de la cutícula, grosor, esclerotización y la presencia de sustancias
antifúngicas y nutricionales (Charleyn, 1989). La fuerza mecánica es notable en el
extremo de una hifa invasiva donde la capa cuticular es deformada por presión
(Tanada y Kaya, 1993). Se produce un tubo germinativo y un apresorio, con éste
se fija en la cutícula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se
da la penetración al interior del cuerpo del insecto mediante presión mecánica.
En la penetración participa un mecanismo físico y uno químico, el primero consiste
en la presión ejercida por la estructura de penetración, la cual rompe las áreas
esclerosadas y membranosas de la cutícula. El segundo mecanismo es químico y
consiste en la acción enzimática, principalmente proteasas, lipasas y quitinasas,
las cuales causan degradación del tejido en la zona de penetración, lo que facilita
la penetración física (Monzón, 2001). Las enzimas descubiertas en el tubo
germinativo son proteasas, aminopeptidasas, lipasas, esterasas, y N-acetil-
glucosamidasa (quitinasas). Estudios in vitro indican que en la digestión del
integumento sigue una secuencia de lipasa-proteasa-quitinasa (Tanada y Kaya,
1993).
Los hongos B. bassiana, M. anisopliae, Paecilomyces spp., y L. lecanii, producen
grandes cantidades de proteasas y quitinasas en medios de cultivo líquido
(Guilliespie, 1988). En la producción de proteasa, lipasa y quitinasa sobre la
cutícula del insecto, se ha demostrado con M. anisopliae mediante coloración de
enzimas específicas, recuperadas de moscas previamente inoculadas con
conidias del hongo (Tanada y Kaya, 1993). En varios aislamientos de B. bassiana
y M. anisopliae la enzima principal es una endoproteasa que disuelve la proteína
matriz que cubre la quitina cuticular. Por lo tanto, la producción de quitinasa ocurre
después del proceso de infección y una vez que el hongo atraviesa la cutícula
debe vencer el sistema inmunológico del hospedero antes de entrar a la hemolinfa
y desarrollarse dentro del mismo (Guilliespie, 1988).
4.2.5.4. Penetración a través de cuerpos abiertos. Los hongos pueden infectar
insectos a través de la cavidad bucal, espiráculos y otras aberturas externas de un
insecto. Puesto que la humedad no es un problema en el tracto alimenticio, la
espora puede germinar rápido en este ambiente; por otra parte, los fluidos
digestivos pueden destruir la espora o la hifa germinativa. La digestión de
estructuras fúngicas puede causar la muerte por toxicidad más que por micosis
(Charleyn, 1989). Los hongos pueden infectar insectos a través de los espiráculos
y otros cuerpos abiertos, M. anisopliae ocasionalmente infecta larvas a través de
los espiráculos y poros de órganos de los sentidos B. bassiana infecta varias
especies de mosquitos a través del sifón; en Heliothis zea a través del espiráculo y
en el gorgojo de la alfalfa Hypera postica a través de la tráquea y no por la cutícula
del integumento. La región anal de las larvas del gusano de seda es más
frecuentemente infectada por el hongo Aspergillus flavus oryzae (Tanada y Kaya,
1993).
4.2.5.5. Crecimiento del hongo en el hemocele. Después de llegar al
hemocele, la mayoría de los hongos convierten el crecimiento micelial en una fase
de levadura o sea crecimiento por gemación. Se producen toxinas y enzimas,
aunque algunos hongos aparentemente no poseen toxinas, matan el insecto al
consumir todos los nutrientes o por física destrucción (Bustillo, 2001). Los hongos
pueden evitar la defensa inmune de un insecto por (1) desarrollo de protoplastos
que no son reconocidos por la población de hemocitos del insecto (2) formando
cuerpos hifales multiplicándose y dispersándose rápidamente (Samson et al.,
1988) y (3) produciendo micotoxinas (Tanada y kaya, 1993). Las toxinas causan la
muerte del insecto debido a la degeneración de los tejidos, producto de la pérdida
de la integridad estructural de las membranas seguido de la deshidratación de las
células por pérdida de fluido (Ferron, 1981).
Posterior al crecimiento del hongo en el hemocele, la micosis induce a síntomas
fisiológicos anormales en el insecto tales como convulsiones, carencia de
coordinación y comportamientos alterados. Ocurre una competencia entre el
hongo y la flora intestinal. En la mayoría de los casos los hongos producen
sustancias antibacteriales y cambio de color del cadáver (Ferron, 1981). Después
de muerto el insecto, si la disponibilidad de agua es alta los hongos emergen al
exterior a través de la cutícula y esporulan sobre el cadáver produciendo inóculo
para infectar a otros insectos. Si las condiciones no son favorables, queda dentro
del cadáver del insecto, donde puede sobrevivir por algunos meses y
eventualmente producirá conidias cuando lleguen las condiciones favorables. La
esporulación ocurre generalmente en cadáveres pero puede también ocurrir en
insectos vivos (Tanada y Kaya, 1993).
4.2.5.6. Producción de micotoxinas. En el proceso de multiplicación de los
hongos en el hemocele del insecto se producen toxinas que pueden matar al
insecto debido a sus propiedades insecticidas y además actúan como inhibidores
de las reacciones de defensa del hospedante por alteraciones de los hemocitos y
retardo en la agregación de las células de la hemolinfa (López, 1994). Entre las
principales toxinas producidas por los hongos entomopatógenos se destacan la
beauvericina, beauverolides, bassianolides, isarolides, ácido oxálico, destruxinas
a, b, c y d y Cytochalasinas (Castellanos, 1997).
4.2.5.7. Muerte del insecto. Posterior al crecimiento del hongo, la micosis induce
síntomas fisiológicos anormales en el insecto como convulsiones, carencia de
coordinación y comportamientos alterados. Ocurre una competencia entre el
hongo y la flora intestinal, se producen sustancias antibacteriales y cambios de
coloración en el insecto (Leucona, 1996). Los síntomas en la fase infectiva de una
larva enferma por hongos entomopatógenos son: pérdida de apetito, decoloración
del integumento, hinchazón, flacidez, falta de movilidad hasta la parálisis, muerte
y la momificación. Las larvas de lepidópteros y coleópteros que son afectadas en
los últimos estados de su desarrollo larval, empupan en actitud de defensa antes
de cumplir el ciclo (Ferron, 1981). Los adultos que se enferman pierden el apetito,
interrumpen la oviposición, pierden movilidad hasta la parálisis, la muerte y la
momificación. Los coleópteros adultos enfermos se retiran del lugar donde se
alimentan en actitud de protección de su especie. Este comportamiento lo
acompaña con una segregación de feromonas informantes que evitan que otros
adultos de su especie, lleguen al sitio a enfermarse. La finalización de esta fase
generalmente resulta en la muerte del insecto. Algunos de los insectos muertos
por causa de los hongos entomopatógenos manifiestan la miceliación y la
esporulación (Ferron, 1981).
4.2.5.8. Dispersión de las conidias. La dispersión de la espora puede ser un
proceso activo o pasivo y depende de las características de la conidia y el
esporangio, cada conidia puede adherirse o pasar de un invertebrado a otro por
dispersión (Tanada y Kaya, 1993). El integumento de los cadáveres aparece
recubierto por una masa fúngica miceliar constituida por conidióforos, los cuales
darán lugar en la región conidiogénica a nuevas conidias, secuenciando así el
ciclo biológico del hongo. La debilidad del insecto causada por la intoxicación
hace difícil su sostenimiento y generalmente caen de las plantas por la acción de
la lluvia y el viento (López, 1994).
4.2.6. Importancia de la actividad enzimática de l os hongos
entomopatógenos. El segundo mecanismo de penetración del hongo en la
cutícula de insecto es por acción enzimática, principalmente proteasas, lipasas y
quitinasas, las cuales causan degradación del tejido en la zona de penetración, lo
que facilita la penetración física (Monzón, 2001). Las enzimas descubiertas en el
tubo germinativo son proteasas, aminopeptidasas, lipasas, esterasas, y N-acetil-
glucosamidasa (quitinasas). Estudios in vitro indican que en la digestión del
integumento sigue una secuencia de lipasa-proteasa-quitinasa (Tanada y Kaya,
1993). Los hongos B. bassiana, M. anisopliae, Paecilomyces spp., y L. lecanii,
producen grandes cantidades de proteasas y quitinasas en medios de cultivo
líquido (Guillespie, 1988). En la producción de proteasa, lipasa y quitinasa sobre la
cutícula del insecto, se ha demostrado con M. anisopliae mediante coloración de
enzimas específicas, recuperadas de moscas previamente inoculadas con
conidias del hongo (Tanada y Kaya, 1993). En varios aislamientos de B. bassiana
y M. anisopliae la enzima principal es una endoproteasa que disuelve la proteína
matriz que cubre la quitina cuticular. Por lo tanto, la producción de quitinasa ocurre
después del proceso de infección y una vez que el hongo atraviesa la cutícula
debe vencer el sistema inmunológico del hospedero antes de entrar a la hemolinfa
y desarrollarse dentro del insecto (Guillespie, 1993).
Gran parte de los estudios relacionados con los hongos entomopatógenos se han
enfocado a la actividad de su metabolitos exocelulares como micotoxinas.
(Roberts, 1981). Las destruxinas son compuestos dispares, los cuales pueden
aparecer como isómeros estructuralmente similares, se compone básicamente de
cinco aminoácidos y un α-hidroxiácido, producen efectos antialimentarios y letales
en insectos (Rosas-Acevedo et al., 2003). Las efrapeptinas son inhibidores de
intercambio de proteínas a nivel intracelular, afectan a los insectos por sus efectos
antialimentarios y contienen propiedades inhibidoras de crecimiento. La
oosporina es una dibenzonquinona producida especialmente por hongos del
género Beauveria, presenta propiedades repelentes y antialimentarias en insectos
(Rosas-Acevedo et al., 2003) La beauvericina, bassianolida y beauveriolida son
enzimas que se originan de una hexapeptidasa aisladas de hongos de los géneros
Paecilomyces y Beauveria. Muestran actividad antibiótica y producen efectos
letales en insectos aún en bajas concentraciones (Rosas-Acevedo et al., 2003).
4.2.7. Factores que afectan la viabilidad de las co nidias. La humedad y la
temperatura son requeridas generalmente para la esporulación rápida y posterior
germinación de las conidias. La infección del insecto puede ser independiente de
la humedad ambiental siempre y cuando el insecto disponga en su superficie de
suficiente humedad. Esto conduciría a la suposición de que el fenómeno físico de
la capa límite del integumento del insecto, facilita la germinación de las conidias
aún si la atmósfera está completamente deshidratada (Ferron, 1978). El rango
de temperatura óptima para el crecimiento y esporulación de los hongos
entomopatógenos se encuentra entre 25 y 30°C y la h umedad relativa óptima es
del 94%. Sin embargo, el hongo es capaz de sobrevivir a una humedad relativa
del 45%. El crecimiento micelial puede ocurrir entre 10 y 30°C, siendo óptimo
entre 24 y 26°C. El punto termal de muerte oscila entre 55 y 60°C (Avila y Umaña,
1988). Las conidias de los hongos como los de la mayoría de microorganismos
pierden rápidamente su viabilidad al ser expuestos al sol que es una de las
principales fuentes de luz ultravioleta (Zimmermann 1982). Las conidias se ven
afectadas principalmente por longitudes de onda inferiores a 320 nm, radiación
que puede causar retardo en la germinación o muerte del conidio debido a
inducción de cambios en la división celular, la actividad enzimática, la
permeabilidad de la membrana, el transporte iónico y metabolismo de los fosfatos
(St. Lerger et al., 1992).
4.3. FORMULACIÓN DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS.
Los hongos que presentan un rango estrecho de hospederos son muy virulentos y
generalmente los más difíciles de cultivar, aún más las especies que presentan
fases parasíticas y saprofíticas en su ciclo de vida. En forma natural, los hongos
satisfacen ciertos requerimientos nutricionales por la digestión enzimática de sus
hospedadores (Heale et al., 1989). Estos requerimientos también pueden ser
suplementados en cantidades adecuadas en un medio de cultivo para lograr un
máximo de crecimiento y esporulación, aún cuando debe tenerse en cuenta que
estos requerimientos pueden ser diferentes para la obtención de biomasa miceliar,
por lo tanto las técnicas y procesos de producción más adecuados pueden variar
para diferentes especies de hongos (Kononova, 1981).
4.3.1. Características básicas de una formulación c omercial. Existen
problemas que hay que tener en cuenta, el mecanismo de acción mediante el cual
actúa el microorganismo, así como si su efecto se encuentra estrechamente
vinculado a condiciones ambientales, específicamente a condiciones de humedad,
temperatura, radiación solar, entre otros factores condicionantes (Samsinakova y
Kalova, 1981). En la selección del método de reproducción de hongos
entomopatógenos es importante tener en cuenta no sólo la factibilidad tecnológica
y económica, sino el mecanismo de acción ya que en el producto final deben estar
presentes las estructuras infectivas y los metabolitos activos de forma estable y
con su mayor potencial biológico (Bansal et al., 1988). Entre los aspectos a tener
en cuenta se encuentra la selección de la cepa adecuada, la selección de un
medio de cultivo con un balance nutricional que permita obtener un desarrollo del
hongo con el máximo potencial patogénico y con eficiencia económica, la
posibilidad tecnológica y económica de escalar el proceso a nivel de producción, la
formulación que permita periodos de almacenamiento prolongados, la facilidad de
aplicación y estabilidad en condiciones de campo y la estabilidad en el medio
ambiente, puede ser, incluso más importantes que la patogenicidad de la cepa en
condiciones de laboratorio (Taborsky, 1992; Batista et al. 1998).
Las formulaciones fúngicas, aún aquellas en las que se logran bajos porcentajes
de humedad necesitan ser conservadas en frío. Temperaturas superiores a 10 ºC
no garantizan la estabilidad de estos productos por más de tres meses, lo cual es
sin duda uno de los mayores inconvenientes para su producción a escala industrial
(Chet, 1987). El objetivo de una formulación es preparar una combinación de
ingredientes de forma tal que el principio activo se mantenga estable, efectivo y
fácil de aplicar. Una de las principales desventajas de los productos
microbiológicos para el control de plagas es el efecto negativo de las condiciones
ambientales, lo cual afecta su estabilidad y eficacia. Esta desventaja puede ser
resuelta en gran medida mediante la preparación de formulaciones para lo cual el
ingrediente activo una vez obtenido se mezcla con los diferentes componentes. El
desarrollo de una formulación a partir de microorganismos resulta similar a la de
un insecticida químico (Bateman et al., 1999, Devotto y Gerding 2003).
Las formulaciones básicas se agrupan en líquidas como suspensiones acuosas o
emulsificantes y sólidas como polvos para espolvoreo, polvos humedecibles,
cebos y granulados (Burgues y Hussey, 1971). En toda formulación se distinguen
tres tipos de componentes: (1) el principio activo (microorganismo y sus toxinas);
(2) el soporte o vehículo, que puede ser sólido o líquido y es un material inerte y
(3) los coadyuvantes, son inertes pero tienen función protectora, dispersante y
adherente, entre otras. Para mejorar la formulación es necesario obtener la
estabilidad física y biológica durante el almacenamiento, evitar la evaporación,
incrementar la cobertura y adherencia en el follaje, mejorar la dispersión, la
suspensibilidad, aumentar la resistencia a las condiciones ambientales (lluvia,
temperatura, radiación, etc.) y facilitar la aplicación (Hernández, 1996).
4.3.2. Formulaciones líquidas. Una de las alternativas liquidas es el desarrollo
de emulsiones, las cuales surgen de la mezcla de aceite, conidias e inertes, agua
y un emulsificador, dicha formulación permite la dispersión estable y homogénea
de glóbulos menores de 10 micras en el agua. Varios tipos de suspensiones con
aceite mineral se han empleado en las formulaciones de B. bassiana. Las
formulaciones oleosas se emplean frecuentemente para aplicaciones en UBV
(ultra bajo volumen), ya que evitan la evaporación hay una mejor adhesión y
dispersión de las conidias. El ingrediente activo (conidias) se mezcla con
productos comestibles o materiales inertes y se preparan como pequeñas esferas
o bloques que resultan atractivos para el insecto plaga. En caso de que no sea
necesario ingerirlos para su acción, estas formulaciones protegen las conidias de
condiciones adversas. Se ha usado el salvado de trigo con conidias de B.
bassiana, obteniéndose un incremento significativo en la mortalidad de insectos
(Hernández 1996, Morales 1993).
4.3.3. Formulaciones sólidas. La característica de los ingredientes para la
formulación como tal es utilizar un soporte sólido para diluir el principio activo en
formulaciones sólidas. Se emplean sales solubles en agua como cloruros,
carbonatos, sulfatos, fosfatos y se usan tierras inertes como talco, arcillas, caolín,
bentonita, silicato, zeolita, etc. También se utilizan los soportes líquidos, solubles o
emulsionables como el xileno, derivados del petróleo, ciclohexano, alcoholes,
aceites minerales, etc. Además, se utilizan los tensoactivos que son sustancias
que bajan la tensión superficial de los líquidos, favoreciendo la formación de
emulsiones y un mejor mojado y esparcimiento del principio activo, estos pueden
ser catiónicos, aniónicos y no iónicos como el Tween® o los detergentes. Otros
adyuvantes protegen las conidias de las condiciones ambientales, como polímeros
(aumentan tamaño de gota y evitan evaporación), enzimas (aumentan actividad
del patógeno), protectores de radiación, agentes de fluidez (silicatos de aluminio y
sodio), adherentes (gelatina, gomas, dextrinas, polímeros, aceites), dispersantes
(Gomas, albúminas, almidón, alcoholes), estabilizantes (aminas, glicoles, fenoles)
y protectores como melaza y Tritón X® (Burges y Hussey, 1971). Las
formulaciones sólidas y oleosas al mantener humedades relativas inferiores al
10%, permiten mejorar la viabilidad del hongo al retardar los procesos de
germinación y disminuir el impacto de los cambios en la temperatura, aunque en
general los entomopatógenos se almacenan a temperaturas de refrigeración y los
mejores resultados se obtienen entre 4-10 ºC. Las formas liofilizadas aunque
estables al almacenamiento, tienen la dificultad de formar agregados en la
aplicación, por lo cual se requiere de un disolvente, además las conidias no
disponen de materiales nutritivos que faciliten su germinación en el campo (Galán
et al., 1992, Cenicafé 1996).
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. OBSERVACIONES PRELIMINARES.
5.1.1. Ubicación del área de estudio. La presente investigación se llevó a cabo
bajo condiciones de laboratorio y campo con material colectado en lotes no
mayores de diez años, en el Campo Experimental Palmar de La Vizcaína, del
Centro de Investigación en Palma de Aceite Cenipalma, localizado en la
jurisdicción del municipio de Barrancabermeja (Santander) a 35 Km del perímetro
urbano vía corregimiento El Centro, 75 m., de altura y se extiende
aproximadamente entre los 7 grados 21 minutos de Latitud norte y 73 grados 54
minutos de longitud oeste del meridiano de Greenwich. Los bioensayos de
investigación fueron realizados entre los años 2006, 2007 y 2008 con las
siguientes características climáticas: temperatura máxima: 33.7 º C, temperatura
mínima: 21.2 º C, temperatura media anual: 27,4 º C, precipitación media anual:
2964,3 mm y humedad relativa 60-80 % (Datos suministrados por el Campo
Experimental Palmar de La Vizcaína, Cenipalma, 2008).
5.1.2. Consecución del material biológico. Se realizó en lotes comerciales de
palma de aceite en diferentes plantaciones de la Zona Central palmera. Las
colectas fueron manuales utilizando embudos pequeños y detectándolos en los
focos dentro de los lotes. Una vez capturados se depositaron en recipientes
plásticos, se guardaron en cajas grandes de icopor y se trasladaron al laboratorio
de Entomología del Campo Experimental Palmar de La Vizcaína en
Barrancabermeja para su manutención. Se estableció un criadero de adultos D.
neivai en condiciones de laboratorio y semicontroladas a una temperatura de 27 º
C aproximadamente (Figura 2).
Figura 2. Captura y mantenimiento de colonias de adultos de D. neivai sobre lotes comerciales de palma de aceite. Foto: Luis Carlos Martínez, 2007.
Los insectos fueron colocados en grupos de 100 individuos (50 machos y 50
hembras) sobre bandejas plásticas tipo sanducera de color blanco y cubiertas por
tela oscura ajustadas al borde de la bandeja con bandas con resorte. Para su
alimentación se utilizaron frutos verdes que se cambiaron cada dos días evitando
así la contaminación por factores bióticos. Para la realización de las pruebas, en
todos los casos, se emplearon únicamente individuos sanos sin amputaciones ni
malformaciones aparentes.
5.1.3. Observaciones de laboratorio y campo. Los ensayos de campo se
realizaron en las plantaciones Palmas Oleaginosas Bucarelia S. A., y Palmeras de
Yarima S. A., ubicadas en los municipios de Puerto Wilches y San Vicente de
Chucurí, respectivamente. Estas plantaciones corresponden en su ubicación a la
Zona Central Palmera de Colombia. El material biológico colectado en campo se
distribuyó en grupos de no más de 100 individuos en recipientes tipo sanducera
cubiertos con tela negra, a los que se les agregó espiga de racimo de palma de
aceite necesario como fuente de alimento y a su vez, para proporcionar refugio
atendiendo al hábito del insecto. Los recipientes tipo sanducera se almacenaron
en laboratorio bajo condiciones de humedad relativa (entre el 70 y 80%),
temperatura (entre 27 ºC ± 2 ºC) y fotoperiodo controlado, ya que experiencias
análogas han demostrado que cambios repentinos en la intensidad lumínica
inciden negativamente en el comportamiento de los insectos. Teniendo en cuenta
los hábitos escotofílicos del insecto blanco de estudio, permitió interpretar los
datos obtenidos respecto a la hora local y la época del año.
5.2. PATOGENICIDAD DE TRES AISLAMIENTOS DE HONGOS
ENTOMOPATÓGENOS SOBRE ADULTOS DE D. neivai.
5.2.1. Selección de hongos entomopatógenos. Se evaluaron tres aislamientos
procedentes de las diferentes zonas palmeras del país y que fueron encontrados y
afectando insectos plagas de palma de aceite y de forma natural. Los
aislamientos estaban conservados y registrados con sus datos de origen, código y
hospedero en el Banco de Entomopatógenos de Cenipalma, ubicado en el Campo
Experimental Palmar de La Vizcaína CEPV (Tabla 1). La selección se realizó
previamente en investigaciones anteriores por su alta capacidad virulenta sobre D.
neivai (Valencia y Benítez, 2004) y preservados en tubos de ensayo con medio de
cultivo Sabouraud Dextrosa Agar, SDA (Butt y Goettel, 2000; Humber, 1997;
Lacey, 1997).
Tabla 1. Datos específicos de los aislamientos seleccionados para el control de D. neivai. Fuente: Campo Experimental Palmar de la Vizcaína. Código Aislamiento Origen Hospedero Estado
M 003 Metarhizium anisopliae
Puerto Wilches (Santander)
Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) Martínez. 2008. Adulto
B 018 Beauveria bassiana
San Alberto (Cesar)
Stenoma impressella (Lepidoptera: Elachistidae) Howard et al. 2001. Larva
B 025 Beauveria bassiana
Puerto Wilches (Santander)
Stenoma impressella (Lepidoptera: Elachistidae) Howard et al. 2001. Larva
5.2.2. Producción de conidias. Los aislamientos se sembraron en un medio de
cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) (Butt y Goettel, 2000; Humber, 1997; Lacey,
1997): 1000 mL de agua destilada estéril, 200 gramos de papa, 15 gramos de
agar, 18 gramos de sacarosa, 1 gramo de cloruro de sodio. El medio de cultivo
PDA se esterilizó en autoclave a 15 PSI durante 20 minutos sin despresurizar.
Posteriormente se vertió en cajas Petri de 52 mm de diámetro y se dejo solidificar.
La siembra de cada aislamiento se hizo raspando las conidias con un asa
metálica dejándolas caer sobre la superficie del medio. Las cajas Petri se sellaron
con plástico Parafilm® y se colocaron en incubadora a 26 º C sin luz durante 15
días, tiempo en que tardan los aislamientos en esporular (Figura 3).
5.2.3. Preparación de los aislamientos por dilución seriada . Se realizó un
raspado a nivel de la superficie del micelio obteniendo la extracción máxima de
conidias. Se colocaron las conidias en un erlenmeyer con 50 mL de agua
destilada estéril y 1 % de Tween 80. La suspensión se agitó por 20 minutos. La
mezcla resultante fue una suspensión concentrada del inóculo más otras
partículas; la cual fue considerada como solución madre. Con estas solución, se
prepararon diluciones en serie de 10–1, 10–2, hasta 10–3 con el fin de realizar el
conteo de conidias contenidas en la suspensión. El conteo de conidias se realizó
con ayudad de una cámara de Neubauer. El montaje de las muestras se adelantó
colocando una pequeña cantidad de la muestra con ayuda de una micropipeta y
encima de esta una lámina cubreobjetos. Los recuentos fueron observados al
microscopio con un objetivo de 40x y se contaron cinco cuadrantes del área
sombreada, realizando 15 recuentos por cada aislamiento. Una vez obtenido la
concentración de la solución madre se prepararon diferentes diluciones. La
primera dilución se obtuvo transfiriendo con una pipeta estéril un mL de la solución
madre a un tubo que contiene nueve mL de agua destilada estéril con 1 % de
Tween 80 y agitado fuertemente durante un minuto. Se tomó 1 mL de esta
suspensión y se colocó en otro tubo de ensayo que contiene 9 mL de agua
destilada estéril con 1 % de Tween 80, obteniendo así la segunda dilución.
Figura 3. Producción de conidias de cada uno de los aislamientos seleccionados para el control del raspador del fruto de la palma de aceite D. neivai. Foto: L. C. Martínez, 2007.
5.2.4. Determinación de la concentración letal med ia CL50 y Tiempo letal TL.
Para la inoculación con los aislamientos seleccionados, se desinfestaron los
insectos sumergiéndolos en una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante un
minuto; posteriormente se realizaron tres lavados con agua estéril y se colocaron
en recipientes de vidrio durante 48 horas descartando los insectos que por el
proceso hubieran sido afectados. La suspensión de cada aislamiento fue
inoculado directamente sobre el escutelo del insecto en una aplicación de 1 µL.
Los insectos infectados fueron mantenidos en contenedores de icopor y
alimentados con cinco frutos verdes y frescos, previamente desinfectados con
una solución de hipoclorito al 0.5%. Se evaluaron cinco concentraciones de cada
uno de los aislamientos: 101, 103 105, 107 y 109 conidias mL-1 y un testigo con
agua destilada. Las evaluaciones se realizaron a partir del primer día; los datos de
mortalidad se tomaron desde el momento de la inoculación por intervalos de
tiempo de 24 horas constantes durante 20 días después de la infección.
5.2.5. Análisis estadístico. Para los cálculos de la concentración letal media, los
parámetros estadísticos CL50 y sus límites de confianza fueron determinados
mediante un análisis de regresión logística Probit mediante la correlación entre el
logaritmo del tiempo de la muerte de los insectos y el Probit de la mortalidad
(Seefeldt et al., 1995; Montesinos y Bonaterra, 1996; Finney, 1971), empleando el
software XLSTAT 9.0 para Windows.
5.3. PRUEBAS DE ADHERENCIA E HIDROFOBICIDAD DE DOS
AISLAMIENTOS DE B. bassiana SOBRE ADULTOS DE D. neivai.
5.3.1. Pruebas de adherencia. Se aclararon estructuras de cutícula a partir del
integumento del insecto (Boucias et al., 1988). Se disectaron seis estructuras del
cuerpo de D. neivai, donde posiblemente el insecto tiene mayor contacto con las
conidias: piezas bucales, postarsos, pronoto, escutelo, élitros y abdomen. Las
estructuras fueron colocadas en una solución de hidróxido de potasio KOH al 15%
y se calentó hasta llevar al punto de ebullición por cuatro horas hasta que los
fragmentos del insecto estuvieran traslúcidos. Las estructuras se lavaron tres
veces seguidas con agua destilada estéril por un minuto. Treinta estructuras de
cada parte se colocaron en una suspensión de 10 mL de conidias de cada
aislamiento y se agitaron a 500 rpm durante cuarenta minutos. Las
concentraciones ajustadas para cada aislamiento fueron: B018 6.15 x 109
conidias mL-1 y B025 5.49 x 109 conidias mL-1. Se realizó una tinción con azul de
lactofenol por un minuto de las estructuras seguida con tres pases de agua
destilada estéril y se montaron en láminas portaobjetos para su observación al
microscopio a 40x. Se realizaron 15 recuentos en la cámara de Neubeauer sobre
cinco cuadrantes del área sombreada. Adicionalmente, se tomaron fotografías
con un microscopio electrónico de barrido SEM. Se amplió la imagen de la
superficie de cada estructura evaluada del integumento del insecto hasta 64 µm y
se corrió cada muestra con un haz concentrado de electrones a 30.0 Kv. Para el
barrido se utilizó vapor de agua y nitrógeno líquido, transformando cada punto
leído de las muestras en píxeles por un software de imágenes Gimp, versión 2.2
para Windows.
5.3.2. Pruebas de hidrofobicidad. Con las conidias producidas de cada
aislamiento se preparó una suspensión inicial llamada fase acuosa en un
erlenmeyer con 20 mL de agua destilada estéril al 1% de Tween 80 agitada por
20 minutos. Se realizaron 15 recuentos de conidias en la cámara de Neubeauer y
se observaron al microscopio con un objetivo de 40x contados sobre cinco
cuadrantes del área sombreada. Se tomó 1 mL adicionando 1 mL de tolueno
(fase oleosa), la mezcla se agitó durante 40 minutos a 500 rpm y se mantuvo en
reposo hasta la separación de las fases. Se realizaron 15 réplicas por tratamiento.
Posteriormente se determinó la concentración de la fase acuosa mediante
recuentos en cámara de Neubeauer y se comparó con el recuento inicial (Boucias
et al., 1988).
5.3.3. Análisis estadístico. Los datos de la adherencia de las conidias fueron
analizados estadísticamente con un análisis de varianza en un diseño
completamente al azar y comparados con una prueba de máxima de significancia
Duncan, empleando el software Statistix versión 8.0 para Windows. Los datos de
las pruebas de hidrofobicidad fueron analizados mediante una prueba T para
medias de muestras emparejadas empleando el software Excel versión 2003 para
Windows (Boucias et al., 1988).
5.4. CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE VEHICULOS Y COADYUVA NTES PARA
EL DISEÑO DE DIFERENTES PROTOTIPOS DE FORMULACIÓN D E B.
bassiana.
5.4.1. Producción artesanal del principio activo. Se multiplicó el hongo B.
bassiana en medio liquido papa-sacarosa gelatina en frascos y bandejas de
vidrio (Rogg, 1998; Vélez et al. 1997; Feng et al. 1994). Se esterilizaron los
frascos de vidrio de 30 x 25 x 25 cm y las bandejas de 25 x 40 x 5 cm en un
horno a 110 ºC durante dos horas dejando reposar. La preparación del medio de
cultivo líquido se realizó utilizando los siguientes ingredientes 100 gr de papa, 5 gr
de gelatina industrial, 5 gr de azúcar, 1 gr de sal por litro de agua destilada estéril.
Se retiró la cáscara de la papa, se cortó en pequeños trozos y ablandó calentado
a fuego lento con agua destilada estéril en una plancha de calentamiento a una
temperatura inferior a 100ºC. La mezcla de todos los ingredientes se hizo con
ayuda de una licuadora por 20 segundos hasta observarse homogéneamente. El
medio líquido se vertió en un erlenmeyer y esterilizando en el autoclave hasta
llegar a 15 psi. Se dejó reposar y se vertió en los frascos y bandejas de vidrio 200
mL del medio. Sobre el medio se dispersaron homogéneamente las conidias del
hongo con un asa metálica sobre toda la superficie de medio líquido y se cubrió
los frascos con plástico vinilpel. Los frascos y bandejas se llevaron al cuarto de
crecimiento a 26 º C durante 10 días. Una vez pasado este tiempo, se retiró el
hongo del medio líquido y se colocó en una bandeja desechable de aluminio
forrada con plástico vinilpel a 26 ºC por dos días. Una vez seco, se cosecharon
las conidias y se mezclaron con cada uno de los prototipos de formulación en
proporción 1:1 (Figura 4).
Figura 4. Producción artesanal hongos entomopatógenos: esporulación B. bassiana a 15 días de siembra en medio líquido. Foto: L. C. Martínez, 2007.
5.4.2. Caracterización física de los excipientes. Los excipientes para una
formulación granular o polvos humectables de hongos entomopatógenos que se
aplicarán sobre la corona de la palma deben presentar características físicas
adecuadas con el fin de evitar variaciones en el producto final y asegurar su
establecimiento en condiciones de campo, su efectividad en el control de D.
neivai y estabilidad tanto en almacenamiento como en el momento de la
aplicación. Se evaluaron las propiedades físicas de 16 excipientes (Voight y Borns
1979; Cenicafé 1996, ICONTEC 1992, 1998): tamaño de partícula voluminosidad,
fluidez, humectabilidad, humedad y pH (Tabla 2).
5.4.2.1. Tamaño de partícula. Se llevó a cabo mediante la técnica de gravimetría
(Voight y Borns, 1979). Se utilizó un shaker vibratorio o zaranda pesando 150
gramos de cada uno de los excipientes por una batería compuesta por siete
tamices (4.00 mm, 2.36 mm, 2.00 mm, 1.00 mm, 0.5 mm, 0.3 mm, 0.007 pulg.)
ordenados de arriba hacia abajo en forma descendente de tamaño de poro a una
velocidad constante durante 2 minutos. Una vez cumplido el tiempo de agitación,
se pesó el material retenido en cada uno de los tamices y en la base. Con los
datos de los pesos retenidos en cada tamiz se determinó el porcentaje de peso
retenido por cada uno de los tamices evaluando el rango del tamaño de partícula y
el tamaño de polvos finos de cada material (Voight y Borns, 1979).
Tabla 2. Lista de excipientes con su respectivo código para la identificación en cada una de las pruebas de caracterización física.
SUSTANCIA SIGLA CODIGO PROPIEDAD Albúmina A 1 Aglutinante
Alginato de Calcio A 2 Aglutinante Almidón A 3 Aglutinante Dextrina A 4 Aglutinante Gelatina A 5 Aglutinante
Goma Arábiga A 6 Aglutinante Arcilla D 1 Diluente
Bentonita D 2 Diluente Caolín D 3 Diluente
Fécula de maíz D 4 Diluente Harina de trigo D 5 Diluente Maíz quebrado D 6 Diluente
Microtalco D 7 Diluente Tierra de diatomeas D 8 Diluente Dióxido de Titanio FP 1 Fotoprotector
Óxido de Zinc FP 2 Fotoprotector
5.4.2.2. Voluminosidad. Para determinar la voluminosidad se realizó mediante el
método de peso constante – volumen variable (Voight y Borns 1979). Se pesó 25
gramos de cada uno de los excipientes y se colocó en una probeta, se leyó el
volumen ocupado del material (V1) y posteriormente se apisonó el material
levantando la probeta sostenida por dos bandas de caucho hasta la altura máxima
permitida y dejándola caer libremente sobre una base de madera. Esta operación
se repitió hasta el momento en que no se presentó variación en el volumen dado
por la probeta (Vf), (Voight y Borns 1979; Cenicafé 1996).
5.4.2.3. Fluidez. Esta característica describe la facilidad de flujo granulado e
influye en el llenado y su manipulación. Se realizó por el método de fluidez
estática (Voight y Borns 1979; Cenicafé 1996, ICONTEC 1992, 1998). Se calculó
el ángulo de reposo, con la medida r (radio) de cada excipiente y se dejó fluir por
un cilindro de cuatro centímetros de diámetro, el cual estuvo situado a una altura
de cinco centímetros por encima de una superficie horizontal. El ángulo de
reposo se forma entre la horizontal y la arista y es una medida del coeficiente de
rozamiento entre partículas y por consiguiente de la fluidez del material. La altura
de la pila (h) y el radio (r) dan la medida de la tangente del ángulo (<), con la cual
se puede determinar la fluidez mediante la fórmula matemática F= 1/Tang<
(Voight y Borns 1979; Cenicafé 1996, ICONTEC 1992, 1998).
5.4.2.4. Humectabilidad. Se realizó colocando cinco gramos de cada granulado
en el centro de un vaso precipitado de 250 mL y 7 cm de diámetro interno con 200
mL de agua estéril y se midió con ayuda de un cronómetro el tiempo en que la
muestra tardó en sumergirse por completo (Voight y Borns 1979; Cenicafé 1996,
ICONTEC 1992, 1998).
5.4.2.5. Humedad. El porcentaje de humedad se realizó por el método de
pérdida de peso por secado (USP23, 1975), el cual se fundamenta en la variación
de peso debido a la evaporación de agua al someter un peso conocido del
granulado a una temperatura constante por un tiempo determinado. Se pesaron
los viales de vidrio y una cantidad exacta de cada excipiente (1 gramo).
Posteriormente los viales fueron colocados en una estufa corriente de aire a 105 º
C durante 24 horas. Cada vial fue pesado nuevamente para obtener su peso final.
Conociendo el peso inicial del vial, el peso inicial de la muestra y el peso final se
calcularon el peso de agua evaporada y el porcentaje de humedad inicial (Voight y
Borns 1979; Cenicafé 1996, ICONTEC 1992, 1998).
5.4.2.6. pH. Se realizó una suspensión 1:10 P/V de cada granulado en agua
destilada y se medirá el pH con un potenciómetro previamente calibrado (Voight y
Borns 1979; Cenicafé 1996, ICONTEC 1992, 1998).
5.4.3. Análisis estadístico. Los rangos de aceptación según estudios de
caracterización física para la selección de excipientes fueron tenidos en cuenta
con los siguientes rangos: humedad, aquellos excipientes que superaron un
porcentaje mayor al 10 %; humectabilidad, se consideró que un excipiente es
altamente humectable cuando sus partículas son mojables en un 100 % en un
tiempo menor a 15 segundos; tamaño de partícula, cuando el porcentaje de
peso retenido por cada uno de los tamices evaluando el rango del tamaño de
partícula y el tamaño de polvos finos de cada material se encuentre entre el 20 y
70 %; fluidez, el ángulo de reposo de los excipientes no debe superar los 40º,
voluminosidad, cuando el peso constante – volumen variable varíe entre 0 – 2 mL
y pH, debe estar entre 6 y 7,5 (Voight y Borns 1979; Cenicafé 1996, ICONTEC
1992, 1998). El diseño experimental para todas las pruebas se realizó mediante
Análisis de Varianza con un diseño completamente al azar y con cuatro
repeticiones. Para la comparación de los datos se empleó la prueba de rango
múltiple Tukey. Los análisis se realizaron utilizando el software SAS user versión
9.0 para Windows.
5.5. VIABILIDAD DE LAS CONIDIAS DE B. bassiana FRENTE A LA
EXPOSICIÓN A RAYOS ULTRAVIOLETA Y SU RESPUESTA A LA ADICIÓN
DE DOS PROTECTORES SOLARES.
5.5.1. Producción de conidias de B. bassiana. Se utilizó el aislamiento B025
del hongo B. bassiana y se inoculó en un erlenmeyer con medio SDA al 5%, se
mantuvo a 26°C en oscuridad, hasta que el micelio del hongo cubrió la superficie
del medio y observando una esporulación completa (Butt y Goettel, 2000; Humber,
1997; Lacey, 1997). La extracción de las conidias se realizó raspando con un asa
metálica las conidias y adicionando Tween 80 al 1%. Esta suspensión se
homogeneizó en un agitador magnético durante cinco minutos a 5000 rpm, al cabo
de los cuales se determinó la concentración de conidias mediante un recuento
microscópico con un hematocímetro.
5.5.2. Evaluación de los fotoprotectores. De la suspensión de conidias se
extrajeron varias alícuotas para evaluar cada tratamiento. Los tratamientos fueron
los protectores solares al 1% peso/volumen (p/v), con diferentes concentraciones
(0.125, 0.25, 0.5 y 1 gr.) y distribuidos de la siguiente forma: tratamiento uno T1,
sin protector solar; tratamiento dos T2, óxido de Zinc; tratamiento tres T3, dióxido
de Titanio y tratamiento cuatro T4, óxido de Zinc + dióxido de Titanio. Cada
alícuota de 1 mL se esparció con una micropipeta en placas Petri (Æ = 55 mm,
altura 13 mm) con medio agar-agua al 5% y con un espesor menor a 4 mm. La
exposición de las conidias a la luz UV-C se realizó colocando las cajas destapadas
a 50 cm de distancia vertical de una lámpara de mercurio de 30 W (General
Electric, modelo TUV 30, Estados Unidos), con emisión de luz ultravioleta de l =
254 nm con tiempos de exposición de 15, 30, 45, y 60 minutos. Posteriormente,
las placas se retiraron de la cámara, se taparon, se sellaron y se mantuvieron en
oscuridad en una incubadora a 26°C. La viabilidad s e determinó 24 h después de
la exposición. De la zona media de cada placa se extrajo una faja de agar de 1 cm
de ancho y de igual longitud que el diámetro de la placa, se colocó en un
portaobjeto y se examinó a 40X bajo un microscopio compuesto. Se consideró que
una conidia había germinado cuando había emitido un tubo germinativo de igual o
mayor longitud que el largo máximo de la conidia. La germinación se calculó
tomando solamente el porcentaje de germinadas (número conidias germinadas x
100/número total de conidias examinadas) y se examinó por 4 repeticiones.
5.5.3. Análisis estadístico. El diseño experimental de todas las pruebas de
caracterización se realizó mediante Análisis de Varianza con un diseño
completamente al azar y con cuatro repeticiones. Para la comparación de los
datos se empleó la prueba rangos múltiples Tukey. Los análisis se realizaron
utilizando el software SAS user versión 9.0 para Windows.
5.6. DESARROLLO Y SELECCIÓN DE DIVERSOS PROTOTIPOS DE
FORMULACIÓN PARA UN AISLAMIENTO DE B. bassiana EN EL CONTROL
DEL RASPADOR DEL FRUTO.
5.6.1. Selección de los prototipos de formulación p ara el hongo B025. Una
vez conocido las propiedades que presentan los fotoprotectores, se procedió a
realizar los prototipos con el fin de determinar el mejor atendiendo a los
resultados en las pruebas de fluidez y voluminosidad y descartando las demás
pruebas físicas puesto que no representan diferencia significativa para los
excipientes seleccionados (Tabla 3).
Tabla 3. Relación y mezclas de los diferentes diluentes para el desarrollo de prototipos, descripción y codificación. NUMERO FORMULA RELACIÓN/DILUENTES ADHERENTES
1 FP+(25:75)+5% alm Microtalcos 25: Tierra de diatomeas 75 Almidón al 5%
2 FP+(50:50)+5% alm Microtalcos 50: Tierra de diatomeas 50 Almidón al 5%
3 FP+(75:25)+5% alm Microtalcos 75: Tierra de diatomeas 50 Almidón al 5%
4 FP+(25:75)+10%
alm Microtalcos 25: Tierra de diatomeas 75 Almidón al 10%
5 FP+(50:50)+10%
alm Microtalcos 50: Tierra de diatomeas 50 Almidón al 10%
6 FP+(75:25)+10%
alm Microtalcos 75: Tierra de diatomeas 50 Almidón al 10%
7 FP+(25:75)+5% gel Microtalcos 25: Tierra de diatomeas 75 Gelatina al 5%
8 FP+(50:50)+5% gel Microtalcos 50: Tierra de diatomeas 50 Gelatina al 5%
9 FP+(75:25)+5% gel Microtalcos 75: Tierra de diatomeas 50 Gelatina al 5%
10 FP+(25:75)+10%
gel Microtalcos 25: Tierra de diatomeas 75 Gelatina al 10%
11 FP+(50:50)+10%
gel Microtalcos 50: Tierra de diatomeas 50 Gelatina al 10%
12 FP+(75:25)+10%
gel Microtalcos 75: Tierra de diatomeas 50 Gelatina al 10%
FP: fotoprotector; alm: almidón; gel: gelatina.
5.6.2. Pruebas de fluidez. Se realizó por el método de fluidez estática. Se
calculó el ángulo de reposo, con la medida r (radio) de cada prototipo y se dejó
fluir por un cilindro de cuatro centímetros de diámetro, el cual estuvo situado a una
altura de cinco centímetros por encima de una superficie horizontal (Voight y
Borns 1979; Cenicafé 1996, ICONTEC 1992, 1998).
5.6.3. Pruebas de voluminosidad. Se realizó mediante el método de peso
constante – volumen variable. Se pesó 25 gramos de cada uno de los prototipos y
se colocó en una probeta, se leyó el volumen ocupado del material (V1) y
posteriormente se apisonó el material levantando la probeta sostenida por dos
bandas de caucho hasta la altura máxima permitida y dejándola caer libremente
sobre una base de madera (Voight y Borns 1979; Cenicafé 1996, ICONTEC 1992,
1998).
5.6.4. Análisis estadístico. La caracterización de las pruebas de fluidez y
voluminosidad se realizó mediante Análisis de Varianza con un diseño
completamente al azar y con cuatro repeticiones. Para la comparación de los
datos se empleó la prueba de rango múltiple Tukey. Los análisis se realizaron
utilizando el software SAS user versión 8.0 para Windows.
5.7. EVALUACIÓN DE CUATRO PROTOTIPOS DE FORMULADOS DE B.
bassiana PARA EL CONTROL DE D. neivai EN CONDICIONES DE
LABORATORIO.
5.7.1. Preparación de los prototipos de formulación . Con los resultados
obtenidos sobre la evaluación de los fotoprotectores y la caracterización del resto
de los excipientes se tomaron para la preparación de los prototipos los siguientes
excipientes: dióxido de titanio y oxido de zinc al 1 %, microtalcos y tierra de
diatomeas en proporción 25:75 y almidón o gelatina al 5 o 10 % (Tabla 4). Se
diseñaron cuatro formulados y se mezclaron junto con conidias de B. bassiana en
proporción 1:1.
5.7.2. Producción de conidias. Se multiplicó el hongo B. bassiana en medio
liquido papa-sacarosa gelatina en frascos y bandejas de vidrio, ver ítem 5.4.1
(Rogg, 1998; Vélez et al. 1997; Feng et al. 1994).
Tabla 4. Listado de prototipos de formulación para B. bassiana en el control del raspador del fruto.
PROTOTIPO FORMULA RELACIÓN/DILUENTES ADHERENTES 1 FP+(25:75)+5%
alm Microtalcos 25: Tierra de diatomeas 75
Almidón al 5%
2 FP+(25:75)+10% alm
Microtalcos 25: Tierra de diatomeas 75
Almidón al 10%
3 FP+(25:75)+5% gel
Microtalcos 25: Tierra de diatomeas 75
Gelatina al 5%
4 FP+(25:75)+10% gel
Microtalcos 25: Tierra de diatomeas 75
Gelatina al 10%
FP: Fotoprotector; alm: almidón; gel: gelatina
5.7.3. Determinación de conidias en cada uno de lo s prototipos. Una vez
mezclados los prototipos con las conidias del hongo, se adicionó agua creando
una solución para facilitar la aplicación, dado que los prototipos son polvos
mojables WP. A partir de la solución madre, se prepararon diluciones en serie
(10–1, 10–2, hasta 10–3) con el fin de realizar el conteo de conidias contenida en la
concentración. El conteo de conidias se realizó con un hematocímetro o cámara
de Neubeauer que es una lámina de vidrio grueso con una H en centro para definir
el área donde se realizaron los recuentos de cada aislamiento. El montaje de las
muestras se adelantó colocando una pequeña cantidad de la muestra con ayuda
de una micropipeta y encima de esta una lámina cubreobjetos. Los recuentos
fueron observados al microscopio con un objetivo de 40x y se contaron sobre
cinco cuadrantes del área sombreada obteniendo diferentes concentraciones por
cada uno de los tratamientos (Tabla 5).
5.7.4. Preparación de los insectos para la inocula ción. Con ayuda de un
atomizador fueron aplicados directamente los formulados sobre racimos. La
unidad experimental fue de 30 insectos contenidos en recipientes de icopor con
el racimo de fruto de palma con cinco repeticiones más un testigo. Las
evaluaciones se realizaron a partir del primer día; los datos de mortalidad se
tomaron desde el momento de la inoculación por intervalos de tiempo (24 horas)
constantes hasta 15 días después de la infección.
Tabla 5. Concentración de conidias de cada uno de los prototipos de formulación evaluados. TRATAMIENTO FORMULACIÓN CONCENTRACIÓN
T1 Hongo sin formular 2.14 x 109 conidias T2 Prototipo 1 FP 1 % (25:75) alm 5% 2.14 x 109 conidias T3 Prototipo 1 FP 1 % (25:75) alm 10% 2.14 x 109 conidias T4 Prototipo 1 FP 1 % (25:75) gel 5% 2.14 x 109 conidias T5 Prototipo 1 FP 1 % (25:75) gel 10% 2.14 x 109 conidias FP: Fotoprotector; alm: almidón; gel: gelatina
5.7.5. Análisis estadístico. Para el análisis de datos se empleó un diseño
completamente al azar y una prueba de comparación de rango múltiple Tukey del
porcentaje de mortalidad obtenida en 15 días de evaluación. Se determinó el
porcentaje de eficacia de cada uno de los tratamientos, mediante la fórmula de
Schneider-Orelli.
5.8. EVALUACIÓN DE UN PROTOTIPO DE FORMULACIÓN DE B. bassiana
PARA EL CONTROL DEL D. neivai EN CONDICIONES SEMICONTROLADAS
DE CAMPO.
5.8.1. Producción de conidias y formulación. Se multiplicó el hongo B.
bassiana en medio liquido papa-sacarosa gelatina en frascos y bandejas de
vidrio, ver ítem 5.4.1 (Rogg, 1998; Vélez et al. 1997; Feng et al. 1994).Una vez
seco, se rasparon las conidias y se mezclaron con el prototipo de formulación FP+
(25:75)+10% gel, proporción 1:1.
5.8.2. Preparación de los tratamientos y captura de insectos. Una vez
mezclado el prototipo seleccionado con el hongo, se adicionó agua creando una
solución para facilitar la aplicación, dado que los prototipos son polvos mojables
WP. Se realizó el conteo de conidias con la cámara de Neubeauer para conocer
la concentración. Los tratamientos evaluados fueron los siguientes: T1, hongo
entomopatógeno sin formulación; T2, prototipo de formulación (hongo +
excipientes) y T3, Testigo. La unidad experimental fue un racimo de palma de
aceite con 30 insectos colocados y cubiertos con mallas de tela de tul. La
aplicación de los tratamientos se hizo directamente en los racimos de lotes
comerciales de palma de aceite con cinco repeticiones.
5.8.3. Análisis estadístico. Los datos de mortalidad se tomaron 15 días después
de la infección. Para el análisis de datos se empleó un diseño completamente al
azar con una prueba de comparación de rango múltiple Tukey del porcentaje de
mortalidad obtenida en 15 días de evaluación en época seca. Se determinó el
porcentaje de eficacia de cada uno de los tratamientos, mediante la fórmula de
Schneider-Orelli. Adicionalmente, se realizó una prueba de germinación de las
conidias de cada uno de los tratamientos.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. PATOGENICIDAD DE TRES AISLAMIENTOS DE HONGOS
ENTOMOPATÓGENOS SOBRE ADULTOS DEL RASPADOR DEL FRUT O DE
LA PALMA DE ACEITE D. neivai.
6.1.1. Obtención de aislamientos y síntomas de infe cción del insecto. Las
concentraciones obtenidas en cada aislamiento fueron: B018 2.33 x 109 conidias
mL, B025 2.33 x 109 conidias mL y M003 2.33 x 109 conidias mL. Los aislamientos
cultivados bajo condiciones de laboratorio presentaron colonias con un crecimiento
moderadamente rápido, obteniendo una esporulación 15 días después de su
siembra en medio de cultivo PDA. Esto permitió comprobar las diferencias
morfológicas de cada aislamiento como su aspecto, color y velocidad de
crecimiento. De la misma manera, los cuerpos de D. neivai colocados en cámaras
húmedas permitieron observar la emisión de conidias, de color blanco en insectos
infectados por B. bassiana y color verde en insectos infectados por M. anisopliae
y que se ha descrito anteriormente en diversos trabajos (Samson et al., 1988;
Humber, 1981). Con respecto a los síntomas que presentaron los adultos de D.
neivai, se identificaron los cambios en su comportamiento como aislamiento del
grupo focal situado en las espigas y movimientos erráticos o parciales de su
actividad locomotora. Una explicación de estos eventos durante la etapa
infectiva del hongo, podría ser la acción de toxinas como la beauvericina
producida por B. bassiana y la destruxina producida por M. anisopliae que durante
el periodo de post-inoculación reduce la actividad fisiológica inhibiendo la
formación de aminoácidos (Nation, 2002), absorción de carbohidratos (Dixon,
1969) y degradación de proteínas lípidos y polisacáridos (Trougakos y
Margaritis, 2002). Posterior a los síntomas iniciales y muerte del insecto, se
produjo el desarrollo del micelio blanquecino del hongo, sobre algunas estructuras
y en los espacios intersegmentales del cuerpo.
6.1.2. Concentración letal media. Durante la evaluación de la concentración letal
media CL50, se demostró que el aislamiento M003 en ninguna de las
concentraciones evaluadas alcanzó una mortalidad en el insecto superior al 50%
de su población (Testigo: 0.66%; 101: 3.33%; 103: 2.66%; 105: 4.66%; 107:
14.44%, 109: 34.66%). El aislamiento B018 presentó un comportamiento muy
similar al aislamiento M003 sin alcanzar la concentración letal media (Testigo:
10.66%; 101: 2.66%; 103: 11.33%; 105: 7.33%; 107: 5.33%, 109: 31.33%). Solo el
aislamiento B025 presentó un alto porcentaje de mortalidad en concentración
más alta evaluada (Testigo: 0%; 101: 4%; 103: 8.66%; 105: 8.66%; 107: 12%, 109:
73.33%). Al comparar la mortalidad en las concentraciones de cada aislamiento,
el análisis Probit indicó que la prueba de bondad de ajuste fue altamente
significativa (X2 = 46,66; P < 0,0001), presentando diferencias significativas en
cada uno de los aislamientos seleccionados. De acuerdo al análisis, el
aislamiento B025 fue superior (P = 0,071) causando una mortalidad en la
población de D. neivai hasta en un 73.33%. La línea de regresión expresa la
proporción de mortalidad en adultos del raspador del fruto en valores probitos por
el logaritmo de las concentraciones en mL de cada aislamiento durante los 20 días
de evaluación para el cálculo de CL50. (Figuras 5, 6, 7). El análisis Probit sobre los
cálculos probables de CL50 se exponen totalmente en los Anexos A, B, C. El
patrón homogéneo de respuesta indica que, para todos los aislamientos, la
tendencia de la mortalidad del insecto fue mayor mientras se incrementa las
concentraciones y se expresa la variabilidad de la mortalidad en los individuos
estimados bajo los parámetros de regresión del modelo.
Regresión logística de la mortalidad de D. neivai a diferentes concentraciones de M. anisopliae (M003)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 6 8 10
Log(Conidias (mL))
Pro
babi
lidad
inse
ctos
mue
rtos
Activas Modelo Mortalidad natural
Límite inferior (95%) Límite superior (95%)
Figura 5. Línea de regresión entre los valores probitos o mortalidad Probit por el logaritmo de las concentraciones de M. anisopliae (M003) sobre D. neivai.
Regresión logística de la mortalidad de D. neivai a diferentes concentraciones de B. bassiana (B018)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 6 8 10
Log(Conidias (mL))
Pro
babi
lidad
inse
ctos
mue
rtos
Activas Modelo Mortalidad natural
Límite inferior (95%) Límite superior (95%)
Figura 6. Línea de regresión entre los valores probitos o mortalidad Probit por el logaritmo de las concentraciones de B. bassiana (B018) sobre D. neivai.
Regresión logística de la mortalidad de D. neivai a diferentes concentraciones de B. bassiana (B025)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 6 8 10
Log(Conidias (mL))
Pro
babi
lidad
inse
ctos
mue
rtos
Activas Modelo Mortalidad natural
Límite inferior (95%) Límite superior (95%)
Figura 7. Línea de regresión entre los valores probitos o mortalidad Probit por el logaritmo de las concentraciones de B. bassiana (B025) sobre D. neivai.
El cálculo de probabilidad efectiva de la mortalidad al 50% de insectos adultos de
D. neivai fue de 5.84x108 conidias/mL del aislamiento B025, 2.16x1010
conidias/mL para B018 y 4.51x1010 conidias/mL para M003 (Tabla 6).
Tabla 6. Probabilidad de mortalidad de insectos adultos de D. neivai de acuerdo a la concentración letal media de cepas aisladas de B. bassiana y M. anisopliae.
Cepa Pendiente Intersección X2 CL50 Limite inferior
Limite superior
B025 0.071 -9.648 < 0.0001 5.84x108 3.02x108 9.17x109 B018 0.031 -4.818 < 0.0001 2.16x1010 6.01x109 3.98x1011 M003 0.039 -3.781 < 0.0001 4.51x1010 5.59x109 5.92x1013
Según los resultados, los aislamientos seleccionados fueron patogénicos a adultos
de D. neivai, sin observarse mortalidades superiores al 5% en el testigo. Lo
anterior coincidió con investigaciones realizadas con aislamientos nativos de otros
países sobre insectos coleópteros (Soares et al., 1983; Poprawski et al., 1985;
Moorhouse et al., 1992). Se demostró la susceptibilidad del insecto expuesto a
diferentes concentraciones de cada aislamiento. Sin embargo, B. bassiana B025
presentó una alta capacidad patogénica para el control de D. neivai. Para el caso
de los aislamientos B018 y B025, las diferencias en los grados de virulencia
pertenecientes a la misma especie de hongo, se pueden deber a las variaciones
genéticas dadas por la especialización hacia un determinado hospedero y por la
distribución geográfica de las cepas aisladas (Alves, 1998; Coates et al., 2002).
Los porcentajes mayores de mortalidad del insecto con micosis se presentaron en
las concentraciones más altas de cada aislamiento, disminuyendo notablemente
en el resto de las concentraciones. Esto significa que a mayor concentración,
mejor es la respuesta de cada aislamiento. La manifestación de la micosis no solo
dependió de la concentración, si no posiblemente de algunos factores como el
tamaño, peso y susceptibilidad de los insectos frente a cada aislamiento. Efectos
similares sobre la micosis en insectos han sido expuestos incluyendo
subespecies, patotipos, cepas y aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae
(Bielikova et al., 2002), con la clara intención de buscar los mejores aislamientos y
con sus concentraciones más bajas para el control de insectos plaga (Alves,
1998; Butt y Goettel, 2000).
En contraste con esto, la esporulación de cada aislamiento fue muy similar sobre
el cuerpo del insecto después de someterlos a periodos de incubación (Figura 8).
Existen también diversas razones que pueden explicar la alta esporulación que
presentó el insecto frente a cada aislamiento evaluado, tales como la temperatura
y humedad relativa en el ambiente de incubación de los insectos muertos,
presencia de nutrientes u otros factores esenciales e ideales para el desarrollo de
las conidias (Gottwald y Tedders, 1984; Tanada y Kaya, 1993). La capacidad de
esporulación de los hongos entomopatógenos sobre su hospedero es fundamental
para la diseminación de la enfermedad en condiciones de campo, permitiendo
reinfecciones a partir de insectos parasitados (Gottwald y Tedders, 1984).
Figura 8. Esporulación de hongos entomopatógenos sobre D. neivai después de periodos de incubación en cámaras húmedas. Aislamientos de izquierda a derecha: M. anisopliae M003, B. bassina B018 y B025. Foto: L. C. Martínez, 2007.
6.1.3. Tiempo letal. Existen diferencias marcadas en la interacción de tiempo de
infección-mortalidad, indicando la susceptibilidad del insecto no solo a diferentes
concentraciones sino también a periodos de tiempo de incubación del cada
aislamiento sobre su hospedero. Los insectos manifestaron el inicio de la invasión
del hongo a las 24 horas, quedando totalmente cubiertos por el micelio entre
cuatro a ocho días después de haber sido aplicado los diferentes aislamientos con
sus respectivas concentraciones. El tiempo requerido de infección de cada
aislamiento fue diferente. Para el caso de los aislamientos M. anisopliae M003 y B.
bassiana B018 se observó la muerte de algunos insectos a partir de las 72 horas,
mientras que el aislamiento B025 las etapas de desarrollo de la micosis sobre
adultos de D. neivai sucedieron a las 24 horas después de la inoculación. El TL50
para B. bassiana B025 se alcanzó a los 11.3 días de evaluación (Figura 9), valor
que se incrementó de forma constante hasta los 20 días evaluados, alcanzando
una mortalidad del 73.3%. El resto de los insectos se mantuvo durante el ensayo
en condiciones normales, manteniendo su capacidad locomotora y alimenticia.
Tiempo letal de hongos entomopatógenos sobre D. neivai
0
20
40
60
80
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Tiempo (Días)
Mor
talid
ad (
%)
M. anisopliae M003 B. bassiana B018 B. bassiana B025
Figura 9. Resultados del tiempo letal de los tres aislamientos de hongos entomopatógenos evaluados sobre adultos de D. neivai.
Los porcentajes de mortalidad ocasionados en dos de los aislamientos
seleccionados en adultos de D. neivai fueron bajos por lo que el TL50 no pudo ser
calculado. Resultados similares se han mencionado sobre inoculaciones en
adultos de insectos plaga y que generalmente presentan una respuesta directa en
el integumento del insecto ya que repelen la infección de hongos
entomopatógenos (Steinkraus et al., 1991). En muchos ensayos, los aislamientos
de hongos entomopatógenos con TL50 mayores a los 15 días han sido
considerados no patogénicos (Samuels et al., 1989). Sin embargo, el aislamiento
B018 ha presentado un buen comportamiento de su actividad patogénica en
condiciones de campo (Valencia y Benítez, 2004). Resultados similares se
presentaron al aplicar concentraciones diferentes de conidias en aislamientos de
B. bassiana sobre Chalcodermus bimaculatus Fiedles (Coleoptera:
Curculionidae), donde se observó que el insecto es menos susceptible bajo
condiciones de laboratorio, reportando un 30% de mortalidad después de los 21
días de la aplicación (Quintinela et al., 1990). Los aislamientos de B. bassiana
generalmente tienden a ser más virulentos en su hospedero original, o en
especies cercanamente relacionadas. Bioensayos hechos sobre Leptinotarsa
decemlineata Say (Coleoptera: Chrysomelidae) con aislamientos de B. bassiana
colectados en diferentes países y de diferentes insectos, se han obtenido valores
de TL50 después de 21 días (Feng et al., 1994).
6.2. PRUEBAS DE ADHERENCIA E HIDROFOBICIDAD DE DOS
AISLAMIENTOS DE B. bassiana SOBRE ADULTOS DE D. neivai
6.2.1. Hidrofobicidad de las conidias . Para el aislamiento B. bassiana B018, la
lectura inicial media fue de 622.5 conidias mientras que la lectura final fue de
511.42 (P (T<=t) 0,00667832) decreciendo en un 17.84% al ser centrifugado con
tolueno. Mientras que para el aislamiento B025, la lectura inicial media fue de
559.64 conidias mientras que la lectura final fue de 522.28 (P (T<=t) 0,00667832)
decreciendo en un 6.67% al ser centrifugado con tolueno (Figura 10). De acuerdo
a los resultados de este ensayo, el efecto en la disminución de conidias en ambos
aislamientos resultó se muy similar. Es importante mencionar que las conidias
poseen una cubierta de monoaminas conocidas como hidrofobinas y que pueden
ofrecer alguna protección ambiental además de incrementar la hidrofobicidad de la
conidia. Los resultados del bioensayo exponen una alta posibilidad de los
aislamientos evaluados presenten una alto grado de infección el cuerpo de D.
neivai. Generalmente, se ha demostrado que B. bassiana inicia este proceso
cuando la conidia entra en contacto con la cutícula del insecto y se adhiere por
mecanismos hidrofóbicos (Boucias et al., 1988). Las interacciones hidrofóbicas, la
producción, mucosidad y apresorios por el hongo influyen en la adhesión de la
cutícula del insecto (Bidochka et al., 1997). Se ha demostrado que las hidrofobinas
pueden estar presentes en conidias sumergidas en formulaciones líquidas u
oleosas o en otros prototipos de formulaciones de hongos entomopatógenos
(Bidochka et al., 1995).
Hidrofobicidad de conidias en los aislamientos más activos contra D. neivai .
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100
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400
500
600
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800
Inicial FinalLecturas
Núm
ero
de c
onid
ias
B025 B018
Figura 10. Efecto en la disminución del número de conidias de los aislamientos B025 y B018 para el control de D. neivai.
6.2.2. Adherencia de conidias . El Valor de F para el modelo estadístico del
diseño completamente al azar es significativo con un nivel de significancia α =
0,05 ya que Pr >F (Probabilidad mayor que el F calculado) es igual = 0,97.
Mediante la aplicación del Método de Duncan se forman dos grupos de
tratamientos. Se encontró que la adherencia de conidias del aislamiento B025
sobre varias estructuras del integumento del insecto es mayor que en otras. En el
escutelo y abdomen, las conidias presentaron mayor adherencia con 422.03 y
304.53 conidias en promedio por campo óptico, en los basitarsos y élitros con
24.03 y 51.2 conidias en promedio mientras que en el aparato bucal y el pronoto
la adherencia no fue de 3.33 y 4.46 conidias en promedio respectivamente. En el
aislamiento B. Bassiana B018 se encontró que la adherencia de sus conidias
sobre varias estructuras del integumento del insecto es mayor que en otras. En el
escutelo y abdomen, las conidias presentaron mayor adherencia con 309.63 y
177.03 conidias en promedio, en los basitarsos y élitros con 54.46 y 34.9 conidias
en promedio mientras que en el aparato bucal y el pronoto la adherencia no fue
estadísticamente significativa con 26.63 y 42.9 conidias en promedio (Figura 11).
Conidias adheridas sobre diferentes estructuras del cuerpo de D. neivai
0
100
200
300
400
500
600
A. bucal Pronoto Escutelo Abdomen Basitarso Elitro
Estructuras
Núm
ero
de
coni
dia
s
B025
B018
Figura 11. Adherencia de conidias de B. bassiana de los aislamientos B025 y B018 en diferentes estructuras morfológicas del D. neivai.
Para el caso de los aislamientos evaluados de B. bassiana, la adherencia es un
paso previo necesario para su acción patogénica. La adhesión entre el patógeno y
el hospedero tiene lugar por medio de moléculas de superficie del patógeno,
llamadas adhesinas, que se unen a receptores superficiales complementarios que
existen en las células del hospedero. La mayor parte de adhesinas estudiadas
hasta el momento son glucoproteínas o lipoproteínas, mientras los receptores de
las células del hospedero son generalmente azúcares como la manosa. Se ha
demostrado que las adhesinas de diferentes aislamientos de la misma especie
pueden variar en su estructura (Dulbecco et al. 1985). Diferentes tipos de células
del hospedero pueden tener diferentes tipos de receptores. Si se logra alterar la
adhesinas, los receptores o ambos, así como sus mecanismos de interacción se
puede inducir o inhibir la adhesión de un patógeno al hospedero (Tortuva y Funke,
1993). El entendimiento de las particularidades de los mecanismos de adhesión y
los factores influyentes en este proceso son fundamentales para determinar que
tipo de formulaciones deberán ser usados en la producción industrial de un
bioinsecticida, por ejemplo, a partir de un hongo como B. bassiana (Pereira y
Roberts 1990).
Las fotografías de microscopía de barrido demostraron que las conidias se
adhieren perfectamente a esas estructuras en mayor proporción unas que otras,
especialmente en la cabeza a nivel de aparato bucal, antenas, patas, escutelo,
abdomen y genitalia (Figuras 12, 13, 14, 15 y 16). La variación de la virulencia de
B. bassiana se puede relacionar con la producción y actividad enzimática durante
el proceso de penetración en la cutícula del hospedero. Otros factores pueden ser
el éxito en la adhesión de conidias a la cutícula como presencia de ácidos grasos,
crecimiento fúngico antes de la penetración y, la producción y regulación de otras
toxinas (Bidochka y Khachatourians, 1990). Se ha estudiado las alteraciones de la
epicutícula del insecto al ser infectado por 147 aislamientos diferentes de B.
bassiana y B. brongniartii con ayuda de la microscopia electrónica (Leucona et al.,
1990). Mediante este método, se han encontrado que las conidias se adhieren
específicamente a los receptores de naturaleza polisacarida del hospedero por
intermedio de una particular segregación azucarada del hongo. Simultáneamente
en la cutícula se modifica la distribución de sus componentes. Así, por ejemplo,
seis horas después de la aplicación de los hongos sobre Ostrinia nubilalis Hubner
(Lepidoptera: Pyralidae) aproximadamente el 85% de los carbohidratos de la
cutícula desaparecen. (Leucona et al., 1990).
Figura 12. Fotografía de las conidias de B. bassiana B025 adheridas en el integumento del raspador del fruto D. neivai. Foto: L. C. Martínez, 2007.
Figura 13. Fotografía de las conidias de B. bassiana adheridas en el pronoto y escutelo del raspador del fruto D. neivai. Foto: L. C. Martínez, 2007.
Figura 14. Fotografía de las conidias de B. bassiana adheridas en el plato genital masculino del raspador del fruto D. neivai. Fotos: L. C. Martínez, 2007.
Figura 15. Fotografía de las conidias de B. bassiana adheridas en la cabeza del raspador del fruto D. neivai. Foto: L. C. Martínez, 2007.
Figura 16. Fotografía de las conidias de B. bassiana adheridas en el abdomen del raspador del fruto D. neivai. Fotos: L. C. Martínez, 2007.
6.3. CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE EXCIPIENTES PARA EL DISEÑO DE
DIFERENTES PROTOTIPOS DE FORMULACIÓN DE B. bassiana.
6.3.1. Humedad. De acuerdo con el porcentaje de humedad hecho por el método
de pérdida de peso por secado, aquellos excipientes que superaron un porcentaje
mayor al 10 % presentaron que bajo efecto de temperatura, son susceptibles y
pueden afectar la humedad de las conidias (Voight y Borns, 1979). Los
excipientes A2, A3 A5, A6, D2, D4 y D5 presentaron una pérdida de humedad por
encima del 10 %, los demás excipientes presentaron diversos rangos de pérdida
de humedad (Tabla 7).
6.3.2. Humectabilidad. Se consideró que un excipiente es altamente humectable
cuando sus partículas son mojables en un 100 % en un tiempo menor a 15
segundos (Voight y Borns, 1979). En los resultados obtenidos se determinó que
los excipientes D6, D8, FP1 y FP2 se encontraron sobre el rango (son mojables a
un tiempo menor de 15 segundos) mientras que los excipientes A3, A4, A5, D1,
D3, D4 y D5 los tiempos oscilaron entre 19 hasta 371 segundos. Para los
excipientes A1, A2, A6 y D2 esta prueba no se aplicó con resultados satisfactorios
ya que superaron más de las seis horas (Tabla 7).
6.3.3. pH. El pH de un excipiente debe estar entre 6 y 7,5 por lo tanto, existen
varios excipientes que demostraron ser ácidos o alcalinos (Voight y Borns, 1979).
Los excipientes A4, A6 y D3 presentaron un pH ácido mientras que los excipientes
A6, D1, D2, D7 Y FP2 son alcalinos. Los excipientes A1, A2, A3, A5, D4, D5, D8 y
FP1 se encuentran dentro del rango de pH aceptable y posiblemente no generarán
efectos antagónicos en B. bassiana (Tabla 7).
6.3.4. Voluminosidad. Los excipientes A4, A5, A6, D1, D2, D5, D6, D7, FP1 y
FP2 presentaron una voluminosidad adecuada, con valores menores a 2 mL
respectivamente (Tabla 7), ya que no fueron significativamente diferentes del
límite máximo para dicho parámetro, para que los materiales no presenten
problemas durante la manipulación (Martín, 1967). Este resultado permite sugerir
que posiblemente ninguno los excipientes seleccionados presentará problemas en
los procesos de formulación frente a un producto terminado a escala industrial.
6.3.5. Fluidez. Para aquellos excipientes que presentan fluidez, el ángulo de
reposo no debe superar los 40º (Voight y Borns, 1979). De acuerdo a este
parámetro, los excipientes A1, D1 y D8 superan el ángulo que describe la facilidad
de flujo granulado e influye en el llenado y su manipulación (Tabla 7).
6.3.6. Tamaño de partícula. Según los resultados (Tabla 7), con los pesos
retenidos en cada tamiz se logró determinar que los excipientes A3, A4, A5, D1,
D3, D5, D7, D8 y FP2 presentaron el rango del tamaño de partícula y el tamaño
de polvos finos necesarios para ser tenidos en cuenta en los procesos de
formulación (Voight y Borns, 1979).
Tabla 7. Resumen de los datos de la caracterización física de los excipientes evaluados para el diseño de un prototipo de formulación de hongos entomopatógenos.
La prueba de comparación de rango múltiple Tukey determinó que existieron
diferencias significativas entre los excipientes evaluados en las diferentes pruebas
de caracterización física. De acuerdo al resumen del análisis de varianza, El valor
del F calculado para cada uno de los excipientes evaluados significativo. El
porcentaje de humedad en los excipientes fue menor al 10% representa un valor
que se encuentra entre el límite de aceptación para los productos biológicos,
puesto que bajo estas condiciones de humedad el metabolismo de los hongos se
SIGLA HUMEDAD (%)HUMECTABILIDAD
(segundos) pHVOLUMINOSIDAD
(mL)FLUIDEZ (< de
reposo)TAMAÑO DE PARTICULA
A 4,93 N,A 6,82 2,92 40,49 16,2
A 15,08 N,A 7,43 2,21 32,37 71,14
A 13,86 62,8 6,22 2,2 27,72 56,88
A 7,97 19,6 5,27 1,8 20,49 53,36
A 10,92 45,8 7,01 1,66 26,56 26,62
A 10,76 N,A 4,78 1,76 26,95 97,56
D 0,46 154,6 8,78 1,59 41,14 62,52
D 10,74 N,A 10,17 1,35 28,12 71,25
D 1,03 84,8 5,61 2,85 37,84 21,03
D 12,59 35,188 6,18 2,08 24,39 96,01
D 12,65 371,2 7,13 1,98 39,13 46,78
D 9,95 1 6,28 1,36 0 1,61
D 0,20 84,4 9,32 1,68 20,03 41,09
D 7,28 4,254 7,03 2,6 43,68 41,11
FP 0,40 2 7,08 1,2 24,48 3,56
FP 0,18 0,674 7,72 1,22 26,96 12,32
SUSTANCIA
ALBUMINACODIGO
1
3
1
5
2
ALMIDON
6
DEXTRINA 4
BENTONITA 2
3
1
4
5
6
7
ALGINATO DE CALCIO
OXIDO DE ZINC
HARINA DE TRIGO
MAIZ QUEBRADO
CAOLIN
DIOXIDO DE TITANIO
FECULA DE MAIZ
GELATINA
GOMA ARABIGA
ARCILLA
2
8TIERRA DE DIATOMEAS
MICROTALCO
hace más lento, lo que contribuye a aumentar su estabilidad y por tanto su vida útil
(Butt et al. 2001). De acuerdo con el valor óptimo en la fluidez, los resultados
obtenidos para los excipientes seleccionados fluirían fácilmente y no presentarán
problemas cuando sean manipulados en grandes cantidades en los procesos de
llenado y empaque principalmente durante una producción industrial; además, la
alta fluidez de los formulados favorecería la aplicación del producto (Valencia,
2000). El tamaño de partícula en un proceso de formulación, podrían asegurar
una mayor cantidad de conidias incrementando la actividad biocontroladora
(Valencia, 2000).Esto evitaría que se presenten problemas en el producto
terminado cuando sea almacenado por períodos de tiempo prolongados,
evitándose su compactación en la base, lo que impediría el flujo libre del producto
y la utilización total del mismo (Morales 1993). Esto adicionalmente, podría facilitar
la suspensión en el volumen de reconstitución, disminuyendo la velocidad de
sedimentación de las mismas y evitando el taponamiento de las boquillas de los
equipos, cuando sea aplicado en campo (Butt et al. 2001).
6.4. VIABILIDAD DE CONIDIAS DE B. bassiana FRENTE A LA EXPOSICIÓN A
RAYOS ULTRAVIOLETA Y SU RESPUESTA A LA ADICIÓN DE D OS
PROTECTORES SOLARES.
La germinación de las conidias en suspensión acuosa no fue afectada por la
adición del protector solar, a pesar de que estos son compuestos químicos que
comúnmente son empleados como pantallas físicas. Con respecto a los
tratamientos, el testigo fue el que presentó el menor porcentaje de conidias
germinadas en todas sus repeticiones (Figura 17). Los resultados en los diferentes
tiempos de exposición, la germinación fue disminuyendo gradualmente, siendo
esta un factor dependiente y que influye directamente sobre las conidias. El óxido
de zinc como pantalla física presentó un grado significativo en el porcentaje de
conidias germinadas. Entre concentraciones y tiempos de exposición, se
determinó un porcentaje máximo hasta del 78% con un tiempo de exposición de
15 minutos y con una concentración de 0.25 gr. En el mismo tiempo pero en
diferentes concentraciones, la germinación disminuyó casi progresivamente. A
medida que las conidias fueron expuestas a los rayos U. V., la germinación
disminuyó hasta el punto de cero. Las conidias obtuvieron porcentajes de
germinación en promedio en concentraciones entre 0.25 y 0.5 gramos entre 30 y
45 minutos de exposición.
El dióxido de titanio como pantalla física también presentó un grado significativo
en el porcentaje de conidias germinadas aunque menor que el óxido de zinc.
Entre concentraciones y tiempos de exposición, se determinó un porcentaje
máximo hasta del 60% con un tiempo de exposición de 15 minutos y con una
concentración de 0.5 gr. En el mismo tiempo pero en diferentes concentraciones,
la germinación disminuyó casi progresivamente. A medida que las conidias fueron
expuestas a los rayos U. V., la germinación disminuyó hasta el punto de cero. Las
conidias obtuvieron porcentajes de germinación en promedio en concentraciones
entre 0.25 y 0.5 gramos entre 15 y 45 minutos de exposición (Figura 17). Sin
embargo, la mezcla del dióxido de titanio y el óxido de zinc como fotoprotector
presentó el grado más significativo en el porcentaje de conidias germinadas.
Entre concentraciones y tiempos de exposición, se determinó un porcentaje
máximo hasta del 93% con un tiempo de exposición de 15 minutos y con una
concentración de 0.25 gr. En el mismo tiempo pero en diferentes concentraciones,
la germinación disminuyó casi progresivamente (Figura 17). A medida que las
conidias fueron expuestas a los rayos U. V., la germinación disminuyó hasta un
8%. Las conidias obtuvieron porcentajes de germinación tanto en diferentes
tiempos de exposición como en la concentración del fotoprotector.
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15 min 30 min 45 min 60 min
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15 min 30 min 45 min 60 min
Tiempo (min)
Germinación (%)
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15 min 30 min 45 min 60 min
Tiempo (min)Germinación (%)
CONCENTRACIÓN 0.125g CONCENTRACIÓN 0.25g
CONCENTRACIÓN 0.5g CONCENTRACIÓN 1g
Figura 17. Análisis de los fotoprotectores. Porcentaje de conidias germinadas durante las diferentes concentraciones y tiempos de exposición a rayos ultravioleta de cada tratamiento.
Los tiempos de exposición necesarios para reducir sustancialmente la germinación
fueron extremadamente bajos en este ensayo, en comparación a los resultados
informados en otros ensayos in vitro, en los cuales se señala que los tiempos
letales TL50 variaron entre 1 a 4 h para algunos géneros de entomopatógenos
representativos como Metarhizium sp., Beauveria sp., y Nomuraea sp. (Moore et
al. 1993). A diferencia de los insecticidas químicos, los micoinsecticidas tienen
ingredientes activos capaces de reproducirse. Un modelo desarrollado para
describir el efecto de M. flavoviride Gams y Rozsypal (posteriormente M.
anisopliae var. acridum Driver y Milner) en la población Hieroglyphus daganensis
Krauss (Orthoptera: Acrididae) demostró que sólo el 48% de la mortalidad total se
debió al contacto directo entre las conidias aplicadas y los insectos, mientras que
la ruta de infección secundaria (conidias residuales) representó el 40% de la
mortalidad total (Thomas et al. 1997), incrementos muy pequeños en la actividad
residual de las conidias causaron grandes incrementos en la mortalidad total en la
misma temporada como entre temporadas.
Esta particular forma de acción de los micoinsecticidas reafirmaría la importancia
de incrementar la actividad residual de B. bassiana para que sus conidias se
transformen en focos de una epizootia secundaria, en la medida que las
condiciones ambientales favorezcan el desarrollo de la enfermedad (Langewald et
al. 1997). Los resultados obtenidos fueron similares a aquellos registrados para
otros hongos entomopatógenos expuestos a rayos ultravioleta. Se ha observado
muerte de conidias, después de la exposición de éstas al simulador de luz solar, a
longitudes de onda entre 280 y 320 nm (Lomer y Prior, 1992). De comprobarse la
utilidad de la mezcla del óxido de zinc y dióxido de titanio en campo, este grado
de protección, aunque no total, podría representar una diferencia importante en el
desarrollo de un bioinsecticida.
6.5. DESARROLLO Y SELECCIÓN DE DIVERSOS PROTOTIPOS DE
FORMULACIÓN PARA UN AISLAMIENTO DE B. bassiana.
6.5.1. Fluidez. El análisis de varianza de las pruebas de fluidez en los formulados
mostró aceptación y se ajustan perfectamente al diseño completamente al azar
(Anexo 1). En el análisis de varianza es significativo al nivel de significancia α =
0,05 ya que Pr >F (Probabilidad mayor que el F calculado) es igual = 0,0000001
y el F calculado 13.26 fue significativo para α = 0,05. El valor del F calculado para
cada uno de los prototipos y repeticiones es significativo. Los prototipos fueron
comparados entre sus medias y se presentaron los prototipos 7, 10, 1, 8, 2 y 4
como los mejores por su particularidad física (Figura 18).
Figura 18. Resultados prueba de fluidez, resumen de pruebas de comparación Tukey en los prototipos desarrollados.
6.5.2. Voluminosidad. El análisis de varianza de las pruebas de voluminosidad
en los formulados mostró aceptación y se ajustan perfectamente al diseño
completamente al azar (Anexo 2). En el análisis de varianza es significativo al
nivel de significancia α = 0,05 ya que Pr >F (Probabilidad mayor que el F
calculado) es igual = 0,0000001. El F calculado 7.39 es significativo para α = 0,05,
esto implica que el F calculado también es significativo para α = 0,05 para cada
uno de los prototipos y repeticiones es significativo. Los prototipos fueron
comparados entre sus medias y se presentaron los prototipos 7, 10, 3, 4, 1 y 9
como los mejores por su particularidad física (Figura 19).
Figura 19. Resultados prueba de voluminosidad, resumen de pruebas de comparación Tukey en los prototipos desarrollados.
A pesar de lo promisorio que puede resultar el uso del aislamiento B025, esta
cepa no existe como bioinsecticida registrado ni en Colombia ni en el mundo,
siendo además, el primero en ser formulado exclusivamente para el control de
insectos plaga en palma de aceite. Una etapa importante en el desarrollo es la
formulación, la cual se define como el conjunto de actividades organizadas
conducentes a la determinación de las características del principio activo y de los
cambios químicos, físicos y microbiológicos que éste puede sufrir sólo o al
combinarlo con los auxiliares de formulación necesarios para la elaboración del
producto final (Gómez y Villamizar 2000; Morales, 1993). Diferentes estudios han
comprobado que los bioinsecticidas formulados en polvos mojables WP, la materia
activa se encuentra dispersa en un vehículo inerte sólido presentando mayor
fluidez y estabilidad de sus componentes (Barbera, 1976; Díaz y Forero, 1997;
Marino, 2001). Los polvos para reconstituir se presentan en forma de un polvo
capaz de ser mojado y mantenerse en suspensión en el agua durante un período
de tiempo largo (Barbera 1976).
6.6. EVALUACIÓN DE CUATRO FORMULADOS DE B. bassiana PARA EL
CONTROL D. neivai EN CONDICIONES DE LABORATORIO.
6.6.1. Porcentaje de mortalidad en cada uno de los formulados. El mejor
tratamiento es el T5 (Anexo 3). La mortalidad obtenida por el testigo fue del 3.33
%. Para el caso del hongo sin formular, la mortalidad alcanzó el 75 %, resultados
muy similares a los obtenidos en los bioensayos de la CL50. La mortalidad
alcanzada de los demás tratamientos fueron los siguientes: tratamiento T5 que
corresponde al prototipo 4 FP 1 % (25:75) gel 10% con un porcentaje de
mortalidad del 94.16 %, tratamiento T4 Prototipo 3 FP 1 % (25:75) gel 5% con un
90.83%; tratamiento T3 Prototipo 2 FP 1 % (25:75) alm 10% 89.16% y tratamiento
T2 Prototipo 1 FP 1 % (25:75) alm 5% que logró alcanzar el 85% (Figura 20). El
Valor de F para el modelo estadístico de diseño completamente al azar es
significativo al α = 0,05 ya que Pr >F (Probabilidad mayor que el F calculado) es
igual = 0,0000001. El F calculado fue 34.48 y es significativo para α = 0,05. Con la
aplicación de la prueba de comparación Tukey se formaron dos grupos entre los
tratamientos. Los promedios de los tratamientos dentro de los grupos entre ellos
no son diferentes. El promedio poblacional dentro de un grupo es diferente del
promedio poblacional del tratamiento de cualquier otro grupo.
EVALUACIÓN DE PROTOTIPOS DE FORMULADOS PARA EL MANEJO DE D. neivai
0
20
40
60
80
100
120
T5 T4 T3 T2 T1 T0
TRATAMIENTOS
MO
RT
ALI
DA
D (
%)
Figura 20. Media de cada porcentaje mortalidad del raspador del fruto obtenida en cada uno de los prototipos de formulados de B. bassiana. Tratamiento T5 que corresponde al prototipo 4 FP 1 % (25:75) gel 10%; tratamiento T4 Prototipo 3 FP 1 % (25:75) gel 5%; tratamiento T3 Prototipo 2 FP 1 % (25:75) alm 10% 89; tratamiento T2 Prototipo 1 FP 1 % (25:75) alm 5%.
Con respecto a la sobrevivencia del insecto en cada uno de los formulados de
acuerdo al tiempo, se observó que la sobrevivencia disminuyó entre el segundo y
el tercer día y se redujo hasta el día 12. Para todos los tratamientos excepto el
testigo, la sobrevivencia bajo en los primeros siete días. (Figura 21). La
sobrevivencia se mantuvo para todos los tratamientos después del día 12.
Figura 21. Sobrevivencia de adultos del raspador del fruto en días bajo diferentes prototipos de formulados de B. bassiana.
6.6.2. Porcentaje de mortalidad de cada uno de los formulados sin la adición
del hongo entomopatógeno. La mortalidad obtenida en el testigo fue del 3.37
%. Los prototipos de formulados alcanzaron mortalidades muy similares siendo el
tratamiento T2 Prototipo 4 FP 1 % (25:75) alm 5% el que mayor porcentaje
alcanzó 3.38 %, para los demás tratamientos, las medias de los prototipos de
formulación fueron similares al testigo (Figura 22). El Valor de F para el modelo
estadístico del diseño completamente al azar fue significativo al nivel de
significancia α = 0,05 ya que Pr >F (Probabilidad mayor que el F calculado) es
igual = 0,97. También el valor de F para tratamientos fue significativo para α =
0,05 por la misma razón, o sea Pr >F = 0,1 < 0,05. Mediante el método de
comparación Tukey se formó un solo grupo de tratamientos. Para este ensayo se
ajusta a los porcentajes obtenidos de mortalidad, siendo estos valores demasiados
bajos. Los formulados utilizados no presentaron ninguna diferencia significativa
según la prueba de comparación entre ellos ni tampoco en el testigo en cuanto a
0102030405060708090
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
TIEMPO DE EVALUACION (Días)
SO
BR
EV
IVE
NC
IA (
%)
T1 T2 T3 T4 T5 T0
mortalidad se refiere. La mortalidad es causada por efecto del hongo
entomopatógeno y no por efecto de los excipientes que formulan cada prototipo.
MORTALIDAD DE D. neivai SIN LA ADICIÓN DE B. bassiana
3,364
3,368
3,372
3,376
3,38
3,384
T1 T2 T3 T4 T5
TRATAMIENTOS
MO
RT
ALI
DA
D (
%)
Figura 22. Media de cada porcentaje mortalidad del raspador del fruto obtenida en cada unos de los prototipos de formulados sin el hongo entomopatógeno.
Los formulados presentaron un efecto sinérgico cuando se combinaron con el
hongo entomopatógeno, incrementando su eficacia contra el insecto plaga
(Womack et al. 1996; Prior et al. 1988). Es posible que los formulados pudieran
activar algunos factores determinantes en el mecanismo de acción del hongo,
como haber aumentado la velocidad de germinación de los conidios, la producción
de enzimas como quitinasas o la producción de toxinas que determinan la
capacidad de virulencia del microorganismo (Lezama, 1994); siendo estos los
parámetros fundamentales en el mecanismo de acción (Clarkson y Charnley 1996)
y que pudo repercutir en la alta actividad biocontroladora del producto. El
incremento en la mortalidad cuando el hongo entomopatógeno es formulado
concuerda con estudios realizados al evaluar virus de la granulosis formulado
sobre Tecia solanivora Povolny (Lepidoptera: Gelechiidae). Se encontraron
porcentajes de eficacia entre el 88% y 100%, resultados significativamente
diferentes a los obtenidos por los aislamientos de virus sin formular con un
porcentaje de eficacia entre el 36% y 86% o con Lecanicillium lecanii en el control
de mosca blanca (Gómez et al. 2005; Espinel et al. 2008; Garzón, 2004).
6.7. EVALUACIÓN DE UN PROTOTIPO DE FORMULACIÓN DE B. bassiana
PARA EL CONTROL DEL RASPADOR DEL FRUTO EN CONDICION ES
SEMICONTROLADAS DE CAMPO.
6.7.1. Porcentaje de mortalidad en cada uno de los tratamientos. Para los
tratamientos evaluados se utilizó una concentración de 2.51 x 109 conidias en el
hongo sin formular T2 mientras que para el hongo formulado T3 la concentración
fue de 1.85 x 109 conidias. El Valor de F para el modelo estadístico de diseño
completamente al azar es significativo con un nivel de significancia α = 0,05 ya
que Pr >F (Probabilidad mayor que el F calculado) es igual = 57.05. El mejor
tratamiento es el T3, el hongo formulado (Anexo 5). La mortalidad obtenida en el
testigo fue del 3.33 %. El hongo formulado alcanzó una mortalidad del 61.2%
mientras que el hongo no formulado T2 solo llegó hasta el 18.4% (Figura 23). Con
respecto a la esporulación, el 28 % del total de insectos colectados en el
tratamiento T2 u hongo no formulado logró esporular mientras que en el
tratamiento T3 u hongo formulado se presentó el 42.1 % de esporulación del total
de insectos colocados en cámaras húmedas después de 15 días en incubación.
Este resultado define la importancia de evaluar los prototipos desarrollados en
condiciones de campo, ya que es bajo condiciones ambientales drásticas en que
se podría apreciar las ventajas de la formulación. Los resultados obtenidos en el
ensayo fueron bajos de acuerdo a los datos presentados en condiciones de
laboratorio. Una de las posibles causas por la cual no se dio la mortalidad
estimada o similar en insectos adultos de D. neivai fueron las condiciones
extremas de ambiente en el lote. Resultados similares se han expresado en
estudios como es el caso de una formulación desarrollada a base del hongo
entomopatógeno M. anisopliae para el control de Rhammatocerus
schistocercoides Rhen (Orthoptera: Acrididae), la cual al evaluarse bajo
condiciones de campo ocasionó una mortalidad del 67,8% en comparación con los
conidios del hongo sin formular con los que la mortalidad fue del 9,5% (Espinel et
al. 1998); en el control de Ancognatha scarabaeiodes (Coleoptera: Scarabaeidae)
(Marino, 2001) o en el control de T. vaporariorum (Villamizar y Cotes, 2004;
Jimenez, 2002).
MEDIA DE DATOS POR TRATAMIENTO
0
20
40
60
80
100
T1 T2 T3
TRATAMIENTOS
MO
RT
ALI
DA
D (
%)
Figura 23. Datos de mortalidad del raspador del fruto obtenida en las aplicaciones sobre racimos en lotes comerciales de palma de aceite Oleaginosas Bucarelia S. A: T1, testigo; T2 hongo entomopatógeno sin formular, T3 hongo entomopatógeno formulado.
7. CONCLUSIONES
Según los resultados, el aislamiento B. bassiana B025 del Banco de
entomopatógenos de Cenipalma BEC, fue el más patogénico en insectos adultos
de D. neivai, superando el porcentaje de mortalidad obtenida por otros
aislamientos. El aislamiento B025 causó una mortalidad en poblaciones del
insecto hasta el 73.33% en condiciones de laboratorio y fue más patogénico a
mayores concentraciones. El TL50 para B. bassiana B025 se alcanzó a los 11 días
de evaluación. Los resultados de las pruebas de adherencia mostraron que las
conidias del aislamiento B025 sobre varias estructuras del integumento del insecto
fue mayor en el escutelo y abdomen; así como su capacidad hidrofóbica en la
fase acuosa.
La evaluación de excipientes para el desarrollo de un prototipo de formulación a
base de hongos entomopatógenos a partir de estudios físicos como
voluminosidad, tamaño de partícula, fluidez, pH, humedad, humectabilidad,
permitió la selección. Los prototipos de formulación utilizados no presentaron
ninguna diferencia significativa entre ellos. Esto ocasionó un efecto letal bajo sobre
el insecto e incrementó la mortalidad obtenida con respecto al hongo no
formulado. Los resultados del B. bassiana con un prototipo de formulación en
condiciones de laboratorio y semicontroladas de campo, demostraron un efecto
letal sobre adultos de D. neivai.
La formulación del B. bassiana B025 mejoró su desempeño en el campo, facilitó
su manejo, producción, aplicación en campo y permitió su almacenamiento en
condiciones que disminuyen su costo, con una pérdida mínima de las cualidades
del producto. El desarrollo de un prototipo de formulación con hongos
entomopatógenos se constituyó en la base para el éxito de un bioplaguicida de
origen microbiano para el manejo de las poblaciones del raspador del fruto de
palma de aceite D. neivai. Esto generó una alternativa diferente al control químico
y se incorporó en los programas de Manejo Integrado de Plagas que atienden las
diferentes plantaciones de palma de aceite en la Zona Central Palmera.
8. RECOMENDACIONES
A partir de la selección de aislamientos de hongos entomopatógenos de los
géneros Beauveria y Metarhizium provenientes del Banco de Entomopatógenos de
Cenipalma se logró identificar un aislamiento con alta capacidad patogénica sobre
D. neivai. Es importante continuar con los procesos de colección, conservación y
selección de estos microorganismos, que han sido encontrados en campo y
afectan diferentes insectos de importancia económica en el cultivo de palma de
aceite.
Otra recomendación es la aplicación directa sobre el insecto situado en el racimo
de palma con equipos de ultrabajo volumen. Estos equipos son utilizados
comúnmente en plantaciones. El uso de estos equipos no ha sido probado con
claridad sobre la arquitectura de los racimos de la palma de aceite y aún falta
estandarizar procesos como el modo, forma y frecuencia de aplicación del
formulado.
Existen causas posibles que provocaron variaciones durante el desarrollo de la
investigación. Bajo condiciones de laboratorio, se logró controlar la temperatura,
humedad y radiación UV. En condiciones semicontroladas de campo, existen
diversos factores ambientales que de alguna manera puede variar el efecto del
hongo formulado y la mortalidad insectos adultos de D. neivai. Es importante
tener en cuenta en investigaciones futuras el estudio de variables ambientales con
fin de refinar los prototipos de formulación y su aplicación técnica, en búsqueda de
la persistencia de este nuevo bioinsecticida.
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ANEXOS
Anexo 1. Análisis estadístico: pruebas de fluidez Análisis de varianza, diseño completamente al azar. The GLM Procedure Dependent Variable: y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 13 2053.431591 157.956276 13.26 <.0001 Error 30 357.430909 11.914364 Corrected Total 43 2410.862500 R-Square Coeff Var Root MSE y Mean 0.851741 14.36720 3.451719 24.02500 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Formulado 10 2030.780000 203.078000 17.04 <.0001 Bloques 3 22.651591 7.550530 0.63 0.5991
Tukey's Multiple Range Test Alpha0.05 Error Degrees of Freedom 30 Error Mean Square11.91436 Numbe 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
r of Means
Critical Range
4.985
5.238
5.403
5.520
5.609
5.678
5.734
5.780
5.818
5.84
9
Anexo 2. Análisis estadístico: pruebas de voluminosidad. Análisis de varianza, diseño completamente al azar. The GLM Procedure Dependent Variable: y Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 13 0.34567273 0.02659021 7.39 <.0001 Error 30 0.10800000 0.00360000 Corrected Total 43 0.45367273 R-Square Coeff Var Root MSE y Mean 0.761943 14.04255 0.060000 0.427273 Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Formulado 10 0.34087273 0.03408727 9.47 <.0001 Bloques 3 0.00480000 0.00160000 0.44 0.7230
Tukey's Multiple Range Test Alpha0.05 Error Degrees of Freedom 30 Error Mean Square0.0036
Numbe
r of Means
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Critical Range
.0866
.0911
.0939
.0960
.0975
0.987
.0997
.1005
.1011
.1017
Anexo 3. Análisis de varianza del porcentaje de mortalidad obtenida en cada unos de los prototipos de formulados de B. bassiana. Diseño completamente al azar. Randomized Complete AOV Table for DATOS Source DF SS MS F P BLOQUE 3 295.7 98.56 TRATAMIEN 5 24166.8 4833.37 34.48 0.0000 Error 15 2102.8 140.19 Total 23 26565.3 Grand Mean 72.667 CV 16.29 Datos de la prueba de comparación Tukey's 1 Degree of Freedom Test for Non additivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 1 24.50 24.497 0.17 0.6907 Remainder 14 2078.34 148.453 Relative Efficiency, RCB 0.94 Means of DATOS for TRATAMIEN TRATAMIEN Mean Homogeneous Groups 5 94.000 A 4 90.500 A 3 88.750 A 2 85.000 A 1 74.750 A 0 3.000 B
Anexo 4. Análisis de varianza del porcentaje de mortalidad obtenida en cada unos de los prototipos de formulados de sin el hongo entomopatógeno. Diseño completamente al azar. Randomized Complete AOV Table for DATOS Source DF SS MS F P BLOQUES 3 2.20000 0.73333 TRATAMIEN 4 0.20000 0.05000 0.10 0.9791 Error 12 5.80000 0.48333 Total 19 8.20000 Grand Mean 1.3000 CV 53.48 Tukey's 1 Degree of Freedom Test for Non additivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 1 0.89091 0.89091 2.00 0.1853 Remainder 11 4.90909 0.44628 Relative Efficiency, RCB 1.05 Observations per Mean 4 Standard Error of a Mean 0.3476 Std Error (Diff of 2 Means) 0.4916 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test of DATOS for TRATAMIEN TRATAMIEN Mean Homogeneous Groups 2 1.5000 A 1 1.2500 A 3 1.2500 A 4 1.2500 A 5 1.2500 A Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 0.4916 Critical Q Value 4.515 Critical Value for Comparison 1.5695 Error term used: BLOQUES*TRATAMIEN, 12 DF There are no significant pairwise differences among the means.
Anexo 5. Análisis de varianza del porcentaje de mortalidad obtenida en cada unos de los tratamientos evaluados en Oleaginosas Bucarelia S. A. Diseño completamente al azar. Randomized Complete AOV Table for DATOS Source DF SS MS F P BLOQUES 4 428.4 107.10 TRATAMIEN 2 9093.7 4546.87 57.05 0.0000 Error 8 637.6 79.70 Total 14 10159.7 Grand Mean 27.533 CV 32.42 Tukey's 1 Degree of Freedom Test for Non additivity Source DF SS MS F P Nonadditivity 1 24.623 24.6233 0.28 0.6123 Remainder 7 612.977 87.5681 Relative Efficiency, RCB 1.04 Means of DATOS for TRATAMIEN TRATAMIEN Mean 1 3.000 2 18.400 3 61.200 Observations per Mean 5 Standard Error of a Mean 3.9925 Std Error (Diff of 2 Means) 5.6462 Tukey HSD All-Pairwise Comparisons Test of DATOS for TRATAMIEN TRATAMIEN Mean Homogeneous Groups 3 61.200 A 2 18.400 B 1 3.000 B Alpha 0.05 Standard Error for Comparison 5.6462 Critical Q Value 4.034 Critical Value for Comparison 16.106 Error term used: BLOQUES*TRATAMIEN, 8 DF There are 2 groups (A and B) in which the means are not significantly different from one another.
