Decreased activity of superoxide dismutase in the seminal plasma of infertile men correlates with increased sperm deoxyribonucleic acid fragmentation during the first hours after sperm donation Andrology 2015;3:748-755; DOI: 10.1111/andr.12061 ARTUR WDOWIAK (1), SZYMON BAKALCZUK (2) AND GRZEGORZ BAKALCZUK (3) (1) Diagnostic Techniques Unit, Faculty of Health Sciences, Medical University, (2) Non-Public Health Care Unit ‘Ovum Reproduction and Andrology’, and (3) Department of Obstetrics, Gynaecology and Obstetric-Gynaecological Nursing, Faculty of Health Sciences, Medical University, Lublin, Poland Correspondence to: Grzegorz Bakalczuk, Department of Obstetrics, Gynaecology and Obstetric-Gynaecological Nursing, Faculty of Nursing and Health Sciences, Medical University, Lublin, Poland. E-mail: grzegorz.bakalczuk@resetnet.pl !Sperm DNA fragmentation varies between individuals and is more pronounced with increased patient age and time after sperm donation. The intensification of DNA fragmentation depends on the balance of the oxidoreductive system, which is regulated mainly by two enzymes: superoxide dismutase (SOD) and catalase. The objective of this study was to determine the relationship between sperm DNA fragmentation dynamics, fertility and seminal SOD and catalase activity. The study was conducted in 2013 and 2014 at the Non-Public Health Care Unit ’Ovum Reproduction and Andrology’ in Lublin, Lublin, Poland, and covered 218 men aged 25–35 (85 fertile and 133 patients treated for infertility). Percentage of fragmented DNA was measured in a modified chromatin dispersion test at four time points after sperm donation (t=0, 3, 6, 12 h). SOD and catalase activities were determined spectrophotometrically. We confirmed that the activity of SOD in the seminal plasma of men with reproductive disorders was lower compared with fertile men. Conversely, no significant correlations were found between fertility and catalase activity. Sperm DNA of infertile males was initially more fragmented than fertile male sperm DNA. SOD and catalase activity did not correlate with the degree of DNA fragmentation in fertile men. In men with reproductive disorders, the rate of DNA fragmentation was slow within first 3 h after sperm donation and then increased between 6 and 12 h. In this group of infertile men, those with higher SOD activity had a lower DNA fragmentation index (DFI) after 12 h, and a reduced rate of intensity of fragmentation from 6 to 12 h. Alternatively, higher catalase activity among men treated for infertility was accompanied by higher initial DFI and higher rate of DNA fragmentation from 6 to 12 h. These results highlight the importance of determining a proper time window between sperm donation and procedures of assisted reproductive technology. !La diminuzione della superossido dismutasi nel plasma seminale degli uomini infertili correla con l’aumento della frammentazione dell’acido desossiribonucleico spermatico nel corso delle prime ore dopo la donazione dello sperma La frammentazione del DNA spermatico varia tra gli individui ed è più pronunciata con l’aumentare dell’età del paziente a con il tempo successivo alla donazione dello sperma. L’intensificazione della frammentazione del DNA dipende dall’equilibrio del sistema ossidoriduttivo, che è regolato principalmente da due enzimi: la superossido dismutasi (SOD) e la catalasi. L’obbiettivo di questo studio fu di determinare la correlazione tra dinamica della frammentazione del DNA spermatico, la fertilità e l’attività della SOD e della catalasi seminale. Lo studio fu condotto nel 2013 e nel 2014 presso l’Unità non pubblica di controllo della salute “Ovum Reproduction and Andrology” a Lublin, Lublin, Polonia e riguardò 218 uomini con età di 25-35 anni (85 fertili e 133 pazienti trattati per infertilità). La percentuale del DNA frammentato fu misurata con una analisi dispersione della cromatina modificata a quattro punti temporali dalla donazione dello sperma (t=0, 3, 6, 12 h). L’attività della SOD e della catalasi furono determinate per via spettrofotometrica. Abbiamo confermato che l’attività della SOD nel plasma seminale degli uomini con disordini riproduttivi è minore di quella degli uomini fertili. Al contrario, non furono rilevate correlazioni significative tra la fertilità e l’attività della catalasi. Il DNA spermatico degli uomini infertili era inizialmente più frammentato del DNA degli uomini fertili. L’attività della SOD e della catalasi non correlò con il grado di frammentazione negli uomini fertili. Negli uomini con disordini riproduttivi il tasso della frammentazione del DNA fu più lento nella prime 3 h dopo la donazione dello sperma e aumentò tra le 6 e le 12 h. In tale gruppo di uomini infertili, coloro con l’attività della SOD più alta avevano un indice di frammentazione del DNA (DFI) più basso dopo 12 h e una riduzione del tasso di intensità della frammentazione tra le 6 e le 12 h. Alternativamente, la maggiore attività della catalasi tra gli uomini trattati per l’infertilità fu accompagnata da un maggiore DFI iniziale e da un maggior tasso di frammentazione del DNA tra le 6 e le 12 ore. Questi risultati marcano l’importanza di determinare una adeguata finestra temporale tra la donazione di sperma e le procedure per le tecniche di fecondazione assistita. !Il commento - La questione delle molecole e degli atomi ossidativi presenti nello sperma diviene sempre più pressante in quanto, come ormai è ben consolidato nelle conoscenze, oltre il moderato livello necessario

ad alcune attività degli spermatozoi (preparazione alla capacità fecondativa) e alla loro tutela dalle presenze dei microrganismi divengono generatori di danno agli spermatozoi stessi e in particolare al loro contenuto in DNA che va incontro a frammentazioni non più riparabili. La frammentazione del DNA nello spermatozoo maturo riduce anche drasticamente la sua capacità fertile, aumenta il rischio di alterazioni geniche che possono manifestarsi sin dall’embrione (da cui il blocco dello sviluppo embrionario) o che possono manifestarsi successivamente alla nascita per quei geni che nella vita entreranno in funzione nel corso degli anni. E’ bene precisare che un discreto numero delle frammentazioni vengono rapidamente riparate dai meccanismi dell’ovocito una volta che il nucleo dello spermatozoo di sia appaiato a quello dell’ovocito dopo la fecondazione. La questione della frammentazione è tanto più importante, come altre volte abbiamo avuto modo di sottolineare nel commento ad altri studi, quanto più si “saltano” i meccanismi fisiologici della selezione degli spermatozoi e quindi nella FIVET prima e nella ICSI dopo… in altri termini, come gli Autori sottolineano, la questione è tanto più importante quanto più si agisce con le tecniche di fecondazione assistita. Lo studio svolto pone l’attenzione sulla possibilità di valutare in via preliminare quale sia la condizione di mantenimento dell’equilibrio ossidativo nello sperma per mezzo dei due enzimi fondamentali, la SOD e la catalasi: gli Autori dimostrano che il fattore principale, se non esclusivo, di alterazione dell’equilibrio è la carenza della SOD (agisce trasformando gli anioni, in particolare quello più potente dell’ossigeno, in acqua ossigenata che è decisamente meno aggressiva), mentre la carenza di catalasi (agisce trasformando l’acqua ossigenata in acqua e ossigeno libero, neutralizzando definitivamente l’attività ossidativa) ha un ruolo meno significativo (è evidente che se la SOD non prodice acqua ossigenata, la catalasi non ha materiale per agire). Il dato degli Autori per cui non sembra esserci una correlazione tra il livello della frammentazione del DNA e il livello della SOD con molta probabilità deriva da una carenza di costruzione del gruppo studiato in gruppi meglio caratterizzati (la frammentazione del DNA può avere ragioni diverse dallo stato ossidativo, su cui lo stato ossidativo può agire con maggiore forza) e in ogni caso l’intero gruppo disfertile ha un maggiore tasso di frammentazione rispetto ai soggetti fertili con il trascorrere del tempo dall’ejaculazione… come dire che in ogni caso la carenza di SOD tende a proteggere meno gli spermatozoi con il passare del tempo. Questa osservazione “dinamica” fa suggerire agli Autori che nelle condizioni di fecondazione assistita dove già di parta con un probabile discreto danno del DNA e una carenza di SOD, la procedura è bene che sia realizzata nel più breve tempo possibile, non superando mai le 6 ore dall’ejaculazione. Rendendo il dosaggio della SOD spermatica un esame costante nello sperma dei soggetti disfertili, possiamo supporre che una preparazione dello sperma in cui si incrementi con l’opportuna integrazione la quantità di SOD consenta di meglio gestire lo sperma ai fini della fecondazione assistita. Resta ovviamente aperto il tema di come migliorare la qualità dello sperma sul profilo dello stato ossidativo prima dell’ejaculazione atta alla fecondazione, sia che questa avvenga naturalmente che artificialmente: tale compito spetta all’andrologo nelle fasi di valutazione e terapia delle disfertilità.