darbas atliktas analizinĖs ir toksikoliginĖs …
TRANSCRIPT
5 priedas
DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLIGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kokybinis ir kiekybinis B grupės vitaminų
tyrimas maisto papilduose“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos
dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS
TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos
dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos
dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE,
INSTITUTE)
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos
dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas)
vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos
dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
GABIJA KRUOPYTĖ
KOKYBINIS IR KIEKYBINIS B GRUPĖS VITAMINŲ TYRIMAS
MAISTO PAPILDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Vadovas:
Prof. dr. Liudas Ivanauskas
KAUNAS, 2020
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė
Parašas
Data
KOKYBINIS IR KIEKYBINIS B GRUPĖS VITAMINŲ TYRIMAS
MAISTO PAPILDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Liudas Ivanauskas
Parašas
Data:
Recenzentas
Vardas, pavardė
Parašas
Data:
Darbą atliko
Magistrantė
Gabija Kruopytė
Parašas
Data:
KAUNAS, 2020
3
TURINYS
SANTRAUKA...........................................................................................................................................5
SUMMARY ............................................................................................................................................. 6
SANTRAUPOS ........................................................................................................................................ 8
ĮVADAS ................................................................................................................................................... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ................................................................................................... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA .......................................................................................................... 11
1.1 Vitamino B3 literatūros analizė .................................................................................................... 11
1.1.1 Vitamino B3 cheminė struktūra ir fizikinės savybės .......................................................... 11
1.1.2 Vitamino B3 biologinis poveikis, vitamino šaltiniai ........................................................... 11
1.2 Vitamino B6 literatūros analizė ..................................................................................................... 13
1.2.1 Vitamino B6 cheminė struktūra ir fizikinės savybės .......................................................... 13
1.2.2 Vitamino B6 biologinis poveikis, vitamino šaltiniai ........................................................... 13
1.3 Biotino literatūros analizė ............................................................................................................. 15
1.3.1 Biotino cheminė struktūra ir fizikinės savybės................................................................... 15
1.3.2 Biotino biologinis poveikis, vitamino šaltiniai ................................................................... 15
1.4 Vitamino B12 literatūros analizė ................................................................................................... 17
1.4.1 Vitamino B12 cheminė struktūra ir fizikinės savybės ......................................................... 17
1.4.2 Vitamino B12 biologinis poveikis, vitamino šaltiniai ........................................................ 18
1.5 B grupės vitaminų analizės metodai ............................................................................................. 20
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS.......................................................................................... 24
2.1 Tyrimo objektas ............................................................................................................................ 24
2.2 B grupės vitaminų kokybinis ir kiekybinis vertinimas ESC metodu............................................ 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ................................................................................................ 28
3.1 ESC metodo pritaikymas .............................................................................................................. 28
3.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija biotinui ....................................... 28
3.2.1 Biotino analizės specifiškumas ........................................................................................... 29
3.2.2 Biotino analizės atsikartojamumas (glaudumas) ................................................................ 30
4
3.2.3 Biotino analizės tiesiškumas, aptikimo ir nustatymo ribos ................................................ 32
3.3 Maisto papildų turinčių B grupės vitaminų analizės rezultatai .................................................... 33
3.3.1 Vitamino B3 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose .... 33
3.3.2 Vitamino B6 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose .... 35
3.3.3 Biotino kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose ............. 36
3.3.4 Vitamino B12 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose .. 38
3.3.5 Palyginamoji vit. B3 ir vit. B6 kiekybinė analizė maisto papilduose................................. 40
4. IŠVADOS ........................................................................................................................................... 42
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS.............................................................................................................. 43
5
SANTRAUKA
G. Kruopytės magistro baigiamasis darbas „Kokybinis ir kiekybinis B grupės vitaminų tyrimas maisto
papilduose“. Mokslinis vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto
Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2020
Raktiniai žodžiai: B grupės vitaminai, efektyvioji skysčių chromatografija.
Tikslas: identifikuoti vitaminus B3, B6, B12 ir biotiną bei įvertinti jų kiekį B grupės turinčiuose
maisto papilduose.
Tyrimo uždaviniai: parinkti tinkamiausią analizės metodą B grupės vitaminų kokybiniam ir
kiekybiniam tyrimui; atlikti pasirinktos metodikos validaciją B grupės vitaminų analizei; pritaikyti
efektyviosios skysčių chromatografijos metodą ir identifikuoti B grupės vitaminus deklaruojamus maisto
papildų etiketėse; kiekybiškai įvertinti B grupės vitaminų sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos
metodu bei gautus duomenis palyginti su gamintojo deklaruojamais etiketėje vitamino kiekiais.
Darbo objektas: maisto papildų preparatai su B grupės vitaminais.
Metodas: efektyvioji skysčių chromatografija.
Pagrindiniai tyrimo rezultatai ir išvados: pritaikyta efektyviosios skysčių chromatografijos
metodologija vitamino B3, B6, B12 ir biotino analizei. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
validuota biotinui atsižvelgiant į specifiškumo, atsikartojamumo, tiesiškumo parametrus. Atlikus
kokybinį maisto papildų vertinimą vitaminas B6 buvo nustatytas visuose tirtuose maisto papilduose,
vitaminas B3 buvo identifikuotas keturiuose maisto papilduose (X4, X5, X6, X7), vitaminas B12
identifikuotas tik viename maisto papilde (X3). Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo
validacijos metu nustatyta biotino aptikimo riba – 0,2 µg/ml, nustatymo riba – 1,1 µg/ml, nors pasirinktų
tirti maisto papildų ekstraktų koncentracija nurodyta 5-20 µg/ml ribose, vitaminas identifikuotas nebuvo.
Įvertinus vitaminų kiekius gautus tyrimo metu, mažiausias vitamino B3 nuokrypis nuo deklaruojamo
kiekio etiketėje būdingas maisto papildui X5 (-45 proc.), didžiausias – maisto papilduose X2 ir X3
(-100 proc.). Vitamino B6 mažiausi kiekio nuokrypiai nustatyti papilduose X3 (+45proc.) ir X5
(+27proc.), didžiausias maisto papilde X1 (+360 proc.). Vitaminas B12 identifikuotas tik maisto papilde
X3, kurio nuokrypis nuo gamintojo deklaruojamo kiekio etiketėje yra -84 proc.
6
SUMMARY
Gabija Kruopytė Master‘s thesis „Qualitative and quantitative analysis B- group vitamins in
food supplements“. Academic cordinator prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lithuanian University of Health
Sciences, medicine faculty, department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas, 2020.
Keywords: Biotin, B-group vitamins, liquid chromatography.
Aim of search: the aim of study is to evaluate quantitative and qualitative determination of B-
group vitamins in food supplements using High - performance liquid chromatography.
Tasks of research: to select the most appropriate analytical method for qualitative and
quantitative analysis of B-group vitamins; to validate selected methodology for analysis of B-group
vitamins, to apply HPLC method for the qualitative evaluation B-group vitamins, to compare obtained
data with the manufacturers declared vitamin amounts.
Object: food supplements containing B-group vitamins.
Method: high performance liquid chromatography
Results and conclusions: The applied HPLC method was suitable for determination of B-group
vitamins in food supplements. The HPLC methodology was validated for biotin applying specificity,
repeatability, linearity parameters. Following a qualitative evaluation of food supplements, vitamin B6
was detected in all tested food supplements, vitamin B3 has been identified in four food supplements
(X4, X5, X6, X7), vitamin B12 has been identified in only one food supplement (X3). Biotin limit of
detection – 0,5 µg/ml, limit of quantitation - 2,2 µg/ml, although the concentration of food supplement
extracts were found to be in the range of 5 to 20 µg / ml, no vitamin was identified. After estimating the
amounts of vitamin obtained during the study, the smallest deviation of vitamin B3 from the declared
amount on the label is characteristic in food supplement X5 (45%), the largest - in food supplements X2
and X3 (100%). The smallest deviations of vitamin B6 content were found in supplements X3 (45%)
and X5 (27%), the largest in food supplement X1 (360%). Vitamin B12 has been identified only in food
supplement X3, which deviates from the amount declared by the manufacturer on the label by 84%.
7
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju savo darbo vadovui prof. Liudui Ivanauskui už konsultacijas, vertingus
patarimus, pagalbą atliekant tyrimą bei rašant baigiamąjį darbą. Dėkoju lektoriui Mindaugui Marksai už
bendradarbiavimą ir suteiktas žinias.
8
SANTRAUPOS
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
NAD – nikotinamido adenino dinukleotidas
NADP – nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas
PLP – piridoksalio fosfatas
UESC – ultraefektyvioji skysčių chromatografija
UV – ultravioletinė spinduliuotė
Vitaminas B3 – niacinas
Vitaminas B6 – piridoksolis
Vitaminas B7 – biotinas
Vitaminas B12 – kobalaminas
9
ĮVADAS
Kiekvienos vaistinės asortimente gausu maisto papildų, kurių sudėtyje yra įvairių vitaminų ir
mikroelementų. Nagrinėjant vaistinės asortimentą matyti, kad maisto papildų etiketėse dažnai nurodyti
B grupės vitaminai, kurie yra svarbūs daugeliui biocheminių procesų vykstančių žmogaus organizme,
normaliam kūno augimui, tinkamam nervų sistemos darbui.
Vitaminai skirstomi į dvi stambias grupes – tirpius riebaluose arba vandenyje. Tirpiems
vandenyje vitaminams priklauso tiaminas (vitaminas B1), riboflavinas (vitaminas B2), niacinas
(vitaminas B3), pantenono rūgštis (vitaminas B5), piridoksinas (vitaminas B6), biotinas (vitaminas B7),
folio rūgštis (vitaminas B9) ir kobalaminas (vitaminas B12). Trūkstant B grupės vitaminų teigiama, jog
jaučiamas silpnumo jausmas, nuovargis, nervų sistemos funkcijų sutrikimo problemos.
Vandenyje tirpių B grupės vitaminų svarba dažnai nagrinėjama literatūroje. Vitaminas B3
naudojamas redokso reakcijose, jo trūkumas dažniausia siejamas su pelagra, kuri pasireiškia
viduriavimu, dermatitu ir demencija [1]. Vitaminas B6 svarbus raudonųjų kraujo kūnelių gamyboje, o
esant trūkumui pastebimas padidėjęs dirglumas, periferinė neuropatija, sideroblastinė anemija [2].
Vitaminas B7 būtinas baltymų, riebalų, angliavandenių apykaitoje, trūkumas gali sukelti širdies
funkcijos sutrikimus, anemiją, depresiją [3]. Vitaminas B12 svarbus tinkamai nervų sistemos veiklai,
trūkumas dažnai sukelia anemiją [2]. Norint išvengti vitaminų disbalanso ir palaikyti normalias
organizmo funkcijas patariama vartoti B grupės vitaminų turinčius maisto papildus arba praturtinti
maisto racioną produktais, kuriuose gausu trūkstamų vitaminų.
Siekiant užtikrinti maisto papildų vartojimo racionalumą būtina analizuoti jų sudėtį, ištirti
kokybę ir kiekybę. Šio darbo tikslas yra identifikuoti vitaminus B3, B6, B12 ir biotiną bei įvertinti jų
kiekį B grupės turinčiuose maisto papilduose, taip siekiant išsirinkti kokybiškiausią produktą iš didelės
maisto papildų pasiūlos.
10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tyrimo tikslas: identifikuoti vitaminus B3, B6, B12 ir biotiną bei įvertinti jų kiekį pasirinktuose tirti B
grupės turinčiuose maisto papilduose.
Tyrimo uždaviniai:
1. Parinkti tinkamiausią analizės metodą B grupės vitaminų kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui.
2. Atlikti pasirinktos metodikos validaciją B grupės vitaminų analizei.
3. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą ir identifikuoti B grupės vitaminus
deklaruojamus maisto papildų etiketėse.
4. Kiekybiškai įvertinti B grupės vitaminų sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos metodu bei
gautus duomenis palyginti su gamintojo deklaruojamais etiketėje vitamino kiekiais.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Vitamino B3 literatūros analizė
1.1.1 Vitamino B3 cheminė struktūra ir fizikinės savybės
Vitaminas B3 dar žinomas kaip vitaminas PP, kuris turi du aktyvius junginius – nikotino rūgštį
(niaciną) ir nikotinamidą. Vitaminas priklauso vandenyje tirpių vitaminų klasei [4]. Nikotino rūgšties
cheminis pavadinimas – 3-piridinkarboksirūgštis, nikotinamido cheminis pavadinimas – 3-
piridinkarboksiamidas, jų cheminės formulės nurodytos 1 pav. Abu junginiai lengvai virsta vienas kitu
[5]. Vitaminas PP yra jautrus šviesos, deguonies poveikiui. [6]
Nikotino rūgštis (3-piridinkarboksirūgštis) Nikotinamidas (3-piridinkarboksiamidas)
1 pav. Vitamino B3 junginiai: nikotino rūgštis ir nikotinamidas
Iš vitamino B3 junginio niacino susintetinamos biologiškai aktyvios formos NADP+ ir NAD+,
kurios atlieka svarbias ląstelėje funkcijas [4].
1.1.2 Vitamino B3 biologinis poveikis, vitamino šaltiniai
Vitamino B3 junginiai – nikotino rūgštis ir nikotinamidas lengvai virsta vienas kitu.
Nikotinamidas gaunamas amidinant nikotino rūgštį, o nikotino rūgštis gaunama hidrolizuojant
nikotinamidą. Iš vitamino B3 junginio niacino susintetinamos biologiškai aktyvios formos NADP+ ir
NAD+, kurios atlieka svarbias ląstelėje funkcijas. NAD+ dalyvauja kaip substratas sintezės reakcijose, jo
trūkstant gali pakisti ląstelių dalijimosi procesas, kuris ypač svarbus greitai besidalinantiems audiniams
[7].
Vitaminas siūlomas vartoti kraujagyslių ligoms gydyti, nes turi antitrombozinį poveikį,
pagerina endotelio funkciją [8],[7]. Jeigu padidėjęs mažo ir labai mažo tankio lipoproteinų kiekis
tikslinga vartoti B3 preparatus, nes nikotino rūgštis inhibuoja lipolizę riebaliniame audinyje, taip kraujyje
sumažindami riebalų rūgštis, o kepenyse – trigliceridų sintezę, kas slopina mažo tankio lipoproteinų
sintezę. NAD+ ir NADP+ dalyvauja biologinės oksidacijos reakcijose susidarant redukuotiems NADH ir
12
NADPH, kurie atlieka reguliacinę funkciją energijos apykaitoje. Nuo NADPH pertekliaus priklauso
fermento gliukozės 6-fosfato hehidrogenazės aktyvumas, o NADH inhibuodamas fermentus reguliuoja
Krebso ciklo oksidacinių reakcijų greitį [5].
Vitaminas B3 padeda metabolizuoti angliavandenius, riebalus, alkoholį. Vitaminas B3
dalyvauja ne tik biologinių procesų, tokiuose kaip energijos gamyba, cholesterolio ir riebalų rūgščių
sintezė, valdyme, tačiau ir klinikinių ligų (diabetas, šizofrenija) gydyme. Palaiko normalią odos būklę.
Vitaminas B3 yra svarbus žmogaus organizmui mikroelementas dėl savo savybių palaikyti cholesterolio
kiekį ir normalų virškinimo sistemos darbą [9]. Nikotino rūgštis plečia kraujagysles ir mažina
aterosklerozės riziką, todėl rekomenduojama vartoti kraujagyslių ligoms ir hiperlipoproteinemijai
gydyti.
Nikotinamidas gali būti gaunamas keliais būdais: laikantis subalansuotos mitybos, kai valgomi
kiaušiniai, mėsa, žuvis, grybai, arba kitu atveju nikotinamidas gaunamas endogeninio triptofano
metabolizmo metu.
Vitamino B3 randama jautienoje, vištienoje, žemės riešutų svieste, žuvyje [10].
1 lentelė. Vitamino B3 šaltiniai
Produktas Vitamino B3 kiekis niacino ekvivalentais/100g
Jautienos kepenys 14,5
Lašiša 11,1
Kiauliena 10
Jautiena 10
Pupelės 7,0
Bulvės 3,0
Rekomenduojama vitamino B3 paros norma yra 14 mg niacino moterims ir 16 mg niacino
vyrams. Reikia atsižvelgti, jog nėščioms ir maitinančioms moterims vitamino poreikis yra didesnis [10].
Vitamino B3 trūkumą dažnai sukelia gaunamas nepakankamas vitamino kiekis su maistu arba
susilpnėjusi rezorbcija plonojoje žarnoje. Vitamino B3 gali trūkti dažniau padidėjus vitamino poreikiui
nėštumo metu arba laktacijos periodu. Trūkstant vitamino sutrinka oksidacijos procesai ląstelėse.
Pažeidžiami greitai atsinaujinantys audiniai. Trūkstant vitamino B3 pasireiškia pelagra, kurios metu
pažeidžiama oda (galimi įvairūs odos uždegiminiai procesai, būdingas dermatitas atsirandantis dėl saulės
poveikio), virškinamasis traktas (būdinga apetito stoka) ir nervų sistema (gali pasireikšti galvos
skausmas, depresija, psichozės, silpnaprotystė) [11].
13
1.2 Vitamino B6 literatūros analizė
1.2.1 Vitamino B6 cheminė struktūra ir fizikinės savybės
Vitaminas B6 (piridoksolis) apibūdinamas trimis aktyviais piridino grupės junginiais:
piridoksoliu, piridoksaliu, piridoksaminu bei kitomis fosforilintomis vitamino formomis. Vitaminas yra
gerai tirpus vandenyje ir etanolyje, atsparus rūgščių ir temperatūrų poveikiui, tačiau neatsparus veikimui
UV spinduliuote [6].
Piridoksolis Piridoksalis Piridoksaminas Piridoksolio
fosfatas
2 pav. Vitamino B6 junginiai
1.2.2 Vitamino B6 biologinis poveikis, vitamino šaltiniai
Vitaminas B6 svarbus aminorūgščių apykaitoje. Daugiausia funkcijų atlieka kofermentas
piridoksalio fosfatas (PLP), kuris dalyvauja aminorūgščių metaboliniuose procesuose. Dėl savo
struktūros PLP gali dalyvauti ir kitose svarbiose reakcijose: glikogenolizėje, aminorūgščių
dekarboksilinime, skydliaukės hormonų biosintezėje, vitamino PP sintezėje ir kt. [12]. Kofermentas PLP
dalyvauja dopamino, norepinefrino, seratonino, γ-aminosviesto rūgšties sintezėje, trūkstant vitamino B6
sutrinka nervų sistemos funkcijos, galimas dirglumas, depresija. Vitaminas B6 triptofano metabolizmo
metu veikia kaip kofaktorius ir apsaugo nuo neurotoksinių produktų kaupimosi [13]. Vitaminas B6
aktyviai dalyvauja sveikų raudonųjų kraujo kūnelių gamyboje, taip pat sumažina krūties vėžio riziką
[14],[15].
14
Vitamino B6 rekomenduojama paros dozė iki 1 mg vaikams, suaugusiems - 1,3 mg,
nėščiosioms - 1,9 mg, maitinančioms iki 2 mg [10]. Per didelės vitamino B6 dozės gali sukelti periferinę
neuropatiją ir nervų degenergaciją, perdozavus vitamino ir nutraukus jo vartojimą šie pakitimai yra
negrįžtami. Cukriniu diabetu sergantiems asmenims dažnai yra vitamino B6 stygius, nes vitaminas
dalyvauja triptofano katabolizme, kuris gali daryti įtaką insulino sekrecijos kiekiui ir gliukozės
tolerancijai [13].
Vitaminas B6 randamas ir gyvūninės, ir augalinės kilmės produktuose. Didelė vitamino
koncentracija randama mėsoje (jautienoje, jautienos kepenyse, viščiukų kepenyse), kiaušinio trynyje, ir
ankštinėse kultūrose. Vitamino B6 taip pat randama bananuose, žuvyje, alaus mielėse. [5].
2 lentelė. Vitamino B6 šaltiniai
Produktas Vitamino B6 kiekis mg/100g
Kukurūzai 2,30
Kviečių sėlenos 2,40
Jautiena 0,25
Kiauliena 0,57
Lašiša 0,98
Sojų pupelės 0,95
Bulvės 0,20
Vitamino B6 avitaminozė pasireškia retai, tačiau yra veiksnių kas gali daryti įtaką šio vitamino
trūkumui. Būtina įvertinti, kad skiriant gydymą pacientui antituberkulioziniais vaistais tokiais kaip
izoniazidas arba gydant pacientus sulfidrilo junginiais tokiais kaip penicilaminu yra galima šio vitamino
hipovitaminozės rizika. Gydantis antibiotikais galimas vitamino B6 trūkumas, dėl susilpnėjusios žarnyno
bakterijų veiklos ir pakitusios mikrofloros. Nėštumo ir laktacijos periodu vitamino poreikis padidėja
[12].
Vitamino B6 trūkumas gali sukelti nervų sistemos pažeidimus: epilepsijos priepuolius,
depresiją, periferinę neuropatiją, padidėjusį dirglumą, nervingumą [13]. Trūkstant vitamino B6
pasireiškia tachikardija, pažeidžiamas širdies raumuo, galima sideroblastinė anemija [12], [16].
15
1.3 Biotino literatūros analizė
1.3.1 Biotino cheminė struktūra ir fizikinės savybės
Vitaminas B7 yra žinomas kaip biotinas, vitaminas H, koenzimas R (C10H16N2O3S), kuris
priklauso tirpių vandenyje vitaminų klasei. Cheminis junginio pavadinimas 2‘-okso-3,4-imidazoli-2
tetrahidrotiofenpentano rūgštis. Vitamino stabilumui įtaką daro šarmų, rūgščių poveikis bei šviesa [6].
3 pav. Biotino cheminė formulė
1.3.2 Biotino biologinis poveikis, vitamino šaltiniai
Biotinas yra ligazių klasės fermentų kofermentas. Fermento ir biotino kompleksas gaunamas
vitaminui jungiantis amidiniu ryšiu su tokiais biotininiais fermentais kaip propionil-CoA-karboksilaze
(trumpinys-PCC), kuri katalizuoja fermentus svarbius amino ir riebalų rūgščių katabolizme,
metilkrotanil-CoA-karboksilaze (trumpinys-MCC), kuri katalizuoja fermentus svarbius leucino ir
izovalerijono rūgšties katalizei ir acetil-CoA karboksilaze (trumpinys-ACC), dalyvaujančioje riebalų
rūgščių biosintezėje [17]. Taigi, biotinas daro įtaką organizmui svarbioms reakcijoms: riebalų rūgščių
sintezei, angliavandenių sintezei, leucino apykaitai ir kt.
Dėl savo kainos ir lengvo prieinamumo šis vitaminas yra populiari medžiaga maisto papildų
sudėtyje, kurie skirti plaukų slinkimui mažinti ir normaliai odos būklei palaikyti. Biotinas dažnai
rekomenduojamas kaip maisto papildas plaukams stiprinti, todėl daugelyje plaukų ir odos kosmetikos ir
maisto papildų sudėtyje galime jį rasti, nors pats biotinas nedaro tiesioginės įtakos kultūrinių žmogaus
folikulų keratinocitų proliferacijai ir diferenciacijai [18].
Biotino trūkumas žmogaus organizme pasireiškia retai, nes žarnyno bakterijos pačios sintetina
šį vitaminą, tačiau susirgus virškinamojo trakto ligomis tokiomis kaip virškinamojo trakto disbakteriozė,
organizmas gali negebėti pats susintezuoti pakankamą kiekį biotino. Biotinas gali būti gaunamas kartu
su maistu, jo galima rasti tiek augalinės, tiek gyvūninės kilmės produktuose. Vitamino didesni kiekiai
16
randami kiaušinyje (ypač gausus jo kiekis yra trynyje), pieno produktuose (sūryje, piene), mėsoje
(kiaulienoje, kiaulienos kepenyse), avižiniuose dribsniuose, šiek tiek mažiau daržovėse, vaisiuose ir kt
[18].
3 lentelė. Biotino šaltiniai
Maisto produktas Biotino kiekis µg/100 g
Kiaušinio trynys (kiaušinis) 53,0 (25,0)
Kiaulienos kepenys 27,0
Avižiniai dribsniai 20,0
Sūris 6,2
Karvės pienas 3,5
Kiauliena 5,0
Morka 5,0
Obuolys 4,5
Špinatai 6,9
Biotinas yra būtinas žmogaus organizmui vitaminas, kurio reikalinga paros dozė suaugusiam
žmogui yra 30 μg [19]. Nėščiosioms rekomenduojama paros dozė – 30 µg, naujagimiams
rekomenduojama skirti 5 µg per parą, o moterims laktacijos periodu 35 µg [10].
Biotino trūkumas gali būti įgytas arba įgimtas. Biotino kiekio stygius naujagimiams atsiranda
dėl fermento halokarboksilazės trūkumo, dažniausia pasireiškia per pirmas 6 gyvenimo savaites ir
pasireiškia dermatitu, alopecija, antakių ir blakstienų nebuvimu [20]. Žmogaus žarnyno bakterijoms
sintetinant biotiną, jo trūkumas pasireiškia retai, tačiau avitaminozei būdingi tokie požymiai: dermatitas
(paraudusi ir pleiskanota oda), komplikuojantis šiai būklei galimas plaukų slinkimas, nagų skilinėjimas,
jaučiamas raumenų skausmas, širdies sutrikimai. Pažeidžiama nervų sistema, jaučiamas mieguistumas,
depresija, sunkiais atvejais – paralyžius. Biotino trūkumas gali turėti neigiamos įtakos moters
reprodukcinei sistemai [21].
Reikėtų atsižvelgti, kad nėštumo laikotarpiu paspartėja biotino katabolizmas, o laktacijos
periodu, dėl padidėjusio vitamino poreikio reikia palaikyti didesnę biotino koncentraciją kraujyje [18].
Dažnai vitamino trūkumą gali sukelti ne tik ligos, tačiau ir mitybos ypatumai: galima susirgti valgant
daug žalių kiaušinių, nes kiaušinio baltyme yra daug glikoproteino avidino, kuris žarnyne susijungia su
biotinu ir sudaro vandenyje netirpų ir nerezorbuojamą kompleksą. Vitamino hipovitaminozė taip pat
galima dėl vartojamų vaistų – sulfanilamidų, kurie slopina žarnyno bakterijų veiklą ir taip stabdo
vitamino biosintezę. Didesnis šio vitamino trūkumas pastebimas žmonėms sergantiems alkoholizmu,
rūkantiems ir vyresnio amžiaus žmonėms [18].
17
1.4 Vitamino B12 literatūros analizė
1.4.1 Vitamino B12 cheminė struktūra ir fizikinės savybės
Vitaminas B12 yra vandenyje tirpus vitaminas, kurio cheminis molekulės pavadinimas yra α-
(5,6-dimetilbenzimidazol-1-il) kobamido cianidas. Vitaminas yra atsparus temperatūros poveikiui,
tačiau paveiktas rūgščių ar šviesos – kinta. [6]. Pagrindinis B12 cheminės struktūros bruožas yra korino
žiedas, kurio keturi pirolo žiedų azoto atomai susijungia su centriniu kobalto atomu, kuris paprastai būna
Co(III) oksidacijos būsenoje. B12 molekulę atpažįstama dėl kobalto atomo, kuris yra susijungęs su
heterociklinės bazės 5,6-dimetilbenzimidazolo azoto atomu (trumpinys-DMB) [22],[23].
4 pav. Vitamino B12 cheminė formulė
Dvi pagrindinės vitamino B12 biologinės formos yra metilkobalaminas ir
deoksiadenozilkobalaminas (vitamino B12 kofermentas), jie abu turi alkilo grupes, o dėl Co-C ryšių gali
būti lengvai suskaidomos, nes jų disociacijos energija yra maža, kai nėra šviesos energijos. Dėl šių
savybių metilkobalaminas ir deoksiadenozilkobalaminas yra naudojami kaip kofaktoriai fermentų
katalizėje. Esant kitokiai B12 biologinei formai pvz. cianokobalamino atveju, biologinio poveikio nėra ir
norint naudoti turi būti paverčiamas metilkobalaminu arba deoksiadenozilkobalaminu [22],[24].
18
1.4.2 Vitamino B12 biologinis poveikis, vitamino šaltiniai
B12 yra reikalingas folio ir riebalų rūgščių apykaitos procesuose [25]. Metilkobalaminas (metil-
B12) dalyvauja metionino sintezėje, kurios metu homocisteinas virsta į metioniną. Reakcija vyksta
citozolinėje aplinkoje, o dėl vitamino kofaktoriaus trūkumo padidėja N-metil-THFR kiekis, kas daro
įtaką, jog proceso eigoje THRF darinių trūksta, tad sutrinka aminorūgščių sintezė (metionino sintezė iš
homocisteino). Šis procesas yra būtinas, o disfunkcija paveikia DNR sintezę, fiziologinius procesus,
kuriems reikalinga intensyvi ląstelių replikacija. Deoksiadenozilkobalaminas (5’-adenozil-B12)
reikalingas riebalų rugščių apykaitoje. Metilmalonil-CoA inhibuoja riebalų rūgščių biosintezę, todėl
galimi neurologiniai sutrikimai dėl ląstelių atrofijos, audinių vientisumo pokyčių, aksonų pažeidimų,
audinio demielinizacijos. Neuronų mielino apvalkalų būklė itin priklauso nuo riebalų rūgščių
metabolizmo, todėl dėl nedidelio deoksiadenozilkobalamino biologinio praeinamumo neuronuose,
mielino sluoksnis išeikvojamas, atsiranda nervų signalų perdavimo sutrikimai [26].
Vitamino B12 šaltiniai yra gyvūninės kilmės produktai: kiauliena, žuvis, paukštiena, kepenys,
inkstai ir kt. Tik labai maži kiekiai vitamino randami tokiose daržovėse kaip brokoliai, šparagai, pupų
daigai. Vitamino B12 didesni kiekiai daržovėse randami tokiuose augaliniuose produktuose, kurie buvo
apdoroti fermentuojant tam tikromis pieno rūgštimis ar propioninėmis bakterijomis. Vitamino B12 yra
įvairių rūšių arbatos lapuose, auksinėse voveraitėse (Cantharellus cibarius), jūros dumbliuose
(Enteromorpha sp) ir kt. [26].
4 lentelė. Vitamino B12 šaltiniai
Maisto produktas Vitamino B12 kiekis µg/100 g
Kiauliena 4
Žuvis 9
Arbatos lapai 0,1-1,2
Auksinės voveraitės 1,09-2,65
Rekomenduojama vitamino B12 paros dozė vyrams ir moterims – 2,4 µg. Nėštumo metu ir
maitinant kūdikį vitamino poreikis didesnis, atitinkamai 2,6 µg ir 2,8 µg. [10]
B12 yra būtinas eritropoezės funkcijai ir nervų sistemos tinkamai veiklai. Trūkumas gali sukelti
makrocitinę anemiją, kuri panaši į folio rūgšties trūkumą. Norint jas atskirti būtina nustatyti
homocisteino ir metilmalono rūgšties kiekį serume. Vitamino B12 trūkumas yra išgydomas, tačiau
negydomas gali sukelti sunkius neurologinius sutrikimus. Naujagimiams, kuriems trūksta vitamino B12
pirmieji simptomai pasireiškia ne visada iš karto, dažnai simptomai pastebimi po pusmečio. Ankstyvas
19
vitamino trūkumo nustatymas yra efektyvesnis nei gydymas pradėtas simptominėje stadijoje [27].
Vitamino B12 trūkumas yra labai dažnas senyvo amžiaus žmonėms. Pagrindinės būklės, kurias sukelia
kobalamino trūkumas: nepageidaujami reiškiniai kraujotakos sistemai (labai dažnai makrocitozė,
makrocitinė aemija, neutrofilų hipersegmentacija, rečiau trombocitopenija, neutropenija), nervų
sistemos sutrikimai (labai dažni polineuritas, ataksija, retai optinė atrofija, šlapimo ar išmatų
nelaikymas), virškinimo trakto sutrikimai (pagrindiniai simptomai medžiotojo glositas, gelta, bilirubino
kieko padidėjimas, rečiau pilvo skausmas, pykinimas, vėmimas, viduriavimas), kiti sutrikimai
(nuovargio jausmas, apetito nebuvimas) [28].
Vitaminas B12 yra būtinas nervų sistemai, norint išvengti nervinio audinio demielinizacijos,
ląstelių atrofijos, audinių vientisumo pokyčių, aksonų pažeidimų. Jo trūkumas gali būti besimptomis,
nors pacientai ir patiria sunkų nepakankamumą. Vitamino B12 trūkumas gali būti matomas magnetinio
rezonanso tomografijos vaizduose, tačiau įprastai MRT smegenų tyrimas ne visada parodo visus
vitamino trūkumus [29].
20
1.5 B grupės vitaminų analizės metodai
Vandenyje tirpūs vitaminai yra žinomi dėl savo svarbos energijos metabolizme, norint palaikyti
sveiką odą, plaukus, raumenis. Jų trūkumas ar perteklius gali sukelti medžiagų apykaitos sutrikimus, dėl
kurių atsiranda tokių sveikatos sutrikimų kaip anemija, įvairūs neurologiniai sutrikimai, pelagra.
Remiantis Europos parlamento ir tarybos reglamentu (EB) Nr. 1925/2006 nutarimu dėl maisto produktų
papildymo vitaminais ir mineralais bei tam tikromis kitomis medžiagomis suprantama, jog norint
kontroliuoti potencialią riziką vartotojams reikia žinoti bendrus vitaminų kiekius, kad būtų išvengiama
trūkumo ar vitaminų pertekliaus [6]. Per didelis vitaminų kiekis gali turėti neigiamų pasekmių, tad būtina
atsižvelgti į rekomenduojamas vitaminų paros normas. Tikslūs vitaminų analizės metodai yra svarbūs
norint patvirtinti nurodytą vitaminų kiekį etiketėje. Vandenyje tirpių vitaminų analizė yra sudėtinga dėl
mažų vitamino kiekių ir skirtingų koncentracijų, sąveikos su kitais junginiais. [30], [31].
Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas mėginių paruošimui dėl vitaminų cheminio
nestabilumo. Visi mėginiai turėtų būti ruošiami tamsaus stiklo induose, palaikant optimalią temperatūrą
ir pH viso tyrimo metu. Norint išvengti vitaminų oksidacijos rekomenduojama naudoti tinkamus
stabilizatorius, tai ypač svarbu vitaminui B9, kuris yra linkęs greitai oksiduotis.
Analizuojant literatūros šalinius dažniausia pasirenkami metodai norint įvertinti vandenyje
tirpių vitaminų kiekybę yra chromatografijos metodai tokie kaip efektyvioji skysčių chromatografija,
atvirkštinių fazių skysčių chromatografija ir kt. Taip pat minimas kapiliarinės elektroforezės metodas.
Literatūroje minimuose tyrimuose vitaminas B3 (niacinas), vitaminas B6 (piridoksinas),
vitaminas B7 (biotinas) esantys maisto papilduose tiriami skysčių chromatografijos metodu su masių
spektrometrija. B3 (nikotinamidas), B6 (piridoksinas) gali būti tiriami naudojant diodų matricos
nustatymo metodą. Vitaminas B7 yra gana atsparus UV spinduliuotei, tad analizuoti pritaikant ją gali
būti sudėtinga [30].
Kapiliarinė elektroforezė
Kapiliarinė elektroforezė yra efektyvi, tačiau nėra tokia jautri lyginant su kitais
chromatografijos metodais [32]. Pasirinkus kapiliarinei elektroforezei tinkamus detektorius
(fluorescencijas) gaunami analitės rezultatai. Naudojant kapiliarinės elektroforezės metodą mėginiai
ekstrahuojami ultragarsu acetonitrilo ir vandens mišiniu, kurio santykis 20:80. Pasirinktas elektrolitas –
natrio borato buferinis tirpalas, kurio pH=9. Aptikimo ribos (LOD) buvo intervale nuo 2,5 iki 36 mg/l.
Santykinis standartinis nuokrypis 1,3 - 1,9%. Metodas tinkamas tiksliai nustatyti vitamino B1, B2, B3 ir
B6 kiekį maisto papilduose [33].
21
Atviršktinių fazių skysčių chromatografija
Remiantis literatūros šaltiniais metodas naudojamas vandenyje tirpių vitaminų kiekybei
nustatyti. Judrioji fazė yra poliškesnė už nejudriąją. Tarp skirtingų fazių, dažniausia naudojama C18 tipo
kolonėlė, eliuuojant vandens ir organinių tirpiklių (etanolio, metanolio) mišiniu [6]. Metodas sėkmingai
naudojamas vandenyje tirpių vitaminų junginių nustatymui: nikotinamido, nikotino rūgšties,
piridoksalo, piridoksamino, kobalamino.
Ultra efektyvioji skysčių chromatografija (UESC)
Ultra efektyviosiosios skysčių chromatografijos analizei būdinga didelė skiriamoji geba,
naudojama chromatografavimo kolonėlė, kurios sorbentų dalelių dydis 2 µm, o slėgis ypač didelis. Dėl
itin aukštos skiriamosios gebos galima atskirti homologiškus vitaminus ir aptikti jų mažus kiekius.
Literatūroje minima, jog vienu metu nustatant tris vitamino B6 junginius – piridoksalą, piridoksiną,
piridoksaminą, jų fosforilines formas, vitamino B2 junginius, jų fosforilines formas analizė efektyviosios
skysčių chromatografijos metodu buvo atlikta per 6 minutes [6].
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC)
Literatūros šaltiniuose nagrinėjama vitamino B12 ir biotino nustatymas efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu. Cianokobalamino ir biotino tyrimas mišiniuose yra sudėtingas dėl didelio
vitamino B12 kiekio, kas gali apsunkinti vitamino B7 analizę. [21].
Visi naudoti reagentai analitinio švarumo. Ruošiami standartiniai vitamino B12 ir biotino
tirpalai, kurių koncentracijos 160 μg ir 200 μg atitinkamai. Biotino standartui gaminti buvo papildomai
dedama 200 μl 1 N NaOH, kad medžiaga geriau tirptų. Atlikus kelis skiedimus paruošti 6 tirpalai, kurių
koncentracijos – nuo 92 ng/ml iki 9200 g/ml biotinui ir nuo 4,846 ng/ml iki 484,6 ng/ml vitaminui B12.
Šie tirpalai naudojami tiesiškumo parametrui įvertinti [21],[34].
22
Mėginių paruošimas – B grupės vitaminų turinčios tabletės sutrinamos grūstuvėje, analitinėmis
svarstyklėmis atsveriama po 0,5 g (tikslus svoris). Atsvertas mėginys ištirpinamas 100 ml vandenyje,
kaitinamas 80°C 15 minučių, po to 15 min laikomas ultragarso vonioje. Tiriamam tirpalui atšalus iki
kambario temperatūros mėginiai filtruojami pro 0,45 μm filtrą į analizinius indus. Šio tiriamojo tirpalo
sudėtis turėtų būti 40 μg/ml vitamino B12 ir 0,8 μg/ml biotino. Paruoštas etaloninis B12 tirpalas, kurio
koncentracija 40 μg/ml ir etaloninis biotino tirpalas, kurio koncentracija 0,8 μg/ml. [21]. Žemiau
pateikiama B12 tiriamojo mėginio ir standarto chromatograma (5 pav.) ir biotino tiriamojo ir standarto
chromatograma (6 pav.).
5 pav. Vitamino B12 standarto ir tiriamojo mėginio chromatograma [21]
6 pav. Biotino standarto ir tiriamojo mėginio chromatograma [21]
23
Norint validuoti šį analizės metodą vitaminui biotinui ir vitaminui B12, pasirinktas vienas iš
kriterijų – tiesiškumas. Vitamino B12 ir biotino tiesinės regresijos kreivės pavaizduotos žemiau. (7 pav.,
8 pav.). Įvertinami koreliacijos koeficientų rezultatai.
7 pav. Vitamino B12 tiesinės regresijos kreivė [21]
8 pav. Biotino tiesinės regresijos kreivė [21]
Tyrimo metu gauti koreliacijos koeficientų rezultatai yra tinkami metodo validacijai.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas sėkmingai pritaikytas biotino ir vitamino B12 tyrime.
Atsižvelgus į metodo galimybes aptikti mažus medžiagų kiekius ir metodo ekonomiškumą, pasirinkau
pritaikyti šį metodą savo tyrime.
24
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS
2.1 Tyrimo objektas
Tyrime analizuojami maisto papildai, kurių sudėtyje yra vitaminai B3, B6, B7 ir B12. Maisto
papildai pasirinkti atsitiktinai, siekiant įvertinti jų sudėtyje esančių B grupės vitaminų kokybinę sudėtį
ir įvertinti kiekybiškai efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Visi tyrime analizuojami maisto
papildai įsigyti Lietuvos vaistinėse. Tyrime analizuojami maisto papildai:
• X1 (pagaminta Lenkijoje)
• X2 (pagaminta Danijoje)
• X3 (pagaminta Belgijoje)
• X4 (pagaminta Jungtinėje Karalystėje)
• X5 (pagaminta Danijoje)
• X6 (pagaminta Jungtinėje Karalystėje)
• X7 (pagaminta Danijoje)
• X8 (pagaminta Danijoje)
Maisto papildų sudėtis
X1 dviejose tabletėse yra 102 mg magnio, 2 mg vitamino B6. Pagalbinės medžiagos:
magnio laktatas, užpildas mikrokristalinė celiuliozė, tirštiklis polivinilpirolidonas, lipnumą
reguliuojančios medžiagos, riebalų rūgščių magnio druskos ir silicio dioksidas, piridoksino
hidrochloridas, stabilizatorius polivinilpolipirolidonas.
X2 vienoje tabletėje yra 1,65 mg tiamino (vit. B1), 1,4 mg riboflavino (vit. B2), 24 mg
niacino, 2,4 mg vitamino B6, 2,5 mg vitamino B12, 400 mg folio r., 9 mg pantoteno r., 50 mg biotino,
80 mg vitamino C, 20 mg vitamino D, 120 mg kalcio, 56,25 mg magnio, 14 mg geležies, 10 mg cinko,
1000 mg vario, 150 mg jodo, 3 mg mangano, 40 mg chromo, 55 mg seleno, 50 mg molibdeno. Pagalbinės
medžiagos: kalcio karbonatas, magnio hidroksidas, mikrokristalinė celiuliozė, talkas, šelakas,
gumiarabikas, karnaubo vaškas, glicerolis, titano dioksidas.
X3 vienoje tabletėje yra 18 mg pantenono rūgšties, 16 mg niacino, 5,6 mg vitamino B6,
5,6 mg vitamino B2, 4,4 mg vitamino B1, 0,3 mg folio rūgšties, 200 µg biotino, 10 µg vitamino B12.
Pagalbinės medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė, hidroksipropilmetilceliuliozė, natrio
karboksimetilceliuliozė, talkas, magnio druskos, hidroksipropilceliuliozė, palmių aliejus, kokosų aliejus,
glicerolis, geležies oksidas, titano dioksidas.
X4 dviejose tabletėse yra 600 mg RE vitamino A, 1,3 mg tiamino (vit. B1), 1,5 mg
riboflavino (vit. B2), 1,6 mg vitamino B6, 2 mg vitamino B12, 300 mg folio r., 17 mg NE niacino, 6 mg
25
pantoteno r., 50 mg biotino, 75 mg vitamino C, 25 mg vitamino D, 10 mg α-TE vitamino E, 400 mg
kalcio, 67,5 mg magnio, 9 mg geležies, 9 mg cinko, 900 mg vario, 150 mg jodo, 2 mg mangano, 40 mg
chromo, 50 mg seleno, 50 mg molibdeno. Pagalbinės medžiagos: kalcio karbonatas, maltodekstrinas,
magnio hidroksidas, užpildas (mikrokristalinė celiuliozė), glajinės medžiagos
(hidroksipropilmetilceliuliozė, riebalų rūgščių magnio druskos, akacijų derva, talkas, šelakas, karnaubos
vaškas), geležies fumaratas, drėgmę išlaikanti medžiaga (glicerolis), dažiklis (titano dioksidas), kalcio
D-pantotenatas, mangano sulfatas, polifruktozė.
X5 vienoje tabletėje yra 2 mg liuteino esterių, 20 mg žaliosios arbatos ekstrakto, 10 mg
fosfatidilcholino, 2 mg kofermento Q10, 10 mg L-karnitino, 20 mg alfa lipo rūgšties, 10 mg
bioflavanoidų, 2 mg betakaroteno, 10 µg vitamino D3, 15 mg α-TE vitamino E, 60 mg vitamino C, 14
mg vitamino B1, 4 mg vitamino B2, 30 mg NE vitamino B3, 10 mg vitamino B6, 200 µg folio r., 5 µg
vitamino B12, 50 µg biotino, 6 mg pantoteno r., 60 mg magnio, 10 mg geležies, 15 mg cinko, 1000 µg
vario, 0,5 mg mangano, 120 µg seleno, 75 µg chromo. Pagalbinės medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė,
silicio dioksidas, vario chlorofilinai (dažiklis).
X6 vienoje tabletėje yra 800 µg RE vitaminas A, 1,7 mg vitamino B1, 2 mg vitamino B2,
2,4 mg vitamino B6, 4,5 µg vitaminas B12, 50 mg vitamino C, 5 µg vitamino D, 8 mg α-TE vitamino
E, 150 µg folio r., 14 mg NE niacino, 4,5 mg pantoteno r., 100 mg kalcio, 50 mg magnio, 12 mg geležies,
0,45 mg vario, 150 µg jodo, 1,2 mg mangano, 20 µg chromo, 25 µg seleno, 50 µg molibdeno. Pagalbinės
medžiagos: saldikliai (ksilitolis, acesulfamas K, aspartamas, neohesperidinas DC, taumatinas), glajinės
medžiagos (polivinilpirolidonas, riebalų rūgščių magnio druskos, šelakas), kvapiosios medžiagos.
X7 dviejose tabletėse yra 99 mg vienmečių paprikų ekstrakto, atitinkančio 396 mg vaisių,
53 mg kvapiųjų rozmarinų lapų miltelių, 50 mg dirvinių asiūklių miltelių, 26 mg pipirmėtės lapų miltelių,
atitinkančių 26 mg lapų, 20 mg paprastųjų kraujažolių miltelių, 7 mg paprastųjų moliūgų sėklų miltelių,
7 mg grauželinių gudobelių lapų ir žiedų ekstrakto, atitinkančio 42 mg lapų ir žiedų, 800 mg RE vitamino
A, 1,1 mg tiamino (vit. B1), 1,4 mg riboflavino (vitamino B2), 1,4 mg vitamino B6, 2,5 mg vitamino
B12, 200 mg folio r., 16 mg NE niacino, 6 mg pantoteno r., 50 mg biotino, 80 mg vitamino C, 20 mg
vitamino D, 12 mg α-TE vitamino E, 400 mg kalcio, 14 mg geležies, 10 mg cinko, 1 mg vario, 150 mg
jodo, 2 mg mangano, 40 mg chromo, 55 mg seleno, 50 mg molibdeno. Pagalbinės medžiagos: užpildai
(mikrokristalinė celiuliozė, skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė), glajinės medžiagos (riebalų
rūgščių magnio druskos, hidroksipropilmetilceliuliozė, šelakas, polietilenglikolis, karnaubo vaškas).
26
2.2 B grupės vitaminų kokybinis ir kiekybinis vertinimas ESC metodu
Reagentai
Tyrime naudotos medžiagos ir reagentai yra analitinio švarumo: 98 proc. trifluoracto rūgštis (Sigma
Aldrich, Šveicarija), 99,9 proc. acetonitrilas (Sigma Aldrich, Vokietija), 70 proc. metanolis (Sigma
Aldrich, Vokietija), išgrynintas vanduo (Milipore, JAV).
Apraratūra ir įranga
Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Vokietija)
Vandens gryninimo sistema (Milipore, JAV)
Ultragarso vonelė (Biosonic UC100, JAV)
Centrifuga („Centurion Scientific C2006“, Jungtinė Karalystė)
Kolonėlė ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm, x 5µm)
Chromatografas Waters 2695
Etaloninių tirpalų paruošimas
Visi etaloniniai tirpalai buvo ruošiami tirpinant medžiagas 70% metanolyje. Vitaminui B3
ruošiami 5 skirtingų koncentacijų mėginiai, kurių koncentracija 5,77 – 92,1 mkg/ml ribose, vitaminui
B6 ruošiami 8 skirtingų koncentracijų mėginiai, kurių koncentracija 0,21 – 22,6 mkg/ml ribose,
vitaminui B12 ruošiami 8 skirtingų koncentracijų mėginiai, kurių koncentracija 0,24 – 31,9 mkg/ml,
biotinui ruošiami 6 skirtingų koncentracijų mėginiai, kurių koncentracija 5,93 – 190 mkg/ml. Visi gauti
mėginiai supilami į chromatografinius buteliukus, užsukami, patalpinami į chromatografo mėginių lizdą
tolimesniems tyrimams.
27
Tiriamųjų tirpalų paruošimas
Tyrime analizuojamų maisto papildų tabletės buvo susmulkintos po vieną grūstuvėje,
pasvertos. Tyrimui naudotų tablečių masės: X1=0,59 g, X2=0,95 g, X3=0,75 g, X4=1,15 g, X5=1,02 g,
X6=0,96 g, X7=1,8 g. Atsverti milteliai suberti į 10 ml matavimo kolbas, ištirpinti 8 ml 70 proc.
metanolyje. Mėginiai tirpinami ultragarso vonelėje 20 minučių. Praskiedžiami iki 10 ml 70 proc.
metanoliu. Tirpalai centrifuguojami 5 min taikant 3600 apsisukimus per minutę, kad nusistovėtų
nuosėdos. Gautus mėginių supernatantus patalpiname į chromatografinius buteliukus, užsukame,
patalpiname į skysčių chromatografą tyrimui atlikti.
Metodika/metodo sąlygos
Analizei atlikti taikoma gradientinė eliuacija, naudojant du eliuentus: A – trifluoracto rūgšties
vandeninį tirpalą (0,1%), B – acetonitrilą. Eliuento tekėjimo greitis – 1 ml/min, analizės laikas - 24
minutės, kolonėlės temperatūra 25 °C. Analizės metu injekuojama po 10 µl tiriamojo tirpalo. Vitaminas
B3 identifikuojamas prie 260 nm bangos ilgio, vitaminas B6 prie 290 nm bangos ilgio, vitaminas B12
prie 360 nm bangos ilgio, biotinas prie 207 nm bangos ilgio. Gradientinio režimo sąlygos nurodytos 5
lentelėje.
5 lentelė. Gradientinio režimo sąlygos
Chromatografavimo laikas,
min
Judančioji fazė A, % Judančioji fazė B, %
0 98 2
1 98 2
20 2 98
22 2 98
24 98 2
28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 ESC metodo pritaikymas
Remiantis literatūros apžvalga B grupės vitaminų – B3, B6, B12 ir biotino kiekybei ir kokybei
nustatyti pasirinktas ESC metodas. ESC metodas pasižymi selektyvumu, tikslumu, efektyvumu ir
trumpa tyrimo trukme lyginant su kitais chromatografavimo metodais. Metodui atlikti naudojamas
chromatografas Waters 2695, pasirinkta chromatografinė kolonėlė ACE C18 (250 x 4,6 mm x 5µm),
siekiant geriausio tiriamųjų junginių atsiskyrimo pasirinktas tinkamas judriosios fazės tėkmės greitis –
1 ml/min, kolonėlės temperatūra 25 °C, injekuojama po 10 µl tiriamojo tirpalo, naudojami analitinio
švarumo eliuentai – acetonitrilas ir trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas (0,5 ml: 500 ml), taikomas
gradientinis eliuavimas.
Šio darbo metu pritaikoma Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, analizinės ir toksikologinės
katedroje validuota vitaminų B3, B6, B12 kokybinė ir kiekybinė analizė [35]. Ankstesnė metodika
papildyta biotino kiekybės ir kokybės nustatymu, pilna validacijos procedūra.
3.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija biotinui
ESC validacija atliekama norint įrodyti metodo tinkamumą remiantis ICH (International
Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use) gairėmis.
Chromatografijos metodo validacija atliekama pagal pasirinktus parametrus:
• specifiškumą,
• atsikartojamumą,
• tiesiškumą,
• skaičiuojamos aptikimo ir nustatymo ribos.
29
3.2.1 Biotino analizės specifiškumas
9 pav. Biotino standarto chromatograma su UV spektru
Specifiškumo dėka analizės metodo metu galima nustatyti analitės buvimą tiriamajame
mėginyje nepaisant kitų panašių medžiagų, metabolitų, izomerų ir kt. Norint įvertinti ESC metodikos
validaciją specifiškumo parametru tiriamos etalonų ir tiriamųjų tirpalų chromatogramos, vertinamas
sulaikymo trukmės laikas ir spektrai. Biotino sulaikymo laikas – 9,452 min. ir UV spektras matomas
biotino chromatogramoje (9 pav.).
30
3.2.2 Biotino analizės atsikartojamumas (glaudumas)
Įvertinus to pačio mėginio analizės rezultatus kelis kartus nekeičiant bandymo metodikos ir
sąlygų, galime daryti išvadas apie rezultatų tikslumą. Siekiant įvertinti atsikartojamumą, tą pačią dieną
mėginys tiriamas 5 kartus, gautos chromatogramos palyginamos apskaičiuojant standartinį variacijos
koeficientą sulaikymo laikui, smailės plotui ir smailės aukščiui. Tinkamo variacijos koeficiento ribos
yra < 5%. Biotino analizės glaudumas pirmą dieną pavaizduotas chromatogramoje žemiau (10 pav.).
10 pav. Biotino analizės glaudumas pirmą dieną
6 lentelė. Biotino variacijos koeficientas smailės plotui, smailės aukščiui ir sulaikymo laikui pirmą
dieną
Tiriamasis Variacijos
koeficientas (RSD)
smailės plotui
Variacijos
koeficientas (RSD)
smailės aukščiui
Variacijos
koeficientas (RSD)
sulaikymo laikui
Tyrimas pirmąją dieną
Biotinas (vitaminas B7) 0,3% 0,1% 0,2%
Atlikus atsikartojamumo testą gauti ir 6 lentelėje pavaizduoti rezultatai pirmąją tyrimo
dieną – variacijos koeficientas neviršija 5%, tad galime teigti, kad glaudumo kriterijus atitinka
reikalavimus nurodytus ICH gairėse.
31
Siekiant tikslumo atsikartojamumas vertinamas antrą dieną tomis pačiomis sąlygomis.
Tinkamumo variacijos riba <10%. Biotino analizės glaudumas antrą dieną pavaizduotas
chromarogramoje žemiau (11 pav.).
11 pav. Biotino analizės glaudumas antrą dieną
7 lentelė. Biotino variacijos koeficientas smailės plotui, smailės aukščiui ir sulaikymo laikui antrą
dieną
Tiriamasis Variacijos
koeficientas (RSD)
smailės plotui
Variacijos koeficientas
(RSD) smailės
aukščiui
Variacijos
koeficientas (RSD)
sulaikymo laikui
Tyrimas antrąją dieną
Biotinas (vitaminas B7) 0,2% 0,3% 0,1%
Atlikus atsikartojamumo testą gauti ir 7 lentelėje pavaizduoti rezultatai antrają tyrimo
dieną neviršija 10%, todėl rezultatai yra priimtini.
32
3.2.3 Biotino analizės tiesiškumas, aptikimo ir nustatymo ribos
ESC metodo validacijos biotinui metu nustatyta analitės aptikimo riba – 0,2 µg/ml,
kiekybinio nustatymo riba – 1,1 µg/ml.
Tiesiškumas apibūdina smailės ploto tiesinę priklausomybę nuo analitės koncentracijos.
Tiesiškumas įvertinamas matuojant skirtingų koncentracijų standarto tirpalus ir sudarant kalibracinę
kreivę (12 pav.). Biotino koncentracijų ribos nuo 5,94 mkg/ml iki 189,16 mkg/ml. Nustatomas biotino
koreliacijos koeficientas, kuris nurodytas 8 lentelėje.
12 pav. Biotino tiesinės regresijos kreivė
8 lentelė. Biotino kalibracinės kreivės charakteristika
Tiriamasis Kalibracinio grafiko tiesinės regresijos
lygtis
Koreliacijos koeficientas
Biotinas (vitaminas B7) Y=6.09e+033X+2.55e+004 0,999821
Atlikus tiesiškumo parametro testą 8 lentelėje pateiktuose rezultatuose matyti, kad
tiesiškumo kriterijus atitinka reikalavimus nurodytus ICH gairėse, koreliacijos koeficientas yra ne
mažesnis kaip 0,990.
P
lota
s
33
3.3 Maisto papildų turinčių B grupės vitaminų analizės rezultatai
Vaistinėje atsitiktiniu būdu pasirinkti 7 skirtingi maisto papildai, kurių sudėtyje yra B
grupės vitaminų. Siekiant nustatyti maisto papildų kokybę pasirinktu analizės metodu identifikuoti
tiriami B grupės vitaminai. Norint įvertinti kiekybinę maisto papildų sudėtį tyrimo metu rasti vitaminų
kiekiai palyginami su gamintojo nurodytais etiketėje kiekiais. Maisto papildai analizuojami vertinant
chromatogramose nurodytus sulaikymo laikus, UV spektrus ir lyginant su standartu.
3.3.1 Vitamino B3 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose
Siekiant įvertinti pasirinktų tirti maisto papildų kokybę vertinami UV spektrai ir tyrimo
metu gauti sulaikymo laikai. Lentelėje nurodyti vitamino B3 kokybės rezultatai tiriamuosiuose maisto
papilduose. Atliekant bandymus po tris kartus, gautas sulaikymo laiko vidurkis nurodytas 9 lentelėje,
gautos paklaidos skaičiuojant vidurkį buvo ±0,02, o atsižvelgiant į tai, kad statistinio pakartojamumo
paklaidos nebuvo didesnės nei 5 procentai galime teigti, jog ESC metodas yra patikimas naudoti.
9 lentelė. Vitamino B3 kokybės analizės rezultatai, sulaikymo laikas, koncentracija
Tiriamasis Vitamino B3 kokybė
(rasta-nerasta tyrimo metu
/nurodyta-nenurodyta
gamintojo etiketėje)
Sulaikymo laikas,
min
Koncentracija,
mkg/ml
Maisto papildas X1 -/- - -
Maisto papildas X2 -/+ - -
Maisto papildas X3 -/+ - -
Maisto papildas X4 +/+ 4,119 72,127
Maisto papildas X5 +/+ 4,112 167,935
Maisto papildas X6 +/+ 4,118 78,738
Maisto papildas X7 +/+ 4,120 84,483
Maisto papildo X1 etiketėje nenurodytas vitaminas B3, kokybinio tyrimo metu vitaminas
identifikuotas nebuvo. Maisto papildų X2 ir X3 etiketėse deklaruojamas vitaminas B3, tačiau jis
kokybinės analizės metu nustatytas nebuvo. Maisto papildų X4, X5, X6, X7 etiketėse deklaruojamas
vitaminas B3 – kokybinio tyrimo metu pavyko identifikuoti vitaminą, lentelėje nurodyti sulaikymo laikai
ir koncentracijos. Kaip pavyzdys pateikiama maisto papildo X6 chromatograma (13pav.).
34
13 pav. Maisto papildo X6 chromatograma
Vitamino B3 kiekybės tyrimas atliekamas lyginant tyrimo metu gautus duomenis ir
gamintojo deklaruojamus kiekius etiketėje (14 pav.). Skaičiuojama pagal validuotos metodikos metu
gautą kalibracinės kreivės lygtį Y = 3.86e+004 X + 6.44e+003 [35]. Vadovaujantis Europos komisijos
parengtu dokumentu, leistini maisto papildų kiekio verčių nuokrypiai vitaminams yra nuo +50% iki -
20%, įskaitant matavimo neapibrėžtį. Visų tirtų maisto papildų – X2, X3, X4, X5, X6, X7 sudėtis
neatitinka leistinų nuokrypių. Mažiausias nuokrypis nustatytas maisto papildui X5, kuriame tyrimo metu
nustatyta 16,46 mg vitamino vienoje tabletėje, o gamintojo etiketėje deklaruojamas 30 mg vit. B3 kiekis.
14 pav. Vitamino B3 kiekybės lyginamoji analizė
35
3.3.2 Vitamino B6 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose
Siekiant identifikuoti vitaminą B6 pasirinktuose tirti maisto papilduose analizuojame
sulaikymo laikus, kurie pateikti lentelėje žemiau. Kokybinio tyrimo metu visuose tirtuose maisto
papilduose X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 identifikuotas vitaminas B6 kaip ir deklaruoja maisto papildų
gamintojas etiketėje. Atliekant bandymus po tris kartus, gautas sulaikymo laiko vidurkis nurodytas 10
lentelėje. Gautos paklaidos skaičiuojant vidurkį buvo ±0,02, o atsižvelgiant į tai, kad statistinio
pakartojamumo paklaidos nebuvo didesnės nei 5 procentai galime teigti, jog ESC metodas yra patikimas
naudoti.
10 lentelė. Vitamino B6 kokybės analizės rezultatai, sulaikymo laikas, koncentracija
Tiriamasis Vitamino B6 kokybė
(rasta-nerasta tyrimo metu
/nurodyta-nenurodyta
gamintojo etiketėje)
Sulaikymo laikas,
min
Koncentracija,
mkg/ml
Maisto papildas X1 +/+ 6,660 43,620
Maisto papildas X2 +/+ 6,664 14,33
Maisto papildas X3 +/+ 6,662 617,22
Maisto papildas X4 +/+ 6,668 8,618
Maisto papildas X5 +/+ 6,660 129,692
Maisto papildas X6 +/+ 6,651 31,671
Maisto papildas X7 +/+ 6,658 16,135
Vitamino B6 kiekybės analizė atliekama skaičiuojant pagal validuotos metodikos metu gautą
kalibracinės kreivės lygtį Y = 2.35e+004 X - 3.35e+002 [35]. Kiekybinio tyrimo metu gauti vitamino
B6 kiekiai maisto papilduose yra lyginami su etiketėje nurodytais vitamino B6 kiekiais, kurie
pavaizduoti diagramoje žemiau (15 pav.). Rezultatuose matyti, jog maisto papildai X3, X5 atitinka
maisto papildams leidžiamus nuokrypius. Maisto papildas X1 – viršija leidžiamą +50% nuokrypį, o
maisto papildai X2, X4, X6, X7 neatitinka leidžiamo – 20% nuokrypio.
36
15 pav. Vitamino B6 kiekybės lyginamoji analizė
3.3.3 Biotino kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose
Norint identifikuoti biotiną pasirinktuose tirti maisto papilduose atliekamas kokybinis tyrimas, kurio
metu gautas biotino standarto sulaikymo laikas – 9,452 min. Pateikiama biotino standarto ir visų maisto
papildų chromatograma, kurioje matyti, kad vertinant sulaikymo laikus – biotinas neidentifikuojamas
visuose pasirinktuose tirti maisto papilduose (16 pav.).
16 pav. Biotino standarto ir analizuojamų maisto papildų chromatogramos
37
Vitamino B7, dar žinomo kaip biotino, deklaruoti kiekiai etiketėse yra pateikti 11 lentelėje. Maisto
papildo X1 sudėtyje vitaminas biotino nėra nurodomas, analizei aktualūs kiti tiriamieji – maisto papildai
X2, X3, X4, X5, X6, X7. Visuose pasirinktuose tirti maisto papilduose biotino kiekis nėra didelis,
didžiausias nurodytas kiekis tabletėje – 200 µg. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo
validacijos metu nustatyta biotino aptikimo riba– 0,2 µg/ml, nustatymo riba 1,1 µg/ml, nors pasirinktų
tirti maisto papildų ekstraktų koncentracija nustatyta 5-20 µg/ml ribose, vitaminas identifikuotas
nebuvo. Identifikavus biotiną jo kiekį galima apskaičiuoti naudojantis tiesinės regresijos lygtimi
Y=6.09e+033X+2.55e+004.
11 lentelė. Biotino kiekis tiriamuose maisto papilduose
Maisto papildas Biotino nurodytas pakuotėje
kiekis, µg
Biotino kiekis nustatytas tyrimo
metu, µg
X2 50 0
X3 200 0
X4 50 0
X5 50 0
X6 50 0
X7 50 0
38
3.3.4 Vitamino B12 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose
Norint įvertinti vitamino B12 kokybę vertinami sulaikymo laikai, kurie pateikti 12 lentelėje.
Atliekant bandymus po tris kartus, maisto papildo X3 sulaikymo laiko vidurkis 8,501, pasikliautinasis
intervalas 8,095-8,826, paklaida ±0,02. Kadangi, atlikto statistinio pakartojamumo bandymo paklaidos
neviršijo 5%, galima teigti, jog ESC metodas yra patikimas atlikti B12 kokybės analizę.
12 lentelė. Vitamino B12 kokybės analizės rezultatai, sulaikymo laikas, koncentracija
Tiriamasis Vitamino B12 kokybė
(rasta-nerasta tyrimo metu
/nurodyta-nenurodyta
gamintojo etiketėje)
Sulaikymo laikas,
min
Koncentracija,
mkg/ml
Maisto papildas X1 -/- - -
Maisto papildas X2 -/+ - -
Maisto papildas X3 +/+ 8,501 0,122
Maisto papildas X4 -/+ - -
Maisto papildas X5 -/+ - -
Maisto papildas X6 -/+ - -
Maisto papildas X7 -/+ - -
Maisto papilde X3 identifikuotas vitaminas B12 kaip ir deklaruoja maisto papildų gamintojas produkto
etiketėje. Maisto papilduose X2, X4, X5, X6, X7 gamintojo etiketėje nurodytas vitaminas, tačiau tyrimo
metu vitaminas identifikuotas nebuvo. Pateikiama maisto papildo X3 chromatograma, kurioje matyti
identifikuotas vitaminas B12 (17 pav.).
17 pav. Maisto papildo X3 chromatograma
39
Atlikti kiekybinį vitamino B12 tyrimą buvo galima tik su maisto papildu X3, kuriame buvo
identifikuotas vitaminas B12. Skaičiuojama pagal validuotos metodikos metu gautą kalibracinės kreivės
lygtį Y =5.80e+004 X + 9.62e+002 [35]. Tyrimo metu maisto papilde X3 nustatyti labai maži vitamino
B12 kiekiai.
13 lentelė. Vitamino B12 kiekybės analizė tiriamuose maisto papilduose
Maisto papildas Vitamino B12 kiekis vienoje
tabletėje nurodytas pakuotėje
Vitamino B12 kiekis vienoje
tabletėje nustatytas tyrimo metu
X2 2,5 µg -
X3 10 µg 1,6 µg
X4 2 mg -
X5 5 µg -
X6 4,5 µg -
X7 2,5 µg -
40
3.3.5 Palyginamoji vit. B3 ir vit. B6 kiekybinė analizė maisto papilduose
Pavykus sėkmingai pritaikyti ESC metodą vitaminų B3 ir B6 kiekio nustatymui maisto
papilduose, žemiau pateikiamos diagramos, kuriose lyginami gamintojo deklaruojami ir tyrimo metu
gauti vitaminų kiekiai procentine išraiška.
18 pav. Procentinė vitamino B3 kiekio palyginamoji analizė
Atlikus pasirinktų tirti maisto papildų kiekybės tyrimą buvo pastebėti dideli vitaminų masės
nuokrypiai lyginant tyrimo metu gautus duomenis ir gamintojų etiketėse deklaruojamus kiekius.
Leidžiami tirpių vandenyje vitaminų nuokrypiai svyruoja nuo +50% iki -20%.
Diagramoje mėlyna spalva pažymėtas vitamino B3 kiekis procentais gautas tyrimo metu, o šalia
oranžine spalva gamintojo deklaruojamas kiekis procentais. 100% neatitikmuo buvo gautas net
dviejuose maisto papilduose (X2, X3) tiriant vitaminą B3, kas reiškia, jog tyrimo metu maisto papilde
vitaminas nebuvo rastas. Pažvelgus į 18 pav. diagramą galime matyti, jog mažiausias vitamino B3
nuokrypis identifikuotas maisto papilde X5, kuris yra -45 proc.
41
19 pav. Procentinė vitamino B6 kiekio palyginamoji analizė
Diagramoje mėlyna spalva vaizduojamas vitamino B6 kiekis procentais gautas tyrimo metu, o
šalia nurodomas gamintojo deklaruojamas vitamino kiekis etiketėje. Maisto papilduose X1, X3, X5
analizuojant vitaminą B6 buvo nustatytas didesnis jo kiekis nei teigiama etiketėje, ypač ženklus
nuokrypis pastebėtas maisto papilde X1 – nustatytas vitamino B6 kiekis viršija deklaruojamą kiekį
etiketėje 3,5 karto. Tirti maisto papildai X3 ir X5 atitinka maisto papildams leidžiamus nuokrypius.
42
4. IŠVADOS
1. Pritaikyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodologija vitamino B3, B6, B12 ir biotino
identifikavimui ir kiekio nustatymui.
2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika validuota biotinui atsižvelgiant į specifiškumo
(sulaikymo laikas 9,452 min), atsikartojamumo (variacijos koeficientas <5%), tiesiškumo
(R2 =0,999821) parametrus.
3. Atlikus kokybinį maisto papildų vertinimą vitaminas B6 buvo nustatytas visuose tirtuose maisto
papilduose, vitaminas B3 buvo identifikuotas keturiuose maisto papilduose (X4, X5, X6, X7),
vitaminas B12 identifikuotas tik viename maisto papilde (X3). Efektyviosios skysčių
chromatografijos metodo validacijos metu nustatyta biotino aptikimo riba – 0,2 µg/ml,
nustatymo riba – 1,1 µg/ml, nors pasirinktų tirti maisto papildų ekstraktų koncentracija nurodyta
5-20 µg/ml ribose, vitaminas identifikuotas nebuvo.
4. Įvertinus vitamino kiekius gautus tyrimo metu, mažiausias vitamino B3 nuokrypis nuo
deklaruojamo kiekio etiketėje būdingas maisto papildui X5 (-45 proc.), didžiausias – maisto
papilduose X2 ir X3 (-100 proc.). Vitamino B6 mažiausi kiekio nuokrypiai nustatyti papilduose
X3 (+45proc.) ir X5 (+27proc.), didžiausias maisto papilde X1 (+360 proc.). Vitaminas B12
identifikuotas tik maisto papilde X3, kurio nuokrypis nuo gamintojo deklaruojamo kiekio
etiketėje yra -84 proc.
43
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. S. Amanullah and C. Seeber, “Niacin deficiency resulting in neuropsychiatric symptoms: A case
study and review of literature,” Clin. Neuropsychiatry, vol. 7, no. 1, pp. 10–14, 2010.
2. H. E. Meyer, W. C. Willett, T. T. Fung, K. Holvik, and D. Feskanich, “Association of High In
takes of Vitamins B6 and B12 From Food and Supplements With Risk of Hip Fracture Among
Postmenopausal Women in the Nurses’ Health Study,” JAMA Netw. open, vol. 2, no. 5, p.
e193591, 2019, doi: 10.1001/jamanetworkopen.2019.3591.
3. K. Mikkelsen, L. Stojanovska, M. Prakash, and V. Apostolopoulos, “The effects of vitamin B on
the immune/cytokine network and their involvement in depression,” Maturitas, vol. 96, pp. 58–
71, 2017, doi: 10.1016/j.maturitas.2016.11.012.
4. J. M. Denu, “Vitamin B3 and sirtuin function,” Trends Biochem. Sci., vol. 30, no. 9, pp. 479–483,
2005, doi: 10.1016/j.tibs.2005.07.004.
5. A. Praškevičius, L. Ivanovienė, N. O. Stasiūnienė, J. M. Burneckienė, and H. Rodovičius,
Biochemija _ bendrasis vadovėlis _ LSMU DSpace_CRIS. Kaunas: Vitae Litera, 2006.
6. Z. Fatima, X. Jin, Y. Zou, H. Y. Kaw, M. Quinto, and D. Li, “Recent trends in analytical methods
for water-soluble vitamins,” J. Chromatogr. A, vol. 1606, p. 360245, 2019, doi:
10.1016/j.chroma.2019.05.025.
7. P. Xu and A. A. Sauve, “Vitamin B3, the nicotinamide adenine dinucleotides and aging,” Mech.
Ageing Dev., vol. 131, no. 4, pp. 287–298, 2010, doi: 10.1016/j.mad.2010.03.006.
8. R. A. Fricker, E. L. Green, S. I. Jenkins, and S. M. Griffin, “The Influence of Nicotinamide on
Health and Disease in the Central Nervous System,” Int. J. Tryptophan Res., vol. 11, 2018, doi:
10.1177/1178646918776658.
9. M. Sharma, P. K. Banipal, and T. S. Banipal, “Hydration characteristics, structural effects and the
taste quality of some polyhydroxy compounds in aqueous solutions of nicotinic acid (vitamin B3)
at (288.15–318.15) K,” Food Chem., vol. 310, no. November 2019, p. 125861, 2020, doi:
10.1016/j.foodchem.2019.125861.
10. R. Moore, “Water-Soluble Vitamins : B-Complex and Vitamin C,” Color. State Univ., vol. Fact
Sheet, no. 9, p. 5, 2012.
11. J. E. Prousky, “Treating dementia with vitamin B3 and NADH,” J. Orthomol. Med., vol. 26, no.
2, pp. 163–174, 2011.
12. M. P. Wilson, B. Plecko, P. B. Mills, and P. T. Clayton, “Disorders affecting vitamin B6
metabolism,” J. Inherit. Metab. Dis., vol. 42, no. 4, pp. 629–646, 2019, doi: 10.1002/jimd.12060.
13. S. P. Arévalo, T. M. Scott, L. M. Falcón, and K. L. Tucker, “Vitamin B-6 and depressive
symptomatology, over time, in older Latino adults,” Nutr. Neurosci., vol. 22, no. 9, pp. 625–636,
2019, doi: 10.1080/1028415X.2017.1422904.
14. A. C. Mamede, S. D. Tavares, A. M. Abrantes, J. Trindade, J. M. Maia, and M. F. Botelho, “The
role of vitamins in cancer: A review,” Nutr. Cancer, vol. 63, no. 4, pp. 479–494, 2011, doi:
10.1080/01635581.2011.539315.
15. P. Zhang, T. Suda, S. Suidasari, T. Kumrungsee, N. Yanaka, and N. Kato, “Novel preventive
mechanisms of vitamin B6 against inflammation, inflammasome, and chronic diseases,” in
Molecular Nutrition, Academic Press, 2020, pp. 283–299.
16. J. M. Gostner, K. Kurz, and D. Fuchs, “The significance of tryptophan metabolism and vitamin
B-6 status in cardiovascular disease,” Am. J. Clin. Nutr., vol. 111, no. 1, pp. 8–9, 2020, doi:
10.1093/ajcn/nqz291.
17. A. León-Del-Río, “Biotin in metabolism, gene expression, and human disease,” J. Inherit. Metab.
Dis., vol. 42, no. 4, pp. 647–654, 2019, doi: 10.1002/jimd.12073.
18. R. M. Trüeb, “Serum biotin levels in women complaining of hair loss,” Int. J. Trichology, vol. 8,
no. 2, pp. 73–77, 2016, doi: 10.4103/0974-7753.188040.
19. W. S. Zempleni J1, Hassan YI, “4 Biotin and biotinidase deficiency.” 2008.
44
20. H. M. Almohanna, A. A. Ahmed, J. P. Tsatalis, and A. Tosti, “The Role of Vitamins and Minerals
in Hair Loss: A Review,” Dermatol. Ther. (Heidelb)., vol. 9, no. 1, pp. 51–70, 2019, doi:
10.1007/s13555-018-0278-6.
21. B. Nshime, J. Koedam, B. Stanton, Q. Tran, and P. Chen, “Liquid chromatography method for
the simultaneous quantification of biotin and vitamin B12 in Vitamin B supplements,” J. AOAC
Int., vol. 102, no. 2, pp. 445–450, 2019, doi: 10.5740/jaoacint.18-0029.
22. S. Padmanabhan, M. Jost, C. L. Drennan, and M. Elías-Arnanz, “ A New Facet of Vitamin B 12 :
Gene Regulation by Cobalamin-Based Photoreceptors ,” Annu. Rev. Biochem., vol. 86, no. 1, pp.
485–514, 2017, doi: 10.1146/annurev-biochem-061516-044500.
23. J. Wuerges, G. Garau, S. Geremia, S. N. Fedosov, T. E. Petersen, and L. Randaccio, “Structural
basis for mammalian vitamin B12 transport by transcobalmin,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,
vol. 103, no. 12, pp. 4386–4391, 2006, doi: 10.1073/pnas.0509099103.
24. R. Banerjee and S. W. Ragsdale, “ The Many Faces of Vitamin B 12 : Catalysis by Cobalamin-
Dependent Enzymes ,” Annu. Rev. Biochem., vol. 72, no. 1, pp. 209–247, 2003, doi:
10.1146/annurev.biochem.72.121801.161828.
25. G. Rizzo and A. S. Laganà, “A review of vitamin B12,” Mol. Nutr., pp. 105–129, Jan. 2020, doi:
10.1016/B978-0-12-811907-5.00005-1.
26. G. Rizzo et al., “Vitamin B12 among vegetarians: Status, assessment and supplementation,”
Nutrients, vol. 8, no. 12, pp. 1–23, 2016, doi: 10.3390/nu8120767.
27. G. Gramer et al., “Newborn Screening for Vitamin B12 Deficiency in Germany—Strategies,
Results, and Public Health Implications,” J. Pediatr., vol. 216, pp. 165-172.e4, 2020, doi:
10.1016/j.jpeds.2019.07.052.
28. E. Andrès, A. A. Zulfiqar, and T. Vogel, “State of the art review: oral and nasal vitamin B12
therapy in the elderly,” QJM, vol. 113, no. 1, pp. 5–15, 2020, doi: 10.1093/qjmed/hcz046.
29. K. Vishwakarma et al., “Financial support and sponsorship Piloerection : A Rare Ictal
Phenomenon – Case Report and Review of Literature,” Ann. Indian Acad. Neurol., vol. 20, no. 2,
pp. 169–172, 2017, doi: 10.4103/aian.AIAN.
30. P. Chen and W. R. Wolf, “LC/UV/MS-MRM for the simultaneous determination of water-soluble
vitamins in multi-vitamin dietary supplements,” Anal. Bioanal. Chem., vol. 387, no. 7, pp. 2441–
2448, 2007, doi: 10.1007/s00216-006-0615-y.
31. P. Moreno and V. Salvadó, “Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multi-
vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography,” J.
Chromatogr. A, vol. 870, no. 1–2, pp. 207–215, Feb. 2000, doi: 10.1016/S0021-9673(99)01021-
3.
32. Z. Sun et al., “A yellow-emitting nitrogen-doped carbon dots for sensing of vitamin B12 and their
cell-imaging,” Dye. Pigment., vol. 176, no. December 2019, p. 108227, 2020, doi:
10.1016/j.dyepig.2020.108227.
33. W. Hu, J. Tao, Q. Wang, J. Li, C. Yan, and X. Xu, “[Simultaneous determination of vitamins B1,
B2, B6, niacinamide and calcium pantothenate in compound vitamin B tablets by high
performance quantitative capillary electrophoresis],” Se pu = Chinese J. Chromatogr., vol. 37,
no. 6, p. 661—665, 2019, doi: 10.3724/sp.j.1123.2018.12040.
34. A. H. Kamal, A. A. Marie, and S. F. Hammad, “Stability indicating RP-HPLC method for
simultaneous determination of omeprazole and aspirin in the presence of salicylic acid as
degradation product,” Microchem. J., vol. 152, no. August 2019, p. 104350, 2020, doi:
10.1016/j.microc.2019.104350.
35. M. Lukošaitytė, “B grupės vitaminų ko kybinis ir kiekybinis tyrimas vitaminizuotuose gėrimuose
efektyviosios skysčių chromatografijos metodu,” Kaunas, 2019.