departamento de bioquímica - digital csic

Departamento de Bioquímica

Facultad de Medicina

Universidad Autónoma de Madrid

Nuevos mecanismos de regulación de la angiogénesis

por brote capilar e intususcepción: papel de las

oscilaciones de calcio y de la proteasa MT1-MMP

Doctorando: Sergio Esteban Iglesias (Licenciado en Biología, UAM)

Directora de la Tesis: Alicia García Arroyo

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares- Carlos III (Madrid, ESP)

CERTIFICADO DEL DIRECTOR DE TESIS

La Dra. Alicia García Arroyo CERTIFICA que el doctorando Sergio Esteban Iglesias ha desarrollado y concluido su trabajo de Tesis Doctoral titulado “Nuevos mecanismos de regulación de la angiogénesis por brote capilar e intususcepción: papel de las oscilaciones de calcio y de la proteasa MT1-MMP” bajo su supervisión, en el Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), con la financiación de una beca predoctoral de Formación de Personal Investigador concedida por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades.

En Madrid, a 23 de Septiembre de 2018

Fdo: Alicia García Arroyo

Jefa de Grupo

Laboratorio de Metaloproteinasas de Matriz

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculare-Carlos III

CNIC

Agradecimientos

“El objeto de nuestra enseñanza es que el cerebro

del individuo llegue a ser el instrumento de su

voluntad”

F. Ferrer i Guardia

La parte que todo el mundo lee, así que vamos a ello.

Lo primero agradecer a Alicia las oportunidades y financiación para realizar esta tesis, su

capacidad de trabajo y su disposición durante todos estos años. A mis compañeros de

laboratorio, los que siguen y los que se han marchado. A Cris por su ayuda continua, de

sol a sol, de guardia desde las 7 de la mañana, y por alimentarnos con alimentos ricos en

azúcar (la próxima la tuya). A Vane, con quien fue una alegría trabajar, y que ahora tiene

que molar mucho como profe. A Angel que llego en medio de la tesis y se convirtió en

necesario, aunque “discutamos” a menudo (queda una carrera pendiente y un mus). A

Chuchi por esos ratos cantando en falsete, inventando historias en cultivos y creando

chistes tan gloriosos como el pollo empanado. A Richi y sus bitcoins y a Álvaro cultureta

y divulgador, de ambos he aprendido mucho. A Susana, Mara Magda, Raquel, Diego,

Angela, Aga, Eirini, Cristina SC. A Xenia siempre dispuesta a ayudarnos con nuestra

incompetencia informática, y de la que he aprendido que se puede hablar siempre en

positivo de la gente, junto Angelos forman la pareja de griegos con perfecto español a la

que siempre puedes acudir. Y por supuesto a Pilar, que me ha enseñado y ayudado estos

años taaaaaaaaanto, muchas gracias “jefa”. Acabo, pero no te libraras de mí, algo

encontrare para seguir pidiéndote ayuda.

A los vecinos con los que formamos casi un único labo, los Miguel Angeles (Tere, Dacil,

María G., María A., Garbajosa, Giulio, Quilez, Miguel, Fidel, Inma, Sara F, Sara, Asier,

Ines, Ibón) gracias a todos por las cervezas los cafés, los reactivos y la compañía. Algunos

que merecen mención especial, Rober nuestras vidas seguirán siendo paralelas, nos veo

en el asilo jugando a la petanca, y seguirá siendo un gustazo compartir el tiempo contigo.

A Alberto, sin duda he aprendido de tu compromiso y acción. Mauro nuestra estresada

Lady Gaga de pantalones caídos, y un gran apoyo. A Lucas, una de las grandes amistades

que saco de de la tesis.

A ese grupo de amigos, algunos ya nombrados, que empezamos tomando una birra los

viernes por hacer grupo y ambiente en el labo y hemos terminado siendo un grupo para

cualquier día, con cualquier excusa, y atuendo queda a apoyarse y volcarse unos

“fresquitos”. Ahora somos algo más que un grupo que se junta a tomar algo. Al nihilismo

hecho persona de Montero, Ines, Angel, Amaya, Manuel de todos he aprendido y seguiré

aprendiendo.

Al resto de vecinos, los Juanmis y los Puros especialmente a Silvia, MJ, Sara, Loli y Pablo

que me han ayudado con reactivos, su experiencia y buenos ratos. A Antonio y Yazine

estuvisteis poco tiempo pero suficiente para que la primera os eche de menos. Toda esta

gente y más que me falta ha creado un ambiente de trabajo en nuestra planta que dudo

que vuelva a encontrar en mi vida

A mucha más gente de CNIC que me ha ayudado y de la que me llevo muy buen recuerdo

Dani, Noa, Norman, Lao entre muchos otros.

Pero el CNIC no es solo científicos y yo he tenido la suerte de coincidir con muy buena

gente en mantenimiento, limpieza (de Charo a María pasando por Petri), seguridad

(Tomas, y al indio Victor), informática (Alicia y Eduardo). A cafetería, especialmente a

Angel, el camarero mas rápido y eficiente que puedes conocer. A Cristina G creo que sin

ti no habría hecho papeles suficientes para doctorarme. A Edu, siempre dispuesto a hacer

más de lo que su trabajo requiere, y que nos ha regalado una lección de “anatomía de un

hombre pez”.

A Holger y su laboratorio por acogerme allí y sobre todo a Rodri, Pablo, Santi y Eze por

hacerme pasar tres meses en casa.

A Javito, Oscar, Samu, Jaso, Luiska y Faiz con los que disfrute de un Master que nos

enseñó poco pero que disfrutamos mucho (Andaluza-Antorcha-Ocho y medio, Denia…).

Al Esrasmus, al Borgo, Lucho, Helena, Dani, Niels, Carlos y a Xavi que no vivía allí pero

casi, fue sin duda un gran año que ha marcado nuestras vidas y aunque nos veamos poco

actualmente contar con vosotros después del Erasmus es un lujo.

A un gran grupo de amigos que hice en la universidad con los que seguiré “soñando

siempre armados” Ras, Fer, Sara, Laura, Blanca, Carmen, Guille. A Horse generation

Narro y Alvi, el grupo sin disco ni concierto y casi ni canciones. Y claro, a Jesus y Luci,

todo lo que os diga quedaría escaso, espero disfrutar muchas veces más con vosotros en

Madrid, La Linea, Aleas o La Paz. Por cierto La Paz que gozada conocer este lugar y a la

gente de alli

A Pata, forjamos una amistad en un ambiente surrealista entre birras y horas de curro y

parece que dura unos años. A Laura y al resto de gente que pasó por aquel laboratorio que

tuvo más de campo de trabajo que de laboratorio científico, hasta puede que a Marta, pues

aunque no fuera su intención aprendí bastante de aquel año. A la gente en la que nos

apoyamos sobre todo a Dani.

A David, cuando te conocí nunca pensé que pasaras a ser una persona tan importante para

mí. Seguiremos compartiendo libros revistas y conversaciones de tercios, geopolítica, y

futbol.

A los Dons, Isra, Mario, Elvis, Orlando, Diego, rayo, Santi, Joaquin, Sparrow y Willis

con vosotros he aprendido a perder sobrados de dignidad. Go Dons!!

A Turbinio, un grupo de buenos amigos desde hace muchos años, lo mismo un mus que

un findesemana de futbol burbuja, Dani, litri, Adri, Charli, Diego, yisus, Patxi, Rebe,

Noemi, Jesús, Javi, Isma. A Paco una cabeza prodigiosa y una de las mejores personas

que conozco de la que tengo la suerte de ser amigo. A los dos sabios birreros Acho y

Jonhy cuantos jueves en el parque, Miguel, o Beerseker.

Al Nazari y Vicolo (no a los bares, a la gente de dentro) donde empecé a salir escuchando

Rock&roll “cuando éramos los mejores”, gracias a mi hemana y los que entonces eran

sus amigos, que ahora puedo decir que también lo son míos, Roger, Jonas y Adri, el mejor

Dj de Alcorcón y del que me ha dado muchas lecciones musicales y vitales. A Nando con

quien siempre puedes hablar de Rock&roll, y a Patricia un terremoto de ayuda.

También hay que dar las gracias al Rock&roll en sí, que más de una vez me ha mostrado

las respuestas.

Además hay que quejarse un poco, esta tesis se ha realizado a pesar de los palos en las

ruedas de algunos, que condenan a nuestro sector a la precariedad. Incluso llegaron a

cambiarnos las condiciones contractuales durante nuestros contratos. Pero como no hay

mal que por bien no venga conseguimos darle la vuelta mediante la colaboración.

Demostramos que la precariedad se puede confrontar con asociación y que podemos

llegar a ser trabajadores de pleno derecho el día que luchemos por ello apoyando y

apoyándonos en otros sectores.

A mis padres pues ha sido su esfuerzo el que me ha formado profesionalmente, pero sobre

todo como persona, y continúan haciendo continuamente esfuerzos por mí. Siguen

pendientes de todo desde si estoy malo a si tengo comida y se lo agradezco menos de lo

que debería. A Pilar, mi hermana la persona a la que acudo siempre, para lo bueno y para

lo malo. Aunque todo hay que decirlo la pido más veces ayuda que las alegrías que le

doy. A Quique que hay que meterlo en el apartado de familia, aunque también es colega,

espero vivir contigo muchas más noches como la décima y más psychos, muchas gracias

por tu ayuda.

A José María, porque hay personas que, aunque haga mucho tiempo que no los veas, sus

consejos e influencia te acompañan toda tu vida. Y a Aleas, a la gente y al lugar.

Rodri, la única persona que podría estar en casi todos los grupos anteriores, tío hemos

sido la sombra del otro durante años, nos hemos formado como personas juntos y eres

una parte importante de lo que he terminado siendo.

A lo mejor que me ha pasado en la tesis, Cris, mi Lady Madrid particular. Al inicio de la

tesis te conocí y al apretar el gatillo ya estaba enamorado de ti, ahora vivimos juntos y

compartimos una vida en la que nunca dejara de sonar música por encima de la música.

Solo por ti ha merecido la pena hacer esta tesis. Te quiero.

1

Resumen

La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos

preexistentes y tiene lugar fundamentalmente a través de los mecanismos de brote capilar

e intususcepción. En este trabajo nos hemos propuesto la identificación y caracterización

de nuevos actores moleculares implicados en dichos mecanismos. La angiogénesis por

brote capilar se caracteriza por la selección y especificación de dos fenotipos celulares en

respuesta a estímulos angiogénicos: células endoteliales líder (migratorias) y tallo

(proliferativas). Durante este estudio hemos identificado, mediante el análisis a nivel

poblacional y de célula única, dos tipos oscilaciones de Ca2+ asociadas a los fenotipos

líder y tallo durante la respuesta in vitro a VEGF. Además, los eventos de señalización

por oscilaciones de Ca2+ indican que dichas oscilaciones podrían inducir la fijación del

fenotipo líder y tallo mediante la activación de factores de la transcripción como NFAT.

Por otro lado, la angiogénesis por intususcepción es un mecanismo pobremente

caracterizado por el que un vaso sanguíneo se divide en dos vasos paralelos a través de la

formación y expansión de pilares intraluminales. En este trabajo hemos utilizado el

modelo de colitis experimental en ratón para caracterizar el papel en el endotelio de la

proteasa MT1-MMP como un nuevo actor durante la inducción de la angiogénesis por

intususcepción en contexto inflamatorio. Para ello, se usó una línea de ratones con la

deleción específica endotelial de MT1-MMP (MT1iΔEC). Además, combinando ensayos

in vivo e in vitro hemos diseccionado la vía molecular, demostrando que MT1-MMP

participa, a través de su actividad catalítica, en la vía de producción de óxido nítrico y

vasodilatación de los vasos sanguíneos, induciendo angiogénesis por intususcepción. Así,

MT1-MMP mediante corte proteolítico libera la proteína matricelular trombospondina 1,

que incrementa los niveles de producción de óxido nítrico en células endoteliales por la

unión de su fragmento carboxilo terminal al complejo formado por CD47/integrina αvβ3.

La administración in vivo del nonámero de aminoácidos basado en la secuencia de unión

de trombospondina 1 a la integrina αvβ3, redujo la angiogénesis por intususcepción

durante la colitis experimental. Así pues, a la vista de nuestros resultados proponemos

MT1-MMP y la vía TSP1/CD47/integrina αvβ3/eNOS/óxido nítrico como un nuevo eje

en angiogénesis por intususcepción y una nueva diana terapéutica en colitis.

2

Summary

Angiogenesis is the formation of new blood vessels from pre-existing ones and the main

forms of this physiological process are capillary sprouting and intussusception. In this

report we have undertaken to identify new molecular actors for these two mechanisms.

Sprouting angiogenesis is characterized by the selection and specification of tip

(migratory) and stalk (proliferative) endothelial cells. In this study, we have analyzed the

role of Ca2+ oscillations in tip/stalk specification during sprouting angiogenesis and we

have identified, through population and single cell analysis, two different Ca2+

oscillations associated to tip and stalk phenotypes during VEGF in vitro stimulation.

Moreover, Ca2+ oscillation-mediated signaling could induce tip/stalk phenotype fixation

through activation of transcription factors as NFAT.

On another front, intussusceptive angiogenesis is a poorly characterized mechanism

where pre-existing vessels split creating two daughter vessels by intraluminal pillar

formation and expansion. In this study, we have used mice with specific endothelial

deletion of the protease MT1-MMP (MT1iΔEC) in order to identify MT1-MMP as a new

key player in intussusceptive angiogenesis in murine experimental colitis. Furthermore,

combining in vivo and in vitro assays, we have demonstrated the mechanism through

which MT1-MMP increases nitric oxide production and blood vessel vasodilation,

resulting in the induction of intussusceptive angiogenesis. In this way, MT1-MMP

produces the proteolytic release of the matricellular protein thrombospondin 1 which in

turn increases nitric oxide production through its binding via the carboxy-terminal

fragment to CD47/αvβ3 integrin complex. Finally, in vivo administration of a nonameric

peptide based on the thrombospondin 1 binding sequence to the αvβ3 integrin reduced

intussusceptive angiogenesis during colitis in mice. Our results identify MT1-MMP and

the pathway TSP1/CD47/αvβ3 integrin/eNOS/nitric oxide as new players in

intussusceptive angiogenesis and as potential therapeutic targets in colitis.

3

Índice

Abreviaturas y acrónimos ............................................................................................................. 9

Introducción ................................................................................................................................ 11

1 El endotelio .......................................................................................................................... 13

2 Angiogénesis ........................................................................................................................ 14

2.1 Angiogénesis por brote capilar ..................................................................................... 14

2.2 Angiogénesis por intususcepción .................................................................................. 21

3 MT1-MMP en células endoteliales ....................................................................................... 28

3.1 Estructura de MT1-MMP ............................................................................................... 28

3.2 Regulación de MT1-MMP en células endoteliales ........................................................ 29

3.3 Función de MT1-MMP en células endoteliales ............................................................. 30

3.4 MT1-MMP en angiogénesis por brote capilar e intususcepción .................................. 31

Objetivos ..................................................................................................................................... 33

Materiales y métodos ................................................................................................................. 37

1 Cultivos celulares y técnicas in vitro ..................................................................................... 41

1.1 Cultivo de HUVECs ......................................................................................................... 41

1.2 Aislamiento y cultivo de MAEC ..................................................................................... 41

1.3 Estimulación de células endoteliales ............................................................................ 42

1.4 Silenciamiento de la expresión de proteínas mediante ARN de interferencia. ............ 42

1.5 Exposición de células endoteliales a flujo laminar ........................................................ 42

2 Modelos animales y experimentos in vivo ........................................................................... 43

2.1 Líneas experimentales de ratón .................................................................................... 43

2.2 Inducción química de colitis en ratones y medición del índice de colitis. .................... 44

2.3 Inyección de lentivirus in vivo ....................................................................................... 44

2.4 Ensayo de perfusión ...................................................................................................... 44

3 Técnicas de imagen .............................................................................................................. 45

3.1 Tinciones de inmunofluorescencia en células. .............................................................. 45

3.2 Determinación relativa de la concentración de óxido nítrico ....................................... 45

3.3 Determinación relativa de la concentración de Ca2+ y análisis de oscilaciones ............ 45

3.4 Tinción de tejido in toto ................................................................................................ 46

3.5 Tinciones de tejido parafinado ...................................................................................... 47

3.6 Microscopía intravital de músculo cremáster de ratón ................................................ 47

4 Procedimientos experimentales .......................................................................................... 47

4.1 Western Blotting ........................................................................................................... 47

4.2 Retro-PCR cuantitativa (qPCR) ...................................................................................... 48

4

4.3 Citometría de flujo preparativa ..................................................................................... 49

5 Análisis estadístico ............................................................................................................... 50

Resultados ................................................................................................................................... 51

1 Papel de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación de células endoteliales en células líder

y tallo durante la angiogénesis por brote capilar .................................................................... 53

1. 1 Análisis de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a estímulos angiogénicos ................ 53

1.2 Análisis de la heterogeneidad de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF .......... 57

1.3 Impacto de las oscilaciones de Ca2+ en la transcripción génica ..................................... 62

2 MT1-MMP, nuevo actor en angiogénesis por intususcepción en contexto inflamatorio:

papel del flujo y del óxido nítrico ............................................................................................ 65

2.1 Estudio de la angiogénesis por intususcepción en un modelo de colitis experimental

inducida por DSS .................................................................................................................. 65

2.2 Análisis del papel de MT1-MMP en angiogénesis por intususcepción ......................... 68

2.3 Papel de MT1-MMP endotelial durante la transducción de estímulos mecánicos ....... 81

2.4 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la vasodilatación ....................... 87

2.5 Función de los dominios catalítico y citoplasmático de MT1-MMP durante la

angiogénesis por intususcepción y la producción de óxido nítrico ..................................... 93

2.6 Caracterización de trombospondina 1 como sustrato de MT1-MMP ........................... 97

2.7 Función de MT1-MMP/TSP1 durante la producción de óxido nítrico in vitro ............ 101

2.8 Impacto funcional de la inhibición de la unión de TSP1 a la integrina αvβ3 sobre la

angiogénesis por intususcepción ...................................................................................... 105

2.9 Implicación de MT1-MMP durante la patogénesis de EII Humanas ........................... 106

Discusión ................................................................................................................................... 109

1 Papel de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación de células endoteliales en células líder

y tallo durante angiogénesis por brote capilar ..................................................................... 111

1.1 Inducción de oscilaciones de Ca2+ en células líder y tallo ........................................... 111

1.2 Papel de la vía Dll4/Notch durante las oscilaciones de Ca2+ inducidas por VEGF ....... 113

1.3 Cambios de la expresión de marcadores génicos de células líder y tallo en respuesta a

VEGF .................................................................................................................................. 113

2. MT1-MMP, nuevo actor en angiogénesis por intususcepción en contexto inflamatorio:

papel del flujo y el óxido nítrico ............................................................................................ 115

2.1 Sistema de visualización de angiogénesis por intususcepción en el plexo mucoso ... 115

2.2 Papel de MT1-MMP endotelial durante la patogénesis de colitis experimental ........ 116

2.3 Papel de MT1-MMP durante la respuesta endotelial a flujo sanguíneo ..................... 117

2.4 Función de MT1-MMP durante la vasodilatación y producción de óxido nítrico ....... 118

2.5 Señalización del fragmento carboxilo terminal de TSP1 a través de la integrina αvβ3

........................................................................................................................................... 118

2.6 La vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3/eNOS como diana terapéutica ..................... 120

5

Conclusiones ............................................................................................................................. 123

Bibliografía ................................................................................................................................ 127

6

Índice de figuras

Figura 1. Esquema del sistema de selección de células líder y tallo.....................................................17

Figura 2. Esquema de oscilaciones asincrónicas de la transcripción de Dll4 y HES1en células

endoteliales................................................................................................................................ ................ 18

Figura 3. Esquema de la ruta molecular de generación de oscilaciones de Ca2+............................. 19

Figura 4. Componentes codificantes de las oscilaciones de Ca2+.........................................................20

Figura 5. Observación de la formación de pilares intraluminales por molde de corrosión.......... 26

Figura 6. Estructura esquemática de MT1-MMP…………………………………................................ 28

Figura 7. La estimulación con VEGF y TNFα produce el aumento de la concentración de Ca2+

citoplasmático en células endoteliales…............................................................................................... 54

Figura 8. La estimulación con VEGF y TNFα modifica los patrones de las oscilaciones de Ca2+

en células endoteliales.............................................................................................................................. 55

Figura 9. La actividad del canal de Ca2+ ORAI1 es necesaria para la respuesta mayoritaria a

VEGF por oscilaciones de Ca2+ en HUVECs....................................................................................... 58

Figura 10. VEGF produce diferentes patrones de oscilaciones de Ca2+ dependientes de dosis......59

Figura 11. VEGF produce dinámicas de fosforilación de PLCγ1 dependientes de dosis................60

Figura 12. El patrón de oscilaciones de Ca2+ de las células endoteliales en respuesta a VEGF es

dependiente del corte intracelular de Notch...................................................................................... ... 61

Figura 13. Diferentes dosis de VEGF regulan la trasncripción génica de marcadores de célula

líder o tallo................................................................................................................................................. 63

Figura 14. Papel de NFAT en la regulación de la transcripción de genes marcadores de célula

líder y tallo .......................................................................................................... ...................................... 64

Figura 15. Visualización de la vasculatura intestinal........................................................................... 66

Figura 16. Sistema de cuantificación de angiogénesis por intususcepción en la vasculatura del

plexo mucoso intestinal............................................................................................................................ 67

Figura 17. La inducción de colitis con 1% DSS causa angiogénesis por intususcepción en el plexo

mucoso de ratones.................................................................................................................................... 68

Figura 18. MT1-MMP se expresa en las células endoteliales de arteriolas y capilares del colon

durante el desarrollo de colitis experimental....................................................................................... 69

Figura 19. MT1-MMP se expresa en células endoteliales cercanas a tricórneres y eventos de

angiogénesis por intususcepción.............................................................................................................70

Figura 20. Validación de la deleción endotelial de MT1-MM..............................................................71

Figura 21. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la angiogénesis por intususcepción

durante la colitis inducida por DSS........................................................................................................73

Figura 22. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la perfusión de la vasculatura

intestinal durante la colitis inducida por DSS...................................................................................... 75

Figura 23. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la presencia de células

inflamatorias..............................................................................................................................................76

Figura 24. La deleción endotelial de MT1-MMP mejora la progresión clínica en colitis inducida

por DSS...................................................................................................................................................... 78

Figura 25. La deleción endotelial de MT1-MMP durante el desarrollo de colitis mejora la

progresión de los animales enfermos......................................................................................................80

Figura 26. Eficiencia del silenciamiento de MT1-MMP por ARNi en HUVECs............................ 82

7

Figura 27. La ausencia de MT1-MMP en células endoteliales in vitro no altera su polarización en

respuesta a flujo laminar............................................................................................................. ............ 83

Figura 28. Efecto del flujo turbulento y laminar sobre la expresión de MT1-MMP in vivo......... 84

Figura 29. Eficiencia de la deleción de MT1-MMP en el endotelio aórtico...................................... 85

Figura 30. La deleción de MT1-MMP endotelial afecta a la elongación de las células endoteliales

aórticas sometidas a flujo laminar......................................................................................................... 86

Figura 31. La deleción de MT1-MMP endotelial no afecta a la polarización de células endoteliales

aórticas sometidas a flujo laminar......................................................................................................... 87

Figura 32. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la vasodilatación de arteriolas in

vivo.............................................................................................................................................................. 88

Figura 33. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la vasodilatación de capilares

dependiente de óxido nítrico in vivo....................................................................................................... 90

Figura 34. La deleción de MT1-MMP en células endoteliales disminuye laroducción de óxido

nítrico y la expresión de eNOS................................................................................................................ 92

Figura 35. Estrategia de transducción lentiviral in vivo...................................................................... 94

Figura 36. La función catalítica de la proteína MT1-MMP es esencial para la producción de

angiogénesis por intususcepción............................................................................................................ 95

Figura 37. La función catalítica de MT1-MMP es requerida para la producción de óxido nítrico

en células endoteliales in vitro................................................................................................................. 96

Figura 38. Caracterización in silico del corte de TSP1 por MT1-MMP......................................... 99

Figura 39. La deleción endotelial de MT1-MMP induce la acumulación perivascular de TSP1

durante la colitis..................................................................................................................................... 100

Figura 40. El silenciamiento de la expresión de MT1-MMP produce una acumulación de TSP1

en HUVECs in vitro............................................................................................................................... 101

Figura 41. TSP1 incrementa la producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro…... 102

Figura 42. El bloqueo del receptor de membrana CD47/IAP y de la integrina αvβ3 disminuye la

producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro.............................................................. 103

Figura 43. El nonámero basado en la secuencia de unión de TSP1 a la integrina αvβ3 disminuye

la producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro......................................................... 104

Figura 44. El bloqueo de la unión de TSP1 a la integrina αvβ3 disminuye la angiogénesis por

intususcepción in vivo............................................................................................................................ 106

Figura 45. Caracterización de la expresión de MT1-MMP durante EII humana......................... 107

Figura 46. Esquema representativo de la participación de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación

de células líder y tallo durante angiogénesis por brote capilar............................................................. 115

Figura 47. Esquema de la vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3-CD47/eNOS/óxido nítrico en

inducción de angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de colitis................................. 121

9

Abreviaturas y acrónimos

AI Angiogénesis por intususcepción

ACh Acetilcolina

ADAMTS1 Desintegrina y metaloproteinasa con dominios trombospondina 1

APL1 Apelina

APS Amonio persulfato

BCA Ácido bicinconínico

BSA Albumina de suero bobino

CCL-2 Proteína quimiotáctica de monocitos 1

CSF-2 Factor estimulante de colonias

CXCL12 Motivo C-X-C quimioquina 12

DAG Diacilglicerol

DEANO Sodium 2-(N, N-diethylamino)-diazenolate-2-oxide

DSS Sulfato sódico de dextrano

Dll4 Ligando delta 4

EEM Error estándar de la media

EII Enfermedad inflamatoria intestinal

EphB4 efrinas B4

eNOS Sintasa de óxido nítrico endotelial

EGR1 Respuesta de crecimiento temprana 1

ESM1 Molécula específica endotelial 1

FBS Suero bobino fetal

FGF Factor de crecimiento de fibroblastos

FIH Factor inhibidor de HIF

GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

GFP Proteína verde fluorescente

GSA Generación de segunda armónica

HBSS Solución salina balanceada de Hanks

HCAEC Células endoteliales de arteria coronaria humana

HIF1α Factor inducible de hipoxia

HPRT Hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa

HUVEC Células endoteliales vasculares umbilicales humanas

IAP Proteína asociada a integrina

IB4 Isolectina B4

ICAM2 Molécula de adhesión intercelular 2

IFM Intensidad de fluorescencia media

iNOS Sintasa de óxido nítrico inducible

IP3 Inositol trifosfato

IP3R Inositol trifosfato receptor

MAEC Células endoteliales aórticas de ratón

MT1-MMP Metalloproteinasa de matriz tipo membrana 1

NFAT Factor nuclear de activación de células T

NFκB Factor nuclear κB

NICD Dominio intracelular de Notch

10

nNOS Sintasa de óxido nítrico neuronal

NR No respondientes

OP Oscilación principal

OR Oscilaciones repetidas

PAK1 Quinasa activada por P21

PIP2 Fosfatidil inositol bifosfato

PMCA Bomba de calcio de membrana plasmática

PCDH10 Protocadherina 10

PDGF-BB factor de crecimiento derivado de plaquetas BB

PFA Paraformaldehído

PlGF Factor de crecimiento de la placenta

PLCβ3 Fosfolipasa β3

PLCγ1 Fosfolipasa γ1

RCAN1.4 Regulator of Calcineurin 1 Isoform 4

S1P Esfingosina-1-fosfato

SERCA ATPasa de Ca2+ del retículo sarco/endoplásmico

SFRP Proteínas secretadas relacionadas a frizzled

SOCE Entrada de calcio dependiente de almacenamiento

TBS Buffer Tris-salino

TIMPS Inhibidores tisulares endógenos de metaloproteinasas

TNBS Ácido trinitrobenzenosulfónico

TNFα Factor de necrosis tumoral α

TRPC Canales Receptores de Potencial Transitorio

TSP1 Trombospondina 1

VCAM1 Molécula de adhesión de células vasculares

VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular

VEGFR-1 Receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 1



11

Introducción

13

1 El endotelio

Los vasos sanguíneos están revestidos por una monocapa de células endoteliales

quiescentes denominada endotelio. Las células endoteliales son células polarizadas, en

contacto directo por su zona apical con la sangre y con la lámina basal por su región basal.

La lamina basal es una fina y densa capa de matriz extracelular formada por colágeno

tipo IV, lamininas y otros componentes que ejerce de barrera física tanto para el endotelio

como para las células que cruzan la barrera endotelial 1–3.

La principal función del endotelio es ejercer de barrera selectiva al paso

incontrolado de elementos de la sangre hacia el tejido intersticial, dirigiendo el

intercambio de agua y solutos entre el espacio vascular y perivascular. Además de sus

funciones como barrera semipermeable el endotelio es una estructura activa. Se le

considera como el mayor órgano endocrino del cuerpo, el cual participa del

mantenimiento de la hemostasia, de la respuesta inflamatoria a través de la secreción de

citoquinas y quimioquinas o controlando la extravasación a los tejidos de células del

sistema inmune. También regula la agregación plaquetaria y el tono vascular controlando

el flujo sanguíneo 3.

La monocapa de células endoteliales mantiene una estructura cohesionada en

forma de empedrado, que ha propiciado la denominación de las células endoteliales

quiescentes como células falange por su parecido a la formación de batalla griega 4. Esta

estructura es mantenida gracias a las uniones entre células endoteliales a través de

complejos proteicos, que interaccionan entre células adyacentes y con el citoesqueleto

celular otorgando estabilidad a la monocapa endotelial. Los principales complejos

proteicos que integran la unión endotelial son las uniones estrechas, formadas por

ocludinas y claudinas, y las uniones adherentes, formadas por VE-cadherina y

Pecam/CD31 entre otras proteínas de adhesión 5,6.

Sin embargo, el endotelio está lejos de ser una monocapa de células endoteliales

idénticas. Es altamente heterogéneo, y las células endoteliales presentan características

diferentes en cuanto a su expresión génica, morfología y funciones dependiendo tanto del

de tipo de vaso al que pertenezcan como del órgano o tejido en el que se encuentren 2,7,8.

14

2 Angiogénesis

La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos

preexistentes, que da lugar a un plexo vascular maduro por procesos de expansión y

remodelado vascular 9,10. El plexo vascular primario se forma por vasculogénesis, proceso

en el que células precursoras del endotelio, denominadas angioblastos, se dividen y

diferencian generando de novo un plexo vascular primitivo. Un mecanismo similar a la

vasculogénesis puede formar nuevos vasos sanguíneos tras el nacimiento, reclutando

células progenitoras del endotelio durante procesos patológicos como el cáncer o la

diabetes 11,12.

La angiogénesis es generalmente iniciada y guiada por hipoxia para suplir la

necesidad de nutrientes y oxígeno en contextos fisiológicos como el crecimiento de

tejidos, el desarrollo embrionario o durante el aumento de la demanda metabólica por

ejercicio físico, y en contextos patológicos como el cáncer, procesos inflamatorios o de

cierre de herida 13.

La angiogénesis tiene lugar a través de diferentes mecanismos, en este proyecto

nos centraremos en la angiogénesis por brote capilar y la angiogénesis por intususcepción.

Además, se han identificado mecanismos angiogénicos propios de tumores en los que,

bien las células tumorales forman vasos sanguíneos tomando la posición de células

endoteliales (mimetización vascular), o bien las células madre cancerígenas se

diferencian en nuevas células endoteliales 14. Por otro lado la formación de vasos

linfáticos tiene lugar por un proceso de características similares a la angiogénesis

denominado linfoangiogénesis 15.

2.1 Angiogénesis por brote capilar

La angiogénesis por brote capilar es el proceso caracterizado por la activación de

células endoteliales y su migración colectiva, ordenada y jerarquizada desde un vaso

preexistente para formar nuevos vasos sanguíneos.

Este proceso se desarrolla a través de las siguientes etapas: a) activación del

endotelio quiescente por un estímulo angiogénico, b) aumento de la permeabilidad

endotelial, c) degradación de la membrana basal, d) migración endotelial, e)

reorganización de las uniones entre células endoteliales, f) reclutamiento de pericitos, g)

15

formación del lumen, h) síntesis de la nueva membrana basal, e i) maduración y

remodelado del nuevo plexo vascular 16,17.

2.1.1 Activación del endotelio quiescente

La activación del endotelio quiescente se produce como respuesta a un estímulo

angiogénico, el más estudiado es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que

induce migración, proliferación y supervivencia en células endoteliales. La familia de

VEGF incluye 5 miembros expresados en mamíferos: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C,

VEGF-D y el factor de crecimiento de la placenta (PlGF), que se unen a los receptores de

tipo tirosina quinasa VEGFR 1, 2 y 3 induciendo su dimerización y autofosforilación 18.

Se ha descrito el papel de VEGFR3 (Flt4) durante la linfoangiogénesis activado por la

unión a VEGF-C o D y en la angiogénesis durante el desarrollo embrionario 19,20. Sin

embargo, se ha demostrado que la actividad de VEGFR3 no es necesaria durante la

angiogénesis postnatal en retinas de ratón, siendo la fosforilación de VEGFR2

(Flk1/KDR) la principal responsable de la inducción de la angiogénesis en contextos

postnatales 18,21,22. Por su parte, la expresión de VEGFR1 (Flt1), pero no su actividad

quinasa, es necesaria para el desarrollo vascular normal durante la embriogénesis de

ratones. Los ratones deficientes para la expresión de VEGFR1 mueren durante el

desarrollo embrionario y presentan una vasculatura excesiva y desordenada. Estos y otros

estudios sugieren la competición con VEGFR2 por la unión a VEGF como la principal

función de VEGFR1 en angiogénesis 23,24.

La fosforilación de VEGFR2 tras su unión a VEGF inicia varias cascadas de

señalización celular, induciendo dos fenotipos diferentes y coordinados en las células

endoteliales, en lo que ha sido definido como un “equipo de trabajo” para la angiogénesis

25. Estos dos fenotipos, denominados células líder y tallo, fueron descritos por primera

vez durante la angiogénesis postnatal de la retina 26.

Las células líder son células endoteliales sobre las que VEGF induce polarización

y migración. Se caracterizan por la presencia de numerosos filopodios y guían el

crecimiento del nuevo vaso, integrando la información de gradientes de señales atrayentes

y repelentes del medio 26,27. Las células líder son además las encargadas de la invasión

del tejido perivascular a través de la degradación de las proteínas de matriz extracelular

de la lámina basal. La célula líder presenta contactos especializados mediante los cuales

16

se une a la matriz a través de proteínas de adhesión o proteolíticas como MT1-MMP para

la degradación de la lámina basal 1.

Tras las células líder, las células tallo proliferan en respuesta a VEGF aumentando

el tamaño del nuevo vaso. Además, mantienen la integridad del brote capilar, forman el

lumen vascular y reclutan pericitos estabilizando el vaso 17,26.

Si bien VEGF es el principal factor angiogénico, se han descrito otros estímulos

capaces de inducir la activación del endotelio quiescente en células líder y tallo en

contextos fisiológicos y patológicos, tales como el factor de crecimiento de fibroblastos

(FGF), el factor de necrosis tumoral α (TNFα), la proteína quimiotáctica de monocitos 1

(CCL2/MCP1), óxido nítrico o la esfingosina-1-fosfato (S1P) 16,28–33.

2.1.2 Sistema de selección y diferenciación de las células endoteliales líder y tallo

La correcta y equilibrada selección de células líder y tallo está guiada por la vía

de VEGF y sus receptores y por el sistema de inhibición lateral Dll4/Notch 34. La ruta de

Dll4/Notch es un sistema de inhibición lateral altamente conservado en la evolución, que

controla numerosos procesos de diferenciación durante el desarrollo. En vertebrados se

expresan cuatro receptores Notch (Notch 1-4) y cinco ligandos transmembrana (Jagged1,

Jagged2, Delta-like 1 [Dll1], 3 [Dll3], y 4 [Dll4]). La señalización comienza con la

interacción de Notch con uno de sus ligandos en una célula adyacente. Esto induce el

corte proteolítico de la región citosólica de Notch (NICD) por parte de la γ-secretasa.

NICD es traslocado al núcleo, donde forma complejo con CSL/RBPJ regulando la

transcripción génica 35. Las células endoteliales expresan los receptores Notch 1 y 4 y

todos los ligandos a excepción de Dll3 36. Ratones deficientes para la expresión de Notch

1, Notch 4, CSL o Jagged1 mueren durante el desarrollo embrionario (E9.5-E10.5) y

desarrollan problemas vasculares debido a la incapacidad de maduración del plexo

vascular primitivo 37–39. Por su parte, los ratones deficientes para la expresión de Dll4

mueren durante los primeros días de desarrollo embrionario, mientras que ratones

haploinsuficientes presentan malformaciones vasculares y un elevado número de células

líder en plexos vasculares como el del saco vitelino y la retina 40,41.

Se ha estudiado la localización de la expresión y función de los receptores Notch

y sus ligandos durante la selección de la célula líder. Dll4 es expresado mayoritariamente

por la célula líder, activando la vía de Notch en las células vecinas. El corte de NICD

desencadena la transcripción de genes implicados en la diferenciación de las células

17

endoteliales al fenotipo tallo, como VEGFR1 o HES1, y la inhibición de aquellos otros

que favorecen el fenotipo líder como VEGFR2 y el propio Dll4. Además de los estudios

genéticos ya mencionados, la inhibición de la vía Dll4/Notch por el bloqueo de Dll4

mediante anticuerpos o por inhibición química del corte de NICD, produce un aumento

del número de células líder y de la angiogénesis 41–46. La activación de la vía de

VEGF/VEGFR2 en las células líder expuestas a elevadas concentraciones de VEGF

aumenta la expresión del ligando Dll4, provocando una retroalimentación positiva entre

ambas vías de señalización. Estas vías regulan así el número de células líder, produciendo

un patrón de distribución de ambos fenotipos denominado “sal y pimienta”. Las células

que presentan mayor expresión de VEGFR2 y Dll4 y menor de VEGFR1 están “mejor

equipadas” para ser células líder e inducirán el fenotipo tallo en sus células vecinas

34,44,47,48 (Figura 1).

Figura 1. Esquema del sistema de selección de células líder y tallo. A. Esquema de la selección de

células líder y tallo y formación de un brote capilar. B. Esquema del modelo de distribución de

fenotipos líder y tallo “sal y pimienta”. Adaptado de Eilken HM and Adams RH; 2010.

Si bien la selección de la célula líder se ha descrito a menudo como un proceso

unidireccional, es en realidad un proceso dinámico. Las células del brote capilar ya

formado compiten continuamente por la posición de célula líder. Una célula tallo toma la

posición de líder cuando está “mejor equipada” para guiar el brote capilar. Incluso, se ha

descrito la yuxtaposición de dos células líder al mismo tiempo en un brote capilar en

retinas y durante experimentos de angiogénesis in vitro e in vivo en el modelo de pez

cebra 49–51.

18

Este sistema de selección puede incrementar los niveles de expresión de unos

genes frente a otros en células líder o tallo. Con el objetivo de identificar estos posibles

marcadores génicos de ambos fenotipos se han realizado estudios usando el modelo de

retina postnatal de ratón. Por un lado, Del Toro y colaboradores compararon el perfil

transcriptómico de retinas haploinsuficientes para la expresión de Dll4, con mayor

número de células líder, frente a retinas de genotipo salvaje. Por otro lado, Strasser y

colaboradores analizaron el perfil transcriptómico del frente de avance aislado por

microdisección frente al resto de la retina. Ambos estudios coincidieron en la

identificación de un número de marcadores de célula líder como la molécula específica

endotelial (ESM1) o apelina (APL1). Sin embargo, no fueron identificados marcadores

de célula líder anteriormente aceptados en la bibliografía como CD34 52–54.

La regulación temporal de la transcripción de los marcadores génicos de células

líder y tallo es actualmente motivo de debate. Recientes estudios in silico basados en datos

previos in vivo e in vitro han propuesto oscilaciones génicas de Dll4 y HES1 en el

endotelio quiescente. HES1 reprime la expresión de Dll4 y su propia expresión,

produciendo oscilaciones asincrónicas. Así, al ser activado el endotelio quiescente por

VEGF, cada célula puede encontrarse en un momento de su oscilación que la hace

competente para dar lugar a una célula de fenotipo líder, tallo o no responder 55,56 (Figura

2).

Las oscilaciones asincrónicas de Dll4 durante el brote capilar han sido

posteriormente confirmadas mediante ensayos angiogénicos in vitro en cuerpos

embrionarios. Estas oscilaciones se vuelven sincrónicas a altos niveles de VEGF,

provocando un excesivo número de células líder y angiogénesis patológica 57,58. Sin

Figura 2. Esquema de oscilaciones

asincrónicas de la transcripción de

Dll4 y HES1en células endoteliales.

Adaptado de Beets K et al; 2013.

19

embargo, se desconocen por el momento las señales por las que VEGF puede inducir

cambios en las oscilaciones génicas.

2.1.3 Señalización temprana durante la angiogénesis por brote capilar

La mayoría de los estímulos angiogénicos, tanto químicos como VEGF, S1P,

TNFα o físicos como los cambios de flujo sanguíneo, producen oscilaciones de Ca2+ en

las células endoteliales, regulando numerosos aspectos de la fisiología celular como

transcripción génica, migración, proliferación y apoptosis 59–61. La vía VEGF/VEGFR2

produce la activación de las fosfolipasas C (PLC), que catalizan la conversión de fosfatidil

inositol bifosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3) (Figura 3). En

células endoteliales se expresan mayoritariamente las isoformas PLCγ1 y PLCβ3. PLCγ1

ha sido señalada como la principal responsable de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a

estímulos angiogénicos induciendo migración y proliferación 62. En cuanto a PLCβ3,

estudios in vitro han asociado su fosforilación en células endoteliales de vena umbilical

humana (HUVECs) con la activación de la migración y la inhibición de la proliferación,

como necesaria para el desarrollo normal de la angiogénesis en ratones 63,64. El IP3

producido por las PLCs es el principal agonista de los canales de Ca2+ del retículo

endoplasmático por los que se produce la salida de Ca2+ al citoplasma. La ausencia de

Ca2+ en el retículo cambia la conformación del sensor STIM1, que activa canales de Ca2+

de la membrana extracelular como ORAI1, proceso conocido como SOCE (del inglés

Store-operated calcium entry). El Ca2+ vuelve al retículo endoplasmático y al espacio

extracelular a través de las bombas de Ca2+ del retículo sarcoplásmico (SERCA) y de la

membrana plasmática (PMCA) respectivamente (Figura 3) 65–67.

Figura 3. Esquema de la ruta molecular de generación de oscilaciones de Ca2+. Adaptado de Osama

F et al; 2014.

20

Esta vía genera oscilaciones de Ca2+ con una frecuencia, amplitud y localización

espaciotemporal determinada que pueden ser decodificadas por la célula endotelial

activando diferentes rutas de señalización (Figura 4) 68.

Estudios en los que se utilizan células endoteliales in vitro han identificado la

activación de factores de transcripción por oscilaciones de Ca2+ de una frecuencia y

amplitud de determinadas. Así, se ha observado la translocación al núcleo del factor

nuclear de activación de células T (NFAT) en células endoteliales in vitro estimuladas

con VEGF. Esta activación de NFAT ha sido asociada en células endoteliales y otros tipos

celulares a altas frecuencias de oscilaciones de Ca2+ o una sola oscilación de gran

amplitud y periodo 69,70. Por otra parte, experimentos con células endoteliales humanas

de aorta y cerebro han demostrado la activación de NF-kB por oscilaciones de Ca2+ en un

amplio rango de frecuencias (0-11.7mHz) 71,72.

Durante el desarrollo de este trabajo de tesis doctoral se publicaron dos estudios

que también abordaban el efecto de las oscilaciones de Ca2+ en la selección de células

líder y tallo durante la angiogénesis. Yokota y colaboradores observaron, durante el

desarrollo vascular de pez cebra, oscilaciones de Ca2+ en la célula líder con mayor

frecuencia que en el resto de las células, incluso previamente a ser seleccionada como

líder. Además, se ha descrito un comportamiento similar durante la selección de células

tallo, que presentaron mayor frecuencia de oscilaciones que las células falange. Estas

oscilaciones de Ca2+ eran además sensibles a modificaciones de la vía Dll4/Notch 73. Por

su parte, Noren y colaboradores estudiaron las oscilaciones de Ca2+ en células endoteliales

in vitro durante la estimulación con VEGF. Describieron también dos fenotipos de

oscilaciones diferentes dependientes de la dosis de VEGF, los cuales correlacionan con

comportamientos celulares migratorios asociados a células líder, o de activación de la ruta

de NFAT y proliferación asociados a células tallo 70.

Figura 4. Componentes codificantes de las

oscilaciones de Ca2+. Amplitud y periodo.

21

Estos datos en conjunto indican una función de las oscilaciones de Ca2+ durante

la angiogénesis por brote capilar, así como la posibilidad de ser un punto de inflexión en

la señalización para la toma de decisión celular entre los fenotipos líder y tallo.

2.2 Angiogénesis por intususcepción

La angiogénesis por intususcepción es la formación de nuevos vasos sanguíneos

por duplicación de los vasos preexistentes en respuesta al incremento sostenido de flujo

sanguíneo o estímulos angiogénicos 74,75. Fue descrita a finales de la década de los 80 del

pasado siglo XX, durante el desarrollo de la vasculatura pulmonar tras el nacimiento en

ratas y humanos, donde el área capilar es 30 veces mayor en el adulto 76–78. Desde

entonces se ha descrito en numerosos contextos fisiológicos, como el aumento de la

vasculatura muscular tras ejercicio o la angiogénesis endometrial, y patológicos como la

angiogénesis de la vasculatura intestinal durante enfermedades inflamatorias intestinales

o la angiogénesis tumoral 77,79–83.

Es un proceso más rápido y eficiente metabólicamente que la angiogénesis por

brote capilar, debido a la escasa proliferación requerida. El aumento de volumen vascular

se origina por cambios morfológicos en las células endoteliales. Además, durante el

proceso de división vascular no es necesaria la disrupción de la lámina basal, evitando el

aumento de la permeabilidad en los vasos sanguíneos que puede comprometer la función

del órgano 78,84.

2.2.1 Morfogénesis de la angiogénesis por intususcepción

La división del plexo vascular tiene lugar a través de la formación y expansión de

pilares intraluminales. El aumento del flujo sanguíneo en el lecho capilar produce la

vasodilatación de los vasos sanguíneos. Las células endoteliales del vaso reorganizan su

citoesqueleto y migran en dirección al lumen vascular hasta unirse con el lado opuesto y

reorganizan sus uniones. Las células forman un puente celular en el centro del vaso, rico

en filamentos de actina paralelos. Posteriormente, se forma un poro en el centro del

capilar de 1 a 5 µm que es invadido por pericitos y miofibroblastos. Estas células

depositan fibras de colágeno estabilizando la formación del pilar. Finalmente los pilares

crecen en diámetro y se unen con otros pilares formando una duplicación de dos vasos

paralelos 78,85.

22

La formación de estos pilares intraluminales está implicada además de en los

procesos de crecimiento de la superficie vascular en el remodelado del plexo vascular por

arborización y regresión optimizando el flujo sanguíneo 86–89.

El proceso de angiogénesis por duplicación de los vasos sanguíneos está

pobremente caracterizado, tanto a nivel morfológico como mecanístico, debido

principalmente a la dificultad de los modelos experimentales in vivo y a la escasez de

modelos in vitro. Hasta la fecha, la técnica más utilizada para la visualización de los

pilares intraluminales ha sido la microscopía electrónica combinada con la técnica de

“molde de corrosión”. Esta técnica consiste en la perfusión el sistema circulatorio del

animal con un polímero que solidifica generando un molde del sistema circulatorio. La

sustancia orgánica es digerida para el análisis del molde por microscopía electrónica de

barrido (Figura 5) 90.

2.2.2 Mecanismos de inducción de la angiogénesis por intususcepción

2.2.2.1 Flujo sanguíneo y estrés de cizalla

Las células endoteliales están sometidas de forma continua al flujo sanguíneo, el

cual debido a la geometría de los vasos sanguíneos y la viscosidad de la sangre puede ser

laminar o turbulento. Este flujo sanguíneo genera fuerzas mecánicas que actúan sobre el

endotelio como el estrés de cizalla (del inglés shear stress), que es la fuerza tangencial

ejercida por el flujo sanguíneo sobre las células endoteliales. Esta fuerza es elevada en

casos de alto flujo laminar y desciende en vasos con menor flujo o con flujo turbulento

91. Las células endoteliales responden a estos estímulos mecánicos a través de sistemas

de mecanorrecepción como el complejo CD31/VE-Cadherina/VEGFR2, que transduce el

estímulo físico en una cascada de señalización que desencadena la respuesta celular al

flujo. Así, las células activan la producción de óxido nítrico y se alinean polarizadas en

respuesta a flujo laminar, mientras que responden con procesos de disfunción endotelial

y apoptosis al flujo turbulento 91,92.

El incremento sostenido de flujo sanguíneo de entre el 50 al 60% en la membrana

corioalantoidea de pollo, aumenta el estrés de cizalla y estimula la creación de pilares

intraluminales, dando lugar a la angiogénesis por intususcepción 88. Por otro lado, se ha

observado el aumento del volumen vascular en el músculo esquelético de ratones y ratas

tras la administración de prazosina. La prazosina, un bloqueante de los receptores α1

adrenérgicos, produce un aumento del flujo en el lecho capilar por vasodilatación arterial

23

93. Sin embargo, se ha observado y analizado por modelado matemático en la vasculatura

intestinal que la formación de pilares intraluminales tiene lugar en regiones de los vasos

donde desciende la velocidad de flujo o hay flujo turbulento como las bifurcaciones 94 95.

Estos datos en conjunto indican que, si bien la angiogénesis por intususcepción es

inducida por el aumento de flujo, la formación de los pilares intraluminales tiene lugar en

las regiones del plexo vascular sometidas a un menor estrés de cizalla.

Egginton y colaboradores han usado el modelo de aumento del flujo sanguíneo en

músculo por medio de prazosina para identificar nuevos agentes moleculares en

angiogénesis por intususcepción. Para ello, han comparado mediante un microarray el

transcriptoma de músculos procedentes de animales tratados con prazosina frente a los

procedentes de animales a los que se les había extirpado un músculo sinérgico al

analizado, estimulando así la angiogénesis por brote capilar. Identificaron el aumento de

la sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) y neuropilina, así como la disminución de

restina y midkine específicamente durante angiogénesis por intususcepción, y el

incremento de VEGF y VEGFR-2 y CD31 en ambos tipos de angiogénesis 96.

2.2.2.2 Óxido nítrico

El óxido nítrico es una molécula de señalización gaseosa con una vida media de

segundos, que promueve la supervivencia endotelial y la vasodilatación vascular por

relajación de las células de músculo liso. Se puede producir por la acción de tres proteínas,

la sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) en células endoteliales, la neuronal (nNOS)

en neuronas y la inducible (iNOS) en células del sistema inmune. Las 3 sintasas producen

óxido nítrico a través de la reacción enzimática de conversión de L-Arginina en L-

Citrulina. Tanto nNOS como eNOS se expresan constitutivamente a niveles variables

produciendo concentraciones fisiológicas nanomolares de óxido nítrico, mientras que

iNOS aumenta su expresión en respuesta a estímulos inflamatorios produciendo

concentraciones micromolares del gas 97.

En células endoteliales la expresión de eNOS y su actividad están regulados por

el flujo sanguíneo. Así, el aumento del flujo sanguíneo y del estrés de cizalla incrementa

la producción de óxido nítrico a dos niveles. Por una parte, aumenta la actividad de eNOS

por fosforilación y la concentración de Ca2+ citoplasmático, incrementando la producción

de óxido nítrico a corto plazo. Por otra, a largo plazo aumenta la expresión de eNOS y la

24

estabilidad de su mensajero, como se ha observado durante la angiogénesis por

intususcepción en la musculatura de ratones tratados con prazosina 75,98.

Se ha confirmado el papel funcional de la producción de óxido nítrico durante la

angiogénesis por intususcepción inducida por líneas tumorales en la membrana

corioalantoidea de pollo y en la musculatura de ratones tratados con prazosina. En este

último modelo se ha demostrado, por inhibición química y modelos de depleción génica,

la necesidad de la producción de óxido nítrico por eNOS, pero no nNOS, para el

incremento de la vasculatura por duplicación 99,100. Además, en este contexto se ha

observado que el aumento de la producción de óxido nítrico durante la angiogénesis por

intususcepción induce la expresión de VEGF y VEGFR2 75,98.

2.2.2.3 VEGF

VEGF es el regulador de la angiogénesis más estudiado durante la angiogénesis

por brote capilar, y en los últimos años se han realizado estudios para analizar su papel

durante la angiogénesis por intususcepción. En primer lugar, se ha observado la

correlación entre la expresión de VEGF y las etapas de desarrollo de la membrana

corioalantoidea de pollo en que aparece la angiogénesis por intususcepción 101.

Posteriormente, se ha demostrado que la administración externa de VEGF induce

angiogénesis por intususcepción dependiente de dosis en el músculo esquelético de

ratones tratados con prazosina. Si bien, altas dosis de VEGF inducen una angiogénesis

por intususcepción aberrante, produciendo vasos sanguíneos no funcionales tanto en

músculo de ratón como en contextos tumorales. Por el contrario, el bloqueo de VEGF

inhibe la angiogénesis por intususcepción en los músculos de ratón tratados con prazosina

83,102,103.

2.2.2.4 Otros actores moleculares

La vía Dll4/Notch es un conocido regulador de la angiogénesis por brote capilar

que también ha sido implicado en angiogénesis por intususcepción. La deleción de

Notch1 en células de la médula ósea y la inhibición química del corte de NICD producen

un aumento del volumen vascular y del número de pilares intraluminales en el plexo

hepático. Además, el silenciamiento de la expresión de endoglina aumenta la

angiogénesis por intususcepción inhibiendo la vía de Notch. Sin embargo se desconoce

aún si la inhibición lateral en células endoteliales a través de esta vía tiene un papel en la

selección de las células que forman los pilares intraluminales 104–106.

25

Por otra parte, se ha observado que el factor de crecimiento derivado de plaquetas

BB (PDGF-BB) y el receptor de efrinas B4 (EphB4) regulan la angiogénesis por

intususcepción en el músculo de ratón en respuesta a VEGF, modulando la señalización

de la vía VEGF/VEGFR2. PDGF-BB regula la activación de VEGFR2 inhibiendo la

angiogénesis aberrante inducida por altas dosis de VEGF. Por ello, se ha propuesto su uso

terapéutico junto a VEGF como tratamiento proangiogénico 107,108. Por su parte, la

activación del receptor tirosina quinasa EphB4 no regula la actividad del receptor de

VEGF si no su señalización a través de ERK1/2 109. Finalmente, se han propuesto como

nuevos candidatos para la regulación de la angiogénesis por intususcepción factores que

regulan interacciones de células endoteliales con los pericitos, o las uniones entre las

propias células endoteliales como VE-cadherina 110.

En resumen, si bien se ha demostrado que un aumento de la velocidad del flujo

sanguíneo produce angiogénesis por intususcepción de manera dependiente de la

producción de óxido nítrico y VEGF, los mecanismos moleculares por los cuales se inicia

la angiogénesis por intususcepción permanecen sin esclarecerse.

2.2.3 Colitis como modelo de estudio de la angiogénesis por intususcepción

Se ha descrito la angiogénesis por intususcepción en el colon de ratones durante

la inducción de colitis mediante agentes químicos como ácido trinitrobenzenosulfónico

(TNBS) y Sulfato sódico de Dextrano (DSS), convirtiéndose en un modelo experimental

de estudio de este mecanismo angiogénico durante la inflamación. En estos modelos se

ha demostrado un aumento del volumen capilar en el plexo intestinal, produciéndose la

división de un mismo capilar hasta cuatro veces en 31 días de tratamiento 82. La

angiogénesis tiene lugar en el plexo vascular de la capa más interna del colon, llamada

mucosa. El plexo capilar de la mucosa presenta una arquitectura en forma de panal de

abeja rodeando las criptas del epitelio intestinal, y está irrigado por vasos de mayor calibre

presentes en las otras capas intestinales, la submucosa, y la serosa (Figura 5A).

Además de las duplicaciones de vasos tras la inducción química de colitis se han

observado otros marcadores de angiogénesis por intususcepción como vasodilatación y

formación de pilares intraluminales, ya descritos en otros contextos. Se ha demostrado la

formación de pilares intraluminales en las zonas del plexo con menor estrés de cizalla,

que son las bifurcaciones de capilares llamadas tricórneres (Figura 5B) 82,111–113.

26

Durante este proyecto se ha usado como modelo para el estudio de la angiogénesis

por intususcepción la inducción de colitis con DSS. Este químico destruye la barrera

epitelial permitiendo la entrada de los microorganismos comensales del intestino y sus

productos a la lámina propia. La entrada de estos microrganismos induce la respuesta

inmune. Se produce la secreción de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, así como

el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos, que inducen la inflamación del tejido. La

inflamación causa cambios en el flujo sanguíneo que junto a la estimulación química

inflamatoria y al aumento de la hipoxia inducen angiogénesis, la cual contribuye a su vez

al aumento de la inflamación 114–116.

Figura 5. Observación de la formación de pilares intraluminales por molde de corrosión. A.

Vasculatura intestinal. Plexo mucoso (PM), submucosa (SM), serosa (S). B. vasculatura del plexo

mucoso en panal de abeja. C. Pilar intraluminal. Adaptado de Konerding MA et al; 2013 y Ravnic DJ

et al; 2007.

La inducción de colitis por DSS induce consecuencias fácilmente observables que

son indicativas de la inflamación intestinal, como la pérdida de peso, el sangrado rectal y

la disminución en la consistencia de las heces 116. Éste junto con otros modelos de

inducción de colitis en ratones mimetiza las lesiones de las enfermedades inflamatorias

intestinales (EII) humanas, proporcionando un método de estudio del daño intestinal y de

la etiología de estas enfermedades. Las principales EII humanas son la colitis ulcerosa

(CU) y la enfermedad de Crohn (EC) que actualmente sufren 1 de cada 200 habitantes

europeos 117. Estas enfermedades afectan al colon y otras regiones del tracto

gastrointestinal, la EC causa ulceraciones transmurales en el intestino delgado y colon,

mientras la CU causa ulceraciones no transmurales restringidas al colon 118–120.

Si bien no se ha podido determinar la participación de la angiogénesis por

intususcepción durante la evolución de las EII humanas, sí que se ha descrito el aumento

del volumen vascular durante su patogénesis 121.

27

2.2.4 Mecanismos moleculares angiogénicos en colitis

En concordancia con el incremento de la vasculatura en el intestino de pacientes

de EII y de ratones tras la inducción de colitis, se ha demostrado el aumento de la

producción de factores proangiogénicos en el colon de pacientes de CU y EC. Los

extractos de mucosa intestinal de pacientes incrementan de manera dosis dependiente la

migración de células endoteliales microvasculares de intestino humanas (HIMECs).

Además, se ha observado un incremento de factores proangiogénicos como PDGF,

VEGF, bFGF en el suero y tejido dañado de pacientes de EII 115,121–124.

Los principales estímulos angiogénicos implicados en la inducción de

angiogénesis por intususcepción han sido descritos como actores moleculares durante la

angiogénesis y patogénesis de las EII. Así, mediante el análisis de ultrasonidos por

Doppler se ha observado el aumento del flujo sanguíneo en regiones activas de EC y CU,

que puede inducir angiogénesis por intususcepción 125,126. Por su parte, VEGF y su

receptor VEGFR2, pero no VEGFR1 aparecen sobreexpresados en pacientes de CU y EC

así como en ratones tratados con DSS. El incremento de la expresión de VEGF por la

infección con adenovirus aumenta la angiogénesis y empeora la evolución de los animales

mientras que la sobreexpresión de VEGFR1 produce el efecto opuesto 127.

En cuanto a la función del óxido nítrico en la patogénesis de EII, se ha observado

el aumento de las concentraciones de óxido nítrico y su coproducto de síntesis (L-

Citrulina), así como de la expresión de eNOS en muestras de pacientes de EII,

correlacionando con la actividad inflamatoria de la enfermedad. 128–130. La función

beneficiosa o perjudicial del incremento de la producción de óxido nítrico y la actividad

de las tres NOS es controvertida. Se han publicado trabajos con resultados contradictorios

del efecto de la inhibición de la producción de óxido nítrico y la deleción de la expresión

de eNOS e iNOS, sobre la patogénesis de las EII 131–134. Sin embargo, en los últimos años

se ha propuesto al óxido nítrico producido por iNOS y eNOS como activador de la

angiogénesis intestinal a través de la expresión de VEGF al igual que en otros modelos

de angiogénesis por intususcepción 115,135,136.

Recientemente se han propuesto numerosas terapias de inhibición de la

angiogénesis inducida por inflamación en pacientes de EII. Los tratamientos basados en

la inhibición de la vía de VEGF no se han mostrado eficaces hasta el momento en EII o

han sido contraindicados al impedir el cierre de las perforaciones intestinales en la EC.

28

115,137,138. Actualmente se utilizan terapias basadas en la inhibición de la angiogénesis

mediante moléculas anti-TNFα, como el anticuerpo infliximab 139,140. Otros tratamientos

están en fases de ensayo clínico como los péptidos ABT-510 y ABT-898, ambos basados

en diferentes secuencias de la molécula anti-angiogénica trombospondina que inhiben

parcialmente la inflamación y la angiogénesis en ratones 141–143. Por tanto, la

identificación de agentes moleculares implicados en la patogénesis de EII puede aportar

nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de estas enfermedades. Un análisis de la

expresión génica a través de microarray ha identificado 15 genes diferencialmente

expresados en el colon de animales tratados con DSS que previamente habían sido

identificados en EII humanas, entre los que destacan citoquinas y quimioquinas como IL-

6, IL-16 o CCL2, y las metaloproteasas MMP3 y MT1-MMP 144.

3 MT1-MMP en células endoteliales

3.1 Estructura de MT1-MMP

Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son un grupo de endopeptidasas

dependientes de Zn2+ capaces de degradar componentes de la matriz extracelular (MEC)

y modular la bioactividad de receptores de membrana y factores de crecimiento

modificando su microambiente. MT1-MMP (MMP14) fue la primera MMP anclada a la

membrana que se describió en células tumorales, capaz de activar el zimógeno de MMP2

durante la invasión y metástasis cancerosas 145. Más tarde fue caracterizada como una

fibrinolisina endotelial, necesaria para la invasión y tubulogénesis durante la angiogénesis

146. MT1-MMP es una proteína de 582 aminoácidos con una estructura similar a la del

resto de miembros de la familia de las MMPs. Consta de 6 dominios: un propéptido (M1-

R111), un dominio catalítico (Y112-G285), una región bisagra (E286-I318), un dominio

hemopexina (C319-C508), un dominio enlace (P509-S338), un dominio transmembrana

(A539-F562) y una cola citosólica (R563-V582) 145,147 (Figura 6).

Figura 6. Estructura esquemática de MT1-MMP. Adaptada de Koziol A et al; 2012.

29

3.2 Regulación de MT1-MMP en células endoteliales

Las células endoteliales expresan MT1-MMP a bajos niveles, incrementados por

estímulos angiogénicos e inflamatorios como IL-1, IL-8, TNFα, bFGF, VEGF, CSF-2,

TGFβ o CCL2 30,148–151. La expresión de MT1-MMP en células endoteliales está regulada

por la unión de factores de transcripción a su promotor. Se ha descrito el aumento de la

expresión de MT1-MMP durante la activación de las células endoteliales por la unión del

factor de transcripción EGR-1152. El cual puede ser desplazado del promotor de MT1-

MMP por SP1153. Por su parte, KLF6 ha sido implicado en la sobreexpresión de MT1-

MMP tras daño vascular154. Además, se ha observado la disminución de la expresión de

MT1-MMP por la unión del factor de transcripción de células endoteliales linfáticas

PROX1155. Asimismo, La actividad de MT1-MMP está regulada además por procesos no

transcripcionales:

1. Corte proteolítico. MT1-MMP es activada a través del corte proteolítico de su

propéptido por convertasas de la familia de las furinas en el trans-golgi.156,157.

2. Inhibidores. La actividad de MT1-MMP en células endoteliales está regulada por

inhibidores, como la familia de los TIMPs y glicoproteína RECK 158–160. RECK ha

sido implicado en angiogénesis tumoral 161.

3. Localización subcelular. estudios previos han indicado que MT1-MMP puede

encontrarse en distintos dominios de la membrana plasmática de células endoteliales.

La localización subcelular de MT1-MMP regula su actividad por formación de

complejos con otras proteínas y el acceso diferencial a sus sustratos. Nuestro grupo

detectó MT1-MMP polarizada y activa asociada a la integrina αvβ3, en caveolas de

filopodios y lamelipodios de células endoteliales en migración. Las caveolas son

regiones de la membrana plasmática ricas en colesterol que contienen caveolin-1 y

cavinas. En este contexto, MT1-MMP coprecipita con caveolina y αvβ3 162–164. MT1-

MMP ha sido descrita activa en otros contextos como en la membrana de podosomas,

degradando la matriz extracelular de la lámina basal durante el inicio de la

angiogénesis por brote capilar 165. MT1-MMP también ha sido observada activa en

otros tipos celulares en las adhesiones focales, donde favorece su reciclado y puede

desarrollar funciones de señalización, 166–168 y en el espacio intracelular, donde

procesa la proteína del centrosoma pericentrina, así como tiene funciones de

señalización nuclear regulando la transcripción de PI3K 169,170.

30

Por otro lado, se ha descrito la presencia de MT1-MMP proteolíticamente inactiva en

las uniones celulares en microdominios de tetraspaninas (Tspan) asociada a la

integrina α3β1 y Tspan CD151 171,172. Finalmente, MT1-MMP ha sido identificada en

vesículas extracelulares y exosomas en células endoteliales y tumorales 173,174.

4. Internalización. La vía de caveolina es la principal vía de internalización de MT1-

MMP en células endoteliales 163.

5. Dimerización. La unión de MT1-MMP en dímeros a través del residuo Cys564 del

dominio hemopexina y del dominio transmembrana incrementa la capacidad

proteolítica de la proteína 30,175–177.

6. Flujo sanguíneo. Recientemente se ha analizado el efecto del flujo sanguíneo sobre la

expresión y actividad de MT1-MMP. Se han realizado ensayos sometiendo células

endoteliales a flujo mediante un agitador circular. Se detectó un descenso en la

expresión de MT1-MMP por unión a su promotor de Sp1, desplazando EGR-1 vía

activación de PKCζ 153,178. Sin embargo el laboratorio de la Dra. Bayless ha reportado

el incremento de actividad de MT1-MMP y su polarización hacia la membrana basal

en respuesta a flujo laminar, en un efecto sinérgico con el estímulo angiogénico S1P

179,180.

3.3 Función de MT1-MMP en células endoteliales

MT1-MMP es considerada, debido a su función proteolítica, el mayor modificador

del ambiente pericelular en células endoteliales, pero además ha sido implicada en

distintas vías de señalización independientemente de su función catalítica.

3.3.1 Actividad Catalítica

La actividad proteolítica de MT1-MMP es altamente selectiva, reconociendo una

secuencia Arg-noPro-Xpolar-XHy 181. Su gran repertorio de sustratos incluye proteínas de

matriz extracelular (triple hélice de colágeno I, II y III, laminina, nidógeno,

trombospondina y Cyr61) 146,148,182,183, otras proteasas (Pro-MMP2, pro-MMP8, pro-

MMP13, ADAM9) 145,184–186, citoquinas y quimioquinas (pro-TGFβ, pro-TNFα, SDF1,

CCL7, IL8) 187–190, receptores y proteínas transmembrana (E- y N-cadherina, EMMPRIN,

CD44, integrina αv) 191–196, y proteínas intracelulares (Pericentrina) 169. Durante la

angiogenesis el procesamiento por parte de MT1-MMP de proteínas de la matriz

extracelular y ancladas a la membrana plasmática puede modificar su actividad de

señalización, como en el caso del corte de trombospondina, decorina, endoglina,

31

semaphorina-4D, pro-TNFα o pro-TGFβ. Además, puede liberar factores

proangiogénicos anclados a la matriz extracelular 197. Por otro lado, MT1-MMP puede

modular la señalización de la vía de VEGF a través del corte proteolítico de VEGFR1 191.

Nuestro laboratorio ha identificado una colección de sustratos de MT1-MMP

mediante el análisis del degradoma de células endoteliales pulmonares de ratones de

fenotipo salvaje y deficientes para la expresión de MT1-MMP, estimuladas con TNFα.

El estudio demostró la capacidad de MT1-MMP de desarrollar un programa proteolítico

específico de angiogénesis, modificando mediante el la proteólisis de moléculas como

TSP1 o CYR61 procesos de adhesión y migración celular 148.

3.3.2 Funciones independientes de la actividad catalítica

MT1-MMP está implicada en procesos de señalización en células endoteliales. Se

ha descrito la interacción con receptores transmembrana y GTPasas, participando de la

señalización intracelular en respuesta a estímulos como ox-LDL, TNFα o trombina 198–

201. Así, MT1-MMP es capaz de modificar la expresión de algunos genes implicados en

angiogénesis como VEGF a través de dos vías descritas. Por un lado, MT1-MMP forma

un complejo con VEGFR2 y Src que mantiene VEGFR2 en la membrana plasmática y

activa su cascada de señalización 202,203. Por otro lado, se ha descrito en macrófagos la

asociación de MT1-MMP con el factor de inhibición de HIF1 (FIH-1) y Mint3 en la

membrana del trans-Golgi, inactivando FIH-1 y estabilizando el factor inducido por

hipoxia 1α (HIF-1α), que regula la transcripción de genes angiogénicos 204–206. Además,

nuestro laboratorio ha descrito en macrófagos la unión de MT1-MMP a la proteína

adaptadora p130cas por medio del residuo Tyr563, que permite la regulación de la

GTPasa Rac1. La interacción entre MT1-MMP y Rac1 fue confirmada en la membrana

plasmática de células endoteliales. Así, MT1-MMP puede modular la organización del

citoesqueleto y la migración 170,207.

3.4 MT1-MMP en angiogénesis por brote capilar e intususcepción

Ratones deficientes para la expresión MT1-MMP desarrollan, entre otros

defectos, procesos angiogénicos aberrantes tras el nacimiento. Estos animales mueren en

las primeras semanas de vida, lo que dificulta el estudio de la función de MT1-MMP en

angiogénesis 208–210. Sin embargo, la reciente aparición de animales con deficiencia

inducible de MT1-MMP en tejidos específicos es una nueva herramienta de gran utilidad

32

para identificar la función de MT1-MMP en distintos tipos celulares durante la

angiogénesis 211.

Se ha identificado la expresión mayoritaria de MT1-MMP en la célula líder

durante la angiogénesis por brote capilar, aunque se desconoce si tiene algún papel

durante la especificación en células líder y tallo. Se ha demostrado su participación en

diferentes etapas del proceso angiogénico por brote capilar 212.

1. Migración. MT1-MMP es necesaria para la migración del brote capilar a través de la

matriz extracelular. Así, se han descrito defectos en migración tanto en ensayos de

angiogénesis ex vivo usando anillos aórticos de ratón deficientes para la expresión de

MT1-MMP en matrices 3D, como en células endoteliales murinas y humanas en

matrices en 2D 171,213,214. Además, MT1-MMP puede afectar a la migración celular a

través de la modulación de la actividad de las GTPasas Rho por la interacción con su

cola citosólica 148,207.

2. Invasión. La actividad proteolítica de MT1-MMP es necesaria para la degradación de

la lámina basal, permitiendo la invasión endotelial. Explantes de anillos aórticos de

ratón deficientes para la expresión de MT1-MMP presentan defectos en la invasión

de geles de colágeno y fibrina. Se ha observado el enriquecimiento de MT1-MMP en

zonas de la membrana plasmática de células endoteliales en contacto con la lámina

basal, formando estructuras llamadas podosomas encargadas de la degradación 1,146.

3. Tubulogénesis. MT1-MMP es necesaria para la formación del lumen vascular. A

través de la formación de túneles de guía vascular crea el espacio a través del cual

migran las células endoteliales y forman el nuevo vaso 215.

4. Reclutamiento de células perivasculares. Se ha descrito la interacción entre MT1-

MMP y PDGFRβ regulando la migración de proliferación de las células

perivasculares y por tanto la estabilización del vaso 216.

5. Regresión. MT1-MMP también ha sido implicada en procesos de regresión vascular

en modelos angiogénicos usando anillos aórticos ex vivo 217.

En cuanto a la función de MT1-MMP durante la angiogénesis por intususcepción,

si bien no ha sido estudiada hasta el momento, se han observado importantes defectos

durante el aumento de la superficie vascular pulmonar tras el nacimiento en animales

deficientes para la expresión de MT1-MMP. Este proceso se produce mayoritariamente a

través de angiogénesis por intususcepción, constituyendo un indicio de la posible función

de MT1-MMP como nuevo actor en este tipo de angiogénesis 76,214.

33

Objetivos

35

La angiogénesis, por brote capilar o intususcepción, se ha considerado una posible diana

terapéutica en patologías como el cáncer o la enfermedad inflamatoria intestinal, pero su

inhibición no ha obtenido los efectos terapéuticos esperados, lo que indica que es

necesario profundizar en los mecanismos moleculares subyacentes. Dado los

antecedentes sobre el papel de las oscilaciones de Ca2+ en regulación de patrones

dinámicos de expresión génica y sobre las acciones de la proteasa MT1-MMP en células

endoteliales, hipotetizamos que caracterizar las oscilaciones de calcio y la función de

MT1-MMP en los distintos modos de angiogénesis avanzará nuestro conocimiento sobre

este proceso y su posible inhibición en patología. Para ello, en este trabajo nosotros

proponemos los siguientes objetivos:

1. Caracterizar el patrón, regulación y señalización de las oscilaciones de Ca2+ en células

endoteliales en condiciones de especificación de células líder y tallo.

2. Analizar el posible papel de la proteasa MT1-MMP durante la angiogénesis por

intususcepción en el contexto inflamatorio:

2.1. Caracterizar el impacto de la deleción de MT1-MMP en células endoteliales

sobre la angiogénesis por intususcepción.

2.2. Investigar el impacto de la deleción de MT1-MMP en células endoteliales

sobre la patogénesis de la colitis experimental.

2.3. Explorar el mecanismo molecular implicado en la inducción de la

angiogénesis por intususcepción.

2.4. Evaluar la posible aplicación de MT1-MMP como diana terapéutica en colitis.

37

Materiales y métodos

39

Reactivos Compañía 4-Hidroxitamoxifeno Sygma-Aldrich

Acetilcolina Sigma-Aldrich

Agujas BD-Biosciences

APS Sygma-Aldrich

ARNs interferencia Thermo Fisher

BCA Thermo Fisher

Bis-acrilamida Biorad

BSA Sygma-Aldrich

β-mercaptoetanol Sigma-Aldrich

Colagenasa tipo I GIBCO

Colagenasa tipo I Worthington

DAPT Sigma-Aldrich

DEANO Sigma-Aldrich

DSS MP Biomedicals

Elastasa Worthington

Estreptomicina Lonza

Eosina Sigma-Aldrich

FluoromontG SouthernBiotech

Gelatina Sygma-Aldrich

Glicerol Merk-Millipore

Glutamina Lonza

Hematoxilina Sigma-Aldrich

Hemocult Colon Screen

Hepes Lonza

HUVECs Lonza

Inhibidores de fosfatasas Roche

Inhibidores de proteasas Roche

Jeringuillas BD-Biosciences

Lipofectamina RNAimax Thermo Fisher

Medio 199 Lonza

Medio DMEN F12 Lonza

Medio EGM2 Promocell

Medio Optimem Lonza

Membrana de nitrocelulosa Biorad

NaCl Sygma-Aldrich

Paraformaldehído Merk-Millipore

Penicilina Lonza

Placas de cultivo Falcon

SDS Sigma-Aldrich

Suero bovino fetal Gibco

Suero de burro Jackson

Suero de cabra Jackson

Suero de Pollo Jackson

Synta 66 Aobious Inc

Temed Sigma-Aldrich

Tabla 1

40

TNFα PeproTech

Triton X-100 Sigma-Aldrich

TSP1 Athensresearch

VEGF PeproTech

Equipo Compañía Bioflux Fluxion Biosciences

BioRad-CFX-384 BioRad

Imaris Bitplane AG

LAS4000 Gelifesciences

Leica DM6000-FS Leica

Lupa Nikon

Material de disección Fine scientific tools

Microscopio de campo claro Nikon

Placa de neubauer Marienfeld

Western blot kit Biorad

Zeiss LSM 700 Carl Zeiss

Zeiss LSM 780 Carl Zeiss

Anticuerpo/fluoróforo WB IF Referencia

Actina 1:5000 Sigma-Aldrich

A5441

Anti-mouse IgG 1:500 Jackson

Anti-rabbit IgG 1:500 Jackson

Anti-rat IgG 1:500 Jackson

Β-galactosidasa 1:100 Abcam ab476120

CD11b 1:100 Ebiosciences 51-

0112-82

CD31 1:100 Millipore

MAB1398Z

CD31 1:100 Dianova DIA310

CD34 1:100 Dako M7165

DAF-FM 2,5 µM Thermo Fisher

eNOS 1:1000 BD-Biosciences

610297

ERG-647 1:100 Abcam ab196149

Fluo-4 1 µM Thermo Fisher

Faloidina FITC 1:200 Life Technologies

GAPDH 1:10000 Sigma G9545

GFP 1:1000 Abcam ab13970

Hoechst 1:5000 Invitrogen H1399

HRP goat-anti-mouse 1:10000 Jackson

HRP goat anti rabbit 1:5000 Jackson

ICAM2 1:100 Bd pharmingen

553325

Isolectina B4 1:100 Vector: B-1205

Tabla 3

Tabla 2

41

MT1-MMP (LEM-2/15) 1:5 1:1 Galvez et al;

2001

MT1-MMP HR 1.100 Abcam ab38971

P-PLCγ 1:1000 Cell Signaling

2821

PLCγ 1:1000 Cell Signaling

5690

TSP1 1:100

Cedido por el

laboratorio de Mª

Luisa Iruela

Arispe

TSP1 1:100 Thermo Fisher

MA5-13398

Tubulina 1:5000 Sigma T6074

1 Cultivos celulares y técnicas in vitro

1.1 Cultivo de HUVECs

Las células endoteliales vasculares humanas de cordón umbilical (HUVECs)

fueron provistas por la casa comercial Lonza obtenidas de diferentes donantes. Las

HUVECs fueron cultivadas sobre una matriz de gelatina 0.5% (Sigma) en medio 199

(Lonza) suplementado con 20% de suero fetal bovino (SFB, Gibco), 100U/ml penicilina

(Lonza), 100 mg/ml estreptomicina (Lonza), 2mM L-Glutamina (Lonza), 10mM hepes

(Lonza), y factores de crecimiento endoteliales suplementados con heparina (Promocell).

Las células fueron utilizadas entre el tercer y quinto pase.

1.2 Aislamiento y cultivo de MAEC

Las células endoteliales de aorta de ratón (MAEC) fueron aisladas tras la disección

de 10 aortas procedentes de ratones de 4 semanas. En primer lugar, se retiró el tejido graso

de las aortas y fueron incubadas durante 5 minutos en una solución de colagenasa tipo I

a una concentración de 3.33 mg/ml (Worthington). Tras la digestión, se retiro la

adventicia de las aortas y fueron cortadas en pequeños fragmentos incubados durante 45

minutos en una dilución en medio comercial DMEM/F12 de colagenasa tipo I (6mg/ml)

y elastasa (2,5 mg/ml) (Worthington). Finalmente, el medio obtenido fue plaqueado sobre

una matriz de gelatina 0.2% en medio DMEM/F12 suplementado con 20% SFB, 2 mM

L-glutamina, 50 U/ml penicilina, 50 μg/ml estreptomicina, 10 U/ml heparina (Chiesi), y

factores de crecimiento endoteliales. Con el objetivo de descartar células musculares de

42

la vasculatura, las MAEC fueron seleccionadas positivamente dos veces con el anticuerpo

anti-ICAM2 (BD Biosciences) unido a bolas magnéticas.

1.3 Estimulación de células endoteliales

Para la estimulación de células endoteliales se usó el factor de crecimiento

endotelial vascular (VEGF) o el factor de Necrosis tumoral (TNFα), provistos por

Peprotech a una concentración de 1 o 20 ng/ml. Las células fueron cultivadas previamente

al experimento en ausencia de ECGS y manteniendo la concentración de SFB al 1%.

Durante el tiempo de tratamiento se mantuvieron las mismas condiciones de cultivo.

Las HUVECs fueron tratadas con DAPT (5µM) para la inhibición de la γ-

secretasa, y Synta 66 (5µM, Aobious Inc) para la inhibición del canal de Ca2+ ORAI1.

1.4 Silenciamiento de la expresión de proteínas mediante ARN de interferencia.

Las HUVECs fueron silenciadas para la expresión de MT1-MMP a nivel de ARN

mediante la transfección con ARN de interferencia (ARNi) formando liposomas con

lipofectamina RNAimax (ThermoFisher). Previamente a la transfección, las células se

encontraban entre 70-80% de confluencia, cultivadas en medio sin antibiótico. Las células

se incubaron en medio Optimen (Lonza) sin suplementar durante 2 horas, y se añadió el

ARNi, a una concentración final de 10 nM, a un ratio ARNi-lipofectamina de 6 pmoles/µl.

Las células se incubaron con ARNi-lipofectamina durante 6 horas tras las cuales se añadió

medio con 20% SFB. Este proceso se llevó a cabo dos días consecutivos. El medio se

retiró al día siguiente siendo sustituido por medio 199 completo durante al menos 24 horas

antes de realizar los ensayos in vitro.

Los ARNi para el silenciamiento de MT1-MMP y control utilizados fueron

proporcionados por Ambion, Thermo Fisher Scientific (MT1-ARNi#1, 8877 (4390824)

MT1-ARNi#2 8879 (4390824) y Control No. 1 (4390843)). Fueron producidas por

Thermo Fisher Scientific.

1.5 Exposición de células endoteliales a flujo laminar

Las HUVECs fueron plaqueadas en microcanales de flujo de placas de 48 pocillos Bioflux

(Fluxion Bioscience) sobre una matriz de fibrinógeno (100ng/ml). Se cultivaron durante

36 horas en medio DMEN 199 suplementado. Posteriormente, las células fueron

sometidas a flujo laminar a 37ºC durante 12 horas produciendo un “estrés de cizalla” de

43

12 dynas/cm2 usando el sistema Bioflux (Fluxion Bioscience). Finalmente, las células

fueron teñidas por inmunofluorescencia siguiendo el protocolo detallado más adelante.

2 Modelos animales y experimentos in vivo

2.1 Líneas experimentales de ratón

Los ratones fueron mantenidos en instalaciones libres de patógenos en el

animalario del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), mantenidos

a una temperatura constante y sometidos a ciclos de luz oscuridad de 12 horas. Los ratones

fueron alimentados con pellets comerciales y agua disponibles ad libitum.

La línea MT1-MMP (Mmp14)loxP/loxP VE-cadherin (Cdh5)-CreERT2 fue generada

por el cruce de la línea MT1-MMP (Mmp14)loxP/loxP cedida por el laboratorio del Dr Lopez

Otin 211, con la línea VE-cadherin (Cdh5)-CreERT2 cedida por el laboratorio del Dr Adams.

La deleción de Mmp14 fue inducida por la inyección durante 5 días consecutivos de 200μl

de 4-hidroxitamoxifeno a una concentración de 5mg/ml (Sigma Aldrich). Además, se

utilizaron ratones reporteros MT1-MMP (Mmp14)lacz/+ cedidos por el laboratorio del Dr.

Seiki212, que expresan β-galactosidasa bajo el promotor del gen Mmp14.

El genotipado fue realizado para confirmar la presencia de los alelos flox, cre y

Lac Z por PCR de ADN genómico procedente de la cola de los animales. Además, se

confirmó por PCR la recombinación del alelo MT1-MMP en ADN genómico procedente

de la cola o pulmones de los animales. Las secuencias de los cebadores utilizados se

muestran en la Tabla 4. Fueron producidos por Sigma Aldrich.

Todo protocolo que incluye animales ha sido aprobado por PROEX 34113.

Genotipado Cebadores

Flox 5´-CCCTGGGTCAACTACAGCA-3´

5´-TTTGTGGGTGACCCTGACTTG-3´

LacZ 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAA-3´

5´-TGCTGACGGTTAACGCCTCG-3´

Cre 5´-AGGTGTAGAGAAGGCACTTAGC-3´

5´-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG-3´

Tabla 4

44

2.2 Inducción química de colitis en ratones y medición del índice de colitis.

La colitis fue inducida en ratones de 8 a 18 semanas de edad por la administración

de sulfato sódico de dextrano (DSS) 1% (m:v) en el agua de bebida ad libitum durante 3

o 7 días. El índice de colitis de los animales fue evaluado diariamente, los ratones fueron

pesados, se analizó la consistencia de las heces y la presencia de sangre oculta en las

mismas. A día 0 se le asignó un índice de colitis 0, el resto de días fue calculado de la

siguiente forma: el porcentaje de pérdida de peso con respecto al día 0 se puntuó con un

0 para aquellos ratones que mantuvieron o ganaron peso, un 1 para una pérdida de entre

el 1 y el 5% del peso corporal, 2 para una pérdida del 5 al 10%, 3 del 10 al 20% y 4 para

aquellos ratones que perdieron más del 20% de su peso. Para la consistencia de las heces

se puntuó como 0 las heces bien formadas de tamaño y forma de pellet normal, como 2

aquellos ratones de pellets blandos, y como 4 aquellos ratones de heces líquidas. En

cuanto al sangrado rectal, se puntuó con un 0 la ausencia de sangre en heces, con un 2 la

aparición de sangre oculta en heces positiva por hemocult (Colon Screen), y 4 la aparición

de sangre abundante visible en las heces y el ano.

2.3 Inyección de lentivirus in vivo

Ratones de 8 a 18 semanas fueron inyectados con lentivirus que expresan la

secuencia completa de la proteína MT1-MMP, con la mutación Y573F, o E240K bajo el

promotor SFFV. Se inyectaron 200 µl de lentivirus por ratón a una concentración 2x107

PV/ml a través de la vena yugular en ratones previamente anestesiados.

Se comprobó la eficiencia de transducción y expresión por Western blot de la

proteína verde fluorescente (GFP), expresada en el vector viral bajo el mismo promotor

que nuestra proteína de interés.

2.4 Ensayo de perfusión

Para analizar la funcionalidad de los vasos sanguíneos del plexo mucoso se realizó

un ensayo de perfusión. Los ratones se perfundieron vía intravenosa 20 minutos antes de

ser eutanasiados con 100 μl de isolectina B4 biotinilada o fluoresceinada (Vector labs) y

fueron perfundidos con PBS. El porcentaje de vasculatura perfundido por IB4 fue

analizado mediante el software Imaris (version 7.7.2; Bitplane AG).

45

3 Técnicas de imagen

3.1 Tinciones de inmunofluorescencia en células.

Las células fueron plaqueadas sobre cristal cubierto de gelatina al 1% y fijadas

con paraformaldehído (PFA) al 4% durante 8 minutos a temperatura ambiente. La

reactividad inespecífica de los anticuerpos fue bloqueada durante 30 minutos a

temperatura ambiente, con BSA 5% en PBS, suplementado con el 5% de sueros

procedentes de la especie animal en la que hubieran sido producidos los anticuerpos

secundarios que iban a ser utilizados. Las células fueron permeabilizadas en los casos que

fue necesario con Triton X-100 0.1% disuelto en PBS durante 15 minutos a temperatura

ambiente. Se incubaron con los anticuerpos primarios en solución de bloqueo durante una

noche a 4ºC y se lavaron 3 veces durante 15 minutos con PBS. Tras ello, las células fueron

incubadas con los anticuerpos secundarios unidos a fluoróforos durante 45 minutos a

37ºC y se lavaron 3 veces durante 10 minutos con PBS. Finalmente, las muestras fueron

observadas y fotografiadas con un microscopio confocal Zeiss LSM700 (Plan-

Apochromat 63x1.4 o 40x1.3 Oil DIC M27).

3.2 Determinación relativa de la concentración de óxido nítrico

La determinación de la concentración relativa de óxido nítrico en HUVECs fue

realizada mediante la sonda DAF-FM diacetato (ThermoFisher). Las células fueron

incubadas a una concentración de 2.5 μM de la sonda disuelta en Optimen en ausencia de

rojo fenol durante 30 minutos a 37ºC. A continuación, se lavaron abundantemente con

PBS y se fijaron con PFA 4% durante 8 minutos. Las células fueron observadas usando

un microscopio confocal Zeiss LSM700 (Plan-Apochromat 40x1.3 Oil DIC M27). Se

cuantificó la intensidad de fluorescencia media (IFM) a nivel de célula única usando el

software ImageJ.

3.3 Determinación relativa de la concentración de Ca2+ y análisis de oscilaciones

La determinación de la concentración relativa de Ca2+ en HUVECs fue realizada

mediante la sonda fluorescente de Ca2+ Fluo4-AM (ThermoFisher). Las células fueron

incubadas con la sonda a una concentración de 1µM disuelta en HBSS con ácido

plurónico (0.002%) durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las

células fueron lavadas y se analizó la variación de Ca2+ intracelular a lo largo del tiempo

en situación control o bajo el efecto de los estímulos angiogénicos VEGF o TNFα,

mediante un microscopio confocal Zeiss LSM700 (Plan-Apochromat 40x1.3 Oil DIC

46

M27). Se cuantificó la intensidad de fluorescencia media a nivel de célula única por

fotograma usando el software ImageJ y se normalizó respecto al valor del primer

fotograma de cada célula.

Las frecuencias de oscilación de cada célula se obtuvieron mediante la

transformada rápida de Fourier usando el protocolo adaptado desarrollado por Uhlén para

el software Matlab (MathWorks) 218.

3.4 Tinción de tejido in toto

Se realizaron tinciones de inmunofluorescencia de tejido in toto en tejido de colon

procedente de ratón o de biopsias humanas, así como de aortas y músculo cremáster de

ratón.

Los fragmentos distales del colon de los animales y los músculos cremáster fueron

abiertos y fijados durante una noche con PFA al 4% en PBS a 4ºC. Las muestras fijadas

fueron incubadas durante una hora en solución de bloqueo, 5% BSA, 0.3% Triton X-100,

y 5% de sueros provenientes de la especie animal en la que hubieran sido producidos los

anticuerpos secundarios que se iban a utilizar. A continuación, las muestras se incubaron

a 4ºC durante una noche en agitación suave, con los anticuerpos primarios en solución de

bloqueo y se lavaron con PBS 0.1% Triton X-100 al menos 3 veces. Finalmente, las

muestras fueron incubadas con los anticuerpos secundarios unidos a fluoróforos durante

una noche a 4ºC y se lavaron con la misma solución de lavado que anteriormente. Las

muestras fueron observadas y fotografiadas con un microscopio confocal Zeiss LSM700

(Plan-Apochromat, 25X0.8 or 63x glycerol DIC M27). La reconstrucción de la

vasculatura del colon en 3 dimensiones, y la cuantificación de la misma fueron realizadas

por medio del software Imaris (version 7.7.2; Bitplane AG).

Las aortas fueron extraídas de los animales tras ser perfundidos con PFA al 4% en

PBS, limpiadas, abiertas y postfijadas durante una hora con PFA al 4% en PBS. Se tiñeron

y analizaron las aortas mediante el mismo protocolo seguido en el caso de las muestras

de colon y músculo cremáster.

El análisis de la polarización de las células endoteliales de la aorta se llevó a cabo

mediante la medición del ángulo formado por el vector entre el núcleo y el aparato de

Golgi, y el vector del flujo sanguíneo usando el software ImageJ. Se realizó un histograma

de su distribución usando el software R-estudio.

47

3.5 Tinciones de tejido parafinado

Fragmentos de colon de los ratones tratados con DSS o control fueron fijados con

4% de PFA a 4ºC durante 12 horas, embebidos en parafina y cortados en secciones de 5

µm. Las secciones fueron desparafinadas e hidratadas en una cadena xilol-etanol, y se

tiñeron con hematoxilina/eosina para el análisis histológico de las muestras o fueron

desenmascaradas con tampón Tris-EDTA pH 9 durante 20 minutos a 95ºC para ser

teñidas por inmunofluorescencia.

Las muestras desenmascaradas para tinción de inmunoflurescencia fueron

bloqueadas durante una hora a temperatura ambiente con PBS 0.3% Tx100, 5% BSA, 5%

suero de cabra y anti-CD16/CD32 a una concentración de 1:100. Posteriormente, se

incubaron con anticuerpos primarios durante una noche y se lavaron las muestras con

PSB 0.1% Tx100. Las muestras fueron incubadas con anticuerpos secundarios

conjugados con diferentes fluorocromos durante 2 horas a temperatura ambiente y se

lavaron con PSB 0.1% Tx100. Finalmente, se montaron en Fluoromont con Hoechst

33342 para la visualización de los núcleos y se observaron utilizando un microscopio

confocal Zeiss LSM700 (Plan-Apochromat 25x Oil DIC M27).

3.6 Microscopía intravital de músculo cremáster de ratón

La microscopía intravital en el músculo cremáster se realizó de acuerdo a lo

descrito previamente 219. El músculo cremáster de ratones anestesiados fue cortado

longitudinalmente y expuesto al microscopio intravital Leica DM6000-FS ajustado a una

cámara DFC350-FX con un objetivo de inmersión en agua Apo 40x NA 1.0. El músculo

fue perfundido continuamente con buffer Tyrode. Los animales fueron tratados por vía

intravenosa con 100µl de Acetilcolina 100µM (ACh), y 100 µl de DEANO 10-4 M. Se

analizó la vasodilatación arterial mediante el programa LAS-AF.

4 Procedimientos experimentales

4.1 Western Blotting

Las células fueron lisadas en buffer RIPA (Tris 50mM, NaCl 150 mM, SDS 0.1

%, Na-deoxicolato 0.5 %, NP40 1%) a 4ºC con inhibidores de proteasas y fosfatasas

(Roche). La concentración de proteínas de los lisados fue determinada por colorimetría

usando ácido bicinconínico (BCA) (ThermoFisher). Las proteínas desnaturalizadas en

48

tampón Laemmli con 4% β-mercaptoetanol se cargaron en geles de acrilamida del 8 al

12% (SDS-PAGE) y se realizaron electroforesis en condiciones desnaturalizantes. Se

utilizó el marcador de pesos moleculares Secblue plus presteined (ThermoFisher).

Tras la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de

nitrocelulosa (Biorad). Se bloquearon los sitios de unión no específica con BSA 5% en

TBS durante una hora a temperatura ambiente y las membranas fueron incubadas con los

anticuerpos primarios durante una noche a 4ºC. Al día siguiente, se incubaron durante 45

minutos a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa

de rábano. La señal producida al suministrar sobre la membrana luminol (Merk Milipore),

sustrato de la peroxidasa, fue detectada por quimioluminiscencia mediante el equipo LAS

4000.

Los resultados fueron cuantificados por densitometría usando el software ImageJ

y normalizados respecto al control de carga, GAPDH, actina o tubulina. Los anticuerpos

usados y la concentración de uso se muestran en la tabla 3.

4.2 Retro-PCR cuantitativa (qPCR)

El ARN de tejidos y células fue extraído utilizando el kit comercial RNeasy Plus micro

kit (Qiagen) y cuantificado usando el espectofotómetro Nanodrop ND-100 (Thermo

Fisher Scientific). Se sintetizó 1 μg de ADNc usando el kit de transcripción reversa de

alta capacidad (Applied Biosystems). A continuación, se realizó una PCR cuantitativa por

triplicado para cada uno de los ARNm mediante el sistema SYBR Green (Applied

Biosystems). La fluorescencia del agente intercalante fluorescente SYBR Green fue

detectada por el termociclador CFX-384 (Biorad)

Los cebadores fueron diseñados usando la librería online primerBank. Las secuencias de

los cebadores se muestran en la Tabla 5, para los genes humanos y en la Tabla 6, para los

genes de ratón. Todos ellos fueron sintetizados por Sigma Aldrich. Los datos fueron

analizados usando el software qBASE.

Gen Cebadores

DLL4 5´-GTCTCCACGCCGGTATTGG-3´

5´-CAGGTGAAATTGAAGGGCAGT-3´

CD34 5´-CTACAACACCTAGTACCCTTGGA-3´

5´-GGTGAACACTGTGCTGATTACA-3

Tabla 5

49

ESM1 5´-CAGGGGGACGGGAAAATGC-3´

5´-CAGATGCCATGTCATGCTCC-3´

CXCL12 5´-ATTCTCAACACTCCAAACTGTGC-3´

5´-ACTTTAGCTTCGGGTCAATGC-3´

VEGFR2 5´-GGCCCAATAATCAGAGTGGCA-3´

5´-CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT-3´

PCDH10 5´-TGGATGGTGGAAGGAGTCTTT-3´

5´-TTCAGCGATATTCCCCACGAA-3´

PAK1 5´-AGGGGAGTTTACGGGAATGC-3´

5´-TCTTCTGCTCCGACTTAGTGATA-3´

SFRP 5´-ACGTGGGCTACAAGAAGATGG-3´

5´-CAGCGACACGGGTAGATGG-3´

STAT1 5´-ATCAGGCTCAGTCGGGGAATA-3´

5´-TGGTCTCGTGTTCTCTGTTCT-3´

RCAN1.4 5´-CTCACTAGGGGCTTGACTGC-3´

5´-CAGGCAATCAGGGAGCTAA-3´

ICAM1 5´-ATGCCCAGACATCTGTGTCC-3´

5´-GGGGTCTCTATGCCCAACAA-3

VCAM1 5´-GGGAAGATGGTCGTGATCCTT-3´

5´-TCTGGGGTGGTCTCGATTTTA-3´

MMP14 5´-GGCTACAGCAATATGGCTACC-3´

5´-GATGGCCGCTGAGAGTGAC-3´

NOS3 5´-GGCTGGGTTTAGGGCTGTG-3´

5´-TGAGGGTGTCGTAGGTGATG-3´

GAPDH 5´-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3´

5´-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3´

HPRT 5´-CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT-3´

5´-AGACGTTCAGTCCTGTCCATAA-3

YWHAB 5´-CCTGCATGAAGTCTGTAACTGAG-3´

5´-GACCTACGGGCTCCTACAACA-3´

Gen Cebadores

Mmp14 5´- CAGTATGGCTACCTACCTCCAG-3´

5´- GCCTTGCCTGTCACTTGTAAA-3´

Cdh5 5´-AAAGAACTGGACAGAGAAA-3´

5´-GGTTGTCATTCTCATCCAAG-3´

Tbp 5´- GCTCTGGAATTGTACCGCAG-3´

5´- CTGGCTCATAGCTCTTGGCTC-3´

Gapdh 5´- AATGCATCCTGCACCACCAA-3´

5´- GTGGCAGTGATGGCATGGAC-3´

4.3 Citometría de flujo preparativa

Pulmones procedentes de ratones recién eutanasiados por dislocación cervical fueron

digeridos en colagenasa tipo I a una concentración de 0.2% (GIBCO) durante una hora a

Tabla 6

50

37ºC. Las células extraídas de los pulmones fueron incubadas durante 5 minutos en

tampón ACK (150mM NH4Cl, 0.1mM Na2EDTA, 10mM KHCO3, pH=7.4) para

eliminar los eritrocitos, y resuspendidas en buffer de citometría de flujo preparativa (PBS

+ 1% FBS + 10mM HEPES). Posteriormente, se bloquearon los receptores Fcγ, que se

unen a inmunoglobulinas, con anti-CD16/CD32 (Pharmingen) durante 10 minutos a 4ºC.

Las muestras fueron teñidas con anti-CD31 (Mec13.3) conjugado con el fluorocromo

Alexa Fluor 488 y anti- CD45.1 conjugado con el fluorocromo V405 (BD Bioscience,

Pharmingen). Finalmente, las muestras fueron analizadas por Synergy 4L Cell Sorter

(Sony Biotechnology Inc.) y la población endotelial definida como CD31+/CD45- fue

aislada para su análisis por qPCR.

5 Análisis estadístico

Todos los resultados fueron analizados y representados en gráficas usando el software

GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA). Para comparar dos grupos

muestrales de igual varianza se utilizó el método de la t de Student de dos colas. Cuando

las varianzas eran significativamente diferentes, se aplicó el método de Welch. En los

casos en que se comparó más de dos grupos muestrales se utilizó ANOVA de una cola o

dos colas combinado con el método de comparación múltiple Benjamini–Hochberg en

los casos en los que las muestras se ajustaron a una distribución paramétrica, y el método

de Kruskal-Wallis combinado con el método de comparación múltiple de Dunn cuando

no se ajustaron. En aquellos casos donde las muestras control se normalizaron a uno se

usó el método de la t de Student de un grupo para su análisis estadístico. Finalmente, en

el caso de datos procedentes del mismo individuo o célula, se realizó un análisis de la t

de Student pareada.

En todos los casos se representó la media ± el error estándar de la media (EEM) y se

consideraron diferencias significativas cuando el valor p del correspondiente análisis

estadístico era inferior a 0.05. Se representó el grado de significación con uno, dos, tres o

cuatro asteriscos, siendo: * p<0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001, **** p< 0,0001.

51

Resultados

53

1 Papel de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación de células endoteliales en

células líder y tallo durante la angiogénesis por brote capilar

Diferentes estímulos mecánicos y químicos producen la activación de las células

endoteliales, dando lugar a angiogénesis por brote capilar por la especificación de las

células endoteliales quiescentes en células líder y tallo. Para que la angiogénesis por brote

capilar se produzca correctamente es necesaria una respuesta celular heterogénea ante un

estímulo angiogénico. VEGF A, que nosotros denominaremos a partir de este momento

como VEGF, y TNFα son dos de los estímulos mejor caracterizados en la bibliografía

como inductores de la angiogénesis por brote capilar13,29.

Sin embargo, se desconoce cómo se produce la señalización celular ante un

estímulo para producir una respuesta heterogénea con dos fenotipos endoteliales bien

diferenciados, las célula líder y tallo. En este trabajo, nosotros proponemos la señalización

por Ca2+ como posible eje para la divergencia en células líder y tallo, durante la

especificación celular ante estímulos angiogénicos como VEGF y TNFα.

1. 1 Análisis de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a estímulos angiogénicos

1.1.1 VEGF y TNFα aumentan la concentración de Ca2+ intracelular en células

endoteliales

En primer lugar, se comprobó si VEGF y TNFα modificaban las oscilaciones de

Ca2+ durante su transducción de señales. Se trataron HUVECs en monocapa confluente,

marcadas con la sonda de Ca2+ fluorescente Fluo 4, con VEGF o TNFα en ausencia de

Ca2+ extracelular durante 10 minutos. Se observó una respuesta moderada en cuanto a las

oscilaciones de Ca2+ en las células endoteliales. Transcurridos 10 minutos se restituyó el

Ca2+ extracelular a una concentración de 5 mM, observando un rápido y significativo

ascenso del Ca2+ intracelular a nivel poblacional y de célula única en HUVECs tratadas

con ambos estímulos (Figura 7). Estos resultados indicaron que VEGF y TNFα utilizan

el Ca2+ intracelular como molécula señalizadora durante la transducción de señales e

implicaron al Ca2+ extracelular y los canales de Ca2+ de la membrana plasmática en las

oscilaciones producidas por ambos estímulos.

54

Figura 7. La estimulación con VEGF y TNFα produce el aumento de la concentración de Ca2+

citoplasmático en células endoteliales. A. Evolución de la concentración intracelular de Ca2+ a nivel

poblacional en HUVECs estimuladas con VEGF (20 ng/ml) en ausencia de Ca2+ durante 10 minutos,

y tras la adición de Ca2+ en el medio extracelular (5 mM). B. Cuantificación de la intensidad de

fluorescencia media de Fluo4 a nivel de célula única en ausencia de Ca2+ extracelular y a una

concentración de 5mM de células estimuladas con VEGF. n=3 experimentos C. Evolución de la

concentración intracelular de Ca2+ a nivel poblacional en células estimuladas con TNFα (20 ng/ml) en

ausencia de Ca2+ durante 10 minutos, y tras la adición de Ca2+ en el medio extracelular (5mM). D.

Cuantificación de la intensidad de fluorescencia media de Fluo4 a nivel de célula única en ausencia

de Ca2+ extracelular y a una concentración de 5mM en células estimuladas con TNFα. n=3. En B y D

se realizaron los análisis estadísticos con el método de la t de Student pareada. *** p< 0,001, ****

p<0,0001.

1.1.2 Análisis de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF y TNFα a nivel de

célula única

A continuación, se analizó de qué forma son capaces VEGF y TNFα de modificar

las oscilaciones de Ca2+ en HUVECs. Para ello, se estimularon HUVECs con 20ng/ml de

VEGF o TNFα y se midió la concentración relativa de Ca2+ cada 1,52 segundos a nivel

de célula única durante 47 minutos de estimulación. De esta forma, se analizó la respuesta

celular independiente frente a ambos estímulos y se comparó con las oscilaciones de Ca2+

en células control sin estimulación.

55

Figura 8. La estimulación con VEGF y TNFα modifica los patrones de las oscilaciones de Ca2+

en células endoteliales. A. B. Evolución de la concentración de Ca2+ intracelular durante 1800

fotogramas (47 minutos) a nivel de célula única en 4 células representativas (A) y a nivel poblacional

(B) en HUVECs sin estímulos angiogénicos externos. C. D. Evolución de la concentración intracelular

de Ca2+ durante 1800 fotogramas (47 minutos) a nivel de célula única en 5 células representativas (C)

y a nivel poblacional (D) en HUVECs estimuladas con 20ng/ml de TNFα. E. F. Evolución de la

concentración intracelular de Ca2+ durante 1800 fotogramas (47 minutos) a nivel de célula única en 5

células representativas (E) y a nivel poblacional (F) en HUVECs estimuladas con 20ng/ml de VEGF.

G. H. Cuantificación del porcentaje de HUVECs tratadas con VEGF (G) o TNFα (H) que presentan

oscilaciones de Ca2+ con periodos clasificados en intervalos de 10 segundos (blanco) comparados con

los de células control (negro) sin estímulos angiogénicos externos. n=3 experimentos. En B, D y F se

representó la media experimental en azul, y en gris cada una de las células del experimento. En G y H

se realizaron los análisis estadísticos con el método ANOVA de dos colas con post-test de Benjamini-

Hochberg. * p<0,05, ** p< 0,01.

56

En células control, no estimuladas con ningún factor angiogénico, no se

observaron variaciones en las oscilaciones de Ca2+, tan solo una pequeña proporción de

células presentó picos de Ca2+ espontáneos (Figura 8A,B). Las células estimuladas con

20ng/ml de TNFα presentaron dos subpoblaciones celulares en cuanto a su respuesta de

oscilaciones de Ca2+. Aquellas células que no respondieron a la estimulación mediante

oscilaciones de Ca2+, y las que respondieron con numerosos picos de Ca2+ cortos y de

frecuencia aproximadamente estable, los cuales no eran visibles a nivel poblacional pero

sí a nivel de célula única (Figura 8C,D).

En el caso de las células estimuladas con 20ng/ml de VEGF se observaron

diferentes comportamientos celulares en cuanto a las oscilaciones de Ca2+ en respuesta al

estímulo. Por una parte, la mayoría de células incrementaron rápidamente su

concentración de Ca2+, con una oscilación visible a nivel poblacional de gran amplitud,

seguida de rápidas y amplias oscilaciones o descenso y estabilización del Ca2+

intracelular. Otras células, por el contrario, presentaron numerosas oscilaciones de Ca2+

con un patrón similar al mayoritario en células estimuladas con TNFα, por otro lado una

minoría de células no respondieron a la estimulación con VEGF (Figura 8E,F).

1.1.3 Análisis de las frecuencias de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF y

TNFα

Para analizar las diferencias en las oscilaciones de Ca2+ entre las células

estimuladas con VEGF o TNFα y las células control, se extrajeron las frecuencias de las

oscilaciones de Ca2+ a nivel de célula única usando la transformada rápida de Fourier. Se

cuantificó el porcentaje de células con periodos de oscilación (el inverso de la frecuencia)

clasificados en intervalos de 10 segundos. Las oscilaciones de Ca2+ de las células

endoteliales son oscilaciones complejas que presentan numerosas frecuencias dentro de

una misma onda. Los porcentajes de células con oscilaciones en los distintos intervalos

de periodos fueron comparadas usando ANOVA de dos colas y post test de Benjamini y

Hochberg.

Tanto la estimulación con VEGF como con TNFα, produjo unos porcentajes de

células distribuidas en los intervalos de periodos estadísticamente diferente a la de las

células control. En el caso de VEGF los porcentajes de células con oscilaciones con

periodos menores a 20 segundos fueron significativamente mayores que en el control,

57

mientras que en las células estimuladas con TNFα hallamos diferencia significativa en el

porcentaje de células con periodos menores de 30 segundos. Por tanto se concluyó que

las HUVECs estimuladas con VEGF o TNFα presentan mayor número de células con

oscilaciones de alta frecuencia (Figura 8G,H).

Estos datos en conjunto indican que tanto VEGF como TNFα utilizan las

oscilaciones de Ca2+ intracelulares como método de transducción de señales por medio

del incremento de la concentración intracelular del catión y de la generación de

oscilaciones de alta frecuencia.

1.2 Análisis de la heterogeneidad de las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF

Dado que la estimulación con VEGF produjo en HUVECs una respuesta celular

más heterogénea, con diferentes tipos de oscilaciones de Ca2+, y que de acuerdo con

nuestra hipótesis dicha heterogeneidad es necesaria para iniciar la especificación de las

células endoteliales en los dos fenotipos celulares implicados en la angiogénesis por brote

capilar, se decidió profundizar en su señalización a través de oscilaciones de Ca2+,

excluyendo a partir de entonces la estimulación con TNFα de nuestro estudio.

Con el objetivo de esclarecer cómo las células endoteliales son capaces de

responder de forma diferente ante un mismo estímulo, se estudió a nivel de célula única

la función de algunos componentes de la ruta de señalización responsable las oscilaciones

de Ca2+ en células endoteliales.

1.2.1 Papel del canal ORAI1 en las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF

Conociendo la importancia del Ca2+ extracelular en la respuesta a la estimulación

con VEGF, se decidió comprobar la implicación del principal canal de Ca2+ de la

membrana plasmática, ORAI1, en las oscilaciones de Ca2+. Para ello, se preincubaron

HUVECs en confluencia con el inhibidor químico específico de ORAI1 (Synta 66) y se

estimularon con 20ng/ml de VEGF. No se observó en ninguna célula el pico de Ca2+ de

gran amplitud característico de la mayoría de células tratadas con VEGF. Sólo en torno a

un 13% de las células respondieron a VEGF con múltiples picos de Ca2+ de duración

breve (Figura 9).

Estos datos indicaron que las diferentes oscilaciones de Ca2+ en respuesta a un

mismo estímulo no son dependientes de los mismos canales de Ca2+ de la membrana

plasmática.

58

Figura 9. La actividad del canal de Ca2+ ORAI1 es necesaria para la respuesta mayoritaria a

VEGF por oscilaciones de Ca2+ en HUVECs. A. B. Evolución de la concentración intracelular de

Ca2+ en HUVECs bajo el efecto de la droga inhibidora del canal de Ca2+ ORAI1, Synta 66 (S66),

estimuladas con VEGF (20ng/ml) a nivel poblacional (A) y de célula única (B). Un 12.83% ± 8.74 de

las células respondieron con múltiples picos de Ca2+. En A se representó la media experimental en

azul, y en gris cada una de las células del experimento. Experimento representativo de 3 experimentos

independientes.

1.2.2 VEGF produce diferentes respuestas de oscilaciones de Ca2+ dependientes de

dosis

Se ha descrito que el aumento de la migración celular, característica de células

líder, en células endoteliales estimuladas con VEGF es dependiente de dosis. Por ello, se

decidió comprobar si diferentes concentraciones de VEGF (1ng/ml y 20ng/ml) podían

producir diferentes patrones de oscilaciones Ca2+ cambiando la heterogeneidad de la

respuesta celular.

Las células analizadas se clasificaron en tres grupos según el tipo de oscilaciones

de Ca2+ que presentaron en respuesta a VEGF: i) las que presentaron una oscilación

principal de gran amplitud al inicio de la estimulación como oscilación principal (OP), ii)

las que presentaron repetidas oscilaciones de frecuencia aproximadamente estable como

oscilaciones repetidas (OR) y iii) aquellas que no responden como no respondedoras (NR)

(Figura 10A).

Las células tratadas con 20ng/ml de VEGF presentaron un porcentaje

aproximadamente del 88% de células OP, un 10% de OR y tan solo un 2% de células NR

(Figura 10B) (Video 1). Las células que fueron tratadas con la dosis más baja de VEGF,

1ng/ml, presentaron sin embargo un bajo porcentaje de células OP, elevado de células

OR, y en torno a un 20% de células NR (Figura 10C) (Video 2).

59

Figura 10. VEGF produce diferentes patrones de oscilaciones de Ca2+ dependientes de dosis. A.

Clasificación de los patrones de oscilaciones de Ca2+ en respuesta a la estimulación con VEGF en

HUVECs: presencia una oscilación principal de gran amplitud al inicio de la estimulación (OP)

(arriba), presencia de oscilaciones repetidas (OR) (centro) y a aquellas que no responden (NR) (abajo).

B. Porcentaje de células que presentaron cada una de las respuestas clasificadas en A tras la

estimulación con 20 ng/ml de VEGF. n=4. C. Porcentaje de células que presentaron cada una de las

respuestas clasificadas en A tras la estimulación con 1 ng/ml de VEGF. n=3.

En resumen, estos datos indican que las HUVECs sometidas a elevadas dosis de

VEGF presentan mayoritariamente una respuesta de una oscilación principal mientras

que aquellas sometidas a dosis más bajas responden mayoritariamente con oscilaciones

repetidas.

1.2.3 VEGF produce dinámicas de fosforilación de PLCγ1 dependientes de dosis

Como se ha explicado en la introducción de este trabajo, las oscilaciones de Ca2+

se producen por una vía de señalización en la que las fosfolipasas son pieza esencial. Por

esto, y con objetivo de comprender cómo la misma ruta de señalización puede producir

dos tipos de oscilaciones de Ca2+ diferentes, se decidió analizar la dinámica de

fosforilación de la fosfolipasa mayoritaria en el endotelio, la fosfolipasa gamma 1

(PLCγ1).

HUVECs cultivadas en monocapa confluente fueron estimuladas con 1 y 20 ng/ml

VEGF durante diferentes tiempos y se analizó por Western blot la fosforilación activadora

en la tirosina 783 (Tyr783) de la PLCγ1.

60

Se observó una rápida fosforilación de la proteína en las células tratadas con dosis

elevadas de VEGF que decreció con el tiempo de estimulación, mientras esta fosforilación

es menor pero sostenida en el tiempo en las células estimuladas con 1ng/ml de VEGF.

Estos resultados correlacionaron con las oscilaciones de Ca2+en respuesta a estímulo

mayoritarias en cada tratamiento (Figura 11A,B).

Figura 11. VEGF produce dinámicas de fosforilación de PLCγ1 dependientes de dosis. A. Western

blot representativo de p-PLCγ1, PLCγ1 total y tubulina de HUVECs tratadas con 20ng/ml de VEGF

a diferentes tiempos de estimulación y su cuantificación. n=3. B. Western blot representativo de p-

PLCγ1, PLCγ1 total y tubulina de HUVECs tratadas con 1ng/ml de VEGF a diferentes tiempos de

estimulación y su cuantificación. n=3. Se realizaron los análisis estadísticos con el método de la t de

Student para una muestra. * p<0,05.

1.2.3 Análisis de la regulación de las oscilaciones de Ca2+ por la ruta Dll4/Notch

La vía de inhibición lateral Dll4/Notch es considerada como el principal eje en la

especificación de células líder y tallo, por ello se decidió analizar el efecto de esta vía

sobre las oscilaciones de Ca2+ en respuesta al estímulo angiogénico VEGF.

Se trataron HUVECs en monocapa confluente con un inhibidor de la γ-secretasa

(DAPT), encargada del corte del fragmento intracelular de NOTCH (NICD) responsable

de su señalización, y se estimularon con 1 o 20 ng/ml de VEGF. Se observaron, al igual

que en experimentos anteriores, las oscilaciones de Ca2+ a nivel de célula única en

respuesta a VEGF durante 47 minutos. Finalmente, se cuantificó el porcentaje de células

61

que presentaron cada uno de los diferentes tipos de oscilaciones de Ca2+ en respuesta a

VEGF y se comparó con los de las células no tratadas con DAPT.

Las células tratadas con DAPT y estimuladas con 20 ng/ml de VEGF, no

presentaron oscilaciones de Ca2+ de tipo OP mientras que en las células control, tratadas

solo con VEGF, fue el comportamiento mayoritario. Además, se incrementó un 55% las

células con fenotipo OR (Figura 12A).

Figura 12. El patrón de oscilaciones de Ca2+ de las células endoteliales en respuesta a VEGF es

dependiente del corte intracelular de Notch. A. Porcentaje de células que presentaron cada una de

las respuestas clasificadas en la figura 34 A tras la estimulación con 20 ng/ml de VEGF tratadas o no

con el inhibidor de la γ-secretasa DAPT. n=3 experimentos independientes. B. Porcentaje de células

que presentaron cada uno de las respuestas clasificadas en la figura 10 tras la estimulación con 1 ng/ml

de VEGF tratadas o no con el inhibidor de la γ-secretasa DAPT. n=3 experimentos independientes. Se

realizaron los análisis estadísticos con el método la t de Student. ** p< 0,01, *** p< 0,001, **** p<

0,0001. OP= Oscilación Principal, OR= Oscilaciones Repetidas y NR= No Respondedoras.

En cuanto a las estimuladas con 1ng/ml de VEGF, aquellas células con

oscilaciones de tipo OR disminuyeron un 57% tras el tratamiento con DAPT respecto al

control, y se incrementaron las células que no respondieron mediante oscilaciones de Ca2+

a la estimulación con 1ng/ml de VEGF (Figura 12B). Por tanto, estos datos indicaron

que el bloqueo in vitro del sistema de inhibición lateral desregula los porcentajes de

células que presentan cada tipo de oscilaciones.

Estos datos en conjunto, sugieren que el sistema Dll4/Notch modula la respuesta

a VEGF a través de las oscilaciones de Ca2+ de células endoteliales, y con ello su

especificación en células líder y tallo.

62

1.3 Impacto de las oscilaciones de Ca2+ en la transcripción génica

1.3.1 Regulación génica de marcadores de célula líder o tallo en respuesta a

diferentes dosis de VEGF

Para comprobar si las diferentes oscilaciones de Ca2+ estaban implicadas en la

especificación celular de los dos fenotipos de célula endotelial, se estimularon HUVECs

con 1 y 20ng/ml de VEGF durante 2 y 24 horas y se analizaron los niveles de marcadores

endoteliales de células líder y tallo a nivel de ARNm por qPCR cuantitativa. La búsqueda

de candidatos se realizó de acuerdo a la bibliografía previa 53,220.

Marcadores de células líder como ESM1, CD34, CXCL12, VEGFR2 o DLL4

aumentaron a nivel de ARNm en células HUVECs tratadas con 20ng/ml durante 2 o 24

horas (Figura 13A). Sin embargo, en la mayoría de los marcadores de células tallo como

PAK7, SFRP o PCDH10 no se observó una regulación génica tan clara tras el tratamiento

con diferentes concentraciones de VEGF (Figura 13 B).

Las oscilaciones de Ca2+ pueden activar la transcripción génica en células

endoteliales a través de diferentes factores de la transcripción como NFAT y NFκB. Por

ésto, se analizó la expresión de RCAN1.4 como diana clásica del factor transcripcional

NFAT. RCAN1.4 ha sido caracterizado como marcador de células líder por su

importancia en la migración celular mediada por VEGFR2 221. Como dianas

transcripcionales de NFκB se analizó la expresión de VCAM1 e ICAM1 222. En el caso

de RCAN1.4 observamos el aumento del ARNm en las células tratadas con 20ng/ml de

VEGF. Por el contrario, los niveles del mensajero de ICAM1 y VCAM1 aumentaron en

células endoteliales tratadas tanto con 1 como con 20ng/ml de VEGF durante 24 horas

(Figura 13 C).

63

Figura 13. Diferentes dosis de VEGF regulan la trasncripción génica de marcadores de célula

líder o tallo. A. qPCR en HUVECs estimuladas con 1 o 20 ng/ml VEGF durante 2 o 24 horas de los

marcadores de célula líder (A) DLL4, CD34, ESM1, CXCL12, VEGFR2, de células tallo (B)

PCDH10, PAK7, SFRP, STAT1, y los marcadores de trancripción dependiente de NFAT, RCAN1.4,

y de NFκB: ICAM1 y VCAM (C). . Se realizaron los análisis estadísticos con el método de la t de

Student para una muestra. * p<0,05.

64

Dado que RCAN1.4 apareció sobreexpresado en células líder siendo un gen diana

de NFAT, factor transcripcional asociado previamente a la diferenciación de células tallo,

se comparó la expresión de los marcadores en células estimuladas con VEGF tratadas o

no con el inhibidor de la ruta de NFAT, ciclosporina (CSA). Se observó que el aumento

de la expresión de la mayoría de los genes marcadores de célula líder ESM1, CD34,

CXCL12, y DLL4 son independientes de la activación de NFAT y no se observaron

cambios en genes marcadores de células tallo como PAK7, Col8a, PCDH10, o SFRP. Sin

embargo, el tratamiento con CSA inhibió el incremento de la expresión de RCAN1.4 en

células estimuladas con 20ng/ml de VEGF y atenuó los cambios en los niveles del

mensajero de ICAM y VCAM en células estimuladas con ambas concentraciones de

VEGF (Figura 14 C).

Figura 14. Papel de NFAT en la regulación de la transcripción de genes marcadores de célula

líder y tallo. A.B.C. qPCR cuantitativa de RCAN1.4 (A), ICAM1 (B) y VCAM (C) en HUVECs

control y tratadas con el inhibidor de NFAT ciclosporina (CSA), estimuladas con 1 o 20 ng/ml VEGF

durante 2 o 24 horas. Se realizaron los análisis estadísticos con el método de la t de Student para una

muestra. * p<0,05.

Estos datos demuestran el aumento en la expresión de los marcadores de célula

líder bajo altas concentraciones de VEGF. El aumento de la transcripción de RCAN1.4

en un contexto que estimula la transcripción de marcadores de célula líder, sugiere la

participación de la vía de NAFT en la especificación de este fenotipo líder.

65

2 MT1-MMP, nuevo actor en angiogénesis por intususcepción en contexto

inflamatorio: papel del flujo y del óxido nítrico

2.1 Estudio de la angiogénesis por intususcepción en un modelo de colitis

experimental inducida por DSS

2.1.1 Visualización de la vasculatura intestinal y sistemas indirectos de

cuantificación de angiogénesis por intususcepción

Desde la caracterización de la angiogénesis por intususcepción en EII, esta ha sido

estudiada usando como herramienta la técnica de molde de corrosión combinada con

microscopía electrónica de barrido. Esta técnica, si bien ha supuesto un gran avance para

la caracterización morfológica de este tipo de angiogénesis, presenta numerosos

problemas derivados de su complejidad técnica y de la dificultad de analizar un número

elevado de individuos. En este trabajo hemos desarrollado un sistema de cuantificación

de angiogénesis por intususcepción a través de microscopía confocal en tinciones de

tejido de intestino in toto y la reconstrucción informática en 3 dimensiones del plexo

capilar de la mucosa.

Así, en primer lugar se optimizó la técnica de tinción por inmunofluorescencia de

tejido in toto, que nos permitió visualizar y caracterizar la vasculatura intestinal. En la

Figura 15 se puede observar la reconstrucción tridimensional de la vasculatura desde el

plexo mucoso, de arquitectura poligonal en torno a las criptas de Lieberkuhn, a las arterias

y venas de mayor calibre presentes en la submucosa y serosa que irrigan la

microvasculatura intestinal.

66

Figura 15. Visualización de la vasculatura intestinal. A. Imagen representativa de la vasculatura

intestinal de colon de ratón, teñida por inmunofluorescencia in toto para CD31 en vista ortogonal. La

barra de escala equivale a 40 µm B. Imágenes representativas de la vasculatura de la mucosa

(izquierda), submucosa (centro) y serosa (derecha) teñidas por inmunofluorescencia in toto para

CD31. La barra de escala equivale a 60 µm.

Seguidamente, con el objetivo de analizar la angiogénesis por intususcepción en

tinciones de colon in toto se implementó un sistema de cuantificación de los eventos

marcadores de angiogénesis por intususcepción presentes en el plexo mucoso, ya

caracterizados por la técnica de molde de corrosión. El primer evento caracterizado son

los pilares intraluminales, formados por la migración de las células endoteliales a través

del lumen del vaso sanguíneo. Estos pilares tienen un diámetro de entre 1 y 5 µm (Figura

16A izquierda). La formación de los pilares tiene lugar en regiones donde el flujo

sanguíneo genera turbulencias o disminuye su velocidad. En el caso de la vasculatura del

plexo mucoso intestinal se forman en torno a los tricórneres, punto en el que confluyen

tres o más capilares. Los pilares formados en los tricórneres aumentan su tamaño y se

fusionan con otros formando un asa (Figura 16A centro). Finalmente, estas asas crecen

hasta convertirse en dos vasos sanguíneos que discurren en paralelo formando las

denominadas duplicaciones (Figura 16A derecha).

67

Por otro lado, la medida de los ángulos formados entre los vasos de cada tricorner

también puede ser usada para cuantificar de forma indirecta la angiogénesis por

intususcepción 111. La media de estos ángulos en un animal sano es de aproximadamente

120º, y decrece con la duplicación de los vasos por intususcepción (Figura 16B).

Figura 16. Sistema de cuantificación de angiogénesis por intususcepción en la vasculatura del

plexo mucoso intestinal. A. Imágenes de la vasculatura del colon teñida para CD31, representativas

de los principales eventos de angiogénesis por intususcepción, pilar (izquierda), asa (centro) y

duplicación (derecha) en los paneles superiores, y sus reconstrucciones en 3 dimensiones usando el

software Imaris (paneles inferiores). Las barras de escala equivalen a 10 µm. B. Medida de los ángulos

formados entre los vasos de un tricorner de la vasculatura del plexo mucoso intestinal.

2.1.2 Cuantificación de la angiogénesis por intususcepción en colitis inducida por

DSS

La presencia de la angiogénesis por intususcepción en el colon durante el

desarrollo de colitis está bien descrita en la bibliografía 82, pero poco se conoce acerca de

los mecanismos moleculares propios de este tipo de angiogénesis. Durante este trabajo

nosotros hemos propuesto a la metaloproteinasa de matriz MT1-MMP, con un papel bien

descrito durante la angiogénesis por brote capilar, como un nuevo actor en la angiogénesis

68

por intususcepción. Para la caracterización de la función de MT1-MMP durante la

angiogénesis por intususcepción en contexto inflamatorio se decidió utilizar un modelo

animal de colitis inducida por DSS administrado en el agua de bebida ad libitum a una

concentración del 1% m:v durante 7 días. Los animales desarrollan bajo este porcentaje

del químico una colitis moderada que permite visualizar los eventos angiogénicos

presentes en la vasculatura, ocultos tras el daño en tratamientos con porcentajes mayores

del químico.

Para comprobar la inducción de angiogénesis por intususcepción en nuestro

modelo se realizó un primer experimento usando ratones C57BL/6 de genotipo salvaje, y

se analizó la estructura de la vasculatura intestinal, así como el número de eventos

marcadores de angiogénesis por intususcepción mediante inmunofluorescencia de tejido

in toto (Figura 17A). Se observó un aumento estadísticamente significativo de los

eventos marcadores de angiogénesis por intususcepción en los animales tratados con 1%

de DSS durante 7 días (Figura 17B).

Figura 17. La inducción de colitis con 1% DSS causa angiogénesis por intususcepción en el plexo

mucoso de ratones. A. Proyecciones máximas de imágenes de microscopía confocal representativas

de la vasculatura del plexo mucoso, procedentes de ratones de fenotipo salvaje tratados durante 7 días

con 1% DSS y su control basal teñidos para CD31. La barra de escala equivale a 20 µm. B.

Cuantificación de los eventos de angiogénesis por intususcepción de los ratones de A. n=3 por

condición. Se realizó el análisis estadístico con el método de la t de Student. **p< 0.01.

2.2 Análisis del papel de MT1-MMP en angiogénesis por intususcepción

2.2.1 Caracterización de la expresión endotelial de MT1-MMP durante angiogénesis

por intususcepción en el colon de ratón

Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron por Western blot el

incremento de la expresión de la proteína MT1-MMP en lisado total de colon, durante el

69

desarrollo de colitis inducida por administración de DSS al 1% m:v en agua de bebida a

ratones de genotipo salvaje.

Figura 18. MT1-MMP se expresa en las células endoteliales de arteriolas y capilares del

colon durante el desarrollo de colitis experimental. Proyecciones máximas de imágenes de

microscopía confocal representativas de la vasculatura intestinal de ratones reporteros MT1-MMP

(Mmp14) lacz/+ tratados durante 3 o 7 días con 1% DSS y su control basal, teñidos para ICAM2 (verde),

β-galactosidasa (rojo) y ERG (blanco). Se muestran en detalle zonas con una arteriola (recuadro

naranja) y zonas del plexo capilar (recuadro verde). Las flechas amarillas indican células endoteliales

positivas para β-galactosidasa. La barra de escala equivale a 50 µm (panel superior) y 25 µm (vistas

en detalle).

Para comprobar si el aumento de la expresión de MT1-MMP durante la progresión

de la enfermedad tiene lugar en células endoteliales, se utilizaron animales MT1-MMP

(Mmp14)lacz/+, reporteros de la actividad del promotor del gen Mmp14 212. Los animales

fueron tratados durante 3 y 7 días con 1% DSS. Se analizó la vasculatura del plexo

mucoso y las arteriolas que lo irrigan por inmunofluorescencia en cortes de parafina y de

tejido in toto. Las muestras se tiñeron con anticuerpos contra β-galactosidasa, para

analizar la actividad del promotor de Mmp14, y los marcadores de células endoteliales

ERG (nuclear) e ICAM2 (membrana). Se decidió en este punto la inclusión de un estadio

70

intermedio de la enfermedad a 3 días para visualizar los eventos tempranos de

intususcepción.

Se observó la continua de MT1-MMP en el endotelio de las arteriolas durante el

tratamiento con DSS. En cuanto a las células endoteliales de los capilares del plexo

mucoso, se observó un aumento del número de células con actividad en el promotor de

MT1-MMP en paralelo a los días de tratamiento (Figura 18). Además, se observó, en

colon de ratones tratados durante 7 días y teñidos por inmunofluorescencia in toto, un

mayor número de células positivas para la expresión de MT1-MMP localizadas en torno

a los tricórneres, donde se inicia la angiogénesis por intususcepción (Figura 19).

Figura 19. MT1-MMP se expresa en células endoteliales cercanas a tricórneres y eventos de

angiogénesis por intususcepción. Proyecciones máximas de una imagen de microscopía confocal

representativas de la vasculatura intestinal de ratones reporteros MT1-MMP (Mmp14) lacz/+ tratados

con 1% DSS durante 7 días teñida para ICAM2 (verde), β-galactosidasa (rojo) y ERG (blanco). Las

flechas blancas indican células endoteliales positivas para β-galactosidasa junto a un evento de

angiogénesis por intususcepción. La barra de escala equivale a 20 µm.

2.2.2 Deleción endotelial de MT1-MMP

Con el objetivo de caracterizar el impacto funcional de la proteasa endotelial

MT1-MMP durante la angiogénesis por intususcepción en un contexto inflamatorio, se

usaron ratones de la línea MT1-MMP (Mmp14)f/f VE-cadherin (Cdh5)-CreERT2/+. En estos

ratones se indujo la deleción de los exones 4 y 5 de Mmp14, flanqueados por dos

secuencias loxP, mediante la inyección intraperitoneal de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT)

durante 5 días consecutivos (MT1iΔEC). Como animales control se usaron ratones de la

misma línea negativos para la expresión de la recombinasa cre (MT1f/f) (Figura 20A).

71

La deleción de los exones 4 y 5 de Mmp14 fue testada mediante la PCR de ADN

genómico extraído del pulmón de los animales MT1iΔEC y MT1f/f (Figura 20B). Además,

se testó la eficiencia de la deleción a nivel de ARNm por qPCR cuantitativa de células

endoteliales de pulmón aisladas mediante citometría de flujo preparativa. Los animales

MT1iΔEC presentaron una expresión del mensajero de MT1-MMP un 88% menor que los

MT1f/f, mientras que no se hallaron diferencias en la expresión del marcador endotelial

Cdh5 (Figura 20C). Por otro lado, se comprobó la deleción de MT1-MMP a nivel de

proteína en la vasculatura del intestino por inmunofluorescencia de cortes de parafina. En

el panel D de la figura 20 se muestran imágenes representativas en las que se observa la

disminución de la proteína MT1-MMP en células endoteliales de ratones MT1iΔEC.

Figura 20. Validación de la deleción endotelial de MT1-MMP. A. Esquema de la obtención de la

línea MT1-MMP(Mmp14)f/f VE-Cadherina(Cdh5)CreERT2/+. B. PCR de ADN genómico de pulmón

mostrando la banda indicativa de la deleción de MT1-MMP en los ratones MT1 iΔEC y ausencia de

banda en los ratones MT1f/f. La posición de los cebadores usados se indica mediante cuadrados rojos

en el esquema del panel A C. qPCR cuantitativa de VE-cadherina (Cdh5) y MT1-MMP (Mmp14) en

células endoteliales de pulmón de ratones MT1f/f y MT1iΔEC aisladas por citometría de flujo

preparativa. D. Proyecciones máximas de imágenes de microscopía confocal representativas de

secciones transversales del colon de ratones MT1f/f y MT1iΔEC teñidas para MT1-MMP (rojo) y CD31

(verde).

72

2.2.3 La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la angiogénesis por

intususcepción durante la colitis experimental inducida por DSS

Con el objetivo de caracterizar el papel MT1-MMP durante la angiogénesis por

intususcepción se trataron animales MT1iΔEC y MT1f/f con 1% DSS en el agua de bebida

ad libitum siguiendo el diseño experimental descrito en el panel A de la Figura 21, y se

analizó el efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la angiogénesis por

intususcepción en el plexo mucoso del colon de estos ratones.

Se cuantificaron los eventos marcadores de angiogénesis por intususcepción en la

vasculatura del colon. Para ello, la región distal del colon de los ratones MT1iΔEC y MT1f/f

fue teñida por inmunofluorescencia in toto para CD31. Se detectó un incremento

estadísticamente significativo de los eventos de intususcepción durante la progresión de

la enfermedad a 3 y 7 días en los ratones MT1f/f, pero no así en los ratones MT1iΔEC.

Además, se observó una diferencia estadísticamente significativa en el porcentaje de

vasos sanguíneos con eventos entre los ratones MT1iΔEC y MT1f/f a 3 y 7 días de

tratamiento (Figura 21B,C).

Por otro lado, se cuantificaron los ángulos formados por los capilares en los

tricórneres del plexo mucoso. Se observó una disminución del ángulo intervascular de los

tricórneres tras 3 días de tratamiento con DSS al 1% en ratones MT1f/f, ausente en los

ratones MT1iΔEC, indicando una menor angiogénesis por intususcepción en estos animales

(Figura 21D). Finalmente, se cuantificó el volumen vascular de los plexos mucosos de

estos animales. Se observó un aumento del volumen vascular en los animales MT1f/f

tratados con DSS durante 7 días, mientras que el volumen vascular en los animales

MT1iΔEC permaneció sin cambios significativos durante el transcurso de la enfermedad

(Figura 21E).

Estos datos señalan a MT1-MMP como un actor necesario para la inducción de la

angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de la colitis.

74

Figura 21. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la angiogénesis por intususcepción

durante la colitis inducida por DSS. A. Diseño experimental de la deleción de MT1-MMP mediante

inyección de 4-Hidroxitamoxifeno (4-OHT) intraperitoneal e inducción de colitis con 1% DSS ad

libitum en el agua de bebida durante 3 o 7 días. B. Proyecciones máximas de imágenes representativas

de la vasculatura del plexo mucoso, procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 y 7

días con 1% DSS y sus controles basales teñidos con CD31. La barra de escala equivale a 40µm. C.

Cuantificación de los eventos de angiogénesis por intususcepción en ratones MT1f/f y MT1iΔEC

mostrados en B. n=9-15 animales por condición y genotipo de 5 experimentos independientes. D.

Cuantificación de los ángulos formados por los vasos sanguíneos del plexo mucoso en los tricórneres

en ratones MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 días con DSS al 1% y sus controles basales. n=6 ratones

por condición y genotipo de 2 experimentos independientes. E. Cuantificación del volumen vascular

en ratones MT1f/f y MT1iΔEC mostrados en B. n=9-11 animales por condición y genotipo de 5

experimentos independientes. En C, D y E se realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA

de una cola con post-test de Benjamini-Hochberg. * p<0,05, ** p< 0,01.

2.2.4 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la función vascular del

plexo intestinal

Se evaluó la funcionalidad de la vasculatura del plexo mucoso del intestino

mediante un ensayo de perfusión. Animales MT1iΔEC y MT1f/f tratados con 1% DSS

durante 3 y 7 días fueron perfundidos con isolectina b4 (IB4) directamente marcada,

posteriormente se realizaron inmunofluorescencias de tejido del colon in toto contra la

proteína endotelial CD31 para visualizar la vasculatura total (Figura 22A). Se cuantificó

el porcentaje de volumen ocupado por la tinción de isolectina dentro de los vasos

marcados con CD31 mediante el software Imaris.

Los animales sanos de ambos genotipos mostraron una perfusión similar. Sin

embargo, los animales MT1iΔEC tratados con DSS durante 7 días mostraron una perfusión

significativamente mayor que los ratones MT1f/f (Figura 22B).

75

Figura 22. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la perfusión de la vasculatura

intestinal durante la colitis inducida por DSS. A. Proyecciones máximas de imágenes

representativas de la perfusión de la vasculatura del plexo mucoso de ratones MT1f/f y MT1iΔEC

tratados durante 3 y 7 días con 1% DSS y sus controles basales, teñidos para CD31 (verde) e IB4

(rojo). La barra de escala equivale a 40 µm. B. Cuantificación del porcentaje de disminución del

volumen vascular perfundido por IB4 en plexo mucoso de ratones MT1f/f y MT1iΔEC mostrados en A.

n=8-12 animales por condición y genotipo en 5 experimentos independientes. Se realizó el análisis

estadístico con el método de ANOVA de una cola con post-test de Benjamini-Hochberg. ** p< 0,01.

2.2.5 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre el reclutamiento de células

inflamatorias

Se ha descrito el reclutamiento de diferentes células inflamatorias a la zona dañada

durante el desarrollo de las primeras etapas de las EII 223. Por esta razón, se analizó el

76

número de células inflamatorias CD11b+ que incluye neutrófilos y monocitos, presentes

en la mucosa intestinal por inmunofluorescencia en cortes transversales de muestras de

colon parafinados, procedentes de ratones sanos y tratados con DSS durante 3 y 7 días,

de genotipos MT1iΔEC y MT1f/f. Se observó que el número de células CD11b+ en la

mucosa del colon aumenta a lo largo de los días de tratamiento con DSS, hasta ser

significativo a día 7 en ratones MT1f/f pero no en MT1iΔEC (Figura 23A,B). Estos datos

demuestran que la ausencia de MT1-MMP endotelial disminuye la presencia de células

inflamatorias en el colon durante el desarrollo de colitis inducida por DSS.

77

Figura 23. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la presencia de células inflamatorias.

A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de cortes transversales de colon de ratones

MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 y 7 días con 1% DSS y sus controles basales, teñidos para CD11b

(rojo) y Hoechst (azul). La barra de escala equivale a 50 µm. B. Cuantificación del número de células

positivas para la expresión de CD11b en la mucosa de ratones MT1f/f y MT1iΔEC mostrado en A. n=4-

5 animales por condición y genotipo. Se realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA de

una cola con post-test de Benjamini-Hochberg. * p<0,05, **** p<0,0001.

2.2.6 Impacto funcional de la deleción de MT1-MMP endotelial sobre la progresión

clínica de la colitis

Con el objetivo de analizar el efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP en la

progresión de la enfermedad, se analizó la integridad estructural del tejido intestinal

mediante tinciones de hematoxilina/eosina en cortes transversales de intestino. Tras 7 días

de tratamiento con 1% DSS los animales MT1iΔEC presentaron una mayor preservación

de la estructura epitelial, se observó una menor área intestinal con criptas epiteliales

dañadas que en los animales MT1f/f (Figura 24A). La técnica de microscopía generación

de segunda armónica nos permitió visualizar la estructura de las fibras de colágeno en

tejido fresco. Los animales sanos de ambos genotipos presentaron un bajo número de

fibras de colágeno organizadas alrededor de las criptas intestinales, formando una

estructura en panel de abeja. Sin embargo, en los ratones MT1f/f se observó un mayor

número de fibras de colágeno tras 3 días de tratamiento con DSS, que aumentaron hasta

día 7, donde se observó la pérdida de la estructura en panel de abeja. Por el contrario, los

ratones MT1iΔEC tratados con DSS mantuvieron la estructura de fibras de colágeno en

torno a las criptas intestinales (Figura 24B).

Por otro lado, se caracterizó el efecto de la deleción de MT1-MMP sobre la

progresión de la enfermedad, cuantificando a diario la pérdida de peso, el sangrado rectal

y la consistencia de las heces, como parámetros característicos de las EIIs. Estos

parámetros fueron integrados en un índice de gravedad de la enfermedad, el índice de

colitis. Se observó un índice significativamente menor en ratones MT1iΔEC a partir del

sexto día de tratamiento con 1% DSS (Figura 24C). Sin embargo no se observaron

cambios significativos en otros marcadores usados como indicadores de la progresión de

la enfermedad, como la disminución del peso corporal o la longitud del colon tras 7 días

de tratamiento con 1% DSS.

78

Nuestros datos indican que la deleción de MT1-MMP endotelial preserva las

estructuras intestinales y mejora la progresión de los animales durante el desarrollo de

colitis inducida por DSS.

Figura 24. La deleción endotelial de MT1-MMP mejora la progresión clínica en colitis inducida

por DSS. A. Imágenes representativas de tinciones de hematoxilina/eosina del colon de ratones MT1f/f

y MT1iΔEC tratados durante 3 y 7 días con DSS al 1% y sus controles basales. La barra de escala

equivale a 50 µm. B. Proyecciones máximas de imágenes representativas de microscopía de

generación de segunda armónica donde se observa el colágeno fibrilar del plexo mucoso de ratones

MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 y 7 días con DSS al 1% y sus controles basales. La barra de escala

equivale a 40 µm. C. Evolución diaria del índice de colitis en animales MT1f/f y MT1iΔEC tratados con

1% DSS en el agua de bebida durante 7 días. n=19-24 por condición y genotipo en 4 experimentos

independientes.

79

2.2.7 MT1-MMP como diana terapéutica para el tratamiento de EII

Como se ha descrito, la deleción endotelial profiláctica de la proteína MT1-MMP

produjo una disminución del índice colitis, y otros marcadores de la enfermedad en

animales tratados durante 7 días con 1% DSS. Por esta razón, se decidió analizar el papel

de MT1-MMP como posible diana terapéutica en EII. Para testar esta hipótesis, se

delecionó MT1-MMP en ratones de la línea MT1-MMP (Mmp14)f/f VE-cadherin (Cdh5)-

CreERT2/+ una vez comenzada la inducción de la enfermedad, tras cuatro días de

tratamiento con 1% DSS en el agua de bebida. Se mantuvo a los ratones bajo tratamiento

con DSS durante un total de 15 días, siguiendo el diseño experimental mostrado en el

panel A de la Figura 25.

Durante los 15 días de tratamiento se analizó a diario la pérdida de peso y el índice

de colitis de los animales. Ambos marcadores fueron significativamente menores en los

animales MT1iΔEC a partir del día 12 de tratamiento indicando una mejor progresión de

los animales durante la enfermedad (Figura 25B,C). Además, tras 15 días de tratamiento,

los ratones fueron sacrificados y se cuantificó el número de eventos marcadores de

angiogénesis por intususcepción en el plexo mucoso. No se observaron diferencias

significativas en el número de estos eventos entre ambos genotipos (Figura 25D,E).

80

Figura 25. La deleción endotelial de MT1-MMP durante el desarrollo de colitis mejora la

progresión de los animales enfermos. A. Diseño experimental terapéutico incluyendo 15 días de

tratamiento con 1% DSS y la deleción de MT1-MMP por 5 inyecciones de 4-Hidroxitamoxifeno a

días 4-8 del transcurso de la enfermedad. B. Evolución diaria del peso corporal en animales MT1f/f y

MT1iΔEC durante el desarrollo de la enfermedad. n=12-13 animales por condición y genotipo de 3

experimentos independientes. C. Evolución diaria del índice de colitis en animales MT1f/f y MT1iΔEC

durante 15 días de enfermedad. n=12-13 animales por condición y genotipo de 3 experimentos

independientes. D. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la vasculatura del plexo

mucoso, procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 15 días con 1% DSS teñidos para

CD31. La barra de escala equivale a 40 µm. E. Cuantificación de los eventos de angiogénesis por

intususcepción en ratones MT1f/f y MT1iΔEC mostrados en D. n=10-11 animales por genotipo. En B y

C se realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA de dos colas con post-test de Benjamini-

Hochberg y en E se realizó t de Student. * p<0,05, ** p< 0,01, **** p<0,0001.

81

2.3 Papel de MT1-MMP endotelial durante la transducción de estímulos mecánicos

Se ha estudiado en numerosos trabajos la importancia de las señales mecánicas,

especialmente los cambios del flujo sanguíneo, durante la angiogénesis por

intususcepción 75. Dado que nuestros datos indican que MT1-MMP endotelial es un actor

necesario durante la inducción de angiogénesis por intususcepción y que ha sido

implicada en la respuesta de células endoteliales a flujo durante angiogénesis por brote

capilar 179, decidimos testar la posible función de la proteína MT1-MMP en la recepción

y transducción de estímulos mecánicos. MT1-MMP puede estar implicada tanto

formando parte del sistema de mecanorrecepción como en transmisión de señales

intracelulares y la posterior respuesta celular efectora a los estímulos producidos por los

cambios del flujo sanguíneo.

2.3.1 Efecto de la deleción de MT1-MMP en la recepción y transducción de señales

de flujo in vitro

En primer lugar, se analizó in vitro la implicación de MT1-MMP en la recepción

de señales producidas por cambios en el flujo sanguíneo. Para ello se utilizaron células

HUVECs tratadas con un ARN corto de interferencia (ARNi) para silenciar la expresión

de MT1-MMP o con un ARNi control (Ctrl-ARNi). Se testaron dos ARNi (MT1-ARNi#1

y MT1-ARNi#2) para el silenciamiento de la proteína MT1-MMP en células humanas, y

se analizó la eficiencia de ambos por qPCR a nivel de ARNm y Western blot a nivel de

proteína. El MT1-ARNi#2 mostró una eficiencia de deleción mayor en ambos análisis

por lo que decidimos realizar los experimentos de respuesta a flujo con este ANRi

(Figura 26).

82

Figura 26. Eficiencia del silenciamiento de MT1-MMP por ARNi en HUVECs. A. Western blot

representativo del silenciamiento de MT1-MMP en HUVECs por dos ARNi MT1-ARNi#1 y MT1-

ARNi#2 y su cuantificación. n=5. B. qPCR cuantitativa de la eficiencia de interferencia de MT1-MMP

por ambos ARNi en HUVECs. n=4. Se realizó el análisis estadístico con el método de la t de Student

para una muestra. *** p< 0,001, **** p<0,0001.

Las HUVECs interferidas para la expresión de MT1-MMP y control fueron

sometidas a un flujo laminar de 12 dynas/cm2 durante 12 horas usando el sistema Bioflux.

Se analizaron patrones de respuesta a flujo de células endoteliales como polarización

celular. Para esto, se usó la posición relativa del aparato de Golgi con respecto al núcleo

celular, pues se ha descrito que durante la migración este orgánulo se posiciona en la

región anterior al núcleo 224. Así, se tiñó por inmunofluorescencia el aparato de Golgi

usando el marcador GLG1 y se midió la dirección y sentido del vector que toma su origen

en el centro del núcleo y su extremo en el aparato de Golgi (Figura 27A). Las células

fueron clasificadas como polarizadas a favor de flujo, en contra o sin dirección, según lo

indicado en el esquema del panel B de la figura 27. No se obtuvieron diferencias

significativas en el porcentaje de células orientadas en cada una de las direcciones

(Figura 27C).

83

Figura 27. La ausencia de MT1-MMP en células endoteliales in vitro no altera su polarización en

respuesta a flujo laminar. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de HUVECs

control y silenciadas para la expresión de MT1-MMP sometidas a flujo laminar (12dynas/cm2) durante

12 horas, teñidas para Hoechst (azul), MT1-MMP (blanco) y GLG1 (rojo). La barra de escala equivale

a 20µm B. Esquema de la orientación mayoritaria del aparato de Golgi respecto la posición del núcleo

C. Cuantificación de la orientación del Aparato de Golgi con respecto del núcleo de células interferidas

para MT1-MMP y control, siguiendo el esquema de B para clasificarlas en contra, a favor del sentido

del flujo o sin dirección. n=3 experimentos de dos viales de HUVECs independientes. Se realizó el

análisis estadístico con el método de la ANOVA de dos colas con post-test de Benjamini-Hochberg.

2.3.2 Efecto de la deleción de MT1-MMP en la recepción y transducción de señales

de flujo in vivo

Seguidamente, se decidió testar el efecto de la deleción de MT1-MMP sobre la

recepción de los estímulos mecánicos en células endoteliales in vivo, usando como

modelo las células endoteliales de la aorta, que presenta flujo turbulento en la curvatura

menor del cayado aórtico y flujo laminar en la aorta torácica descendente (Figura 28A).

Primero, se analizó la expresión de MT1-MMP en las células endoteliales de estas

dos regiones de la aorta con diferentes flujos. Se utilizó la línea reportera de la actividad

del promotor de Mmp14 (descrito anteriormente). Se cuantificó por inmunofluorescencia

de tejido in toto el número de células con actividad del promotor de Mmp14 en ambas

zonas de la aorta, obteniendo una media de 35.25% células positivas en la zona sometida

84

a flujo turbulento y un 22.85% en aquellas zonas bajo flujo laminar (Figura 28B). Al

realizar la tinción de inmunofluorescencia para la proteína MT1-MMP, ésta apareció

expresada en la mayoría de las células, inclusive en aquellas sin actividad del promotor.

Estos resultados podrían indicar la activación fluctuante de la expresión de MT1-MMP

(Figura 28C).

Figura 28. Efecto del flujo turbulento y laminar sobre la expresión de MT1-MMP in vivo. A.

Esquema de la aorta, indicando el flujo turbulento en la curvatura menor y bifurcaciones y laminar en

la aorta torácica descendente. B. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la monocapa

endotelial en la curvatura menor y la región torácica descendente de aortas de ratones MT1-

MMP(Mmp14)lacz/+ teñidas in toto para CD31 (blanco) y β-galactosidasa (rojo). La barra de escala

equivale a 20 µm. C. Cuantificación del porcentaje de células positivas para β-galactosidasa en las

diferentes regiones de la aorta de B. n=5 ratones de 2 experimentos independientes. Se realizó el

análisis estadístico con el método de la t de Student pareada. D. Proyección máxima de una imagen

representativa de la capa endotelial de la aorta torácica descendente de un ratón MT1-

MMP(Mmp14)lacz/+ representativo teñida in toto para Hoechst (azul), β-galactosidasa (rojo), MT1-

MMP (verde) y CD31 (blanco).

85

A continuación, se decidió analizar el efecto de la deleción de MT1-MMP

endotelial bajo flujo laminar. Para ello se analizaron por inmunofluorescencia de tejido

in toto las aortas torácicas descendentes procedentes de animales de MT1iΔEC y MT1f/f,

tras dos semanas de la deleción de MT1-MMP por la inyección intraperitoneal de 4-

hidroxitamoxifeno durante 5 días (Figura 29A). Se comprobó por tinción para MT1-

MMP la eficacia de la deleción en este contexto (Figura 29B), y se analizó la

polarización, tamaño y elongación celular como marcadores de respuestas endoteliales a

flujo laminar.

Figura 29. Eficiencia de la deleción de MT1-MMP en el endotelio aórtico. A. Esquema del diseño

experimental de la deleción de MT1-MMP en el endotelio aórtico por la inyección de 4-

hidroxitamoxifeno (4-OHT). B. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la monocapa

endotelial de aortas torácicas descendientes procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC dos semanas

después de la deleción de MT1-MMP, teñidas para MT1-MMP (rojo) y CD31 (blanco). La barra de

escala equivale a 20 µm.

Para el análisis de la morfología celular en respuesta a flujo, se cuantificó el área

y el factor elíptico de las células endoteliales de las aortas de animales MT1iΔEC y MT1f/f,

teñidas para el marcador de uniones endoteliales CD31 (Figura 30A). Si bien no se

86

obtuvieron diferencias significativas en el área celular (Figura 30B), sí fueron observadas

en la elongación celular. El factor elíptico (calculado como eje celular menor partido eje

mayor) de las células de la aorta de ratones MT1f/f era significativamente menor,

indicando que estas células eran más alargadas que las procedentes de la aorta de ratones

MT1iΔEC (Figura 30C).

Figura 30. La deleción de MT1-MMP endotelial afecta a la elongación de las células endoteliales

aórticas sometidas a flujo laminar. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la

monocapa endotelial de aortas torácicas descendientes procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC 2

semanas después de la deleción de MT1-MMP, teñidas para CD31 (blanco). La barra de escala

equivale a 50 µm. B. C. Cuantificaciones del factor elíptico (B) y el área (C) de las células endoteliales

de las aortas mostradas en A. n=7 animales por genotipo. Se realizó el análisis estadístico con el

método de la t de Student. ** p< 0,01.

Finalmente, se analizó la polaridad celular utilizando el método ya descrito

anteriormente para células in vitro. Obtuvimos histogramas radiales de la dirección de

polarización celular similares en ambos genotipos (Figura 31A). Además, se clasificaron

las células en tres posibles orientaciones, en contra, a favor de flujo o sin dirección, sin

hallar ninguna diferencia significativa en cuanto a los porcentajes de células en cada una

de estas direcciones (Figura 31B).

87

En conclusión, nuestros datos indican que MT1-MMP está implicada en la

respuesta durante la adaptación celular a flujo sanguíneo regulando la elongación celular

pero no la polarización.

Figura 31. La deleción de MT1-MMP endotelial no afecta a la polarización de células endoteliales

aórticas sometidas a flujo laminar. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la capa

endotelial de aortas torácicas descendientes procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC dos semanas

después de la deleción de MT1-MMP, teñidas con CD31 (verde), Hoechst (blanco) y GLG1 (ROJO).

La barra de escala equivale a 20 µm. B. Histogramas radiales de los ángulos de orientación relativa

del aparato de Golgi con respecto del núcleo celular en A. C. Cuantificación de la orientación del

Aparato de Golgi con respecto del núcleo en A, clasificadas en contra, a favor de flujo o sin dirección

según el esquema de la figura 12B. n=5 ratones por genotipo de 2 experimentos independientes. Se

realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA de dos colas con post-test de Benjamini-

Hochberg.

2.4 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la vasodilatación

Está bien caracterizada la importancia de la vasodilatación causada por el aumento

del flujo sanguíneo durante la angiogénesis por intususcepción, por ello decidimos

analizar la posible función de la proteína MT1-MMP en vasodilatación, bien por formar

parte de la maquinaria de transducción de señales mecánicas como el flujo, o bien por ser

parte efectora en la propia dilatación vascular.

88

2.4.1 Efecto de la deleción endotelial de MT1-MMP sobre la vasodilatación en

músculo cremáster

Con el objetivo de analizar el efecto de la deleción de MT1-MMP sobre la

vasodilatación in vivo se usó como modelo el músculo cremáster de ratones MT1iΔEC y

MT1f/f estimulados con un potente vasodilatador, acetilcolina (ACh). La acetilcolina

aumenta el diámetro de los vasos sanguíneos actuando, al igual que el flujo, a través de

la producción de óxido nítrico. Este modelo nos permitió analizar por una parte la

vasodilatación de las arteriolas in vivo usando microscopía intravital, y por otra la

vasodilatación del plexo capilar por tinción de tejido in toto con el marcador endotelial

CD31.

Se midió el diámetro de las arteriolas antes de la estimulación con acetilcolina vía

intravenosa y en el punto máximo de vasodilatación (Figura 32A). No se observó

diferencia significativa en los diámetros iniciales de las arteriolas de los ratones MT1iΔEC

y MT1f/f (Figura 32B). Sin embargo, tras la administración de acetilcolina se observó

una vasodilatación significativamente mayor en las arteriolas de los ratones MT1f/f que

en los MT1iΔEC, los cuales presentaron una escasa respuesta a la estimulación con

acetilcolina, indicando un posible defecto en la producción de óxido nítrico o en proceso

efector de la vasodilatación (Figura 32C) (Videos 3 y 4).

89

Figura 32. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la vasodilatación de arteriolas in vivo.

A. Imágenes representativas de microscopía intravital de la vasculatura del músculo cremáster de

ratones MT1f/f y MT1iΔEC previas y tras el tratamiento con acetilcolina (ACh). A indica arteriola y V

indica vénula. Las flechas amarillas indican el diámetro arteriolar. La barra de escala equivale a 30

µm. B. Cuantificación del diámetro de las arteriolas del músculo cremáster mostradas en A, antes del

tratamiento con ACh. C. Cuantificación del incremento del diámetro de las arteriolas del músculo

cremáster mostradas en A. n=5-6 ratones por genotipo. Se realizó el análisis estadístico con el método

de la t de Student. ** p< 0,01.

Por otro lado, se cuantificó la vasodilatación del plexo capilar del músculo

cremáster. Se tiñeron por inmunofluorescencia de tejido in toto los músculos cremáster

de ratones de ambos genotipos, basales y tratados con acetilcolina durante 15 minutos. Se

observó una vasodilatación significativamente mayor en los capilares de ratones MT1f/f

tratados con acetilcolina que en aquellos MT1iΔEC con el mismo tratamiento (Figura

33A,B).

Para comprobar si MT1-MMP está implicada en la producción de óxido nítrico o

es parte de la maquinaria efectora de la vasodilatación, se decidió analizar la

vasodilatación del plexo capilar por la administración del donador de óxido nítrico,

DEANO. Se inyectó DEANO vía intravenosa 10 minutos después de estimulación con

acetilcolina, y se diseccionaron los músculos cremáster tras 15 minutos. Los músculos

fueron teñidos siguiendo el mismo protocolo que los animales tratados con acetilcolina y

se observó un aumento estadísticamente significativo en la vasodilatación de ambos

genotipos (Figura 33A,B).

Estos resultados indicaron que MT1-MMP es requerida para la vasodilatación de

capilares y arteriolas, implicándola en el proceso de producción de óxido nítrico.

90

Figura 33. La deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la vasodilatación de capilares

dependiente de óxido nítrico in vivo. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la

vasculatura capilar de músculos cremásteres procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC basales y

tratados con el vasodilatador ACh durante 15 minutos o con ACh (10 minutos) y el donador de NO,

DEANO (15 minutos) teñidos por inmunofluorescencia in toto para CD31 (blanco). B. Cuantificación

del diámetro de los capilares del músculo cremáster mostrados en A. La barra de escala equivale a 25

µm. n=5-8 ratones por condición y genotipo en 4 experimentos independientes. Se realizó el análisis

estadístico con el método de la ANOVA de una cola con post-test de Benjamini-Hochberg. * p<0,05,

** p< 0,01, *** p< 0,001, **** p<0,0001.

2.4.2 Función de MT1-MMP durante la producción de óxido nítrico in vitro

Con el objetivo de confirmar el efecto de la deleción de MT1-MMP sobre la

producción de óxido nítrico, se analizó su producción en células endoteliales de aorta de

ratón (MAEC) procedentes de animales MT1iΔEC y MT1f/f, usando la sonda fluorescente

DAF-FM. Se observó a nivel de célula única la disminución de la producción de óxido

nítrico en MAECs procedentes de ratones MT1iΔEC respecto a las procedentes de animales

MT1f/f (Figura 34A). Se testó usando el mismo método la producción de óxido nítrico en

91

HUVECs interferidas para la expresión de MT1-MMP mediante el MT1-ARNi#2 o Ctrl-

ARNi. Al igual que en el caso de las MAEC, las HUVECs silenciadas para la expresión

de MT1-MMP mostraron una menor producción de óxido nítrico que aquellas interferidas

con el ARNi control (Figura 34B).

Decidimos continuar usando el modelo de HUVECs interferidas para la expresión

de MT1-MMP para el estudio de la participación de MT1-MMP en la producción de

óxido nítrico en células endoteliales. Se analizaron por Western blot la expresión de MT1-

MMP y eNOS, principal proteína productora de óxido nítrico en células endoteliales. Se

observó una disminución de la expresión de eNOS a nivel de proteína en las células

interferidas para MT1-MMP con dos ARNi diferentes (Figura 34C). Además, se

comprobó la bajada de expresión de eNOS (NOS3) a nivel de ARNm por qPCR, en las

células tratadas con ambos ARNi.

Estos datos en conjunto indican que la deleción de la expresión de MT1-MMP en

células endoteliales disminuye la producción de óxido nítrico a través de la menor

expresión de eNOS.

92

Figura 34. La deleción de MT1-MMP en células endoteliales disminuye la producción de óxido

nítrico y la expresión de eNOS. A. Imágenes representativas de microscopía de MAECs teñidas para

la producción de óxido nítrico por la sonda fluorescente DAF-FM (pseudocolor, panel izquierdo) y la

cuantificación de su intensidad de fluorescencia media (IFM) a nivel de célula única (panel derecho).

n=263-266 células en 3 experimentos independientes. La barra de escala equivale a 25 µm B. Imágenes

representativas de microscopía de HUVECs control (Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-

ARNi#2) teñidas para la producción de óxido nítrico por la sonda fluorescente DAF-FM (pseudocolor,

panel izquierdo) y la cuantificación de su IFM a nivel de célula única (panel derecho). n= 637-879 en

3 experimentos independientes. La barra de escala equivale a 50 µm C. Western blot representativo

de la expresión de la proteína eNOS en HUVECs control (Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP

(MT1-ARNi#1 y MT1-ARNi#2) y su cuantificación. n=5. D. qPCR cuantitativa de la expresión del

ARNm de NOS3 (eNOS) en HUVECs control (Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-

ARNi#1 y MT1-ARNi#2). n=4. En A y B se realizó el análisis estadístico con el método de Mann-

Whitney, en C y D se realizó con el método de la t de Student para una muestra. *** p< 0,001, ****

p<0,0001.

93

2.5 Función de los dominios catalítico y citoplasmático de MT1-MMP durante la

angiogénesis por intususcepción y la producción de óxido nítrico

2.5.1 Función de los dominios catalítico y citoplasmático durante la angiogénesis por

intususcepción in vivo

Como ya se ha descrito en la introducción, la región extracelular de MT1-MMP

ha sido caracterizada por su poder proteolítico con numerosas dianas entre proteínas de

la matriz extracelular y proteínas de membrana, mientras que la región citosólica de MT1-

MMP, especialmente la tirosina 573, ha sido implicada en procesos de señalización

celular 148,170.

Con el fin de determinar qué dominio de la proteína MT1-MMP está implicado

en el proceso de angiogénesis por intususcepción y por tanto en la progresión de la colitis

se utilizaron tres construcciones lentivirales que expresan bajo el promotor SFFV

distintas formas de MT1-MMP: la secuencia completa de la proteína MT1-MMP (SC),

con una mutación en la región extracelular de la proteína que impide su función catalítica

(E240A), o con una mutación en la región citosólica (Y573F), la tirosina implicada en las

diferentes rutas de señalización intracelular 167. Además, bajo control de este mismo

promotor se expresa la proteína GFP, que fue usada como control de la eficiencia de

transducción (Figura 35A).

Se inyectaron 200 µl de los lentivirus descritos a una concentración de 1x107

colonias lentivirales por ml a ratones MT1iΔEC a través de la vena yugular. Tres días

después de la inyección de los lentivirus se inició el protocolo de deleción endotelial de

MT1-MMP a través de la inyección intraperitoneal diaria de 4-hidroxitamoxifeno durante

5 días, y se comenzó la inducción de colitis con la administración de 1% DSS en el agua

de bebida según el esquema mostrado en el panel B de la figura 35. Además, ratones

MT1iΔEC y MT1f/f fueron transducidos siguiendo el mismo protocolo con lentivirus

control (Mock) sin ninguna de las secuencias de MT1-MMP, como control de que la

transducción lentiviral no modificaba la angiogénesis por intususcepción o la progresión

de la enfermedad.

Tras 3 días de exposición al químico, los animales fueron sacrificados y se

realizaron tinciones por inmunofluorescencia de tejido in toto del colon. Se comprobó la

eficiencia de transducción por Western blot de GFP de lisado total de un fragmento de

94

intestino, y aquellos animales que no expresaban GFP en el intestino fueron excluidos de

los análisis finales (Figura 35C).

La cuantificación de los eventos marcadores de angiogénesis por intususcepción

en la vasculatura del plexo mucoso de ratones transducidos con los lentivirus de las tres

secuencias de MT1-MMP, mostró un aumento de la angiogénesis por intususcepción en

los ratones transducidos con la secuencia completa de MT1-MMP y la mutación

citosólica Y573F. Sin embargo, aquellos ratones transducidos con el lentivirus de la

mutación E240A, inhibidora de la actividad catalítica, no mostraron un aumento

significativo de los marcadores de angiogénesis por intususcepción (Figura 36A,B).

Figura 35. Estrategia de transducción lentiviral in

vivo. A. Esquema de la construcción lentiviral usada

para la expresión de MT1-MMP y la proteína verde

fluorescente (GFP) bajo el promotor SFFV. Se expresó

la secuencia completa MT1-MMP (SC), y sus

mutaciones E240A (catalítica) e Y573F (citosólico). B.

Diseño experimental para la transducción lentiviral de

animales MT1f/f y MT1iΔEC y la inducción de colitis con

1% DSS ad libitum en el agua de bebida durante 3 días.

C. Western blot representativo de la eficiencia de

transducción de los lentivirus mostrados en A en

extractos de colon de ratones MT1iΔE.

96

Figura 36. La función catalítica de la proteína MT1-MMP es esencial para la producción de

angiogénesis por intususcepción. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la

vasculatura del plexo mucoso, procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC transducidos con el virus

control (Mock) tratados durante 3 días con 1% DSS y sus controles basales teñidos con CD31 (blanco).

La barra de escala equivale a 40 µm. B. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la

vasculatura del plexo mucoso, procedentes de ratones MT1iΔEC tratados durante 3 días con 1% DSS y

transducidos con lentivirus para la expresión de MT1-MMP total, MT1-MMP E240A o MT1-MMP

Y573F. C. Cuantificación de los eventos de angiogénesis por intususcepción en ratones MT1f/f y

MT1iΔEC mostrados en A y B. n=5-8 ratones por condición y genotipo en 2 experimentos

independientes. Se realizó el análisis estadístico con el método de ANOVA de una cola con post-test

de Benjamini-Hochberg. * p<0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001.

2.5.2 Función del dominio catalítico de MT1-MMP durante la producción de óxido

nítrico in vitro.

A continuación, se decidió analizar la implicación del dominio catalítico de MT1-

MMP en la producción directa de óxido nítrico en células in vitro. Con este objetivo se

analizó la producción de óxido nítrico en HUVECs tratadas con el anticuerpo inhibidor

de la actividad de MT1-MMP, LEM-2/15 171. Como control, se usaron células HUVECs

interferidas para la expresión de MT1-MMP mediante el MT1-ARNi#2 previamente

testado. Se observó una disminución significativa de la producción de óxido nítrico en las

HUVECs tratadas con el anticuerpo inhibidor respecto a las células control y a aquellas

células tratadas con un anticuerpo control del mismo isotipo. Mientras que el anticuerpo

LEM-2/15 no tuvo ningún efecto sobre la producción de óxido nítrico de las células

interferidas para la expresión de MT1-MMP (Figura 37).

Figura 37. La función catalítica de MT1-MMP es requerida para la producción de óxido nítrico

en células endoteliales in vitro. Cuantificación de la producción de óxido nítrico, a través de la IFM

de la sonda DAF-FM a nivel de célula única, en HUVECs control y silenciadas para MT1-MMP

tratadas con el anticuerpo inhibidor de la actividad catalítica de MT1-MMP, LEM-2/15 o su IgG1

control (IgG). n=128-360 células por condición en 3 experimentos independientes. Se realizó el

análisis estadístico con el método de Mann-Whitney. **** p<0,0001. Los * representan diferencias

significativas con el control no tratado. Las # representan diferencias significativas con el control de

isotipo.

97

Nuestros resultados demuestran que la actividad proteolítica de MT1-MMP

endotelial es requerida para la inducción de angiogénesis por intususcepción durante la

colitis inducida por DSS in vivo y para la producción de óxido nítrico por células

endoteliales in vitro.

2.6 Caracterización de trombospondina 1 como sustrato de MT1-MMP

A la luz de estos resultados, decidimos analizar la implicación de los sustratos de

MT1-MMP en la producción de óxido nítrico y angiogénesis por intususcepción. La

proteína trombospondina 1 (TSP1) ha sido descrita previamente como sustrato de MT1-

MMP e implicada en la regulación de la producción de óxido nítrico en diferentes

contextos a través de la unión con sus receptores de membrana. Además, ha sido

propuesta como posible regulador de la angiogénesis por intususcepción. Datos previos

de nuestro laboratorio mostraron a MT1-MMP implicada en el corte de la proteína TSP1

en células endoteliales estimuladas con TNFα 148, contexto inflamatorio comparable al de

las EII. Por todo ello, se decidió estudiar la función de TSP1 como sustrato de MT1-MMP

durante la producción de óxido nítrico y angiogénesis por intususcepción.

TSP1 es una proteína capaz de formar trímeros presente en la matriz extracelular,

con efectos pleiotrópicos sobre la angiogénesis, si bien es habitualmente considerada una

molécula anti-angiogénica. Se ha descrito TSP1 como ligando de diferentes receptores de

membrana expresados en células endoteliales como CD36 y CD47/IAP e integrinas como

β1 y αvβ3 225 (Figura 38A).

2.6.1 Modelado in silico del corte de TSP1 por MT1-MMP

Aunque TSP1 ha sido reconocida anteriormente como sustrato de MT1-MMP, su

sitio de corte continúa siendo desconocido. Con el objetivo de identificar los posibles

sitios de corte para MT1-MMP en la proteína TSP1 se utilizó el software online

Cleavpredict (http://cleavpredict.sanfordburnham.org). Las predicciones de este software

fueron analizadas por modelado de proteína in silico hallando tan solo dos posiciones

probables para el corte de TSP1 por parte de MT1-MMP, H441W y/o P467Q. Ambas

posiciones, muy cercanas entre ellas, obtuvieron además una puntuación para P1’P1 de

4/1 y 8/6 respectivamente de acuerdo con la matriz proteolítica para MT1-MMP en la

base de datos online MEROPS (Figura 38B). Las posibles secuencias de corte de TSP1

aparecen resumidas en la tabla 7.

http://cleavpredict.sanfordburnham.org/

98

P1

posici

ón

Residuos

PWM

Puntu

ación

Sec Struct pred Dominio

Transmemb N-masa C-masa

6 GLAWG-

LGVLF 3.71 ____HHHEEE

OOOOOO

OOOO 633.28 128683.54

11 LGVLF-

LMHVC 5.27 HHEEEEEEE_

OOOOOO

OOOO 1162.60 128154.22

93 LLLAS-

LRQMK 6.64 HHHHHHHHHH

OOOOOO

OOOO 9933.05 119383.77

193 RDLAS-

IARLR 1.17 HHHHHHHHHH

OOOOOO

OOOO 21025.78 108291.04

225 TTPED-

ILRNK 3.00 _____EE___

OOOOOO

OOOO 24538.63 104778.19

253 GSSPA-

IRTNY 0.54 _____EEEE_

OOOOOO

OOOO 27366.04 101950.78

286 LELRG-

LRTIV 7.90 HHHH___EEE

OOOOOO

OOOO 31010.84 98305.98

440 GGWSH-

WSPWS 1.33 __________

OOOOOO

OOOO 48377.51 80939.31

467 NSPSP-

QMNGK 1.11 __________

OOOOOO

OOOO 51266.82 78050.00

578 ACPPG-

YSGNG 0.89 __________

OOOOOO

OOOO 62958.91 66357.91

668 NYLGH-

YSDPM 1.56 __________

OOOOOO

OOOO 72791.09 56525.73

1024 DDYAG-

FVFGY 0.75 ____EEEEEE

OOOOOO

OOOO 112343.48 16973.34

1060 QGYSG-

LSVKV 4.42 _____EEEEE

OOOOOO

OOOO 116595.46 12721.36

1075 GPGEH-

LRNAL 1.85 _____EEEEE

OOOOOO

OOOO 118101.23 11215.59

1092 GQVRT-

LWHDP 1.76 _EEEEEE___

OOOOOO

OOOO 120003.22 9313.60

1099 HDPRH-

IGWKD 5.66 _________H

OOOOOO

OOOO 120944.68 8372.14

Tabla 7. Lista de potenciales secuencias de corte de MT1-MMP en TSP1. Se muestran las

secuencias de TSP1 acompañadas de su puntuación de corte por la acción de MT1-MMP.

99

Figura 38. Caracterización in silico del corte de TSP1 por MT1-MMP. A. Esquema de la estructura

de la proteína TSP1 y sus secuencias de unión a receptores de membrana presentes en células

endoteliales. La flecha roja indica los posibles sitios de corte por MT1-MMP. B. Modelado in silico

del corte de TSP1 por parte de MT1-MMP en las posiciones H441W y P477Q. En azul y naranja se

muestran los monómeros de MT1-MMP, con el sitio catalítico en amarillo, en verde se muestra TSP1,

con la posición de corte en rojo.

2.6.2 Caracterización del corte de TSP1 por MT1-MMP in vivo durante colitis

inducida por DSS

Con el objetivo de analizar el corte de TSP1 por parte de MT1-MMP in vivo, se

analizó la acumulación de TPS1 en torno a los vasos sanguíneos en ratones MT1iΔEC y

MT1f/f tratados durante 3 días con 1% DSS. Se tiñeron cortes trasversales de colon

procedentes de ratones MT1iΔEC y MT1f/f por inmunofluorescencia usando un anticuerpo

que reconoce específicamente la región amino terminal, con respecto a las probables

posiciones catalíticas de MT1-MMP, de la proteína TSP1 (Figura 38A). Se ha descrito

en el caso del corte de TSP1 por ADAMTS1 que este dominio amino terminal de TSP1

es degradado en el tejido mientras la región carboxilo terminal de la proteína es liberada

226. Se observó una acumulación significativamente mayor de TSP1 en torno a los vasos

sanguíneos del colon de ratones MT1iΔEC con respecto a los ratones control MT1f/f

(Figura 39 A,B).

100

Figura 39. La deleción endotelial de MT1-MMP induce la acumulación perivascular de TSP1

durante la colitis. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de microscopía confocal de

cortes transversales de intestino procedentes de ratones MT1f/f y MT1iΔEC tratados durante 3 días con

1% DSS, teñidos para CD31 (verde) y TSP1 (rojo). Imagen de la pared intestinal (paneles izquierdos)

y vista en detalle de un vaso sanguíneo (paneles centrales y derechos). La barra de escala indica 100

µm en la imagen general y 10 µm en el detalle. B. Cuantificación de la Intensidad de fluorescencia

media (IFM) de TSP1 alrededor de los vasos sanguíneo en A. n=4 individuos por genotipo. Se realizó

el análisis estadístico con el método de la t de Student. * p<0,05.

2.6.3 Caracterización in vitro del corte de TSP1 por MT1-MMP

Resultados previos del laboratorio demostraron la acumulación de TSP1 en

células endoteliales silenciadas para la expresión de MT1-MMP estimuladas con TNFα

148. Se analizó este evento bajo las condiciones en que hemos observado la bajada en la

producción de óxido nítrico. Así, cultivamos HUVECs silenciadas para la expresión de

MT1-MMP y control durante 36 horas en el medio comercial EGM2 y se realizaron

tinciones de inmunoflorescencia para TSP1. Se observó una acumulación de TPS1 en las

células silenciadas para MT1-MMP con respecto a las células control (Figura 40).

101

En resumen, nuestros resultados combinando experimentos in vivo, in vitro e in

silico sugieren el corte proteolítico de TSP1 por parte de MT1-MMP.

Figura 40. El silenciamiento de la expresión de MT1-MMP produce una acumulación de TSP1

en HUVECs in vitro. Proyecciones máximas de imágenes representativas de HUVECs control (Ctrl-

ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2) cultivadas durante 24 horas y teñidas para MT1-

MMP (blanco), TSP1 (rojo), faloidina (verde) y Hoechst (azul).

2.7 Función de MT1-MMP/TSP1 durante la producción de óxido nítrico in vitro

1.7.1 Efecto de TSP1 sobre la producción de óxido nítrico in vitro

Analizamos el efecto de TSP1 sobre la producción de óxido nítrico en presencia

o ausencia de MT1-MMP. Se cuantificó la producción de óxido nítrico en HUVECs

control e interferidas para la expresión de MT1-MMP cultivadas sobre una matriz de

gelatina enriquecida con TSP1 (200 ng/ml). Observamos un fuerte aumento en la

producción de óxido nítrico en las HUVECs control. Las células interferidas para la

expresión de MT1-MMMP también aumentaron significativamente la producción de

óxido nítrico, aunque en menor proporción que las células control (Figura 41A). Estos

datos indican que TSP1 puede incrementar la producción de óxido nítrico en células que

expresan MT1-MMP.

102

2.7.2 Caracterización de la función de los receptores de TSP1 durante la producción

de óxido nítrico

Posteriormente se analizó la función de los receptores de TSP1 en la producción

de óxido nítrico. Se ha descrito la interacción de TSP1 con receptores capaces de

modificar la vía de producción de óxido nítrico, como CD36, CD47/IAP y la integrina

αvβ3 250,251. La participación de CD36 fue descartada debido a que la secuencia de unión

a este receptor en TSP1 está localizada cercana al corte de MT1-MMP, quedando a priori

inhabilitada tras el corte. Por ello se decidió estudiar el papel de CD47/IAP y la integrina

αvβ3.

Para abordar este objetivo se utilizaron HUVECs interferidas para la expresión de

MT1-MMP con el MT1-ARNi#2 o el Ctrl-ARNi y se analizó la producción de óxido

nítrico a nivel de célula única bajo el efecto de diferentes inhibidores mediante la sonda

fluorescente de óxido nítrico DAF-FM. En primer lugar, se inhibió la unión de TSP1 a

CD47 o αvβ3 con dos anticuerpos bloqueantes de dicha unión, y se utilizó la IgG del

mismo isotipo como control. Se observó una bajada estadísticamente significativa de la

producción de óxido nítrico en HUVECs control con ambos tratamientos. Por el contrario,

la producción de óxido nítrico en células interferidas para MT1-MMP permaneció

constante tras el tratamiento con ambos anticuerpos (Figura 42A).

Ante estos resultados se decidió continuar caracterizando la función de la integrina

αvβ3 en la producción de óxido nítrico. Para ello, se bloqueó la unión de TSP1 a la

integrina con los péptidos RGDS y cilengitide, (basado en el péptido cíclico cyclo-

RGDfV) que se unen a αvβ3 desplazando la unión de la integrina con sus sustratos. Estos

dos péptidos han sido descritos como inhibidores de la acción de la integrina αvβ3 durante

Figura 41. TSP1 incrementa la producción de

óxido nítrico en células endoteliales in vitro. A.

Cuantificación de la producción de óxido nítrico, a

través de la IFM de la sonda DAF-FM a nivel de

célula única, en HUVECs control (Ctrl-ARNi) y

silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2)

cultivadas sobre gelatina suplementada con TSP1

(200 ng/ml) o únicamente sobre gelatina. n=78-

184 células por condición de 3 experimentos

independientes. Se realizó el análisis estadístico

con el método de Mann-Whitney. ** p<0,01, ****

p<0,0001.

103

la angiogénesis a elevadas concentraciones pero también como activadores a bajas, por

ello se decidió usar ambos rangos de concentración 227.

Figura 42. El bloqueo del receptor de membrana CD47/IAP y de la integrina αvβ3 disminuye la

producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro. A. Cuantificación de la producción de

óxido nítrico, a través de la IFM de la sonda DAF-FM a nivel de célula única, en HUVECs control

(Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2) tratadas con anticuerpos bloqueantes de

CD47 y αvβ3 a la unión de TSP1 (1µg/ml y 10 µg/ml respectivamente durante 24 h) o sus controles

de isotipo (IgG). n=78-184 células por condición de 3 experimentos independientes. B. C.

Cuantificación de la producción de óxido nítrico, a través de la IFM de la sonda DAF-FM a nivel de

célula única, en HUVECs control (Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2) tratadas

con el péptido inhibidor de αvβ3 (RGDS) y su control (RADS) (B) o el péptido cíclico inhibidor de

αvβ3 cilengitide (C). n=100-385 células por condición de 3 experimentos independientes. Se realizó

el análisis estadístico con el método de Mann-Whitney. **** p<0,0001. Los * representan diferencias

significativas con el control de células no tratado. Las # representan diferencias significativas con el

control de isotipo o péptido control correspondiente a la muestra.

104

Ambos péptidos inhibieron significativamente a las dos concentraciones usadas la

producción de óxido nítrico en HUVECs control en comparación con las células no

tratadas y las tratadas con el péptido control RDAS. Sin embargo, no causaron cambios

en la producción de óxido nítrico de HUVECs interferidas para la expresión de MT1-

MMP (Figura 42B,C).

Con el objetivo de analizar el efecto específico de la unión de TSP1 a αvβ3 sobre

la producción de óxido nítrico, se sintetizó la secuencia de unión de TSP1 a la integrina,

el nonámero GDGRGDACK, y un nonámero control GDGRADACK. Se analizó su

efecto a dos rangos de concentraciones sobre la producción de óxido nítrico en HUVECs

control e interferidas para la expresión de MT1-MMP.

El nonámero procedente de la secuencia de TSP1, pero no el control, inhibió a

ambas concentraciones la producción de óxido nítrico en células control, sin efecto en

células interferidas para la expresión de MT1-MMP (Figura 43B).

Estos resultados en conjunto indicaron que el fragmento liberado por MT1-MMP

a través del corte proteolítico de TSP1 activa la producción de óxido nítrico a través de

CD47(IAP)/integrina αvβ3.

Figura 43. El nonámero basado en la secuencia de unión de TSP1 a la integrina αvβ3 disminuye

la producción de óxido nítrico en células endoteliales in vitro. A. Cuantificación de la producción

de óxido nítrico, a través de la IFM de la sonda DAF-FM a nivel de célula única, en HUVECs control

(Ctrl-ARNi) y silenciadas para MT1-MMP (MT1-ARNi#2) tratadas con el péptido GDGRGDACK

procedente de la secuencia de unión de TSP1 a αvβ3 o el péptido control GDGRADACK. n=149-337

células por condición de 3 experimentos independientes. Se realizó el análisis estadístico con el

método de Mann-Whitney. **** p<0,0001. Los * representan diferencias significativas con el control

de células no tratado. Las # representan diferencias significativas con el péptido control

correspondiente a la muestra.

105

2.8 Impacto funcional de la inhibición de la unión de TSP1 a la integrina αvβ3 sobre

la angiogénesis por intususcepción

El siguiente objetivo fue analizar el impacto funcional de la señalización de TSP1

a través de la integrina αvβ3 en angiogénesis por intususcepción en el contexto de colitis.

Para ello, se indujo colitis moderada en ratones MT1f/f por administración de 1% DSS en

el agua de bebida ad libitum durante 3 días. Estos animales fueron tratados con el

nonámero GDGRGDACK o su control, GDGRADACK durante los 3 días de inducción

de la enfermedad mediante el injerto subcutáneo de bombas osmóticas que administraron

100mg/kg de nonámero al día de manera continua.

Tras tres días de tratamiento los ratones fueron sacrificados y se analizó la

estructura del plexo mucoso del colon por inmunofluorescencia de tejido in toto de CD31,

cuantificando el número de eventos de angiogénesis por intususcepción. Los animales

tratados con el nonámero presentaron significativamente un menor número de eventos

que los tratados con el nonámero control (Figura 44A).

Además, se caracterizó la conservación del plexo por el análisis de las fibras de

colágeno a través de microscopía de generación de segunda armónica. Se observó el

aumento de las fibras de colágeno en los animales tratados con el péptido control.

106

Figura 44. El bloqueo de la unión de TSP1 a la integrina αvβ3 disminuye la angiogénesis por

intususcepción in vivo. A. Proyecciones máximas de imágenes representativas de la vasculatura del

plexo mucoso, procedentes de ratones MT1f/f tratados durante 3 días con 1% DSS en el agua de bebida

y 100mg/kg/día del péptido GDGRGDACK o su control GDGRADACK a través de una bomba

osmótica subcutánea, teñidos con CD31. B. Cuantificación de los eventos de angiogénesis por

intususcepción en los ratones MT1f/f mostrados en A. n=5-6 animales por condición y genotipo de 2

experimentos independientes. C. Proyecciones máximas de imágenes representativas de generación

de segunda armónica donde puede observarse el colágeno fibrilar del plexo mucoso de ratones MT1f/f

tratados durante 3 días con 1% DSS en agua de bebida y el péptido GDGRGDACK o su control

GDGRADACK a través de una bomba osmótica. La barra de escala equivale a 40 µm. Se realizó el

análisis estadístico con el método de la t de Student. **p< 0,05.

2.9 Implicación de MT1-MMP durante la patogénesis de EII Humanas

Nuestro modelo ha tratado de mimetizar el efecto de las EII crónicas humanas (EC

y CU) en ratones tratados con DSS. Por ello, el siguiente paso fue analizar la presencia

de MT1-MMP en estas enfermedades comprobando el aumento de la expresión de MT1-

MMP endotelial en biopsias de pacientes con EII por inmunofluorescencia de tejido in

toto (Figura 45A). Además, se analizó la expresión de MT1-MMP a nivel de ARNm por

qPCR cuantitativa observando un aumento de la expresión en biopsias de regiones

intestinales afectadas por la enfermedad con respecto a biopsias de regiones control

107

(Figura 45B). Tinciones de TSP1 en secciones de biopsias de pacientes con EII

mostraron un aumento de la expresión de TSP1 en áreas afectadas por la enfermedad

(Figura 45C).

108

Figura 45. Caracterización de la expresión de MT1-MMP durante EII humana. A. Proyecciones

máximas de imágenes representativas de biopsias intestinales humanas procedentes de pacientes con

EII en regiones afectadas y no afectadas del colon, teñidas in toto para MT1-MMP (rojo), CD34

(verde) y Hoechst (azul). La barra de escala equivale a 50 µm. B. qPCR cuantitativa de la expresión

de MT1-MMP (MMP14) en biopsias intestinales humanas procedentes de pacientes con EII C.

Proyecciones máximas de imágenes de microscopía confocal representativas de áreas afectadas y no

afectadas de cortes de biopsias intestinales humanas procedentes de pacientes con EII, teñidas para

TSP1 (rojo), CD31 (blanco) y Hoechst (azul). La barra de escala equivale a 100 µm D. Proyecciones

máximas de imágenes representativas de microscopía de generación de segunda armónica en las que

se observa el colágeno fibrilar del plexo mucoso de biopsias intestinales humanas procedentes de

pacientes con EII.

Por otro lado, se caracterizó la conservación de la estructura del plexo mucoso en

biopsias de CU y sanas usando la técnica de generación de segunda armónica. Se observó

un aumento del número de fibras de colágeno en los individuos enfermos, similar al de

modelos animales de colitis como el usado por nosotros (Figura 45C).

Estos datos indicaron la regulación de MT1-MMP y TSP1 endotelial en el

transcurso de EII humanas.

109

Discusión

111

1 Papel de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación de células endoteliales en

células líder y tallo durante angiogénesis por brote capilar

1.1 Inducción de oscilaciones de Ca2+ en células líder y tallo

Durante el primer capítulo del presente trabajo hemos analizado la respuesta de

las células endoteliales a los estímulos angiogénicos VEGF y TNFα a través de la

modificación de la frecuencia y amplitud de las oscilaciones de Ca2+. Hemos identificado

dos tipos de oscilaciones de Ca2+ en respuesta a VEGF. El primer tipo de respuesta, un

gran pico de Ca2+ al inicio de la estimulación con VEGF, es mayoritaria a elevadas dosis

de VEGF, que incrementan la expresión de marcadores génicos de células líder. Además,

Noren y colaboradores han asociado estas oscilaciones de Ca2+ a la activación de MLCK

y migración celular características de la célula líder 70. El segundo tipo de respuesta en el

que las células presentan numerosas oscilaciones de Ca2+, es mayoritario a bajas dosis de

VEGF. Si bien nosotros no hemos observado regulación génica de marcadores de célula

tallo en este tratamiento, Noren y colaboradores lo asociaron a la activación de NFAT y

la proliferación celular, características de la célula tallo 70.

Por tanto, altas dosis de VEGF inducen la especificación de las células

endoteliales en células líder a la que se asocia una respuesta de Ca2+ determinada,

mientras que dosis más bajas inducen la especificación en células tallo asociadas a

oscilaciones de Ca2+ diferentes. Este resultado concuerda con lo observado en situaciones

fisiológicas, donde un brote capilar está sometido a un gradiente de concentración de

VEGF, la célula líder del brote capilar es estimulada a una mayor concentración de VEGF

que las tallo. Sin embargo, el comportamiento de las células endoteliales no es totalmente

binario. Presentan también oscilaciones de Ca2+ intermedias entre ambos tipos de

oscilación, que pueden indicar fenotipos celulares intermedios, como los de la primera

célula tallo de un brote capilar que compite por la posición de célula líder 50.

La estimulación con TNFα induce oscilaciones de Ca2+ de alta frecuencia

similares a las causadas por bajas concentraciones de VEGF, pero más rápidas. Estas

oscilaciones son comparables a las descritas por Yokota y colaboradores en la célula líder

de los brotes capilares de la aorta dorsal de pez cebra durante el desarrollo de la

vasculatura, donde células líder y tallo presentan oscilaciones de Ca2+ similares pero de

mayor frecuencia en las células líder 70,73.

112

La producción de dos respuestas diferentes por oscilaciones de Ca2+ a un estímulo

requiere la participación de distintas rutas de señalización y canales de Ca2+. Hemos

observado que si bien la entrada de Ca2+ extracelular es necesaria para ambos fenotipos,

la participación de ORAI1 sólo es requerida por parte de la respuesta propia de células

líder. Estudios anteriores han observado cómo el silenciamiento de la expresión de

ORAI1 en HUVECs inhibe la entrada de Ca2+ por la estimulación de altas dosis de VEGF

a nivel poblacional, disminuyendo la migración y proliferación en células endoteliales y

la angiogénesis in vitro e in vivo 65,228. Sin embargo, el bloqueo de otros canales de Ca2+

de la membrana plasmática como los canales iónicos receptores de potencial transitorio

1 y 6 (TRPC1 y 6), no inhibió dicha entrada de Ca2+. Nosotros proponemos que los dos

tipos de oscilaciones de Ca2+ están guiados por diferentes canales de Ca2+, ORAI1 es el

principal canal en oscilaciones de células líder, pero las oscilaciones de Ca2+ en células

tallo podrían ser dirigidas mayoritariamente por otros canales presentes en las células

endoteliales como TRPCs y TRPVs. El silenciamiento de la expresión de TRPC6 o la

transfección con su dominante negativo ha demostrado el papel de este canal en células

endoteliales durante la división celular y la angiogénesis 229. Además, de acuerdo con

nuestra hipótesis se ha observado que la sobreexpresión de TRPC6 promueve la

angiogénesis sin necesidad de VEGF externo, respondiendo a bajas concentraciones del

factor de crecimiento 229. En esta misma línea, estudios en células humanas embrionarias

de riñón combinando experimentos in vitro e in silico han propuesto que variaciones

estocásticas de los niveles de expresión de los canales de Ca2+, a nivel de célula única son

capaces de producir respuestas celulares diferentes ante un mismo estímulo. 230,231

En cuanto al papel de las PLCs, nuestros resultados demuestran que las diferentes

dosis de VEGF utilizadas generan diferentes dinámicas de activación por fosforilación de

la PLCγ1 en línea con los resultados obtenidos por Fearnley y colaboradores al tratar

células endoteliales con las distintas concentraciones de las isoformas de VEGF 165 y

121 61. Estos datos correlacionan con el tipo de oscilación de Ca2+ mayoritario en ambos

tratamientos. Estudios futuros son necesarios para el análisis en profundidad del papel de

la PLCβ3 sobre estas oscilaciones de Ca2+, cuya fosforilación ha sido asociada in vitro a

la disminución de la migración y aumento de la proliferación, proponiéndola como

posible marcador de células líder 63.

113

1.2 Papel de la vía Dll4/Notch durante las oscilaciones de Ca2+ inducidas por VEGF

Nuestros resultados indican un efecto regulador de la vía Dll4/Notch sobre las

oscilaciones de Ca2+ producidas en respuesta a VEGF. La incubación de nuestras células

con DAPT disminuyó el número de células con oscilaciones de Ca2+ características de

célula líder y aumentó las de tallo, en células tratadas con altas dosis de VEGF. Dicha

inhibición a su vez disminuyó el número de células tipo tallo sustituyéndolas por células

no respondedoras a bajas concentraciones de VEGF.

Estos resultados son contradictorios con lo descrito en trabajos previos. La

inhibición de la vía Dll4/Notch aumentó el número de células líder con oscilaciones de

Ca2+ de alta frecuencia in vivo en la aorta dorsal de peces cebra 70,73. Un estudio reciente

ha caracterizado el aumento de la expresión de genes implicados en las oscilaciones de

Ca2+ en células endoteliales aórticas humanas interferidas para la expresión de Notch1

232. Por el contrario, se ha observado la disminución de las oscilaciones de Ca2+ in vitro

en células de músculo liso tratadas con DAPT por disminución de la expresión de canales

de la maquinaria SOCE 233,234.

Los diferentes resultados obtenidos pueden deberse a la mayor complejidad de los

anteriores ensayos realizados in vivo con una mezcla de señales angiogénicas y anti-

angiogénicas. Así, los cambios observados en las oscilaciones de Ca2+ durante la

inhibición de la vía de Notch pueden deberse a cambios en la expresión de la maquinaria

de oscilaciones de Ca2+ en respuesta específicamente a VEGF.

1.3 Cambios de la expresión de marcadores génicos de células líder y tallo en

respuesta a VEGF

Nuestros datos indican que la estimulación de células endoteliales con distintas

concentraciones de VEGF correlaciona con la activación de diferentes programas

génicos. Las células estimuladas con altas dosis de VEGF aumentan la expresión de los

marcadores génicos de célula líder. El incremento de la transcripción del gen Dll4 indica

que el tratamiento con altas dosis de VEGF produce la salida de las oscilaciones

transcripcionales descritas para este gen iniciando la especificación en célula líder 56,58.

Por su parte, la falta de regulación génica observada en los marcadores de célula

tallo a bajas concentraciones de VEGF, puede deberse al cultivo celular en dos

dimensiones, a diferencia de los experimentos de identificación de estos marcadores

realizados en contextos de tres dimensiones que permiten la migración celular y la

114

creación del brote capilar 53,54. Nuevos análisis usando modelos angiogénicos

tridimensionales como la formación de estructuras tipo capilares con esferoides podrían

aportar nuevos datos.

Además, hemos analizado la participación del factor de transcripción NFAT,

implicado previamente en la proliferación de células tallo, en la transcripción de estos

genes. Se ha observado la regulación parcial a través de esta vía de genes como VCAM1

e ICAM1 que aparecían sobreexpresados en los tratamientos de ambas concentraciones

de VEGF durante 24 horas. Es interesante señalar que si bien tal como se esperaba, la

expresión de la mayoría de los marcadores descritos como propios de célula líder no son

regulados por la inhibición de la ruta de NFAT, sí lo es la expresión de su gen diana

RCAN1.4. Ya se ha demostrado previamente la regulación de RCAN1.4 por parte de

NFAT y su papel como inhibidor de la calcineurina y por tanto de la vía de NFAT 235.

RCAN1.4 es además un marcador de células líder implicado en la polarización y

migración celular a través de la regulación de la endocitosis de VEGFR2 221,236. De esta

forma el pico inicial de Ca2+ presente en las células líder podría activar de forma rápida y

transitoria la ruta de NFAT incrementando la expresión de RCAN1.4 que favorecería el

fenotipo líder e inhibiría la posterior activación de la vía de NFAT estabilizando este

fenotipo 70. Nuevos análisis son necesarios para la comprensión de la decodificación de

las oscilaciones de Ca2+ para la activación de los factores de transcripción NFAT y NFκB

en las células endoteliales líder y tallo.

En conjunto nuestros datos y los procedentes de otros estudios similares

demuestran que las células endoteliales responden a VEGF mediante diferentes

oscilaciones de Ca2+ que se correlacionan con su especificación en células líder y tallo

durante la angiogénesis por brote capilar (Figura 46).

115

Figura 46. Esquema representativo de la participación de las oscilaciones de Ca2+ en la especificación

de células líder y tallo durante angiogénesis por brote capilar.

2. MT1-MMP, nuevo actor en angiogénesis por intususcepción en contexto

inflamatorio: papel del flujo y el óxido nítrico

En este trabajo hemos descrito a MT1-MMP como un nuevo actor en la

angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de EII. Además, hemos propuesto

la producción de óxido nítrico por la vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3/eNOS, como

mecanismo dependiente de la actividad catalítica de MT1-MMP, responsable de la

inducción de este tipo de angiogénesis.

2.1 Sistema de visualización de angiogénesis por intususcepción en el plexo mucoso

Hemos desarrollado un nuevo método de visualización y cuantificación de la

angiogénesis por intususcepción, mediante microscopía confocal y reconstrucción en tres

dimensiones mediante el software Imaris. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios

cuantitativos de angiogénesis por intususcepción se han realizado usando microscopía

electrónica de barrido en muestras obtenidas por la técnica de molde de corrosión 82,110.

Esta técnica permite la visualización de alta resolución de los eventos distintivos de

angiogénesis por intususcepción, pilares, asas y duplicaciones, pero su complejidad a

nivel técnico dificulta el uso de un número de sujetos experimentales suficiente. Algunos

estudios recientes han analizado la angiogénesis por intususcepción, producida en vasos

sanguíneos tumorales, usando cortes de tejido teñidos por inmunofluorescencia. El

principal problema de esta técnica es que el escaso grosor de las muestras impide la

cuantificación de pilares, asas y duplicaciones obligando a usar los diámetros de los vasos

116

sanguíneos como medida indirecta de la angiogénesis por intususcepción 107,109. Nuestro

método resuelve algunos de estos problemas. Al realizar la tinción en tejido intestinal in

toto podemos analizar toda la vasculatura del intestino, y mediante la reconstrucción en

tres dimensiones podemos cuantificar los eventos de angiogénesis por intususcepción.

Queda pendiente la visualización del proceso de formación de los pilares, mediante

tinciones de microfilamentos de actina y microscopía confocal de alta resolución.

Creemos que esta técnica permitirá observar las protrusiones endoteliales migrando en

dirección al lumen capilar y el puente endotelial completo, de una forma similar a lo

observado previamente en tumores 85. Además, este sistema de visualización de la

angiogénesis combinado con el uso de líneas de ratón con reporteros fluorescentes

permitirá en el futuro el estudio de nuevos actores moleculares durante la angiogénesis

por intususcepción, y el análisis del papel de otros tipos celulares como los pericitos y

fibroblastos que han sido descritos introduciéndose en el pilar intraluminal 237.

2.2 Papel de MT1-MMP endotelial durante la patogénesis de colitis experimental

En este proyecto, hemos analizado el papel de MT1-MMP endotelial en

angiogénesis por intususcepción durante colitis experimental en ratones tratados con 1%

DSS en el agua de bebida. Este porcentaje más bajo que el usado en trabajos similares,

nos ha permitido una visualización más limpia de la vasculatura por inmunofluorescencia,

debido al menor daño epitelial y la presencia de un menor número de células

inflamatorias. Hemos demostrado que la deleción endotelial de MT1-MMP disminuye la

angiogénesis por intususcepción, mejora la funcionalidad de los vasos y la evolución de

la enfermedad. Sin embargo la deleción de MT1-MMP no tiene efecto en la progresión

de ratones tratados con mayores porcentajes de DSS (4%). Esto indica que la función de

MT1-MMP es importante en contextos donde la angiogénesis influye más en la

progresión de la enfermedad como durante su inicio y en presencia de respuesta

inflamatoria moderada.

Al igual que trabajos previos, nuestros resultados demuestran la participación de

la angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de colitis en ratones 82,121.

Además, hemos observado angiogénesis por intususcepción al tercer día de tratamiento

con 1% DSS sin que sea necesario un gran incremento de células inflamatorias en tejido,

en contra de lo considerado hasta ahora en el campo 223. Es importante destacar que la

mayor parte de estos estudios previos sobre la participación de la angiogénesis en la

etiología de la colitis, no tienen en cuenta el mecanismo angiogénico por el que ésta tiene

117

lugar en dicho contexto, dificultando el estudio de los mecanismos moleculares que

participan en la angiogénesis durante la enfermedad.

Aunque MT1-MMP desempeña también un papel en linfoangiogénesis 238, en este

estudio no hemos abordado su posible función en este proceso, para el que se ha descrito

un papel protector durante el desarrollo de la colitis experimental. Así, Alessio y

colaboradores observaron una mejor evolución de animales tratados con DSS por la

sobreexpresión de VEGF-C, factor promotor de linfoangiogénesis 239.

2.3 Papel de MT1-MMP durante la respuesta endotelial a flujo sanguíneo

Nuestros resultados in vivo han mostrado la expresión de MT1-MMP a nivel de

proteína en células endoteliales bajo elevado flujo laminar en la aorta torácica

descendiente. Sin embargo, la actividad del promotor de MT1-MMP solo está activo en

la quinta parte de las células, indicando una expresión fluctuante de MT1-MMP en estas

condiciones. En cuanto al efecto del flujo turbulento, se observó un número mayor de

células endoteliales con actividad del promotor de MT1-MMP en la curvatura menor de

la aorta, y en las células endoteliales de los tricórneres de animales enfermos. Si bien

estudios previos in vitro usando un agitador circular para simular el flujo sanguíneo sobre

células endoteliales habían descrito una bajada de la expresión de MT1-MMP 153,178,

nuestros resultados in vivo sugieren que la expresión de MT1-MMP está regulada por

flujo, aumentando en zonas de alto flujo laminar y zonas donde existen gradientes de flujo

o disminución del estrés de cizalla como los tricórneres.

Nuestra combinación de experimentos in vivo e in vitro ha demostrado que la

deleción de MT1-MMP endotelial disminuye la elongación celular pero no modifica su

polarización en respuesta a flujo. Estos resultados indicarían la participación de MT1-

MMP en la mecanorrecepción del flujo sanguíneo o la adaptación celular a éste. MT1-

MMP podría formar parte o modificar el mecanosensor endotelial, por ejemplo través del

corte de VE-cadherina al igual que en el caso de las proteínas de la misma familia N-

cadherina y E-cadherina 192. Por otro lado, MT1-MMP podría participar de la elongación

celular, reorganización del citoesqueleto y migración en respuesta a flujo por la activación

de GTPasas, o modulando la actividad de integrinas y eNOS 170.

La menor elongación celular en respuesta a flujo en células deficientes para MT1-

MMP no pudo ser reproducida in vitro, probablemente debido a la limitación temporal,

ya que las células solo pudieron ser sometidas a flujo durante 12 horas. Estudios previos

118

han mostrado un cambio en la morfología celular tras 24 horas de flujo laminar a 35

dyn/cm2 en células endoteliales de arteria coronaria humana (HCAECs) y tras 18 o 48

horas a diferentes flujos (0,5-37dyn/cm2) en HUVECs 240,241.

2.4 Función de MT1-MMP durante la vasodilatación y producción de óxido nítrico

En este trabajo hemos mostrado la menor capacidad de vasodilatación de

arteriolas y capilares del músculo cremáster de ratones MT1iΔEC en respuesta a ACh. La

ACh produce vasodilatación a través de dos mecanismos, la producción de óxido nítrico

y de prostanglandinas 242. En nuestro modelo, la vasodilatación del plexo capilar del

cremáster en ratones MT1iΔEC fue rescatada mediante un donador de óxido nítrico,

indicando la prevalencia de esta vía en este contexto. Además, hemos correlacionado este

defecto en la vasodilatación de los animales MT1iΔEC con la disminución de la producción

de óxido nítrico y la expresión de eNOS en células endoteliales in vitro en ausencia de

MT1-MMP.

MT1-MMP puede desempeñar una doble función a través de la producción de

óxido nítrico durante la inducción y desarrollo de la angiogénesis por intususcepción. Por

una parte, la vasodilatación de la arteriola producida por óxido nítrico incrementa el flujo

sanguíneo en el plexo capilar induciendo, como ya se ha descrito anteriormente,

angiogénesis por división de los capilares 99,243. Por otra parte, el incremento de flujo

inducirá una mayor producción de óxido nítrico local en el plexo capilar que ha sido

propuesto como inductor de la migración de células endoteliales para formar el pilar

intraluminal. De esta forma el óxido nítrico producido en las regiones del plexo con flujo

laminar puede inducir la expresión de VEGFR2 y la migración celular necesaria para la

formación de los pilares intraluminales en la región de menor estrés de cizalla del plexo,

los tricórneres. Futuros estudios son necesarios para la comprensión de los procesos por

los que eNOS puede inducir la formación de pilares en los tricórneres del plexo mucoso

y el papel de la vía de VEGF y sus receptores durante el proceso vascular.

2.5 Señalización del fragmento carboxilo terminal de TSP1 a través de la integrina

αvβ3

Hemos identificado un nuevo mecanismo molecular por el que MT1-MMP es

capaz de incrementar la producción de óxido nítrico y la expresión de eNOS a través del

corte proteolítico de TSP-1 durante el desarrollo de colitis experimental.

119

TSP1 es una glicoproteína secretada a la matriz extracelular, capaz de señalizar

por diferentes vías. Ha sido detectada a bajas concentraciones en contextos fisiológicos

que aumentan rápidamente durante la inflamación en enfermedades crónicas como las

EII. TSP1 interacciona con el receptor CD36 a través de su secuencia repetida I y con

CD47 por su dominio carboxilo terminal; también cuenta con secuencias de interacción

con las integrinas αvβ3 y β1 y otras proteínas de la matriz extracelular 225. La actividad

anti-angiogénica de TSP1 se ha estudiado en profundidad. TSP1 se une a CD36

inhibiendo migración y tubulogénesis e induciendo apoptosis en el endotelio 244–246 e

interacciona con la vía de VEGF/VEGFR2, secuestrando moléculas de VEGF y

bloqueando la fosforilación de VEGFR2 a través de la unión a CD36 y CD47 247–249.

Además, la señalización de TSP1 a través de CD36 y CD47 disminuye la producción de

óxido nítrico por inhibición de la fosforilación de eNOS 250,251.

Sin embargo, TSP1 es una proteína pleiotrópica a la que se le han atribuido

también efectos proangiogénicos en modelos in vitro a través de la inducción de actividad

inflamatoria en células de músculo liso 252, y en ensayos in vivo durante la angiogénesis

en la córnea de conejos 253. Aunque TSP1 puede ser procesada tanto por MT1-MMP como

por otras proteasas, la mayor parte de los ensayos para analizar su potencial anti-

angiogénico se han realizado usando la proteína completa. Nosotros proponemos un

comportamiento pleiotrópico de TSP1 inducido por su corte proteolítico 254. En esta

misma dirección, se ha observado la función proangiogénica del fragmento amino

terminal de TSP1 255. Aunque el papel de TSP1 durante la angiogénesis por

intususcepción es aún desconocido, su expresión ha sido observada en contextos donde

este mecanismo angiogénico está presente, como la expansión del plexo vascular de la

membrana corioalantoidea y la colitis 256.

Durante este trabajo, hemos observado la acumulación de la proteína TSP1 en las

arteriolas del colon de animales MT1iΔEC y en HUVECs silenciadas para la expresión de

MT1-MMP, indicando junto al modelo desarrollado in silico el corte proteolítico de TSP1

por parte de MT1-MMP. El procesamiento de TSP1 por MT1-MMP ya ha sido descrito

anteriormente en otros contextos 148,257. En el caso del corte de TSP1 por ADAMTS1 se

ha descrito la liberación de la matriz del fragmento carboxilo terminal de TSP1 mientras

que el fragmento amino terminal es degradado 226. En nuestro modelo, datos previos del

laboratorio han mostrado el incremento de la proteína TSP1 en el suero de ratones tratados

con 1% DSS, que fue inhibido por el anticuerpo bloqueante de la actividad catalítica de

120

MT1-MMP (LEM-2/15). Además describieron el aumento de la concentración de TSP1

en sueros de pacientes de CU y EC de baja actividad, mimetizado por nuestro modelo

experimental. Nuestros datos indican que el fragmento carboxilo terminal de TSP1

liberado por MT1-MMP señaliza a través del complejo CD47/integrina αvβ3

disminuyendo la producción de óxido nítrico. El complejo CD47/ integrina αvβ3 ha sido

descrito previamente como receptor de TSP1 en diferentes tipos celulares e identificado

como receptor de vitronectina en la membrana apical pero no basal de células adherentes

258–260. En cuanto a la degradación del fragmento amino terminal de TSP1 puede ser

parcialmente responsable del incremento de la producción de óxido nítrico y aumento de

la angiogénesis al suprimir el sitio de unión de TSP1 a CD36, cuya señalización favorece

la apoptosis de células endoteliales e inhibe la producción de óxido nítrico y migración

celular 261. Por otro lado, no debemos descartar la posible participación en el fenotipo del

procesado de la integrina pro-αv en su forma madura 262.

2.6 La vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3/eNOS como diana terapéutica

Hemos demostrado que la unión del fragmento carboxilo terminal de TSP1 a la

integrina αvβ3 induce angiogénesis por intususcepción favoreciendo la evolución de la

colitis en ratones tratados con 1% DSS. Así la angiogénesis por intususcepción disminuyó

al bloquear la interacción TSP1/integrina αvβ3 con el nonapéptido de TSP1

GDGRGDACK. Danese y colaboradores ya analizaron por inmunohistoquímica el efecto

del bloqueo de las integrinas αvβ3 y α5β1 mediante el péptido ATN-161 sobre la

angiogénesis durante la colitis experimental en ratones IL10-/-. Sin embargo, a diferencia

de nuestro trabajo, no se analizó el efecto específico sobre la angiogénesis por

intususcepción ni se identificó el ligando responsable de la angiogénesis 263. Si bien el

nonapéptido GDGRGDACK inhibió la angiogénesis por intususcepción, queda por

determinar si el bloqueo de la integrina puede mejorar la evolución de la enfermedad en

ratones tratados con 1% DSS durante periodos más largos o con porcentajes más elevados

de DSS. Por otra parte, otros dos péptidos basados en la secuencia de TSP1 han sido

usados durante el tratamiento de colitis. Los péptidos ABT-510 y ABT-898 basados en

las secuencias que se unen específicamente a CD36 y CD47 respectivamente inhibieron

parcialmente la angiogénesis durante la colitis experimental en ratones tratados con DSS

y mejoraron la evolución de la enfermedad, aunque no se analizó el efecto en marcadores

de angiogénesis por intususcepción 141,143.

121

En cuanto a la función de MT1-MMP durante la patogénesis de la enfermedad en

humanos, hemos descrito el incremento de MT1-MMP en el endotelio del plexo mucoso

de intestinos procedentes de pacientes de EIIs, indicando un posible uso terapéutico de la

vía descrita.

En resumen y a la luz de nuestros resultados proponemos un modelo en el que la

angiogénesis por intususcepción en un contexto de colitis moderada es estimulada por el

procesado de TSP1 por parte de MT1-MMP. Esto bloquea la inhibición de la producción

de óxido nítrico producida a través de la interacción de TSP1 con el receptor CD36. El

fragmento carboxilo terminal de TSP1 señaliza a través del complejo apical

CD47/integrina αvβ3 estimulando la producción de óxido nítrico y la angiogénesis por

intususcepción (Figura 47).

Figura 47. Esquema de la vía MT1-MMP/TSP1/integrina αvβ3-CD47/eNOS/óxido nítrico en

inducción de angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de colitis. CE célula endotelial,

PR pericito, FB fibroblasto, Col colágeno.

122

En conclusión nuestros datos señalan a MT1-MMP endotelial como un regulador

esencial de la angiogénesis por intususcepción durante la colitis, sugiriendo el posible uso

de la metaloproteasa y de la vía MT1-MMP/TSP1/integrinaαvβ3-CD47/eNOS/óxido

nítrico como diana terapéutica para el tratamiento de las EII humanas y otras

enfermedades donde la angiogénesis por intususcepción aparece implicada como la

displasia broncoalveolar y el cáncer, en los que TSP1 ya ha sido propuesto como diana

terapéutica 264–267.

123

Conclusiones

125

1. Las células endoteliales responden a VEGF y TNFα mediante cambios en la amplitud

y frecuencia de las oscilaciones de Ca2+ intracelular, que requieren la participación del

Ca2+ extracelular. Las células endoteliales tratadas con VEGF presentan oscilaciones de

Ca2+ heterogéneas.

2. El comportamiento de oscilaciones de Ca2+ en células endoteliales en respuesta a

VEGF es dependiente de la dosis del mismo. Células tratadas con altas dosis de VEGF

presentan un pico de Ca2+ al inicio de la estimulación asociado a la especificación de

células líder. Mientras que células tratadas con dosis bajas de VEGF presentan numerosas

oscilaciones de Ca2+ durante la estimulación, asociadas a la especificación de células

tallo.

3. Las oscilaciones de Ca2+ en respuesta a elevadas dosis de VEGF requieren la

participación del canal de Ca2+ ORAI1 y correlacionan con la rápida activación por

fosforilación de la PLCγ1. Altas dosis de VEGF aumentan la transcripción de genes

marcadores de células líder así como la transcripción del inhibidor de calcineurina

RCAN1.4 dependiente de NFAT.

4. El uso combinado de microscopía confocal y reconstrucción tridimensional del plexo

vascular mucoso intestinal, aporta resolución suficiente para el análisis y cuantificación

de eventos vasculares característicos de la angiogénesis por intususcepción.

5. La deleción endotelial de MT1-MMP reduce la angiogénesis por intususcepción y

mejora la función vascular de la vasculatura intestinal del plexo mucoso durante la

patogénesis de colitis experimental en ratón, reduciendo la progresión de la enfermedad.

5. La ausencia de MT1-MMP en el endotelio reduce la vasodilatación de arteriolas y

capilares dependiente de óxido nítrico.

6. La actividad catalítica de MT1-MMP endotelial es necesaria para la inducción de

angiogénesis por intususcepción durante la patogénesis de colitis experimental en ratón.

126

7. La liberación de TSP1 por parte de MT1-MMP aumenta la producción de óxido nítrico

a través del complejo CD47-integrina αvβ3.

8. El bloqueo de la interacción TSP1/integrina αvβ3 reduce la angiogénesis por

intususcepción durante la colitis experimental en ratón.

9. Los niveles de la proteína MT1-MMP aumentan en el endotelio intestinal humano

durante las enfermedades inflamatorias intestinales, por lo que se propone MT1-MMP y

la vía TSP1/integrina αvβ3/ óxido nítrico como posibles nuevas dianas terapéuticas.

127

Bibliografía

129

1. Seano, G. & Primo, L. Podosomes and invadopodia: Tools to breach vascular

basement membrane. Cell Cycle 14, 1370–1374 (2015).

2. Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2,

a006429–a006429 (2012).

3. Félétou, M. The Endothelium. The Endothelium: Part 1: Multiple Functions of

the Endothelial Cells—Focus on Endothelium-Derived Vasoactive Mediators

(2011).

4. Mazzone, M. et al. Heterozygous Deficiency of PHD2 Restores Tumor

Oxygenation and Inhibits Metastasis via Endothelial Normalization. Cell 136,

839–851 (2009).

5. Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions: Adhesion and signaling in

physiology and pathology. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, (2012).

6. Bazzoni, G. Endothelial tightjunctions: permeable barriers of the vesselwall.

Thromb. Haemost. (2006). doi:10.1160/TH05

7. Potente, M. & Mäkinen, T. Vascular heterogeneity and specialization in

development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 477–494 (2017).

8. Nolan, D. J. et al. Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular

Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration. Dev.

Cell 26, 204–219 (2013).

9. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature 386, 671–674 (1997).

10. Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr. Mol. Med. 3,

643–51 (2003).

11. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect

Med 2, a006692 (2012).

12. Schmidt, A., Brixius, K. & Bloch, W. Endothelial precursor cell migration during

vasculogenesis. Circ. Res. 101, 125–136 (2007).

13. Blanco, R. & Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold

130

Spring Harb. Perspect. Med. 3, (2013).

14. Carmeliet, P. & Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of

angiogenesis. Nature 473, 298–307 (2011).

15. Tammela, T. & Alitalo, K. Lymphangiogenesis: Molecular Mechanisms and

Future Promise. Cell (2010). doi:10.1016/j.cell.2010.01.045

16. Díaz-Flores, L. et al. Morphofunctional basis of the different types of

angiogenesis and formation of postnatal angiogenesis-related secondary

structures. Histol. Histopathol. 32, 1239–1279 (2017).

17. Iruela-Arispe, M. L. & Davis, G. E. Cellular and Molecular Mechanisms of

Vascular Lumen Formation. Dev. Cell 16, 222–231 (2009).

18. Shibuya, M. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Its Receptor

(VEGFR) Signaling in Angiogenesis: A Crucial Target for Anti- and Pro-

Angiogenic Therapies. Genes and Cancer 2, 1097–1105 (2011).

19. Dumont, D. J. Cardiovascular Failure in Mouse Embryos Deficient in VEGF

Receptor-3. Science (80-. ). 282, 946–949 (1998).

20. Lohela, M., Bry, M., Tammela, T. & Alitalo, K. VEGFs and receptors involved

in angiogenesis versus lymphangiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 154–165

(2009).

21. Zarkada, G., Heinolainen, K., Makinen, T., Kubota, Y. & Alitalo, K. VEGFR3

does not sustain retinal angiogenesis without VEGFR2. 112, (2014).

22. Sakurai, Y., Ohgimoto, K., Kataoka, Y., Yoshida, N. & Shibuya, M. Essential

role of Flk-1 (VEGF receptor 2) tyrosine residue 1173 in vasculogenesis in mice.

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 1076–1081 (2005).

23. Hiratsuka, S., Minowa, O., Kuno, J., Noda, T. & Shibuya, M. Flt-1 lacking the

tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in

mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9349–54 (1998).

24. Fong, G. H., Rossant, J., Gertsenstein, M. & Breitman, M. L. Role of the Flt-1

receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium.

Nature 376, 66–70 (1995).

131

25. Phng, L. K. & Gerhardt, H. Angiogenesis: A Team Effort Coordinated by Notch.

Dev. Cell 16, 196–208 (2009).

26. Gerhardt, H. et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip

cell filopodia. J. Cell Biol. 161, 1163–1177 (2003).

27. De Smet, F., Segura, I., De Bock, K., Hohensinner, P. J. & Carmeliet, P.

Mechanisms of vessel branching: Filopodia on endothelial tip cells lead the way.

Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 29, 639–649 (2009).

28. Vitorino, P. M. Modular Control of Endothelial Sheet Cohesion and Collective

Cell Migration. Stanford Univ. Thesis 1, 3268–3281 (2009).

29. Sainson, R. C. a et al. TNF primes endothelial cells for angiogenic sprouting by

inducing a tip cell phenotype. Blood 111, 4997–5007 (2008).

30. Gálvez, B. G. et al. Membrane type 1-matrix metalloproteinase is regulated by

chemokines monocyte-chemoattractant protein-1/CCL2 and interleukin-

8/CXCL8 in endothelial cells during angiogenesis. J. Biol. Chem. 280, 1292–

1298 (2005).

31. Priya, M. K. et al. Tipping off endothelial tubes: nitric oxide drives tip cells.

Angiogenesis 18, 175–189 (2015).

32. Takuwa, Y. Roles of sphingosine-1-phosphate signaling in angiogenesis. World

J. Biol. Chem. 1, 298 (2010).

33. Su, S. & Bayless, K. J. Sphingosine-1-Phosphate. 874, 201–213 (2012).

34. Geudens, I. & Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel

formation. Development 138, 4569–4583 (2011).

35. Kopan, R. & Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway:

Unfolding the Activation Mechanism. Cell 137, 216–233 (2009).

36. Caporarello, N. et al. Classical VEGF, Notch and Ang Signalling in cancer

angiogenesis, alternative approaches and future directions (review). Mol. Med.

Rep. 16, 4393–4402 (2017).

37. Xue, Y. et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch

ligand Jagged1. Hum. Mol. Genet. 8, 723–730 (1999).

132

38. Krebs, L. T. et al. Notch signaling is essential for vascular morphogenesis in

mice. Genes Dev. 14, 1343–52 (2000).

39. Uyttendaele, H., Ho, J., Rossant, J. & Kitajewski, J. Vascular patterning defects

associated with expression of activated Notch4 in embryonic endothelium. Proc.

Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 5643–8 (2001).

40. Gale, N. W. et al. Haploinsufficiency of delta-like 4 ligand results in embryonic

lethality due to major defects in arterial and vascular development. Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. 101, 15949–54 (2004).

41. Lobov, I. B. et al. Delta-like ligand 4 (Dll4) is induced by VEGF as a negative

regulator of angiogenic sprouting. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 3219–3224 (2007).

42. Siekmann, A. F. & Lawson, N. D. Notch signalling limits angiogenic cell

behaviour in developing zebrafish arteries. Nature 445, 781–784 (2007).

43. Leslie, J. D. et al. Endothelial signalling by the Notch ligand Delta-like 4 restricts

angiogenesis. Development 134, 839–844 (2007).

44. Suchting, S. et al. The Notch ligand Delta-like 4 negatively regulates endothelial

tip cell formation and vessel branching. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 3225–3230

(2007).

45. Hicklin, D. J. Promoting angiogenesis to a fault. Nat. Biotechnol. 25, 300–302

(2007).

46. Noguera-Troise, I. et al. Blockade of Dll4 inhibits tumour growth by promoting

non-productive angiogenesis. Nature 444, 1032–1037 (2006).

47. Williams, C. K. et al. Upregulation of the Notch ligand Delta-like 4 inhibits

VEGF- induced endothelial cell function. Vascular 107, 1–42 (2005).

48. Hellström, M. et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip

cells during angiogenesis. Nature 445, 776–780 (2007).

49. Arima, S. et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and

heterogeneous collective endothelial cell movement. Development 138, 4763–

4776 (2011).

50. Jakobsson, L. et al. Endothelial cells dynamically compete for the tip cell

133

position during angiogenic sprouting. Nat. Cell Biol. 12, 943–953 (2010).

51. Pelton, J. C., Wright, C. E., Leitges, M. & Bautch, V. L. Multiple endothelial

cells constitute the tip of developing blood vessels and polarize to promote lumen

formation. Development 141, 4121–4126 (2014).

52. Siemerink, M. J. et al. CD34 marks angiogenic tip cells in human vascular

endothelial cell cultures. Angiogenesis 15, 151–163 (2012).

53. Toro, R. et al. Identification and functional analysis of endothelial tip cell

enriched genes. Blood 116, 4025–4033 (2010).

54. Strasser, G. A., Kaminker, J. S., Tessier-lavigne, M. & Dc, W. mediator of tip

cell morphology and branching Microarray analysis of retinal endothelial tip cells

identifies CXCR4 as a mediator of tip cell morphology and branching. 115,

5102–5110 (2012).

55. Moya, I. M. et al. Stalk Cell Phenotype Depends on Integration of Notch and

Smad1/5 Signaling Cascades. Dev. Cell 22, 501–514 (2012).

56. Beets, K., Huylebroeck, D., Moya, I. M., Umans, L. & Zwijsen, A. Robustness in

angiogenesis: Notch and BMP shaping waves. Trends Genet. 29, 140–149

(2013).

57. Bentley, K. & Chakravartula, S. The temporal basis of angiogenesis. Philos.

Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 372, (2017).

58. Ubezio, B. et al. Synchronization of endothelial Dll4-Notch dynamics switch

blood vessels from branching to expansion. Elife 5, 1–32 (2016).

59. Seol, G. H. et al. Sphingosine-1-phosphate-induced intracellular Ca2+

mobilization in human endothelial cells. Endothelium 12, 263–269 (2005).

60. Ando, J. & Yamamoto, K. Flow detection and calcium signalling in vascular

endothelial cells. Cardiovasc. Res. 99, 260–268 (2013).

61. Fearnley, G. W., Bruns, A. F., Wheatcroft, S. B. & Ponnambalam, S. VEGF-A

isoform-specific regulation of calcium ion flux, transcriptional activation and

endothelial cell migration. Biol. Open 4, 731–742 (2015).

62. Mclaughlin, A. P. et al. Role of PLC γ and Ca 2 + in VEGF- and FGF-induced

134

choroidal endothelial cell proliferation Role of PLC ␥ and Ca 2ϩ in VEGF- and

FGF-induced choroidal endothelial cell proliferation. 92612, 1448–1456 (2012).

63. Bhattacharya, R. et al. Distinct role of PLCbeta3 in VEGF-mediated directional

migration and vascular sprouting. J. Cell Sci. 122, 1025–1034 (2009).

64. Ha, J. M. et al. Regulation of retinal angiogenesis by phospholipase C-β3

signaling pathway. Exp. Mol. Med. 48, e240 (2016).

65. Li, J. et al. Orai1 and CRAC channel dependence of VEGF-activated Ca2+ entry

and endothelial tube formation. Circ. Res. 108, 1190–1198 (2011).

66. Koch, S. & Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial

growth factor receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, 1–21 (2012).

67. Moccia, F. Update on vascular endothelial Ca 2+ signalling: A tale of ion

channels, pumps and transporters. World J. Biol. Chem. 3, 127 (2012).

68. Smedler, E. & Uhlén, P. Frequency decoding of calcium oscillations. Biochim.

Biophys. Acta - Gen. Subj. 1840, 964–969 (2014).

69. Rinne, A., Banach, K. & Blatter, L. A. Regulation of nuclear factor of activated T

cells (NFAT) in vascular endothelial cells. J. Mol. Cell. Cardiol. (2009).

doi:10.1016/j.yjmcc.2009.06.010

70. Noren, D. P. et al. Endothelial cells decode VEGF-mediated Ca2+ signaling

patterns to produce distinct functional responses. Sci. Signal. 9, ra20-ra20 (2016).

71. Scharbrodt, W. et al. Cytosolic Ca2+ oscillations in human cerebrovascular

endothelial cells after subarachnoid hemorrhage. J Cereb.Blood Flow Metab 29,

57–65 (2009).

72. Zhu, L. et al. Ca2+ oscillation frequency regulates agonist-stimulated gene

expression in vascular endothelial cells. J. Cell Sci. 121, 2511–2518 (2008).

73. Yokota, Y. et al. Endothelial Ca2+oscillations reflect VEGFR signaling-

regulated angiogenic capacity in vivo. Elife 4, 1–26 (2015).

74. Styp-Rekowska, B., Hlushchuk, R., Pries, A. R. & Djonov, V. Intussusceptive

angiogenesis: pillars against the blood flow. Acta Physiol. (Oxf). 202, 213–223

(2011).

135

75. Egginton, S. In vivo shear stress response. Biochem. Soc. Trans. 39, 1633–1638

(2011).

76. Caduff, J. H., Fischer, L. C. & Burri, P. H. Scanning electron microscope study

of the developing microvasculature in the postnatal rat lung. Anat. Rec. 216, 154–

164 (1986).

77. Burri, P. H. & Tarek, M. R. A novel mechanism of capillary growth in the rat

pulmonary microcirculation. Anat. Rec. 228, 35–45 (1990).

78. Burri, P. H., Hlushchuk, R. & Djonov, V. Intussusceptive angiogenesis: Its

emergence, its characteristics, and its significance. Dev. Dyn. 231, 474–488

(2004).

79. Patan, S., Munn, L. L. & Jain, R. K. BRIEF COMMUNICATION

Intussusceptive Microvascular Growth in a Human Colon Adenocarcinoma

Xenograft: A Novel Mechanism of Tumor Angiogenesis. Microvasc. Res. 51,

260–272 (1996).

80. Hlushchuk, R. et al. Tumor recovery by angiogenic switch from sprouting to

intussusceptive angiogenesis after treatment with PTK787/ZK222584 or ionizing

radiation. Am. J. Pathol. 173, 1173–1185 (2008).

81. Gargett, C. E. Focal vascular endothelial growth factor correlates with

angiogenesis in human endometrium. Role of intravascular neutrophils. Hum.

Reprod. 16, 1065–1075 (2001).

82. Konerding, M. A. et al. Inflammation-induced intussusceptive angiogenesis in

murine colitis. Anat. Rec. 293, 849–857 (2010).

83. Gianni-Barrera, R. et al. VEGF over-expression in skeletal muscle induces

angiogenesis by intussusception rather than sprouting. Angiogenesis 16, 123–136

(2013).

84. Ji, J. W., Tsoukias, N. M., Goldman, D. & Popel, A. S. A computational model

of oxygen transport in skeletal muscle for sprouting and splitting modes of

angiogenesis. J. Theor. Biol. 241, 94–108 (2006).

85. Paku, S. et al. A new mechanism for pillar formation during tumor-induced

intussusceptive angiogenesis: Inverse sprouting. Am. J. Pathol. 179, 1573–1585

136

(2011).

86. Djonov, V. G., Galli, A. B. & Burri, P. H. Intussusceptive asborization

contributes to vascular tree formation in the chick chorio-allantoic membrane.

Anat. Embryol. (Berl). 202, 347–357 (2000).

87. karthik, S. et al. Synergistic interaction of sprouting and intussusceptive

angiogenesis during zebrafish caudal vein plexus development. Sci. Rep. 8, 9840

(2018).

88. Djonov, V. G., Kurz, H. & Burri, P. H. Optimality in the developing vascular

system: Branching remodeling by means of intussusception as an efficient

adaptation mechanism. Dev. Dyn. 224, 391–402 (2002).

89. Hlushchuk, R. et al. Decrease in VEGF expression induces intussusceptive

vascular pruning. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 2836–2844 (2011).

90. Liu, C. & Martin, J. Visualizing fetal mouse great blood vessels by plastic

casting. Cold Spring Harb. Protoc. 5, (2010).

91. Givens, C. & Tzima, E. Endothelial Mechanosignaling: Does One Sensor Fit All?

Antioxid. Redox Signal. 25, 373–388 (2016).

92. Wragg, J. W. et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in

vascular endothelium. Microcirculation 21, 290–300 (2014).

93. Zhou, a L., Egginton, S., Hudlická, O. & Brown, M. D. Internal division of

capillaries in rat skeletal muscle in response to chronic vasodilator treatment with

alpha1-antagonist prazosin. Cell Tissue Res. 293, 293–303 (1998).

94. Mentzer, S. J. & Konerding, M. A. Intussusceptive angiogenesis: Expansion and

remodeling of microvascular networks. Angiogenesis 17, 499–509 (2014).

95. Turhan, A. et al. Effect of intraluminal pillars on particle motion in bifurcated

microchannels. Vitr. Cell. Dev. Biol. - Anim. 44, 426–433 (2009).

96. Williams, J. L. et al. Differential gene and protein expression in abluminal

sprouting and intraluminal splitting forms of angiogenesis. Clin. Sci. (Lond). 110,

587–595 (2006).

97. Poulos, T. L. & Li, H. Nitric oxide synthase and structure-based inhibitor design.

137

Nitric Oxide - Biol. Chem. (2017). doi:10.1016/j.niox.2016.11.004

98. Hudlicka, O., Brown, M. D., May, S., Zakrzewicz, A. & Pries, A. R. Changes in

capillary shear stress in skeletal muscles exposed to long-term activity: Role of

nitric oxide. Microcirculation 13, 249–259 (2006).

99. Williams, J. L., Cartland, D., Hussain, A. & Egginton, S. A differential role for

nitric oxide in two forms of physiological angiogenesis in mouse. J. Physiol. 570,

445–454 (2006).

100. Vimalraj, S., Bhuvaneswari, S., Lakshmikirupa, S., Jyothsna, G. & Chatterjee, S.

Nitric oxide signaling regulates tumor-induced intussusceptive-like angiogenesis.

Microvasc. Res. 119, 47–59 (2018).

101. Baum, O. et al. VEGF-A promotes intussusceptive angiogenesis in the

developing chicken chorioallantoic membrane. Microcirculation 17, 447–457

(2010).

102. Williams, J. L., Cartland, D., Rudge, J. S. & Egginton, S. VEGF trap abolishes

shear stress- and overload-dependent angiogenesis in skeletal muscle.

Microcirculation 13, 499–509 (2006).

103. Nico, B. et al. Intussusceptive microvascular growth in human glioma. Clin. Exp.

Med. 10, 93–98 (2010).

104. Hlushchuk, R. et al. Endoglin inhibition leads to intussusceptive angiogenesis via

activation of factors related to COUP-TFII signaling pathway. PLoS One 12, 1–

17 (2017).

105. Dill, M. T. et al. Disruption of Notch1 induces vascular remodeling,

intussusceptive angiogenesis, and angiosarcomas in livers of mice.

Gastroenterology 142, 967–977.e2 (2012).

106. Dimova, I. et al. Inhibition of Notch signaling induces extensive intussusceptive

neo-angiogenesis by recruitment of mononuclear cells. Angiogenesis 16, 921–

937 (2013).

107. Gianni-Barrera, R. et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal

muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis 0, 0

(2018).

138

108. Banfi, A. et al. Therapeutic angiogenesis due to balanced single-vector delivery

of VEGF and PDGF-BB. FASEB J. 26, 2486–2497 (2012).

109. Groppa, E. et al. EphrinB2/EphB4 signaling regulates non‐sprouting

angiogenesis by VEGF. EMBO Rep. e45054 (2018).

doi:10.15252/embr.201745054

110. Spiegelaere, W. De et al. Intussusceptive Angiogenesis : 390–404 (2012).

doi:10.1159/000338278

111. Ackermann, M., Tsuda, A., Secomb, T. W., Mentzer, S. J. & Konerding, M. A.

Intussusceptive remodeling of vascular branch angles in chemically-induced

murine colitis. Microvasc. Res. 87, 75–82 (2013).

112. Ravnic, D. J. et al. Structural adaptations in the murine colon microcirculation

associated with hapten-induced inflammation. 0, 518–523 (2007).

113. Filipovic, N. et al. Computational flow dynamics in a geometric model of

intussusceptive angiogenesis. Microvasc. Res. 78, 286–293 (2009).

114. Kiesler, P., Fuss, I. J. & Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel

diseases. Med. Hyg. (Geneve). 59, 241–248 (2001).

115. Alkim, C., Alkim, H., Koksal, A. R., Boga, S. & Sen, I. Angiogenesis in

inflammatory bowel disease. Int. J. Inflam. 2015, (2015).

116. Kawada, M., Arihiro, A. & Mizoguchi, E. Insights from advances in research of

chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease.

World J. Gastroenterol. 13, 5581–5593 (2007).

117. Ng, S. C. et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel

disease in the 21st century: a systematic review of population-based studies.

Lancet 390, 2769–2778 (2017).

118. Eichele, D. D. & Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model:

An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel

diseases pathogenesis. World J. Gastroenterol. 23, 6016–6029 (2017).

119. Khor, B., Gardet, A. & Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory

bowel disease. Nature 474, 307–317 (2011).

139

120. Melgar, S. et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis

using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int.

Immunopharmacol. 8, 836–844 (2008).

121. Danese, S. et al. Angiogenesis as a Novel Component of Inflammatory Bowel

Disease Pathogenesis. Gastroenterology 130, 2060–2073 (2006).

122. Kanazawa, S. et al. VEGF, basic-FGF, and TGF-beta in Crohn’s disease and

ulcerative colitis: a novel mechanism of chronic intestinal inflammation. Am. J.

Gastroenterol. 96, 822–828 (2001).

123. Kumagai, S. et al. Platelet-Derived Growth Factor and its Receptors Are

Expressed in Areas of Both Active Inflammation and Active Fibrosis in

Inflammatory Bowel Disease. The Tohoku Journal of Experimental Medicine

195, 21–33 (2001).

124. Cromer, W. E., Mathis, J. M., Granger, D. N., Chaitanya, G. V. & Alexander, J.

S. Role of the endothelium in inflammatory bowel diseases. World J.

Gastroenterol. 17, 578–593 (2011).

125. Nassef, M. A., Botros, S. M. & Adel Ghaffar, M. K. The update of ultrasound

techniques in diagnosis of inflammatory bowel disease. Egypt. J. Radiol. Nucl.

Med. 45, 289–294 (2014).

126. Sasaki, T. et al. Doppler ultrasound findings correlate with tissue vascularity and

inflammation in surgical pathology specimens from patients with small intestinal

Crohnś disease. BMC Res Notes 7, 363 (2014).

127. Scaldaferri, F. et al. VEGF-A Links Angiogenesis and Inflammation in

Inflammatory Bowel Disease Pathogenesis. Gastroenterology 136, 585–595.e5

(2009).

128. Abdelouhab, K. et al. Mucosal intestinal alteration in experimental colitis

correlates with nitric oxide production by peritoneal macrophages: Effect of

probiotics and prebiotics. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 34, 590–597

(2012).

129. Dhillon, S. S. et al. Higher activity of the inducible nitric oxide synthase

contributes to very early onset inflammatory bowel disease. Clin. Transl.

140

Gastroenterol. 5, 1–7 (2014).

130. Avdagić, N. et al. Nitric oxide as a potential biomarker in inflammatory bowel

disease. Bosn. J. basic Med. Sci. / Udruzenje basicnih Med. Znan. = Assoc. Basic

Med. Sci. 13, 5–9 (2013).

131. Sasaki, M. et al. Increased disease activity in eNOS-deficient mice in

experimental colitis. Free Radic. Biol. Med. 35, 1679–1687 (2003).

132. Vallance, B. A. et al. Relative contributions of NOS isoforms during

experimental colitis: endothelial-derived NOS maintains mucosal integrity. Am.

J. Physiol. Liver Physiol. 287, G865–G874 (2004).

133. Beck, P. L. et al. Paradoxical roles of different nitric oxide synthase isoforms in

colonic injury. Am. J. Physiol. Liver Physiol. 286, G137–G147 (2004).

134. Kolios, G., Valatas, V. & Ward, S. G. Nitric oxide in inflammatory bowel

disease: A universal messenger in an unsolved puzzle. Immunology 113, 427–437

(2004).

135. Alkim, C. et al. Thrombospondin-1 and VEGF in inflammatory bowel disease.

Libyan J. Med. 7, 1–6 (2012).

136. Palatka, K. et al. Changes in the expression and distribution of the inducible and

endothelial nitric oxide synthase in mucosal biopsy specimens of inflammatory

bowel disease. Scand. J. Gastroenterol. 40, 670–680 (2005).

137. Adenis, A., Vanseymortier, L., Foissey, D. & Colombel, J. F. Bevacizumab and

postponed suture leakages after surgery for ulcerative colitis and rectal cancer

[5]. Gut 56, 734 (2007).

138. Boers-Sonderen, M. J. et al. Severe exacerbation of Crohn’s disease during

sunitinib treatment. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 234–236 (2014).

139. Diamanti, A. et al. The clinical implications of thalidomide in inflammatory

bowel diseases. Expert Rev. Clin. Immunol. 11, 699–708 (2015).

140. Rutella, S. et al. Infliximab therapy inhibits inflammation-induced angiogenesis

in the mucosa of patients with crohn’s disease. Am. J. Gastroenterol. 106, 762–

770 (2011).

141

141. Punekar, S. et al. Thrombospondin 1 and its mimetic peptide ABT-510 decrease

angiogenesis and inflammation in a murine model of inflammatory bowel

disease. Pathobiology 75, 9–21 (2008).

142. Lopez-Dee, Z. P. et al. Thrombospondin-1 type 1 repeats in a model of

inflammatory bowel disease: Transcript profile and therapeutic effects. PLoS One

7, (2012).

143. Gutierrez, L. S., Ling, J., Nye, D., Papathomas, K. & Dickinson, C.

Thrombospondin peptide ABT-898 inhibits inflammation and angiogenesis in a

colitis model. World J. Gastroenterol. 21, 6157–6166 (2015).

144. Te Velde, A. A. et al. Comparative analysis of colonic gene expression of three

experimental colitis models mimicking inflammatory bowel disease. Inflamm.

Bowel Dis. 13, 325–330 (2007).

145. Sato, H. et al. A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive

tumour cells. Nature 370, 61–65 (1994).

146. Hiraoka, N., Allen, E., Apel, I. J., Gyetko, M. R. & Weiss, S. J. Matrix

metalloproteinases regulate neovascularization by acting as pericellular

fibrinolysins. Cell 95, 365–377 (1998).

147. Zucker, S., Pei, D., Cao, J. & Lopez-Otin, C. Membrane type-matrix

metalloproteinases (MT-MMP). Curr. Top. Dev. Biol. 54, 1–74 (2003).

148. Koziol, A. et al. The protease MT1-MMP drives a combinatorial proteolytic

program in activated endothelial cells. FASEB J. 26, 4481–4494 (2012).

149. Genís, L., Gálvez, B. G., Gonzalo, P. & Arroyo, A. G. MT1-MMP: Universal or

particular player in angiogenesis? Cancer Metastasis Rev. 25, 77–86 (2006).

150. Han, Y. P., Tuan, T. L., Wu, H., Hughes, M. & Garner, W. L. TNF-alpha

stimulates activation of pro-MMP2 in human skin through NF-(kappa)B

mediated induction of MT1-MMP. J. Cell Sci. 114, 131–139 (2001).

151. Tomita, T. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor upregulates

matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and membrane type-1 MMP (MT1-MMP)

in human head and neck cancer cells. Cancer Lett. 156, 83–91 (2000).

142

152. Haas, T. L., Stitelman, D., Davis, S. J., Apte, S. S. & Madri, J. A. Egr-1 mediates

extracellular matrix-driven transcription of membrane type 1 matrix

metalloproteinase in endothelium. J. Biol. Chem. 274, 22679–22685 (1999).

153. Yun, S. et al. Transcription factor Sp1 phosphorylation induced by shear stress

inhibits membrane type 1-matrix metalloproteinase expression in endothelium. J.

Biol. Chem. 277, 34808–34814 (2002).

154. Gallardo-Vara, E. et al. Transcription factor KLF6 upregulates expression of

metalloprotease MMP14 and subsequent release of soluble endoglin during

vascular injury. Angiogenesis (2016). doi:10.1007/s10456-016-9495-8

155. Gramolelli, S. et al. PROX1 is a transcriptional regulator of MMP14. Sci. Rep. 8,

1–13 (2018).

156. Sato, H., Kinoshita, T., Takino, T., Nakayama, K. & Seiki, M. Activation of a

recombinant membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP) by furin

and its interaction with tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)-2. FEBS

Lett. 393, 101–104 (1996).

157. Yana, I. & Weiss, S. J. Regulation of Membrane Type-1 Matrix

Metalloproteinase Activation by Proprotein Convertases. Mol. Biol. Cell 11,

2387–2401 (2000).

158. Masciantonio, M. G., Lee, C. K. S., Arpino, V., Mehta, S. & Gill, S. E. The

Balance Between Metalloproteinases and TIMPs: Critical Regulator of

Microvascular Endothelial Cell Function in Health and Disease. Progress in

Molecular Biology and Translational Science 147, (Elsevier Inc., 2017).

159. Sato, H. & Takino, T. Coordinate action of membrane-type matrix

metalloproteinase-1 (MT1-MMP) and MMP-2 enhances pericellular proteolysis

and invasion. Cancer Sci. 101, 843–847 (2010).

160. Golan, K., Vagima, Y., Goichberg, P., Gur-Cohen, S. & Lapidot, T. MT1-MMP

and RECK: Opposite and essential roles in hematopoietic stem and progenitor

cell retention and migration. J. Mol. Med. 89, 1167–1174 (2011).

161. Oh, J. et al. The membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of

extracellular matrix integrity and angiogenesis. Cell (2001). doi:10.1016/S0092-

143

8674(01)00597-9

162. Gálvez, B. G., Matías-Román, S., Yáñez-Mó, M., Sánchez-Madrid, F. & Arroyo,

A. G. ECM regulates MT1-MMP localization with β1 or αvβ3 integrins at

distinct cell compartments modulating its internalization and activity on human

endothelial cells. J. Cell Biol. 159, 509–521 (2002).

163. Galvez, B. G. et al. Caveolae are a novel pathway for membrane-type 1 matrix

metalloproteinase traffic in human endothelial cells. Mol Biol Cell 15, 678–687

(2004).

164. Gonzalo, P., Moreno, V., Gálvez, B. G. & Arroyo, A. G. MT1-MMP and

integrins: Hand-to-hand in cell communication. BioFactors 36, 248–254 (2010).

165. Seano, G. et al. Endothelial podosome rosettes regulate vascular branching in

tumour angiogenesis. Nat. Cell Biol. 16, 931–941 (2014).

166. Takino, T. et al. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase modulates focal

adhesion stability and cell migration. Exp. Cell Res. 312, 1381–1389 (2006).

167. Gonzalo, P. & Arroyo, A. G. A novel component of the macrophage cell fusion

machinery. 3, 256–259 (2010).

168. Wang, Y. & McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions

occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. J. Cell Biol. 196,

375–385 (2012).

169. Golubkov, V. S. et al. Membrane type-1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP)

exhibits an important intracellular cleavage function and causes chromosome

instability. J. Biol. Chem. 280, 25079–25086 (2005).

170. Koziol, A., Martín-Alonso, M., Clemente, C., Gonzalo, P. & Arroyo, A. G. Site-

specific cellular functions of MT1-MMP. Eur. J. Cell Biol. 91, 889–895 (2012).

171. Gálvez, B. G., Matías-Román, S., Albar, J. P., Sánchez-Madrid, F. & Arroyo, A.

G. Membrane Type 1-Matrix Metalloproteinase is Activated during Migration of

Human Endothelial Cells and Modulates Endothelial Motility and Matrix

Remodeling. J. Biol. Chem. 276, 37491–37500 (2001).

172. Yahez-Mó, M. et al. MT1-MMP collagenolytic activity is regulated through

144

association with tetraspanin CD151 in primary endothelial cells. Blood 112,

3217–3226 (2008).

173. Hakulinen, J., Sankkila, L., Sugiyama, N., Lehti, K. & Keski-Oja, J. Secretion of

active membrane type 1 matrix metalloproteinase (MMP-14) into extracellular

space in microvesicular exosomes. J. Cell. Biochem. 105, 1211–1218 (2008).

174. Taraboletti, G. et al. Shedding of the matrix metalloproteinases MMP-2, MMP-9,

and MT1-MMP as membrane vesicle-associated components by endothelial cells.

Am. J. Pathol. 160, 673–680 (2002).

175. Rozanov, D. V. et al. Mutation analysis of membrane type-1 matrix

metalloproteinase (MT1-MMP): The role of the cytoplasmic tail Cys574, the

active site Glu240, and furin cleavage motifs in oligomerization, processing, and

self-proteolysis of MT1-MMP expressed in breast carcino. J. Biol. Chem. 276,

25705–25714 (2001).

176. Itoh, Y. et al. Homophilic complex formation of MT1-MMP facilitates proMMP-

2 activation on the cell surface and promotes tumor cell invasion. EMBO J. 20,

4782–4793 (2001).

177. Itoh, Y., Ito, N., Nagase, H. & Seiki, M. The second dimer interface of MT1-

MMP, the transmembrane domain, is essential for ProMMP-2 activation on the

cell surface. J. Biol. Chem. 283, 13053–13062 (2008).

178. Kim, J. Il, Cordova, A. C., Hirayama, Y., Madri, J. A. & Sumpio, B. E.

Differential effects of shear stress and cyclic strain on Sp1 phosphorylation by

protein kinase Czeta modulates membrane type 1-matrix metalloproteinase in

endothelial cells. Endothelium 15, 33–42 (2008).

179. Kang, H., Kwak, H. Il, Kaunas, R. & Bayless, K. J. Fluid shear stress and

sphingosine 1-phosphate activate calpain to promote Membrane Type 1 Matrix

Metalloproteinase (MT1-MMP) membrane translocation and endothelial invasion

into three-dimensional collagen matrices. J. Biol. Chem. 286, 42017–42026

(2011).

180. Kang, H., Duran, C. L., Abbey, C. A., Kaunas, R. R. & Bayless, K. J. Fluid shear

stress promotes proprotein convertase-dependent activation of MT1-MMP.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 460, 596–602 (2015).

145

181. Kridel, S. J. et al. A unique substrate binding mode discriminates membrane

type-1 matrix metalloproteinase from other matrix metalloproteinases. J. Biol.

Chem. 277, 23788–23793 (2002).

182. Ohuchi, E. et al. Membrane-Type metalloproteinase digests extracellular matrix

macromolecules including interstitial collagens. Matrix Biol. 16, 76–77 (1997).

183. Hotary, K. B. et al. Matrix metalloproteinases (MMPs) regulate fibrin-invasive

activity via MT1-MMP-dependent and -independent processes. J. Exp. Med. 195,

295–308 (2002).

184. Knäuper, V. et al. Cellular Mechanisms for Human Procollagenase-3 ( MMP-13

). 271, 17124–17131 (1996).

185. Chan, K. M. et al. MT1-MMP Inactivates ADAM9 to Regulate FGFR2 Signaling

and Calvarial Osteogenesis. Dev. Cell 22, 1176–1190 (2012).

186. Holopainen, J. M. et al. Activation of matrix metalloproteinase-8 by membrane

type 1-MMP and their expression in human tears after photorefractive

keratectomy. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2550–2556 (2003).

187. Karsdal, M. A. et al. Matrix metalloproteinase-dependent activation of latent

transforming growth factor-β controls the conversion of osteoblasts into

osteocytes by blocking osteoblast apoptosis. J. Biol. Chem. 277, 44061–44067

(2002).

188. Tam, E. M., Morrison, C. J., Wu, Y. I., Stack, M. S. & Overall, C. M. Membrane

protease proteomics: Isotope-coded affinity tag MS identification of undescribed

MT1-matrix metalloproteinase substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 6917–6922

(2004).

189. McQuibban, G. A. et al. Matrix Metalloproteinase Activity Inactivates the CXC

Chemokine Stromal Cell-derived Factor-1. J. Biol. Chem. 276, 43503–43508

(2001).

190. Mcquibban, G. A. et al. Matrix metalloproteinase processing of monocyte

chemoattractant proteins generates CC chemokine receptor antagonists with anti-

inflammatory properties in vivo. Blood 100, 1160–1167 (2002).

191. Han, K. Y., Dugas-Ford, J., Lee, H., Chang, J. H. & Azar, D. T. MMP14

146

cleavage of VEGFR1 in the cornea leads to a VEGF-trap antiangiogenic effect.

Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 5450–5456 (2015).

192. Covington, M. D., Burghardt, R. C. & Parrish, A. R. Ischemia-induced cleavage

of cadherins in NRK cells requires MT1-MMP (MMP-14). Am. J. Physiol. Renal

Physiol. 290, F43-51 (2006).

193. Kajita, M. et al. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase cleaves CD44 and

promotes cell migration. J. Cell Biol. 153, 893–904 (2001).

194. Egawa, N. et al. Membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP/MMP-

14) cleaves and releases a 22-kDa extracellular matrix metalloproteinase inducer

(EMMPRIN) fragment from tumor cells. J. Biol. Chem. 281, 37576–37585

(2006).

195. Deryugina, E. I., Ratnikov, B. I., Postnova, T. I., Rozanov, D. V. & Strongin, A.

Y. Processing of integrin av subunit by membrane type 1 matrix

metalloproteinase stimulates migration of breast carcinoma cells on vitronectin

and enhances tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase. J. Biol. Chem.

277, 9749–9756 (2002).

196. Jin, G. et al. MT1-MMP cleaves Dll1 to negatively regulate Notch signalling to

maintain normal B-cell development. EMBO J. 30, 2281–2293 (2011).

197. Mimura, T. et al. MT1-MMP-Mediated cleavage of decorin in corneal

angiogenesis. J. Vasc. Res. 46, 541–550 (2009).

198. Ohkawara, H., Ikeda, K., Ogawa, K. & Takeishi, Y. MEMBRANE TYPE 1 -

MATRIX METALLOPROTEINASE ( MT1 - MMP ) IDENTIFIED AS A

MULTIFUNCTIONAL REGULATOR OF VASCULAR RESPONSES. (2015).

199. Sugimoto, K. et al. LOX-1-MT1-MMP axis is crucial for RhoA and Rac1

activation induced by oxidized low-density lipoprotein in endothelial cells.

Cardiovasc. Res. 84, 127–136 (2009).

200. Ando, K. et al. Crucial Role of Membrane Type 1 Matrix Metalloproteinase

(MT1- MMP) in RhoA/Rac1-Dependent Signaling Pathways in Thrombin-

Stimulated Endothelial Cells. J. Atheroscler. Thromb. 18, 762–773 (2011).

201. Ohkawara, H. et al. Membrane type 1-matrix metalloproteinase/akt signaling axis

147

modulates TNF-α-induced procoagulant activity and apoptosis in endothelial

cells. PLoS One 9, 1–11 (2014).

202. Eisenach, P. A., Roghi, C., Fogarasi, M., Murphy, G. & English, W. R. MT1-

MMP regulates VEGF-A expression through a complex with VEGFR-2 and Src.

J. Cell Sci. 123, 4182–4193 (2010).

203. Sounni, N. E. et al. Up-regulation of Vascular Endothelial Growth Factor-A by

Active Membrane-type 1 Matrix Metalloproteinase Through Activation of Src-

Tyrosine Kinases. J. Biol. Chem. 279, 13564–13574 (2004).

204. Sakamoto, T. & Seiki, M. Cytoplasmic tail of MT1-MMP regulates macrophage

motility independently from its protease activity. Genes to Cells (2009).

doi:10.1111/j.1365-2443.2009.01293.x

205. Sakamoto, T. & Seiki, M. Mint3 enhances the activity of hypoxia-inducible

factor-1 (HIF-1) in macrophages by suppressing the activity of factor inhibiting

HIF-1. J. Biol. Chem. (2009). doi:10.1074/jbc.M109.019216

206. Sakamoto, T. & Seiki, M. A membrane protease regulates energy production in

macrophages by activating hypoxia-inducible factor-1 via a non-proteolytic

mechanism. J. Biol. Chem. (2010). doi:10.1074/jbc.M110.132704

207. Gonzalo, P. et al. MT1-MMP Is Required for Myeloid Cell Fusion via

Regulation of Rac1 Signaling. Dev. Cell 18, 77–89 (2010).

208. Holmbeck, K. et al. MT1-MMP-Deficient Mice Develop Dwarfism, Osteopenia,

Arthritis, and Connective Tissue Disease due to Inadequate Collagen Turnover

MMP Unit cellular tools in embryonic development, in growth, in mammary

involution, and in a number of diseases such. Cell 99, 81–92 (1999).

209. Atkinson, J. J. et al. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase is required for

normal alveolar development. Dev. Dyn. 232, 1079–1090 (2005).

210. Zhou, Z. et al. Impaired endochondral ossification and angiogenesis in mice

deficient in membrane-type matrix metalloproteinase I. Proc. Natl. Acad. Sci. 97,

4052–4057 (2000).

211. Gutierrez-Fernandez, A. et al. Loss of MT1-MMP causes cell senescence and

nuclear defects which can be reversed by retinoic acid. EMBO J. 34, 1875–1888

148

(2015).

212. Yana, I. et al. Crosstalk between neovessels and mural cells directs the site-

specific expression of MT1-MMP to endothelial tip cells. J. Cell Sci. 120, 1607–

1614 (2007).

213. Chun, T. H. et al. MT1-MMP-dependent neovessel formation within the confines

of the three-dimensional extracellular matrix. J. Cell Biol. 167, 757–767 (2004).

214. Oblander, S. A. et al. Distinctive functions of membrane type 1 matrix-

metalloprotease (MT1-MMP or MMP-14) in lung and submandibular gland

development are independent of its role in pro-MMP-2 activation. Dev. Biol. 277,

255–269 (2005).

215. Stratman, A. N. et al. MT1-MMP − dependent proteolysis in 3-dimensional

collagen matrices Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation

requires MT1-MMP – dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.

Analysis 114, 237–247 (2009).

216. Lehti, K. et al. An MT1-MMP-PDGF receptor-β axis regulates mural cell

investment of the microvasculature. Genes Dev. 19, 979–991 (2005).

217. Aplin, a C., Zhu, W. H., Fogel, E. & Nicosia, R. F. Vascular regression and

survival are differentially regulated by MT1-MMP and TIMPs in the aortic ring

model of angiogenesis. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C471–C480 (2009).

218. Uhlén, P. Spectral Analysis of Calcium Oscillations. Sci. Signal. (2004).

219. Rius, C. & Sanz, M. J. in Methods in Molecular Biology (2015).

doi:10.1007/978-1-4939-2929-0_26

220. Harrington, L. S. et al. Regulation of multiple angiogenic pathways by Dll4 and

Notch in human umbilical vein endothelial cells. Microvasc. Res. 75, 144–154

(2008).

221. Alghanem, A. F. et al. RCAN1.4 regulates VEGFR-2 internalisation, cell polarity

and migration in human microvascular endothelial cells. Angiogenesis 20, 341–

358 (2017).

222. Kempe, S., Kestler, H., Lasar, A. & Wirth, T. NF-κB controls the global pro-

149

inflammatory response in endothelial cells: Evidence for the regulation of a pro-

atherogenic program. Nucleic Acids Res. 33, 5308–5319 (2005).

223. Chidlow, J. H. et al. Differential angiogenic regulation of experimental colitis.

Am. J. Pathol. 169, 2014–2030 (2006).

224. Millarte, V. & Farhan, H. The Golgi in cell migration: Regulation by signal

transduction and its implications for cancer cell metastasis. Sci. World J. 2012,

(2012).

225. Zhao, C., Isenberg, J. S. & Popel, A. S. Human expression patterns: qualitative

and quantitative analysis of thrombospondin-1 under physiological and

pathological conditions. J. Cell. Mol. Med. 22, 2086–2097 (2018).

226. Lee, N. V. et al. ADAMTS1 mediates the release of antiangiogenic polypeptides

from TSP1 and 2. EMBO J. 25, 5270–5283 (2006).

227. Reynolds, A. R. et al. Stimulation of tumor growth and angiogenesis by low

concentrations of RGD-mimetic integrin inhibitors. Nat. Med. 15, 392–400

(2009).

228. Abdullaev, I. F. et al. Stim1 and orai1 mediate crac currents and store-operated

calcium entry important for endothelial cell proliferation. Circ. Res. 103, 1289–

1299 (2008).

229. Ge, R. et al. Critical role of TRPC6 channels in VEGF-mediated angiogenesis.

Cancer Lett. 283, 43–51 (2009).

230. Nakamura, N., Yamazawa, T., Okubo, Y. & Iino, M. Temporal switching and

cell-to-cell variability in Ca2+ release activity in mammalian cells. Mol Syst Biol

5, 247 (2009).

231. Marhl, M., Gosak, M., Perc, M. & Roux, E. Importance of cell variability for

calcium signaling in rat airway myocytes. Biophys. Chem. 148, 42–50 (2010).

232. Mack, J. J. et al. NOTCH1 is a mechanosensor in adult arteries. Nat. Commun.

(2017). doi:10.1038/s41467-017-01741-8

233. Smith, K. A. et al. Notch Activation of Ca 2 1 Signaling in the Development of

Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction and Pulmonary Hypertension. 53, 355–367

150

(2015).

234. Yamamura, H. et al. Activation of Notch signaling by short-term treatment with

Jagged-1 enhances store-operated Ca 2 ϩ entry in human pulmonary arterial

smooth muscle cells. 871–878 (2018). doi:10.1152/ajpcell.00221.2013

235. Kingsbury, T. J. & Cunningham, K. W. A conserved family of calcineurin

regulators. Genes Dev. 14, 1595–1604 (2000).

236. Holmes, K., Chapman, E., See, V. & Cross, M. J. Vegf stimulates RCAN1.4

expression in endothelial cells via a pathway requiring Ca2+/calcineurin and

protein kinase C-δ. PLoS One 5, 1–13 (2010).

237. Gianni-Barrera, R., Bartolomeo, M., Vollmar, B., Djonov, V. & Banfi, A. Split

for the cure: VEGF, PDGF-BB and intussusception in therapeutic angiogenesis.

Biochem. Soc. Trans. 42, 1637–1642 (2014).

238. Wong, H. L. X. et al. MT1-MMP sheds LYVE-1 on lymphatic endothelial cells

and suppresses VEGF-C production to inhibit lymphangiogenesis. Nat. Commun.

7, 10824 (2016).

239. D’Alessio, S. et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function

ameliorates experimental inflammatory bowel disease. J. Clin. Invest. (2014).

doi:10.1172/JCI72189

240. Song, J. W., Daubriac, J., Tse, J. M., Bazou, D. & Munn, L. L. RhoA mediates

flow-induced endothelial sprouting in a 3-D tissue analogue of angiogenesis. Lab

Chip (2012). doi:10.1039/c2lc40389g

241. Chang, A. H. et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell

migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling

axis. Genes Dev. 31, 1308–1324 (2017).

242. Kellogg, D. L., Zhao, J. L., Coey, U. & Green, J. V. Acetylcholine-induced

vasodilation is mediated by nitric oxide and prostaglandins in human skin. J.

Appl. Physiol. 98, 629–632 (2004).

243. Egginton, S. Shear Stress Response. Biochem. Soc. Trans. 39, 1633–1638 (2011).

244. Dawson, D. W. et al. CD36 mediates the in vitro inhibitory effects of

151

thrombospondin- 1 on endothelial cells. J.Cell Biol. 138, 707–717 (1997).

245. Mirochnik, Y., Kwiatek, A. & Volpert, O. Thrombospondin and Apoptosis:

Molecular Mechanisms and Use for Design of Complementation Treatments.

Curr. Drug Targets 9, 851–862 (2008).

246. Lawler, P. R. & Lawler, J. Molecular basis for the regulation of angiogenesis by

thrombospondin-1 and -2. Cold Spring Harb. Perspect. Med. (2012).

doi:10.1101/cshperspect.a006627

247. Chu, L. Y., Ramakrishnan, D. P. & Silverstein, R. L. Thrombospondin-1

modulates VEGF signaling via CD36 by recruiting SHP-1 to VEGFR2 complex

in microvascular endothelial cells. Blood 122, 1822–1832 (2013).

248. Kaur, S. et al. Thrombospondin-1 inhibits VEGF receptor-2 signaling by

disrupting its association with CD47. J. Biol. Chem. 285, 38923–38932 (2010).

249. Laklai, H. et al. Thrombospondin-1 is a critical effector of oncosuppressive

activity of sst2 somatostatin receptor on pancreatic cancer. Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. (2009). doi:10.1073/pnas.0908674106

250. Isenberg, J. S. et al. Thrombospondin-1 inhibits nitric oxide signaling via CD36

by inhibiting myristic acid uptake. J. Biol. Chem. 282, 15404–15415 (2007).

251. Rogers, N. M., Sharifi-Sanjani, M., Csányi, G., Pagano, P. J. & Isenberg, J. S.

Thrombospondin-1 and CD47 regulation of cardiac, pulmonary and vascular

responses in health and disease. Matrix Biol. (2014).

doi:10.1016/j.matbio.2014.01.002

252. Nicosia, R. F. & Tuszynski, G. P. Matrix-bound thrombospondin promotes

angiogenesis in vitro. J. Cell Biol. 124, 183–193 (1994).

253. Benezra, D., Griffin, B. W., Maftzir, G. & Aharonov, O. Thrombospondin and

Invivo Angiogenesis Induced by Basic Fibroblast Growth Factor or

Lipopolysaccharide. Invest.Ophthalmol.Visual Sci. 34, 3601–3608 (1993).

254. Iruela-Arispe, M. Regulation of Thrombospondin1 by Extracellular Proteases.

Curr. Drug Targets (2008). doi:10.2174/138945008785909365

255. Ferrari do Outeiro-Bernstein, M. A. et al. A recombinant NH2-terminal heparin-

152

binding domain of the adhesive glycoprotein, thrombospondin-1, promotes

endothelial tube formation and cell survival: A possible role for syndecan-4

proteoglycan. Matrix Biol. 21, 311–324 (2002).

256. Gutierrez, L. S. The role of thrombospondin 1 on intestinal inflammation and

carcinogenesis. Biomark. Insights 2008, 171–178 (2008).

257. Butler, G. S., Dean, R. A., Tam, E. M. & Overall, C. M. Pharmacoproteomics of

a Metalloproteinase Hydroxamate Inhibitor in Breast Cancer Cells: Dynamics of

Membrane Type 1 Matrix Metalloproteinase-Mediated Membrane Protein

Shedding. Mol. Cell. Biol. 28, 4896–4914 (2008).

258. Lindberg, F. P., Gresham, H. D., Reinhold, M. I. & Brown, E. J. Integrin-

associated protein immunoglobulin domain is necessary for efficient vitronectin

bead binding. J. Cell Biol. 134, 1313–1322 (1996).

259. Sipes, J. M., Krutzsch, H. C., Lawler, J. & Roberts, D. D. Cooperation between

thrombospondin-1 type 1 repeat peptides and α(v)β3 integrin ligands to promote

melanoma cell spreading and focal adhesion kinase phosphorylation. J. Biol.

Chem. 274, 22755–22762 (1999).

260. Gao, A. G., Lindberg, F. P., Dimitry, J. M., Brown, E. J. & Frazier, W. A.

Thrombospondin modulates α(v)β3function through integrin-associated protein.

J. Cell Biol. 135, 533–544 (1996).

261. Jiménez, B. et al. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of

neovascularization by thrombospondin-1. Nat. Med. (2000). doi:10.1038/71517

262. Ratnikov, B. I. et al. An alternative processing of integrin αv subunit in tumor

cells by membrane type-1 matrix metalloproteinase. J. Biol. Chem. 277, 7377–

7385 (2002).

263. Danese, S. et al. Angiogenesis blockade as a new therapeutic approach to

experimental colitis. Gut 56, 855–862 (2007).

264. De Paepe, M. E., Benny, M. K. V., Priolo, L., Luks, F. I. & Shapiro, S. Florid

intussusceptive-like microvascular dysangiogenesis in a preterm lung. Pediatr.

Dev. Pathol. (2017). doi:10.1177/1093526616686455

265. De Paepe, M. E., Greco, D. & Mao, Q. Angiogenesis-related gene expression

153

profiling in ventilated preterm human lungs. Exp. Lung Res. (2010).

doi:10.3109/01902141003714031

266. Ribatti, D. & Djonov, V. Intussusceptive microvascular growth in tumors.

Cancer Letters (2012). doi:10.1016/j.canlet.2011.10.040

267. Henkin, J. & Volpert, O. V. Therapies using anti-angiogenic peptide mimetics of

thrombospondin-1. Expert Opin. Ther. Targets (2011).

doi:10.1517/14728222.2011.640319

156

“Somos los mismos que cuando empezamos

¡Cuidado!”

departamento de bioquímica - digital csic

Documents