desarrollo de un modelo computacional como …

DESARROLLO DE UN MODELO COMPUTACIONAL COMO PLATAFORMA PARA EL

ESTUDIO DE GALACTOSEMIA CLÁSICA

AMANDA ROCÍO CARO NARANJO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE NUTRICIÓN Y DIETÉTICA

BOGOTÁ, D.C

NOVIEMBRE, 2017




TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

NUTRICIONISTA DIETISTA

DIRECTORA DE TRABAJO DE GRADO

JOHANA MARÍA GUEVARA MORALES

CODIRECTORA DE TRABAJO DE GRADO

OLGA YANETH ECHEVERRI PEÑA

ASESORA DE TRABAJO DE GRADO

DIANA MARCELA ROJAS GÓMEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE NUTRICIÓN Y DIETÉTICA

BOGOTÁ, D.C

NOVIEMBRE, 2017

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N°13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral

católica y porqué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes

bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.




APROBADO

Johana María Guevara Morales Olga Yaneth Echeverri Peña

Bacterióloga. Ph.D. Bacterióloga. Ph.D.

Directora Codirectora

Diana Marcela Rojas Gómez Valentina Guzmán Pérez

Nutricionista Dietista. Ph.D. Nutricionista Dietista. Ph.D

Asesora Jurado




APROBADO

Concepción Judith Puerta Bula. Ph.D. Martha Constanza Liévano Fiesco ND. MSc.

Decana Directora de Carrera

Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias

DEDICATORIA

Este trabajo está dedicado a mi familia y amigos, quienes cada día me demuestran su apoyo

incondicional y me hacen sentir afortunada por tenerlos en mi vida. Deseo que para los que

ya emprendieron el camino en esta carrera, este manuscrito sea la pauta o el impulso para

asumir nuevos retos y ver más allá de lo que creemos conocer; pensar que siempre hay algo

nuevo que aprender y que vale la pena hacerlo para dar lo mejor a nuestros pacientes y sus

familias.

vi

AGRADECIMIENTOS

Gracias a Dios y a mi familia, quienes me han permitido estudiar las cosas que he querido y

creer que vale la pena seguir y construir nuevos sueños, gracias porque no dejan de confiar

en que me espera una vida llena de logros y aprendizaje.

Gracias a mis amigos por impulsarme a tomar riesgos y a creer en ellos, por llenar mi vida de

momentos que vale la pena recordar y estar siempre dispuestos a escuchar.

A Johana Guevara, Olga Echeverri y Diana Rojas debo decirles que no pude pedir ni imaginar

mejores guías, gracias es poco para todo lo que hicieron por mí, pero es lo mejor que se puede

decir por eso debo agradecerles por aceptar este proyecto y ser tan comprometidas e

incondicionales, por cada momento que me regalaron que atesorare siempre; me ayudaron a

crecer como profesional y como persona, con su ejemplo me enseñaron que nuestra

formación nunca termina porque siempre se puede trabajar con dedicación para dar lo mejor

a las personas.

Gracias a Nelson Vega por mostrarme el mundo de la Biología de sistemas y todo lo que esta

herramienta nos permite hacer para acercarnos un poco más a la medicina de precisión y

ampliar nuestra formación, por su ayuda y motivación. También quiero agradecer a Ángela

García y Diego Salazar por estar dispuestos a enseñarme y orientarme de la mejor manera

posible, además de impulsarme a continuar aprendiendo y creciendo, muchas gracias por todo

su tiempo.

Finalmente gracias a cada uno de mis profesores por hacer parte del camino, inspirar sueños

y motivarnos a crecer sin olvidarnos de nuestros principios y lo que se puede lograr trabajando

en equipo para ser integrales en todo sentido.

vii

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1

2. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 2

2.1 GALACTOSEMIA CLÁSICA. .......................................................................................... 2

2.1.1 Metabolismo de la galactosa. .................................................................................. 3

2.1.2 Fisiopatología de la Galactosemia Clásica. ............................................................. 3

2.1.3 Tratamiento. ............................................................................................................. 4

2.1.4 Modelos animales. ................................................................................................... 6

2.2 BIOLOGÍA DE SISTEMAS Y MODELOS A ESCALA GENÓMICA COMO

HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDADES. .............................................. 6

2.2.1 Reconstrucción de modelos a escala genómica. .................................................... 7

2.2.3 Aplicaciones de los modelos a escala genómica. ................................................... 8

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ....................................................... 9

3.1 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN ................................................................................. 9

3.2 JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................... 10

4.1 OBJETIVO GENERAL .................................................................................................. 11

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 11

5. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 12

5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ................................................................................ 12

5.2 MÉTODOS ................................................................................................................... 12

6. RESULTADOS .................................................................................................................... 14

6.1 ENRIQUECIMIENTO DEL MODELO IHEPATOCYTES 2322 ..................................... 14

6.2 CARACTERIZACIÓN DEL FENOTIPO METABÓLICO. .............................................. 15

6.2.1 Distribución de flujos en condición normal vs deficiencia de GALT. ..................... 15

6.2.2 Distribución de flujos en el metabolismo primario de galactosa. ........................... 17

6.2.3 Reacciones activas por vía metabólica. ................................................................. 19

6.2.4 Distribución de flujos en el metabolismo energético. ............................................. 20

7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ......................................................................................... 21

8. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 29

9. RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 29

10. REFERENCIAS ................................................................................................................. 30

viii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Ajustes realizados para generar el modelo enriquecido (iHepatocytes 2322_sd.galt)…………………………………………………………………………………………14

ÍNDICE DE FÍGURAS

Figura 1. Metodología……………………………………………………………………………….13

Figura 2. Total de reacciones activas en condiciones anabólicas. Resultados obtenidos con

los tres modelos al tomar como objetivo la síntesis de glucógeno……………………………...16

Figura 3. Total de reacciones activas en condiciones catabólicas. Resultados obtenidos con

los tres modelos al tomar como objetivo la producción de ATP………………………………...16

Figura 4. Distribución de flujos en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt y iHepatocytes

2322_def galt tomando como objetivo la síntesis de glucógeno y una entrada de 62g/kg/día

(6,25 fmol/célula/hora) de galactosa……………………………………………………………….17

Figura 5. Distribución de flujos en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt y iHepatocytes

2322_def galt tomando como objetivo la producción de ATP y una entrada de 62g/kg/día (6,25

fmol/célula/hora) de galactosa………………………………………………………………………18

Figura 6. Reacciones activas por vía metabólica para la síntesis de glucógeno en respuesta

a la entrada de 62g/kg/día (6,25 fmol/célula/hora) de galactosa……………………………….19

Figura 7. Reacciones activas por vía metabólica para la producción de ATP en respuesta a la

entrada de 62g/kg/día (6,25 fmol/célula/hora) de galactosa……………………………………..20

Figura 8. Distribución de flujos metabólicas en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt y el

modelo iHepatocytes 2322_def.galt al tomar como objetivo la síntesis de glucógeno con un

flujo de entrada de 6,25 fmol/célula/hora de galactosa…………………………………………..22

Figura 9. Distribución de flujos metabólicas en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt y el

modelo iHepatocytes 2322_def.galt al tomar como objetivo la producción de ATP con un flujo

de entrada de 6,25 fmol/célula/hora de galactosa………………………………………………..23

ÍNDICE DE APÉNDICES

Apéndice A. Metabolismo de la galactosa

Apéndice B. Vías alternas al metabolismo de la galactosa

Apéndice C. Contenido de galactosa libre en algunos alimentos

ix

Apéndice D. Estudios y recomendaciones para el tratamiento de galactosemia clásica

Apéndice E. Metodología

Apéndice F. Reacciones modificadas en sintaxis

Apéndice G. Lista de tareas metabólicas

Apéndice H. Metabolitos eliminados

Apéndice I. Estudios elegidos para establecer la entrada de galactosa en el sistema

Apéndice J. Ajustes realizados en las reacciones de transporte

Apéndice K. Ajustes realizados en las reacciones de metabolismo primario de galactosa

Apéndice L. Distribución de flujos en la vía Leloir al tomar como objetivo la reacción de

GALE

Apéndice M. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de

0,77mg/kg/día (7,72E-5 fmol/célula/hora) de galactosa

Apéndice N. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de


Apéndice O. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de


Apéndice P. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de

114,3mg/kg/día (0,011 fmol/célula/hora) de galactosa

Apéndice Q. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de 10g/kg/día

(1 fmol/célula/hora) de galactosa

Apéndice R. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de 30g/kg/día

(3 fmol/célula/hora) de galactosa

Apéndice S. Flujo de las reacciones de intercambio al simular condiciones anabólicas y

catabólicas

ABREVIATURAS

1,3-Bifosfoglicerato 1,3-BPG

3-Fosfoglicerato 3-PG

Base de datos de enzimas de Braunschweig BRENDA

Reconstrucción y análisis basados en restricciones COBRA

Dihidroxiacetona fosfato DHAP

Errores Innatos del Metabolismo EIM

Ánalisis de balance de flujos FBA

Fructosa 1,6-bifosfato FBP

Glucosa 6-fosfatasa G6Pase

Glucosa 6-fofato deshidrogenasa G6PD

UDP-galactosa 4-epimerasa GALE

Galactoquinasa GALK

Galactosa Mutarotasa GALM

Galactosa1-fosfato uridil transferasa GALT

Gliceraldehido 3-fosfato GAP

Modelos a escala genómica GEMs

Base de datos del metaboloma humano HMBD

Reacción metabólica humana 2 HMR2

Atlas de proteínas humanas HPA

Inosina 5’-monofosfato IMP

Enciclopedia de Kioto de Genes y Genomas KEGG

Laboratorio de Matriz MATLAB

Orotidina 5’-monofosfato OMP

Fosfoenolpiruvato PEP

Fosfoglucomutasa PGM

Glucógeno fosforilasa PGYL

5-Fosforribosil-1-pirofosfato PRPP

Reconstrucción, análisis y visualización de redes metabólicas RAVEN

Radicales libres del Oxígeno ROS

UDP-glucosa/galactosa pirofosforilasa UGP

Uridinina 5’-monofosfato UMP

El recurso de proteínas universal UniProt

ABREVIATURAS PARA COMPARTIMENTOS DEL MODELO iHEPATOCYTES2322

Región extracelular S

Citosol C

Lisosoma L

Retículo endoplasmático R

Aparato de Golgi G

Peroxisoma P

Mitocondria M

Núcleo N

vii

RESUMEN

Los errores innatos del metabolismo se asocian a defectos en una proteína, enzima o cofactor

que producen una alteración en las rutas metabólicas normales de la célula. Dentro de estas

alteraciones se encuentra la galactosemia, un grupo de tres enfermedades clasificadas según

la enzima afectada como tipo I (GALT), II (GALK) y III (GALE). Aunque la mayoría de estudios

se han enfocado en la más común de las tres enfermedades (galactosemia clásica o tipo I),

aún se desconoce su fisiopatología y tratamiento más adecuado, por lo cual se requieren más

estudios orientados al entendimiento de las alteraciones bioquímicas que implica. De este

modo, el objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo in silico de galactosemia clásica

como plataforma para realizar estudios bioquímicos. Para esto se realizó el enriquecimiento

del modelo más completo actualmente (iHepatocytes2322), a través de la búsqueda de

literatura y bases de datos. Posteriormente se bloqueó la reacción catalizada por GALT y se

llevó a cabo un análisis de balance de flujos con diferentes cantidades de galactosa, utilizando

como objetivo una reacción anabólica como la síntesis de glucógeno y una reacción catabólica

como la producción de ATP. Como resultado se obtuvo un modelo capaz de producir galactitol

y galactonato en presencia de cantidades supra fisiológicas de galactosa. Los resultados

obtenidos sugieren que dicha deficiencia puede llevar a alteraciones en otras vías metabólicas

como el metabolismo de otras fuentes de carbohidratos, la β-oxidación, vía pentosas fosfato,

fosforilación oxidativa y producción de ROS, ofreciendo de este modo nuevos escenarios para

la investigación de la enfermedad.

ABSTRACT

Inborn errors of metabolism are caused by defect in in a protein, enzyme or cofactor that

produce alterations in the cell metabolism. Among these disorders we found the galactosemia,

a group of three diseases classified according to the affected enzyme as type I (GALT), II

(GALK) and III (GALE). Although most studies have focused on the most common of the three

diseases (classic galactosemia or type I), its pathophysiology and more adequate treatment

are still unknown, therefore further studies to understand the biochemical alterations involved

are required .Therefore, the aim of this study is to develop a in silico model of classic

galactosemia as a platform for developing basic biochemical studies. To this end, the most

complete model was enriched (iHepatocytes2322), through literature and databases search.

Subsequently, the reaction catalyzed by GALT was blocked and a flux balance analysis was

carried out with different amounts of galactose, using as metabolic objective either an anabolic

reaction such as glycogen synthesis or catabolic reaction such as ATP production. As outcome,

a model capable of producing galactitol and galactonate was obtained in the presence of supra

physiological galactose quantities. The results obtained suggest that GALT deficiency lead to

alterations in other metabolic pathways such as the metabolism of other sources of

carbohydrates, β-oxidation, pentose phosphate pathway, oxidative phosphorylation and ROS

production, thus offering new scenarios for research the illness.

1

1. INTRODUCCIÓN Los errores innatos del metabolismo (EIM) son enfermedades que resultan de la mutación en

un gen que codifica a una proteína, enzima o cofactor, generando la limitación de su capacidad

funcional en una ruta metabólica específica. Como resultado de la alteración se produce

acumulación de un sustrato, depleción de un producto y/o producción de metabolitos

secundarios asociados a signos y síntomas de toxicidad sistémica.

A este grupo de enfermedades pertenece la galactosemia, un EIM de los carbohidratos que

comprende la deficiencia de las tres enzimas que permiten la integración de galactosa al

metabolismo energético mediante la síntesis de glucosa 1-fosfato. Según la enzima afectada,

la enfermedad puede clasificarse en tipo I, II y III si la alteración se produce en GALT, GALK

o GALE, respectivamente, siendo la tipo I o galactosemia clásica la más común y severa de

estas enfermedades.

La enzima GALT cataliza la síntesis de UDP-galactosa a partir de galactosa 1-fosfato, su

deficiencia causa la acumulación del sustrato y otros metabolitos como el galactitol , asociados

a un síndrome de toxicidad aguda caracterizado por signos y síntomas como emesis,

hepatomegalia, ictericia, daño tubular renal, cataratas, hipotonía, letargia, entre otros. Los

síntomas se desarrollan después de la ingesta de leche o formulas con lactosa y pueden

revertirse con la restricción de cualquier fuente de galactosa. A pesar de la adherencia al

tratamiento, la mayoría de los pacientes presentan complicaciones a largo plazo como

alteraciones neurológicas, disminución de la densidad mineral ósea y falla ovárica prematura.

Con el fin de comprender los mecanismos que generan la sintomatología, se han realizado

diversos estudios que a pesar de abarcar el conocimiento en la vía metabólica y determinar

vías alternas, no han logrado esclarecer la fisiopatología exacta y su relación con la producción

endógena y tolerancia a la galactosa exógena. Esto ha contribuido a la implementación de un

tratamiento variable a nivel mundial basado en la percepción que se tiene frente a los

alimentos, cantidades permitidas y riesgos del consumo de varias fuentes de galactosa, lo cual

refleja la necesidad de continuar la investigación, mediante estudios que permitan establecer

la base de los procesos patológicos y a futuro orienten el manejo más adecuado para la

enfermedad.

En los últimos años, además de los modelos experimentales usualmente utilizados, se han

empleado eficazmente instrumentos de la biología computacional como los modelos a escala

genómica (GEMs) para el análisis de diferentes enfermedades, la predicción de metabolitos

alterados y la búsqueda de objetivos terapéuticos eficaces. Este medio no ha sido explorado

en la galactosemia clásica, por lo cual en este estudio se desarrolló un GEM tejido específico

2

de hepatocito, en el cual se analizó el impacto de la deficiencia de la enzima GALT en el

metabolismo global teniendo en cuenta una condición anabólica y una catabólica (síntesis de

glucógeno y la producción de ATP, respectivamente).

Como resultado se obtuvo un modelo capaz de utilizar diferentes cantidades de galactosa y

producir metabolitos tóxicos como el galactitol y el galactonato en los dos momentos

metabólicos seleccionados. Adicionalmente, al simular la síntesis de glucógeno se obtuvo un

aumento en la actividad metabólica de carbohidratos como almidón, sacarosa, y fructosa,

además de la vía pentosas fosfato, síntesis de nucleótidos pirimidinicos y el ciclo de Krebs.

Por otra parte al simular la producción de ATP se generó un aumento en la actividad de la β-

oxidación, producción de ROS, además de cambios en la fosforilación oxidativa, sin embargo

la actividad en glucolisis fue nula. Estos resultados se relacionan con hallazgos previamente

reportados y ofrecen nuevos escenarios para la investigación de la galactosemia clásica.

2. MARCO TEÓRICO

2.1 GALACTOSEMIA CLÁSICA.

La galactosa es un compuesto vital para el ser humano, al que se le atribuyen una amplia

variedad de funciones que incluyen proveer energía y ser un sustrato básico para la síntesis

de glicoconjugados (Coelho, Rubio-Gozalbo, Vicente, & Rivera, 2017; Ribeiro, Silva, &

Figueira, 2014). Durante los primeros meses de vida, se considera el principal sustrato para

la síntesis de glucógeno hepático, ya que se incorpora más rápido que la glucosa (Bossolan,

Trindade, & Barreiros, 2007; Brown et al., 2010). Asimismo al ser un componente estructural

de cerebrósidos y gangliósidos, se requiere para el desarrollo de células cerebrales y el

sistema nervioso central (Lv, & Yu, 2014).

Se conoce como galactosemia a un grupo de tres EIM, caracterizados por la incapacidad de

metabolizar galactosa. Se clasifica en los tipos I, II y III atendiendo a si la deficiencia es de la

enzima galactosa 1-fosfato uridil transferasa (GALT), galactoquinasa (GALK) o UDP galactosa

4-epimerasa (GALE) respectivamente (Lv, & Yu, 2014; Timson, 2016). De este grupo de

enfermedades, la galactosemia clásica o tipo I es el EIM más común y severo, con una

incidencia variable alrededor del mundo que se encuentra en un rango de 1:14000 – 1:53000

(Jumbo-Lucioni et al., 2012; Ridel, Leslie, & Gilbert, 2005; Timson, 2016). La población

Colombiana no cuenta actualmente con datos epidemiológicos.

Generalmente la enfermedad se asocia con signos y síntomas como hepatomegalia, daño

tubular renal, ictericia, emesis, edema cerebral, hipotonía, letargia, sepsis por E. coli, entre

otros (Bosch, 2011; Coelho et al., 2017; Jumbo-Lucioni et al., 2012; Krabbi, Uudelepp, Joost,

Zordania, & Ounap, 2011; Van Calcar et al., 2014).

3

2.1.1 Metabolismo de la galactosa.

A partir de la hidrólisis de lactosa en el intestino delgado, se obtiene galactosa y glucosa; la

galactosa es transportada a través del enterocito por las proteínas SGLT1 y GLUT2 (Coelho

et al., 2017). Una vez que llega al hígado (el sitio principal del metabolismo de galactosa) por

vía porta es convertida en glucosa por medio de una serie de reacciones enzimáticas,

conocidas como la vía Leloir (ver Apéndice A) (Coelho et al., 2017; Ribeiro et al., 2014).

Se han propuesto tres vías alternas al metabolismo de galactosa (ver Apéndice B), la primera

de ellas es la reducción de galactosa a galactitol a través de la vía de los polioles que involucra

enzimas dependientes de NADPH (Coelho et al., 2017).

La segunda vía alterna, consiste en la oxidación de galactosa a galactonato por la galactosa

deshidrogenasa, generalmente este metabolito se excreta en orina (Coelho et al., 2017;

Ribeiro et al., 2014). La vía de la pirofosforilasa actúa como una derivación dependiente de

GALK, ya que provee el sustrato (galactosa 1-fosfato) para la síntesis de UDP galactosa,

mediante la enzima UDP glucosa/galactosa pirofosforialsa (UGP); una enzima que ejerce una

segunda reacción a partir de glucosa 1-fosfato y UTP (Coelho et al., 2017; Ribeiro et al., 2014;

Van Calcar et al., 2014).Sin embargo, la síntesis de UDP-galactosa parece leve comparada

con la producción que deriva de la acción de GALT; adicionalmente se ha propuesto que la

galactosa 1-fosfato actúa como un inhibidor competitivo de la UGP (Lai, Langley, Khwaja,

Schmitt, & Elsas, 2003), por lo cual autores como Berry (citado por Coelho et al., 2017) afirman

que la principal fuente de galactosa endógena es la hidrólisis lisosomal de glicoconjugados.

2.1.2 Fisiopatología de la Galactosemia Clásica.

La deficiencia de GALT genera la acumulación de galactosa, galactosa 1- fosfato y derivados

como el galactitol, con un efecto potencialmente tóxico, asociado a los signos y síntomas

mencionados anteriormente (Bosch, 2011; Coelho et al., 2017; Jumbo-Lucioni et al., 2012;

Krabbi et al., 2011; Van Calcar et al., 2014). Debido a que el galactitol no es sustrato para la

segunda enzima de la vía de los polioles, se produce un aumento del metabolito en tejidos,

que conlleva además de un efecto hiperosmótico, a la acumulación de radicales libres y estrés

oxidativo por la disminución de la actividad de la glutatión reductasa, lo cual se asocia a muerte

célular y formación de cataratas (Coelho et al., 2017; Ribeiro et al., 2014).

Autores como Ribeiro et al, (2014) refieren dos hipótesis para explicar la toxicidad de la

galactosa 1-fosfato, la primera consiste en que niveles elevados del metabolito podrían

“conducir a reacciones de fosforilación inútiles en las que el ATP queda atrapado en galactosa-

1-fosfato, el cual se puede desfosforilar a metabolitos que no tienen capacidad de generar

energía”; en la segunda hipótesis se cree que la acumulación de galactosa 1-fosfato podría

4

“inhibir las enzimas esenciales de metabolismo de la glucosa como glucosa 6-fosfatasa

(G6Pase), glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), fosfoglucomutasa (PGM), glucógeno

fosforilasa (PGYL) y UGP” alterando la producción de energía. Además se reportó que niveles

elevados del sustrato de GALT inhiben la galactosil transferasa, lo que podría explicar

parcialmente los defectos en la glicosilación asociados a la enfermedad (Ribeiro et al., 2014).

La fisiopatología exacta de la sintomatología aguda y las complicaciones a largo plazo

asociadas a alteraciones neurológicas, falla ovárica prematura y baja densidad mineral ósea

aún se desconocen; sin embargo una posible explicación para estos signos clínicos podría ser

el defecto en la formación de galactolípidos y glicoproteínas, producidos por la deficiencia de

UDP hexosas, que conllevaría a una alteración en la mielina, la hormona folículo estimulante

y el colágeno (Pannis, & Forget, 2004; Ridel et al., 2005).

2.1.3 Tratamiento.

A la fecha la restricción dietaría de galactosa es el único tratamiento recomendado a los

pacientes con Galactosemia clásica, puesto que permite prevenir o revertir la sintomatología

aguda (Coelho et al., 2017). Regularmente las complicaciones clínicas aparecen después de

la ingesta de leche materna o fórmulas con lactosa, por lo cual se inicia el manejo con fórmulas

especiales a base de soya o elementales (Bosch, 2011; Van Calcar et al., 2014). Algunos

casos reportados indican que la ingesta de fórmulas elementales genera una rápida reducción

de las concentraciones de galactosa 1-fosfato en eritrocitos, sin embargo estos casos carecen

de un grupo control y no se han realizado estudios que demuestren mejoría en los resultados

a largo plazo con el uso de este tipo de fórmulas (Van Calcar et al., 2014). Por otro lado, se

ha debatido sobre la seguridad de utilizar fórmulas a base de soya, debido al contenido de

estrógenos, sin embargo no existe evidencia que demuestre efectos perjudiciales en la salud

ósea, reproductiva y/o endocrina (Annet M. Bosch, 2011; Welling et al., 2017); no obstante, el

único consenso a la fecha es la necesidad de restringir cualquier fuente de galactosa en el

neonato (Van Calcar et al., 2014).

Anteriormente, con el inicio de la alimentación complementaria se prohibían alimentos lácteos

como leche de vaca y derivados como yogurt y quesos, ya que son la principal fuente de

galactosa libre y contienen alrededor de 2400mg, 1800mg y 600mg, respectivamente, de

galactosa en 100g o ml de alimento (Bosch, 2011; Ribeiro et al., 2014; Van Calcar et al., 2014).

Además, se recomendaba evitar alimentos como vísceras, en los cuales la galactosa se

encuentra ligada en forma de galactolípidos, galactosil cerebrósidos y gangliósidos (Lv, & Yu,

2014; Ribeiro et al., 2014; Van Calcar et al., 2014) En los años noventa, se demostró la

presencia de galactosa en frutas, vegetales y leguminosas, la cual se encuentra libre o ligada

5

en forma de polisacáridos como arabinogalactanos, oligosacáridos como rafinosa, estaquiosa

y verbascosa o conjugada con proteínas y lípidos (Lv, & Yu, 2014; Van Calcar et al., 2014); en

consecuencia se desarrollaron guías de manejo, más restrictivas (Van Calcar et al., 2014).

Actualmente no existe consenso sobre los alimentos permitidos en la ablactación de estos

pacientes, considerando factores como el hecho de que gran parte de la galactosa que se

encuentra en frutas, verduras y leguminosas no puede digerirse, por falta de enzimas en el

tracto gastrointestinal (Van Calcar et al., 2014). Adicionalmente la mayoría de estos alimentos

tienen un contenido de galactosa libre menor a 50mg/100g de alimento (ver Apéndice C), el

cual ha sido considerado irrelevante para la carga total de galactosa comparado con la

producción endógena (Van Calcar et al., 2014); no obstante las concentraciones del alimento

pueden variar, según el almacenamiento, maduración y la aplicación de algunas técnicas de

procesamiento (Van Calcar et al., 2014). De igual forma, una de las razones que lleva a

cuestionar el beneficio de prolongar la restricción de estos alimentos es que a futuro podrían

generar deficiencias nutricionales, ya que son fuentes de vitaminas fibra y minerales (Van

Calcar et al., 2014).

Además de considerar la inclusión en la dieta de los alimentos mencionados anteriormente,

algunos expertos recomiendan el consumo de quesos madurados, por su bajo contenido de

galactosa y el aporte significativo de Calcio que puede contribuir al aumento de la densidad

mineral ósea de los pacientes (Coelho et al., 2017; Van Calcar et al., 2014); no obstante, la

cantidad de galactosa libre de los quesos podría estar determinada por factores como, el tipo

de cepa utilizado, la producción a nivel regional o industrial y las condiciones y tiempo de

maduración (Van Calcar, Bernstein, Rohr, Berry, Yannicelli, & Scaman, 2014).

Por otro lado, se cree que la producción de galactosa endógena disminuye con la edad y

podría aumentar la tolerancia a la galactosa exógena, debido a los estudios reportados por

Bosch y Coss (citado por Van Calcar et al.,2014; Welling et al., 2017) donde adolescentes y

adultos consumieron entre 600mg-4000mg/día de galactosa durante 14 semanas, sin

presentar complicaciones ni aumento en los niveles de galactosa en eritrocitos; sin embargo

aún se desconoce el rol de la producción endógena, la edad en la cual posiblemente aumente

la tolerancia, además de la correlación entre las concentraciones de metabolitos de galactosa

y las complicaciones a largo plazo que suelen presentarse a pesar del tratamiento (Bosch,

2011; Jumbo-Lucioni et al., 2012; Krabbi et al., 2011; Ribeiro et al., 2014; Van Calcar et al.,

2014), por lo cual no se puede ignorar el hecho de que una liberación dietaría podría

incrementar rápidamente la carga de galactosa y generar complicaciones a largo plazo

(Bosch, 2011).

6

Como se mencionó anteriormente el tratamiento varia ampliamente alrededor del mundo, por

falta de consenso (Jumbo-Lucioni et al., 2012; Ribeiro et al., 2014), a pesar de ello en países

como Bélgica se ha logrado el desarrollo de guías de manejo, basadas tanto en restricciones

severas promovidas por países como Francia y las recomendaciones más flexibles de otros

Estados como Inglaterra (Kerckhove et al., 2015); sin embargo, en este país la cantidad de

galactosa diaria recomendada aun depende del centro médico (Adam et al., 2015). En un

esfuerzo para unificar criterios, se creó una guía para el diagnóstico, tratamiento y

seguimiento con el apoyo de redes internacionales como GalNet, donde se recomienda

permitir el consumo de cualquier cantidad y tipo de alimento que contenga menos de

25mg/100g a excepción de productos de soya fermentados (Welling et al., 2017) (ver Apéndice

D). De igual forma, como parte del tratamiento dietario, se han considerado otras opciones,

como el consumo de papa dulce o la extracción de sus componentes con el fin de contrarrestar

el estrés oxidativo asociado a la enfermedad, gracias a su contenido en antocianinas (Timson,

2014). Sin embargo algunos expertos consideran que el tratamiento debe ir más allá de una

restricción dietaría, por lo cual se ha evaluado el desarrollo de inhibidores de GALK (Coelho

et al., 2017; Timson, 2016) y terapias a base de chaperonas que permitan mejorar la actividad

y estabilidad de la enzima, contribuyendo de este modo a un nuevo enfoque terapéutico

(Coelho et al., 2017).

2.1.4 Modelos animales.

Como una alternativa para el mejor entendimiento de la patología se han desarrollado

modelos de levaduras, bacterias, ratones y Drosophila melanogaster, por los cuales se afirma

que la exposición a galactosa induce estrés en el retículo endoplasmático, y puede clasificarse

como un desorden conformacional debido a la disminución en la estabilidad de la enzima

GALT (Coelho et al., 2017), sin embargo ninguno de los modelos animales ha logrado

reproducir totalmente el fenotipo de la enfermedad (Coelho et al., 2017; Lai et al., 2003; Ridel

et al., 2005). Es por esto que hasta el momento no se comprende completamente la

fisiopatología y en este contexto se pueden considerar otras herramientas como la biología de

sistemas, ya que ofrece una plataforma de estudio a partir de la recopilación de diseños

experimentales, datos fisiológicos, bioquímicos y genéticos en una reconstrucción de redes

metabólicas (Adil Mardinoglu et al., 2014).

2.2 BIOLOGÍA DE SISTEMAS Y MODELOS A ESCALA GENÓMICA COMO

HERRAMIENTAS PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDADES.

De la mano de la tecnología, la biología de sistemas surge hacia el año 2000, como una

herramienta dinámica para el estudio de estados funcionales celulares (condiciones

fisiológicas), mediante el desarrollo de reconstrucciones computacionales de redes

7

metabólicas capaces de sintetizar transformaciones bioquímicas de diferentes organismos ,

que aumentaban a medida que lo hacía la secuenciación del genoma (Palsson, 2006; Thiele,

& Palsson, 2010).

Esta disciplina ofrece un “enfoque computacional y experimental combinado para el análisis

de sistemas biológicos complejos” (Huang & Juan, 2012) que permite obtener un acercamiento

a los mecanismos que determinan la relación genotipo-fenotipo, predecir metabolitos alterados

en diferentes enfermedades, identificar biomarcadores, capturar las propiedades de fármacos

y su relación con la enfermedad, determinar nuevos objetivos terapéuticos, entre otros (Huang

& Juan, 2012; Mardinoglu, Gatto, & Nielsen, 2013; Pagliarini & di Bernardo, 2013)

2.2.1 Reconstrucción de modelos a escala genómica.

Uno de los enfoques de la biología de sistemas, ha sido el desarrollo de modelos a escala

genómica (GEMs), que consisten en reconstrucciones capaces de capturar la complejidad del

metabolismo en un modelo matemático, sujeto al desarrollo de restricciones que permiten

simular un fenotipo (Mardinoglu et al., 2013). El proceso de reconstrucción de un modelo

computacional depende inicialmente de identificar funciones metabólicas, reacciones y datos

experimentales fisiológicos y bioquímicos, a través de la búsqueda exhaustiva de literatura y

bases de datos disponibles que recopilan información sobre el organismo de interés (Thiele,

& Palsson, 2010).

Posteriormente se convierte la reconstrucción a un sistema matemático utilizando software de

cálculo como Matlab y herramientas de simulación como COBRA y RAVEN a través de un

análisis de balance de flujo (FBA) (Orth, Thiele, & Palsson, 2010; Thiele, & Palsson, 2010).

Este tipo de análisis se define como un enfoque matemático capaz de estimar la tasa de

producción de las reacciones metabólicas mediante la aplicación de una serie de comandos

(García Sánchez & Torres Sáez, 2014; Orth et al., 2010); para conseguir el flujo de las

reacciones (v) se requiere delimitar el espacio de la distribución de flujos, estableciendo

restricciones o límites en el sistema (por ejemplo el consumo de un metabolito específico)

asumiendo un estado estable, es decir, que todo lo que se consume se utiliza y permanece

constante en el tiempo (García Sánchez & Torres Sáez, 2014). Además de las restricciones,

el sistema requiere establecer funciones objetivo, puesto que estas representan la condición

que desea evaluarse; algunos ejemplos de funciones objetivo son: tasa de producción de ATP,

tasa de producción de un sustrato, producción de biomasa, entre otros (Orth et al., 2010).

La matriz estequiométrica y las funciones objetivo, definen un sistema de ecuaciones lineales,

que deben resolverse mediante programación lineal, para conseguir datos que puedan

validarse con reportes experimentales (Orth et al., 2010); para ello se dispone de programas

8

o solvers como Mosek o Gurobik incluidos en los Toolbox RAVEN y COBRA (Orth et al., 2010;

Thiele, & Palsson, 2010). Después de comparar con la literatura se realizan los ajustes

necesarios hasta obtener las simulaciones o condiciones deseadas en el sistema (Thiel, &

Palsson, 2010).

2.2.3 Aplicaciones de los modelos a escala genómica.

Algunos GEMs son el resultado de la expansión o enriquecimiento de otras reconstrucciones,

que se dan al integrar manualmente elementos de la literatura y comparar con diferentes bases

de datos, es decir, se realiza el refinamiento y se repiten los pasos para la reconstrucción de

un modelo computacional (Mardinoglu et al., 2014). Algunos ejemplos de GEMs son Recon 2,

una reconstrucción consenso del metabolismo humano que parte de la expansión de Recon1,

capaz de predecir cambios de metabolitos en 49 errores innatos del metabolismo y de

determinar el efecto de algunos medicamentos en enfermedades como el cáncer (Thiele et

al., 2013); HepatoNet 1, una reconstrucción de un modelo tejido específico para el estudio de

enfermedades y el modelo iHepatocytes 2322, una reconstrucción consenso para hepatocitos,

que incluye la extensión de modelos previos como iHepatocytes 1154, HepatoNet1, iAB676,

ILJ1046, datos de modelos como HMR2, iAdipocytes 1809, datos proteomicos y una

exhaustiva búsqueda de literatura, dando como resultado 2322 genes, 5686 metabolitos (2895

metabolitos únicos), 7930 reacciones en 8 compartimientos (Mardinoglu et al., 2014). El

modelo fue capaz de simular 256 diferentes funciones metabólicas y permitió identificar una

deficiencia de serina en pacientes con enfermedad del hígado graso no alcohólico (Mardinoglu

et al., 2014).

Actualmente se ha incrementado el uso de modelos celulares y/o tejido específicos, con el fin

de obtener un acercamiento a las alteraciones asociadas a enfermedades como cáncer,

obesidad, diabetes, entre otras (Geng & Nielsen, 2017; Adil Mardinoglu et al., 2013). De igual

forma, estas reconstrucciones metabólicas, han permitido identificar objetivos terapéuticos

para el desarrollo de fármacos y efectos secundarios de este tipo de tratamiento,

principalmente en modelos de células cancerígenas (Geng & Nielsen, 2017). En el estudio de

(Nilsson, Mardinoglu, & Nielsen, 2017) , se pudo simular las curvas de crecimiento y cambios

en la composición corporal desde el nacimiento hasta los 6 meses, utilizando el modelo HMR2

e integrando datos de ingesta, composición de la leche y gasto energético; con otras

simulaciones se pudo determinar que deficiencias de Co, Fe y Mg afectan la producción de

energía y limitan el crecimiento.

Como se mencionó anteriormente, su aplicación se ha extendido a la evaluación de EIM, ya

sea a partir de la simulación de mutaciones, predicción de metabolitos y reacciones alteradas

9

en hepatocitos, por enfermedades como fenilcetonuria, intolerancia a la fructosa,

homocistinuria, entre otras (Pagliarini, & Di Bernardo, 2013). Además del modelamiento de

procesos de estrés oxidativo, beta oxidación y alteraciones en el metabolismo de

esfingolípidos que permitieron identificar a β-hexosaminidasa y β-glucoronidasa como

potenciales biomarcadores en enfermedades como la mucopolisacaridosis (Salazar et al.,

2016).

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

La galactosemia clásica se caracteriza por un síndrome de toxicidad aguda relacionada con

la acumulación de galactosa 1-fosfato y metabolitos como el galactitol en eritrocitos, hígado,

riñón y cristalino; además de la alteración en glicoconjugados por la deficiencia de UDP

hexosas. Clínicamente, la enfermedad se asocia con signos y síntomas como cataratas,

ictericia, hepatomegalia, daño tubular renal, pobre ganancia de peso, hipotonía, letargia, entre

otros (Coelho et al., 2017; Ribeiro et al., 2014; Van Calcar et al., 2014).

Generalmente los signos y síntomas aparecen días después de la ingesta de leche materna o

fórmulas con lactosa y pueden mitigarse mediante la restricción de lácteos, derivados y otras

fuentes de galactosa como frutas, verduras y vísceras. Aunque el tratamiento es efectivo para

revertir la sintomatología aguda, parece no tener efecto en el desarrollo de complicaciones a

largo plazo asociadas a daño neurológico y falla ovárica prematura (Bosch, 2011; Jumbo-

Lucioni et al., 2012; Krabbi et al., 2011; Ribeiro et al., 2014; Van Calcar et al., 2014). Hasta el

momento se desconoce con detalle los mecanismos que inciden en la sintomatología y su

relación con factores como la síntesis de galactosa endógena y la tolerancia a la galactosa

exógena (Coelho et al., 2017; Ribeiro et al., 2014; Van Calcar et al., 2014).

Algunos expertos consideran que la producción endógena disminuye con la edad y no se

presenta una alteración significativa por el aporte de alimentos diferentes a los lácteos (Van

Calcar et al., 2014; Welling et al., 2017). Esta situación ha llevado a que el manejo nutricional

de los pacientes con galactosemia, a nivel mundial, sea heterogéneo y esté basado en la

percepción u opinión que se tiene de la enfermedad, frente a aspectos como la cantidad de

galactosa permitida en la ingesta, el consumo de frutas, verduras, legumbres, vísceras, quesos

madurados y el manejo por grupo etario (Jumbo-Lucioni et al., 2012; Van Calcar et al., 2014;

Welling et al., 2017). Un ejemplo de ello es que países como España y Francia defienden una

dieta de por vida libre de cualquier fuente de galactosa, frente a algunos centros en Alemania,

Holanda y Estados Unidos que recomiendan únicamente una dieta libre de lactosa (Bosch,

2011; Jumbo-Lucioni et al., 2012; Kerckhove et al., 2015). Actualmente no hay evidencia

10

científica que soporte la recomendación de una cantidad de galactosa específica por grupo

etario, por lo cual las últimas guías de manejo sugieren permitir cualquier cantidad y tipo de

alimento con un contenido de galactosa menor a 25mg/100g de alimento (Welling et al., 2017).

Por el contrario otros autores recomiendan alimentos con una composición menor a 5mg/100g

de alimento (Colombo, Cornejo & Raimann, 2017), y algunos centros han establecido una

cantidad de hasta 500mg para adultos con galactosemia clásica, sin embargo se desconoce

la cantidad o rango permitido que manejan desde la ablactación (Adam et al., 2015); además,

se desconoce la cantidad límite de galactosa que se puede ingerir sin producir toxicidad

(Colombo et al., 2017).

De este modo permanece abierto el debate sobre los ajustes y limitaciones del tratamiento

actual, que conllevan a considerar nuevas alternativas con base en el estudio de las

interacciones bioquímicas y/o moleculares de la patología (Coelho et al., 2017; Timson, 2016).

Por lo anterior se requiere inicialmente de estudios que evalúen con detalle la fisiopatología

de la enfermedad, a partir de las alteraciones bioquímicas que podrían presentarse en

diferentes rutas metabólicas por el defecto en la enzima GALT y la utilización de galactosa,

con el fin de obtener nuevas perspectivas para lo que aún se desconoce y establecer así una

base teórica que a futuro permita desarrollar estrategias de intervención más efectivas y

mejorar así la calidad de vida de los pacientes y sus familias. Por lo tanto y de acuerdo a lo

anteriormente expuesto, en este estudio se desarrolló un modelo computacional tejido

específico de hepatocito bajo la condición de deficiencia de la enzima GALT como plataforma

para estudios sobre el efecto metabólico de esta deficiencia en la galactosemia clásica.

3.2 JUSTIFICACIÓN

La galactosemia clásica, es una enfermedad hereditaria causada por defectos en el

metabolismo de galactosa, debido a la deficiencia de GALT. La restricción de cualquier fuente

de galactosa fue el primer tratamiento recomendado y el único disponible a la fecha, sin

embargo en la mayoría de los casos no es suficiente para prevenir las complicaciones a largo

plazo (Bosch, 2011; Jumbo-Lucioni et al., 2012; Kerckhove et al., 2015; Krabbi et al., 2011;

Ridel et al., 2005; Van Calcar et al., 2014), que podrían ir más allá de alteraciones físicas y

contener aspectos emocionales, alterando posiblemente la participación social, situación y

calidad de vida de los pacientes y sus familias, dado que algunos adultos con galactosemia

clásica presentan un fenotipo de ansiedad y depresión y otros han llegado a considerar el

tratamiento como una carga (Hoffmann, Dragano, & Schweitzer-Krantz, 2012; Waisbren et al.,

2012).

11

No obstante el hecho de flexibilizar la dieta conllevaría a un aumento importante de la ingesta

diaria de galactosa, que podría incidir en la producción endógena y elevar la toxicidad, por lo

cual la liberación completa de la dieta no debería promoverse hasta que se conozcan los

mecanismos o las reacciones metabólicas y metabolitos interconectados que resultan de la

deficiencia de GALT y su relación con la ingesta de galactosa (Bosch, 2011; Mardinoglu et al.,

2014). Sin embargo, resulta evidente que una de las razones por las que las recomendaciones

nutricionales actuales se han instaurado sin conocer la fisiopatología exacta de la enfermedad,

radica en las limitaciones de los modelos celulares y animales desarrollados o el hecho de que

diferentes estudios se han enfocado en la búsqueda de biomarcadores en lugar de

interacciones (Coelho et al., 2017; Pannis, & Forget, 2004), por ello se requieren diseños

experimentales adicionales o complementarios orientados hacía el estudio de las

interacciones metabólicas generadas en la patología.

Un método no invasivo que puede contribuir a este fin y que no ha sido aplicado en el estudio

de la enfermedad, es el uso de GEMs, ya que representan el conocimiento actual del

metabolismo generado a través de la integración de estudios y datos celulares, bioquímicos y

fisiológicos (Mardinoglu et al., 2014) permitiendo analizar el cambio en las rutas metabólicas

ante diferentes alteraciones (Orth et al., 2010). De este modo un modelo in silico ofrece una

base teórica para el entendimiento de las alteraciones bioquímicas generadas por la

deficiencia de GALT (además del metabolismo primario y las vías alternas), y una plataforma

de estudio orientada hacia la medicina de precisión, en la búsqueda de las estrategias de

intervención más adecuadas para tratar la enfermedad y mejorar la calidad de vida de los

pacientes y sus familias.

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Desarrollar un modelo computacional tejido específico de hepatocito bajo la condición de

deficiencia de la enzima GALT.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

-Generar un modelo metabólico computacional hepático humano enriquecido para el

metabolismo de galactosa y rutas metabólicas asociadas.

-Determinar a través del análisis de balance de flujos, las alteraciones metabólicas asociadas

a la deficiencia de la enzima GALT.

-Evaluar la sensibilidad y distribución de flujos metabólicos durante la administración y

utilización de galactosa en el modelo propuesto para galactosemia clásica.

12

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

Estudio experimental descriptivo diseñado para determinar en un modelo computacional y

mediante el análisis de balance de flujos (FBA) el efecto metabólico que resulta de la

deficiencia de la enzima GALT en presencia de diferentes cantidades de galactosa.

5.2 MÉTODOS

A continuación se explica brevemente el procedimiento utilizado en el estudio (figura 1). La

descripción detallada de los métodos se encuentra en el Apéndice E.

Se seleccionó como punto de partida un GEM hepático, iHepatocytes 2322, considerado como

la reconstrucción célular / tejido-especifica más grande a la fecha. El modelo iHepatocytes

2322, incorpora datos obtenidos de la información de los modelos de hepatocito publicados

previamente, datos proteómicos, una actualización del HMR2 y la revisión exhaustiva de la

literatura y bases de datos, con el fin de garantizar la recopilación de todas las funciones

metabólicas hepáticas conocidas actualmente (Adil Mardinoglu et al., 2014)

Inicialmente se realizó una revisión de la literatura y bases de datos para establecer el

metabolismo primario de la galactosa y vías metabólicas alternas. Con base en esta

información se realizó un curado manual del metabolismo de la galactosa, verificando las

reacciones presentes, retirando o agregando y modificando reacciones según la necesidad.

Este proceso permitió generar un modelo enriquecido denominado iHepatocytes 2322_sd.galt,

que fue comparado con el modelo original para verificar el cumplimiento de tareas en el modelo

enriquecido (iHepatocytes 2322_sd.galt), utilizando los software MATLAB y RAVEN (ver

Apéndices F, G).

Una vez que se validó el modelo enriquecido, se bloqueó la enzima GALT para desarrollar un

modelo deficiente llamado iHepatocytes 2322_def.galt. Posteriormente se bloquearon algunos

metabolitos de entrada como toxinas y medicamentos (ver Apéndice H), estableciendo límites

o restricciones de entrada para aminoácidos, carbohidratos, grasas, entre otros, además de

límites para las vías alternas de la galactosa en cada uno de los modelos. Después se validó

iHepatocytes 2322_def.galt tomando como objetivo la reacción de GALE. Para evidenciar las

consecuencias metabólicas del defecto y la capacidad metabólica del hepatocito en

condiciones anabólicas y catabólicas, se evaluó la síntesis de glucógeno y producción de ATP,

respectivamente. Los análisis se realizaron en presencia de diferentes cantidades de

galactosa (ver Apéndice I) mediante la aplicación del FBA y los resultados se compararon con

los del modelo iHepatocytes 2322_sd.galt (condición normal).

13

Figura 1. Metodología. Para comparar la distribución de flujos en condición normal

(iHepatocytes2322_sd.galt) y deficiencia de la enzima GALT (iHepatocytes2322_def.galt) se

utilizó un análisis de balance de flujos (FBA).

Modelo original

Validación de iHepatocytes

2322_def.galt

Modelo enriquecido

Modelo deficiente

14

6. RESULTADOS

6.1 ENRIQUECIMIENTO DEL MODELO IHEPATOCYTES 2322

Después de realizar la revisión de reacciones y metabolitos en diferentes bases de datos y

literatura se modificaron, añadieron y/o eliminaron las reacciones indicadas en la Tabla1.

Adicionalmente se cambió la sintaxis de 42 reacciones y se eliminó la entrada de compuestos

no fisiológicos, como resultado se obtuvo un modelo enriquecido (iHepatocytes 2322_sd.galt)

con 7933 reacciones, 5246 metabolitos (2897 metabolitos únicos) y 2322 genes distribuidos

en 8 compartimientos. El modelo generado fue capaz de cumplir 262 tareas metabólicas que

incluyen la síntesis de nucleótidos, gluconeogénesis, síntesis y liberación de glucógeno,

absorción de aminoácidos esenciales, metabolismo de ácidos grasos, conjugación de

bilirrubina, vía de Leloir, entre otros.

Tabla 1. Ajustes realizados para generar el modelo enriquecido (iHepatocytes

2322_sd.galt)

Reacción (sintaxis modelo original) Ajustes

requeridos

Reacciones de transporte*

galactose[s] + Na+[s] => galactose[c] + Na+[c] Reacción eliminada

galactose[s] + 2 Na+[s] => galactose[c] + 2 Na+[c] Reacción eliminada

UDP-galactose[c] + UMP[g] <=> UDP-galactose[g] + UMP[c] Gen modificado

galactitol[c] => galactitol[s] Reacción añadida

alpha-D-galactonate[c] => alpha-D-galactonate[s] Reacción añadida

Reacciones de intercambio*

galactitol[s] => Reacción añadida

alpha-D-galactonate[s] => Reacción añadida

Reacciones del metabolismo primario de galactosa**

beta-D-galactose[c] <=> alpha-D-galactose[c] Reacción añadida

ATP[c] + galactose[c] => ADP[c] + galactose-1-phosphate[c] Reacción eliminada

glucose-1-phosphate[c] + UDP-galactose[c] <=> alpha-D-galactose-1-phosphate[c] + UDP-glucose[c]

Reacción eliminada

alpha-D-galactose + NADP+ <=> alpha-D-galactono-1,4-lactone + NADPH

+ H+ Reacción añadida

alpha-D-galactose-1-phosphate[c] + UTP[c] => PPi[c] + UDP-galactose[c] Gen y enzima modificada

glucose-1-phosphate[c] + UTP[c] => PPi[c] + UDP-glucose[c]

Reacción modificada en dirección

*La evidencia utilizada para las modificaciones se detalla en el apéndice J.

**La evidencia utilizada para las modificaciones se detalla en el apéndice K.

15

6.2 CARACTERIZACIÓN DEL FENOTIPO METABÓLICO.

6.2.1 Distribución de flujos en condición normal vs deficiencia de GALT.

A partir de iHepacytes 2322_sd.galt, se obtuvo iHepatocytes 2322_def.galt bloqueando la

reacción catalizada por GALT. Para verificar la alteración del flujo cuando no hay actividad en

GALT (ver Apéndice L), se evaluaron 4 entradas de galactosa tomadas a partir de estudios

experimentales y recomendaciones nutricionales (Apéndice I). Los resultados iniciales de los

modelos no mostraron cambios en los flujos del metabolismo primario en presencia de GALT,

ni producción de metabolitos tóxicos en ausencia de la enzima, por lo cual para reflejar mejor

lo ocurrido in vivo, se decidió aumentar los límites de flujo de las reacciones del galactitol y

galactonato a 5 fmol/célula/hora en el modelo iHepatocytes 2322_def.galt (que inicialmente

eran de 0,5 fmol/célula/hora) y probar cantidades supra fisiológicas a partir de 10g/kg/día

(1fmol/célula/hora) de galactosa, los cuales se fijaron como valores intermedios entre las

cantidades fisiológicas y un valor máximo obtenido de glucosa (6,25fmol/célula/hora)

reportado en el estudio de (Chan, Berthiaume, Lee, & Yarmush, 2003).

A pesar que no se encontraron cambios en las condiciones fisiológicas, se logró determinar

que la mayor tasa de producción de metabolitos tóxicos en ausencia de GALT fue con una

entrada de 6,25 fmol/célula/ hora que corresponde a 62g/kg/día de galactosa para un hombre

de 70kg. Posteriormente al evaluar las funciones objetivo elegidas para determinar la

capacidad metabólica del hepatocito en condiciones anabólicas y catabólicas (síntesis de

glucógeno y producción de ATP, respectivamente) en los tres modelos (original, enriquecido

y deficiente) no se observaron cambios en el número total de reacciones activas, excepto al

utilizar cantidades supra fisiológicas como se observa en las figuras 2 y 3. En dichas

circunstancias en condiciones anabólicas se observa un efecto variable, sin embargo el

número de reacciones de iHepatocytes 2322 siempre fue menor respecto a iHepatocytes

2322_sd.galt al tomar como objetivo la producción de ATP (figura 3).

16

Figura 2. Total de reacciones activas en condiciones anabólicas. Resultados obtenidos con

los tres modelos al tomar como objetivo la síntesis de glucógeno.

Figura 3. Total de reacciones activas en condiciones catabólicas. Resultados obtenidos al

tomar como objetivo la producción de ATP

17

6.2.2 Distribución de flujos en el metabolismo primario de galactosa.

Además de determinar el número total de reacciones activas por cada función objetivo, se observó la distribución de flujos, inicialmente,

en el metabolismo primario de galactosa. En el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt el flujo de la reacción catalizada por UGP y la tasa

de producción de glucógeno permaneció constante a pesar de las diferencias en las concentraciones de galactosa evaluadas

(fisiológicas y supra fisiológicas); por otro lado en el modelo iHepatocytes 2322_def.galt la reacción del galactitol se activó a partir de

la utilización de 10g/kg/día de galactosa, mientras que el galactonato se sintetizo en menor medida con un flujo de 3 fmol/célula/hora

(30g/kg/día) de galactosa; la mayor cantidad de galactitol y galactonato se produjo con un flujo de 6,25 fmol/célula/hora (62g/kg/día)

de galactosa como se observa en la figura 4.

Figura 4. Distribución de flujos en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt (a) y iHepatocytes 2322_def.galt (b) tomando como objetivo la

síntesis de glucógeno y una entrada de 62g/kg/día (6,25 fmol/célula/hora) de galactosa. La flecha de color gris en (b) indica hacía

donde tiende la reacción en el modelo.

a) b)

18

La tasa de producción de ATP en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt permaneció constante para todas las entradas de galactosa,

sin embargo con una cantidad por debajo de 10g/kg/día (1fmol/célula/hora) de galactosa se activaron únicamente las reacciones de

GALM y la vía del galactonato con la cantidad asignada. Por otro lado valores de 30g/kg/día y 62g/kg/día (3 y 6,25 fmol/célula/hora)

fueron capaces de activar la vía de Leloir, galactitol y galactonato, generando la misma cantidad de flujo para estos metabolitos (0,5

fmol/célula/hora). En la figura 5 se muestran los resultados para valores de 62g/kg/día.

En el modelo iHepatocytes 2322_def.galt se obtuvo el mismo resultado con valores de galactosa menores a 10g/kg/día, sin embargo

con un valores de 30 y 62 g/kg/día de galactosa la tasa de producción del galactitol y galactonato correspondía al 50% del valor de

entrada en términos de flujo. Adicionalmente la vía Leloir y de la pirofosforilasa permanecieron inactivas para todos los casos (figura 5)

Figura 5. Distribución de flujos en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt (a) y iHepatocytes 2322_def.galt (b) tomando como objetivo la

producción de ATP y una entrada de 62g/kg/día (6,25 fmol/célula/hora) de galactosa.

a) b)

19

6.2.3 Reacciones activas por vía metabólica.

Al simular una condición anabólica, en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt se encontró que

valores menores a 30g/kg/día (3fmol/célula/hora) no fueron capaces de activar el metabolismo

asociado a β-oxidación de ácidos grasos, que permaneció inactivo en iHepatocytes

2322_def.galt en todos los casos (ver Apéndice M, figura M1; Apéndice N, figura N1; Apéndice

O, figura O1, Apéndice P, figura P1; Apéndice Q, figuraQ1; Apéndice R, figura R1). Asimismo

el metabolismo del folato solo se activó en iHepatocytes 2322_def.galt con una cantidad de

62g/kg/día (6,25fmol/célula/hora) de galactosa (figura 6).

Figura 6. Reacciones activas por vía metabólica para la síntesis de glucógeno en respuesta

a la entrada de 62g/kg/día (6,25 fmol/célula/hora) de galactosa.

Al comparar iHepatocytes 2322_sd.galt con iHepatocytes 2322_def.galt, en una condición

catabólica, se encontró que el metabolismo del inositol fosfato permaneció inactivo en

iHepatocytes 2322_def.galt en presencia de cualquier cantidad de galactosa (ver Apéndice M,

figuras M2; Apéndice N, figura N2, Apéndice O, figura O2, Apéndice P, figura P2, Apéndice Q,

figura Q2, Apéndice R, figura R2). Adicionalmente en este modelo la detoxificación de ROS

se activó a partir de 30g/kg/día (3 fmol/célula/hora) de galactosa (ver figura R2), sin embargo

fue mayor con una entrada de 62g/kg/día (6,25fmol/célula/hora) (figura 7).

Vía

met

abó

lica

20

Figura 7. Reacciones activas por vía metabólica para la producción de ATP en respuesta a la

entrada de 62g/kg/día (6,25 fmol/célula/hora) de galactosa.

6.2.4 Distribución de flujos en el metabolismo energético.

En cuanto a la distribución de flujos que se obtuvo a partir de diferentes entradas de galactosa

y utilizando la síntesis de glucógeno como objetivo, se encontró que en el modelo iHepatocytes

2322_sd.galt con cantidades menores a 10g/kg/día (1fmol/célula/hora) de galactosa el flujo en

el metabolismo de almidón y sacarosa fue directamente proporcional a la entrada de

galactosa; sin embargo con valores por encima de esta cantidad se obtuvo el efecto contrario

hasta que la actividad fue nula. Adicionalmente a medida que aumentó la cantidad de

galactosa se redujo levemente el flujo en la glucólisis, la producción de Acetil CoA a partir de

piruvato, vía pentosas fosfato, ciclo de Krebs y fosforilación oxidativa. El metabolismo de

purinas y pirimidinas permaneció constante para todos los casos (figura 8).

Por otro lado en el modelo iHepatocytes 2322_def.galt a medida que aumentó la cantidad de

galactosa se redujo el flujo en glucólisis y aumentó en el metabolismo de sacarosa y almidón,

además de vía pentosas fosfato, metabolismo de pirimidinas, ciclo de Krebs y fosforilación

oxidativa. Adicionalmente a partir de una cantidad de 32g/kg/día (3fmol/célula/hora) de

galactosa comenzó a activarse la vía de los polioles, siendo mayor la tasa de producción con

un valor de 62g/kg/día (6,25fmol/célula/hora) de galactosa (figura 8).

Respecto a la distribución de flujos en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt tomando como

objetivo la producción de ATP, se encontró que a medida que aumentó la cantidad de

Vía

met

abó

lica

21

galactosa se redujo el flujo en el metabolismo del piruvato, purinas y β-oxidación y aumentó la

actividad en el metabolismo del aspartato y glutamato (figura 9).

En cuanto a la distribución de flujos en el modelo iHepatocytes 2322_def.galt tomando como

objetivo la producción de ATP, se encontró que a mayor cantidad de galactosa hubo mayor

producción de lactato y oxalacetato a partir de piruvato, además del aumento en el flujo de β-

oxidación, ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa. Por otro lado a medida que aumentaba la

cantidad de galactosa se reducía el flujo del metabolismo de alanina, aspartato y glutamato,

purinas y aumentaba en el metabolismo de arginina y prolina. Adicionalmente se presenta un

aumento en la producción de ROS con las cantidades más grandes de galactosa (figura 9).

En todos los casos, los cambios más significativos se presentaron con la mayor cantidad de

galactosa (6,25fmol/célula/hora = 62g/kg/día) como se observa en las figuras 8 y 9.

Algunos cambios obtenidos en las reacciones de intercambio frente al simular las condiciones

anabólicas y catabólicas, se encuentran en el apéndice S (figura S1 y S2 respectivamente).

7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El estudio de la galactosemia clásica se ha realizado por más de un siglo en modelos animales,

celulares y humanos que han permitido establecer las manifestaciones clínicas de la

enfermedad, ampliar el conocimiento en la vía metabólica principal, determinar posibles vías

alternas y complicaciones crónicas (Coelho, Berry, & Rubio-Gozalbo, 2015; Coelho et al.,

2017; Timson, 2016). Pese a los estudios desarrollados, todavía no se comprenden totalmente

los mecanismos involucrados en la fisiopatología de la enfermedad y la influencia de factores

tan importantes como la producción endógena y la tolerancia exógena a este monosacárido,

lo que ha contribuido a un manejo heterogéneo a nivel mundial y plantea la necesidad de

mayor investigación (Jumbo-Lucioni et al., 2012; Ribeiro et al., 2014).

Una herramienta dinámica, utilizada con éxito para determinar alteraciones y objetivos

terapéuticos en enfermedades como el cáncer, y que no ha sido probada aún en el estudio de

la galactosemia, corresponde al uso de GEMs (Geng & Nielsen, 2017). Por tanto, en el

presente estudio se desarrolló un GEM de hepatocito (en el cual se eliminó la actividad de

GALT) que reprodujo el fenotipo metabólico conocido (producción de galactitol y galactonato)

en condiciones anabólicas como catabólicas con cantidades supra fisiológicas de galactosa.

22

Figura 8. Distribución de flujos metabólicos en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt (morado) y el modelo iHepatocytes 2322_def.galt (verde) al

tomar como objetivo la síntesis de glucógeno con un flujo de entrada de 6,25 fmol/célula/hora de galactosa.

0,45

3,24

3,24*

3,75

-0,45

3,75

10

6,25

3,75

1,88

1,88 *

1e-5

10

6,75

0,45

0,45

2,28 5e-5 2,73 1,37

4,92

1e-5* 0,68

3,01

3,01*

6,01

-0,68

3,89

9,9

0,21

10

2,96

1,44

6,01

3,01*

3,75

6,01

3,

01

9,02

6,99

0,68

2,03 7,29 4,05 3,38

CI CII CIII CIV

Los flujos con (*) son constantes para toda la vía

Flujos de 1,37 para desoxirribosa 5-P

El flujo del folato se activa (0,89) con la reacción 5,10-

metenil-THF + NADPH 5,10 metilene-THF + NADP

Ribosa 5-P

Ribosa

Ribitol

0,68

UDP UTP

23

Figura 9. Distribución de flujos metabólicos en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt (morado) y el modelo iHepatocytes 2322_def.galt (verde) al

tomar como objetivo la producción de ATP con un flujo de entrada de 6,25 fmol/célula/hora de galactosa

5,25

0,067

0,603 0,603

0,603

0,603

0,603

0,603

2,308

0,34 2,55

10

5,09 3,55

0,067*

5,25

0,2

-0,2

0,1

0,2

0,9

0,7

0,9

0,7

0,7

0,9

0,7 0,7

0,5

5,15

2,25 10

4,5 3,3

CI CII CIII CIV

0,1*

Los flujos con (*) son constantes para toda la vía

La ruta de AMP a ATP tiene un flujo de

2,308 a nivel mitocondrial

La ruta de AMP a ATP tiene un flujo de

5,15 a nivel mitocondrial

El flujo de la detoxificación de ROS (0,81) se activa con la

reacción 2H2O2 => 2H2O +O2

4,38

10

2,79

Ribosa 5 -P

Ribosa

Ribitol

9,02

UDP UTP

24

En condiciones anabólicas (síntesis de glucógeno como función objetivo), la síntesis de

glucógeno en iHepatocytes 2322_def.galt no se vio alterada, sin embargo se observó un

cambio en los flujos del metabolismo de carbohidratos, dado por una elevada tasa de

producción en la glucosa 1-fosfato a partir de glucosa 6-fosfato, así como la hidrolisis hepática

de los carbohidratos glucosa, sacarosa y fructosa (figura 8). Estos resultados demuestran un

posible aumento de las necesidades energéticas en deficiencia de GALT, que a su vez

refuerza el papel de la galactosa como sustrato energético en condición normal (Brown et al.,

2010; Coelho et al., 2015). Bajo las condiciones simuladas, este aumento de uso de

carbohidratos en iHepatocytes 2322_def.galt resulta en un incremento de la tasa de

producción de Acetil CoA a partir de piruvato y la actividad en Krebs y la fosforilación oxidativa,

lo que implica a su vez que rutas catabólicas están activadas (figura 8).

La dependencia de otros carbohidratos para generar energía lleva a pensar que en su

ausencia pueda producirse fallo energético, tal es el caso de los lactantes menores de 4 meses

donde la fuente de carbohidratos es únicamente lactosa. En este grupo etario, el lactante con

galactosemia carecerá de una reserva importante para un momento catabólico debido a que

la galactosa se incorpora más rápidamente al glucógeno hepático que la glucosa (Bossolan et

al., 2007). Esto sumado al hecho de no contar con otra fuente de carbohidratos para responder

a las demandas energéticas, generaría una falla hepática y deficiencia energética, lo que

podría explicar el síndrome de toxicidad aguda reportado en los pacientes (Van Calcar et al.,

2014). De igual forma, la disponibilidad de otros sustratos energéticos mediante la ingesta de

alimentos como frutas y vegetales, podría explicar porque al permitir su consumo en algunos

pacientes galactosemicos no se observan complicaciones (Frederick, Cutler, & Fridovich-Keil,

2017; Krabbi et al., 2011; Ridel et al., 2005) y haya un posible aumento en la tolerancia a la

galactosa con la edad.

Por otro lado, los resultados obtenidos establecen el papel de UGP como una ruta limitante

para la producción de UDP-hexosas en la galactosemia, al restringir la actividad de GALK y

GALE (figura 4). Estos resultados concuerdan con la hipótesis de que las complicaciones

crónicas en la galactosemia clásica están asociadas a la deficiencia de UDP-hexosas, por los

bajos niveles reportados en pacientes galactosemicos por Ng et al., y Shin et al (citado por

Walter & Fridoich-Keil,2014), que han sido relacionados con alteraciones en la formación de

gliconjugados, (Coss et al., 2014; Lai et al., 2003; Lebea & Pretorius, 2005; Leslie, 2003;

Leslie, Yager, Reynolds, & Segal, 2005; Walter, & Fridovich-Keil, 2014). De forma similar, se

observó que en el modelo iHepatocytes 2322_def.galt, solo al superar el umbral fisiológico, se

generaron metabolitos tóxicos. Esto puede estar relacionado con que las dosis fisiológicas de

galactosa son inferiores al flujo de la reacción catalizada por la enzima UGP en el modelo,

25

ratificando el papel de esta reacción como regulador del flujo en la vía de Leloir en ausencia

de la enzima GALT. Con cantidades supra fisiológicas, se observó un predominio del galactitol

sobre el galactonato, resultados que están en concordancia con lo reportado en plasma y orina

de pacientes galactosemicos que no estuvieron en ayuno (Forges et al., 2006; Yager, Chen,

Reynolds, & Segal, 2003; Yager et al., 2006). Algunos signos de toxicidad aguda y

complicaciones crónicas se asocian principalmente al galactitol (Berry et al., 2001; Walter &

Fridovich-Keil, 2014;Yager et al., 2006), probablemente por la baja producción de galactonato

(figura 4) y la suposición de que este metabolito puede transformarse en xilosa e ingresar a la

vía pentosas fosfato sin generar mayor toxicidad. Aunque esta ruta fue demostrada en 1966

por Cuatrecasas & Segal en roedores, solo se ha documentado la presencia de galactosa

deshidrogenasa (primer paso de la vía) en hígado humano y no se cuenta con estudios que

validen la ruta completa (Cuatrecasas & Segal, 1966; Segal & Cuatrecasas, 1968; Walter,

J.H., & Fridovich-Keil, 2014). Asimismo, por el hecho de que el galactitol y el galactonato se

excretan en cantidad significativa en la orina de los pacientes galactosemicos, se consideran

productos terminales de las vías alternas en humanos (Lai & Klapa, 2004). Puesto que el

mecanismo metabólico de producción de galactonato resulta controversial y se requieren

pruebas adicionales de la existencia de una o más rutas alternas para la oxidación de

galactosa (Bosch, 2006; Walter, & Fridovich-Keil, 2014), en este estudio el galactonato fue el

producto terminal de la vía de oxidación de galactosa.

Otros vías metabólicas impactadas al simular la síntesis de glucógeno en iHepatocytes

2322_def.galt fueron la vía pentosas, pirimidinas (aumento en la actividad) y purinas

(reducción en la actividad) (figura 8). Estos resultados se relacionan con los hallazgos de

(Pourci, Mangeot, Soni, & Lemonnier, 1990) en fibroblastos derivados de pacientes

galactosemicos entre los 6 y 3 años, que crecieron normalmente cuando se suplementó

inosina en presencia de galactosa. Dichos resultados, sugieren un déficit en la síntesis de

purinas secundario a la utilización de ribosa para la producción de UTP, debido a que de la

disponibilidad de este nucleótido y de la glucosa depende la concentración de UDP-glucosa,

la cual modula la actividad de la glucógeno sintasa para la producción de glucógeno (Lecca &

Ceruti, 2008). Es decir, probablemente altas cantidades de UTP son necesarias para

compensar la síntesis de glucógeno en deficiencia de GALT, y esto puede repercutir en la

síntesis de otros nucleótidos.

Al simular condiciones catabólicas (producción de ATP como función objetivo) en iHepatocytes

2322_def.galt la tasa de producción de galactitol y galactonato fue igual (figura 5). Como se

mencionó anteriormente la toxicidad se ha atribuido en mayor medida al galactitol, sin embargo

bajo estas condiciones (catabolismo), el galactonato también puede ser un factor patógeno,

26

puesto que se ha relacionado con un potencial redox por la disminución de la relación

NADH/NAD debida a la reducción del piruvato y aumento en el lactato en eritrocitos de

pacientes galactosemicos (Berry et al., 1998). Asimismo, se ha sugerido que la síntesis de

galactitol está relacionada con una disminución en la actividad de la glutatión reductasa por la

depleción de NADPH. Esto conlleva a la producción de radicales libres y estrés oxidativo

(Coelho et al., 2017) como se evidenció en el modelo iHepatocytes 2322_def.galt (figura 9).

El papel del estrés oxidativo en la fisiopatología de la galactosemia ha sido propuesto por

varios estudios. De esta forma en un modelo de Drosophila melanogaster se encontró que

oxidantes como DMSO (dimetil sulfóxido) tenían un impacto negativo en la supervivencia de

los mutantes pero no de los controles, y antioxidantes como vitamina C, generaban el efecto

contario (Jumbo-Lucioni et al., 2013). Los biomarcadores de estrés oxidativo (glutatión

reducido y oxidado e intermediarios de cisteína) también mostraron que la galactosa (en una

dieta de galactosa o galactosa más glucosa) incrementaba el estrés oxidativo, puesto que los

mutantes tenían una respuesta disminuida frente a los controles (Jumbo-Lucioni et al., 2013).

Los autores atribuyen el resultado a que la galactosa no solo genera estrés oxidativo sino

sensibilidad a otras fuentes de oxidación y una alteración en la respuesta (Jumbo-Lucioni et

al., 2013), posiblemente determinada por la producción de galactitol y galactonato. Estos

resultados corresponden con la disminución de la actividad de catalasa, glutatión peroxidasa

y NADPH oxidasa, reportada en linfocitos y otros tejidos de pacientes con galactosemia (Al-

Essa, Dhaunsi, Al-Qabandi, & Khan, 2013).

Aunque aparentemente en deficiencia de GALT, el aumento en la cantidad de galactosa fue

directamente proporcional a la actividad de Krebs y la fosforilación oxidativa, no es válido

atribuir una asociación directa, ya que al simular una condición catabólica (figura 9) la

galactosa no se utilizó como fuente de energía, sino de metabolitos tóxicos. Por esta razón, y

para responder a la demanda de ATP, el hepatocito debe utilizar sustratos de reserva como

ácidos grasos y aminoácidos y activar reacciones como la piruvato carboxilasa, para mantener

cantidades suficientes de los componentes del ciclo de Krebs (figura 7; figura 9). No obstante,

se han propuesto otros mecanismos para explicar el déficit de energía, como la participación

de ciclos de fosforilación inútiles, donde el ATP queda atrapado en galactosa 1-fosfato y puede

desfosforilarse a otros metabolitos incapaces de producir energía (Jumbo-Lucioni et al., 2013;

Ribeiro., 2014; Walter, & Fridovich-Keil, 2014). La hipótesis proviene de modelos animales en

donde análogos de galactosa fueron asociados a necrosis hepática (Walter, & Fridovich-Keil,

2014) y estudios de 1975 que evidenciaron un aumento en la hiperuricemia en pacientes

galactosemicos que recibieron una carga de galactosa, relacionándolo además con un

27

aumento en el catabolismo y una reducción de nucleótidos hepáticos por acumulación de

galactosa 1-fosfato y uso de ATP (Forster et al., 1975; Walter, & Fridovich-Keil, 2014).

Por otro lado, en estado catabólico, se observa que en el modelo enriquecido la galactosa se

utilizó para la síntesis de inositol, lo cual se inactivo completamente en deficiencia de GALT

(figura 7). Estos resultados concuerdan con lo reportado en el cerebro de neonatos con

galactosemia post mortem en donde se encontró una reducción de aproximadamente el 80%

de inositol. Con base en estos y otros hallazgos se ha sugerido que una depleción de mionisitol

podría explicar alteraciones neurológicas de los pacientes (Bhat, 2003) secundarias a una

posible inhibición del inositol monofosfato por altos niveles de galactosa 1-fosfato, o una

perturbación del galactitol por el efecto hiperosmotico que puede generar un transporte

reducido del mioinositol (Berry, 2011; Bhat, 2003). En un modelo de levadura deficiente en

GALT se encontró que la sobreexpresión de mioinositol monofosfatasa humana (IMPasa) y

UGP podía revertir la toxicidad, puesto que la actividad de UGP impediría la acumulación de

galactosa 1-fosfato previniendo así una alteración en la función de IMPasa (Mehta, Kabir, &

Bhat, 1999), lo cual no se observó en este estudio, puesto que UGP siempre permaneció

inactiva al simular una reacción catabólica.

Los resultados obtenidos muestran múltiples cambios metabólicos que tienen implicaciones a

nivel del metabolismo general, algunas de las cuales concuerdan con mecanismos

fisiopatológicos previamente propuestos. Sin embargo, algunas hipótesis en la fisiopatología

de la galactosemia que incluyen la inhibición de galactosiltransferasas y enzimas importantes

en el metabolismo energético por acumulación de galactosa y sus metabolitos tóxicos (Coelho

et al., 2017; Daenzer et al., 2016; Forges et al., 2006; Leslie, 2003; Walter, & Fridovich-Keil,

2014), no pueden descartarse del todo, debido a que este modelo no considera parámetros

cinéticos en la formulación. No obstante en el modelo desarrollado se establecieron límites de

flujo en las vías alternas, basados en la literatura, como una alternativa para superar tales

limitaciones, y se logró reproducir el fenotipo del metabolismo primario con o sin GALT,

utilizando cantidades supra fisiológicas de galactosa.

Adicionalmente no es posible brindar nueva información en relación a postulados aun

controversiales como el de Isselbacher en 1957 (citado por Van Calcar et al., 2014) quien

sugirió que un aumento con la edad de la actividad hepática de la UGP, podría explicar un

aumento en la tolerancia y oxidación de galactosa. Esto debido a que el modelo considerado

contiene flujos fijos. Sin embargo, vale la pena aclarar que aunque poca, la evidencia

experimental parece descartar esta teoría ya que por ejemplo Abraham & Howell (1969) no

encontraron un incremento de la actividad de esta enzima en el hígado humano de recién

28

nacidos y adultos en condición normal; además establecieron que la ruta solo podía

metabolizar galactosa a una tasa del 1% comparada con GALT. Estos resultados reproducen

lo obtenido en levaduras y fibroblastos derivados de un paciente galactosemico, que tuvieron

una tasa de producción de UDP-galactosa alrededor de 1000 veces más baja con UGP

respecto a GALT, y solo crecieron en un medio con galactosa al sobre expresar el gen hUGP2

(Lai et al., 2003; Lai & Elsas, 2000).

De igual forma en el modelo presentado se impusieron manualmente límites diferentes en las

reacciones del galactitol y el galactonato. Aunque dichos ajustes se hicieron con el fin de

simular el fenotipo conocido reportado en la literatura, no se dispone de evidencia experimental

que permita un ajuste exacto de estos flujos. Esto evidencia que la información disponible en

la literatura es insuficiente y controversial en vías como el galactonato, lo que limita el

refinamiento de este tipo de herramientas computacionales. Por esta razón es necesario

validar la relevancia biológica de los hallazgos teniendo en cuenta el impacto que puede tener

en el modelo cambios de esos flujos.

Por otro lado, llama la atención que los flujos de las funciones objetivo (producción de

glucógeno y ATP), tienden al máximo independiente a la entrada de galactosa, lo cual sugiere

la presencia de loops o ciclos interminables en la red, que aparentemente no tienen límites y

muestran por defecto el valor de límites inferiores o superiores establecidos (Bordel, Agren, &

Nielsen, 2010; Schellenberger, Lewis, & Palsson, 2011). Aunque en el estudio se utilizaron

comandos que limitan este tipo de “loops”, al interior del modelo podrían quedar ciclos sin

corregir en otras rutas metabólicas que precisan de un mayor refinamiento. Esto puede

realizarse utilizando otras herramientas como el análisis de variabilidad de flujos (FVA), que

muestra las reacciones que tienden hacia los límites; además permite verificar los metabolitos

que comparten y la dirección de la reacción con el fin de orientar la búsqueda de literatura o

bases de datos para continuar refinando el modelo (Bordel et al., 2010).

A pesar de las limitaciones del modelo que posiblemente impiden utilizar cantidades normales

de galactosa y obtener cambios en la síntesis de glucógeno y producción de ATP; en este

estudio se obtuvo una plataforma que refleja el comportamiento general en la galactosemia

clásica y ofrece nuevas perspectivas para diseños experimentales orientados al estudio del

comportamiento de otras fuentes de carbohidratos, el rol de la vía pentosas fosfato, la

producción de ROS y los cambios en la producción de metabolitos tóxicos en un periodo post

absortivo y en estado catabólico.

29

8. CONCLUSIONES

-Se obtuvo un modelo enriquecido en el metabolismo de galactosa y vías alternas, que incluye

la evidencia conocida a la fecha en seres humanos y se utiliza bajo la simulación de

condiciones anabólicas y catabólicas y en presencia de diferentes cantidades de galactosa.

-El modelo propuesto para galactosemia clásica reproduce el fenotipo metabólico con

cantidades supra fisiológicas y permite observar mediante la simulación de la síntesis de

glucógeno, deficiencia de hexosas determinada por la actividad de UGP, producción de

metabolitos tóxicos con predominio de galactitol, un aumento en la actividad del metabolismo

de la fructosa, sacarosa y almidón, además de la vía pentosas fosfato y la fosforilación

oxidativa.

-Al simular la producción de ATP y con cantidades supra fisiológicas se observa un cambio

en la capacidad metabólica del hepatocito asociado a la producción de la misma cantidad de

galactitol y galactonato, una actividad nula en la ruta de UGP y metabolismo de carbohidratos

y el aumento en β-oxidación, ciclo de Krebs y producción de ROS.

9. RECOMENDACIONES

- Se requiere una revisión más exhaustiva de la literatura y la aplicación de pruebas

computacionales como el FVA para continuar enriqueciendo el modelo y garantizar resultados

más precisos al utilizar cantidades fisiológicas de galactosa.

-Se sugiere aplicar una prueba adicional como el random sampling que permite determinar los

cambios de una o varias reacciones en respuesta a la entrada de un metabolito, en este caso

la galactosa, con el fin de verificar la calidad del modelo.

-Una vez corregidos los puntos anteriores, se sugiere realizar análisis utilizando

concentraciones de metabolitos similares a las observadas en lactantes y limitando otras

fuentes de carbohidratos, con el fin de validar los resultados obtenidos al sintetizar glucógeno

en deficiencia de GALT.

-Se recomienda generar una reacción artificial para simular la producción de galactosa

endógena y determinar su relación con la entrada de galactosa exógena.

30

10. REFERENCIAS

Abraham, H., & Howell, R. (1969). Hepatic Uridine Diphosphate Galactose Pyrophosphorylase.

Journal of Biological Chemistry, 5(3), 545–50.

Adam, S., Akroyd, R., Bernabei, S., Bollhalder, S., Boocock, S., Burlina, A., … Zweers, H.

(2015). How strict is galactose restriction in adults with galactosaemia? International

practice. Molecular Genetics and Metabolism, 115(1), 23–26.

https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2015.03.008

Al-Essa, M., Dhaunsi, G. S., Al-Qabandi, W., & Khan, I. (2013). Impaired NADPH oxidase

activity in peripheral blood lymphocytes of galactosemia patients. Experimental Biology

& Medicine, 238, 779–786. https://doi.org/http://dx.doi.org/10.1177/1535370213480692

Ashikov, A., Routier, F., Fuhlrott, J., Helmus, Y., Wild, M., Gerardy-Schahn, R., & Bakker, H.

(2005). The human solute carrier gene SLC35B4 encodes a bifunctional nucleotide sugar

transporter with specificity for UDP-xylose and UDP-N-acetylglucosamine. Journal of

Biological Chemistry, 280(29), 27230–27235. https://doi.org/10.1074/jbc.M504783200

Berry, G.T., Hunter, J.V., Wang, Z., Dreha, S., Mazur, A., Brooks, D.G., Ning, C., Zimmerman,

R., & Segal, S. (2001). In vivo evidence of brain galactitol accumulation in an infant with

galactosemia and encephalopathy. Journal of Pediatric, 138(2), 260–2.

https://doi.org/10.1067/mpd.2001.110423

Berry, G. T. (2011). Is prenatal myo-inositol deficiency a mechanism of CNS injury in

galactosemia? Journal of Inherited Metabolic Disease, 34(2), 345–355.

https://doi.org/10.1007/s10545-010-9260-x

Berry, G. T., Palmieri, M., Gross, K. C., Acosta, P. B., Henstenburg, J. a, Mazur, a, … Segal,

S. (1993). The effect of dietary fruits and vegetables on urinary galactitol excretion in

galactose-1-phosphate uridyltransferase deficiency. Journal of Inherited Metabolic

Disease, 16(1), 91–100. https://doi.org/10.1007/BF00711320

Berry, G. T., Reynolds, R. A., Yager, C. T., & Segal, S. (2004). Extended [13C]galactose

oxidation studies in patients with galactosemia. Molecular Genetics and Metabolism,

82(2), 130–136. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2004.03.003

Berry, G. T., Wehrli, S., Reynolds, R., Palmieri, M., Frangos, M., Williamson, J. R., & Segal, S.

(1998). Elevation of erythrocyte redox potential linked to galactonate biosynthesis:

elimination by Tolrestat. Metabolism: Clinical and Experimental, 47(11), 1423–1428.

Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9826225

31

Bhat, P. J. (2003). Galactose-1-phosphate is a regulator of inositol monophosphatase: A fact

or a fiction? Medical Hypotheses, 60(1), 123–128. https://doi.org/10.1016/S0306-

9877(02)00347-X

Blais, E. M., Rawls, K. D., Dougherty, B. V., Li, Z. I., Kolling, G. L., Ye, P., … Papin, J. A.

(2017). Reconciled rat and human metabolic networks for comparative toxicogenomics

and biomarker predictions. Nature Communications, 8, 14250.

https://doi.org/10.1038/ncomms14250

Bordel, S., Agren, R., & Nielsen, J. (2010). Sampling the solution space in genome-scale

metabolic networks reveals transcriptional regulation in key enzymes. PLoS

Computational Biology, 6(7), 16. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000859

Bosch, A. M. (2006). Classical galactosaemia revisited. Journal of Inherited Metabolic Disease,

29(4), 516–525. https://doi.org/10.1007/s10545-006-0382-0

Bosch, A. M. (2011). Classic galactosemia: Dietary dilemmas. Journal of Inherited Metabolic

Disease, 34(2), 257–260. https://doi.org/10.1007/s10545-010-9157-8

Bosch, A. M., Bakker, H. D., Wenniger-Prick, L. J. M. de B., Wanders, R. J. A., & Wijburg, F.

A. (2004). High tolerance for oral galactose in classical galactosaemia: dietary

implications. Archives of Disease in Childhood, 89(11), 1034–6.

https://doi.org/10.1136/adc.2003.037671

Bossolan, G., Trindade, C. E. P., & Barreiros, R. C. (2007). Blood galactose and glucose levels

in mothers, cord blood, and 48-hour-old breast-fed full-term infants. Neonatology, 91(2),

121–126. https://doi.org/10.1159/000097129

Brown, L. D., Cavalli, C., Harwood, J. E. F., Casadei, A., Teng, C. C., Traggiai, C., … Denver,

C. (2010). Plasma Concentrations of Carbohydrates and Sugar Alcohols in Term

Newborns after Milk Feeding. Pediatric Research, 64(2), 189–193.

https://doi.org/10.1203/PDR.0b013e3181761888.

Chan, C., Berthiaume, F., Lee, K., & Yarmush, M. L. (2003). Metabolic Flux Analysis of

Cultured Hepatocytes Exposed to Plasma. Biotechnology and Bioengineering, 81(1), 33–

49. https://doi.org/10.1002/bit.10453

Coelho, A. I., Berry, G. T., & Rubio-Gozalbo, M. E. (2015). Galactose metabolism and health.

Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care, 18(4), 422–427.

https://doi.org/10.1097/MCO.0000000000000189

32

Coelho, A. I., Rubio-Gozalbo, M. E., Vicente, J. B., & Rivera, I. (2017). Sweet and sour: an

update on classic galactosemia. Journal of Inherited Metabolic Disease, 40(3), 325–342.

https://doi.org/10.1007/s10545-017-0029-3

Colombo.C.M., Cornejo, V., & R. . (2017). Errores innatos del metabolismo de los hidratos de

carbono. In Errores innatos en el metabolismo del niño (Cuarta edi, pp. 207–213).

Santiago de Chile: Editorial Universitaria.

Coss, K. P., Byrne, J. C., Coman, D. J., Adamczyk, B., Abrahams, J. L., Saldova, R., … Treacy,

E. P. (2012). IgG N-glycans as potential biomarkers for determining galactose tolerance

in Classical Galactosaemia. Molecular Genetics and Metabolism, 105(2), 212–220.


Coss, K. P., Hawkes, C. P., Adamczyk, B., Stöckmann, H., Crushell, E., Saldova, R., … Treacy,

E. P. (2014). N-glycan abnormalities in children with galactosemia. Journal of Proteome

Research, 13(2), 385–394. https://doi.org/10.1021/pr4008305

Cuatrecasas, P., & Segal, S. (1966). Galactose conversion to D-xylulose: an alternate route of

galactose metabolism. Science, 153(735), 549–551. Retrieved from papers://8c23484c-

02d8-46c3-9325-c916c1add806/Paper/p6563

Daenzer, J. M. I., Jumbo-Lucioni, P. P., Hopson, M. L., Garza, K. R., Ryan, E. L., & Fridovich-

Keil, J. L. (2016). Acute and long-term outcomes in a Drosophila melanogaster model of

classic galactosemia occur independently of galactose-1-phosphate accumulation.

Disease Models & Mechanisms, 9(11), 1375–1382. https://doi.org/10.1242/dmm.022988

Forges, T., Monnier-Barbarino, P., Leheup, B., & Jouvet, P. (2006). Pathophysiology of

impaired ovarian function in galactosaemia. Human Reproduction Update, 12(5), 573–

584. https://doi.org/10.1093/humupd/dml031

Forster, J., Schuchmann, L., Hans, C., Niederhoff, H., Künzer, W., & Keppler, D. (1975).

Increased serum urate in galactosemia patients after a galactose load: A possible role of

nucleotide deficiency in galactosemic liver injury. Klinische Wochenschrift, 53(24), 1169–

1170. https://doi.org/10.1007/BF01476458

Frederick, A., Cutler, D., & Fridovich-Keil, J. (2017). Rigor of non-dairy galactose restriction in

early childhood, measured by retrospective survey, does not associate with severity of

five long-term outcomes quantified in 231 children and adults with classic galactosemia.

Journal of Inherited Metabolic Disease, 40(6), 1–23. https://doi.org/10.1007/s10545-017-

0067-x.

33

García Sánchez, C. E., & Torres Sáez, R. G. (2014). Comparison and analysis of objective

functions in flux balance analysis. Biotechnology Progress, 30(5), 985–991.

https://doi.org/10.1002/btpr.1949

Geng, J., & Nielsen, J. (2017). In silico analysis of human metabolism: Reconstruction,

contextualization and application of genome-scale models. Current Opinion in Systems

Biology, 2, 29–38. https://doi.org/10.1016/j.coisb.2017.01.001

Gille, C., Bölling, C., Hoppe, A., Bulik, S., Hoffmann, S., Hübner, K., … Holzhütter, H.-G.

(2010). HepatoNet1: a comprehensive metabolic reconstruction of the human hepatocyte

for the analysis of liver physiology. Molecular Systems Biology, 6(411), 1–13.

https://doi.org/10.1038/msb.2010.62

Hoffmann, B., Dragano, N., & Schweitzer-Krantz, S. (2012). Living situation, occupation and

health-related quality of life in adult patients with classic galactosemia. Journal of

Inherited Metabolic Disease, 35(6), 1051–1058. https://doi.org/10.1007/s10545-012-

9469-y

Holden, H. M., Rayment, I., & Thoden, J. B. (2003). Structure and Function of Enzymes of the

Leloir Pathway for Galactose Metabolism. Journal of Biological Chemistry, 278(45),

43885–43888. https://doi.org/10.1074/jbc.R300025200

Huang, H., & Juan, H. (2012). Systems biology: Applications in cancer-related research.

Singapore: World Scientific.

Hughes, J., Ryan, S., Lambert, D., Geoghegan, O., Clark, A., Rogers, Y., … Treacy, E. P.

(2009). Outcomes of Siblings with Classical Galactosemia. Journal of Pediatrics, 154(5),

721–726. https://doi.org/10.1016/j.jpeds.2008.11.052

Ishida, N., & Kawakita, M. (2004). Molecular physiology and pathology of the nucleotide sugar

transporter family (SLC35). Pflugers Archiv European Journal of Physiology, 447(5), 768–

775. https://doi.org/10.1007/s00424-003-1093-0

Ishida, N., Kuba, T., Aoki, K., Miyatake, S., Kawakita, M., & Sanai, Y. (2005). Identification and

characterization of human Golgi nucleotide sugar transporter SLC35D2, a novel member

of the SLC35 nucleotide sugar transporter family. Genomics, 85(1), 106–116.

https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2004.09.010

Jumbo-Lucioni, P. P., Garber, K., Kiel, J., Baric, I., Berry, G. T., Bosch, A., … Fridovich-Keil, J.

L. (2012). Diversity of approaches to classic galactosemia around the world: A

comparison of diagnosis, intervention, and outcomes. Journal of Inherited Metabolic

34

Disease, 35(6), 1037–1049. https://doi.org/10.1007/s10545-012-9477-y

Jumbo-Lucioni, P. P., Hopson, M. L., Hang, D., Liang, Y., Jones, D. P., & Fridovich-Keil, J. L.

(2013). Oxidative stress contributes to outcome severity in a Drosophila melanogaster

model of classic galactosemia. Disease Models & Mechanisms, 6(1), 84–94.

https://doi.org/10.1242/dmm.010207

Kerckhove, K. Vande, Diels, M., Vanhaesebrouck, S., Luyten, K., Pyck, N., De Meyer, A., …

Bihet, G. (2015). Consensus on the guidelines for the dietary management of classical

galactosemia. Clinical Nutrition ESPEN, 10(1), e1–e4.

https://doi.org/10.1016/j.clnme.2014.10.001

Krabbi, K., Uudelepp, M. L., Joost, K., Zordania, R., & Ounap, K. (2011). Long-term

complications in Estonian galactosemia patients with a less strict lactose-free diet and

metabolic control. Molecular Genetics and Metabolism, 103(3), 249–253.


Lai, K., & Elsas, L. J. (2000). Overexpression of Human UDP-Glucose Pyrophosphorylase

Rescues Galactose-1-Phosphate Uridyltransferase-Deficient Yeast. Biochemical and

Biophysical Research Communications, 271(2), 392–400.

https://doi.org/10.1006/bbrc.2000.2629

Lai, K., & Klapa, M. I. (2004). Alternative pathways of galactose assimilation: Could inverse

metabolic engineering provide an alternative to galactosemic patients? Metabolic

Engineering, 6(3), 239–244. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2004.01.001

Lai, K., Langley, S. D., Khwaja, F. W., Schmitt, E. W., & Elsas, L. J. (2003). GALT deficiency

causes UDP-hexose deficit in human galactosemic cells. Glycobiology, 13(4), 285–294.

https://doi.org/10.1093/glycob/cwg033

Lebea, P. J., & Pretorius, P. J. (2005). The molecular relationship between deficient UDP-

galactose uridyl transferase (GALT) and ceramide galactosyltransferase (CGT) enzyme

function: A possible cause for poor long-term prognosis in classic galactosemia. Medical

Hypotheses, 65(6), 1051–1057. https://doi.org/10.1016/j.mehy.2005.06.025

Lecca, D., & Ceruti, S. (2008). Uracil nucleotides: From metabolic intermediates to

neuroprotection and neuroinflammation. Biochemical Pharmacology, 75(10), 1869–1881.

https://doi.org/10.1016/j.bcp.2007.12.009

Leslie, N. D. (2003). Insights into the pathogenesis of galactosemia. Annual Review of

Nutrition, 23(1), 59–80. https://doi.org/10.1146/annurev.nutr.23.011702.073135

35

Leslie, N., Yager, C., Reynolds, R., & Segal, S. (2005). UDP-galactose pyrophosphorylase in

mice with galactose-1-phosphate uridyltransferase deficiency. Molecular Genetics and

Metabolism, 85(1), 21–27. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2005.01.004

Li, M., Maruthur, N. M., Loomis, S. J., Pietzner, M., North, K. E., Mei, H., … Köttgen, A. (2017).

Genome-wide association study of 1,5-anhydroglucitol identifies novel genetic loci linked

to glucose metabolism. Scientific Reports, 7(1), 2812. https://doi.org/10.1038/s41598-

017-02287-x

Lv, Y., & Yu, G. (2014). Galactose:Chemical Structure, Dietary Sources and Clinical

Significance. In Galactose:Structure and Function in Biology and Medicine (pp. 1–23).

New York: Nova Science Publishers,Inc.

Mackie, A., Keseler, I. M., Nolan, L., Karp, P. D., & Paulsen, I. T. (2013). Dead End Metabolites

- Defining the Known Unknowns of the E. coli Metabolic Network. PLoS ONE, 8(9), 1–11.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0075210

Mardinoglu, A., Agren, R., Kampf, C., Asplund, A., Nookaew, I., Jacobson, P., … Nielsen, J.

(2014). Integration of clinical data with a genome-scale metabolic model of the human

adipocyte. Molecular Systems Biology, 9(1), 649–649.

https://doi.org/10.1038/msb.2013.5

Mardinoglu, A., Agren, R., Kampf, C., Asplund, A., Uhlen, M., & Nielsen, J. (2014). Genome-

scale metabolic modelling of hepatocytes reveals serine deficiency in patients with non-

alcoholic fatty liver disease. Nature Communications, 5(May 2013), 1–11.

https://doi.org/10.1038/ncomms4083

Mardinoglu, A., Gatto, F., & Nielsen, J. (2013). Genome-scale modeling of human metabolism

- a systems biology approach. Biotechnology Journal, 8(9), 985–996.

https://doi.org/10.1002/biot.201200275

Mehta, D. V., Kabir, A., & Bhat, P. J. (1999). Expression of human inositol monophosphatase

suppresses galactose toxicity in Saccharomyces cerevisiae: Possible implications in

galactosemia. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease, 1454(3), 217–

226. https://doi.org/10.1016/S0925-4439(99)00037-X

Ministerio de Salúd Pública del Ecuador. (2013). Tratamiento nutricional del paciente

pediátrico y adolescente con galactosemia. Quito. Retrieved from

http://instituciones.msp.gob.ec/documentos/Guias/Guia_de_galactosemia.pdf

Nilsson, A., Mardinoglu, A., & Nielsen, J. (2017). Predicting growth of the healthy infant using

36

a genome scale metabolic model. Npj Systems Biology and Applications, 3(1), 3.

https://doi.org/10.1038/s41540-017-0004-5

Normén, L., Lærke, H. N., Jensen, B. B., Langkilde, A. M., & Andersson, H. (2001). Small-

bowel absorption of D -tagatose and related effects on carbohydrate digestibility : an

ileostomy study 1 – 3. American Journal of Clinical Nutrition, 3–8.

Orth, J. D., Thiele, I., & Palsson, B. Ø. (2010). What is flux balance analysis? Nat Biotechnol,

28(3), 245–248. https://doi.org/10.1038/nbt.1614.What

Pagliarini, R., & di Bernardo, D. (2013). A Genome-Scale Modeling Approach to Study Inborn

Errors of Liver Metabolism: Toward an In Silico Patient. Journal of Computational Biology,

20(5), 383–397. https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0276

Palsson, B. Ø. (2006). Chapter 1. Introduction. In Systems Biology (pp. 1–12). San Diego,

California: Cambridge University Press.

Pannis, B., & Forget, P. (2004). Bone metabolism in galactosemia. Bone, 35(4), 982–987.

https://doi.org/http://dx.doi.org.ezproxy.javeriana.edu.co:2048/10.1016/j.bone.2004.06.0

04

Pourci, M. L., Mangeot, M., Soni, T., & Lemonnier, A. (1990). Culture of galactosaemic

fibroblasts in the presence of galactose: Effect of inosine. Journal of Inherited Metabolic

Disease, 13(6), 819–828. https://doi.org/10.1007/BF01800205

Ribeiro, A.C., Silva, M.J., & Figueira, M. E. (2014). Galactose:Diet and Its Implication in

Galactosemia. In Galactose:Structure and Function in Biology and Medicine (pp. 47–73).

New York: Nova Science Publishers,Inc.

Ridel, K. R., Leslie, N. D., & Gilbert, D. L. (2005). An updated review of the long-term

neurological effects of galactosemia. Pediatric Neurology, 33(3), 153–161.

https://doi.org/10.1016/j.pediatrneurol.2005.02.015

Salazar, D. A., Rodríguez-López, A., Herreño, A., Barbosa, H., Herrera, J., Ardila, A., …

Alméciga-Díaz, C. J. (2016). Systems biology study of mucopolysaccharidosis using a

human metabolic reconstruction network. Molecular Genetics and Metabolism, 117(2),

129–139. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2015.08.001

Schellenberger, J., Lewis, N. E., & Palsson, B. (2011). Elimination of thermodynamically

infeasible loops in steady-state metabolic models. Biophysical Journal, 100(3), 544–553.

https://doi.org/10.1016/j.bpj.2010.12.3707

37

Segal, S., & Cuatrecasas, P. (1968). The oxidation of C14galactose by patients with congenital

galactosemia. The American Journal of Medicine, 44(3), 340–347.

https://doi.org/10.1016/0002-9343(68)90105-8

Segal, S., Wehrli, S., Yager, C., & Reynolds, R. (2006). Pathways of galactose metabolism by

galactosemics: Evidence for galactose conversion to hepatic UDPglucose. Molecular

Genetics and Metabolism, 87(2), 92–101. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2005.09.012

Tazawa, S., Yamato, T., Fujikura, H., Hiratochi, M., Itoh, F., Tomae, M., … Isaji, M. (2005).

SLC5A9/SGLT4, a new Na +-dependent glucose transporter, is an essential transporter

for mannose, 1,5-anhydro-D-glucitol, and fructose. Life Sciences, 76(9), 1039–1050.

https://doi.org/10.1016/j.lfs.2004.10.016

Thiele, I., & Palsson, B. (2010). A protocol for generating a high-quality genome-scale

metabolic reconstruction. Nat Protoc, 5(1), 93–121.

https://doi.org/10.1038/nprot.2009.203.A

Thiele, I., Swainston, N., Fleming, R. M. T., Hoppe, A., Sahoo, S., Aurich, M. K., … Nielsen, J.

(2013). A community-driven global reconstruction of human metabolism. Computational

Biology, 31(5), 419–427. https://doi.org/10.1038/nbt.2488

Thoden, J. B., Timson, D. J., Reece, R. J., & Holden, H. M. (2004). Molecular structure of

human galactose mutarotase. Journal of Biological Chemistry, 279(22), 23431–23437.

https://doi.org/10.1074/jbc.M402347200

Thompson, S., & Netting, M. (2010). Dietary Management of Galactosaemia (Vol. 90).

Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24280198

Timson, D. J. (2014). Purple sweet potato colour--a potential therapy for galactosemia?

International Journal of Food Sciences and Nutrition, 65(4), 391–393.

https://doi.org/10.3109/09637486.2013.860586

Timson, D. J. (2016). The molecular basis of galactosemia — Past, present and future. Gene,

589(2), 133–141. https://doi.org/10.1016/j.gene.2015.06.077

Ung, C., Sanchez, A. V., Shen, L., Davoudi, S., Ahmadi, T., Navarro-Gomez, D., … Kim, L. A.

(2017). Whole exome sequencing identification of novel candidate genes in patients with

proliferative diabetic retinopathy. Vision Research.

https://doi.org/10.1016/j.visres.2017.03.007

Van Calcar, S.C., Bernstein, L.E., Rohr,F.J.,Berry,G.T., Yannicelli, S., & Scaman, C. . (2014).

38

Galactose content of legumes, caseinates, and some hard cheeses: Implications for diet

treatment of classic galactosemia. Journal of Agricultural and Food Chemestry, 62(6),

1397–1402. https://doi.org/10.1021/jf404995a

Van Calcar, S. C., Bernstein, L. E., Rohr, F. J., Scaman, C. H., Yannicelli, S., & Berry, G. T.

(2014). A re-evaluation of life-long severe galactose restriction for the nutrition

management of classic galactosemia. Molecular Genetics and Metabolism, 112(3), 191–

197. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2014.04.004

Waisbren, Susan E., Potter,N., Gordon,C.M., Green, R.C., Greenstein,P., Gubbels,C.S.,

Rubio-Gozalbo, M.E., Schomer,D., Welt,C., Anastasoaie,V., Anna,k., Gentile, J., Guo,

C., Hecht, L., Jackson,R., Jansma,B., Li,Y., Lip,V., Miller, DT., Murray, M., Power, G.

(2012). The Adult Galactosemic Phenotype. Journal of Inherited Metabolic Disease,

35(2), 279–286. https://doi.org/10.1007/s10545-011-9372-y.

Walter, J.H., & Fridovich-Keil, J. (2014). Galactosemia. In G. Valle, D., Beaudet, A., Vogelstein,

B., Kinzler, K., Antonarakis, S., Ballabio, A., Gibson, K.,& Mitchell (Ed.), The Online

Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. New York: McGraw-Hill. Retrieved

fromhttp://ommbid.mhmedical.com.ezproxy.javeriana.edu.co:2048/content.aspx?bookid

=971&sectionid=62672411.

Welling, L., Bernstein, L. E., Berry, G. T., Burlina, A. B., Eyskens, F., Gautschi, M., … Bosch,

A. M. (2017). International clinical guideline for the management of classical

galactosemia: diagnosis, treatment, and follow-up. Journal of Inherited Metabolic

Disease, 40(2), 171–176. https://doi.org/10.1007/s10545-016-9990-5

Yager, C. T., Chen, J., Reynolds, R., & Segal, S. (2003). Galactitol and galactonate in red blood

cells of galactosemic patients. Molecular Genetics and Metabolism, 80(3), 283–289.


Yager, C., Wehrli, S., & Segal, S. (2006). Urinary galactitol and galactonate quantified by

isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clinica Chimica Acta, 366(1–

2), 216–224. https://doi.org/10.1016/j.cca.2005.10.015

Zavadskaia, E., Kudriavtseva, M., Kudriavtsev, B., Smirnova, S., & Skorina, A. (1983). Dry

weight of isolated normal human hepatocytes and in chronic hepatitis. Tsitologiia, 25(4),

447–451.

APÉNDICES

Apéndice A. Metabolismo de la galactosa

Figura A1. Metabolismo de la galactosa. Después de la hidrólisis de lactosa en el intestino,

interviene inicialmente la galactosa mutarotasa (GALM) en hígado modificando su

configuración de β-D-galactosa a α-D-galactosa. De ese modo ingresa a la vía Leloir, la cual

comprende las enzimas galactoquinasa (GALK), galactosa 1-fosfato-uridil transferasa (GALT)

y galactosa 4-epimerasa (GALE). La glucosa 1-fosfato requiere de la acción de la

fosfoglucomutasa (PGM) para ingresar a otras rutas metabólicas.

Apéndice B. Vías alternas al metabolismo de la galactosa.

Figura B1. Vías alternas al metabolismo de la galactosa. Se han reportado tres vías alternas

al metabolismo de la galactosa, en la condición de deficiencia de la enzima galactosa 1-fosfato

uridil transferasa, que corresponden a la reducción de galactosa, oxidación de galactosa y la

vía de la pirofosforilasa; en este última intervienen dos enzimas de la vía Leloir,

galactoquinasa (GALK) y galactosa 4-epimerasa (GALE), para proporcionar el sustrato para

la enzima UDP glucosa/ hexosa pirofosforilasa (UGP), esta enzima también cataliza la

formación de UDP-glucosa, a partir de glucosa-1-fosfato.

Apéndice C. Contenido de galactosa libre en algunos alimentos.

Alimento (mg/100g/ml de alimento)

Lácteos y derivados

Leche de vaca 2400 a

Yogurt 1800 i

Queso Cheddar fuerte 9,5 +/- 17,9 (<2,8 – 104,3) a

Queso Cheddar del oeste de UK 3,6 (<2,8 -11,4) b

Gruyere 4,1 +/-1,2 (<2,8 – 5,1) a

Emmental /Suizo 3,5 +/-1,2 (2,8-7,4) a

Parmesano americano (madurado por 10 meses)

18,3 +/- 33,3 (<2,8 -156) a

Parmesano americano (rallado) 9,7 +/- 12,0 (<2,8 -23,6) a

Varias frutas (crudas o procesadas) 9,7 +/- 7,9 (1,0 – 44,5) a

Sandía 14,7 e

Papaya 28,6 e

Kiwi 9,8 e - 27,1 d

Arándano 26,2 e

Piña 18,7 d

Pera 7,3 e

Fresa 4,6h – 10,7g

Banano 9,2 e

Manzana 8,3 e,f

Melón 5,5 c

Varios vegetales (crudos o procesados) 9,3 +/- 11,4 (ND-77,2) a

Cebolla 5,1e – 15,3g

Tomate 5,6g – 13,3 d

Coles de Bruselas 9,2 e,f

Lechuga 3,1e -7,8g

Brócoli 6,8e

Zanahoria 6,2e

Jugos de fruta y vegetales 18,3 +/- 14 (4,0 – 46,4) a

Tubérculos

Papa 1,2e-10,7g

Leguminosas

Garbanzo (cocinado o preparado) 149,5 +/- 197 (24,6 – 443,8) a

Garbanzo 443 c

Frijol rojo 153 c

Frijol verde 5,5 g

Lenteja 115,8 c

Arveja 11,8 c

Productos de soya

Soya entera 43,8a / 44g

Leche de Soya 5,1 +/-0,4 (4,8 -5,3) a

Tofu 90 (dry weight)a

a)Van Calcar et al., 2014; b) Portnoi, & MacDonald 2009, 2015; c) Acosta, & Gross 1995; d) Gropper, Weese, West,

& Gross, 2000; e) Gross & Acosta, 1991; f) Scaman, Jim, & Hartnett, 2004; g) Kim, Hartnett, & Scaman, 2007; h) Kim,

Hartnett, & Scaman, 2007; i) Bosch, 2011.

Los ítem a y b corresponden a las referencias consultadas en la adaptación de Welling et al., 2017. Los ítem c, d, e,

f, g, h corresponden a las referencias consultadas en la adaptación de Ribeiro et al., 2014.

Apéndice D. Estudios y recomendaciones para el tratamiento de galactosemia clásica.

Autor Año Tipo Población Recomendación / Análisis

Bosh et al citado por

(Welling, et al,2017)

2004 Estudio experimental diseñado para determinar tolerancia a la galactosa

3 Adolescentes entre 15-18 años

El estudio duro 10semanas, durante la semana 1-2 la ingesta fue de 17-22mg; desde la semana 3-10 los pacientes tuvieron un dieta de 11-15mg; desde la semana 5 recibieron suplementación, de modo que iniciaron con 200mg hasta 600mg; en este tiempo no presentaron complicaciones ni valores elevados de galactosa 1-fosfato en sangre.

Coss et al citado por

(Welling, et al,2017)

2012

Estudio experimental diseñado para investigar si los patrones de Ig G N-glicanos son un marcador de seguimiento mejor a los actuales

10 pacientes con GC entre 18 y 26 años

Se liberó la dieta de los pacientes hasta 4000mg por 14 semanas; no presentaron cambios significativos en los niveles de galactosa 1-fosfato, ni complicaciones clínicas.

Krabbi et al 2011

Estudio de serie de casos retrospectivo, que evaluó complicaciones y excreción de galactosa y galactitol en pacientes de Estonia, con una dieta menos restringida desde la sospecha

5 pacientes entre 7 - 14 años

La dieta de los pacientes incluía quesos madurados, frutas, verduras. Los rangos de galactosa y galactitol variaron de una muestra a otra, pero permanecieron por encima de los valores normales para la patología. Todas las mujeres presentaron insuficiencia ovárica, en tres pacientes el desarrollo cognitivo y del habla fue normal, y uno de ellos presento retardo moderado; por lo cual se concluye que la dieta estricta no cambia el resultado a largo plazo.


Thompson & Netting

2010 Guía de manejo australiana -

No se establecen recomendaciones por grupo etario, sin embargo se recomienda retirar la leche materna y reemplazar con fórmula libre de galactosa en el período neonatal; posteriormente consumir cantidades moderadas de frutas y vegetales, cereales, leguminosas y vísceras y evitar leche, derivados y productos de soya fermentados.

Kerckhove et al 2014 Guía de manejo consenso de Bélgica

Todos los grupos etarios

Basadas en las guías de manejo de Francia (estricta eliminación de frutas, vegetales y productos de soya) y las guía de UK y Holanda (dieta libre de galactosa, y se permite el consumo de otras fuentes de galactosa. No se recomienda una cantidad específica por grupo etario, sin embargo se permite desde el periodo escolar el consumo de frutas, vegetales, nueces, quesos madurados, limitar el consumo de bebidas de soya.

Ministerio de Salúd Pública del Ecuador

2013 Guía de manejo de Ecuador Todos los grupos

etarios

Se recomienda (mg/día): Lactantes 50 -200; preescolares 150-200; escolares 200-300; adolescentes 250-400; adultos 300-500. Adicionalmente se establecen rangos de manejo para una dieta muy estricta (40mg/día), en lactante 50mg; niño 150-200mg; y adulto 250-300mg


Van Calcar et al 2014 Revisión de literatura y encuesta sobre prácticas dietarías recomendadas

Todos los grupos etarios

Se obtuvieron 138 respuestas para la encuesta, encontrando que para alimentos como quesos madurados, caseinatos y legumbres predomina la restricción, en contraste con alimentos de soya de los que se permite una ingesta moderada. Sin embargo, después de la revisión y los resultados se recomiendan frutas, vegetales, jugos legumbres y productos de soya no fermentados para la dieta; durante el periodo neonatal se recomiendan fórmulas a base de soya y elementales para prematuros.

Welling et al 2017 Guía para diagnóstico, tratamiento y seguimiento

-

No se recomienda una cantidad específica de galactosa por grupo etario, sin embargo se sugiere cualquier tipo y cantidad de alimento con un contenido menor a 25mg/100g de alimento, a excepción de productos de soya fermentados.

Apéndice E. Metodología

Expansión y enriquecimiento del modelo iHepatocytes 2322

Inicialmente se realizó la búsqueda de información sobre fisiopatología y tratamiento de la

enfermedad en bases de datos como Scopus, Science Direct y PubMed, utilizando palabras

clave como “classic galactosemia”, “treatment”, “diet”, “GALT”, “physiopathology”, “galactose

restriction”, “deficiency”, entre otros, aplicadas en ecuaciones de búsqueda como (“classic

galactosemia” or GALT deficiency) and treatment. De los resultados obtenidos se

seleccionaron estudios experimentales en humanos, revisiones, guías de tratamiento y libros

en inglés; adicionalmente se llevó a cabo la revisión de referencias cruzadas con el fin de

ampliar y validar los resultados encontrados.

A partir de la información obtenida se estableció la vía metabólica de la galactosa, vías alternas

propuestas en la enfermedad y funciones metabólicas o destino del sustrato en condición

normal, para orientar la búsqueda o verificación en el modelo computacional seleccionado

(iHepatocytes 2322). Este modelo se eligió porque incluye información de reconstrucciones

hepáticas previamente publicadas (HepatoNet, iLJ1046, iAB676, iHepatocyte1154) una

búsqueda de literatura exhaustiva y toma como base la reconstrucción HMR2 (diseñada para

generar GEMs tejido específico), que a su vez se considera el recurso más completo para las

reacciones bioquímicas relacionadas con los seres humanos que incluye genes, metabolitos

y reacciones de modelos como Recon2 (Mardinoglu et al., 2013). Durante la reconstrucción

de iHepatocytes 2322 con el fin de verificar su calidad, se comparó la información con bases

de datos como HPA, se realizó una búsqueda de literatura para verificar la información sobre

datos proteómicos y se evaluó cuidadosamente la conectividad de la red para verificar que los

metabolitos producidos en una reacción pudieran consumirse en otra. Asimismo se validó el

GEMs verificando el cumplimiento de tareas metabólicas como la síntesis de ácidos grasos,

aminoácidos, colesterol, ácidos biliares, procesos como gluconeogénesis, entre otros,

obteniendo un modelo que incluye todas las funciones metabólicas del hepatocito conocidas

a la fecha (Mardinoglu et al., 2014).

La información encontrada se validó mediante la revisión de las siguientes bases de datos:

Base de datos Uso

KEEG Mediante esta herramienta se identificó el metabolismo de galactosa en humanos, reacciones, metabolitos y dirección de las reacciones.

String Esta base de datos permitió identificar las proteínas asociadas al metabolismo primario de la galactosa, según su función.

Uniprot Con esta herramienta se revisaron reacciones, compartimentos y referencias asociadas.

Base de datos Uso

Compartments Mediante esta herramienta se verificó la localización célular de las enzimas y el nivel de evidencia.

HMBD Mediante esta base de datos se verificó la información sobre metabolitos asociados a la base de datos KEGG

BRENDA y ENZIME

Estas bases de datos, se utilizaron para validar la función de las enzimas en el modelo, sustratos y productos de la reacciones.

Ensembl

El modelo original contiene en la lista de genes un código asociado a esta base de datos, por ello se verificó mediante esta herramienta la asociación del gen y la enzima en reacciones del metabolismo primario de galactosa. Adicionalmente se validó la información sobre cada gen mediante la búsqueda de literatura en la base de datos Pubmed.

HPA A través de esta base de datos se verificó la expresión y localización de genes y proteínas asociadas al metabolismo primario de la galactosa.

Los datos obtenidos sobre el metabolismo primario de galactosa, síntesis y degradación de

glicoconjugados, se recopilaron en una hoja de cálculo que incluye enzimas, reacciones, tipo

de reacción, compartimento, ajustes requeridos y referencias de literatura.

Considerando que el modelo se basa en un libro de Excel que incluye una hoja para

reacciones, metabolitos, compartimentos, genes y descripción del modelo, las reacciones

añadidas o modificadas se establecieron en la hoja de reacciones utilizando la sintaxis del

modelo HMR2, debido a que se partió de esta reconstrucción para desarrollar iHepatocytes

2322 (Mardinoglu et al., 2013); de igual forma en esta hoja se incluyó un código para cada

reacción, el número de la enzima que cataliza la reacción, el gen asociado con el código de la

base de datos Ensembl y el subsistema o la vía metabólica a la que corresponde. Asimismo

los metabolitos que hacían parte de las reacciones incluidas o modificas se establecieron en

la hoja de metabolitos con la formula química, el nombre del metabolito y compartimento

célular correspondiente; mediante la fórmula química se puede validar el balance

estequiométrico de la reacción.

Con el fin de validar el modelo original versus el enriquecido se verificaron las reacciones que

no estaban correctamente balanceadas, a través de la herramienta en línea Biomet-toolbox

encontrando un 7% de reacciones desequilibradas estequiométricamente en los dos modelos

que no interferían con las reacciones de estudio; no fue posible verificar este porcentaje en

reconstrucciones previas de hepatocito por errores de formato que impidieron importarlos en

la herramienta en línea, por ello, para verificar si los GEMs manejan un porcentaje de

reacciones en desequilibrio, se realizó la misma prueba en un modelo de adipocito que arrojo

un 4% de reacciones en desequilibrio, el modelo HMR y HMR2 con aproximadamente 9% de

reacciones (Mardinoglu et al., 2014).

A continuación, se convirtió la reconstrucción en un modelo matemático utilizando el software

de visualización numérica MATLAB y el software para análisis y visualización de redes

metabólicas RAVEN, el cual es una caja de herramientas o Toolbox con una serie de

comandos que permite ejecutar o asignar funciones al modelo para llevar a cabo una serie de

simulaciones en MATLAB. Para ello se utilizó el comando “importExcelModel” que devuelve

una descripción del modelo (total de genes, metabolitos, reacciones, entre otras) y la matriz

estequiométrica (S) generada de dimensiones m x n, donde m (filas) representa los

metabolitos de cada reacción y n (columnas) indica las reacciones, a través de coeficientes

estequiométricos, de modo que un signo positivo representa producción, un signo negativo

consumo y el 0 simboliza el hecho de que el metabolito no participa en la reacción (García

Sánchez & Torres Sáez, 2014; Orth et al., 2010). Posteriormente mediante la función

“checkTask” se verificó el cumplimiento de 256 tareas metabólicas hepáticas propuestas en

un GEM desarrollado previamente (HepatoNet1), en el modelo original y el modelo enriquecido

al que se le llamo iHepatocytes 2322_sd.galt (Gille et al., 2010; Mardinoglu et al., 2013). Por

otro lado, a través de la función “haveFlux” se verificó que las reacciones incluidas,

modificadas y originales tuvieran flujo. Después de la revisión se encontró que ninguna de las

reacciones incluidas en el modelo propuesto tenía flujo, por ello se modificó la sintaxis de 42

reacciones con el fin de dar flujo a la reacción de la enzima GALM (ver Apéndice F).

Adicionalmente el galactitol era un metabolito sin salida en el modelo original, es decir se

producía en una reacción conocida, pero no se consumía en otra, ni tampoco se asociaba con

un transportador, por ello no tenía flujo (Mackie, Keseler, Nolan, Karp, & Paulsen, 2013).

Debido a lo anterior, se realizó una búsqueda en literatura y las bases de datos HMBD y

HumanCyc para verificar otras reacciones asociadas, sin embargo no se encontró evidencia

del metabolismo del galactitol en humanos, por ello se añadió una reacción de transporte al

espacio extracélular y una reacción de intercambio que hace referencia a los metabolitos que

pueden entrar o salir de la célula. Además se realizó el mismo procedimiento para las dos

reacciones propuestas para la producción de galactonato, debido a que no se encontró

evidencia del metabolismo del galactonato en humanos (Segal, Wehrli, Yager, & Reynolds,

2006; C. Yager et al., 2006). Después de las modificaciones realizadas en el modelo

enriquecido (iHepatocytes 2322_sd.galt) se verificó nuevamente que todas las reacciones

tuvieran flujo.

Para validar el modelo enriquecido se propusieron tareas metabólicas asociadas a la vía de

Leloir y vías alternas de la galactosa para un total de 262 tareas (ver Apéndice G), verificadas

con la función “checkTask”. Por otro lado se generó la condición de deficiencia de GALT,

limitando el flujo a cero de la reacción catalizada por la enzima mediante la función “setParam”,

en este manuscrito al modelo deficiente de la enzima se refiere como ‘iHepatocytes

2322_def.galt”

Análisis de flujos metabólicos en condición normal vs deficiencia de GALT.

Para determinar la distribución de flujos metabólicos del sistema, es decir “la tasa a la cual

cada metabolito es consumido o producido por cada reacción” (Orth et al., 2010), se utilizó un

FBA . Debido a que en la matriz estequiométrica (S) es mayor el número de reacciones que

de metabolitos ocurre un problema de optimización, que puede resolverse mediante la

aplicación de una serie de restricciones que limiten el espacio de solución (Orth et al., 2010).

La dirección de las reacciones (reversibles o irreversibles) y los coeficientes estequiometricos

fueron el primer grupo de restricciones establecidas en los modelos (original, enriquecido y

deficiente en GALT), sin embargo para representar condiciones fisiológicas en un hepatocito,

se fijaron límites de entrada o salida de flujo (máximo y mínimo flujo permitido en la reacción)

según el metabolito en algunas reacciones de intercambio (reacciones que indican metabolitos

que pueden ingresar o salir del hepatocito) de los modelos con base en los estudios de (Blais

et al., 2017; Chan et al., 2003), en una unidad de fmol/célula/hora como se indica a

continuación:

Metabolito Chan et al., 2003 Blais et al., 2017

Histidina 0,67 -

Isoleucina 1,67 -

Leucina 2,83 -

Lisina 2,50 -

Metionina 0,03 -

Fenilalanina 8,75 -

Treonina 0,92 -

Triptófano 0,03 -

Valina 0,54 -

Alanina 1,33 -

Asparagina 0,03 -

Glutamina 10,00 -

Tirosina 1,33 -

Cisteina 0,26 -

Arginina 9,58 -

Glicina 5,83 -

Metabolito Chan et al., 2003 Blais et al., 2017

Prolina 2,92 -

Serina 9,58 -

Ornitina 7,50 -

Glicerol 8,75 -

Linolenato - 3,1

Linoleato - 10

Pantotenato (Vit B5) - 1

Folato - 1

Piridoxal (Vit B6) - 1

Biotina - 1

Ascorbato - 1

Tiamina - 1

Riboflavina - 1

α-tocoferol (Vit E) - 1

Vitamina D3 - 1

Retinol - 1

Filoquinona (VitK1) - 1

Para otras reacciones de intercambio como azúcares, minerales, electrolitos, CO2, H2O, O2

entre otros y reacciones internas o involucradas en cada una de las vías metabólicas, se

establecieron límites inferiores y superiores de -10 y 10 para reacciones reversibles y 0 y 10

en reacciones irreversibles, “esta configuración se usa comúnmente porque la absorción y las

tasas de secreción pueden estar limitadas a valores medidos experimentalmente, mientras

que los límites de la reacción interna a menudo se desconocen” (Schellenberger et al., 2011).

Con el fin de evitar errores en los resultados se bloqueó el flujo de entrada de metabolitos

como medicamentos y toxinas incluidas en el modelo, además de la entrada en las reacciones

que los utilizaban estableciendo límites de 0 para cada una (ver Apéndice H). Adicionalmente

se establecieron arbitrariamente límites de flujo en condición normal para el galactitol y

galactonato de 0,5, con base en las bajas concentraciones en plasma y excreción en orina de

estos metabolitos que presentan pacientes no galactosemicos (Yager, Chen, Reynolds, &

Segal, 2003; Yager et al., 2006). En cuanto al modelo iHepatocytes 2322_def.galt se fijó un

flujo de 5 para estos metabolitos, ya que se estima que los pacientes con galactosemia pueden

oxidar hasta 50% de la galactosa en 24 horas (Berry, Reynolds, Yager, & Segal, 2004). De

igual forma para cada modelo se establecieron limites superiores e inferiores de 0,1 debido a

que se estima que la reacción catalizada por UGP tiene una actividad del 1% respecto a GALT

(Abraham & Howell, 1969).

Para fijar las cantidades de entrada de galactosa se utilizaron estudios que evaluaron

tolerancia en pacientes con galactosemia o recomendaciones nutricionales establecidas en

centros médicos (ver Apéndice I). Debido a que el modelo solo acepta datos de flujo, y

representa el metabolismo de un hepatocito, se diseñó un sistema de ecuaciones

estequiometricas para cada valor elegido, tomando como referencia un adulto de 70Kg y el

peso de un hepatocito que corresponde a 4,31E-13Kg (Zavadskaia, Kudriavtseva,

Kudriavtsev, Smirnova, & Skorina, 1983) como se indica a continuación:

54mg/día = 0,77mg/kg/día (en adulto de 70kg); 0,77mg/kg/día es igual a 4,3µmol/kg/día

4,3µmol / kg * 4,31E-13Kg /célula = 1,8533E-12 µmol/célula

1,8533E-12 µmol/célula/día * 1E9 fmol/ µmol * 1 día/ 24 horas = 7,72E-5 fmol/célula/hora

Las cantidades de glucosa fueron equimolares a las de galactosa.

Los valores elegidos y el flujo correspondiente se encuentran a continuación:

Valor elegido (mg/kg/día) Valor elegido en unidad de flujo (fmol/célula/hora)

0,77 7,72E-5

8,57 8,55E-4

57,1 5,70E-3

114,3 0,011

10* 1

30* 3

62* 6,25+

*La unidad corresponde a g/kg/día, considerados como valores supra fisiológicos.

+Esta cantidad corresponde al máximo valor de flujo de glucosa obtenido por (Chan et al., 2003) al exponer hepatocitos en plasma humano, en un medio alto en insulina y suplementado con aminoácidos.

Además de las restricciones previamente descritas, el modelo requiere fijar una función

objetivo definida como una función biológica que representa el fenotipo estudiado o el

problema que se pretende resolver (Orth et al., 2010). De este modo se establecieron como

funciones objetivo la síntesis de glucógeno, ya que es una tarea metabólica del hepatocito, y

la producción de ATP como tarea metabólica célular, lo cual permitía observar la capacidad

metabólica del hepatocito en el anabolismo y catabolismo, respectivamente. Por otro lado, con

el fin de verificar el metabolismo en condiciones normales y en enfermedad se optimizo la

reacción de GALE en el modelo enriquecido (iHepatocytes 2322_sd.galt) y deficiente de GALT

(iHepatocytes 2322_def.galt)

Una vez establecidas las restricciones y la función objetivo, mediante el comando “setParam”

de RAVEN, se reduce aún más el espacio de solución y se obtiene un sistema de ecuaciones

lineales, asumiendo un estado estable donde todo lo que se consume, se utiliza y no existen

cambios de concentración en el tiempo, es decir S * v = 0, donde S es la matriz, v representa

el flujo de las reacciones, y la ecuación que resulta representa la tasa de cambios en los

metabolitos (García Sánchez & Torres Sáez, 2014). Las ecuaciones lineales se resolvieron

mediante software de optimización como Gurobik y Mosek, utilizando el comando “solveLP”

de RAVEN. Posteriormente se utilizó “printFluxes” para obtener un listado de flujos que indica

las reacciones activas después de la optimización. Cabe resaltar que no se pueden optimizar

dos funciones objetivo simultáneamente.

Figura E1. La imagen tomada de (Orth et al., 2010) indica el proceso utilizado para llevar a

cabo un análisis de balance de flujos (FBA).

Una vez se obtuvo las tasas de cambio de las diferentes reacciones en los modelos como

respuesta a la entrada de galactosa, se realizó un análisis cualitativo en función de las

reacciones activas, la distribución y el cambio de flujos metabólicos generados para cada

función objetivo.

Apéndice F. Reacciones modificadas en sintaxis

Cambio de sintaxis

ID Reacción* Subsistema

alpha-D-galactose

HMR_4130 ATP[c] + galactose[c] => ADP[c] + alpha-D-galactose-1-phosphate[c] Metabolismo de galactosa

alpha-D-galactose

HMR_4132 galactose-1-phosphate[c] + UDP-glucose[c] => glucose-1-phosphate[c] + UDP-galactose[c]

Metabolismo de galactosa

alpha-D-galactose

HMR_8766 galactose[c] + H+[c] + NADPH[c] <=> galactitol[c] + NADP+[c] Metabolismo de galactosa

alpha-D-galactose

HMR_0803 globotriaosylceramide[c] + H2O[c] => galactose[c] + LacCer pool[c] Biosíntesis de glicoesfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_4416 galactosylglycerol[s] + H2O[s] => galactose[s] + glycerol[s] Metabolismo de galactosa

beta-D-galactose

HMR_8217 digalactosylceramide[l] + H2O[l] => D-galactosyl-N-acylsphingosine[l] + galactose[l] Metabolismo de esfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_0819 GA1[c] + H2O[c] => GA2[c] + galactose[c] Biosíntesis de glicoesfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_0830 GM1[c] + H2O[c] => galactose[c] + GM2[c] Biosíntesis de glicoesfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_4858 galactose[c] <=> galactose[s] Transporte, extracélular

beta-D-galactose

HMR_8765 galactose[l] => galactose[c] Transporte, extracélular

beta-D-galactose

HMR_4415 H2O[s] + lactose[s] => galactose[s] + glucose[s] Metabolismo de galactosa

beta-D-galactose

HMR_0766 galactose[s] + glucosylceramide pool[s] => H2O[s] + LacCer pool[s] Metabolismo de esfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_9140 <=> galactose[s] Reacción de intercambio

beta-D-galactose

HMR_8764 H2O[l] + lactose[l] => galactose[l] + glucose[l] Metabolismo de galactosa

beta-D-galactose

HMR_7577 2 H2O[l] + l2n2m2mn[l] => 2 galactose[l] + n2m2mn[l] Metabolismo de N-glicanos

beta-D-galactose

HMR_8210 D-galactosyl-N-acylsphingosine[l] + H2O[l] => ceramide pool[l] + galactose[l] Metabolismo de esfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_0786 H2O[l] + LacCer pool[l] => galactose[l] + glucosylceramide pool[l] Metabolismo de glicoesfingolípidos

Cambio de sintaxis


beta-D-galactose

HMR_0804 globotriaosylceramide[l] + H2O[l] => galactose[l] + LacCer pool[l] Metabolismo de glicoesfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_0832 GM1[l] + H2O[l] => galactose[l] + GM2[l] Metabolismo de glicoesfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_0914 H2O[l] + psychosine[l] => galactose[l] + sphingosine[l] Metabolismo de glicoesfingolípidos

beta-D-galactose

HMR_7508 chondroitin sulfate A (GalNAc4S-GlcA), degradation product 5[l] + 4 H2O[l] => D-xylose[l] + 2 galactose[l] + glucuronate[l] + sulfate[l]

Degradación de condroitín sulfato

beta-D-galactose

HMR_7533 chondroitin sulfate C (GalNAc6S-GlcA), degradation product 5[l] + 4 H2O[l] => D-xylose[l] + 2 galactose[l] + glucuronate[l] + sulfate[l]


beta-D-galactose

HMR_7567 chondroitin sulfate E (GalNAc4,6diS-GlcA), degradation product 7[l] + 5 H2O[l] => D-xylose[l] + 2 galactose[l] + glucuronate[l] + 2 sulfate[l]


beta-D-galactose

HMR_7251 3 H2O[l] + heparan sulfate, degradation product 25[l] => D-xylose[l] + 2 galactose[l] + glucuronate[l]

Degradación de heparan sulfato

beta-D-galactose

HMR_7380 2 H2O[l] + keratan sulfate I, degradation product 5[l] => 2 galactose[l] + keratan sulfate I, degradation product 6[l]

Degradación de keratan sulfato

beta-D-galactose

HMR_7384 H2O[l] + keratan sulfate I, degradation product 8[l] => galactose[l] + keratan sulfate I, degradation product 9[l]


beta-D-galactose



beta-D-galactose



beta-D-galactose



beta-D-galactose



beta-D-galactose



beta-D-galactose



beta-D-galactose



beta-D-galactose



beta-D-galactose



Cambio de sintaxis


beta-D-galactose



beta-D-galactose



beta-D-galactose

HMR_7457 2 H2O[l] + keratan sulfate II (core 2-linked), degradation product 2[l] => 2 galactose[l] + keratan sulfate II (core 2-linked), degradation product 3[l]


beta-D-galactose

HMR_7461 H2O[l] + keratan sulfate II (core 2-linked), degradation product 5[l] => galactose[l] + keratan sulfate II (core 2-linked), degradation product 6[l]


beta-D-galactose

HMR_7465 H2O[l] + keratan sulfate II (core 2-linked), degradation product 8[l] => galactose[l] + keratan sulfate II (core 2-linked), degradation product 9[l]


beta-D-galactose

HMR_7467 F1alpha[l] + H2O[l] => core 6[l] + galactose[l] Degradación de keratan sulfato

beta-D-galactose

HMR_7486 2 H2O[l] + keratan sulfate II (core 4-linked), degradation product 2[l] => 2 galactose[l] + keratan sulfate II (core 4-linked), degradation product 3[l]


*En rojo se indica la modificación de la sintaxis realizada en el modelo enriquecido.

Apéndice G. Lista de tareas metabólicas.

ID Tarea metabólica * ID Tarea metabólica *

1 Refosforilación aeróbica de ATP a partir de glucosa

132 Síntesis de novo de ácido 7Z-tetradecanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

2 Refosforilación aeróbica de ATP a partir de ácidos grasos

133 Síntesis de novo de ácido physeteric (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

3 Refosforilación aeróbica de GTP 134 Síntesis de novo de ácido pentadecílico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

4 Refosforilación aeróbica de CTP 135 Síntesis de novo de palmitato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

5 Refosforilación aeróbica de UTP 136 Síntesis de novo de palmitoleato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

6 Refosforilación anaeróbica de ATP 137 Síntesis de novo de ácido palmitoleico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

7 Refosforilación anaeróbica de GTP 138 Síntesis de novo de ácido heptadecanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

8 Refosforilación anaeróbica de CTP 139 Síntesis de novo de ácido 10Z- heptadecanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

9 Refosforilación anaeróbica de UTP 140 Síntesis de novo de ácido 9-heptadecilénico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

10 Síntesis de novo de ATP (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

141 Síntesis de novo de estearato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

11 Síntesis de novo de CTP (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

142 Síntesis de novo de ácido 13z-octadecanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

12 Síntesis de novo de GTP (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

143 Síntesis de novo de ácido cis-vaccénico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

13 Síntesis de novo de UTP (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

144 Síntesis de novo de oleato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

14 Síntesis de novo de dATP (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

145 Síntesis de novo de elaídico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

15 Síntesis de novo de dCTP (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

146 Síntesis de novo del ácido 7Z-octadecanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

16 Síntesis de novo de dGTP (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

147 Síntesis de novo del ácido 6Z,9Z-octadecadienoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)


17 Síntesis de novo de dTTP (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

148 Síntesis de novo del ácido nonadecanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

18 Recuperación de ATP de adenosina 149 Síntesis de novo de eicosanoato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

19 Recuperación de ATP de la hipoxantina 150 Síntesis de novo de ácidos 13Z-eicosanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

20 Recuperación de dTTP de la timina 151 Síntesis de novo de ácidos cis-gondoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

21 Reducción aeróbica de NAD+ 152 Síntesis de novo de 9-eicosanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

22 Reducción aeróbica de NADP+ 153 Síntesis de novo de 8,11-eicosanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

23 Gluconeogénesis de lactato 154 Síntesis de novo de ácido eicosatrienoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

24 Gluconeogénesis de glicerol 155 Síntesis de novo de ácido henicosanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

25 Gluconeogénesis de alanina 156 Síntesis de novo de ácido behénico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

26 Gluconeogénesis de lactato y opcionalmente ácido graso

157 Síntesis de novo de ácido cis-erúcico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

27 Gluconeogénesis de glicerol y opcionalmente ácido graso

158 Síntesis de novo de ácido cis-cetoleico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

28 Gluconeogénesis de alanina y ácido graso

159 Síntesis de novo de ácido tricosanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

29 Almacenamiento de glucosa en glucógeno

160 Síntesis de novo de ácido lignocerato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

30 Liberación de glucosa de glucógeno 161 Síntesis de novo de ácido nervónico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

31 Degradación de fructosa 162 Síntesis de novo de ácido cerótico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

32 Degradación de galactosa 163 Síntesis de novo de ácido ximeninico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

33 Producción de galactosa 1-fosfato (metabolismo de galactosa)

164 Síntesis de novo de linolenato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)


34 Producción de UDP-galactosa (metabolismo de galactosa)

165 Síntesis de novo de ácido estearidónico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

35 Producción de UDP-glucosa (metabolismo de galactosa)

166 Síntesis de novo de ácido araquidónico-omega 3 (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

36 Producción de galactitol (metabolismo de galactosa)

167 Síntesis de novo de EPA (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

37 Producción de galactonato (metabolismo de galactosa)

168 Síntesis de novo de DPA (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

38 Producción de UDP-galactosa (pirofosforilasa)

169

Síntesis de novo de 9Z,12Z,15Z,18Z,21Z-TPA (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

39 Síntesis de novo de UDP-glucosa (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

170

Síntesis de novo de 6Z,9Z,12Z,15Z,18Z,21Z-THA (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

40 Síntesis de novo de UDP-galactosa (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

171 Síntesis de novo de DHA (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

41 Síntesis de novo de UDP-glucoronato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

172

Síntesis de novo de ácido 11Z,14Z,17Z-eicosatrienoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

42 Síntesis de GDP-L-fucosa de novo (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

173 Síntesis de novo ácido 13,16,19-docosatrienocico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

43 Síntesis de GDP-manosa de novo (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

174

Síntesis de novo pacido 10,13,16,19- docosatrienoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

44 Síntesis de de novo UDP-N-acetil-D-galactosamina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

175

Síntesis de novo de ácido 12,15,18,21-tetracosatrienoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

45 Síntesis de de novo CMP-N-acetilneuraminato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

176 Síntesis de novo de linoleato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

46 Síntesis de de novo UDP-N-acetil-glucosamina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

177 Síntesis de novo de gama-linolenato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

47 Síntesis de de novo de glucoronato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

178 Síntesis de novo de dihomo-gama-linolenato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

48 Síntesis de novo de alanina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

179 Síntesis de novo de araquidonato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)


49 Síntesis de novo de arginina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

180 Síntesis de novo de ácido adrenico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

50 Síntesis de novo de asparagina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

181 Síntesis de novo de 9Z,12Z,15Z,18Z-TTA (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

51 Síntesis de novo de aspartato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

182

Síntesis de novo de 6Z,9Z,12Z,15Z,18Z-TPA (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

52 Síntesis de novo de glutamato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

183

Síntesis de novo de 4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-DPA (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

53 Síntesis de novo de glicina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

184 Síntesis de novo de 11Z,14Z-ácido eicosadienoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

54 Síntesis de novo de glutamina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

185 Síntesis de novo de 13Z,16Z-docosadienocico (sustratos mínimos, excreción fisiologica)

55 Síntesis de novo de prolina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

186 Síntesis de novo 10,13,16-docosatrienoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

56 Síntesis de novo de serina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

187 Ácido laurico (oxidación completa)

57 Síntesis de novo de histidina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

188 Ácido tridecanoico (oxidación completa)

58 Capatación de histidina 189 Ácido mirístico (oxidación completa)

59 Síntesis de novo de isoleucina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

190 Ácido tetradecanoico (oxidación completa)

60 Capatación de isoleucina 191 Ácido 7Z-tetradecanoico (oxidación completa)

61 Síntesis de novo de leucina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

192 Ácido physeteric (oxidación completa)

62 Captación de leucina 193 Ácido pentadecilico (oxidación completa)

63 Síntesis de novo de lisiina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

194 Palmitato (oxidación completa)

64 Captación de lisina 195 Palmitalato (oxidación completa)

65 Síntesis de novo de metionina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

196 Ácido palmitoleico (oxidación completa)

66 Captación de metionina 197 Ácido heptadecanoico (oxidación completa)

67 Síntesis de novo de fenilalanina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

198 Ácido 10Z-heptadecenoico (oxidación completa)

68 Captación de fenilalanina 199 Ácido 9-heptadecilenico (oxidación completa)


69 Síntesis de novo de treonina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

200 Estearato (oxidación completa)

70 Captación de treonina 201 Ácido 13Z-octadecanoico (oxidación completa)

71 Síntesis de novo de triptofano (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

202 Ácido cis-vaccenico (oxidación completa)

72 Captación de triptofano 203 Oleato (oxidación completa)

73 Síntesis de novo de valina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

204 Elaidato (oxidación completa)

74 Captación de valina 205 Ácido 7Z-octadecanoico (oxidación completa)

75 Síntesis de novo de cisteina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

206 Ácido 6Z,9Z-octadecadienoico (oxidación completa)

76 Síntesis de novo de cisteina (sustratos mínimos y AA, excreción mínima)

207 Ácido nonadecilico (oxidación completa)

77 Síntesis de novo de cisteina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

208 Eicosanoato (oxidación completa)

78 Síntesis de novo de tirosina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

209 Ácido 13Z-Eicosanoico (oxidación completa)

79 Síntesis de novo de tirosina (sustratos mínimos y AA, excreción mínima)

210 Acido cis-gondoico (oxidación completa)

80 Síntesis de novo de homocisteina (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

211 Ácido 9-Eicosenoico (oxidación completa)

81 Síntesis de novo de homocisteina (sustratos mínimos y AA, excreción mínima)

212 Ácido 8,11-Eicosadienoico (oxidación completa)

82 Síntesis de novo de beta-alanina (sustratos mínimos, excreción mínima)

213 Ácido eicosatrienoico (oxidación completa)

83 Degradación de alanina 214 Ácido eicosanoico (oxidación completa)

84 Degradación de arginina 215 Ácido bhenico (oxidación completa)

85 Degradación de asparagina 216 Ácido cis-erucico (oxidación completa)

86 Degradación de aspartato 217 Ácido cis-cetoleico (oxidación completa)

87 Degradación de cisteina 218 Ácido tricosanoico (oxidación completa)

88 Degradación de glutamato 219 Lignocerato (oxidación completa)

89 Degradación de glicina 220 Ácido Nervonic (oxidación completa)

90 Degradación de histidina 221 Ácido cerotic (oxidación completa)

91 Degradación de isoleucina 222 Ácido ximenico (oxidación completa)

92 Degradación de glutamina 223 Linolenato (oxidación completa)

93 Degradación de leucina 224 Ácido estearidonico (oxidación completa)


94 Degradación de lisina 225 Ácido araquidonico-omega 3 (oxidación completa)

95 Degradación de metionina 226 EPA (oxidación completa)

96 Degradación de fenilalanina 227 DPA (oxidación completa)

97 Degradación de prolina 228 9Z,12Z,15Z,18Z,21Z-TPA (oxidación completa)

98 Degradación de serina 229 6Z,9Z,12Z,15Z,18Z,21Z-THA (oxidación completa)

99 Degradación de treonina 230 DHA (oxidación completa)

100 Degradación de triptofano 231 11Z,14Z,17Z-eicosatrienoico (oxidación completa)

101 Degradación de tirosina 232 13,16,19-docosatrienoico (oxidación completa)

102 Degradación de valina 233 10,13,16,19-docosatetraenoico (oxidación completa)

103 Degradación de homocisteina 234 12,15,18,21-tetracosatetraenoico (oxidación completa)

104 Degradación de ornitina 235 Linoleato (oxidación completa)

105 Degradación de beta-alanina 236 gamma-Linolenato (oxidación completa)

106 Urea de alanina 237 Dihomo-gamma-linolenato (oxidación completa)

107 Urea de glutamina 238 Araquidonato (oxidación completa)

108 Síntesis de novo de creatina (sustratos mínimos, ecreción fisiológica)

239 Ácido adrenico (oxidación completa)

109 Síntesis de novo de hemo (sustratos mínimos, ecreción fisiológica)

240 9Z,12Z,15Z,18Z-TTA (oxidación completa)

110 Síntesis de novo de PC (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

241 6Z,9Z,12Z,15Z,18Z-TPA (oxidación completa)

111 Síntesis de novo de PE (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

242 4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-DPA (oxidación completa)

112 Síntesis de novo de PS (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

243 11Z,14Z-eicosadienoico (oxidación completa)

113 Síntesis de novo de PI (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

244 13Z,16Z-docosadienoico (oxidación completa)

114 Síntesis de novo de cardiolipina (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

245 10,13,16-docosatriynoico (oxidación completa)

115 Síntesis de novo de SM (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

246 Síntesis de novo de triacylglycerol (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

116 Síntesis de novo de ceramida (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

247 Síntesis de novo y excreción Glycocolateo (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

117 Síntesis de novo de lactosilceramida (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

248 Síntesis de novo y excreción de glycoquenodeoxicolato


118 Síntesis de novo de CoA (sustratos mínimos,excreción fisiológica)

249 Síntesis de novo y excreción de taurocolato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

119 Síntesis de novo de NAD (sustratos mínimos,excreción fisiológica)

250

Síntesis de novo y excrecion de tauroquenodeoxicolato (minimal substrates, physiological excretion)

120 Síntesis de novo de NADP (sustratos mínimos,excreción fisiológica)

251 Sínteis de novo de PAPS (sustratos mínimos y excreción fisiológica)

121 Síntesis de novo de FAD (sustratos mínimos,excreción fisiológica)

252 PAP degradación

122 Síntesis de novo de tiorredoxina (sustratos fisiológicos, excreción fisiológica)

253 Síntesis de novo de SAM (sustratos mínimos y excreción fisiológica)

123 Síntesis de novo de THF (sustratos mínimos,excreción fisiológica)

254 Síntesis de novo de GSH (sustratos mínimos y excreción fisiológica)

124 Síntesis de novo de Piridoxal fosfato (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

255 Conjugación de bilirrubina (sustratos mínimos y excreción fisiológica)

125 Síntesis de novo de acetoacetato y excreción

256 Importación y degradación de NH3

126 Síntesis de novo hidroxibutonoato 257 Importación y degradación de etanol (sustratos mínimos, excreción minima)

127 Síntesis de novo de Pirofosfato de farnesilo (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

258 Fosforilación oxidativa

128 Síntesis de novo de ácido laurico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

259 Decarboxilación oxidativa

129 Síntesis de novo de ácido tridecanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

260 Ciclo de krebs NADH

130 Síntesis de novo de ácido mirístico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

261 Ubiquinol a protón

131 Síntesis de novo de ácido 9E-tetradecanoico (sustratos mínimos, excreción fisiológica)

262 Ubiquinol a ATP

*Doscientas cincuenta y seis tareas metabólicas pertenecen a la reconstrucción metabólica de

hepatocito, HepatoNet1 (Gille et al., 2010), las cuales se utilizaron para validar iHepatocytes 2322

(Mardinoglu et al., 2014), las tareas en rojo debían fallar en la evaluación. Adicionalmente se

propusieron otras tareas metabólicas (33-38) para el metabolismo de la galactosa.

Apéndice H. Metabolitos eliminados

Código del metabolito

Metabolito (sintaxis del

modelo)

Código de la

reacción

Reacción de entrada bloqueada

Subsistema Descripción Fuente

HMR_7108 benzo[a]pyrene

HMR_7109 benzo[a]pyrene[s] =>

benzo[a]pyrene[c] Transporte extracelular

Hidrocarburo aromático se produce en procesos industriales o algunas prácticas de cocción; su metabolismo es hepático y su principal ruta de eliminación es la bilis.

Franco & Ramirez, 2013

HMR_6993

benzo[a]pyrene[c] + H+[c] +

NADPH[c] + O2[c] => benzo[a]pyrene-7,8-oxide[c] +

H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de

xenobioticos por C. P450

HMR_7110 naphthalene

HMR_7111 naphthalene[s] =>

naphthalene[c] Transporte extracelular

Hidrocarburo; la exposición aguda por inhalación o ingesta (nuez negra) se asocia con daño hepático

Base de datos PubChem del

NIH

HMR_7001

H+[c] + NADPH[c] + naphthalene[c] + O2[c] => (1R,2S)-naphthalene 1,2-

oxide[c] + H2O[c] + NADP+[c] Metabolismo

de xenobioticos por C. P450

HMR_7002

H+[c] + NADPH[c] +

naphthalene[c] + O2[c] => (1S,2R)-naphthalene 1,2-

oxide[c] + H2O[c] + NADP+[c]

HMR_7112 aflatoxin B1

HMR_7113 aflatoxin B1[s] => aflatoxin

B1[c] Transporte extracelular

Micotoxina hepatotóxica y hepatocarcinógena, se encuentra como contaminante en algunos granos.


NIH

HMR_7020

aflatoxin B1[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] => aflatoxin

B1-endo-8,9-epoxide[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_7021

aflatoxin B1[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] => aflatoxin B1-exo-8,9-epoxide[c] + H2O[c]

+ NADP+[c]

HMR_7114 trichloroethene

HMR_7115 trichloroethene[s] => trichloroethene[c]

Transporte extracelular

Disolvente y extracto en la fabricación de alimentos

HMBD HMR_7033 H+[c] + NADPH[c] + O2[c] + trichloroethene[c] => chloral[c]

+ H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de



modelo)

Código de la

reacción



HMR_7029 GSH[c] + trichloroethene[c] => hydrochloride[c] + S-(1,2-dichlorovinyl)glutathione[c]


HMR_7116 bromobenzene

HMR_7117 bromobenzene[s] => bromobenzene[c]


Compuesto que pertenece a la familia de los epóxidos

HMBD

HMR_7040

bromobenzene[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] =>

bromobenzene-3,4-oxide[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_7048

bromobenzene[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] <=>

bromobenzene-2,3-oxide[c] + H2O[c] + NADP+[c]

HMR_7118 7,12-

dimethylbenz[a]anthracene

HMR_7119

7,12-dimethylbenz[a]anthracene[s]

=> 7,12-dimethylbenz[a]anthracene[c]


Hidrocarburo aromático, presente en el humo del tabaco, es un potente carcinógeno


NIH

HMR_7053 7,12-dimethylbenz[a]anthracene[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] =>

7-hydroxymethyl-12-methylbenz[a]anthracene[c] +

H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_7120

4-(n-nitrosomethylamino)-1-(3-pyridyl)-

1-butanone

HMR_7121

4-(n-nitrosomethylamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone[s] => 4-(n-

nitrosomethylamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone[c]


Potente carcinógeno presente en el humo del tabaco.

Hazardous Substances Data Bank

HMR_7059

4-(n-nitrosomethylamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone[c] + H+[c] +

NADPH[c] => 4-(methylnitrosamino)-1-(3-

pyridyl)-1-butanol[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_7122 nitronaphthalene HMR_7123 1-nitronaphthalene[s] => 1-

nitronaphthalene[c] Transporte extracelular

Compuesto aromático policíclico, altamente tóxico.

HMBD

https://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB





modelo)

Código de la

reacción



HMR_7082

1-nitronaphthalene[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] => 1-

nitronaphthalene-7,8-oxide[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


No hay evidencia de ser carcinógeno

Hazardous Substances Data Bank

HMR_7124 1,1-

dichloroethylene

HMR_7125 1,1-dichloroethylene[s] => 1,1-

dichloroethylene[c] Transporte extracelular

Compuesto utilizado para producir solventes y mezclas químicas


NIH Hazardous Substances Data Bank

HMR_7091

1,1-dichloroethylene[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] => 1,1-

dichloroethylene epoxide[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_7088

1,1-dichloroethylene[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] => 2,2-dichloroacetaldehyde[c] +

H2O[c] + NADP+[c]

HMR_7096

1,1-dichloroethylene[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] =>

chloroacetyl chloride[c] + H2O[c] + NADP+[c]

HMR_7126 1,2-

dibromoethane

HMR_7127 1,2-dibromoethane[s] => 1,2-

dibromoethane[c] Transporte extracelular

Fumigante. Su inhalación prolongada puede causar necrosis hepática


NIH

HMR_7099

1,2-dibromoethane[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] => 2-

bromoacetaldehyde[c] + H2O[c] + hydrobromic acid[c] +

NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_7103 1,2-dibromoethane[c] + GSH[c] + H+[c] => glutathione episulfonium ion[c] + 2

hydrobromic acid[c]

HMR_9213 4-nitrocatechol

HMR_8035 4-nitrocatechol[c] <=> 4-

nitrocatechol[s] Transporte extracelular Se produce por la oxidación

de nitrofenol (compuesto tóxico) por la acción del citocromo P450

HMBD

HMR_8034 H+[c] + NADPH[c] + O2[c] +

PNP[c] => 4-nitrocatechol[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de




modelo)

Código de la

reacción



HMR_9226 4-hydroxy-tolbutamide

HMR_8053 4-hydroxy-tolbutamide[c] <=>

4-hydroxy-tolbutamide[s] Transporte extracelular

Subproducto de hidroxilación de tolbutamida, un bloqueador de canales de potasio utilizado para el tratamiento de la DMT2

HMBD

HMR_8052

H+[c] + NADPH[c] + O2[c] + tolbutamide[c] => 4-hydroxy-

tolbutamide[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_9227 4-nitrophenyl-

sulfate

HMR_8101 4-nitrophenyl-sulfate[c] <=> 4-

nitrophenyl-sulfate[s] Transporte extracelular Producto del metabolismo del

Paratión (excretado en orina), un insecticida altamente tóxico.

HMBD

HMR_7688 PAPS[c] + PNP[c] => 4-

nitrophenyl-sulfate[c] + PAP[c]

Metabolismo de


HMR_9323 5-hydroxy-omeprazole

HMR_8047 5-hydroxy-omeprazole[c] <=>

5-hydroxy-omeprazole[s] Transporte extracelular

Este metabolito está presente unicamente en sujetos que han tomado Omeprazol

HMBD

HMR_8046

H+[c] + NADPH[c] + O2[c] + omeprazole[c] => 5-hydroxy-

omeprazole[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_9265 antipyrine

HMR_8042 antipyrine[c] <=> antipyrine[s] Transporte extracelular

Analgésico, antipirético HMBD

HMR_8043

antipyrine[c] + H+[c] + NADPH[c] + 0.5 O2[c] =>

edaravone[c] + methanol[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_9266 alpha-pinene-

oxide

HMR_8602 alpha-pinene-oxide[c] <=>

alpha-pinene-oxide[s] Transporte extracelular

Compuesto utilizado en la industria para la producción de perfumes.

HMBD

HMR_8601

(+)-alpha-pinene[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] => alpha-pinene-oxide[c] + H2O[c] +

NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_9267 (+)-alpha-pinene HMR_8600 (+)-alpha-pinene[c] <=> (+)-alpha-pinene[s]


Líquido incoloro, tóxico Base de datos PubChem del

NIH

HMR_9299 debrisoquin HMR_8031 debrisoquin[c] <=>

debrisoquin[s] Transporte extracelular

Bloqueador neuronal adrenérgico



modelo)

Código de la

reacción



HMR_8032

debrisoquin[c] + H+[c] + NADPH[c] + O2[c] => 4-

hydroxy-debrisoquine[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de



NIH

HMR_9306 edaravone HMR_8044 edaravone[c] <=> edaravone[s] Transporte extracelular

También conocido como Radicut, utilizado para tratar la esclerosis lateral amiotrófica. Adicionalmente es un producto del antypirene


NIH

HMR_9311 aflatoxin B1-exo-

8,9-epoxide HMR_8869

aflatoxin B1-exo-8,9-epoxide[c] <=> aflatoxin B1-exo-8,9-

epoxide[s]


Producto del metabolismo de la aflotoxina B1

HMBD

HMR_9312 ebastine

HMR_8057 ebastine[c] <=> ebastine[s]


Antihistamínico Base de datos PubChem del

NIH

HMR_8058 ebastine[c] <=> ebastine[r]

Transporte RE

HMR_8059

ebastine[r] + H+[r] + NADPH[r] + O2[r] => H2O[r] +

hydroxylated-ebastine[r] + NADP+[r]

Metabolismo de


HMR_9313 hydroxylated-

ebastine

HMR_8061 hydroxylated-ebastine[c] <=>

hydroxylated-ebastine[s] Transporte extracelular Producto del metabolismo de

la ebastina Hashizume et

al., 1998 HMR_8060

hydroxylated-ebastine[c] <=> hydroxylated-ebastine[r]

Transporte RE

HMR_9357 6-

hydroxypaclitaxel

HMR_8050 6-hydroxypaclitaxel[c] <=> 6-

hydroxypaclitaxel[s] Transporte extracelular

Metabolito del paclitaxel, un medicamento para el tratamiento del cáncer.

HMBD Base de datos PHARMGKB HMR_8049

H+[c] + NADPH[c] + O2[c] + paclitaxel[c] => 6-

hydroxypaclitaxel[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_9379 nifedipine

HMR_8054 nifedipine[c] <=> nifedipine[s]


Antihipertensivo, bloqueador de canales de calcio

HMBD

HMR_8055

H+[c] + NADPH[c] + nifedipine[c] + O2[c] => H2O[c]

+ hydroxy-nifedipine[c] + NADP+[c]

Metabolismo de




modelo)

Código de la

reacción



HMR_9380 hydroxy-nifedipine

HMR_8056 hydroxy-nifedipine[c] <=>

hydroxy-nifedipine[s] Transporte extracelular

Producto del metabolismo del nifedipine

HMBD

HMR_9387 omeprazole HMR_8045 omeprazole[c] <=>

omeprazole[s] Transporte extracelular

Inhibidor de la bomba de protones utilizado para el tratamiento de RGE


NIH

HMR_9388 (1R,2S)-

naphthalene 1,2-oxide

HMR_8927 (1R,2S)-naphthalene 1,2-

oxide[c] <=> (1R,2S)-naphthalene 1,2-oxide[s]


Compuesto derivado del naftaleno

HMBD HMR_7008

(1R,2S)-naphthalene 1,2-oxide[c] => 1-naphthol[c]

Metabolismo de


HMR_7011 (1R,2S)-naphthalene 1,2-oxide[c] => 2-naphthol[c]

Metabolismo de


HMR_9390 perillyl alcohol HMR_8599 perillyl alcohol[c] <=> perillyl

alcohol[s] Transporte extracelular

Monoterpeno de aceites de lavanda y hierbabuena, utilizado para investigar la capacidad de inhibir el crecimiento de células tumorales

Chen et al., 2017

HMR_9369 limonene

HMR_8595 limonene[c] <=> limonene[s] Transporte extracelular

Terpeno derivado de la vía del mevalonato en plantas y precursor del alcohol perílico, utilizado en la industria como aromatizante, utilizado para el estudio como tratamiento de cáncer.

Chen et al., 2017

HMR_8598 H+[c] + limonene[c] +

NADPH[c] + O2[c] => H2O[c] + NADP+[c] + perillyl alcohol[c]

Metabolismo de


HMR_8596 H+[c] + limonene[c] +

NADPH[c] + O2[c] => (-)-trans-carveol[c] + H2O[c] + NADP+[c]

Metabolismo de


HMR_9277 (-)-trans-carveol HMR_8597 (-)-trans-carveol[c] <=> (-)-

trans-carveol[s] Transporte extracelular

Terpenoide extraído de la hierbabuena, se utiliza como fragancia en cosméticos o

HMBD



modelo)

Código de la

reacción



aditivo en la industria alimentaria

HMR_9417 D-tagatose

HMR_8760 D-tagatose[s] => D-tagatose[c] Transporte extracelular

Edulcorante, estero isómero de la D-fructosa metabolizado en hígado por la vía de la fructosa, metabolizado completamente en bacterias

(Normén, Lærke, Jensen,

Langkilde, & Andersson,

2001) HMR_8761

ATP[c] + D-tagatose[c] => ADP[c] + D-tagatose-6-

phosphate[c]

Metabolismo de galactosa

HMR_9419 paclitaxel HMR_8048 paclitaxel[c] <=> paclitaxel[s] Transporte extracelular

Medicamento para el tratamiento de cáncer


NIH

HMR_9425 tolbutamide HMR_8051 tolbutamide[c] <=>

tolbutamide[s] Transporte extracelular

Bloqueador de canales de potasio utilizado para el tratamiento de la DMT2

HMBD

Apéndice I. Estudios elegidos para establecer la entrada de galactosa en el sistema

Autor Tipo Muestra Recomendación/Resultado Valor elegido Valor elegido (fmol/cel/h)

(Berry et al., 1993)

Estudio experimental diseñado para determinar la cantidad de galactosa libre que podría ingerir un paciente con GC en una dieta enriquecida con frutas y vegetales y su efecto en la excreción de galactitol urinario

2 mujeres con galactosemia clásica de 26 y 18 años con un peso de 82Kg y 50Kg respectivamente; con una dieta libre de lactosa y estimado de 4-26mg/día de galactosa aportada por frutas y vegetales, en su dieta normal.

Teóricamente un paciente con galactosemia y una dieta restringida en lactosa, podría ingerir más de 100mg/día de galactosa como consecuencia del consumo de frutas y vegetales, sin embargo se estima que una dieta enriquecida en frutas y vegetales (específicamente, alimentos con altas cantidades de galactosa libre como tomate, pimentón, plátano, kiwi, manzana, entre otros) aporta 54 ± 11mg/día; con esta dieta la excreción de galactitol aumento respecto a la dieta regular, sin embargo no se consideró un cambio significativo.

54mg/día (0,77mg/kg/día)

7,72E-05

( Bosch, Bakker, Wenniger-Prick, Wanders, & Wijburg, 2004)

Estudio experimental diseñado para determinar tolerancia a la galactosa exógena

3 Adolescentes con GC entre 15-18 años con una dieta restringida en galactosa desde el diagnóstico

A partir de la semana 5 se realizó la suplementación de galactosa, administrándola en capsulas de 100mg con las comidas hasta obtener un aporte de 600mg/día (no más de dos semanas); no se presentaron cambios en los niveles de galactosa 1 fosfato en sangre ni complicaciones como cataratas.

600 mg/día (8,57mg/kg/día)

8,55E-04

(Hughes et al., 2009)

Estudio descriptivo diseñado para determinar los resultados a largo plazo de una intervención dietaría en hermanos de 14 familias irlandesas con galactosemia clásica

30 sujetos de 14 familias atendidos en un centro médico que incluía el tratamiento para niños y adultos con restricción dietaria de galactosa.

Se realizó una evaluación retrospectiva del monitoreo químico, historias dietarías y alteraciones neurológicas. Después del análisis dietario, se estimó una ingesta pobre de frutas y vegetales con un valor promedio de galactosa aportada por estos alimentos de 10,2 mg/día en el grupo pediátrico y 11,2mg/día en adultos. Se estableció arbitrariamente como buen cumplimiento del tratamiento una ingesta de galactosa de <20mg/día, y como pobre cumplimiento una ingesta >20mg/día. Se concluyó que aquello que cumplían con la restricción dietaría no tuvieron resultados más

- -

Autor Tipo Muestra Recomendación/Resultado Valor elegido Valor elegido (fmol/cel/h)

favorables que los sujetos con una mayor ingesta de galactosa.

(K. P. Coss et al., 2012)

Estudio experimental diseñado para investigar si los patrones de Ig G N-glicanos son un marcador de seguimiento mejor a los actuales

10 pacientes con GC entre 18 y 26 años

Se liberó la dieta de los pacientes hasta 4000mg/día por 14 semanas sin encontrar cambios significativos en los niveles de Gal-1-P, ni complicaciones clínicas. En el artículo se afirma que el consumo de un adulto normal puede llegar a 8000 mg/día. En otros estudios se estima que esta es la cantidad consumida por un paciente con galactosemia que flexibiliza su dieta (Van Calcar et al., 2014)



5,70E-3

0,011

(Adam et al., 2015)

Estudio descriptivo diseñado para evaluar el grado de flexibilidad de la dieta en la práctica clínica de adultos con galactosemia clásica.

418 adultos con galactosemia, de 39 centros de 12 países.

La mayoría de los centros no calculan formalmente la cantidad de galactosa en la dieta, sin embargo un centro en Bélgica permite unicamente un consumo de 50mg/día de galactosa en contraste con otro centro del mismo país que permite 300mg/día; por otro lado en Italia y Holanda se permiten 100mg/día frente a la recomendación de 300-500mg/día en Alemania



1,42E-4

4,29E-4

*Para el estudio se eligieron las concentraciones de 54 mg/día, 600mg/día, 4000mg/día, 8000mg/día, debido a que el resto de los valores

reportados en otros estudios se encontraban dentro de este rango de concentraciones y adicionalmente con el uso de las mismas no se

reportó ninguna complicación en los pacientes.

Apéndice J. Ajustes realizados en las reacciones de transporte

Reacción (sintaxis del modelo) Ajustes

requeridos Comentarios

galactose[s] + Na+[s] => galactose[c] + Na+[c]

Reacción eliminada, asociada al gen SLC5A9

Co-transportador de sodio-glucosa SGLT4, se expresa principalmente en intestino delgado y riñón; está asociado con el transporte de otros azúcares como manosa, 1,5-anhidro-D-glucitol y fructosa (Tazawa et al., 2005)(Ung et al., 2017)

galactose[s] + 2 Na+[s] => galactose[c] + 2 Na+[c]

Reacción eliminada, asociada al gen SLC5A1

Co-transportador de sodio-glucosa y galactosa SGLT1, se expresa principalmente en intestino delgado. La proteína también media la reabsorción de glucosa, en el segmento S3 del túbulo proximal (Li et al., 2017; Tazawa et al., 2005)

UDP-galactose[c] + UMP[g] <=> UDP-galactose[g] + UMP[c]

Gen modificado; la reacción estaba asociada a los genes, SLC35D2 y SLC35B4

El gen SLC35D2 corresponde a un transportador de la familia de azúcar de nucleótido SLC35 (Ishida et al., 2005);según la base de datos Human Protein Atlas, es un transportador de UDP-N-acetil glucosamina y UDP glucosa. El gen SLC35B4 corresponde a un transportador de UDP-Xilosa y UDP-N-acetilglucosamina, no se encontró actividad para UDP-galactosa y UDP N-acetilgalactosamina (Ashikov et al., 2005).El gen que codifica el transportador de UDP-galactosa corresponde a SLC35A2 (Ishida et al., 2005; Ishida & Kawakita, 2004).

galactitol[c] => galactitol[s] galactitol[s] => (reacción de intercambio)

Reacción añadida

Después de verificar el flujo de las reacciones en el modelo se encontró que la reacción del galactitol no tenía flujo, por ello se añadió una reacción de transporte y una reacción de intercambio.

alpha-D-galactonate[c] => alpha-D-galactonate[s] alpha-D-galactonate[s] => (reacción de intercambio)

Reacción añadida

La vía de oxidación de galactosa no se encontraba en el modelo original, por ello se incluyeron dos reacciones (Apéndice K). Posteriormente se encontró que las reacciones añadidas no tenían flujo y se incluyó una reacción de transporte y una reacción de intercambio.

Apéndice K. Ajustes realizados en las reacciones del metabolismo primario de galactosa.

Enzima EC- Numero Reacción (sintaxis del

modelo) Ajustes

requeridos Comentarios

GALM EC:5.1.3.3 beta-D-galactose[c] <=> alpha-D-

galactose[c] Reacción añadida

La enzima actúa sobre D-glucosa, D-galactosa, D-xilosa (Thoden, Timson, Reece, & Holden, 2004) sin embargo GALM demuestra preferencia por galactosa sobre glucosa como sustrato (Holden,

Rayment, & Thoden, 2003; Thoden et al.,

2004).Además GALM cataliza el primer paso en el metabolismo de la galactosa (Coelho et al.,

2017; Holden et al., 2003). Para dar flujo a la reacción se modificó la sintaxis de 42 reacciones (ver Apéndice F).

GALK EC: 2.7.1.6 ATP[c] + galactose[c] => ADP[c]

+ galactose-1-phosphate[c]

Reacción eliminada

Duplicado de la reacción cataliza por GALK que no incluye en la sintaxis la configuración alfa.

GALT EC:2.7.7.12

glucose-1-phosphate[c] + UDP-galactose[c] <=> alpha-D-

galactose-1-phosphate[c] + UDP-glucose[c]

Reacción eliminada

La enzima GALT estaba asociada a 3 reacciones

diferentes en el modelo original. La reacción

eliminada corresponde a un duplicado de GALT que tiene como sustratos los productos; la reacción que se mantuvo se modificó en dirección y sintaxis ya que no incluía la configuración alfa.

Galactosa deshidrogenasa

EC: 1.1.1.120

alpha-D-galactose + NADP+ <=> alpha-D-galactono-1,4-lactone + NADPH

+ H+

Reacción añadida

Se incluyeron dos reacciones asociadas a la vía de oxidación de la galactosa que corresponden a R01097 y R03034 de la base de datos KEGG.

UDP-glucosa-hexosa-1-P-

uridiltransferasa EC: 2.7.7.12

alpha-D-galactose-1-phosphate[c] + UTP[c] => PPi[c]

+ UDP-galactose[c]

Gen y enzima modificada

La reacción estaba asociada al gen y la enzima GALT en el modelo, sin embargo la enzima que cataliza la reacción corresponde a la UGP (EC 2.7.7.10; 2.7.7.9) codificada por el gen UGP2 (Coelho et al., 2017)

UGP EC:2.7.7.9 glucose-1-phosphate[c] + UTP[c]

=> PPi[c] + UDP-glucose[c]

Reacción modificada en dirección

"La enzima ocupa una posición pivote en la síntesis de glucógeno por la formación de UDP-glucosa de glucosa-1-P y UTP" (Leslie et al.,

2005). La base de datos KEEG indica que es una reacción reversible.

Apéndice L. Distribución de flujos en la vía de Leloir al tomar como objetivo la reacción de GALE.

Al optimizar el sistema para la reacción de GALE en condición normal se obtuvo el límite superior establecido (10 fmol/célula/hora) en

todas las entradas de galactosa determinadas (fisiológicas y supra fisiológicas). De igual forma en ningún caso hubo actividad en la

vía de la pirofosforilasa. Asimismo en iHepatocytes 2322_def.galt no se obtuvieron cambios de flujo en la reacción de GALE a pesar

de las diferencias de concentración de galactosa. Sin embargo con cantidades por debajo de 10g/kg/día (1fmol/célula/hora) de

galactosa no hubo actividad en las reacciones del galactitol y galactonato, mientras que con una cantidad de 62g/kg/día

(6,25fmol/célula/hora) de galactosa se encontró la mayor tasa de producción de estos metabolitos.

Figura L1. Distribución de flujos en el modelo iHepatocytes 2322_sd.galt (a) y el modelo iHepatocytes 2322_def.galt (b) con una

cantidad de 62g/kg/día (6,25fmol/célula/hora) de galactosa.

a) b)

Apéndice M. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de

0,77mg/kg/día (7,72E-5 fmol/célula/hora) de galactosa.

Figura M1. Reacciones activas al tomar como función objetivo la síntesis de glucógeno con

una cantidad de 0,77mg/kg/día (54mg/día) de galactosa.

Figura M2. Reacciones activas al tomar como función objetivo la producción de ATP con una

cantidad de 0,77mg/kg/día (54mg/día) de galactosa.

Vía

met

abó

lica

Vía

met

abó

lica

Apéndice N. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de


Figura N1. Reacciones activas al tomar como función objetivo la síntesis de glucógeno con


Figura N2. Reacciones activas al tomar como función objetivo la producción de ATP con una


Vía

met

abó

lica

Vía

met

abó

lica

Apéndice O. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de


Figura O1. Reacciones activas al tomar como función objetivo la síntesis de glucógeno con

una cantidad de 57,1mg/kg/día (4000mg/día) de galactosa

Figura O2. Reacciones activas al tomar como función objetivo la producción de ATP con una

cantidad de 57,1mg/kg/día (4000mg/día) de galactosa

Vía

met

abó

lica

Vía

met

abó

lica

Apéndice P. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de

114,3mg/kg/día (0,011 fmol/célula/hora) de galactosa.

Figura P1. Reacciones activas al tomar como función objetivo la síntesis de glucógeno con


Figura P2. Reacciones activas al tomar como función objetivo la producción de ATP con una


Vía

met

abó

lica

Vía

met

abó

lica

Apéndice Q. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de

10g/kg/día (1fmol/célula/hora de galactosa).

Figura Q1. Reacciones activas al tomar como función objetivo la síntesis de glucógeno con

una cantidad de 10g/kg/día (701624mg/día) de galactosa.

Figura Q2. Reacciones activas al tomar como función objetivo la producción de ATP con una

cantidad de 10g/kg/día (701624mg/día) de galactosa.

Vía

met

abó

lica

Vía

met

abó

lica

Apéndice R. Reacciones activas por vía metabólica en respuesta a la entrada de

30g/kg/día (3fmol/célula/hora) de galactosa.

Figura R1. Reacciones activas al tomar como función objetivo la síntesis de glucógeno con

una cantidad de 30g/kg/día (2104872,39 mg/día) de galactosa.

Figura R2. Reacciones activas al tomar como función objetivo la producción de ATP con una

cantidad de 30g/kg/día (2104872,39 mg/día) de galactosa.

Vía

met

abó

lica

Vía

met

abó

lica

80

Apéndice S. Flujo de las reacciones de intercambio al simular condiciones anabólicas y catabólicas.

En iHepatocytes 2322_def.galt, cambian los flujos de CO2, O2, hipoxantina, inosina y piruvato, permanece constante el flujo del

glucógeno y aparecen reacciones de intercambio para maltododecaosa, glucitol, galactonato y galactitol.

Figura S1.Flujo de las reacciones de intercambio al tomar como objetivo la síntesis de glucógeno.

iHepatocytes 2322_sd.galt iHepatocytes 2322_def.galt

1,37* 1,37

-1,59 -10

-2,79

-10

10

2,03

5 *

9,02

1,15*

Convenciones

(-) sale del sistema (vacio) (+) entra a la región extracelular (*) sale del sistema al ser una reacción irreversible

CO2* Hipoxantina Glucogeno Ribitol Linolenato

O2 Inosina Adenidna Ribosa Piruvato

Acetaldehido Desoxiadenosina Maltododecaosa Glucosa

Galactitol Galactonato Glucitol

2,03*

-9,02

-10

-2,79

-1,37

-1,37

1,37

0,00001

0,304

-2,33

0,206

1,518

Flujo de galactosa: 6,25 fmol/célula/hora

En el modelo iHepatocytes 2322_def.galt se reduce el número de reacciones y aparecen flujos para H2O2 y lactato, aumenta el flujo

de galactitol, galactonato, linolenato y CO2 y disminuye el flujo de O2.

Con esta entrada de galactosa, se reduce el flujo de linolenato, CO2 y H2O y aumenta el flujo de O2, prolina, H+, NH3 HCO3, AKG en

el modelo original y curado. Por otro lado en el modelo curado se activan las reacciones de intercambio del galactitol y galactonato

Figura S2.Flujo de las reacciones de intercambio al tomar como objetivo la síntesis de glucógeno.

iHepatocytes 2322_sd.galt iHepatocytes 2322_def.galt

0,91* 2,55

-0,603

-0,301

-0,155

-0,301

0,603 -0,20

1,43 -0,2

-0,078

Convenciones

(-) sale del sistema (vacio) (+) entra a la región extracelular (*) sale del sistema al ser una reacción irreversible

CO2* Prolina H+ HCO3 Linolenato Galactonato

O2 H2O NH3 AKG Inositol

Galactitol Lactato H2O2

1,4*

0,067

0,011

0,5*

0,1

3,125*

0,5* 3,125*

0,2

-1,62

Flujo de galactosa: 6,25 fmol/célula/hora

desarrollo de un modelo computacional como …

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