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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA
DENSIDADE POPULACIONAL DE HOSPEDEIROS E SUA RELAÇÃO
COM PREVALÊNCIA E DIVERSIDADE DE PARASITAS
CAUSADORES DA MALÁRIA AVIÁRIA ENTRE AVES DE SUB-
BOSQUE NA FLORESTA AMAZÔNICA
CAROLINA SCHUCH DE OLIVEIRA
Manaus, Amazonas
Julho, 2015
CAROLINA SCHUCH DE OLIVEIRA
DENSIDADE POPULACIONAL DE HOSPEDEIROS E SUA RELAÇÃO
COM PREVALÊNCIA E DIVERSIDADE DE PARASITAS
CAUSADORES DA MALÁRIA AVIÁRIA ENTRE AVES DE SUB-
BOSQUE NA FLORESTA AMAZÔNICA
ORIENTADOR: GONÇALO FERRAZ
Dissertação apresentada ao Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia
como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em
Biologia (Ecologia).
Manaus, Amazonas
Julho, 2015
BANCA AVALIADORA
Parecer
Dr. Igor Luis Kaeffer (UFAM) Aprovado
Dra. Luiza Magalli Henriques (INPA) Aprovado
Dr. Rafael Leandro de Assis (INPA) Aprovado
i
O48 Oliveira, Carolina Schuch de
Densidade populacional de hospedeiros e sua relação com
prevalência e diversidade de parasitas causadores da malária
aviária entre aves de sub-bosque na floresta amazônica / Carolina
Schuch de Oliveira. --- Manaus: [s.n.], 2015.
vi, 51 f. : il. color.
Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2015.
Orientador : Gonçalo Ferraz.
Área de concentração : Ecologia.
1.Ecologia de populações. 2. Malária aviária. 3. Interação
parasita-hospedeiro. I. Título.
CDD 616.9362
Sinopse
Este trabalho testou predições de correlação positiva entre a densidade populacional de aves e
duas métricas de infecção para malária aviária, prevalência e número de linhagens de
parasitas, para doze espécies de aves de sub-bosque em uma floresta amazônica de terra firme
príxima a Manaus. A densidade populacional dos hospedeiros foi estimada com o uso de um
modelo de marcação-recaptura espacialmente explícito, ajustado para dados de cinco meses
de amostragem na área de estudo.
Palavras-chave: Plasmodium, Haemoproteus, Denso-dependência, Haemosporidae,
Interação parasita-hospedeiro.
ii
Agradecimentos
Agradeço ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, em especial ao Programa de Pós-
Graduação em Ecologia pelo curso de mestrado disponibilizado e ao CNPq pela minha bolsa
de estudo.
À FAPEAM e ao Smithsonian Institution pelo financiamento do projeto em que minha
pesquisa se inseriu, e ao Malaria Research Coordination Network pelo apoio financeiro que
permitiu meu treinamento laboratorial e a realização das análises moleculares.
Ao Projeto Dinâmica Biológica de Fragmentos Florestais pela infraestrutura e apoio logístico.
Ao Laboratório de Evolução e Genética Animal (LEGAL) da Universidade Federal do
Amazonas, pelo apoio na preparação das amostras e boa vontade de sua equipe.
Ao Dr. Robert Ricklefs e sua equipe por terem me recebido com tanta gentileza e
generosidade em seu laboratório.
À Letícia Soares pelo tempo dedicado ao meu treinamento, a este projeto, e a me dar o tão
necessário apoio moral.
Aos companheiros de campo e amigos Juruna, Aída, Luíza, Pedro, Alejandra, Chico e
Gilberto, por viabilizarem esse projeto e me ensinarem muito; e ao Rafael pelo apoio logístico
da melhor qualidade.
Ao meu orientador Gonçalo Ferraz, pelo comprometimento com este trabalho e por ter me
feito aprender mais do que eu acreditava que seria capaz.
À minha família pelo apoio emocional, psicológico e logístico. Em especial à minha mãe, Ana
Schuch, pela paciência e incondicionalidade desse apoio, além dos bons exemplos de sempre.
Aos meus amigos, por serem a extensão da minha família e continuarem gostando de mim
apesar da loucura e das ausências.
iii
Resumo
Este trabalho testou duas predições de correlação positiva entre densidade populacional de
aves e duas métricas de infecção para malária aviária: prevalência e número de linhagens de
parasitas. A prevalência mensura a proporção de indivíduos infectados na população de
hospedeiros, enquanto o número de linhagens mensura a diversidade de parasitas. Para tal,
nós estimamos a densidade populacional de doze espécies de aves de sub-bosque (sete
Thamnophilidae e cinco Furnariidae) usando um modelo de marcação-recaptura
espacialmente explícito, ajustado para dados de cinco meses de amostragem em uma floresta
de terra firme próxima a Manaus (Amazonas, Brasil). Esta abordagem leva em consideração
as movimentações dos indivíduos e a imperfeição do processo de amostragem, nos permitindo
obter estimativas do número de indivíduos por unidade de área (densidade) com incertezas
associadas, proporcionando uma visão mais acurada do sistema parasita-hospedeiro através da
redução do viés amostral. Para estimar a prevalência e número de linhagens para cada espécie
hospedeira, coletamos e analisamos amostras de sangue de indivíduos hospedeiros com
ensaios de PCR (Polymerase Chain Reaction) e sequenciamento do DNA mitocondrial dos
parasitas. Estas amostras são provenientes das mesmas aves capturadas para estimar a
densidade de espécies. Nossos resultados não apoiaram as predições de relação positiva entre
densidade do hospedeiro e as duas métricas de infecção. A ausência de relação entre
abundância e prevalência reforça a ideia de que a transmissão indireta por vetores artrópodes
evita que a raridade de hospedeiros e limita a prevalência. Por outro lado, a ausência de uma
relação entre densidade e número de linhagens sugere que uma comunidade de parasitas em
sua maioria generalistas é compartilhada com um amplo grupo de espécies.
Palavras-chave: Denso-dependência, Haemoproteus, Haemosporidae, Interação parasita-hospedeiro,
Plasmodium
iv
Abstract
Host population density and its relation with prevalence and diversity of avian malaria
parasites in understory birds in Amazonian forest.
This work tested two predictions of positive correlation between birds population density and
two metrics of avian malaria infection: prevalence and number of parasites lineages.
Prevalence measures the proportion of infected individuals in the host population, while
number of lineages measures the parasite diversity. For this, we estimated the population
density of twelve Amazonian understory bird species (seven Thamnophilidae and five
Furnariidae) using a spatially explicit mark-recapture model, fitted to five months of banding
data in a upland forest site near Manaus (Amazonas, Brazil). This approach takes into account
the individual moviments and the imperfection of sampling process, allowing us to obtain
estimates of number of individuals per unit area (density) with associated uncertainties,
providing a more accurate picture of a parasite-host system by reducing the sample bias. To
estimate prevalence and number of lineages for each host species, we collected and analysed
blood samples from host individuals with PCR assays and sequencing of the parasites’
mitochondrial DNA. These samples were taken from the same birds that appear in the mark-
recapture data used for estimate species density. Our results didn’t support predictions of a
positive relation between host abundance and the two metrics of infection. The absence of
relation between abundance and prevalence reinforces the idea that indirect transmission by
arthropod vectors prevents host rarity from limiting prevalence. On the other hand, the
absence of a relation between density and number of lineages suggests that a community of
mostly generalist parasites is shared by a wide group of species.
Key-words: Density-dependence, Haemoproteus, Haemosporidae, host-parasite interaction,
Plasmodium
v
Sumário
Introdução 1
Objetivo geral 5
Objetivos específicos 5
Capítulo 1: Host population density and its relation with prevalence and diversity of avian
malaria parasites in understory birds in Central Amazonia
7
Cover page 8
Summary 9
1. Introduction 10
2. Materials and methods 12
2.1 Study Area 12
2.2 Sampling Design 12
2.3 Host density estimation 14
2.4 Avian malaria detection and prevalence estimation 15
2.5 Haemosporidians’ DNA genotyping and lineage diversity 16
3. Results 16
4. Discussion 19
Acknowledgments 21
References 22
Tables 25
Figure legends 26
Figures 27
Appendix S1. Description of PCR assays 30
Appendix S2. Table S1. Captures, molecular data and analysis results for all avian species analysed 31
Appendix S3. Table S2. Haemosporidian lineages, genus and used source 35
vi
Appendix S4. SCR0 model in BUGS language 36
Appendix S5 – Prevalence model in BUGS language 37
Conclusão 38
Anexos 39
1
Introdução
Os parasitas causadores da malária aviária, protozoários (Filo Apicomplexa, Ordem
Hemosporida) transmitidos por vetores, infectam o sangue de diversas espécies de
vertebrados. Levando em consideração características morfológicas e do ciclo de vida dos
parasitas, o termo malária tradicionalmente era utilizado para designar infecções por parasitas
do gênero Plasmodium. Porém, mais recentemente, análises filogenéticas mostraram que o
gênero de protozoários Haemoproteus é geneticamente próximo a Plasmodium sp, de modo
que, apesar de suas diferenças, passou a ser incluído entre o grupo de parasitas da malária
aviária (Ricklefs et al. 2005). De fato, dados moleculares mostraram que as espécies de
Plasmodium sp de aves e repteis são mais próximas geneticamente de Haemoproteus sp do
que de Plasmodium sp de mamíferos (Pérez-Tris et al. 2005; Ricklefs et al. 2005).
Estudos moleculares identificaram mais de 1300 linhagens de hemosporídeos em aves
(Clark, Clegg & Lima 2014), sendo os parasitas da malária aviária um grupo diverso e
abundante na maior parte das famílias (Valkiunas 2005). O gênero Plasmodium é comum em
aves de todos os continentes exceto Antártida (Valkiunas 2005; Bensch, Hellgren & Pérez-
Tris 2009; Perkins 2014), enquanto Haemoproteus é também amplamente distribuído, porém
não foi detectado por testes moleculares na Nova Zelândia, Havaí e Polinésia Francesa
(embora linhagens de Haemoproteus sp tenham sido descritas por técnicas de microscopia no
Havaí) (Valkiunas 2005; Clark et al. 2014). Em um estudo recente de análise de dados de
distribuição e estimativas de diversidade, Clark et al.(2014) estimou que a diversidade de
Haemoproteus sp é significativamente mais alta do que a de Plasmodium sp em todas as áreas
em que os gêneros co-ocorrem, com exceção da América do Sul, onde a diversidade de
Plasmodium é mais alta.
Plasmodium sp e Haemoproteus sp apresentam ciclos de vida complexos que utilizam
dois grupos de hospedeiros diferentes, vertebrados (Como as aves, no caso deste estudo) e
invertebrados (dípteros hematófagos). Embora apresentem semelhanças entre si, os ciclos de
vida destes parasitas possuem diferenças importantes, como o invertebrado utilizado:
Plasmodium sp utiliza mosquitos da família Culicidae, enquanto Haemoproteus sp utiliza
insetos da família Ceratopogonidae (meruins) e Hippoboscidade.
2
Resumidamente, o ciclo de vida do parasita no hospedeiro invertebrado começa
quando o vetor ingere sangue de um pássaro infectado que contenha os parasitas na forma de
gametócitos. Um processo sexuado conhecido como esporogonia ocorre no trato digestório do
inseto infectado, dando origem a células chamadas esporozoítos, que migram para suas
glândulas salivares. Isso possibilita que os esporozoítos sejam inoculados pelo inseto no
momento em que ele pica um novo hospedeiro vertebrado suscetível. Uma vez neste
hospedeiro, o parasita passa por uma fase de reprodução assexuada nas células do sistema
reticuloendotelial (monócitos e macrófagos) em diferentes partes do corpo dependendo do seu
gênero, aumentando a carga parasitária. Esta fase equivale ao período pré-patente da
parasitose (Valkiunas 2005). A partir daí, o estágio agora chamado de merozoíto pode
perpetuar o ciclo de reprodução assexual ou então passar por um desenvolvimento diferencial
que resulta na formação de células sexuais especializadas na transição entre o hospedeiro
vertebrado e o invertebrado, os gametócitos.
No gênero Plasmodium, após o período pré-patente os merozoítos invadem as células
vermelhas do hospedeiro e, após uma sucessão de estágios e reproduções assexuadas, passam
por um desenvolvimento diferencial que resulta na formação de células sexuais especializadas
na transição entre o hospedeiro vertebrado e o invertebrado, os gametócitos. Os parasitas do
gênero Haemoproteus não realizam merogonia nos eritrócitos do hospedeiro, e sim em
diferentes tecidos do corpo (Atkinson 2008). De qualquer forma, após esta fase, os
gametócitos se reproduzem dentro dos eritrócitos de seus hospedeiros, e esta fase é chamada
ciclo eritrocítico. Os gametócitos tem potencial para produção de gametas, mas só o fazem
quando no hospedeiro invertebrado. Assim, insetos que piquem os hospedeiros e ingiram
gametócitos completam o ciclo. Uma vez que a reprodução sexuada ocorre nos vetores, os
pássaros são considerados hospedeiros intermediários e os invertebrados hospedeiros finais
(Valkiunas 2005).
A malária em aves tem cinco estágios conhecidos: pré-patente, agudo, crise, crônico e
latente. A fase pré-patente ocorre quando o parasita ainda está se reprodizindo fora do sangue
do hospedeiro. O estágio agudo ocorre quando os parasitas estão na forma infectante no
sangue do hospedeiro (parasitemia); e quando a parasitemia atinge um pico ocorre a crise. A
parasitemia pode durar desde uma a várias semanas ou até meses, dependendo da linhagem do
parasita, espécie do hospedeiro e outros fatores. Após este período, há uma redução na
quantidade de parasitas no sangue e a infecção se torna crônica no hospedeiro sobrevivente, o
3
qual passa a manter uma infecção persistente com baixa carga parasitária no sangue. Este
estágio também pode ter duração variável. Após a fase crônica, a malária aviária
frequentemente entra num estágio latente, onde os parasitas desaparecem do sangue do
hospedeiro, mas persistem em órgãos internos, como fígado e baço. Recidivas (quando o
parasita torna a aparecer no sangue do hospedeiro) podem ocorrer periodicamente,
especialmente no período reprodutivo (Valkiunas 2005).
As informações disponíveis a respeito da patogenicidade de hemosporídeos em aves
são quase completamente baseadas em resultados de experimentos laboratoriais com aves
domésticas. Indivíduos infectados com sinais clínicos costumam apresentar anemia, letargia,
anorexia e penas eriçadas (Atkinson 2008). As patologias mais sérias causadas por
Plasmodium sp são associadas com o bloqueio de capilares em órgãos vitais pelo acúmulo de
parasitas e suas consequências. Para hemosporídeos em geral, uma consequência patológica
importante do desenvolvimento dos parasitas no sangue é a anemia causada pela destruição
dos eritrócitos (Valkiunas 2005).
Embora existam muitos registros a respeito de infecções patogênicas, os impactos da
malária aviária no fitness e na dinâmica populacional das aves é pouco compreendido (Wood
& Cosgrove 2006). Registros de epizootias são raros e mais comumente associados a aves de
cativeiro (Lapointe, Atkinson & Samuel 2012) e introdução de parasitas ou vetores em áreas
livres de malária aviária. Por exemplo, este foi o caso no Hawaii, onde a introdução do vetor
Culex quinquefasciatus em 1826 possibilitou a infecção de hospedeiros até então livres da
doença por Plasmodium relictum (Woodworth et al. 2005), causando alta mortalidade e
implicando em extinção, declínio de populações e restrição da distribuição de múltiplas
espécies (Lapointe et al. 2012).
Com exceção de epizootias, registros de doença aguda ou morte em pássaros de vida
livre são difíceis de obter, pois o estágio agudo da malária aviária é breve e pode produzir
mortalidade significativa (Lachish et al. 2011). Além disso, indivíduos doentes são menos
detectáveis, uma vez que se movem menos e podem ser mais rapidamente predados do que os
saudáveis. Pela possibilidade de existência desse viés, é possível que a informação a respeito
dos seus efeitos em populações silvestres seja baseada, em sua maioria, em indivíduos com
infecções crônicas e latentes (Valkiunas 2005). Entretanto, infecções crônicas parecem ter
custo no fitness dos hospedeiros, como diminuição da capacidade competitiva (Valkiunas
4
2005), menor número de filhotes sobreviventes (Knowles, Wood & Sheldon 2010) e menor
expectativa de vida (Asghar et al. 2015).
De qualquer forma, informações a respeito dos efeitos da malária aviária em
populações silvestres nas quais a infecção é endêmica são escassas (Lachish et al. 2011) e na
maior parte baseadas em estudos com uma única espécie. Estudos experimentais em
populações do chapin-azul (Paridae: Cyanistes caeruleus) das áreas temperadas da Europa e
Ásia ocidental, encontraram que tanto infecções agudas quanto crônicas implicam em
diminuição das taxas de sobrevivência (Lachish et al. 2011) e uma exacerbação do
compromisso entre quantidade e qualidade de prole (Knowles et al. 2010).
Dentre as questões de como os parasitas da malária aviária se comportam em
populações silvestres endêmicas está a importância da densidade populacional de seus
hospedeiros. Quando a densidade do hospedeiro tem um papel importante na transmissão do
parasita, e portanto na sua prevalência, a transmissão é chamada denso-dependente (Begon et
al. 2002). A transmissão denso-dependente pode ocorrer em parasitas com ciclo de vida direto
(que utiliza apenas um hospedeiro em seu ciclo de vida) ou indireto (dois ou mais
hospedeiros). No caso de parasitas com ciclo de vida indireto, a razão entre as populações de
vetores e de hospedeiros vai ser determinante (Anderson & May 1979), uma vez que a
transmissão se relaciona com a probabilidade de encontro entre hospedeiros. Assim, quanto
maior o número de indivíduos hospedeiros por unidade de área, mais oportunidades para
novas infecções e, consequentemente, maior a prevalência dos parasitas na população de
hospedeiros. Essas motivações teóricas a respeito da transmissão denso-dependente de
parasitas são apoiadas por alguns estudos empíricos que encontraram relação positiva entre
densidade de hospedeiro e prevalência de parasitas (Goater, Goater & Esch 2014), inclusive
para parasitas da malária aviária (Isaksson et al. 2013; Drovetski et al. 2014).
Além disso, diferentes densidades de hospedeiros também podem direcionar a
diversidade de parasitas em uma população. Se hospedeiros que ocorram em altas densidades
populacionais tendem a ser mais facilmente infectados por parasitas de um modo geral
(Poulin 2006), podemos esperar que populações com altas densidades apresentem maior
diversidade de parasitas. Esta predição foi confirmada por estudos empíricos que encontraram
relação entre densidade populacional e diversidade de parasitas em diferentes espécies de
hospedeiros (Morand & Poulin 1998; Arneberg 2002; Lindenfors et al. 2007).
5
Justamente porque a transmissão é relacionada com a probabilidade de encontro entre
hospedeiros, é o número de indivíduos por unidade de área que influencia as oportunidades de
novas infecções para os parasitas. Assim, quando falamos a respeito de infecções em uma
população de hospedeiros, uma estimativa de abundância não específica (a qual retorna o
possível número de indivíduos em uma situação de amostragem) não é tão informativa quanto
um valor de densidade. Além disso, é importante considerar que a detecção de parasitas em
uma amostra biológica não é perfeita, mesmo em técnicas moleculares sensíveis como a PCR
(Polymerase Chain Reaction) (Valkiunas 2005). Portanto, quanto maior o número de
amostras, maior a probabilidade de sucesso em encontrar indivíduos infectados e também de
detectar um maior número de espécies de parasitas, o que poderia distorcer nossa impressão a
respeito da influência da denso-dependência, enfatizando-a excessivamente. Por essas razões,
o uso de estimativas do número de indivíduos por unidade de área e suas incertezas associadas
podem ser decisivas para a interpretação das relações denso-dependentes.
Neste trabalho nós testamos as predições de relação positiva entre densidade
populacional de aves e infecção por malária aviária. Nós estimamos o número de indivíduos
hospedeiros por unidade de área usando modelos matemáticos que levam em conta os
movimentos dos indivíduos capturados, e analisamos os ensaios moleculares levando em
consideração o processo amostral. Essa abordagem contribuiu para a construção de um retrato
mais acurado do sistema parasita-hospedeiro e de sua relação com a densidade populacional
do hospedeiro.
Objetivo geral:
Investigar se a prevalência e diversidade de parasitas causadores da malária aviária em
populações de espécies de aves de sub-bosque na floresta amazônica tem relação com a
densidade populacional de seus hospedeiros vertebrados.
Objetivos específicos:
1- Obter estimativas do número de indivíduos por unidade de área para espécies de aves
de sub-bosque na área estudada.
6
2- Testar se existe correlação positiva entre a densidade populacional de aves e duas
métricas de infecção para malária aviária, prevalência e número de linhagens de
parasitas.
7
Capítulo 1
Oliveira, C.S.; Soares, LS; Farias, IP; Ferraz, G. Host
population density and its relation with prevalence and
diversity of avian malaria parasites in understory birds in
Central Amazonia. Manuscrito formatado para a revista
Journal of Animal Ecology.
8
Host population density and its relation with prevalence and 1
diversity of avian malaria parasites in understory birds 2
in Central Amazonia 3
4
5
6
Carolina Schuch *a, Letícia Soares b, Izeni Pires Farias c, Gonçalo Ferraz d 7
aPrograma de Pós-Graduação em Ecologia, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, 8
Manaus, Brazil 9
b University of Missouri- Saint Louis, Sait Louis, United States 10
c Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Brazil 11
d Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil 12
*Corresponding author: [email protected] 13
14
15
16
17
9
Summary 18
This work tested two predictions of positive correlation between avian population density and 19
two metrics of avian malaria infection: prevalence and number of parasites lineages. 20
Prevalence measures the proportion of infected individuals in the host population, while 21
number of lineages measures the parasite diversity. For this, we estimated the population 22
density of twelve Amazonian understory bird species (seven Thamnophilidae and five 23
Furnariidae) using a spatially explicit mark-recapture model, fitted to five months of banding 24
data in a upland forest site near Manaus (Amazonas, Brazil). This approach takes into account 25
the individuals movements and the imperfection of sampling process, allowing us to obtain 26
estimates of number of individuals per unit area (density) with associated uncertainties, 27
providing a more accurate picture of a parasite-host system by reducing the sample bias. To 28
estimate prevalence and number of lineages for each host species, we collected and analysed 29
blood samples from host individuals with PCR assays and sequencing of the parasites’ 30
mitochondrial DNA. These samples were taken from the same birds that appear in the mark-31
recapture data used for estimate species density. Our results didn’t support predictions of a 32
positive relation between host abundance and the two metrics of infection. The absence of 33
relation between abundance and prevalence reinforces the idea that indirect transmission by 34
arthropod vectors prevents host rarity from limiting prevalence. On the other hand, the 35
absence of a relation between density and number of lineages suggests that a community of 36
mostly generalist parasites is shared by a wide group of species. 37
Key-words: Density-dependence, Haemosporidae, Haemoproteus, host-parasite interaction, 38
Plasmodium. 39
40
41
10
1. Introduction 42
A parasite’s population dynamics depends on population characteristics of its host, such as the 43
number of susceptible individuals, the pathogen infectivity, host resistance and availability of 44
whatever transmits the infection. The transmission rate depends on the proportion among 45
infected hosts (in the case of a direct parasite life cycle) or vectors (in the case of parasites 46
with indirect life cycle) and the susceptible individuals. When the hosts densities plays a 47
important role in the parasite transmission, and therefore in its prevalence, the transmission is 48
called density-dependent (Begon et al. 2002). 49
The density-dependent transmission can occur in direct or indirect parasitic life cycles. In the 50
case of parasites with indirect life cycle, the ratio between the sizes of the populations of 51
vectors and hosts will be determinant (Anderson & May 1979). Moreover, host species 52
occurring at high population densities tend to be more easily infected by different parasite 53
species (Poulin 2006), resulting in greater parasitic diversity. This prediction was confirmed 54
by empirical studies that found a relationship between population density and diversity of 55
parasites in different host species (Morand & Poulin 1998; Arneberg 2002; Lindenfors et al. 56
2007). 57
There are compelling biological motifs and well-established theory regarding the density-58
dependent parasite transmission (Anderson & May 1979) and consequent positive effect of 59
population size on the host prevalence (Goater et al. 2014) and diversity of parasites (Poulin 60
2006). When we study parasites infections in a host population, a non-specified abundance 61
estimative (which returns the possible number of individuals in a sampling situation) is not 62
informative as a density value. Once transmission is related with encounter probability among 63
hosts, is the number of individuals per area unit that influences the parasites’ opportunities for 64
new infections. 65
11
The use of a method to estimate host population abundance that takes into account the 66
movements of individuals captured allow us to obtain estimates of the number of individuals 67
per unit area (density) with associated uncertainties (Royle, Kéry & Guélat 2011), and that 68
can make a difference in the interpretation of density-dependent relations. This approach for 69
abundance estimates, called spatially explicit mark-recapture model (SECR), in the estimates 70
of host abundance can contribute to provide a more accurate picture of a parasite-host system 71
by reducing the sample bias. 72
Another issue that can influence our perception about both metrics of parasite infection is the 73
vertebrate hosts’ samplig process. Once prevalence and diversity are estimated from samples 74
within a population, and the capture success is influenced by host density (among other 75
factors), the more common is the host, more biological samples will be potentially collected. 76
Since the detection of parasites in a biological sample is not perfect, the larger the number of 77
samples, the higher the probability of success in finding infected individuals and also to detect 78
a larger number of parasites species, which could distort our impression regarding this 79
relationship, emphasizing it excessively. For this reason, we will take into account the 80
sampling process also in the statistical analysis of molecular assays. 81
Although the transmission of density-dependent parasites is an old subject, the empirical 82
information about the prevalence of parasites in relations with indirect life cycle is scarce, 83
which led us to choose the parasites of avian malaria, the protozoans Plasmodium and 84
Haemoproteus, as models. In recent years, the development of molecular techniques to detect 85
these parasites generated a significant amount of new information on the subject (Fallon et al. 86
2004; Wood & Cosgrove 2006; Knowles et al. 2010; Lapointe et al. 2012), which have been 87
used successfully in studies testing hypotheses about the host-parasite interactions in wild 88
birds (Tella 2002; Lachish et al. 2011; Isaksson et al. 2013). 89
12
In this study, we estimated the number of individuals per area unit of twelve understory birds 90
species in a Central Amazonian forest. Then, with the protozoans Plasmodium and 91
Haemoproteus as models, we investigated the correlation between understory Amazonian bird 92
population density and two metrics of avian malaria infection: prevalence and number of 93
parasites lineages. 94
2. Material and methods 95
2.1 Study Area 96
Fieldwork took place in the study area of the Biological Dynamics of Forest Fragments 97
Project (BDFFP), 70 km north of Manaus, Amazonas, Brazil. The BDFFP area has a tropical 98
rainforest climate with mean annual rainfall around 2,200 mm and a pronounced dry season 99
from June to October with less than 100 mm of rain per month (Gascon & Bierregaard 2001). 100
The vegetation is predominantly dense evergreen upland forest with approximately 75 km2 of 101
29-to-32-year-old secondary-forest patches surrounded by a matrix of old-growth forest that 102
extends hundreds of km to the west, north, and east (Fig. 1; Mesquita et al. 2001). For 103
logistic convenience and bird safety reasons, we sampled always during the dry season, 104
between June 2011 and October 2014. 105
2.2 Sampling design 106
Our sampling design followed a two-pronged approach for gathering molecular data and 107
spatial capture-recapture (SCR) data. The molecular data informed our estimates of 108
haemosporidian prevalence and lineage diversity. Molecular information was obtained from 109
bird blood samples, collected from mist-net captures. Molecular samples took place in June 110
2011 at four BDFFP sites (called Dimona, Porto Alegre, Cabo Frio, and Km 41; Fig. 1).and 111
between June and October of 2013 and 2014, at Porto Alegre and Cabo Frio. 112
13
Blood samples were collected via brachial venipuncture and stored in Longmire’s lysis buffer 113
at room temperature (Longmire, Maltbie & Baker 1997). Avian captures and blood sampling 114
were approved by the Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade – ICMBio 115
(permit nº 14103-2) and by the Committee for Ethics in Animal Use at the Instituto Nacional 116
de Pesquisas da Amazônia – INPA (permit nº 007/2014). All blood samples were deposited 117
in the Scientific Collections at INPA. 118
Sampling in 2011 was 32 days of mist-netting in 17 sampling points: six at Dimona, five at 119
Cabo Frio, and six at the Km 41 site. Each point was sampled for one or two days, using 12 120
mist-nets per day. In 2013 and 2014 we sampled Porto Alegre twice and Cabo Frio five 121
times, with 12-day visits always taking place in separate and consecutive months. We 122
established 32 and 40 mist-netting points at Porto Alegre and Cabo Frio, respectively, and 123
randomly selected 12 points per site per visit for sampling. 124
In both places, half of the sampling was carried out in secondary forest fragments and half in 125
primary forest. In 2013 and 2014 sampling, our random selection of sites was done without 126
replacement within visits, but with replacement between. We worked one day at each point, 127
using from 12 to 30 nets per day depending on weather, number of captures, and availability 128
of field assistants. In all mist-net samples, we used 12-m long mist-nets, which were opened 129
for six hours per day starting at 6 a.m. and were checked every half hour. 130
The SCR data informed population density estimates. SCR sampling for this study was 131
carried out solely in the Cabo Frio site, throughout the dry season of 2014. The location of 132
each capture was recorded as the GPS point taken in the middle of the corresponding mist-net. 133
The black dots in Fig. 1 represent individual net locations for the Cabo Frio site in 2014, 134
these are the nets used in the SCR sample. 135
136
14
2.3 Host density estimation 137
We estimated host species density based on a Bayesian analysis of model SCR0 proposed by 138
Royle and colleagues (Royle et al. 2013). This model draws information from the spatial 139
distribution of individual bird captures and the spatial distribution of sampling effort to obtain 140
an estimate of the number of individuals per unit area. This estimate acknowledges the fact of 141
imperfect detection, i.e. that individual birds that are present at a sampling site may go 142
undetected. The model identifies each individual i with a bivariate normal distribution of its 143
possible spatial positions; each individual’s bivariate normal is centered at the activity center 144
𝒔𝑖, given by two spatial coordinates. We assumed that the spatial distribution of all 𝒔𝑖 - from 145
both seen and unseen individuals – follows a homogeneous point process, i.e. activity centers 146
are uniformly distributed over a region of interest 𝒮: 147
𝒔𝑖~Uniform(𝒮) (1) 148
This uniform distribution was assumed because the secondary-forest patches have 29-to-32-149
year-old and can be usefull as primary forest for at least a part of the bird species in the atudy 150
area. We sampled secondary forest and primary forest with the same effort. 151
The probability that an individual i is captured in sampling occasion j depends on the 𝒙𝑗 152
spatial coordinates of sampling location j and is given by: 153
𝑝𝑖𝑗 = 𝑝0𝑒(−
1
2𝜎2‖𝒙𝑗−𝒔𝑖‖
2), (2) 154
where ‖𝒙𝑗 − 𝒔𝑖‖ is the distance between 𝒙𝑗 and 𝒔𝑖, 𝜎 is a measure of how fast capture 155
probability decays with increasing ‖𝒙𝑗 − 𝒔𝑖‖ and 𝑝0 is the capture probability when 𝒙𝑗 = 𝒔𝑖. 156
In model SCR0, the value of 𝜎 can also be interpreted as the standard deviation of the 157
binomial distribution of possible spatial positions for the average individual. Thus, from the 158
15
definition of a bivariate normal distribution, we can use 𝜎 to approximate the area comprising 159
95% of the individual’s movements as A.95 = 𝜋(𝜎√5.99)2 (Royle et al. 2013). 160
To complete the model, we represent our data as the number of times 𝑦𝑖𝑗 that individual i was 161
captured at sampling location j over the entire SCR sampling period. This number follows a 162
Binomial distribution: 163
𝑦𝑖𝑗~Binomial(𝐾𝑗, 𝑝𝑖𝑗), (3) 164
where 𝐾𝑗 is the number of samples at location j. 165
To implement model SCR0 with our data we defined 𝒮 as an area extending east, west, north, 166
and south for two km beyond the limits of our sampling area. We subsequently divided 𝒮 in 167
1-ha grid cells and counted how many net*days fell within the area of each grid cell 168
throughout the 2014 Cabo Frio sampling. The resulting vector of counts provides the 𝐾𝑗 169
values used in equation 3. The distances ‖𝒙𝑗 − 𝒔𝑖‖ where measured from the center of each 170
grid cell (𝒙𝑗) to each individual’s estimated activity center (𝒔𝑖). 171
The hierarchical model (Appendix S4) was fitted to the data using MCMC algorithm 172
implemented with a combination of software packages R (R Development Core Team 2013) 173
and WinBUGS (Spiegelhalter, Thomas & Best 1999). 174
2.4 Avian malaria detection and prevalence estimation 175
We extracted DNA from the blood samples using standard phenol-chloroform or isopropanol 176
precipitation protocols. To improve the detection probability, we used two different PCR 177
assays to detect the presence of avian malaria parasites, both matching for even Plasmodium 178
and Haemoproteus genome. The first PCR amplified a highly conserved fragment of both 179
parasites DNA, while the second for a highly variable region (Appendix S1). 180
16
The prevalence for each species was estimated as the haemosporidian occupation in the bird 181
populations. We used a set of equations that represent observation and biological processes, 182
considering each host individual as a site and each PCR assay as a visit on this site. In this 183
approach, the PCRs were treated as part of the observation process, taking into account the 184
chance of failing to amplify haemosporidian parasites when a bird is infected (i.e. false 185
negative). Since prevalence was the occupation probability for each avian species, it 186
represented the biological process in the model (Appendix S5). 187
2.5 Haemosporidians’ DNA genotyping and lineage diversity 188
For the samples tested positive for haemosporidian presence, we used the final products of the 189
nested PCR assay for sequencing using a Sanger platform (Beckman Coulter Genomics Inc., 190
Danvers, MA, USA). We genotyped haemosporidian lineages using BLAST® (Basic Local 191
Alignment Search Tool), applying the DNA sequences obtained as queries in searches for 192
matching sequences using the databases of GenBank® and the Ricklefs lab. The criterion for 193
classifying new haemosporidian lineages was a difference of one non silent base pair 194
substitution between the query and the most similar matching sequence or three. All new 195
lineages will be deposited in GenBank® (Appendix S1, Table S1). 196
3. Results 197
Our core results come from a SCR sample of twelve, and a molecular sample of 89 bird 198
species. Analysis of SCR data returned density estimates spanning two orders of magnitude: 199
from Dendrocincla merula’s 1.7, to Glyphorynchus spirurus’ 55.3 individuals per square 200
kilometer. Home-range area estimates, derived from in the spatial capture-recapture model, 201
ranged from ~40 ha, for Thamnomanes caesius, to ~880 ha, for Dendrocincla merula (Table 202
1). 203
17
In the molecular sample, 1,327 blood samples were screened with 2,531 PCR assays; of these, 204
188 blood samples (~14%) tested positive for the presence of haemosporidian mitochondrial 205
DNA in at least one PCR (Table S1). Upon sequencing of positive-testing samples, we were 206
able to identify between one and two lineages for every ten positive-testing samples. 207
Sequencing revealed twenty Plasmodium sp. and four Haemoproteus sp. lineages, totaling 24 208
different lineages in 30 host species (Tables S1 and S2). 209
We estimated prevalence of haemosporidian infection based on PCR results for 27 host 210
species with ten or more blood samples. The sensitivity of PCR assays 1 and 2 was, 211
respectively, 0.4 0.05 and 0.6 0.07. Table S1 shows prevalence estimates for the 27 212
species that passed the ten-sample filter. Estimates range from approximately 1% in 213
Glyphorynchus spirurus, to 91% in Formicarius colma. G. spirurus had the most precise 214
prevalence estimate (sd = 0.02, 95% c.i. 0.001-0.062), while Myrmotherula longipennis had 215
the least precision (sd = 0.26, 95% c.i. 0.058-0.969). There is a lack of an obvious relationship 216
between parasite prevalence and host density for the twelve bird species in the capture-217
recapture sample (Figure 2). Prevalence in the capture-recapture sample ranges from 218
0.010.02 in G. spirurus to 0.360.18 in Willisornis poecilinotus. There are only four species 219
from the molecular sample (Thamnophilus murinus, Myrmotherula axillaris, Myrmotherula 220
longipennis, and Formicarius colma), which are not represented in the capture-recapture 221
sample and have prevalence estimates outside this range. Looking across species in the 222
molecular sample, the three species with the highest number of blood samples (Pithys 223
albifrons, Dixiphia pipra and Glyphorhynchus spirurus) account for 39% of the samples but 224
only 3% of estimated infections; nonetheless, a linear regression model for the data in Figure 225
2, excluding the outlying G. spirurus, results in p ~ 0.143 and r2 < 0.0005. We omit this 226
regression line from Figure 2 to avoid cluttering the plot. 227
18
From a total of 1,327 blood samples from all 88 species, we sequenced 146 samples that 228
tested positive in at least one PCR assay. Of these, 38 samples either failed the sequencing 229
reaction or retrieved highly uncertain nucleotide sequences, which we chose not to report. The 230
remaining 108 returned results that were sufficiently clear for identifying haemosporidian 231
lineages. We identified at least one lineage in each of the 48 species with one or more positive 232
testing PCR assays (Table S1). Combining all the sequencing results, we found 24 lineages: 233
20 Plasmodium sp. and four Hameoproteus sp (Table S2). Nine of these 24 lineages, to the 234
best of our knowledge, had never been identified before; specifically, two Hameoproteus 235
(MAO_10 and MAO_12) and seven Plasmodium (MAO_05, MAO_06, MAO_07, MAO_08, 236
MAO_09, MAO_11 and MAO_13) lineages. Several more lineages can have not been 237
detected due to sampling error. 238
The number of lineages identified per species ranged from one (41 host species) to 5 239
(Percnostola rufifrons, Pithys albifrons, Gymnopithys rufigula, and Dixiphia pipra). A simple 240
linear regression model shows a positive relationship between the number of samples and the 241
number of lineages identified per species (slope = 0.03, R2 = 0.58, p < 10-15). However, 242
looking at the ten species for which we have density estimates and metrics of lineage diversity 243
we find no evidence of relationship between host density and parasite diversity (Fig. 3). The 244
natural logarithm of both metrics of parasite diversity (number of lineages and average 245
number of lineages per sample) shows no evidence or a relationship with the natural 246
logarithm of density. The probability of type I error in the regression (p) and the proportion of 247
variation explained by the linear model (R2) are, respectively, >0.78 and <0.01 for the number 248
of lineages model (Fig. 3A). Regression results are similar for the second metric, average 249
number of lineages per sample, where p > 0.80 and R2 < 0.01 (Fig. 3B). 250
251
19
4. Discussion 252
The lack of direct correlation among birds’ densities and haemosporidian prevalences 253
indicated that number of hosts is not a limiting factor for the spread of avian malaria in these 254
populations. These results were not influenced by the number of analyzed samples, since the 255
three species with larger samples, Pithys albifrons, Dixiphia pipra and Glyphorhynchus 256
spirurus showed low prevalence. We compared these results with the “conventional” aproach 257
to analize this relation, using number of samples in order than density estimates to compare 258
with prevalence, and even in this case the no relation was observed. 259
Our results confirmed the predicted idea that, although host density might influence the 260
parasites’ prevalence in the population, for parasites with indirect transmission cycle, the 261
vector availability (Anderson & May 1979) and compatibility between parasites and hosts 262
(Medeiros, Hamer & Ricklefs 2013) may have a greater influence on the dispersion and 263
prevalence of avian malaria in the analysed populations. 264
Glyphorynchus spirurus had the highest population density and the lowest prevalence (only 265
one positive in 120 analyzed samples, and was not possible identify lineages in sequencing). 266
Among the species features that may offer some explanation are the small size and the 267
nestling behaviour in tree hollows, which may reduce exposure to vectors. Another possibility 268
is that the species has an immune system capable of hold the hemosporidian infection more 269
effectively than the other species. Plasmodium sporozoites may persist for some time in a host 270
which is not compatible, but can’t develop its life cycle there, so is not an effective infection 271
(Valkiunas 2005). As the PCR analysis can detect parasites in different stages of life from a 272
very low threshold, detection of a parasite whose is not on the ideal host, and therefore can’t 273
develop its life cycle, there would also possible (Hellgren, Pérez-Tris & Bensch 2009). 274
20
On the other hand, the lack of correlation between the number of parasite lineages and host 275
population density disagree with the predictions that the greater availability of a host, more 276
strains tend to specialize in it (Poulin 2006). Our results are especially noted when we 277
compare the host density with the number of parasite lineages and with the ratio of number of 278
lineages for number of samples (Figure 3). The more density a host has, the more species can 279
be detected in a higher number of samples collected, and this could mean a higher probability 280
of detecting more strains of parasites. The set of identified samples was mostly composed of 281
Plasmodium sp lineages, which agrees with the patterns described so far to South America, in 282
which Plasmodium is more diverse than Haemoproteus. This pattern is different from other 283
regions of the world, where Haemoproteus sp appears to be more diverse (Clark et al. 2014). 284
Mosquito vectors of avian malaria are generalists and feed on many species of birds (Lapointe 285
et al. 2012), but little is known about the ability of different hemosporidian species and 286
lineages to develop in these vectors (Kimura, Darbro & Harrington 2010). However, the 287
compatibility of parasites in relation to bird hosts in our results showed the presence of some 288
lineages in several birds species, as well was common a single bird species harbour several 289
parasites lineages. This would reinforce the idea that the vector compatibility may be an 290
important factor to direct the distribution of different strains of hemosporidia in these avian 291
populations. 292
To reach a level of knowledge of avian malaria which make possible access informations 293
about its behaviour in wild bird populations, the improvement of studies of relations between 294
parasites and its invertebrates host, as the study of relations between vertebrates and 295
invertebrate hosts, are necessary. These informations would be very usefull to studies 296
adressing avian malaria, because could give more conlusive answers about parasite-host 297
relation and avian hemosporidia epidemiology. 298
21
Acknowledgments 299
The project funding and grants were provided by Conselho Nacional de Desencolvimento 300
Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas 301
(FAPEAM), Smithsonian Institution and Malaria Research Coordination Network. CSO 302
received a fellowship from CNPq. Biological Dynamics of Forest Fragments Project (BDFFP) 303
provided infrastructure and logistical support to field work. We thank for Robert Ricklefs and 304
your lab team for enable molecular analysis, and Laboratório de Evolução e Genética Animal 305
da Universidade Federal do Amazonas (LEGAL/UFAM) for the support with de DNA 306
extraction from the avian blood samples. We further thank to Ocírio, Aída, Luiza, Pedro, 307
Alejandra, Francisco and Gilberto for the field work assistance. 308
309
22
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25
402
Table 1. Estimates (mean ± sd) of host density, 95% home-range area (A95%), and
hemosporidian prevalence for the nine host species for which we could fit spatial capture-
recapture models. Units of density and area are individuals per square kilometer and hectares,
respectively. ‘N’ is the number of individuals in the capture-recapture sample, and ‘B’ is the
number of blood samples tested by PCR. ‘np’ is the number of samples that tested positive for
infection with haemosporidians at least one time. ‘Lins’ is the observed number of
haemosporidian lineages per species; ‘Lins per sample’ is the observed mean number of
lineages per blood sample. Note that not all positive PCR results led to one successful lineage
identification.
Family and species Density
(indiv/km2) A95% (ha)
Prevalence N B np Lins Lins per
sample
Furnariidae
Automolus infuscatus 3.6±1.77 101±87.9 0.08±0.06 12 27 1 1 0.04
Certhiasomus stictolaemus 1.8±0.78 107±63.6 0.11±0.14 8 12 0 0 0.00
Dendrocincla merula 1.7±0.51 883±369.5 0.25±0.18 21 15 2 1 0.07
Glyphorynchus spirurus 55.3±9.49 61±14.4 0.01±0.02 106 120 1 0 0.00
Xiphorhynchus pardalotus 10.6±3.71 555±604.7 0.11±0.07 40 32 2 1 0.03
Thamnophilidae
Gymnopithys rufigula 5.3±1.29 467±160.0 0.21±0.09 37 90 17 5 0.06
Pithys albifrons 7.9±1.08 688±125.0 0.11±0.05 87 162 16 5 0.03
Thamnomanes ardesiacus 11.8±3.94 40±0.4 0.15±0.08 30 48 5 2 0.04
Thamnomanes caesius 8.7±2.47 296±122.5 0.36±0.24 37 61 16 4 0.07
Myrmotherula longipennis 15.2±6.46 8±5.90 0.55±0.25 14 10 4 1 0.10
Hypocnemis cantator 20.2±7.08 18±11.80 0.33±0.20 22 19 4 1 0.04
Willisornis poecilinotus 16.2±3.39 103±26.2 0.36±0.18 51 69 19 4 0.06
26
Figure legends
Figure 1. Study area of the Biological Dynamics of Forest Fragments Project showing four
sampling sites identified by black circles. Sampling site names are, from left to right:
‘Dimona’, ‘Porto Alegre’, ‘Cabo Frio’ and ‘Km41’. Black dots in the ‘Cabo Frio’ site indicate
mistnet locations used in the 2014 spatial-capture-recapture analysis. The study area is
crossed by the BR-174 highway in the west and by the ZF-3 dirt road, east of the highway.
Dark gray and light gray stand for primary and secondary forest, respectively. White patches
represent open areas with grassy vegetation and sparse shrub cover.
Figure 2. Species-specific prevalence of haemosporidian infections and avian host population
density. Six-letter codes show the first three letters of the host genus and species, as listed in
Table 1. Error bars show one standard deviation above and below the mean of the posterior
distributions of density (along the x-axis) and prevalence (along the y-axis).
Figure 3. Two metrics of haemosporidian lineage diversity versus host population density.
The metric in plot A is the total number of lineages found in a host species. The metric in B is
the species-specific number of lineages found per blood sample. In both plots, the x-axis
shows the estimated number of individuals per square kilometer. The lines in both panels
represent a linear regression fit to the natural logarithm of the respective diversity metric and
the natural logarithm of density. Both regressions exclude Certhiasomus stictolaemus (Cersti)
and Glyphorynchus spirurus (Glyspi), for which we could not identify any hemosporidian
lineage. Six-letter codes show the first three letters of the genus and species names listed in
Table 1.
27
Figure 1
28
Figure 2
29
Figure 3
30
Supporting Information
The following Supporting Information is available for this article online.
Appendix S1 – Description of PCR assays:
In the first round of PCRs we used primers and protocol as used by Ricklefs et al (2005). This
PCR assays amplify a highly conserved 154 bp fragment of the parasite’s genome, which
codifies for the small subunit 16S of mithocondrial ribosomal RNA (SSU 16S rRNA). In the
second round of detections we used a nested PCR assay, with primers and protocols as used
by Waldenström et al. (2004). A nested PCR is an assay composed of two amplification
reactions: the first one uses the extracted sample, and the second one uses the product of the
first PCR, with the parasite’s DNA amplificated. These reactions amplify a highly variable
region of the mitochondrial genome, a fragment of cytochrome b (cyt b) gene, a parasite’s
mitochondrial DNA region.
31
Appendix S2. Table S1. Captures, molecular data and analysis results for all avian species
analysed. For each avian species: Number of blood samples used in the molecular analisys for
each avian species, number of positive results for haemosporidian presence in the individual
hosts sampled, prevalence of haemosporidian parasites to the species with at least ten samples
analysed, and number of lineages of haemosporidian parasites. The number of lineages is a
minimum value, once eventually we could detect the presence of haemosporidian parasites in
the sample without identify from which lineage it belonged. NA stands for “not available”
information. We folowed CBRO for the birds nomenclature.
Family and Species Number of
captures
Number
of blood
samples
Positive-
testing
blood
samples
Avian
Malaria,
prevalence
± sd
Number
of
parasite
lineages
Columbidae
Geotrygon montana 17 8 6 NA 3
Trochilidae
Phaethornis bourcieri 15 1 0 NA 0
Trogonidae
Trogon rufus 4 5 1 NA 1
Trogon violaceus 1 1 0 NA 0
Momotidae
Momotus momota 9 8 2 NA 1
Galbulidae
Galbula albirostris 16 8 0 NA 0
Bucconidae
Bucco capensis 1 2 1 NA 1
Malacoptila fusca 5 1 0 NA 0
Nonnula rubecula 1 1 0 NA 0
Ramphastidae
Pteroglossus viridis 2 2 1 NA 1
Picidae
32
Celeus elegans 1 2 0 NA 0
Falconidae
Micrastur ruficolis 1 1 1 NA 1
Thamnophilidae
Cymbilainus lineatus 2 2 0 NA 0
Frederickena viridis 3 1 0 NA 0
Thamnophilus murinus 19 14 4 0.37 ± 0.226 1
Thamnophilus punctatus 1 2 0 NA 0
Thamnomanes ardesiacus 48 48 5 0.15 ± 0.076 2
Thamnomanes caesius 54 61 16 0.36 ± 0.238 4
Isleria guttata 7 1 1 NA 1
Epinecrophylla gutturalis 43 16 1 0.16 ± 0.151 1
Myrmotherula axillaris 22 17 4 0.42 ± 0.252 1
Myrmotherula longipennis 19 10 4 0.55 ± 0.255 1
Myrmotherula menetriesii 15 3 0 NA 0
Hypocnemis cantator 38 19 4 0.33 ± 0.204 1
Cercomacroides tyrannina 2 3 0 NA 0
Percnostola rufifrons 46 61 11 0.20 ± 0.150 5
Schistocichla leucostigma 2 1 0 NA 0
Myrmeciza ferruginea 7 2 0 NA 0
Myrmeciza atrothorax 2 1 0 NA 0
Myrmornis torquata 5 4 0 NA 0
Pithys albifrons 184 162 16 0.11 ± 0.046 5
Gymnopithys rufigula 63 90 17 0.21 ± 0.097 5
Willisornis poecilinotus 76 69 19 0.36 ± 0.183 4
Conopophagidae
Conopophaga aurita 11 3 0 NA 0
Grallaridae
Gralaria varia 0 1 1 NA 1
Hylopezus macularius 0 1 0 NA 0
Formicaridae
Formicarius colma 13 16 13 0.90 ± 0.088 3
Formicarius analis 3 2 1 NA 1
Furnariidae
Sclerurus rufigularis 7 5 2 NA 1
Certhiasomus stictolaemus 16 12 0 0.11 ± 0.143 0
Deconychura longicauda 6 4 0 NA 0
Dendrocincla merula 43 15 2 0.25 ± 0.176 1
Dendrocincla fuliginosa 13 11 1 0.27 ± 0.216 1
Glyphorynchus spirurus 147 120 1 0.02 ± 0.016 1
33
Dendrocolaptes certhia 7 6 2 NA 1
Dendrocolaptes picumnus 1 2 0 NA 0
Hylexetastes perroti 4 2 0 NA 0
Xiphorhynchus pardalotus 50 32 2 0.11 ± 0.069 1
Xenops minutus 12 8 1 NA 1
Philydor erythrocercum 6 4 0 NA 0
Philydor pyrrhodes 1 1 0 NA 0
Automolus ochrolaemus 15 8 1 NA 1
Automolus infuscatus 18 27 1 0.08 ± 0.062 1
Tyrannidae
Attila spadiceus 5 9 0 NA 0
Corythopis torquatus 8 4 0 NA 0
Mionectes macconnelli 33 34 1 0.07 ± 0.055 1
Myiarchus sp. 1 1 1 NA 1
Myiobius barbatus 17 11 1 0.26 ± 0.204 1
Onychorhynchus coronatus 4 5 0 NA 0
Platyrinchus coronatus 18 7 1 NA 1
Platyrinchus platyrhynchos 2 1 0 NA 0
Platyrinchus saturatus 4 2 1 NA 1
Rhynchocyclus olivaceus 7 5 2 NA 1
Rhytipterna simplex 1 1 0 NA 0
Terenotriccus erythrurus 4 2 0 NA 0
Tyrannus melancholicus 0 1 0 NA 0
Cotingidae
Phoenicircus carnifex 2 1 0 NA 0
Pipridae
Ceratopipra erythrocephala 32 21 3 0.27 ± 0.203 1
Corapipo gutturalis 20 12 1 0.22 ± 0.190 1
Dixiphia pipra 156 154 16 0.10 ± 0.047 5
Lepidothrix serena 36 31 0 0.03 ± 0.028 0
Manacus manacus 18 24 3 0.26 ± 0.219 1
Tityridae
Schiffornis olivacea 25 7 3 NA 1
Schiffornis turdina 0 8 2 NA 1
Vireonidae
Hylophilus ochraceiceps 26 7 1 NA 1
Hylophylax naevius 0 1 0 NA 0
Troglodytidae
Cyphorhinus arada 16 3 0 NA 0
Pheugopedius coraya 9 2 0 NA 0
34
Pheugopedius coraya 9 1 0 NA 0
Turdidae
Turdus albicollis 34 26 4 0.31 ± 0.206 1
Polioptilidae
Microbates collaris 16 9 0 NA 0
Thraupidae
Cyanerpes cyaneus 0 2 2 NA 2
Lanio fulvus 1 2 0 NA 0
Ramphocelus carbo 1 1 0 NA 0
Tachyphonus cristatus 2 3 2 NA 1
Tachyphonus surinamus 5 12 1 0.21 ± 0.17 1
Emberizidae
Arremon taciturnus 1 5 1 NA 1
Oryzoborus angolensis 1 1 0 NA 0
Cardinalidae
Cyanocompsa cyanoides 2 1 0 NA 0
35
Appendix S3. Table S2. Haemosporidian lineages, genus and used source. The lineages
avaiable in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) are followed for its acession
numbers. The lineages from local database are still being analised for submission to the same
site.
Lineage code Genus Source
DR_02 Haemoproteus local database
GRW06 Plasmodium GenBank KJ145065
LIN2 Plasmodium GenBank JN415757.1
MAO_01 Plasmodium local database
MAO_02 Plasmodium local database
MAO_03 Plasmodium local database
MAO_04 Haemoproteus local database
MAO_05 Plasmodium local database
MAO_06 Plasmodium local database
MAO_07 Plasmodium local database
MAO_08 Plasmodium local database
MAO_09 Plasmodium local database
MAO_10 Haemoproteus local database
MAO_11 Plasmodium local database
MAO_12 Haemoproteus local database
MAO_13 Plasmodium local database
MAO_15 Plasmodium local database
OZ01_EL008 Plasmodium local blast
OZ04_GD296 Plasmodium GenBank GQ395669.1
RANDOM_ME Plasmodium local database
TI_P24 Plamodium local database
TI_P27 Plasmodium local database
TI_P32 Plasmodium local database
UN204 Plasmodium GenBank KF537322.1
36
Appendix S4 – SCR0 model in BUGS language
Adapted from Royle, J.A., Chandler, R.B., Sollman, R. & Gardner, B. (2015) scrbook:
Companion to the book: Spatial Capture Recapture (2014). R package version 0.28-0. # Priors alpha0 ~ dnorm(0,0.1) logit(p0) <- alpha0 # Baseline detection prob alpha1 ~ dnorm(0,0.1) # 1 / (2*sigma^2) (coefficient of distance) psi ~ dunif(0,1) # Data augmentation 'occupancy' # Likelihood for(i in 1:M) { # Loop over all M individuals z[i] ~ dbern(psi) # Data augmentation variable s[i,1] ~ dunif(xlim[1],xlim[2]) # x-coord of activity center s[i,2] ~ dunif(ylim[1],ylim[2]) # y-coord of activity center for(j in 1:J) { # Loop over all traps d[i,j] <- pow( pow(s[i,1]-traplocs[j,1],2) + pow(s[i,2]-traplocs[j,2],2), 0.5) # distance p[i,j] <- z[i]*p0*exp(-alpha1*pow(d[i,j],2)) # Detection prob Y[i,j] ~ dbin(p[i,j],K) # The observed data } } # Derived quantities N <- sum(z[]) # Population size in state-space (=area) D <- N/area # Density over state-space sigma <- sqrt(1 / (2*alpha1)) # Half-normal scale r.95 <- sigma*sqrt(5.99) # 95% usage HR radius A.95 <- 3.14*pow(r.95,2) # 95% usage HR area
37
Appendix S5 – Prevalence model in BUGS language # Priors v0 ~ dunif(-10,10) v1 ~ dunif(-10,10) for(f in 1:G) { u.mean0[f] ~ dunif(0,1) muu0[f] <- log(u.mean0[f]) - log(1-u.mean0[f]) logit(prevg[f]) <- muu0[f] } for(g in 1:G) { tau.u0[g] ~ dgamma(0.1,0.1) } # Likelihood for (i in 1:n) { u0[i] ~ dnorm(muu0[group[i]],tau.u0[group[i]]) for(j in 1:J[i]){ # BIOLOGY logit(psi[j,i]) <- u0[i] Z[j,i] ~ dbin(psi[j,i],1) # SAMPLING for(k in 1:K[i,j]) { logit(p[j,k,i]) <- v0 + v1*PCR[j,k] mup[j,k,i] <- p[j,k,i]*Z[j,i] Y[j,k,i] ~ dbin(mup[j,k,i],1) } # pcr assays } # individuals logit(prev[i]) <- u0[i] } # species logit(p1) <- v0 + v1 logit(p2) <- v0
38
Conclusão
Nossos resultados não apoiaram as predições de relação positiva entre a abundância
das nove espécies de hospedeiros e as duas métricas de infecção de malária aviária analisadas,
prevalência e diversidade de linhagens. A ausência de relação entre abundância e prevalência
reforça a ideia de que a transmissão indireta por vetores artrópodes evita que a raridade de
hospedeiros limite a prevalência. Por outro lado, a ausência de uma relação entre densidade e
número de linhagens sugere que uma comunidade de parasitas em sua maioria generalistas é
compartilhada com um amplo grupo de espécies. O fato de termos identificado sete novas
linhagens de Plasmodium sp e duas de Haemoproteus sp indica que a riqueza de parasitas
causadores da malária aviária pode ser muito maior do que o atualmente relatado, e sugere
que mais linhagens deverão ser relatadas conforme se intesifiquem os estudos na área. Tal
riqueza de linhagens é compatível com o padrão observado para a floresta amazônica, e a
maior quantidade de Plasmodium sp em relação a Haemoproteus sp compatível com o padrão
encontrado na América do Sul.
39
ANEXO A – Ata de qualificação
40
ANEXO B – Ata de defesa
41
ANEXO C – Autorização do Comitê de Ética
42
ANEXO D – Declaração de depósito de material biológico na coleção de recursos
genéticos do INPA