Osteoblasts

IWO; 24 november 2012

Hans van Leeuwen Calcium and Bone Research Group,

Department of Internal Medicine, Erasmus MC, Rotterdam

Wat zijn de botcellen?

Botcellen

Osteoclast – Osteoblast - Osteocyt

beenmergcellen

bot

osteocyten

osteoblasten

osteoclasten

Wat zijn de botcellen?

?

•  Bone lining cellen (BLC's) bedekken het inactieve (non-remodeling) botoppervlak.

•  BLC's kunnen een belangrijke functie hebben in osteoclast vorming

•  BLC's kunnen betrokken zijn bij het doorgeven van het activatie signaal dat de botafbraak en botombouw initieert omdat activatie van botombouw plaats vindt op de inactieve botoppervlakten.

•  Potentieel doelwit voor therapieën

•  Regulatie van hematopoietische stamcellen en daarmee immuunsysteem

•  Interactie met metastaserende kankercellen.

Bone lining cellen

Van der Eerden, Erasmus MC"

Osteoblasten kunnen verschillende verschijningsvormen hebben die gerelateerd zijn aan verschillende functies !

•  actieve botvormende cuboidale osteoblasten"•  “inactieve” spoelvormige “bone lining” cellen"•  zenuwcel-achtige, mechanische belasting waarnemende osteocyt (+

endocriene functie!)"

Nijweide

Wat doet een osteoblast?

Een osteoblast maakt bot

Waar bestaat bot uit?

Waar is bot uit opgebouwd?

Cellen

Extracellulaire eiwit matrix

•  collageen type I, niet-collagene eiwitten (honderden)

•  functies: 1) structureel; 2) regulatie van cel activiteit

Mineraal

•  calcium, fosfaat: hydroxyapatiet (Ca10(PO4)6(OH)2 )

•  functies: 1) stevigheid/hardheid bot; 2) reservoir voor calcium en fosfaat

Vorming van bot

Osteoblasten

Mineraal

Extracellulaire matrix

?

Oorsprong van de botcellen

Osteoclast

Osteoblast

Osteocyt

Oorsprong

Haematopoetische stamcel ←

Mesenchymale stamcel ←

Osteoblast ←

beenmergcellen

bot

osteocyten

osteoblasten

osteoclasten

Osteoblast is afkomstig van de mesenchymale stamcel

BMP’s, TGFß’s FGF’s PDGF’s IGF’s

PTH, PTHrP Vitamine D Glucocorticoiden Oestradiol

Onder controle van groeifactoren, hormonen en mechanische belasting

Osteocyt Osteoblast

Pre-osteoblast

Mesenchymale stamcel

Myocyt

Adipocyt

Chondrocyt

➡ Teriparatide (Forsteo) ➡ Etalpha ➡ Prednison ➡ Raloxifen (Evista)

Menopauze: vervetting beenmerg

adipogenic medium DMEM + 10% FCS

dexameth. 1 µM

indometh. 0.2 mM

insulin 0.01 mg/ml

IBMX 0.5 mM

osteogenic medium DMEM + 10% FCS

ß-glyceroph.10 mM

dexameth. 1 µM

vit. C 0.5 mM

chondrogenic medium DMEM

sodium pyruvate 100 mM

proline 40 µg/ml

ITS 1:100

TGFß1 10 ng/ml

Phenotypic characterization

collection of mesenchymal stem cells

3 12 19 5 14 7 Days

Human in vitro osteoblast differentiation and bone formation model

Pre-osteoblast Osteoblast Osteocyte

Matrix formation è Matrix maturation è Mineralisation

Cortisol é Activin A ê Vitamin D é Phosphate é

Other hormones é ê? Other factors é ê?

Alkaline phosphatase é Phosphate é

Calciumê pH [high é; low ê]

osteocalcin ê Other matrix proteins é ê?

Enzymes é ê? Ion channels é ê?

Phase 1 Matrix formation and maturation

Phase 2 Control of mineralization

Bone lining cell; apoptosis

Osteoblast differentiatie en botvorming is een dynamisch proces

Collagen type Iα1, Alkalisch fosfatase activiteit, osteocalcine en mineralisatie worden geïnduceerd in een tijdsafhankelijke manier tijdens (human) osteoblast differentiatie

0102030405060708090

100

7 9 12 14 16 19 21

Collagen type I

Alk.Phosphatase

Osteocalcin

Mineralization

% o

f Max

imum

TIME (days)

Collagen I

Alkaline Phosphatase activity

Mineralization

Osteocalcin

Eijken et al; FASEB J. 2007

Activin A remt mineralisatie in humane osteoblast en MSC botvormingsmodellen EN in een vasculaire gladde spiercel model voor

atherosclerose

Vehicle

1x 40x

Activin A (20 ng/ml)

1x 40x 1x 40x

OBs

1x 40x

MSCs NHOsts SV-HFOs VSMCs SV-HFO NHOST MSC VSMC

Osteoblasts

Follistatin Vehicle Activin A

www.arcarios.com

Mesenchymale stamcellen

Botaanmaak: Osteoblasten

Osteoblasten: maken de boteiwitmatrix en reguleren mineralisatie

“Lining” cellen: bedekken

het botoppervlak Osteocyten: ingebed in het bot

en nemen mechanische belasting waar.

Celdood (apoptose)

Bot

10-30%

Osteoblasten

Osteocyten

Wat is Wnt (Wint) signaling? Wg (wingless) + Int1(Integration)

Wnt is een samensmelting van Int (Integration 1) gen in muis en Wg (wingless) gen in de Drosophila melanogaster (fruitvliegje). Hoewel het wingless gen oorspronkelijk was geidentificeerd als een recessieve mutatie die de vleugel en halter ontwikkeling van het fruitvliegje veranderde is het belangrijk geweest voor het begrijpen van Wnt signaling in andere organismen, waaronder de mens

Wat is Wnt (Wint) signaling? Wg (wingless) + Int1(Integration)

Wnt eiwitten vormen een familie van sterk geconserveerde gesecreteerde signaal moleculen die cel-cel interacties reguleren tijdens embryogenese. Mutaties in Wnt genen of onderdelen van de Wnt signaling pathway leiden tot specifieke ontwikkelings defecten, terwijl meerdere humane ziekten, waaronder kanker, veroorzaakt worden door abnormale Wnt signaling. Wnt eiwitten binden aan celmembraan receptoren van de Frizzled en LRP (Low density lipoprotein receptor (LDLR)-Related Protein) families. Via verschillende cytoplasmatische “relay” componenten wordt het signaal doorgegeven aan β-catenine. Β-catenine gaat de celkern binnen en vormt een complex met TCF om Wnt target genen te activeren.

http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/main#Diagrams

Osteoporosis Pseudo Glioma (Matt Warman, Cell 2001) Autosomal Recessive

High Bone Mass: Z Score 5.6 ! (R. Recker and M Johnson, J Hum Gen 2002) Autosomal Dominant

Both linked to chromosome 11q13

Human Genetic Studies Link Bone Mass To a Specific Region of the Human Genome

LDL rec repeats

B propellers

EGF-like repeats

Beide bleken mutaties in de LRP5 receptor te zijn

HBM G171V mutation

OPPG Null or Single Point mutations

Human genetic disease - LRP5

LRP5

β-Catenin

β-Catenin LEF-1

β-Catenin

β-Catenin

High bone mass Little et al., 2002 ; Boyden et al., 2002

Wnt Dickkopf-1

[-]

Kremen

LEF-1 Low bone mass Gong et al., 2001

LRP5

Wnt

Frizzled Frizzled

Decreased osteoblast number and bone formation parameters in LRP5-deficient mice

Kato et al., J Cell Biology, 157:303-314; 2002

Krishnan et al , JCI 2006

However, ……. It is not always as simple as it looks…..

+ +

-

-

-

-

Wnt signaling

▪  Wnt signaling is important in early stage of mesenchymal to osteoblast-lineage transition but ……..

▪  acts negative at the late stages of osteoblast differentiation de Boer et al. Bone 34:818 (2004); van der Horst et al., JBMR 29:1867 (2005); Eijken et al. J. Cell Biochem 104:568 (2008)

Mesenchymal stem cell

Preosteoblast Immature osteoblast

Mature osteoblast

Osteocyte

- -

++

Mimics differentiation stage-dependent effect of RUNX2

Sclerostin (SOST)

Hum Mol Gen (2000)

Sclerosteosis and Van Buchem syndrome

• Humane genetica: •  Verhoogde botmassa en

dikke cortices in:

•  Sclerosteosis: •  Inactiverende mutaties in

Sclerostin

•  Van Buchem syndrome: • Deleties met afgenomen

sclerostin expressie (Brunkow et al, 2001; Balemans et al. 2002; Loots et al., 2005)

Robling et al., ASBMR 2006

Mechanische belasting onderdrukt Sclerostin expressie in osteocyten

Sclerostin antibodies (Phase III, CDP7851/AMG785)

Sclerostin remt Wnt signaling

Wat doet een osteoblast?

Regulator van botafbraak (osteoclast vorming / activiteit)

© 2007 Amgen. All rights reserved. Provided as an educational resource. Do not copy or distribute.

Interaction between mesenchymal (MSC) and hematopoietic (HSC) stem cell lineages crucial for bone metabolism

Walsh  et  al.,  2006  

M-­‐CSF  RANKL  

OPG  

HSC MSC

bone formation bone resorption

Wat doet een osteoblast?

Botvorming

Controle botafbraak

……….

Osteo-immunologie

Bot/Beenmerg: èén orgaan (?)

Bot

Beenmerg

Osteoblasts

Osteo-immunologie

Interplay  between  the    Immune  System  and  Bone  

Lymphocyte   Macrophage  

Osteoblasts   Osteoblasts  

Osteoclasts  

Bone  

Osteocytes  

Grassel et al., 2007

Stamcel niche (stem cell niche) Osteoblasts are major constituents of the HSC niche, and play an

important role in the control of HSC renewal and differentiation

Parathyreoid hormoon (PTH)

PTH-treated mice had: 1.  increased the number of stem cells in the bone marrow 2.  increased LTC-IC (Long-term culture initiating cell) frequency

3.  Bone marrow cells of PTH-treated mice had increased ability to reconstitute secondary recipients after bone marrow transplantation

4.  Unchanged CFU-C representing the more mature progenitors

Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche L. M. Calvi et al. Nature 2003; 425:841-846;

1 2 3 4

PTH behandeling geeft een “survival” voordeel na beenmerg transplantatie (ook minder vetcellen)

Bone Morphogenetic Protein (BMP)

Bone lining cell(?)

Prostate tumor cell pretreatment reduced the success rate of subsequent bone marrow transplantation

•  PTH treatment increases prostate tumor cell localization (metastasis) in bone

•  Hematopoietic stem cells and tumor cells compete for the osteoblast stem cell niche

•  Bot/osteoblasten vormen een stamcel niche voor goede hematopoietische stamcel (HSC) onderhoud en differentiatie en daarmee uiteindelijk voor een volledig functioneel immuunsysteem

•  PTH en BMP beïnvloeden HSC onderhoud en effectiviteit van beenmerg transplantatie.

Therapieën die botstofwisseling beïnvloeden zouden indirect het

immuunsysteem kunnen beïnvloeden

•  Metastaserende tumorcellen interfereren met de HSC niche en beenmergtransplantatie en dit wordt ook beïnvloedt door PTH

Therapieën die botstofwisseling beïnvloeden zouden indirect het tumor metastase kunnen beïnvloeden

Osteoblasten: zo veel meer dan u waarschijnlijk dacht